FI97550B - Menetelmä peptidien valmistamiseksi, menetelmässä käyttökelpoinen yhdistelmäplasmidi ja plasmidilla transformoituja myeloomasoluja - Google Patents

Menetelmä peptidien valmistamiseksi, menetelmässä käyttökelpoinen yhdistelmäplasmidi ja plasmidilla transformoituja myeloomasoluja Download PDF

Info

Publication number
FI97550B
FI97550B FI871607A FI871607A FI97550B FI 97550 B FI97550 B FI 97550B FI 871607 A FI871607 A FI 871607A FI 871607 A FI871607 A FI 871607A FI 97550 B FI97550 B FI 97550B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
cells
plasmid
transformed
gene
desired peptide
Prior art date
Application number
FI871607A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI871607A (fi
FI871607A0 (fi
FI97550C (fi
Inventor
Kenji Murakami
Yasuaki Tonooka
Norie Saito
Kokichi Nakasuji
Norifumi Sugiyama
Original Assignee
Daiichi Seiyaku Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daiichi Seiyaku Co filed Critical Daiichi Seiyaku Co
Publication of FI871607A0 publication Critical patent/FI871607A0/fi
Publication of FI871607A publication Critical patent/FI871607A/fi
Publication of FI97550B publication Critical patent/FI97550B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI97550C publication Critical patent/FI97550C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

97550
Menetelmä peptidien valmistamiseksi, menetelmässä käyttökelpoinen yhdistelmäplasmidi ja plasmidilla transformoituja myeloomasoluja 5 Tämä keksintö koskee menetelmää peptidien tuotta miseksi, jossa käytetään hyväksi geenitekniikkaa, yhdis-telmäplasmidia käytettäväksi tässä menetelmässä ja tällä yhdistelmäplasmidilla transformoituja myeloomasoluja.
On tehty erilaisia yrityksiä peptidien tuottami-20 seksi transformoimalla eläinsoluja ja viljelemällä trans-formantteja. Seuraavassa luetellaan esimerkkejä näistä suurin piirtein laskettuine sääntöineen.
(i) BPV (naudan papilloomavirus) - hiiri C127 - järjestelmä: ihmisen IFN-Y^-geeni (cDNA) , SV40:n aikainen pro- 25 moottori; 3 x 10^ KY/ml /r. Fukunaga et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 5086/; (ii) SV40-CV-1-järjestelmä: ihmisen IFN-^-geeni (cDNA) , SV40:n aikainen promoottori; 2 x 104 KY/ml /D. Cheysen et ai., J. Mol, Appi. Genetics 1 (1982) 305/; 20 (lii) SV40-COS-järjestelmä: ihmisen insuliinigeeni (cDNA), SV40:n aikainen promoottori /jö, Laud et ai., J. Biol.
Chem, 258 (1983) 60437; (iv) Eco-gpt-CHO-järjestelmä: ihmisen IFN-~7^-geeni (cDNA) , 4 r- SV4Q:n aikainen promoottori; 1 x 10 KY/ml /T. Kadotan! 25 et ai., Seikagaku 56 (1984) 9157; ja (v) dhfr-CHO-järjestelmä: ihmisen IFN-Y^-geeni (cDNA), 5 - SV40:n aikainen promoottori; 1 x 10 KY/ml /S. Scahill et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983) 46547·
Vaikka kullakin näistä menetelmistä on omat omi-30 naispiirteensä, ovat kaikki menetelmät vielä epätyydyttäviä, erityisesti halutun peptidin saannon suhteen.
Myös myeloomia on käytetty vasta-aineita tuottavina soluina tuotettaessa monoklonaalisia vasta-ainepep-tidejä. Niiden käyttöä muiden peptidien tuottamiseen ei . 35 kuitenkaan vielä tunneta.
97550 2 Tämä keksintö koskee menetelmää peptidien tuottamiseksi käyttämällä transformoituja eläinsoluja, erityisesti myeloomasoluja, ja siinä transformoidaan solut ja viljellään transformoituja soluja. Tarkemmin määritelty-5 nä tämän keksinnön eräs suoritusmuoto koskee menetelmää haluttujen peptidien tuottamiseksi, jossa menetelmässä transformoidaan nisäkässoluja käyttämällä vektorina yhdiste lmäplasmidia, jossa on SV40:n aikainen promoottori-sekvenssi sekä haluttua peptidiä koodaavan geenin edellä 10 (5’-puolella) että sen jäljessä (3’-puolella), ja tämän jälkeen viljellään näin transformoituja nisäkässoluja.
Tämän keksinnön eräs toinen suoritusmuoto koskee menetelmää halutun peptidin tuottamiseksi suurina määrinä, jossa menetelmässä transformoidaan myeloomasoluja 15 vektorina käytettävällä yhdistelmäplasmidilla, jossa on SV40:n aikainen promoottorisekvenssi sekä haluttua peptidiä koodaavan geenin edellä (5’-puolella) että sen jäljessä (33-puolella).
Myeloomasolut ovat edullisia siinä suhteessa, et-2Q tä niillä on kyky kasvaa nopeasti in vivo ja in vitro, suuri proteiinien syntetisointikapasiteetti (IgG:n suhteen) ja kyky monistua suureen solutiheyteen. Keksinnön tämän suoritusmuodon eräänä erinomaisena piirteenä on se, että saavutetaan peptidien tuotanto suurina määrinä 25 yhdistämällä myeloomasolujen edellä mainitut edulliset piirteet SV40-promoottorin ja -edistäjän voimakkaaseen ilmentymistä edistävään vaikutukseen.
Keksintö koskee lisäksi yhdistelmäplasmidia, jossa on SV40:n aikainen promoottorisekvenssi sekä haluttuja 30 peptidejä koodaavan geenin edellä (5’-puolella) että sen jäljessä (3’-puolella), ja mainitulla yhdistelmäplasmidilla transformoituja eläinsoluja.
Kuva 1 ja kuva 2 ovat molemmat vektorin konstruointia kuvaavia kaavioita; 35 kuva 3 ja kuva 4 esittävät molemmat erään DNA- 97550 3 fragmentin restriktiokarttaa; ja kuvat 5-12 esittävät kunkin käytetyn plasmidin karkeaa restriktiokarttaa.
Haluttuja peptidejä koodaavan geenin edellä (5 * — 5 puolella) olevan SV40:n aikaisen promoottorisekvenssin tulisi sijaita alueella, joka on muutamia kymmeniä emäs-pareja aloituskodonin edellä, edullisesti muutaman emäs-parin etäisyydellä aloituskodonin edellä tai välittömästi sitä ennen. Mitä tulee jäljessä, 3'-puolella sijaitko sevaan toiseen SV4Q;n aikaiseen promoottoriin, sen on hyvä sijaita alueella, joka on muutaman kiloemäsparin, esimerkiksi 2,5 ke:n, sisällä haluttuja peptidejä koodaavan geenin jäljessä.
Eläinsoluihin tuotu plasmidi tulee sisällytetyk-si eläimen kromosomi-DNArhan ja jää sinne pysyvästi. Transformoidut solut tuottavat jatkuvasti geenituotetta, ts. peptidiä, ja transformoidut solut pystyvät elämään pysyvästi.
Käyttämällä tuottamattomia tai erittämättömiä 2o (XgG:n suhteeni myelooma-soluja voidaan välttää IgG-kon- taminaatio, ja tällainen käyttö on siten edullista halutun peptidin puhdistuksessa. Koska myeloomasoluja voidaan lisätä eläimen, kuten hiiren, vatsaontelossa, voidaan geenituotteita (peptidejä) odotetusti tuottaa suu-25 ria määriä.
Tämä keksinnön eräänä lisäpiirteenä on se, että vektorin käyttö, jossa SV40-promoottori sijaitsee sekä haluttua peptidiä (esimerkiksi IFN:a) koodaavan hetero-logisen geenin edellä (5’-puolella) että sen jäljessä 30 (3’-puolella), saa aikaan geenituotteen saannon kasvami sen noin kymmenkertaiseksi.
Isäntäsoluina käytettävinä soluina voidaan mainita erilaiset myeloomaeolut, esimerkiksi hiiren, rotan ja ihmisen myeloomasolut. Näistä tuotteen puhdistuksen kan-35 naita ovat sopivia IgG:tä tuottamattomat tai IgG:tä erit- 97550 4 tämättömät solut. Solulinjat P3-X63-Ag8-Ul (erittämätön tyyppi) HGPRT-, X63-Ag8-6.5.3 (tuottamaton tyyppi) HGPR- ja SP2/OAgl4 (tuottamaton tyyppi) HGPRT" ovat esimerkkejä tunnetuista hiiren myeloomasolulinjoista 5 /Munemura (toim.), Saibo Baiyo Manual (Manual of Cell Culture), Kodansha, Tokio 1982; Iwasaki et al.,
Tankuron Kotai (Monoclonal Antibodies), Kodansha, Tokio 19827.
Käytettävässä vektorissa olisi hyvä olla voimakas IQ promoottori, jolla on kyky saada aikaan geenin ilmentyminen eläinsoluissa (esimerkiksi SV40-promoottori, BPV-promoottori, metallitioniinipromoottori, dhfr-promoot-tori, retroviruksen tai LTR:ien erilaiset pitkät terminaaliset toistuvat jaksot, jotka kaikki ovat hyvin tun-15 nettuja), ja selektiivinen markkeri. Promoottorina käytetään edullisesti SV40-promoottoria. Selektiivisenä markkerina voidaan mainita esimerkiksi Eco-gpt ^Proc.
Natl. Acad. Sei. USA 78 (1981) 2072-20767, tk ^Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 (1979) 37577 3a 7M°lec· Cell.
20 Biol. 1 (1981) 845-8647, jotka kaikki ovat hyvin tunnettuja. Myös muita tunnettuja selektiivisiä markkereita voidaan käyttää.
SV40-promoottorin emässekvenssi esitetään julkaisussa Science 200 (1978) 495-498. Alan ammattimies 25 konstruoi helposti esimerkiksi jäljempänä esitettävien esimerkkien avulla. Vektorin, jossa SV40-promoottori yhdistetään haluttua polypeptidiä vastaavaan geeniin.
DNA-fragmenttien pilkkominen, syntetisoiminen, analysoiminen, eristäminen ja muut käsittelyt, jotka ovat 30 välttämättömiä vektorin muodostamiseksi, voidaan toteuttaa tavanomaisin menetelmin £Äm. J. Hum. Genet, 31 (1979) 531; T. Maniatis et ai.. Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory 19827.
Protoplastifuusiomenetelmää, kalsiumfosfaatti-35 menetelmää tms. voidaan käyttää eläinsolujen transformoin- il 97550 5 tiin yhdistelmäplasmidilla kyseessä olevan geenin tuomiseksi soluihin /Mol. Cell. Biol. 1(8) (1981) 743-752;
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983) 825-829; Ogawara, Wakariyasui Idenshi Kumikae (Comprehensible Gene Recom-5 bination), Hirokawa Shoten, Tokio 1985, s 144-165^.
Solujen monistumista voidaan edistää in vitro tai in vivo käyttämällä sopivia menetelmiä. Solujen monistus-järjestelmä on hyvä valita tapauksen mukaan ja halutun polypeptidin tuottamiseksi tehokkaasti /iwasaki et ai, 10 Tankuron Kotai (Monoclonal Antibodies), Kodansha, Tokio 1982/.
In vitro -viljelyssä voidaan käyttää alustoja, joita yleensä käytetään myeloomasolujen viljelyyn in vitro, esimerkiksi RPMI-1640-alustaa, joka on täydennetty 10:liä 15 tilavuus-%:11a naudan sikiöseerumia (FCS), tai RDF-alus-taa (RPMI-1640:DMEM:F12 suhteessa 8.1:1), joka on täydennetty 10:llä tilavuus-%:11a PCS:a tai synteettisellä seerumilla, kuten Nu-seerumilla, tai seerumittomalla alustalla, kuten RDF-alustalla (RPMI-1640:DMEM:F12 suh-20 teessä 3:1:1), joka on täydennetty ITES:llä) (insuliini, transferriini, etanoliamiini ja seleeni) ja albumiinilla. /Katso liite nro 27 julkaisuun Tanpakushitsu Kakusan,
Koso (Protein, Nucleic Acid and Enzyme) (1984) 453-4557·
In vitro -viljelyssä käytettiin petrimaljoja ja 25 pyörityspulloja. Viljelymenetelmänä voidaan käyttää suu- fitiheyksistä viljelymenetelmää, jossa viljely tehdään 6 7 solutiheyden ollessa 10 solua/ml tai suurempi (10' - 10®) . Erityisesimerkkejä niistä ovat onttokuituviljely /Science 178 (1972) 657 r mikrokapselivil jely US-patentti jui-. 30 kaisu 4 409 331) , paineilmaviljely /Biochem. Soc. Trans. 13 (1985) 107 ja kalvoperfuusioviljely (inkubaattoria myy Millipore Co., USAl. Näistä onttokuituviljely on tehokas ja edullinen (inkubaattoria tätä menetelmää varten myy Amicon Co. tai Endotronics Co). In vitro-viljely voi-35 daan tehdä hyvin tunnetulla menetelmällä /ftunemura (toim.) , Saibo Baiyo Manual (Manual of Cell Culture), Kodansha, 97550 6
Tokio 1982 ja Fukui et ai. (toim.), Saibo Baiyo Gijutsu (Cell Culture Technology), Kodansha, Tokio 19857. Niinpä in vitro-viljely tehdään esimerkiksi hiilidioksidin (5 %) läsnäollessa.
5 Myeloomasolujen lisääminen in vivo voidaan tehdä eläimen vatsaontelossa, kuten alalla hyvin tiedetään. Eläimistä mainittakoon erityisesti hiirikannat Balb/c nu/nu ja Balb/c, joihin on mahdollista siirtää myelooma-soluja (näitä hiirikantoja myy Charles River Japan, Inc). 10 Tämä keksintö soveltuu mihin tahansa käyttökel poisiin peptideihin, esimerkiksi lymfokiineihin, kuten interferoneihin, tuumorin nekroositekijään ja interleu-kiineihin; hormoneihin, kuten insuliiniin ja kasvuhormoniin; antigeenisiin proteiineihin, kuten hepatiitti-15 ja influenssarokotteisiin; plasminogeenin kudosaktivaat- toriin ja somatomediineihin.
Tuotettu peptidi voidaan eristää ja puhdistaa jollakin sopivalla tunnetulla menetelmällä, esimerkiksi affi-niteettikolonnikromatografiällä, ioninvaihtokromatogra-2o fiällä, molekyyliseulojen avulla jne.
Seuraava esimerkki, jossa käytettiin gammainter-feronia ( >^-IFN) esimerkkinä peptidistä, valaisee tätä keksintöä, mutta ei millään tavoin rajoita sitä.
Esimerkki 25 I, Vektorin muodostaminen (kuva 1) a, >*"-IFN -geenin insertoiminen perusvektoriin Plasmidi pKSV-10 (Pharmacia P-L Biochemicals; katso kuva 5, tämän plasmidin Kpnl-kohta - BamHI-kohta-fragmentin restriktiokartta esitetään kuvassa 3) katkais-30 tiin Bglll-kohdasta, joka sijaitsee välittömästi SV40:n aikaisen promoottorin jäljessä, ja tehtiin tylppäpäiseksi käyttämällä Klenow-fragmenttia, minkä jälkeen tehtiin Smal-kytkijän (Takara Shuzo) insertio. Siten saatua plas-midia pKSV-10-SmaI (katso kuva 6) lisättiin Escherichia 35 coli HBlOlrssä.
il 97550 7
Ihmisen '^-IFN-geenin sisältävä plasmidi pMK-5 /talletettu the Fermentation Research Institute E. coli MK-5:n muodossa; talletusnumero FERM BP-1329 (katso kuva 11)7 käsiteltiin erikseen Banlllrlla ja BamHirllä. Siten 5 irrotettu "V^-IFN—geeni (genominen) tehtiin tylppäpäiseksi Klenow-fragmentilla ja insertoitiin pKSV-10-SmaI:een Smal-kohtaan, jolloin saatiin pKSV-10-V(katso kuva 7).
b. Selektiivisen Eco-gpt-markkerigeenin sijoittaminen pKSVplO-i^: aan 20 Plasmidi pSV-2-gpt ^Bethesda Research Laboratories (katso kuva 8) tai ATCC-nro 371457 käsiteltiin PcuIIrlla ja EvoRIrllä. Siten irrotettu Eco-gpt-fragmentti ligatoi-tiin fragmenttiin, joka saatiin käsittelemällä plasmidi pUC13 (Pharmacia P-L Biochemicals) Smal:llä ja EcoRIrllä, 25 jolloin saatiin plasmidi pUCl3-SV-gpt (katso kuva 9).
Eco-gpt-geeni (SV40-promoottori + Eco-gpt + SV-terminaat-tori) irrotettiin mainitusta pUCl3-SV-gpt:stä BamHIrllä. Tuloksena oleva fragmentti, jonka restriktiokartta esi- . g/ tetään kuvassa 4, insertoitiin pKSV-10-Vraan (katso kuva 20 7; BamHI-kohta SV40-terminaattorin päässä V'-IFN-geenin 3'-puolella) BamHI-kohtaan, jolloin saatiin pKSV-10-V^-gpt (katso kuva 10).
Koska edellä mainitun Eco-gpt-geenin edellä, 5’-puolella, on SV4Q;n aikainen promoottori, on \?"-IFN-geeni 25 edellä muodostetussa plasmidissa kahden SV40-promootto- rin välissä. Tätä plasmidia käytettiin transformointiin.
c. Selektiivisen tk-markkerigeenin tuominen pKSV-10-\^:aan (katso kuva 2) tk-geeni (tk-promoottori + tk + tk-terminaattori) 30 irrotettiin plasmidista pFG-5 /Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 (1979) 37577 BamHirllä ja insertoitiin pKVS-10-V7aan (katso kuva 7) BamHI-kohtaan, jolloin saatiin plasmidi pKSV-10-V"-tk (katso kuva 12). Tässä plasmidissa on vain yksi SV4Q:n aikainen promoottori %^-IFN-geenin 5’-puolella. 35 Tätä plasmidia käytettiin transformointiin.
97550 8 II. Transformoidun myeloomalinjän perustaminen a. Plasmidin tuominen soluun protoplastifuusiolla (1) Protoplastipreparaatti
Escherichia colia, joka sisälsi vektorin pKSV-10-5 (katso kuva 10) kasvatettiin lämpötilassa 37 °C
L-liemessä (LB), joka sisälsi glukoosia /loppupitoisuus 1 % (paino/tilavuus// ja ampisilliinia (loppupitoisuus 50yUg/ml) (lopullinen tilavuus 50 ml), kunnes optinen tiheys (OD) aallonpituudella 600 nm mitattuna oli 0,5.
20 Seuraavat käsittelyt tehtiin lämpötilassa 4 °C. Kasvatus-lientä sentrifugoitiin kierrosnopeudella 300 min 1 15 min, huuhdottiin sedimentti 0,05 M Tris-puskurilla (pH 8), joka sisälsi 20 % (paino/tilavuus) sakkaroosia, lisättiin 1,25 ml samaa puskuria, ja sekoitettiin seos. Siihen li-25 sättiin 0,25 ml lysotsyymiä (Sigma) /liuotettu 0,25 M
Tris-puskuriin (pH 8) pitoisuudeksi 5 mg/ml7, ja saadun seoksen annettiin seistä 5 min. Kun oli lisätty vielä 0,5 ml 0,24 M EDTA-liuosta, seoksen annettiin seistä 5 min.
20 Edellä mainittuun seokseen lisättiin 0,5 ml 0,05 M Tris-puskuria (pH 8), lämpötila nostettiin 37 °C:ksi, ja seoksen annettiin seistä 15 min. Siihen lisättiin 10 ml sakkaroosilla /loppupitoisuus 10 % (paino/tilavuus// ja ma,gnesiumkloridilla (loppupitoisuus 10 mmol/1) täy-25 dennettyä DME-alustaa. Tuloksena olevan seoksen annettiin seistä 10 min lämpötilassa 37 °C.
(2) Protoplastien ja myeloomasolujen fuusiointi (transformoitujen solujen valmistus)
Myeloomasolut /1 x 10^ solua; X63-Ag8-6.5.3 (HGPR-), 30 Flow Laboratories Inc., Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd7 lisättiin edellä kohdassa (1) saatuun viljelmään. Seosta sentrifugoitiin kierrosnopeudella 1500 min 5 min, Super-natantti heitettiin pois, sedimentti irrotettiin, ja siihen lisättiin hitaasti 0,5 ml polyetyleeniglykoliliuosta 35 /valmistettiin lisäämällä fosfaattipuskuroitua fysiolo- li 97550 9 gista suolaliuosta (PBS) 9 g:an PEG 4000 (Sigma) lop-putilavuuteen 20 ml7 sedimentin suspendoimiseksi tasaisesti. Kun seoksen oli annettu seistä 1 min, lisättiin kahdeksan 1 ml:n annosta DME-alustaa lämpötilassa 37 °C 5 30 s:n välein. Koko seos sentrifugoitiin, ja sedimentti suspendoitiin RPMI-XHT-alustaan, jolla oli jäljempänä annettava koostumus. Siten saatu solususpensio jaettiin kolmeen 96-syvennyksiseen maljaan ja inkuboitiin 48 tuntia.
10 RPMI-XHT-alustan koostumus: RPMI-1640:een (Gibco; 1 litraa vastaava määrä) lisättiin 36 mg kanamysiiniä, 120 mg streptomysiiniä, 250 mg ksantiinia, 13,6 mg hypoksantiinia, 3,87 mg tyrni-diiniä, 3,5^ug 2-merkaptoetanolia ja 2,0 g natriumvety-15 karbonaattia. Täytettiin 1 litraksi. Tähän liuokseen lisättiin 100 ml FCS:ää (naudan sikiöseerumia).
Tämän jälkeen transformoitujen solujen valikointi tehtiin viljelemällä soluja edellä mainitussa mykofeno-lihapolla (6 mg/1) täydennetyssä alustassa (RPMI-XHMT) .
Kun soluja oli viljelty 2 viikkoa korvaten puolet alustasta tuoreella 3 vrk:n välein, valikointi oli saatettu loppuun.
L(tkj-solujen (tymidiinikinaasia vaativat hiiren fibroblastit; Exp. Cell. Res. 31, 297-312) ollessa kyseessä pKSV-10-V~gpt ja pKSV-10-^-tk tuotiin soluihin 25 kalsiumfosfaattimenetelmällä, ja valikointi tehtiin kuten edellä käyttämällä RPMI-XHMT-alustaa ja vastaavasti RPMJ>HAT-alustaa.
III. V'-IFNrn tuottaminen pKSV-lQ-'l^-gpt: llä transformoitujen myeloomasolu-30 jen X63-Ag8-6.5.3 (HGPRT~) tiheys säädettiin arvoon 5 x 4 1Q solua/ml alustalla, jolla oli jäljempänä annettava koostumus. 20 ml:n annos suspensiota laitettiin maljaan, jonka läpimitta oli 10Q mm, ja kasvatettiin inkubaatto-rissa lämpötilassa 37°C 4 vrk. Solut otettiin talteen, 35 laitettiin pyörityspulloon tiheydeksi 8 x 10 solua/ml 97550 10 viljelmän tilavuuden ollessa 100 ml, ja kasvatettiin vakiolämpötilaan 37 °C säädetyssä huoneessa pyöritysno-peuden ollessa 50 min~^".
Alustan koostumus: 5 Seokseen, joka koostui 8 tilavuusosasta RPMI-1640 (Sigma, 1 litraa vastaava määrä), 1 tilavuusosasta DME: tä (Sigma) ja 1 tilavuusosasta F-12 (Sigma), liuotettiin HEPES-puskuria (25 mmol, Sigma), 4 g glukoosia, 2 g nat-riumvetykarbonaattia, 3,5^,ug 2-merkaptoetanolia, 36 mg kanamysiiniä, 150 mg streptomysiiniä, 350 mg ksantiinia, 13,6 mg hypoksantiinia ja 3,87 mg tymidiiniä, ja säädettiin lopputilavuus 1 litraksi. Tähän liuokseen lisättiin pykofenolihappoa pitoisuudeksi 6 mg/1. Saatu seos täydennettiin vielä 100 ml:11a NU-seerumia (Collaborative 35 Research).
Viidennestä päivästä aloittaen korvattiin puolet alustasta tuoreella joka päivä. Viljelyä jatkettiin pitäen solutiheys pyörityspullossa arvossa 1,0 x 10^-1,5 x 10^/ml. Päivittäin talteenotettu viljelmäsupernatantti tutkittiin jäljempänä esitettävällä tavalla.
Mitä kohdassa II saatuihin transformoituihin L-soluihin tulee, niitä viljeltiin 60 mmm maljoissa tavanomaisesti, ja tutkittiin kukin supernatantti jäljempänä kuvattavalla tavalla.
25 Erikseen inokuloitiin 7 viikon ikäiset Balb/c nu/nu-hiiret vatsaontelonsisäisesti 0,5 ml:11a pristaa-nia (2,6,1Q,14-tetrametyylipentadekaani; Wako Pure Chemical Industries) ja viikon kuluttua samoin intraperitone-aalisesti pKSV-10-^-gpt:llä transformoiduilla myelooma-3Q soluilla X63-Ag8-6.5.3 (FTGPRT~) (1 x 10^). 20 vrk:n kuluttua kerättiin vesivatsaneste ja tutkittiin se jäljempänä kuvattavalla tavalla.
IV. 'V^-IFNm määrittäminen
Viljelmäsupernatantti- ja vesivatsanestenäytteis-35 tä tutkittiin 'V^-IFN 96-syvennyksisessä mikromaljassa li 97550 11 käyttämällä koetta, jossa mitattiin sytopaattisen vaikutuksen (CPE) 50-%:inen esto Philipin et ai. /Methods on Enxymology, 78 (1981) 389-3947 kuvaamalla tavalla käyttämällä ihmisen vesikalvosta saatuja FL-soluja ja SV:tä 5 (Shindbis-virus) yhdessä standardi-o(.-iFN: n (NIH) ja Y^^IFNrn (Genentech) kanssa.
Saadut koetulokset esitetään seuraavassa.
In vitro-viljelmä Isäntä 'v^-IFN-pitoisuus (ky/ml) 10_____ pKSV-10- 7^-gpt X63-Ag8-6.5.3 4 x 105 (HGPRT ) pKSV-10- V"-gpt L (tk") 3 x 103 pKSV-10- V"-tk L (tk_) 3 x 102 2^5 Vatsaontelonsisäinen viljely Balb/c nu/nu-hiiressä: pKSV-10-V"-gpt X63-Ag8-6.5.3 7 x 105 (HGPRT-!
Vaikka pyörityspulloviljelyä jatkettiin 20 vrk, 2o Pysyi tuotteen määrä puolessa alustan tilavuudessa, joka otettiin talteen päivittäin päivästä 5 alkaen, lähes 5 muuttumattomana. Tuotantomäärä 4 x 10 yksikköä/ml vastaa 50 ml:aa alustaa/100 ml:n pyörityspullo päivässä ja on erinomainen. Arvioidaan, että suuritiheyksisessä 25 viljelyssä, jossa käytetään ontelokuituja, saataisiin aikaan tuotepitoisuus 5 x 10 yksikköä/ml. Tämä keksintö tarjoaa siten erinomaisen menetelmän peptidien tuottamiseksi .
oL -IFN-geenin, jota käytettiin 1^-IFN-geenin si-30 jasta pKSV-10- 'TYgpt-L(tk ) ja pKSV-10- i^-tk-L(tk )-yhdistelmissä, ilmentyminen johti tuotepitoisuuksiin 1 x 1Q4 yksikköä/ml ja vastaavasti 2 x 10J yksikköä/ml.
Kun tuotanto toteutettiin pKSV-10-\^-grt:n ja X63-Ag8-6.5.3:n yhdistelmässä pyöritysviljelmä käyttä-35 mällä alustaa, joka ei sisältänyt seerumia /sisälsi insu- 97ö„ 12 liinia, transferriiniä, seleeniä, etanoliamiinia ja naudan seerumialbumiinia (BSA) FCS:n sijasta7 saatiin tuo-tepitoisuus 1 x 106 yksikköä/ml.
il

Claims (8)

97550
1. Menetelmä haluttujen peptidien tuottamiseksi, tunnettu siitä, että 5 (1) transformoidaan myeloomasoluja vektorilla, jossa on SV40:n aikainen promoottorisekvenssi sekä haluttua peptidiä koodaavan geenin edellä (5'-puolella) että sen jäl-j essä (3'-puolella), (2) viljellään transformoituja soluja ja 10 (3) puhdistetaan halutut peptidit.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että myeloomasolu on hiiren myeloomasolu.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että hiiren myeloomasolu on X63-Ag8-6.5.3 HGPRT".
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että haluttu peptidi on lymfokiini .
5. Vektori, jossa on SV40:n aikainen promoottori sekvenssi sekä haluttua peptidiä koodaavan geenin edellä (5'-puolella) että sen jäljessä (3'-puolella), tunnettu siitä, että ensimmäinen SV40:n aikainen promoottorisekvenssi sijaitsee alueella, joka käsittää usei-25 ta kymmeniä emäspareja haluttua peptidiä koodaavan geenin aloituskodonin edellä ja toinen SV40:n aikainen promoottorisekvenssi sijaitsee alueella, joka käsittää useita kiloemäspareja haluttua peptidiä koodaavan geenin jäljessä.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se sisältää 5' -» 3'-suunnassa (1) ensimmäisen SV40:n aikaisen promoottorisekvenssin, (2) haluttua peptidiä koodaavan geenin, 35 (3) ensimmäisen SV40-lopetussekvenssin, 97550 (4) toisen SV40:n aikaisen promoottorisekvenssin, (5) selektiomarkkeria koodaavan geenin, ja (6) toisen SV40:n lopetussekvenssin.
7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen vektori, 5 tunnettu siitä, että haluttu peptidi on lymfo- kiini.
8. Myeloomasolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu jonkin patenttivaatimuksista 5-7 mukaisella vektorilla. 97550
FI871607A 1986-04-14 1987-04-13 Menetelmä peptidien valmistamiseksi, menetelmässä käyttökelpoinen yhdistelmäplasmidi ja plasmidilla transformoituja myeloomasoluja FI97550C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP8552786 1986-04-14
JP8552786 1986-04-14

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI871607A0 FI871607A0 (fi) 1987-04-13
FI871607A FI871607A (fi) 1987-10-15
FI97550B true FI97550B (fi) 1996-09-30
FI97550C FI97550C (fi) 1997-01-10

Family

ID=13861362

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI871607A FI97550C (fi) 1986-04-14 1987-04-13 Menetelmä peptidien valmistamiseksi, menetelmässä käyttökelpoinen yhdistelmäplasmidi ja plasmidilla transformoituja myeloomasoluja

Country Status (15)

Country Link
US (1) US5019499A (fi)
EP (1) EP0244677B1 (fi)
JP (1) JP2573215B2 (fi)
KR (1) KR960007195B1 (fi)
CN (2) CN1034427C (fi)
AT (1) ATE109827T1 (fi)
AU (1) AU600481B2 (fi)
CA (1) CA1297434C (fi)
DE (1) DE3750348T2 (fi)
DK (1) DK189987A (fi)
FI (1) FI97550C (fi)
IE (1) IE65500B1 (fi)
IL (1) IL82207A (fi)
NO (1) NO175872C (fi)
PH (1) PH26343A (fi)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU622870B2 (en) * 1987-08-07 1992-04-30 Medical Research Council, The Vector for integration site independent gene expression in mammalian host cells
GB8809129D0 (en) * 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5879936A (en) * 1988-04-18 1999-03-09 Aluguisse Holding A.G. Recombinant DNA methods, vectors and host cells
US5573937A (en) * 1989-12-07 1996-11-12 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Serum free culture medium
US5891693A (en) * 1990-01-25 1999-04-06 Alusuisse Holdings A.G. Recombinant DNA methods vectors and host cells
GB9022545D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
GB9022543D0 (en) * 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
EP0798379A3 (en) * 1996-03-29 1999-10-06 Tosoh Corporation Human glutamic acid decarbocylase-expressing myeloma cell line
UY26317A1 (es) * 2000-08-30 2000-10-31 Alfonso Cayota Carlos Pritsch Sistema de produccion de trombopoyetina humana por celulas de mamiferos en cultivo

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU572108B2 (en) * 1983-01-19 1988-05-05 Genentech Inc. Human tpa production using vectors coding for dhfr protein
US4713339A (en) * 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
US4740461A (en) * 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4663281A (en) * 1984-03-22 1987-05-05 Mass Institute Of Technology Enhanced production of proteinaceous materials in eucaryotic cells
JPS6147500A (ja) * 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
JPS61134324A (ja) * 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ヒト抗体ｈ鎖遺伝子の発現方法
JPS61134325A (ja) * 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
WO1986005807A1 (en) * 1985-04-01 1986-10-09 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
JPH0714341B2 (ja) * 1985-11-20 1995-02-22 鐘淵化学工業株式会社 蛋白質の高生産株の取得方法
JP2581668B2 (ja) * 1985-11-27 1997-02-12 三井東圧化学株式会社 ヒト正常細胞由来のヒト組織プラスミノ−ゲン活性化因子をコ−ドする新しいｄｎａ配列とそれを含むベクタ−及び細胞
GB8607679D0 (en) * 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product

Also Published As

Publication number Publication date
JPS6344897A (ja) 1988-02-25
PH26343A (en) 1992-04-29
US5019499A (en) 1991-05-28
NO175872B (fi) 1994-09-12
NO175872C (no) 1994-12-21
IL82207A (en) 1992-03-29
FI871607A (fi) 1987-10-15
FI871607A0 (fi) 1987-04-13
CN1034427C (zh) 1997-04-02
EP0244677A3 (en) 1988-08-03
NO871573D0 (no) 1987-04-14
CA1297434C (en) 1992-03-17
EP0244677A2 (en) 1987-11-11
EP0244677B1 (en) 1994-08-10
KR960007195B1 (ko) 1996-05-29
KR870010190A (ko) 1987-11-30
CN87102823A (zh) 1987-11-04
CN1107513A (zh) 1995-08-30
DE3750348D1 (de) 1994-09-15
IE65500B1 (en) 1995-11-01
NO871573L (no) 1987-10-15
DK189987D0 (da) 1987-04-13
DE3750348T2 (de) 1994-12-15
IE870952L (en) 1987-10-14
ATE109827T1 (de) 1994-08-15
AU600481B2 (en) 1990-08-16
DK189987A (da) 1987-10-15
FI97550C (fi) 1997-01-10
JP2573215B2 (ja) 1997-01-22
AU7151687A (en) 1987-10-15
IL82207A0 (en) 1987-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2957974B2 (ja) エリスロポエチン活性を有するタンパク質の製造方法
JP3149182B2 (ja) 多領域造血刺激因子類
US5681718A (en) Methods for enhanced production of tissue plasminogen activator in cell culture using alkanoic acids or salts thereof
AU611750B2 (en) Monoclonal antibodies against human interleukin-4 and hybridomas producing the same
EP0077670B1 (en) Human immune interferon
KR950012804B1 (ko) 재조합 인간인자 viii : c의 제조방법 및 그를 위해 사용되는 형질전환체
FI103987B (fi) Interleukiini-7
FI97550B (fi) Menetelmä peptidien valmistamiseksi, menetelmässä käyttökelpoinen yhdistelmäplasmidi ja plasmidilla transformoituja myeloomasoluja
EP0239292B1 (en) Production of proteins by cell culture
US4808523A (en) Constitutive production of human IFN-β1 by mammalian cells transformed by the IFN-β1 gene fused to an SV40 early promoter
JPH04228066A (ja) 外来遺伝子発現用培養細胞
US4757018A (en) Myeloma cell lines and uses thereof
JP2001120262A (ja) 生理活性物質の産生増強方法
WO1990002183A1 (en) Production of a novel lymphokine exhibiting differentiation inhibitory activity
AU620537B2 (en) Human interleukin-4 muteins
JPH02195888A (ja) ヒトインターロイキン２活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換えｄｎａ体および該組換えｄｎａ体により形質転換された原核生物細胞
KR20020013538A (ko) 세포의 배양방법
KR100280241B1 (ko) 융합 세포의 수득방법
Dreano et al. Production of secretable proteins using the passage in vivo as tumours of cells carrying heat-inducible expression constructs
US5700915A (en) Human interleukin immunopurification processes
JP2576200B2 (ja) 生理活性タンパク質の製造法
KR920001379B1 (ko) 유전자 재조합 기술을 이용한 당단백 호르몬의 제조방법
Roggenbuck et al. Cell Cluster Formation during Up-Scaling of a Human—Mouse Heterohybridoma Producing a Polyspecific Human IgM Antibody

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
MM Patent lapsed
MM Patent lapsed

Owner name: DAIICHI SEIYAKU CO. LTD