JP2576200B2

JP2576200B2 - 生理活性タンパク質の製造法

Info

Publication number: JP2576200B2
Application number: JP63170142A
Authority: JP
Inventors: 正弘村田; 譲江藤; 博四郎柴井
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1988-03-09
Filing date: 1988-07-08
Publication date: 1997-01-29
Anticipated expiration: 2012-01-29
Also published as: JPH029388A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、チャイニーズ・ハムスターオバリージヒド
ロ葉酸還元酵素欠損株（以下CHO dhfr^-と略する）細胞
を生産宿主として用い、これを浮遊攪拌培養することに
よる生理活性タンパク質を効率よく大量に生産させる方
法に関する。

従来技術従来、CHO dhfr^-細胞は、タンパク質の生産宿主とし
て広く用いられているが、本細胞がその生育（増殖）に
支持体を必要とする付着細胞であるため本細胞を大量に
培養し、生理活性タンパク質を多量に取得することは困
難であった。マイクロビーズの上に細胞を生育させ浮遊
攪拌系で物質を生産させる方法が開発されたが、マイク
ロビーズ上に均一に細胞が生育しない等の問題点があ
り、実用化は行われなかった。また、ファイバー状の支
持体に細胞を生育させる高密度培養装置が開発された
が、その培養液量の制限より物質の大量生産には応用さ
れていない。

本発明が解決しようとする課題目的遺伝子を有するプラスミド（DHFR遺伝子を含む）
で形質転換したCHO dhfr^-細胞を大量培養し、生理活性
タンパク質を大量に生産させる場合に一番問題となって
いるのは生育（増殖）に増殖支持体を必要とする点であ
る。従って本発明の課題は増殖支持体を用いずに形質転
換した細胞を浮遊攪拌系で大量培養して目的とする生理
活性物質を大量に生産する方法の提供である。

課題を解決する為の手段本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を重ね
た結果、生育（増殖）に支持体を必要とするCHO dhfr^-
細胞及び目的遺伝子を有するプラスミドで形質転換した
CHO dhfr^-細胞が浮遊攪拌培養下で生育できることを見
い出し本発明を完成した。

即ち、本発明は生理活性タンパク質をコードする遺伝
子及びdhfr遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミド
をCHO dhfr^-細胞に形質転換して得られた浮遊攪拌培養
に適した細胞を浮遊攪拌培養し、培養液中に目的生理活
性タンパク質を生産させ、そして、目的生理活性タンパ
ク質を取得することを特徴とする生理活性タンパク質の
製造法である。

本発明を更に詳細に説明する。

まず、浮遊攪拌培養可能なCHO dhfr^-細胞（この場合
既に、生理活性タンパク質をコードする遺伝子及びdhfr
遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドで本細胞を
形質転換した細胞並びに、生理活性タンパク質をコード
する遺伝子及びdhfr遺伝子を発現可能な状態で有するプ
ラスミドにより、まだ形質転換されていない細胞のどち
らを用いてもよい。）の取得方法としては、以下のよう
に行えばよい。

支持体表面で細胞を生育させた後、核酸を含むα−ME
M培地（GIBCO社，カタログNo.410-1900）（10％牛血清
を含む）に出来るだけ低密度（１−４×10⁴個/ml）にな
るように細胞を懸濁し、浮遊攪拌培養を行う。

尚、浮遊攪拌培養を行う時の条件は特にこだわらない
が、初期細胞濃度は４×10⁴/mlを出来るだけ越えない方
が望ましい。

また、この時、培養液のpHを正確にコントロールする
ことが望ましいが、完全な密閉状態が維持できてさえい
れば、培養初期にpHを7.0に正確に合わせておけば問題
はない。

この操作を繰り返すことで浮遊攪拌培養に適した細胞
が得られる。また、培地は、上述のα−MEM培地と同程
度、もしくはそれ以上の濃度の核酸を含む培地ならいづ
れでもよい。しかし、本細胞がブロリン要求性であるた
めブロリンを含む培地でなくてはいけない。

当初、細胞の生育は悪く、また最大細胞密度も低いが
繰り返し培養を行い生育（増殖）の良好な最大細胞密度
の高い細胞がえられる。

この様にして得られた細胞は、従来から知られている
浮遊培養株、例えば、ヒト急性単球白血病細胞（THP−
1,Int,J.Cancer 26:171-176（1980））、ヒト急性前骨
髄性白血病細胞のHL-60（ATCC CCL 240）、ヒト急性単
球性白血病細胞のＵ−937（ATCC CRL 1593）、ヒト慢性
骨髄性白血病細胞のＫ−562（ATCC CCL 243）、ヒト急
性骨髄性白血病細胞のKG−１（ATCC CCL 246）、ヒト単
球性白血病細胞のＪ−111（ATCC CCL 24）と同様に扱う
ことができる。

得られた浮遊攪拌培養に適したCHO dhfr^-細胞の培養
は、好ましくは、攪拌基の付いたスピンナ−フラスコで
行なうことが望ましい。

やむをえない場合は、微生物用のフラスコディッシュ
（組織細胞用ディッシュフラスコではなく、細胞が付着
しやすいようにコーティングしていないものなら良い）
で培養することも可能である。また前記以外の方法を用
いてもかまわない。このように浮遊攪拌培養に適したCH
O dhfr^-細胞を樹立しても、目的とする生理活性タンパ
ク質をコードする遺伝子、dhfr遺伝子を有するプラスミ
ドを含有していない場合には以下に示すような操作を行
なうことにより目的とする生理活性タンパク質を生産し
得る。

つまり、予め、dhfr遺伝子及び目的生理活性タンパク
質をコードする遺伝子を有するプラスミドを導入する細
胞、即ち、CHO dhfr^-細胞を浮遊攪拌培養に適した細胞
として分離した後に、dhfr遺伝子及び目的生理活性物質
をコードする遺伝子を有するプラスミドで形質転換し、
次に、目的生理活性蛋白質を産生している形質転換株を
分離する。

このようにして得られた形質転換株をメソトレキセー
ト（以下MTXと略す。）を含む培地で生育させ、耐性形
質転換細胞を分離する。この様な細胞は、MTX耐性にな
ったことで、dhfr遺伝子が増幅されている。従ってこの
時に目的生理活性蛋白質をコードする遺伝子も一緒に増
幅されているため、目的生理活性蛋白質を大量に生産し
ている。

この目的生理活性蛋白質を大量に生産している細胞を
以後用いればよい。

くり返し述べるが、もちろん、dhfr遺伝子と目的生理
活性蛋白質をコードする遺伝子を有するプラスミドをま
ずCHO dhfr^-細胞に形質転換した後に浮遊攪拌培養に適
した細胞を樹立してもよい。即ち、形質転換した後に、
浮遊攪拌培養に適した細胞を樹立してもよいし、また、
浮遊攪拌に適した細胞を樹立してから形質転換しても良
いのである。

本発明で用いるプラスミドは原則的にdhfr遺伝子及び
生理活性蛋白質をコードする遺伝子を有していなければ
いけないが、好ましくは真核生物細胞内で転写可能なプ
ロモーター及びSV40スプライシングシグナル（尚、本発
明においてはSV40スプライシングシグナルとはSV40スプ
ライシングシグナル及びポリＡ付加シグナルの両方から
なるシグナルのことを言うものとする。）を有している
方が好ましい。

プロモーターとしては普通SV40初期プロモーター（SV
40 early）、ウシパピロ−マウイルス（BPVと略する）
などが用いられ、このプロモータとスプライシングシグ
ナルの間に目的とする生理活性蛋白質をコードする遺伝
子を挿入するわけである。

プラスミドとしては同一プラスミド内にて目的生理活
性蛋白質をコードする遺伝子とdhfr遺伝子を有する方が
好ましい。

しかし、プラスミド内にdhfr遺伝子を有していなくて
も別のプラスミド上にdhfr遺伝子を有している場合でも
よい。

この時は、両者を一緒にして形質転換を行なわせる。
また、プロモーター中に転写活性を上昇させるようなエ
ンサンサー配列（例えばSV40 70bpくり返し、レトロウ
イルスロングターミナルリピート（LTR）中に存在する
エンハンサー配列）を有していることも好ましい。

さて、このようなプラスミドの転写単位（プロモータ
ー）の下流に目的生理活性蛋白質をコードする遺伝子を
導入する。

上述のことを考え合すと、好ましいプラスミドの形と
してはSV40初期プロモーター（SV40 early）、目的生理
活性蛋白質をコードする遺伝子、SV40スプライシングシ
グナル（SV40 splicing＆polyA）、dhfr等の遺伝子を含
有するプラスミドがよい。尚、SV40スプライシングシグ
ナルはR.C.Mulligan及びP.Bergにより報告（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,vol 78,2072-7076（1981）に記載されて
いて、しかも入手可能である。

さて、好ましいプラスミドの例を具体的に示すと、プ
ラスミドΔSV40初期プロモーダー−目的生理活性蛋白質
をコードする遺伝子−SV40スプライシングシグナル−SV
40初期プロモーター−dhfr遺伝子−SV40スプライシング
シグナル又はプラスミドΔSV40初期プロモーター−dhfr
遺伝子−SV40スプライシングシグナル−SV40初期プロモ
ーター−目的生理活性蛋白質をコードする遺伝子−SV40
スプライシングシグナルである。

さて、本発明で言う、目的生理活性蛋白質とはヒト及
びハウスインターロイキン１、ヒト及びマウスインター
ロイキン２、ヒト及びマウスインターロイキン３、ヒト
及びマウスα−インターフェロン、ヒト及びマウスβ−
インターフェロン、ヒト及びマウスγ−インターフェロ
ン、エリスロポエチン、ヒト分化誘導因子BUF−３ヒト
Ｂ細胞分化因子BSF−２等、何を用いてもよい。

これらの生理活性蛋白質の中でもヒト分化誘導因子BU
F−３（BUF−３）、ヒトインターロイキン（IL−２）、
及びヒトＢ細胞分化因子（BSF−２）が特に好ましい。
尚、以後、IL−２、BUF−３、BSF−２と記すと特にこと
わりがない限り、ヒトIL−２、ヒトBUF−３、ヒトBSF−
２を表示するものとする。また、BSF−２はBCDFとも、I
L−６とも呼ばれているが、本発明においては最近、最
っともよく用いられているBSF−２という名称を用い
る。

本発明でいう形質転換法としてはDNAをカルシウムリ
ン酸と共澱させるカルシウムリン酸法（Graham,F.L van
der Eb.A.J:Virology.52,456（1973））、あるいはDEA
E−テキストラン法（Stow,N.D.et al:J.Gen Virol 33,4
47（1976）、ミクロマニピュレーターを用いて核内に遺
伝子を導入する微注入法（Graesamahn,A.,et al Hethod
in Enzymol.65,816（1980））、リン脂質を懸濁して得
られるリポソーム中に遺伝子を入れ標的細胞と融合せる
リポソーム融合法（Gregoriadis,G.et al 283,814（198
0））、目的遺伝子を有する原核細胞生物をプロトプラ
スト化もしくは、スフエロプラスト化にし標的細胞とPE
G存在下で融合させるプロトプラスト法（Schaffner,W.P
roc.Natl,Acad,Sci U.S.A 77,2163（1980））などがあ
る。

尚、培養液中に生産された目的生理活性タンパク質を
精製する方法は従来より用いられている一般的な方法を
用いればよい。

以下、本発明を実施例に基づいて説明する。

実施例１ヒト分化誘導因子BUF−３について BUF−３は、ヒト急性単球白血病細胞THP−１細胞が産
生する蛋白性分化誘導因子である。

BUF−３は、マウス・フレンド白血病細胞に作用し、
この細胞を正常赤芽球細胞へ分化誘導する分化誘導活性
を有する蛋白質である。

BUF−３遺伝子は既にクローニングされていて、その
塩基配列及びアミノ酸配列も決定されている（第１図参
照）。BUF−３に関しては特開昭62-234097号公報にくわ
しく記載されている。

さて、このBUF−３をコードする遺伝子を含有する動
物細胞発現ベクターpSD（ｘ）/BUF−３を第２図に示す
ように構築した。プラスミドベクターpSV2dhfrとpBR322
よりメソトレキセート耐性遺伝子（dhfr遺伝子）をSV40
初期プロモーター（SV40 early）及びSV40スプライシン
グシグナル（SV40 splicing＆polyA）の間に順方向に導
入したプラスミドpBR322-dhfrを得た。

また、第２図のように、プラスミドpSV2-dhfrを制限
酵素HindIII/BglIIで切断後、本断片をT4DNAポリメラー
ゼで処理し、平滑末端にした後、アガロースゲル電気泳
動により、SV40初期プロモーター及びSV40スプライシン
グシグナルを含むラージフラグメントを分離した後、こ
れにXhoIリンカーを付加した。

このフラグナントを再び制限酵素XhoIで処理した後に
T4DNAリガーゼで処理し、閉環した。これをプラスミドp
SV（ｘ）と命名した。

次に前述のプラスミドpBR 322-dhfrを制限酵素BamHI
で処理後アガロースゲル電気泳動を行うことより、SV40
プロモーター−dhfr遺伝子−SV40スプライシングシグナ
ルのフラグナントを単離した（第２図）。

このSV40初期プロモーター−dhfr遺伝子−SV40スプラ
イシングシグナルを含むBamHI断片をプラスミドpSV
（ｘ）のBamHI部位に導入し、プラスミドpSD（ｘ）を構
築した（第２図）。

次にクローニングしたBUF−３のDNAをT4DNAポリメラ
ーゼで処理した後、XhoIリンカーを結合させ、そして、
XhoI処理して得た断片をプラスミドpSD（ｘ）のXhoI部
位に導入した（第２図）。

このようにしてBUF−３遺伝子を有するプラシミドpSD
（ｘ）/BUF−３を構築した。

即ち、発現ベクターpSD（ｘ）/BUF−３は、SV40初期
プロモーター−BUF−３をコードする遺伝子−SV40スプ
ライシングシグナル−SV40初期プロモーター−dhfr遺伝
子−SV40スプライシングシグナルを有する。

尚、この実施例１では、pSD（ｘ）/BUF−３プラスミ
ドを予め、チャイニーズ・ハムスター・オバリージヒド
ロ葉酸還元酵素欠損株に形質転換し、BUF−３を産生す
る形質転換株を分離した後に浮遊攪拌培養に適した株を
分離する方法について述べる。

プラスミドpSD（ｘ）/BUF−3 10μｇをカルシウムリ
ン酸法でマウスCHO細胞にトランスフェクションした。
導入後は10％仔牛血清を含む所定の選択培地（GIBCO社
製α−MEM培地CAT410-2000,核酸類を含まない）５％CO₂
存在下、37℃で選択を行ない、３日毎に培地換えを行っ
た。約２週間後に生育してくる細胞集団が得られた（IF
O 50125）。次に導入されたプラスミドのコピー数を増
加させてやるためにdhfrの拮抗剤であるメソトレキセー
ト（0.1μＭ）含む選択培地で培養し耐性細胞を得た。
そして順次メソトレキセート濃度を0.2μM,0.4μM,1μ
M,2μM,4μＭで上昇させ種々の段階での耐性コロニーを
得た。そして各メントレキセート濃度で耐性を示す形質
転換細胞が産生するBUF−３蛋白量をフランド細胞を用
いたヘモグロビン合成量で測定したところ、メソトレキ
セート４μＭ濃度に耐性であった形質転換細胞では、20
00U/mlの濃度のBUF−３を３日間で蓄積していた。これ
は、蛋白量換算にすると１μg/mlの濃度に相当するBUF
−３を生産していた。

次に、付着状態で生育する形質転換細胞（４μＭメソ
トレキセート耐性2000U/ml/3days）より浮遊化に適した
細胞（CHO-SUSP）（IFO 50146）を以下の様にして分離
した。４μＭメソトレキセート耐性細胞を細胞培養用プ
ラスチックフラスコＦ−75（Nunc社製No.156502）に30m
lの10％仔牛血清を含む選択培地（４μＭメソトレキセ
ートを含む）を入れ、１×10⁶個の細胞を添加し、５％C
O₂存在下、37℃で培養した。完全に生育した後細胞を集
め、全容400mlスピンナーフラスコに10％血清を含む100
ml培地（GIBCO社製α−MEM培地CAT410-1900,上記選択培
地に核酸添加したもの。）を張った。次に４×10⁴個/ml
になるように本細胞を培地に懸濁した後、攪拌培養を行
ない37℃で培養した。８日間培養した後に、最大細胞密
度8.8×10⁴個/ml、世代時間192時間以上を示した（表−
１参）。そして更に８日間の培養をくり返し行なうこと
で４週間後には、最大細胞密度2.6×10⁵個/ml、世代時
間87hrsの細胞が得られた（表−１参）。そして次に細
胞初期密度１×10⁵個/mlで培養をくり返すことで、世代
時間48hrs、最大細胞密度7.8×10⁵個/mlと良好に生育す
る株、即ちCOH-SUSP（IFO-50146）が得られた（表−１
参）。

このようにして得られたCHO-SUSP株（IFO50146）は、
安定にBUF−３を培地中に8000U/ml蓄積していた。そし
てCHO-SUSP株は、同様の培養を20サイクルくり返し行っ
たが、世代時間、最大細胞密度BUF−３蓄積量には変化
はなく、安定な生育、BUF−３生産量を示した（第３
図）。

更にこのCHO-SUSP株（IFO 50146）は、pHを7.0、溶存
酸素を0.05,0.015atmに正確にコントロールされた培養
系では世代時間は、24hrsとなり、最大細胞密度は1.0×
10⁶個/mlにまで達した。

このようにして得られた浮遊攪拌培養に適した細胞を
分離することでBUF−３の大量生産が容易となった。

尚、BUF−３の単離精製は特開昭62-230497号公報に従
って行った。即ち、BUF−３を含む培養液100mlを、65％
飽和の硫安で５℃,12時間塩析した。遠心分離により得
られた塩析沈殿物を50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.8）
2.5mlに溶解し、透析チューブ（スペクトルボア社製,CM
W6,000-8,000）を用い、５℃で充分透析した。

次に、この透析内液にアセトニトリルを71％、かつpH
が２になるようにトリフルオロ酢酸を（以下TFAと略
す。）添加し、23℃で30分間、攪拌させた。次に、この
懸濁液を遠心分離し、その遠心上清液を室温23℃から−
５℃に冷却した状態で３時間以上静置させた。これによ
り、本液は二相分離をおこした。その際、BUF−３は、
選択的に下層画分（アセトニトリル約45％）に濃縮・精
製された。これを0.1％TFAで２倍希釈し、逆相高速液体
クロマトグラフィーで精製した。逆相カラムは、ハイボ
アRP-304（バイオラッド社製，C₄,300Å,5μｍ）を用い
た。溶媒は、0.1％（TFA）及び、80％アセトニトリル−
0.1％TFAの２液を用い、リニアグラジエントプログラム
で溶出させた。

次に、この溶出されたBUF−３画分を、再度、逆相高
速液体クロマトグラフィーを行った。カラムは、ハイボ
アRP-304（バイオラッド社製，C₄,300Å,5μｍ）を用い
た。

溶媒は、0.13％ヘプタフルオロ酪酸（HFBA）及び80％
アセトニトリル−0.13％ヘプタフルオロ酪酸の２液を用
い、リニアグラジエントプログラムで溶出せた。

次に、このようにして得られたBUF−３精製品のうち
１μｇを用いSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル濃度15％）を行った。その結果、メルカプトエタノー
ル非存在下では25kdに、メルカプトエタノール存在下で
は16kdに単一なバンド（銀染色法）が認められ、他に蛋
白のバンドは検出されなかった。このようにして精製さ
れたサンプルの比活性は約２×10⁶U/mg蛋白であった。

更に、この精製品を逆相高速液体クロマトグラフィー
に供した。この時、用いたカラムはYMC AP-803（山村化
学研究所（株）製）、溶出液は0.1％TFA及び80％アセト
ニトリル−0.1％TFAを用いリニアグラジエント（アセト
ニトリル１％分）により溶出した。

これにより完全に単一なピークが得られることにより
完全にBUF−３は単離精製し得た。

尚、念の為に得られたBUF−３精製サンプルをアミノ
酸分析に供したところ、第１図と同じアミノ酸配列を有
していることを確認した。

実施例２ヒト・インターロイキン−２についてヒト・インターロイキン−２（IL−２）は、Ｔ細胞の
増殖を促進させる蛋白性因子である。

IL−２遺伝子は、谷口ら（Nature,302.305（1983））
によって既にクローニングされている。また第４図に示
すようにその塩基配列も既に決定されている（特開昭59
-140882）。このIL−2cDNAは、pCEIL−２に含まれてい
る（第５図）。以下第５図に示すような操作を行なっ
た。このIL−2cDNAは両端に数十塩基の長さに及ぶGCテ
イルを有している。このＧあるいはＣという同一の塩基
が並んだ場合、cDNAの発現の邪魔になると考えられた。
したがってpCEIL−２より制限酵素PstI（宝酒造）処理
によりIL−2cDNAフラグメントを分離し、それにエクソ
ヌクレアーゼであるBal 31（NEB）処理を行ない、GCテ
イルの除去を行なった。そして、T4 DNA polymerase
（宝酒造）で両末端を平滑末端にした後、pCEIL−２よ
りPstI処理をしてIL−2 cDNAを除いたフラグメントも同
様にT4 DNA polymeraseで平滑末端にし、両者をT4 DNA
ligase（宝酒造）で結合した。そして、作製されたプラ
スミドを大腸菌HB101株に導入した後、得られた形質転
換株より、プラスミドを調製した。得られたプラスミド
の中で、GCテイルが除かれ発現効率の高まったものを選
択し、このプラスミドをpCEIL−２（Bal 7）と名つけ
た。

pCEIL−２（Bal 7）からは制限酵素BamHI（宝酒造）
処理によりIL−2cDNAフラグメントを分離し、T4 DNA po
lymeraseによって平滑末端にし、さらにBamHI,HindIII
の各リンカー（宝酒造）と共にT4 DNA ligase処理を行
ない、その後、BamHI,HindIII（宝酒造）処理を行なっ
た。このようにして得られたフラグメントを次に、pSV2
−dhfr（S.Subramani,et al,:Mol.Cell.Biol.1,854（19
81））のHindIII,BglII処理して得られる大きい方の断
片と結合し、大腸菌DH1株に形質転換し、その中から、
第５図のpSV2−IL2を有するものを得る。すなわち、pSV
2-dhfr由来のSV40初期プロモーター（SV40 early promo
ter）とSV40スプライシングシグナル（SV40 splicing＆
polyA）との間にIL−2 cDNAが挿入されたものを得る。
次にこのpSV2-IIL−２プラスミドをPvuII,BamHI処理し
て得られるIL−2 cDNAを含んだフラグメントにBamHIリ
ンカーをつけ、BamHI処理した後に、pSV2 dhfrのBamHI
切断部位に挿入し、プラスミドpSD（Ｉ）/IL0−２ΔSV4
0初期プロモーター−dhfr遺伝子−SV40スプライシング
シグナル−SV40初期プロモーター−IL−２をコードする
遺伝子−SV40スプライシングシグナルを得た。このプラ
スミドpSD（Ｉ）/IL−２はIL−2 cDNAの上流にpSV2-dhf
r由来のマウスdhfr cDNAを有している。

プラスミドpSDI/IL−２をCHO dhfr^-細胞にカルシウム
・リン酸法でトランスフェクションし、pSDI/IL−２プ
ラスミドが導入された形質転換細胞を分離した。導入直
後では、22.9U/mlのヒトIL−２を生産していた。次に本
細胞をMTX 1 μＭを含む培地で生育させMTX耐性細胞を
分離した。

1 μM MTX耐性形質転換細胞は、512U/mlのヒトIL−２
を生産していた。次に本細胞より浮遊攪拌培養に適した
細胞の分離を行った。1 μM MTX耐性形質転換細胞を支
持体の上で生育させた後、細胞初期密度４×10⁴個/mlに
なる様に攪拌基の付いたスピンナーフラスコ全容400ml
の100ml培地（実施例１で示した核酸を有する培地）に
懸濁した。そして、37℃で攪拌培養し、細胞密度が最大
に達するまで培養をつづけ、この攪拌培養を８サイクル
くり返すことで最大細胞密度2.9×10⁵個/ml、世代時間8
0時間となり、そして更に６サイクルくり返すことで最
大細胞密度6.8×10⁵個/ml、世代時間30時間を有する浮
遊攪拌に適した細胞が分離された。そして、このように
して得られた浮遊攪拌に適した細胞は、安定にヒトIL−
２生産能力を有していた。また、実施例１で示したよう
に、得られた浮遊攪拌に適した細胞を以後、くり返し継
代をつづけても、世代時間、最大細胞密度、ヒトIL−２
生産能力を安定に保持していた。

実施例３（１） BSF−２は、ヒトの成熟Ｂ細胞を抗体産生細胞
へ分化される因子で、第６図に示すようにそのDNA配列
及びアミノ酸配列も既に決定されている（特開昭63-426
88、特開昭63-56291）。

またBSF−２は感染症及び癌の治療に有用であること
も本発明者らは見い出している（特開昭62-289007）。

さて、このような有用なBSF−２をコードする遺伝子
をハムスターCHO細胞について発現させる為に、以下の
ようにプラスミドpSD（ｘ）/BSF−２を構築した。

ｉ）まずpCDαを制限酵素HpaIで切断し、アガロース
ゲル電気泳動により大きなDNA断片を回収した（第７
図）。

ii） BSF−2 cDNAを有するプラスミドpBSF2-38（T.Hir
ano et al.Nature 324,73（1986））を制限酵素BamHIと
BanIIで切断し、DNAポリメラーゼ処理した後、アガロー
スゲル電気泳動によりBSF−2 cDNAを含む断片を回収し
た（第７図）。

iii）ｉ）とii）で得られた２種類のDNA断片をT4 DNA
リガーゼを用いて結合させた（第７図）。

得られた組み換えDNAを大腸菌HB101株へ導入しアンピ
シリン抵抗性を有する株を選択した。得られた株からプ
ラスミドDNAを得て制限酵素による切断試験を行なうこ
とによりpCD BSF−２と保持する菌を選定した。

iv）ファージDNA λ BSF 2.5（T.Hirano et la Natur
e 324,73,（1986））をEcoRIで切断し、アガロースゲル
電気泳動によりBSF−2 cDNAを含む最も小さな断片を回
収した（第７図）。

ｖ）プラスミドpSP65（アマシャム社製）を制限酵素E
ccRIで切断した後、これをiv）で精製したDNA断片とT4
DNAリガーゼを用いて結合させた（第７図）。得られた
組換えDNAを大腸菌HB101株へ導入しアンピシリン抵抗性
を有する株を選択した。得られた株からプラスミドDNA
を得て制限酵素による切断試験を行なうことによりpBSF
2−10S6を保持する菌を選定した。

vi）上述のiii）で得たプラスミドpCD BSF−２を制限
酵素Xho IとXba Iで切断し、アガロースゲル電気泳動に
より小さな断片を回収した（第８図）。

vii）上述のｖ）で得たプラスミドpBSF2-10S6を制限
酵素Sma Iで切断した後、T4 DNAリガーゼを用いてXho I
リンカーを結合し、さらに制限酵素Xho IとXba Iを切断
してアガロースゲル電気泳動によりBSF−2 cDNAの後半
部分を含む断片を回収した（第８図）。

viii）プラスミドpSD（ｘ）を制限酵素Xho Iで切断し
た後、この断片とvi）で得た断片及びvii）で得た断片
の３者をT4 DNAリガーゼを用いて結合させた（第８
図）。即ち、プラスミドpSD（ｘ）/BSF−２ΔSV40初期
プロモーター−dhfr遺伝子−SV40スプライシングシグナ
ル−SV40初期プロモーター−BSF−２をコードする遺伝
子−SV40スプライシングシグナルを構築した。この構築
したプラスミドを大腸菌HB101株へ導入し、アンピシリ
ン抵抗性を有する株を選択した。得られた株からプラス
ミドDNAを調製し、制限酵素による切断試験を行ったこ
とによりプラスミドpSD（ｘ）/BSF−２を保持する株を
選定した。

（２）プラスミドpSD（ｘ）/BSF−２をカルシウムリ
ン酸法により、実施例１に従ってハムスターCHO細胞に
導入し、核酸非要求株を選択した。その培養上清をELIS
A法により測定したところ、100U/mlのBSF−２活性を示
した。

（３）（２）で得られたCHO細胞株を１×10^-8Ｍメソ
トレキセート（MTX）を含む培地で培養したところ、培
養上清中のBSF−２活性は200U/mlに上昇した。また、さ
らに１×10^-7M MTXを含む培地で培養したところ、BSF−
２活性は800U/mlに上昇した。

800U/mlのBSF−２活性を有する細胞が得られました
が、本細胞が付着細胞であるため浮遊かくはん培養に適
した細胞の分離を行った。

BSF−２活性800U/mlの細胞を初期細胞密度４×10⁴/ml
で500ml容量のスピンナーフラスコで培養温度は37℃、
回転速度100rpmの８日間の培養を行った。この培養をを
９サイクル行ったところ、培養初期では最大細胞密度が
７×10⁴/mlであったものが３×10⁵/mlと上昇し、世代時
間も初期では130時間以上であったが56時間と上昇し
た。

更に、初期細胞密度を１×10⁵/mlとし、４日間の培養
を６サイクル繰り返した。この結果、最終的に世代時間
30時間、最大細胞密度６×10⁵/mlと生育の良い細胞CHO-
BSF2（FERM P−9970）を得た。この様に浮遊かくはん培
養に適した細胞（FERMP−9970）が得られたがBSF−２生
産能は安定に保持されていた。

BSF−２ユニットは、１×10⁴/mlのSKW-c14細胞におい
てIgM産生を最大の50％だけ誘導する活性を1Uと定義す
る。

効果従来CHO dhfr^-細胞はBUF−３、IL−２、BSF−２等の
各種生理活性タンパク質の生産には適しているが、浮遊
攪拌培養ができない為に目的とする生理活性タンパク質
を大量に生産することはできなかった。しかし、本発明
の方法を用いるとCHO dhfr^-細胞での浮遊攪拌培養が可
能となり、それ故、目的とする生理活性タンパク質を極
めて大量に生産し得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト分化誘導因子BUF−３のアミノ酸配列及び
それをコードする塩基配列を示す。第２図はプラスミドpSD（ｘ）/BUF−３の構築図であ
る。第３図は得られたCHO-SUSP株のEDF生産能及び生育の安
定性を示した図である。第４図はヒトインターロイキン２のアミノ酸配列及びそ
れをコードする塩基配列を示す。第５図はプラスミドLPSDI/IL−２の構築図である。第６図はヒトＢ細胞分化因子のアミノ酸配列及びそれを
コードする塩基配列を示す。第７図はプラスミドpCD BSF−２及びプラスミドpBSF2−
10S6の構築図を示す。第８図はプラスミドpSD（ｘ）/BSF−２の構築図を示
す。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】生理活性タンパク質をコードする遺伝子及
びジヒドロ葉酸還元酵素（以下dhfrとする。）遺伝子を
発現可能な状態で有するプラスミドをチャイニーズ・ハ
ムスターオバリージヒドロ葉酸還元酵素欠損株（CHO dh
fr^-）細胞に形質転換して得られた浮遊攪拌培養に適し
た細胞を浮遊攪拌培養し、培養液中に目的生理活性タン
パク質を生産させ、そして目的生理活性タンパク質を取
得することを特徴とする生理活性タンパク質の製造法。
【請求項２】生理活性タンパク質がヒト分化誘導因子BU
F−３（以下BUF−３とする）、ヒトインターロイキン２
（以下IL−２とする）、及びヒトＢ細胞分化因子（以下
BSF−２とする）のいずれかである請求項（１）記載の
製造法。
【請求項３】プラスミドがpSD（ｘ）/BUF−３ΔSV40初
期プロモーター−BUF−３をコードする遺伝子−SV40ス
プライシングシグナル−SV40初期プロモーター−ジヒド
ロ葉酸還元酵素（以下dhfrとする）遺伝子−SV40スプラ
イシングシグナルである請求項（１）記載の製造法。
【請求項４】プラスミドがpSD（ｘ）/BSF−２ΔSV40初
期プロモーター−dhfr遺伝子−SV40スプライシングシグ
ナル−SV40初期プロモーター−BSF−２をコードする遺
伝子−SV40スプライシングシグナルである請求項（１）
記載の製造法。
【請求項５】プラスミドがpSD（Ｉ）/IL−２ΔSV40初期
プロモーター−dhfr遺伝子−SV40スプライシングシグナ
ル−SV40初期プロモーター−IL−２をコードする遺伝子
−SV40スプライシングシグナルである請求項（１）記載
の製造法。