JPH02195887A - ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプ
チドを有する遺伝子に関する。

インターロイキン２（以下、ｒｌＬ−２Ｊと略記する。

）は、以前はＴ細胞増殖因子と呼ばれており、レクチン
あるいは抗原で活性化されたＴ細胞より産生される可溶
性たんばく　（一般には「リンホカイン」として知られ
ている）である（ＭｏｒｇａｒＩ　ら。

５ｃｉｅｎｃｅ、　　１９３．１００７〜１００Ｂ（１
９７６）、　Ｇ１１ｌｉｓら、Ｊ。

１＋ａｇａｕｎｏ１．＋　　Ｈ艷、　２０２７〜２０３
３（１９７８））、ＩＬ−２はリンパ球の反応性を調節
でき、抗原特異的なエフェクターニーリンパ球のｉｎ　
ｖｉｔｒｏにおける長期培養を可能ならしめることがで
きる（Ｇｉｌｌｉｓら、　Ｎａｔｕｒｅ。

廁、１５４〜１５６　（１９７７）　）。またＩＬ−２
は、胸腺細胞の分裂の促進（Ｃｈｅｎら、　Ｃｅ１ｌ　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋２２＋　２２１〜２２４（１９７７
）、　５ｈａ−ら、　Ｊ、　Ｉｍｎ＋ｕｎｏ１．、１２
０．１９６７〜１９７３（１９７８））、ヌードマウス
の肺細胞の培養系での細胞障害性Ｔリンパ球活性（Ｗａ
ｇｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ＋２８４＋２７８〜２８０．
　（１９８０）　）や抗−３ＲＢＣプラ一ク形成細胞反
応の誘導（Ｇｉｌｌｉｓら、　　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅ
ｄ、　■、１９６０〜１９６８　（１９７９））等の関
連する他の生物活性をもつことが明らかにされている。

従って、このリンパ球調節因子は液体免疫や細胞性免疫
反応を増強したり免疫不全状態を正常な液体や細胞性免
疫の状態に回復させるのに有用である。これらの明らか
にされたＩＬ−２の免疫学的活性は、ＩＬ−２が悪性腫
瘍、細菌またはウィルス感染、免疫不全、自己免疫疾患
等（Ｐａｐｅｒｍａｓ　ｔｅｒら、　Ａｄｖ、　１ａ＋
ｍｕｎｏｐｈａｒｍ、。

５０７、　（１９８０））に対する医科免疫療法に有用
であることを示している。インターフェロンと同様に、
ＩＬ−２はナチュラルキラー細胞活性を増強することが
示されてきたが、これは悪性腫瘍治療への有用性を強く
示唆している。更に、■シー２は単クローン性の活性化
１゛細胞の保持を可能とし、この事は、Ｔ細胞分化の分
子機構、Ｔ細胞機能の分化機構、Ｔ細胞の抗原リセプタ
ーの機構を研究する上で重要な役割を担っていることを
示している。また、ＩＬ−２は単りローン性Ｔ細胞を長
期培養することにより、他の種々の分野で有用な様々な
Ｔ細胞由来のリンホカインを製造するためにも使用でき
る。更に、ＩＬ−２の産生とリンパ球のＩＬ−２に対す
る応答性は、免疫学的機能の重要なパラメーターであり
、免疫異常の臨床診断に有用である。

ＴＬ−２は従来の技術では、マイトジェンでマウス、ラ
ットあるいはヒトのリンパ球を刺激することにより製造
されてきた（Ｇｉｉｌｉｓら、　Ｎａｔｕｒｅ＋　２６
８＋１５４〜１５６．　（１９７７））、　Ｆａｒｒａ
ｒら、　Ｊ、　Ｉｍｎ＋ｕｎｏ１．＋１２Ｌ１３５３〜
１３６０．（１９７８）、　Ｇ１１ｌｉｓら、　Ｊ、　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、、月刊。

２０２７〜２０３３．　（１９７８））。ヒトの末梢血
リンパ球をマイトジェンで刺激することにより（Ｇｉｌ
ｌｉｓら１Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２４．１９５４〜１９６２．（
１９８０））、Ｇ１１ｌｉｓらはＴリンホーマ細胞株か
らのマウスＩＬ−２の製造（Ｇｉｌｌｉｓら、　Ｊ、　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２５．２５７０〜２５７８（１
９８０））とヒト白血病細胞株からのヒトＩＬ−２の製
造（Ｇｉｌｌｉｓら、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　
１５２．１７０！ＩＪ〜１７１９．　　（１９８０））
を報告している。

Ｇ１１ｌｉｓらによる上記の技法は、細胞培養法を用い
てマイトジェンで活性化されたＴ白血病細胞株からヒ１
−ＩＬ−２を製造する方法に関するものである。しかし
ながら、この方法では低濃度のヒ目Ｉ、−２しか産生さ
れないのが難点で、大量の培養液から微量のＩＬ−２を
得るために、複雑な精製工程を必要とする。更に、ヒト
Ｔ白血病細胞株は少量のヒ）ＩＬ−２に酷似した他の生
理活性物質も産生ずるので、ＩＬ−２をこれらの他の免
疫活性を有する分子と分離、あるいは時として共存する
細胞毒物質（ｔｏｘｔｃ　１ｅｃｔｉｎ）と分離するに
はかなりの困難が伴う。

ＩＬ−２を製造する他の方法として、インターフェロン
のような他の生理活性ヒト由来たんばくを製造するため
に用いられた組換えＤＮＡ　（デオキシリポ核酸の略）
法（Ｇｒａｙら、　Ｎａｔｕｒｅ　２９５．５０３〜５
０８゜（１９８１）、　Ｎａｇａｔａら、　Ｎａｔｕｒ
ｅ　２８４．３１６〜３２０　（１９８０）。

Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、　Ｇｅｎｅ　１０．１１〜１５
．　　（１９８０））が好ましいと思われる。しかしな
がら、本発明の以前には組換えＤＮＡ法によってＩＬ−
２を製造する試みは成功していなかった。例えば、組換
えＤＮＡ体によってＩＬ−２を産生ずる生命体を作成し
ようとする試みは、恐ら＜ＩＬ−２ポリペプチドをコー
ドする遺伝子が未だクローン化されていなかったために
成功していないという事が、′日経バイオテクノロジー
、第１９号、　１９８２年７月５日゛に報告されていた
。

従って、ＩＬ−２をコードするクローン化遺伝子とその
遺伝子を持った組換えＤＮＡ体が渇望されてきた。また
、組換えＤＮＡ体を有する生細胞株と、その細胞株を使
ってＩＬ−２を製造する方法が渇望されてきた。

本発明の要旨は以下の記述から更に容易に明白となる。

本発明の目的はＩＬ−２活性を有するポリペプチドをコ
ードする遺伝子を創出したことにある。

すなわち、本発明はヒトインターロイキン２活性をもつ
、次のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
遺伝子を提供するものである。

Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔ
ｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＧＩＮＬｅｕ　ＧＩＮ
　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　
Ａｓｐ　Ｌ、ｅｕ　ＧＩＮＭｅｔ　　ｒｌｅ　　Ｌｅｕ
　　ＡｓＮ　　ＧｌｙＰｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　
Ｔｈｒ　　ＡｒｇＴｙｒ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌ
ｙｓＬｅｕ　ＧＩＮ　Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　ＧｌｕＧｌｕ
　　Ｇｌｕ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　ＡｓＮＰｈｅ旧ｓ
　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒ。

Ｔｌｅ　　ＡｓＮ　　Ｖａｌ　　Ｉｌｅ　　ＶａｌＧｌ
ｕ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　ＭｅｔＴｈｒ　
　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　ｌｉｅ　　ＶａｌＩｃｅ　　Ｔ
ｈｒ　　Ｐｈｅ　　Ｃｙｓ　　ＧＩＮｈｒ 本発明の遺伝子は、 ＴＡＣＡＴＧ　　ＣＣＣＡＡＧ　　ＡＡＧｌｉｅ　　Ａ
ｓＮ　　ＡｓＮ Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　ＧＩＮ Ａｒｇ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ Ｌ６１４　　にｌｕ　　Ｌｅｕ Ｃｙｓ　　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ Ｇｌｕ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ Ｓｅｒ　　ｌｉｅ　　ｌｉｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ １ｅ Ｌｙｓ Ａｌａ ＡｓＮ Ｓｅｒ Ｌｙｓ　　ＡｓＮ Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ Ｌｙｓ　Ｈｉｓ Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　　ＡｓＮ ５ｅｒ　　ＡｓＮ Ｇｌｙ　Ｓｅｒ 八ｓｐ　　Ｇｌｕ 八ｒｇ　　Ｔｒｐ Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ 次の塩基配列を有する。

ＧＣＣＡＣＡ　　ＧＡＡ　　ＣＴＧ　　ＡＡＡ　　ＣＡ
ＴＣＴ 本発明の遺伝子を利用することによって、ＩＬ−２はＩ
Ｌ−２活性を有するポリペプチドを産生ずべくコードさ
れた遺伝子の挿入と、細胞の中で複製され得るベクター
ＤＮＡの挿入で組換え法により修飾され、該遺伝子のコ
ードシーケンスが、プロモーターシーケンスの下流に位
置するＤＮＡによって！Ｌ−２を産生すべ（形質転換さ
せた原核生物細胞株、特にエシェリヒア・コリを培地に
浮遊培養（好気的）することによって製造される。

本発明のＩＬ−２ポリペプチドをコードしたクローン化
遺伝子は、ＩＬ−２活性を有するポリペプチドを産生ず
る能力をもつことによって特徴づけられる哺乳動物細胞
に由来するＩＬ−２に相当するメツセンジャーＲＮＡ　
（ｍＲＮＡ　Ｈ“ＲＮＡ″はリボ核酸の略、以下“ＩＬ
−２ｍＲＮＡ”という）を相補的ＤＮ＾（ｃＤＮＡ）に
逆転写することによって得られる。得られた一重ｔ、ｊ
’ＪｃＤＮＡ（ｓｓ−ｃＤＮＡ）は−重鎖ｃＤＮＡ　（
ｄｓ−ｃＤＮＡ）に変換させることができる。

ｃＤＮＡを調製するための鋳型として用いるｍＲＮＡは
、ＩＬ−２ポリペプチドを産生ずる哺乳動物細胞から単
離することができる。単離されたＲＮＡはポリアデニル
化され（ＧｉＬＬｉｓら、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　Ｒｅｖ、＋　６３＋１６７〜２０９　（１９Ｂ２）
）　、ポリアデニル化されたＲＮＡは、例えばショ糖密
度勾配遠心法によって１１〜１２Ｓ画分に分画すること
ができる。１３ＳのｍＲＮＡにＩＬ−２ｍＲＮＡ活性が
現われることがあるが、この場合はｌ　ｌ　＝　１２　
ＳｍＲＮＡの凝集物であることが考えられる。

ｍＲＮＡの供給源となるＩＬ−２を産生ずることができ
る哺乳動物細胞は、哺乳動物より摘出できる末梢血単核
球、扁桃腺細胞、肺臓細胞のようなＴリンパ球で良い。

細胞にＩＬ−２産生能を与えたり、またはＩＬ−２活性
を増強するために、ナイロン力→ム処理、抗血清と補体
処理、密度勾配分画、ノイラミニダーゼとガラクトース
オキシダーゼの組合せ処理、トリプシン処理のような様
々な酵素処理、Ｘ線照射など従来知られた方法で前処理
しても良い。上記哺乳動物細胞をＴ細胞増殖因子存在下
で培養後得られるクローン化Ｔリンパ球もｍＲＮへの供
給源として用いることができ、これはより好ましいＴ−
リンパ球である。白血病やリンパ腫細胞株に由来するＴ
リンパ球それ自体または上記の方法で前処理または変異
したそれらの誘導体などの形質転換されたリンパ球細胞
株またはクローニングされた形質転換細胞株もｍＲＮＡ
の供給源として好ましい。明らかに、クローン化した細
胞株は通常クローン化前の親株に比較して多量のＩＬ　
−２ｍＲＮＡを含んでいる。上記したリンパ球由来細胞
とＯＥＭ。

Ｍｏ１ｔ　４Ｐ、　ＢＷ５１４７のごとき腫瘍細胞株を
融合することによって得られたＴ細胞ハイブリドーマも
また使用するのに好ましい哺乳動物細胞である。この場
合のリンパ球由来細胞は、（１）ＩＬ−２の自発産生細
胞および（２）ＩＬ−２産生を補助する他の細胞の存在
下または非存在下に培養液中にマイトジェンが導入され
存在している時のみＩＬ−２を産生ずる細胞を含む。

ＩＬ−２自発産生細胞においてＩＬ−２ｍＲＮＡを誘導
するために、ＩＬ−２自発産生細胞は、細胞培養の分野
でよく知られた方法で培養される。マイトジェン存在下
のみでＩＬ−２を産生ずる細胞においてｍＲＮＡを産生
ずる場合は、培養した細胞は培地で良く洗った後、血清
を含むかまたは含まないローズウエルパークメモリアル
インスティテニート１６４０（以下、“ＲＰ旧１６４０
”　と略す。）、ダルベラコラ変法イーグル培地（以下
“ＤＭＥＭ”と略す、）またはクリック培地のごとき培
地に再び浮遊する。これらの細胞培養培地には、ペニシ
リン、ストレプトマイシンまたは他の抗生物質、Ｌ−グ
ルタミン。

へベス緩衝液、または炭酸水素ナトリウムのような種々
の添加物を細胞培養の分野で一般に使われる濃度で加え
ても良い。好ましい細胞濃度は０．５〜４Ｘ１０６細胞
／ｄである。ｍＲＮＡの活性化とＩＬ２の産生を誘導す
るために適当な刺激剤が加えられる。この適当な刺激剤
の中には、マイトジェン、ノイラミニダーゼ、ガラクト
ースオキシダーゼ、塩化亜鉛の如き亜鉛化合物またはプ
ロティンＡ、ストレプトリジン−〇の如き細菌由来のリ
ンパ球活性化因子が含まれる。刺激された細胞は回収さ
れ、洗浄される。マイトジェン刺激の際、マクロファー
ジまたはプントリティック細胞を共存させるとやはりｍ
ＲＮＡを活性化し、あるいは活性化ｍＲＮＡの収量を増
大させ得る。同様にｌ１ｌａｊｉ、　Ｄａｕｄ＋。

に５６２．　ＢＡＬＬ−１の如きＢリンパ球またはＢリ
ンパ球細胞株に由来する細胞株を共存させてもｍＲＮＡ
は活性化され、または活性化ｍＲＮＡの収量を増大させ
得る。

哺乳動物細胞を増殖させるために、細胞は通常の条件下
でｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞培養により、または組織適合
動物の体内で維持される。ｍＲＮＡの供給源を調製する
ためにｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養による継代を行なう場合に
は、従来Ｔ細胞の生育を促進することが知られている培
地であればどのような培地にもこれら細胞は生育する。

これらの培地には哺乳動物の血清、血清成分または血清
アルブミンを添加しても良い。ｍＲＮＡの活性化のため
の培養時間は、ｍＲＮＡを生成するための活性化に必要
な時間に対応する。

この時間は、通常ＩＬ−２の培地中への産生が開始され
るまでに必要な時間と対応している。好ましい時間は、
マイトジェン等の刺激剤を添加してから３〜１２時間で
ある。培養時間が長すぎる場合、生成したＩＬ−２ｍＲ
ＮＡが分解されることがある。ＩＬ２産生細胞の活性化
に際し、ＰＭＡまたはＴＰＡの如きホルボールエステル
類を１０〜５０ｎｇ／ｍｌ添加して活性化レベルを上昇
させることもできる。

ＩＬ−２ｍＲＮＡ活性化のための上記工程はｐ）１７．
０〜７．４．温度範囲３２〜３８°Ｃの飽和水蒸気の環
境下で行なわれる。

ＩＬ−２を産生ずる哺乳動物細胞を取得し培養する方法
を以下に述べる。

（イ）ＩＬ−２自発産生株の取得 ヒトＴリンパ球由来白血病細胞であるジュルカット細胞
（フレッド・ハッチンソン・癌研究所／シアトル／アメ
リカ、ソータ研究所／サンジエゴ／アメリカ、西ドイツ
国立癌センター／ハイデルベルヒ／西ドイツ等で自由に
手に入る。）を１×１０６個／ｄの細胞密度でクリック
培地中に懸濁させ、１５０レントゲン／分の照射速度で
合計８．０００レントゲンのＸ線照射を行なう。この後
、本細胞を０．１細胞／２００μ！培地の細胞密度で９
６穴の平底マイクロタイタープレート（［フアシヨン３
０７２Ｊ）に添加し、５％牛脂児血清を含むクリック培
地中で３週間３７°Ｃにて５％ＣＯｚインキュベーター
中にて培養する（限界希釈法によるクローニング）。細
胞の生育が認められた培養ウェル中の細胞は、細胞が底
面全体をおおう密度に到達する前に２４穴のヌンク社製
培養プレートに移し、クリック培地中にて５日間細胞を
増殖させる。さらに、本細胞を１〜２Ｘ１０６個／　ｍ
ｌの細胞密度にて血清も血清由来アルブミンも含まない
無血清合成培地に懸濁して２日間培養し、本培養上清を
遠心分離操作で分離し、次いで０．２２μのミリポアフ
ィルタ−にてデブリス除去と無菌化を行なった。このよ
うにして得た培養上清のＩＬ−２活性を測定することに
よってＩＬ−２を自発産生ずるＸ線、処理変異株が選択
され、かつクローニングされた。

（ＩＩ）ヒト末梢血単核細胞よりＩＬ−２産生株の取得
ヒトの末梢血を採血し、フィコール・ハイバークの密度
勾配遠心法により末梢血リンパ球（以下、ＰＢＬと略す
）。を採取する。本ＰＢＬをｌＸｌ０”個／ｄの細胞密
度で５％ＦＣ５を含むクリック培地に懸濁し、各２ｄ宛
２４穴のヌンクの培養プレートに接種する。ここにフィ
トヘマグルチニン−Ｍ（ギブコ社製）を５μｇ／ｄの終
末濃度になるように１００μ！添加し、上述の条件下に
４８時間培養し、次いで細胞を培養液で洗浄し、再び１
×１０’個／　ｍｌの細胞密度でクリック培地１　ｍｌ
に接種する。さらに、コンカナバリンＡ（以下、Ｃｏｎ
Ａと略す。）２．５μｇｌｒｔｄで４８時間刺激したヒ
ト牌細胞から調製したコンディショニングした培地ｌｄ
を加え、該コンディショニングした培地５０％を含む培
地を３日毎に取り換えて、ＰＢＬからのヒトＴリンパ球
を長期継代培養する。このように長期継代培養して得た
Ｔリンパ球を、前述と同様の限界希釈法でコンディショ
ニングした培地に由来するヒト牌細胞の存在下、クロー
ニングを行ない、かつ同様に細胞増殖を行なう。こうし
て得られたクローン化１９７３球をｌＸｌ０”個／ｄの
細胞密度に１０μｇ／ｄのフィトヘマグルチニン（以下
、ＰＨＡと略す。）の存在下、２４穴のタンク培養プレ
ート中のＲＰＭＩ　１６４０培地１ＩＩｄｌに接種し、
２４時間、３７℃で７．５％ＣＯ，インキエベーター中
にて培養した０本培養上清を遠心分離操作で分離し、次
いで０．２２μのミリポアフィルタ−で無菌化を行なっ
た後、ＩＬ−２産生ヒト正常Ｔリンパ球クローンを同定
するために、ＩＬ−２活性検定を行なった。

（ハ）マイトジェン刺激でＩＬ−２を生産するヒトリン
パ球由来悪性化細胞の取得 前述のジュルカット細胞や前記した限界希釈法によりク
ローン化されたＪ−１１１株は、前記の無血清培地や血
清１〜２％を含むＢＰ旧１６４０培地中にてＣｏｎＡ　
　ｌ　Ｏｕ　ｇ／ｍｌやＰＩＩ４２．５　ｕ　ｇ　／ｄ
の存在下に２４時間培養すると、１０〜４．０００単位
／ｄのＩＬ−２を産生ずることができる。また、これら
ヒト悪性化細胞は塩化亜鉛、プロティンＡ。

ビシバニール存在下に培養しても、ＩＬ−２を産生ずる
。

（＝）他の細胞もしくはその細胞の産生ずる因子の存在
下にマイトジェンで刺激することにより■７−２を産生
ずる細胞の取得 ヒトリンパ球悪性化細胞Ｍｏ１ｔ　４　Ｆや前述の限界
希釈法でクローン化されたジュルカット細胞の１つのク
ローン、ジェルカット９９株は、上述のごときレクチン
やマイトジェンを広い濃度範囲で加えて２４〜７２時間
培養してもＩＬ−２を産生じない。ところが、この間モ
ノ力インの１種であるインターロイキンｌを５〜１０ｕ
／−または５０％のに５６２やラージ（Ｒａｊ　ｉ）細
胞を共存させて３７’Ｃ，２４時間培養すると、Ｉｌ、
−２を確認しうる量（１０−Ｌ　ＯＯｕ／ｘｉり産生す
る。

このようにして活性化された細胞よりＩＬ　−２ｍＲＮ
Ａを抽出するには、細胞の種類を問わず常法によって行
なえばよい。たとえば、ＮＰ　−４０、ＳＤＳ、Ｔｒｉ
ｔｏｎＸｌｏｏ、デオキシコール酸などの界面活性剤を
添加して細胞を部分的または完全に分解するか、ホモゲ
ナイザーや凍結融解などの物理的方法を用いて、細胞を
部分的あるいは完全に破壊、可溶化する。その際にＲＮ
ａｓｅによるＲＮＡの分解を防ぐために、抽出液中にＲ
Ｎａｓｅインヒビター、たとえばヘパリン、ポリビニル
硫酸、ベントナイト、マカロイド、ジエチルピロカーボ
ネート、バナジウム複合体などを添加しておくのが好ま
しい。また、場合に応じては、抗ＩＬ−２抗体を用いて
ＩＬ−２合成途上のポリゾームを沈降せしめ、これより
ｎ＋ＲＮＡを界面活性剤などで抽出する方法も行ない得
る。

また、ｐｏｌｉＡを含むｍＲＮＡの精製についてはオリ
ゴｄＴ−セルロース、セファロース２Ｂを担体とするポ
リＵ−セファロースなどのアフィニティ・カラムあるい
はバッチ法による精製法、　ＳＤＧ遠心法による分画、
アガロースゲル電気泳動法等によって行なうことができ
る。

上記の如くして得られたｍＲＮＡがＴＬ　−２ｍＲＮＡ
活性を有するものであることを確認するためには、ｌｌ
ＲＮＡを蛋白に翻訳させ、その生理活性を調べるか、抗
ＩＬ−２ペプチド単りローン性抗体を用い該翻訳蛋白を
同定する等の方法を行なえばよい。たとえば−ＲＮＡは
通常、アフリカッメガエル（７１ａｅｖｉｓ）の卵にマ
イクロインジェクションすることにより（Ｇｕｒｄｏｎ
ら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２３３．１７７〜１８２（１９
７２））あるいは網状赤血球または小麦胚無細胞翻訳シ
ステムを使用することにより対応する蛋白に翻訳される
。

ＩＬ−２活性は、先にＧ１１１ｉｓら（Ｇｉｌｌｉｓら
、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２０．２０２７〜２０３３（１
９７８））によって基本的には述べられているミクロ検
定法によって確認できる。この検定法では、Ｇ１１ｌｉ
ｓらによって確立された方法に従って作成した細胞障害
性Ｔリンパ球細胞株（以下、ＣＴＬＬと略す。）のＩＬ
−２に依存細胞のＤＮＡ合成上昇（ＩＬ　−２ｄｅｐｅ
ｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉ
ｏｎ）を指標としている。即ち、４Ｘ１０”個のＣＴＬ
Ｌ細胞を２％のＦＣＳを含むＩ？Ｐ旧−１６４０培地１
００μ２に懸濁し、１００μｌの連続希釈した翻訳産物
と共に９６穴の平底マイクロプレートに接種する。３７
°Ｃ，５％ＣＯ，下で２０時間培養した後、細胞を０．
５μＣｉ／ウエルの”Ｈ−ＴｄＲで４時間ラベルし、自
動細胞ハーベスタ−を用いて帯状ガラス繊維上に細胞を
回収し、細胞が取り込んだ放射能を液体シンチレーショ
ン法で測定する。

この検定により、ＩＬ−２存在下に培養されたＣＴＬＬ
細胞が投与量に依存して’Ｈ−ＴｄＲを取込むことが判
明し、このことから検体中に含まれるＩＬ−２量を明確
に計算することができる。

ＩＬ−２はＴリンパ球の増殖を促す活性を有するので、
ＩＬ−２活性をＴリンパ球の増殖を指標として測定する
ことができる。即ち、５個のＣＴＬＬ細胞を２％のＦＣ
Ｓを含むＤＭＥＭ　　１００μｌに懸濁し、１００μｌ
の連続希釈した翻訳産物と共に９６穴の平底マイクロプ
レートに接種する。７２〜９６時間、３７°Ｃ，５％Ｃ
Ｏｔ下で培養した後、活性化し増殖した細胞の数を顕微
鏡下で計測する。対照群として１００Ｕ／ｄ、ＩＯＵ／
ｄのＩＬ−２を用い、この対照群の増殖した生細胞数と
比較して検体のＩＬ−２活性を求める。

このようにして最も高活性の両分から得られたＩＬ−２
ｍＲＮＡはｄｓ−ｃＤＮ八を合成するための鋳型として
用い、ｄｓ　−ｃＤＮＡはベクターＤＮＡと結合させる
。

ｃＤＮＡの合成は従来の方法によって行なう。

まず、ｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴをプライマーと
してｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰの
存在下で逆転写酵素によりｍＲＮＡと相補的なｓｓ　−
ｃＤＮＡを合成し、アルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡを分解
除去した後、今度は単鎖ｃＤＮＡを鋳型にして逆転写酵
素あるいはＤＮＡポリメラーゼを用いてｄｓ−ｃＤＮＡ
を合成する。

このようにして得られたｄｓ−ｃＤＮＡと原核生物で複
製できるレプリコンを含むベクターＤＮＡから組み換え
ＤＮＮ棒体作られる。しかる後、この組み換えＤＮＡ体
は宿主細胞に組み込まれる。

このｄｓ−ｃＤＮＡ及び原核生物で増殖し得るベクタ−
ＤＮＡは、これらを結合させる前にエキソヌクレアーゼ
処理、化学合成りＮＡ断片の追加、ｄｓ−ｃＤＮＡやベ
クターＤＮＡの末端に連結可能な端末をつけるためにＧ
、Ｃ−鎖を伸ばすなど各種処理によって修飾される。こ
れらの連結可能なりＮＡは、例えばＡＴＰ共存下にＴ４
ファージのＤＮＡライゲースによってつぎ合せることが
出来る。

このようにして調製された組換え口Ｎ棒体によってクロ
ーン化されたｃＤＮＡを増巾させるため又はＩＬ−２ポ
リペプチドを製造するために生細胞を形質転換する。

ＩＬ−２生産のための適当な原核生物宿主としてはエシ
ェリヒア・コリ、バチルス・ズブチリスなどが含まれる
。宿主細胞中でのＤＮＡ増巾のためにはエシェリヒア・
コリを宿主とすることが出来るが、その他の宿主細胞と
することも出来る。

適当なエシェリヒア・コリ用ベクターとしてはＥＫ型プ
ラスミドベクター（ストリンゼント型）としてｐｓｃｌ
ｏｌ、　ｐＲに３５３．　ｐＲに６４６．　ｐＩｌに２
４８．　ｐＤＦ４１など、、ＥＫタイププラスミドベク
ター（リラックストタイプ）　　：　Ｃｏ１Ｅ１．　ｐ
Ｖ）１５１．　ｐＡｃ１０５．　Ｒ５Ｆ２１２４゜ｐｃ
Ｒｌ、　　ｐＭＢ９．　　ｐＢＲ３１３，ｐＢＲ３２２
，ｐＢＲ３２４，ｐＢＲ３２５゜ｐＢＲ３２７，ｐＢＲ
３２Ｂ、　　ｐＫＹ２２８９．　　ｐＫＹ２７００．　
　ｐＫＮ８０．　　ｐＫＣ？。

ｐＫＲ１５８，ｐＭＫ２００４．　ｐＡｃＹｃｌ、　ｐ
ＡｃＹｃｌ、８４．　ｄｕｌ等、Ｉλｇｔタイプファー
ジベクター：λｇｔ、λＣ１λｇｔ、λＢ。

λ−ＢＳ、λＣ１λＷＥＳ、λＢ、・λＺＪｖｉｒ−＋
　　λＢ＋、λＡＬＯ，λＢ。

λ畦Ｓ、Ｔｓ６２２．λＤａｍ等が含まれている。一般
に、ｐＢＲ３２２はエシェリヒア・コリ用ベクターとし
てしばしば利用されてきたが、この場合最も良いクロニ
ング部位はＰｓｔｌならびにＥｃｏＲ１部位である。

組換えＤＮＡ体を用いた宿主細胞の形質転換には、通常
よく用いられる次の方法がある。エシェリヒア・コリの
如き原核生物が宿主の場合、このＤＮＡを取り込むこと
の出来るコンピテント細胞は対数増殖期における細胞を
回収後、良（知られているＣａＣ１ｚ法によって形質転
換出来る。形質転換反応液中にＭｇ（、ｅ、又はＲｂＣ
ｆを共存させれば形質転換効率は向上する。また、宿主
細胞のプロトプラスト調製後形質転換させることも可能
である。

ＩＬ−２遺伝子を保有する細胞は、次の２つの方法の何
れかを用いて形質転換後分離可能である。

（１）プラス−マイナス法：抗原刺激した哺乳動物細胞
抽出液より蔗糖密度勾配遠心分離にて１ｌ−１２Ｓ画分
として部分精製したＩＬ　　２　ｍＲＮＡを調製し、こ
の部分精製ｍＲＮＡを鋳型として３Ｚｐ−放射性５ｓ−
ｃＤＮＡを合成する。アルカリ処理にて鋳型ｍＲＮＡを
除去後、単離されたｃＤＮＡは、抗原刺激しない哺乳動
物細胞から抽出され、部分精製した１１−１２　ＳｍＲ
ＮＡでハイブリダイズする。引続いてハイブリダイズし
なかったｃＤＮＡとハイブリダイズしたｃＤＮＡはハイ
ドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで分画す
る。ハイブリダイズしなかったｃＤＮＡとハイブリダイ
ズしたｃＤＮＡをそれぞれプローブＡ、及びプローブＢ
と呼ぶ。何れの組換え体も同一の方法によりそれぞれニ
トロセルロース濾紙上で生育させる。そして、細胞のＤ
ＮＡをアルカリ処理にて濾紙上に固定する。プローブＡ
及びＢをそれぞれ、二つの異った濾紙上でＤＮＡとハイ
ブリダイズさせる。その後、オートラジオグラフィーを
行ってプローブＡと陽性に反応する組換え体（プラス）
、プローブＢと僅か又は全熱反応しない組換え体（マイ
ナス）を選別する（呑口ら；　Ｐｒｏｃ。

Ｊａｐ、＾ｃａｄ、、　Ｖ１５５Ｂ　　４６４〜４６９
（１９７９）。

（２）第２の方法は、例えば１０００〜ｉｏ、ｏｏ。

の組換体クローンを２〜３０ないし２〜３００クローン
宛のクローングループに大別し、それぞれのクローング
ループをそれぞれ常法によって培養しプラスミドＤＮＡ
５を調製する。次いで、これらプラスミドＤＮＡ５を例
えば熱変性してｓｓ　−ｃＤＮＡをニトロセルロース濾
紙上に固定し、活性化ＩＬ−２−ｍＲＮＡを含有する哺
乳動物細胞から調製されたｍＲＮＡと相補的にハイブリ
ダイゼーションを行う。あるいはまた、ＩＬ−２ｍＲＮ
Ａを含有するｍＲＮＡ　（混合物）を熱変性したプラス
ミドＤＮへ（混合物）とハイブリダイズさせるとＤＮ八
−ｍＲＮＡハイフ゛す・ンドがニトロセルロース濾紙上
に固定される。この濾紙を１ｍＭのＨＥＰＥＳ、あるい
はｌｏｍＭの食塩水のごとき低塩類緩衝液で洗浄し、濾
紙上に吸着されたｍＲＮＡを０．５ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡ；
０．１χＳＤＳ溶液含有液で例えば９５°Ｃ１１分間処
理して抽出する。精製ｍＲＮＡはこれをｏｌｉｇ。

ｄＴ−セルロースカラムクロマトグラフィーにて？吉川
回収する。次いで、ｎ＋ＲＮＡをアフリカッメガエル卵
母細胞にマイクロインジェクションして蛋白質に翻訳し
てＩＬ−２活性を確認する。あるいはｎ＋ＲＮＡに依存
性の網状赤血球系又は小麦胚のｉｎ　ｖｉｔｒｏ無細胞
合成系を用いてこのｍＲＮＡを蛋白に翻訳させ、抗ＩＬ
−２抗体を用いてＩＬ−２−活性を分析することが出来
る。これらの方法によってＩＬ−２活性が検出されたグ
ループをさらに少数の組換え体クローンを含有する群に
類別し最終的にはＩＬ−２ＤＮＡを有する単一クローン
が得られるまで繰返し実施する。

ＩＬ−２産生能のある組換え体よりＩＬ−２ポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡを得るには、先ずトランスフォ
ーマント中の組換えＤＮＡ体を分離し、これを制限酵素
エンドヌクレアーゼで切断する。切断によって得られる
ＤＮＡ分画より組込まれたｃＤＮＡ画分を分離する。

ｐｌＬ−２−５０Ａを組換えたＤＮＡよりＩＬ−２ポリ
ペプチドをコードするＰｓｔｌ　ＤＮＡインサートの全
ヌクレオチド配列は、Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅ
ｒｔ法（Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍ、　６５．４９９〜５６０．　（１９８０）
）；ならびにニブオキシヌクレオチド鎖末端法（Ｓｍｉ
ｔｈ、＾、　Ｊ、　Ｍ、　Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍ、　６５．５６０〜５８０．　（１９８０）
　）にて決定された。

ｃＤＮ八イフィンサート限酵素エンドヌクレアーゼによ
る切断図を第１図及び第２図（ａ）に示す。第２図（ａ
）に示すごとく、このｃ　Ｄ　Ｎ　ＡはそれぞれＢｓｔ
Ｎｌ、　Ｘｂａ　Ｉ　、　ＢｓｔＮ　Ｉなる制限酵素エ
ンドヌクレアーゼで切断される構造を有する。

本ｃＤＮＡインサートのＤＮＡ配列は一つの大きなオー
プンリーディングフレームを保有する。真核生物の読み
取り開始配列となることの多い第一のＡＴＧ配列（Ｋｏ
ｚａｋ、　Ｍ、　Ｃｅ１１．１５．１１０９〜１１２３
（１９７Ｂ）　）は、５゛〜端から４８−５０ヌクレオ
チド位に存在し、読み終り配列ＴＧＡが存在するヌクレ
オチド位５０７−５０９迄１５２の配列がこのＡＴＧに
つながっている。ｍＲＮＡの３’−ｐｏｌｙ（八）末端
に相当するＡのつながりがｃＤＮＡ末端に見出され、通
常真核生物ｍＲＮへのほとんどに見出される６個からな
るヌクレオチドＡＡＴＡＡＡ　（７７１−７７６位）が
先に位置する。

（ＰｒｏｕｄｆｏｏＬ、　　Ｎ、Ｊ、　　＆　Ｂｒｏｗ
ｎｌｅｅ　Ｃ，Ｇ、、　　Ｎａｔｕｒｅ　’１Ｊ２４゜
２１１−２１４．（１９７６）） ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列は第２図（
ｂ）（アミノ酸配列１）のごとく演えきでき、しかもア
ミノ酸配列Ｉのポリペプチドは１５３個のアミノ酸から
なり、その分子量は１７６３１．７ダルトンと計算され
る。今日迄知られている分泌蛋白の殆んどに見られると
報告されているように（ＢｌｏｂｅｌＧ、　ｅｔ　ａｌ
、　Ｓｙｍ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｍａｄ、、　３３
．９〜３６（１９７９））。

上記演えきＩＬ−２ポリペプチドのＮ末端領域はやはり
疎水性である。本領域は成熟ＩＬ−２の分泌時に切断さ
れるシグナルペプチドの役割を果しているであろう。切
断は２０−２１位のＳｅｔとＡｌａ間で起るか２１−２
２位間のＡｌａ−Ｐｒｏ間で切断され、アミノ酸配列■
および■を有するポリペプチドを生成する。何故ならば
同様な切断位置は今迄知られたその他の分泌蛋白にもし
ばしば見出されているからである（Ｂｌｏｂｅｌ、　Ｇ
、　ｅｔ　ａｌ、　Ｓｙｍｐ、　Ｓｏｃ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、、　３３．９〜３６（１９７９））、従って、
成熟ＩＬ−２ポリペプチドは１３３ないし１３２個のア
ミノ酸から成り、分子量は１５４２０．５または１５３
４９．４ダルトンと算出される。本分子量値はジュルカ
ット細胞から得られたヒ目Ｌ−２蛋白の分子量（１５０
００ダルトン）として報告されたものを対比される（Ｇ
ｉｌｌｉｓｅｔ　ａｌ、、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　Ｒｅｖ、＋　６３＋　６７〜２０９（１９８２））
。

また実施例３に示すごとく塩基配列１１１〜１１３位に
あるＣＣＴ配列から始まるＤＮＡ画分、即ち、２２位に
位置するＰｒｏから始まるポリペプチドに対するコード
（第２（ｂ）図中のアミノ酸配列■）はＩＬ−２活性を
有するポリペプチドを表現していることが確認された。

塩基配列１０７〜１１０位にあるＧＣＡから始まるＤＮ
Ａ画分、即ち第２（ｂ）図のアミノ酸配列■に示すごと
く、２１位に位置するＡｌａから始まるポリペプチドを
コードするＤＮＡ画分は、実施例６に示すごと＜ＩＬ−
２活性を有するポリペプチドを表現していることが確認
された。

有核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子でも知
られている様に多形現象を示すことが知られている（呑
口ら、　Ｇｅｎｅ　１０．１１〜１５（１９８０）。

大野、呑口、、　Ｐｒｏｃ、　Ｍａｄ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７７５３０５〜５３０９（１９８１
）；　　Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、　　Ｎａｔｕｒｅ　２
９５゜ｔｏ７〜５０８　（１９８１））。この多形現象
によって、蛋白生産物のアミノ酸のあるものが置換され
る場合もあれば、塩基配列の変化はあっても全く変らな
い場合もある。ヒトＩＬ−２・ｃＤＮＡの場合、ｐｒＬ
−２−５０八ｃＤＮＡの５０３位のＡ１Ａ基がＧ残基で
置き換えられた他のｃＤＮＡクローン（ｐ　Ｉ　ｌ、−
２−５０３）も検出できる。

ｐｌＬ−２−５ＱＡ　ｃＤＮＡとは塩基配列が異なるそ
の他のｃＤＮＡクローンの存在も期待できる。

上記説明からも明らかなごとく、本発明の遺伝子は、第
２（ａ）図に示された塩基配列を有するＤＮＡ　。

４８−５０位のＡＴＧ配列から始まり、５０４〜５０６
位にある少くともＡＣＴ配列に至る連続塩基配列を有す
るＤＮＡ５．１０８−１１０位のＧＣＡ配列から始まり
、ＧＣＡ配列から少くともＡご汀配利に至る連続塩基配
列を有するＤＮＡ、また１１１−１１３位のＯＣＴ配列
から少くともＡ（、Ｔ配列に至る連続塩基配列を有する
［ｌＮＡを包含する。本発明の遺伝子はまた、５０４〜
５０６位のＡＣＴ配列に終り、１位のＡに始まるＤＮＡ
　、　４８−５０位のＡＴＧで始まるＤＮＡ、１０Ｂ−
１１０位のＧＣＡ配列で始まるＤＮＡ又は１１１−１．
１３位のＣＣＴ配列で始まるＤＮＡを包含する。

更に本発明の遺伝子は、５０７〜５０９位のＴＧＡ配列
に終り、１位のＡに始まるＤＮＡ、４８〜５０位のＡＴ
Ｇ配列で始まるＤＮＡ、１０８〜１１０位のＧＣＡ配列
で始まるＤＮＡまたは１１１−１１３位のＯＣＴ配列で
始まるＤＮＡを包含する。更に本発明の遺伝子は、８０
１位のＣで終り、１位のＡで始まるＤＮＡ、４８〜５０
位のＡＴＧで始まるＤＮＡ。

１０８−１１０位のＧＣＡで始まるＤＮＡまたは１１１
−１．１３位のＣＣＴ配列で始まるＤＮＡを包含する。

本発明の遺伝子はまたｐｏｌｙ（Ａ）で終り、４Ｂ−５
０位のＡＴＧ配列から始まるＤＮへ、　１０８４１０位
のＯＣＡ配列で始まるＤＮＡまたは１１１−１１３位の
ＣＣＴ配列で始まるＤＮＡを含む。また、本発明の遺伝
子は、アミノ酸配列ｒ、ｎ、ｍに相当する塩基配列を有
する遺伝子を含む。アミノ酸配列Ｉの中で１個ないしそ
れ以上のアミノ酸を欠くポリペプチド、あるいはアミノ
酸配列Ｉの中の１個ないしそれ以上のアミノ酸が１個な
いしそれ以上のアミノ酸で置換されたポリペプチドはＩ
Ｌ２活性を有することもあり、従ってこの様なポリペプ
チドをコードする遺伝子は本発明の遺伝子として使える
。同様にアミノ酸配列ＬＩＩまたは■に対して１個ない
しそれ以上のアミノ酸を表現し得る１個ないしそれ以上
の塩基を余分に結合した遺伝子であっても追加されたア
ミノ酸が、ポリペプチドのＩＬ−２活性発現に邪魔しな
い限り本発明の遺伝子の中に包含される。ＩＬ−２とし
てのポリペプチド機能を阻害する追加アミノ酸配列を有
する修飾領域であっても新たに追加された領域が容易に
除去出来るものならば本発明の遺伝子として利用出来る
。同じことはアミノ酸配列Ｉ、　　ＩＩおよび■に対応
する遺伝子のアミノ酸配列１．ＩＩおよび■のＣ−末端
にアミノ酸追加をコードするＤＮＡが３゛−末端に追加
結合せしめたＤＮＡの場合にも言える。上記の如くして
得られた本発明の遺伝子を利用してＩＬ−２を生産する
には、まず本発明の遺伝子を含有する組換えＤＮＡ体を
作り、次いで該組換えＤＮＡ体により宿主細胞を形質転
換し、該形質転換された生物細胞を培地で培養すればよ
い。

住細胞中でＩＬ−２産生をする組換えＤＮＡ体は、次の
各種方法で作られる。例えば、ＩＬ−２・ｃＤＮＡをコ
ードする配列を発現ベクターのプロモーター配列下流に
挿入する。あるいはプロモーター配列を持つｃＤＮＡ片
を発現ベクターのｃＤＮＡ挿入の前あるいは後にＩＬ−
２をコードする配列の上流に挿入することが出来る。

ＩＬ−２−ｃＤＮＡを発現し、ＩＬ−２−ポリペプチド
を産生ずる原核生物の造成法を詳述すれば以下の通りで
ある。

（１）エシェリヒア・コリによるＩＬ　　２−ｃＤＮへ
の発現 エシェリヒア・コリ中でＩＬ−２−ｃＤＮＡを発現させ
るには、先ずｃＤＮＡを各種細菌プロモーターと結合せ
しめた後、プロモーター下流にｃＤＮＡを含有するバイ
ブリドプラスミドを作る。このプラスミドを、例えばエ
シェリヒア・コリＨＢＩＯＩに感染させ、ヒトＩＬ−２
活性を有する蛋白を生合成する細菌がクローンされる。

本来細菌のプロモーターならば如何なるものでもｃＤＮ
Ａに適当に接続されていればＩＬ−２−ｃＤＮＡを発現
する。この様なｃＤＮＡの発現例は以下のとおりである
。

１Ｌ−２をコードするクローン化ｃＤＮＡは第２図に示
される様な１５３個のアミノ酸からなるポリペプチドを
コードする。本ポリペプチドの２０個のアミノ酸に相当
するＮ−末端領域は極めて疎水性であり、殆んどの分泌
蛋白の特徴でもある。この様な疎水性配列はシグナル配
列と称し分泌過程で切断される。故に、成熟Ｉし一２ポ
リペプチドは、１５３個のアミノ酸より少ない筈である
。このことから、成ＰＩＬ−２ポリペプチドをコードす
るｃＤＮＡ部分を発現させることが望ましく、ＩＬ−２
シグナル配列相当部分を発現させるのは望ましくはない
。

（ｉ）　　プラスミドベクターｐＴｒＳ−３の構築ρＴ
ｒＳ−３は、エシェリヒア・コリＴｒｐプロモーターを
含み、ｐＴｒＳ−３のリーダーペプチドのためのリポソ
ーム結合部位（ＳＤ配列）は既に報告されている（Ｇ、
　Ｍｉｏｚｚａｒｉ　ａｎｄ　Ｙａｎｏｆｓｋｙ　Ｊ、
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３３＋１４５７〜１４６６
　（１９７８）　）、ＳＤ配列の下流１３塩基対にある
ＡＴＧコードンの存在も報告されている（Ｎｉｓｈｉ　
ｅｔａｌ、生化学５４．　Ｎ（１８，６７６（１９８２
））。このプラスミドベクターはまた、ＡＴＧ開始配列
（第３図）の下流に一つのｓｐｈ　　１部位を含んでい
る。

ＩＬ−２・ｃＤＮＡを発現させるため、先ずプラスミド
をＳｐｈ　　Ｉで消化しエシェリヒア・コリＤＮＡポリ
メラーゼＩ　（フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント
）または、バクテリオファージＴ４０Ｎ＾ポリメラーゼ
Ｉで処理し３゛−位突き出し末端を除去する（第４図（
ａ））。プラスミドｐｌＬ−２−５ＯＡをＰｓｔ　　Ｉ
および）ＩｇｉＡ　Ｉで２回消化し、より大きいｃＤＮ
Ａ画分を単離する。

次いでＤＮＡをエシェリヒア・コリＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ　（フレノウフラグメント）又はバクテリオファージ
Ｔ４　ＯＮＡポリメラーゼで処理して３′−突き出し末
端を切りはなす。この処理をしたｃＤＮＡは１３２個の
アミノ酸のＩＬ−２ポリペプチドをコードする（第４（
ａ）図）。このｃＤＮＡを上述のごとく前処理したｐＴ
ｒＳ−３プラスミドＤＮＡに結合せしめ、ＡＴＧ開始コ
ードンをＩＬ　−２ｃＤＮＡのＣＣＴ　（Ｐｒｏ）配列
につなぎ合せる。こうしてプラスミドｐＴ　［Ｌ−２−
２２が得られる。Ｔｒｐプロモーター配列とｐＴ　ＩＬ
−２−２２のＩＬ−２ｃＤＮＡ配列の結合は第４（ａ）
図に示す。

プラスミドｐＴ　ＩＬ−２−２２はエシェリヒア・コリ
によりプロリンから始まる１３２個のアミノ酸からなる
ＩＬ−２ポリペプチド合成を指令する。

（ｉｉ）成熟ＩＬ−２はプロリンの代りにＮ　−末端ア
ミノ酸としてアラニン（２１位）を含むこともあり、１
３３個のアミノ酸から成るｒＬ−２ポリペプチド合成を
指示するプラスミドを以下の如く作ることができる。

プラスミドｐＴｒＳ−３はＳＤ配列とＡＴＧ配列との間
に１つのＣ１ａ　Ｉ切断部位がある（第３図）。本プラ
スミドはＣｌａ　　ＩとＳａｔ　　Ｉで切断される。プ
ラスミドｐｌＬ−２−５ＯＡをＰｓｔ　　Ｉで部分分解
し、エシェリヒア・コリＤＮＡポリメラーゼＩで処理し
、最も長い［］ＮＡを単離する。次いでＩＩＮＡを制限
酵素Ｘｈｏ　　Ｉ切断部位を含む合成りＮＡリンカ−と
結合させ、ＩＬ−２をコードする配列の３゛−側下流に
ＤＮＡリンカ−を導入したプラスミドｐｌＬ−２−５Ｏ
Ａ（Ｘｈｏ）を含むクローンを単離する。プラスミドｐ
ｒＬ−２−５ＯＡ　（Ｘｈｏ）を先ずＨｇ１Ａ　Ｉで切
断し、エシェリヒア・コリ　フレノウフラグメントまた
はＴ４　ＤＮΔポリメラーゼで処理し、Ｘｈｏ　　Ｉで
消化すればｃＤＮＡ画分が単離できる。

このｃＤＮＡフラグメントをＣ１ａ　　ＩおよびＳａＩ
　　Ｉで前処理したｐＴｒＳ−３ＤＮＡに結合させ第４
（ｂ）図の如く合成りＮＡにつなげる。かくしてＡｌａ
からスタートする１３３個のアミノ酸から成るＩＬ−２
ポリペプチドをエシェリヒア・コリ中で合成させるプラ
スミドｐＴＩＬ−２−２１が得られる。（第４（ｂ）図
）。同様なことはＸｈｏ　　Ｉリンカ−を使用しなくと
も作られる。

（ｉｉｉ　）異ったＮ−末端アミノ酸を有する異った大
きさのＩＬ−２ポリペプチドはｐＴｒＳ−３発現プラス
ミドベクターを用いても作られる。以下に示すごとく、
ｐｌＬ−２−５ＯＡにクローンされたＩＬ−２ｃＤＮＡ
はヌクレオチド結合部位８１−８５に唯一つだけＤｄｅ
　　１部分を有する。プラスミドｐｌＬ−２−５０＾（
Ｘｈｏ）を、Ｄｂｅ　　Ｉで切断し、ｃＤＮＡのより大
きい区分を含有するＤＮＡ画分を単離する。本画分はｐ
ＢＲ３２２より３０００塩基対を有するＤＮＡを含んで
いる（第４（ｃ）図）。

ＤＮ八へ分をエクソヌクレアーゼＢａｌ　３１で処理し
、次いでＸｈｏ　　Ｉで切断する。ここで得られたＤＮ
Ａをｓｐｈ　　Ｉで切断したｐＴｒＳ−３と結合せしめ
、Ｋｌｅｎｏ−フラグメントまたはＴ４　ＤＮＡポリメ
ラーゼで処理し次いでＳａｔ　　Ｉで消化する（第４（
ｃ）図）。つなぎ合せたＤＮＡをエシェリヒア・コリＨ
Ｂ　１０１に感染させ、ヒ）ＩＬ−２を発現するクロー
ンを検索する。これらのクローンは色色な大きさのヒ目
Ｌ−２を発現する筈である。何故ならばヒトＩＬ−２の
Ｎ−末端領域に相当するＤＮＡは種々切断除去されるか
らである。か（してＩＬ　　２　ｃＤＮＡを含有するｐ
ＴＩＬ−２−１４と１５が得られる。

（ｉｖ）　ＩＬ−２ｃＤＮＡはまたｐＫＴ　２１８　（
Ｔａｌｍａｇｅより提供を受けた；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

７７、　Ｐ、３３６９〜３３７３（１９８０））を用い
ても発現可能である。プラスミドｐＫＴ　２１８はＰｓ
ｔ　　Ｉで切断し、ｐｒｔ。

２−５０八をＨｇ１Ａ　ＩとＰｓｔ　　Ｉで切断（第５
図）して得たＩＬ　　２　ｃＤＮＡ挿入部分とつなぎ合
わせる。出来上ったプラスミドｐＫＩＬ−２−２１は第
５図に示したように、蛋白合成開始の始発位に配列を有
している。

したがって、このプラスミドｐＫＩＬ−２−２１はＩＬ
−２の１３３個のアミノ酸とβ−ラクタマーゼのアミノ
酸からなる両者が融合したポリペプチドからなり、これ
をエシェリヒア・コリ中で合成することが出来る筈であ
る（最初のメチオニンはエシェリヒア・コリでは切断除
去される）。

（ｖ　）　ｐ−ＢＲ・３２２にｔｕｆＢに対するプロモ
ーター配列を挿入したプラスミドｐＴｕＢｌｐ−５の発
現は既に行なわれている（呑口ら、生化学５３９６６（
１９８１））。

このプラスミドは一つのＣ１ａ　　Ｉ切断部位を含み、
第６図に示すごとく本切断部位はＳＤ配列の２塩基対だ
け下流に位置する。ｐＴｒＳ−３もまたＳＯ配列とＡＴ
Ｇ始発配列の間にある一つのＣ１ａ　　Ｉ切断部位を含
み、同時にこのＣ１ａ　　１部位はｐＴｒｓ−３とＩＬ
−２ｃＤＮＡを用いて発現用プラスミドを作る過程で壊
されないので細菌ＴｒｐプロモーターをｔｕｆＢプロモ
ーターで置き換えることは極めて簡単である。従ってヒ
トＩＬ−２ｃＤＮＡはｔｕｆ１１プロモーターの制御下
で発現される。例えばｐＴｒＬ−２−２２をＣ１ａ　　
ＩとＰｖｕ　Ｕで切断し、ＩＬ−２ｃＤＮ八を含むＤＮ
Ａ画分を分離する。

次いでこの両分をｐＴｕＢＩＰ−５でつなぎ合わせ、Ｃ
１ａ　　ＩとＰｖｕ　Ｕで予め切断後、第６図に図示さ
れる様にプラスミドｐＴｕｌＬ−２−２２が造成される
。ＩＬ−２活性はプラスミドｐＴｕｌＬ−２−２２を含
むエシェリヒア・コＩＪＨＢＩＯＩの抽出液に検出でき
る。

（ｖｉ）例えばｐＴＩＬ−２−２１を使っても、また基
本的にはｐＴｒＳ−３を用いて達成したすべての発現用
プラスミドを用いることによっても同様に造成できる。

また例えばｐＴｕｌＬ−２−２２をＣ１ａ　　Ｉで切断
し、Ｂａ１３１またはＳＩまたはＤＮＡポリメラーゼＩ
　（エシェリヒア・コリ）にてＤＮＡの塩基対２−３個
を除去または補充し再度プラスミドをつなげることによ
ってＳＤおよびＡＴＧ配列の距離を至適の長さにするこ
とも可能である。

次いで、組換えＤＮＡ体を挿入したエシェリヒア・コリ
、バチルス・ズブチリスの如き形質転換された原核生物
細胞を培養して組換えＤＮＡ体を増巾し又はＩＬ−２ポ
リペプチドを生産する。この培養は通常の方法で行なわ
れる。

細胞内または細胞外に生産されたＩＬ−２は硫安沈澱、
塩類除去のための透析（常圧または減圧下）。

ゲル濾過、クロマトグラフィー、等電点平板上濃縮、ゲ
ル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（以下１１Ｐ
ＬＣと略記）、（イオン交換、ゲル濾過並びに逆相クロ
マトグラフィー）、及び色素結合担体、ＩＬ−２に対す
るモノクローナル抗体を結合した活性化セファロース４
Ｂ又はレクチン結合セファロース４Ｂ等によるアフィニ
ティクロマトグラフィー等、公知の方法によって回収す
ることができる。

ＩＬ−２の単離精製法はｗａ　ｔｓｏｎら（Ｊ、　Ｅｘ
ｐ、　Ｍｅｄ、。

１５０、８４９−８６１（１９７９）、　Ｇ１１ｌｉｓ
　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１２４、１９５４−１９６２（１９８０）、　Ｍｏｃｈ
ｉｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　、１４１８５−２
０１（１９８０）、　Ｗｅｌｔｅ。

Ｋ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｋｘｐ、　Ｍｅｄ、、　ｊル
４５４−４６４（１９８２））によって報告されている
。

かくして得られたポリペプチドはマイトジェン刺激によ
って哺乳動物細胞から作られるＩＬ−２について知られ
ているものと同一の生化学的並びに生物学的挙動を示し
ＩＬ−２活性を有する。分子量は約１５０００ダルトン
でありＩＬ−２活性は、Ｉｇｓｏｒｂ（Ｅｎｚｙｍｅ　
Ｃｅｎｔｅｒ）の様な免疫吸着剤の有無にかかわらず完
全に中和され、またはモノクローナル抗！Ｌ−２抗体で
沈澱した。免疫電気泳動において、ＩＬ−２ポリペプチ
ドは、対応する抗ＩＬ〜２抗体に対して唯１個の沈降線
を示す。ＩＬ−２活性は２−メルカプトエタノールで還
元後も安定であり、ＤＮＡ５ｅ及びＲＮＡ５ｅ処理して
も、又５６’Ｃ，３０分熱処理しても安定である。活性
はｐＨ２〜９で安定である。この様にして生産されたＩ
Ｌ〜２はモノクローナルな機能を有するＴ細胞（細胞障
害性Ｔリンパ球）の増殖を促進し、胸腺細胞の分裂を強
め、更に抗原非存在下、メモリー状態から抗癌特異的細
胞障害Ｔリンパ球への分化を惹き起こす、また、ＹＡＣ
−１細胞やＲＬ　　１細胞に対するナチュラルキラー細
胞の活性化の増強に役立つ。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例１ （１）　　ヒトＴ細胞系白血病細胞株であるジュルカッ
ト細胞（日本、西独および米国では自由に入手可能であ
る）をＪＯ％ＦＣ５を含むＲＰ旧１６４ｏ培地にけん濁
し、Ｘ線照射装置Ｅｘｓ　１５０／３００−４（東芝・
日本）により５０秒間、室温で１０，０００レントゲン
に達するまで照射した。その後照射された細胞は上述の
培地中、初期細胞密度ｌＸｌ０’個／　ｍｌで５％炭酸
ガス、３７℃のインキュベーター中で５日間培養した。

この変異細胞（０，２個／穴）を９６穴の平底のマイク
ロプレートの１０穴にまき、５％炭酸ガス、３７°Ｃの
インキュベーター中で２１日間培養した。

生育してくる穴から得られるクローンはクローン量を増
加させるため新たな培地へ移し、その増加したクローン
はＣｏｎＡ　　５０　ｕ　ｇ／　ｔｉｌｌ存在下で初期
細胞密度ｌＸｌ０６個／ｄで２４時間培養した。そして
ＩＬ−２活性は前述の方法に従って測定した。

この結果、ジュルカット−１１１（ＡＴＣＣＣＩ？Ｌ８
１２９）　（以後“Ｊ−１１１”と称する）と命名され
たヒトＴ細胞株が親株のジュルカットからクローン化、
選択され、この細胞のＩＬ−２産生能は親株の４０倍に
増加していた。

このクローン化したＪ−１１１細胞株は通常条件下で増
殖し、その増殖速度は通常のジュルカット細胞とほとん
ど同じであった。

（２）Ｊ−１１１細胞（ＩＸＩＯ’個／　ｍｌ　）を無
血清合成培地ＲＩＴ　Ｃ５５−９（Ｓａｔｏ、　Ｔ、　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｘｐ。

Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、　■、　１２７−１３４．　（１
９８２））　１０００ｄに接種し、ローラー培養ボトル
（フアシヨン３０２７）内で３７°Ｃ，４日間培養し、
増殖した細胞を遠心分離により取得した。この細胞を再
び４Ｘ１０”個／　ｍｌとなるよう上述のＣｏｎＡ　２
５μｇ／１ｒｒ１含有培地に接種した。ローラー培養ボ
トル（フアシヨン）４バツチの各々に細胞を接種した培
養液１ｏｏｉを入れ、６時間回転培養した。

（３）　　このようにＣｏｎＡ　２５μｇ／ｒｔｄｌで
６時間刺激したジュルカット細胞（１，２Ｘ１０’）は
生理食塩−リン酸緩衝液（以後ＰＢＳと略す）　８，０
００ｄに懸濁した。この細胞は遠心操作により２回洗浄
し、ヌクレアーゼ阻害剤であるリボヌクレオシドーバナ
デイル複合体（１０ｍＭ）を含有するＲ　Ｓ　ａ　溶液
（１０ｍｌトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７，５，１０ｍＭ
　ＮａＣ１，１、５ｍＭ　Ｍｇ（ｆ！　ｚ）　８ＧＯｍ
ｌに再懸濁した。その後、界面活性剤ＮＰ−４０を最終
濃度０．０５％となるように加え、ゆっくり混合し、細
胞核を３．０ＯＯｒｐｒａ、５分、４　”Ｃ下で遠心し
分離した。５Ｏ３（０，５％）及びＥ！ＤＴＡ　（５ｍ
Ｍ）を上清液へ加え、細胞質ＲＮＡを上清液と同量のフ
ェノールを加え抽出した。フェノールによる抽出を３回
繰返した後、ＲＮＡは２倍量のエタノールにより沈澱さ
れ、本沈澱物を遠心により集め、ｐＨ７，５の１０ＩＩ
ＩＭトリスー塩酸に溶解した。得られたＲＮＡ　ｉは１
９６■であった。

ｍＲＮＡの分画はオリゴ（ｄＴ）　−セルロース（Ｐ、
　Ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｔｙｐｅ　？）のアフィ
ニティークロマトグラフィーを使用し行った。吸着液は
２０ｍＭトリス−塩酸、０．５　Ｍ　ＮａＣ１！、ｌ　
ｍＭ　　ＥＤＴＡ及び０．５％ＳＤＳを含むｐＨ７，５
の溶液であり、溶出はカラムを緩衝液（２０ｍＭ）リス
−塩酸、ｐ）１７．５．０、５Ｍ　ＮａＣｊ！、　１ｍ
Ｍ　Ｆ！ＤＴＡ）で洗浄後、水と１０ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ７，５）で交互に行った。溶出により得られたｍ
ＲＮＡは３．６■であった。次にこの得られたｍＲＮＡ
　２．４■を蔗糖密度勾配遠心法（５０ｍＭ　　トリス
−塩酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．２　　Ｍ　ＮａＣｎ
を含むｐＨ１，５の溶液中で蔗糖密度勾配５−２５％、
２６．０００ｒｐｍで４°Ｃ下２４時間）により分画し
た。ｍＲＮＡの１１から１２３が分画Ｎｏ、１２．１３
、ｌ４へ分画され、各々５９μｇ、４６μｇ、６０μｇ
であった。

（４）ｌ！１１３の分画に得られたｍＲＮＡをアフリカ
ッメガエル７　ｂ！１校の卵母細胞へ注入した（５０Ｈ
ｇ　ｉＲＮ＾／卵母細胞）、この卵母細胞の培養液をＩ
Ｌ−２活性測定した。表１に示す如く、３）（−チミジ
ンＣＨ−ＴｄＲ）の取込みの上昇及び活性化Ｔリンパ球
数の増加が確認され、明らかにこの分画中のｍＲＮＡは
ヒ目Ｌ−２ｍＲＮＡを含んでいる事が立証された。

表１ （ａ） 分画１３の翻 訳生成物 ｘ８　　　　　１４．６８３　　　３２ｘ３２　　　　
　１０．１６５ （ｂ） 分画１３の翻　　Ｘ２　　　　１１５　　　４０訳生成
物　　　　Ｘ１６　　　　　５５＊　単位は標準ＩＬ−
２（１０単位／ｄ）の”Ｈ−ＴｄＲ取込み量と比較する
事により算出した。

（５）その後ＩＬ−２ｍＲＮＡを含む１１〜１２Ｓ　ｍ
ＲＮＡのＮα１３分画からｉｎ　ｖｉｔｒｏでｃＤＮＡ
を合成した。

組換え体ＤＮＡはプラスミドベクターｐＢＲ３２２と構
成した。組換え体ＤＮＡをエシェリヒア・コリに形質転
換し、ＩＬ２ｃＤＮ＾クローンを獲得したクローンを以
下に示す如き方法により選択した。

（５−１）　５０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
５）、３０ｍＭ　ＮａＣｌ、６ｍＭ　ＭｇＣｆｆ１．　
、５ｍＭジチオスレイトール（以後ＤＴＴと略す）、０
．５ｍＭの各ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、　ｄＴ
ＴＰ　（ｄＣＴＰは！ｐ放射標識したものを含む）、０
．７Ｈｇオリゴ（ｄＴ）　＋　ｏ、１０μｇ　ｍＲＮＡ
及び１５単位ＡＭＶ逆転写酵素（Ｊ、　Ｗ、　Ｂｅａｒ
ｄ）を混合し、４１°Ｃ下で９０分保った。反応終了後
、ＤＮＡはフェノール処理後エタノール沈澱物として回
収し、このＤＮＡを２０ｍＭ　　トリスおよび１　ｍＭ
　ＥＤＴＡを含むｐＨ７，５の溶液に溶解した。

５ｓ−ｃＤＮＡ　２．５μｇが合成された。本反応液よ
りｍＲＮＡを除くために反応液にＮａ０ＦＩ溶液を加え
て０、３３　Ｎ　ＮａＯＨ溶液とし、室温にて１５時間
置き、次いでｐＨ７，５のＬＭ）リス−塩酸緩衝液を同
量加えて中和しセファデックスＧ−５０カラムをカラム
を通した。回収されたｃＤＮＡは１．８μｇであった。

（５−２）５０ｎ＋Ｍ　　リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）
、１０ｎ＋Ｍ　ＭｇＣｆｚ　、１０ｎ＋Ｍ　ＤＴＴ、　
０．７５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰＳｄ
ＴＴＰ　（ｄＣＴＰは３Ｈで標識したものを含む）、１
．８μｇ　５ｓ−ｃＤＮＡおよび８単位ポリメレースＩ
　（ＢＲＬ、米国）を混ぜ１５時間、１５°Ｃで反応を
行った。反応終了後ＤＮＡをフェノール及びクロロホル
ム処理後エタノール沈澱物として回収した。１．１０μ
ｇのｄｓ−ｃＤＮＡが生成した。５０ｍＭ酢酸ソーダ（
ｐ）ｌ　４．５　）　、０．２　Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭ
　ＺｎＣ１ｔおよび１．１０　ｕ　ｇ二本鎖ｃＤＮＡの
混合物を３７°Ｃで３０分間インキュベートした後０．
２５単位のヌクレアーゼＳ＋（三井、日本）を加え、さ
らに１５分間インキュベートした。反応終了後、フェノ
ール処理を２回行った反応生成物をセファデックスＧ−
５０へ供し、二本鎖ｃＤＮＡ　Ｏ，５５／／　ｇを得た
。

（５−３）０．１４Ｍカコジル酸カリウム、３０ｍＭト
リス塩基、０．１　ｍＭ　ＤＴＴ、　　１　ｍＭ　Ｃｏ
Ｃ１ｚ、０．６４ｍＭゴ”Ｐ−ｄＣＴＰ　（比活性２．
７　Ｘ　１０６ｃｐｍ／ｎ　ｍｏｌ）、０、５５　ｕ　
ｇ　ｄｓ−ｃＤＮＡおよび５単位のターミナルトランス
フェラーゼ（ＢＲＬ）を混合し、３７°Ｃで７分間イン
キュベートした後フェノール処理し、次いでセファデッ
クスＧ−５０カラムに供し、エタノール沈澱物として０
．５０μｇ　ＤＮＡを得た。回収したこのＤＮＡは約５
０個のｄＣＭＰ残基が両３°末端に付加されている事が
判明した。

ｐＢＲ３２２ｒ）ＮＡ　１０μｇを制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ
で切断したのちｄＣＴＰのかわりにｄＧＴＰを用いたこ
と以外は前述のｄｓ−ｃＤＮＡにｄＣＭＰ鎖を付加した
ときに用いた方法と全く同じ条件により、切断したＤＮ
Ａの両３゛末端にｄＧＭＰ鎖を付加した。

（５４）　５０１１１Ｍ　　）リス−塩酸（ｐＨ７，５
）０、１Ｍ　ＮａＣｆ、　５ｍＭ　ＤＥＴＡ、　０．０
５　ｕ　ｇ　ｄＧＭＰ残基付加ｐＢＲ３２２および０．
０１Ｍｇ　ｄＣＭＰ残基付加ｃＤＮＡをまず６５°Ｃで
２時間、次いで４６°Ｃで１２０分間、さらに３７゛Ｃ
で６０分間、そして室温で６０分間インキュベートした
。

エシェリヒア・コリｚ　１７７６（Ｃｕｒｔｉｓｓ　ｍ
　、　Ｒ，ｅｔａｌ、、　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮ
Ａ＋（Ｗ、＾、　５ｃｏｔｔ　＆　Ｒ，Ｗｅｒｎｅｒ　
ｅｄ、）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

（１９７７））を５０ｍ１のし培地（１００Ｂ　ｇ　／
　ｍｆｌのジアミノピメリン酸、５０Ｍｇ／ｍｌ！のチ
ミジン、１％トリプトファン、０．５％酵母エキス、０
．５％ＮａＣ１および０．１％グルコースを含む）に接
種し培養液の吸光度が５６２ｎｍで０．３付近になるま
で３７℃で振とう培養した。培養終了後、培養液を３０
分間Ｏ′Ｃに保持し、菌体を遠心分離により集め、５１
　トリス−塩酸（ｐＨ７，６）　、０．　Ｉ　Ｍ　Ｎａ
Ｃ’ｌ、５ｍＭＭｇＣｊ！２および１０ｍＭ　Ｒｂ（／
！を含む溶液２５−で２回洗浄した。

得られた菌体を５１１μＭトリスー塩酸（ｐＨ７，６）
、０．２５Ｍ　　ＫＣｆｆｉ、５ｍＭ　ＨｇＣ１ｚ　、
０．１　Ｍ　ＣａＣ１ｚおよびｌ　ＯｍＭ　ＲｂＣｆを
含む溶液２０ｍ１に懸濁し、Ｏ′Ｃで２５分間静置後、
菌体を集め上記と同じ溶液１ｍｌ１に菌体を再懸濁し、
得られた菌体懸濁液の０．２ｍｆｌに上記組換え体ＤＮ
Ａを入れ、０°Ｃで６０分間静置した。その後り培地０
．１ｍｌを加え３７°Ｃで３０分間振とう培養した。こ
うして得られた培養液（０，１ｄ）を１００μｇ／ｄジ
アミノピメリン酸、５０Ｍｇ／ｄチミジンおよび１５ｔ
ｉｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むし培地の１．５％寒
天培地上に一面に塗抹し、３７°Ｃで２日間インキュベ
ートした。

（５−５）出現した４３２のコロニーを１８のグループ
に分け、（その各グループは２４の異なるバクテリアク
ローンを含む）１００Ｉ１ｇ／−のジアミノピメリン酸
、５０Ｍｇ／ｄのチミジンおよび１０Ｍｇのテトラサイ
クリンを含むし培地２００−に接種し、３７°Ｃで５〜
７時間振とう培養した。次に最終濃度１７０μｇ／ｌｄ
となるように加えられたクロラムフェニコールを含む新
たなし培地２００ｄを加え、さらに−晩培養した。

このようにして増強されたプラスミドＤＮ＾を常法に従
い精製した。

ｒＬ−２ｃＤＮＡを有するクローンはｍＲＮＡハイブリ
ダイゼーション−トランスレーションアッセイ（以後Ｈ
−Ｔアッセイと略称する）により選択した。

ここで用いられたＨ−Ｔアッセイは以下に示す如く行っ
た。

純化したＤＮＡ（２５μｇ）を制限酵素肛堕旦により開
裂しフェノールで３回、フェノール−クロロホルムおよ
びクロロホルムで各々処理し、エタノールで沈澱させ８
０％エタノールで洗浄し、８０％ホルムアミド４０ｍ１
にン容解した。

反応液を変性させるため９０゛Ｃで５分間加熱後１０　
Ｘ５ＳＣ（１，５Ｍ　ＮａＣ１、０，１５Ｍ　　クエン
酸ソーダ）で１．３−に希釈した。その後、本ＤＮＡを
ニトロセルロース濾紙上に固定し、これを８０゛Ｃで３
時間乾燥させ、５０％ホルムアミド、２０　ｍＭ　Ｐｉ
ｐｅｓ（ｐＨ６，５）、０．７５　Ｍ　ＮａＣ１！、５
　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．２％ＳＯＳ及びＪ−１１１細
胞由来のｐｏｌｙ　（Ａ）　ｍＲＮＡ２５０Ｍｇを含む
溶液中で３７°Ｃ１１８時間インキュベートし、濾紙上
に固定されたＤＮＡとＩＬ−２ｍＲＮＡをハイブリダイ
ズした。

次にその濾紙を６５℃で３回ｐｉ（６，５のｌｏｍＭＰ
ｉｐｅｓ、　０．１５　Ｍ　Ｎａ（ｆ！溶液、１　ｍＭ
　Ｐｉｐｅｓ、　　１０μＭ　ＮａＣ／！溶液で洗浄し
０．５　ｍＭ　ＥＤＴＡＳｏ、　１％ＳＤＳ溶液で９５
°Ｃ，１分間処理し濾紙からハイブリダイズしたｍＲＮ
Ａを回収した。

このようにして抽出したｍＲＮＡを常法に従ってオリゴ
ｄＴ−セルロースカラム上で精製し、アフリカッメガエ
ル卵母細胞へ注入し、翻訳された蛋白のＩＬ−２活性を
測定した。

各々２４クローンからなる１８グループのうちの１グル
ープが前述の’Ｈ−ＴｄＲ取込みによるアッセイで４８
単位／ｄのＩＬ−２活性陽性を示した。

一方他のグループは明らかに陰性であった。

次に、陽性のグループに属する２４の各単一コロニーを
既述と同じ組成のＬ培地２００ｄへ接種し、３７°Ｃで
５〜７時間好気的に培養し、同様にクロラムフェニコー
ル含有のし培地をさらに添加した。

一晩培養して、プラスミドＤＮＡを増強後、プラスミド
ＤＮ＾を同様に標準法に従って精製した。肛皿ｌで各プ
ラスミドＤＮＡ約５μｇを開裂後、各プラスミドを同様
にニトロセルロース濾紙へ固定した。

その濾紙をＩＬ−２ｍＲＮＡとハイブリダイズし、ハイ
ブリダイズしたｍＲＮＡをアフリカッメガエル卵母細胞
へ注入し、翻訳された蛋白のＩＬ−２活性を測定するた
め回収した。

表２に示す如く、ｐ３−１６と表示した単一コロニーか
ら精製されたプラスミドＤＮＡのみが陽性のＩＬ２活性
を示した。それ故、本クローンがＩＬ−２ｃＤＮＡを有
するクローン（Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ｚ　１７７６／ｐ３
−１６ＡＪ１１９９５　（ＦＥＲＭ−ＢＰ−２２５））
と同定された。このようにプラスミドＤＮＡ、ｐ３−１
６はＩＬ−２ｎ＋ＲＮ八と特異的ハイブリッドを形成す
る能力のあるＤＮＡ（ＩＬ−２遺伝子）を確かに有して
いる事が確認された。

表２ （ａ） ｍＲＮへの翻訳 生成物 ×　　２ ×３２ ２０．４５３ ２０．９６１ （ｂ） ｍＲＮＡ”の翻訳 生成物 ×　　２ ×３２ ＊　プラスミドρ３−１６からのｃＤＮＡとハイブリダ
イズしたｍＲＮＡ プラスミドｐａ−１６のｃＤＮＡインサートは制限酵素
Ｘｂａ　　Ｉにより１部位で、又Ｂｓｔ旧により２部位
（Ｘｂａ　Ｉ開裂部位の上流及び下流）で切断されると
いう特徴を示した。しかしながら、プラスミドｐ３−１
６は約６５０塩基対より構成されるｃＤＮＡインサート
を含んでおり、これは明らかに１１〜１２Ｓの大きさの
ＩＬ−２ｍＲＮＡの一部分に相当するものである。それ
故、イ也のｃＤＮパライフ゛ラリ−を、Ｓ寿型としてＩ
Ｌ−２ｍＲＮＡを用い、Ｌａｎｄ等の方法（Ｌａｎｄｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
、　ｖｏｌ　９＋　ｐ２５５１．（１９８１））に従っ
て作製した。−本領ｃＤＮＡ（１，６μｇ）を、ｄＣＭ
Ｐ残基を付加したＩＬ−２ｍＲＮ八４μへを用いて合成
し、そしてｄｓ　−ｃＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼ■
（Ｋｌｅｎｏ−断片）によりブライマーとしてオリゴ（
ｄＧ）１２＝１８を用いる事により合成した。６８０塩
基対ＯＮ八サイズマーカー（ｓｉｚｅ　ｍａｒｋｅｒ）
より長いｃＤＮＡ（０，６μｇ）は蔗糖密度勾配遠心法
によって得られ、標準的なＧ−Ｃティリング法によりｐ
ＢＲ３２２のＰｓｔ　　１部位へ挿入出来た。

組換えＤＮＡ体によるエシェリヒア・コリ　χ１７７６
の形質転換後、その場所でプローブとしてニック翻訳さ
れた（ｎｉｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）ｐ３−１６　
ｃＤＮＡインサートを用いたＧｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏ
ｇｎｅｓｓのハイブリダイゼーション法により約２００
０コロニーを選別し、およそ８５０塩基対を含むプラス
ミドｐＩＬ　２−５ＯＡを含有するコロニー及び形質転
換されたクローン（エシェリヒア・コリ　χ　１７７６
／ｐｌＬ　２−５ＯＡ、　ＡＪ１１９９６（ＦＥＲＭ−
ＢＰ−２２６）　）を同定した。ｐｌＬ２−５ＯＡのｃ
ＤＮＡインサートの制限酵素切断図を第１図に示した。

形質転換されたエシェリヒア・コリ　χ１７７６／ｐｌ
Ｌ２−５ＯＡからのＩＬ−２ペブタイドをコードしてい
る遺伝子を単離するため、プラスミドＤＮＡを通常法に
従い、菌体からＤＮＡを単離後制限酵素Ｐｓｔ　　１に
より切断した。この処理により生成する２つのＤＮ八へ
片のうちより小さな断片はＩＬ−２ベプタイドをコード
しているＤＮＡ遺伝子であった。ｐｌＬ２−５０八から
のＰｓｔ　　Ｉインサートの完全なヌクレオチド配列は
Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔの方法（Ｍａｘａ
ｍ、八、　Ｈ，ｅｔａｌ、、　Ｅｎｚｙｍ、　６５．、
４９９−５６０．１９８０）により決定した。全構造を
第２図（ａ）に示す。

実施例２ 実施例１に記載された方法に従ってジュルカット細胞か
らクローン化された構成的ＩＬ−２産生細胞株Ｊ−＾１
８８６　（ＡＴＣＣＣＲＬ　８１３０）は同様にローラ
ー培養ボトルで生育した。生育した細胞は初期細胞密度
１．　Ｘ　１０６個／戴で新鮮な合成培地ＲＩＴＣ−５
５−９に再懸濁し、培養開始８時間後に、実施例１で詳
細に示したステップに従って３Ｘ１０”個の細胞から１
１〜１２３分画としてのＩＬ−２，ＲＮＡ抽出のために
使用された。

ｄｓ　−ｃＤＮＡは実施例１と同様に合成され、６００
塩基対より長いｃＤＮＡ（２，４μｇ）が蔗糖密度勾配
遠心法による分画により得られた。次にこのｃＤＮＡを
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
を用い、ｄＣＭＰ残基で伸長し、その５０ｎｇがｄＧ？
ＩＰで伸長したＰｓｔ　　Ｉ切断ｐＢＲ３２２２５０ｇ
ｇとアニールされた。

生成したハイブリッドプラスミドはエシェリヒア・コリ
　χ１７７６に形質転換され、約４．０００クローンの
トランスホーマントが得られた。

Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓの方法に従い、プ
ローブとして用いたプラスミド３−１６　ｃＤＮＡと相
補的な３個のクローンが選択された。すなわち、このよ
うにして選択された形質転換されたクローンはヒトＩＬ
−２遺伝子を有するクローンである。

実施例３ エシェリヒア・コリ細胞でヒトＩＬ−２の合成を指令す
るプラスミドを以下の如き方法で構築した。

プラスミドｐ’ｒ　ＩＬ２−２２は第４（ａ）図で図解
されている如く、一連の改変の方法によりｐＴｒＳ−３
（Ｎｉｓｈｉ　Ｔ、＋Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　　Ｔ、　　
ｅｔ　　ａｌ、、　　５ＥＩＫＡＧＡＫＬＩ　　５３．
　９６７、　　（１９８１）。

同５４．６７６（１９８２））及びＩＬ−２ｃＤＮＡを
含むｐｌＵ２−５ＯＡから構築した。プラスミドρＴｒ
Ｓ−３はＴｒｐプロモーターとｐＢＲ３２２の［ｘｃｏ
Ｒ１部位とＣ１ａ　　１部位の間に５ｈｉｎｅ　Ｄａｌ
ｇａｒｎｏ　（以後ＳＤと略号する）の領域の挿入を含
む。

本プラスミドはまた第３図で示した如く、単一のｓｐｈ
　　１部位と同様にＳＤ配列の下流１３ｂｐにＡＴＧイ
ニシェーションコードンを含んでいる。

言及している蛋白に対応するＤＮＡ配列がＡＴＧコード
ンの丁度下流の部位に挿入されるとそのベクターはこの
蛋白を生産するには非常に効果的である。

このＡＴＧコードンはｐＴｒＳ−３の鋤　Ｉ消化に引続
きＴ４　ＤＮ＾ポリメラーゼによる処理によって生成さ
れる。それ故プラスミドｐＴｒＳ−３（３０μｇ）は制
限酵素鋤Ｉで、常法により切断され、引続きフェノール
、クロロホルム処理、エタノール沈澱法により回収され
両末端がＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ処理によりフラッシ
ュにされた。

次に、同様の方法によりフェノール、クロロホルム処理
及びエタノール沈澱法によりＤＮＡ（２１，４μｇ）を
回収した。他方ｆＬ−２ｃＤＮＡを含むｐｌＬ２−５Ｏ
Ａ　３８０ｇｇはＰｓｔ　　Ｉにより切断され、ＩＬ　
　２　ｃＤＮＡインサートはアガロースゲル電気泳動に
より単離された。　ｃＤＮＡインサート（１１８ｇ）は
加ＡＩにより切断され、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼによ
って処理され、大きい方の部分のＤＮＡｌ０／ｌ１ｇが
アガロースゲル電気泳動により単離された。本性に従っ
て１３２個のアミノ酸をコードするｃＤＮＡ　（７，２
μｇ）が得られ、このＤＮＡ断片はプラントエンドを有
していた（第４（ａ）図）。

次に、このようにして得られたｃＤＮＡ断片をＡＴＧ配
列の丁度下流で、前もって力担（により消化されたＴ４
　ＤＮＡポリメラーゼにより処理されたｐＴｒＳ−３ベ
クターへ連結した。このように連結′したプラスミドは
それから、常法に従いエシェリヒア・コリＨａ　１０１
へ形質転換された。この連結は次のようにして行った。

ＩＬ　−２ｃＤＮＡ（０，４ｕ　ｇ　）の前述の大きい
方の断片およびｐＴｒＳ−３ベクターＤＮＡ　０．２　
ｕ　ｇを６．６　ｍＭ　ＭｇＣｌ　ｔ、　１　ｍＭ　Ａ
ＴＰおよび１０ｍＭ　ＤＴＴを含むｐｉ（７，５の６６
ｍＭ）リス−塩酸中でＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ０．８単位
と共に混合し、混合物を４°Ｃ１−晩反応させた。アン
ピシリンを含むし培地寒天プレート上に出現するトラン
スホーマントの中で、１３２個のアミノ酸をコードして
いるＩＬ−２ｃＤＮＡ部分を含むプラスミドを持つコロ
ニーをその場テコロニーハイブリダイゼーションアンセ
イ法により選択した。こうして選択したコロニーを再び
培養（１０ｍＩ！、）ｊ、、リゾチーム処理および凍結
。

融解による処理によりプラスミドＤＮＡを調製した。

このプラスミドＯＮΔをＰｓｔ　　ＩとＸｂａ　　Ｉで
切断し、その結果の生成物をアガロースゲル電気泳動に
より分析し、ｃＤＮＡがｐＴｒＳ−３のΔＴＧ配列の後
に正しい方向で凍結しているｐＴＩＬ−２−２２を同定
した。

ｐＴＩＬ−２−２２を含むエシェリヒア・コリＨＢ　１
０１を微生物の増殖のために知られている通常法の下に
培養した。細胞は２５μｇ／ｍｌストレプトマイシンお
よび２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むχ培地（２，
５％バクトｌ・リブトン、１％酵母エキス、０．１％グ
ルコース、　　２０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ＊、　　５０ｉＭト
リスー塩酸、　ｐＨ７，５）　１０　＋ｙ＋４２中で３
７°Ｃで一晩生育させた。ついで培養懸濁液１　ｍｌを
同じχ培地（１００ｍｊｌりへ接種し、３７゛Ｃで培養
した。

６５０ｍμの０．Ｄ、がおよそ１．５−２．０に達した
時点で３−インドールアクリル酸（ＩＡ八）を加えた。

インデューサーの添加３時間後に、細胞を集め、２０ｍ
Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７，５、３０ｍＭ　ＮａＣｆｆ１
を含む）で洗浄し、同じ緩衝液Ｓ　ｍｅ中に再び懸濁し
た。

Ｔｒｐプロモーターの効果的な機能発現のために、１面
の如きインデューサーを最終濃度５０μｇ／ｍｅになる
ように添加した。かくして細菌細胞中に産生される蛋白
をソニック処理（０°Ｃ，２分間）またはりゾチーム（
８μｇ）消化（０°Ｃｌ２Ｏ分）に引き続き凍結融解を
３回行う事により抽出した。

この方法により、−船釣にＩＬ−２は細胞から抽出され
た。抽出されたＩＬ−２活性は１０，０００から１２０
，０００単位／ｎｕの範囲であった。

ｐＴＩＬ２−２２を含むエシェリヒア・コリ　ＨＢ　１
０１（八Ｊ１２００９）はＦ２１７Ｍ−ＢＰ２４５とし
て寄託されている。

実施例４ ＩＬ−２ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＴｕｌＬ２−２
２はｐＴｕＢＩＰ−５（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　Ｔ、　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｓｅｉｋａｇａｋｕ＋　５３゜９６６
、１９８１）および実施例３に示したｐＴＩＬ２−２２
から第６図に図解した方法により構築された。プラスミ
ドｐＴｕＢＩＰ−５はｐＢＩ’１３２２中にｔｕｆＢの
プロモーター配列が挿入されている。このプラスミドは
また単一のＣ１ａ　　Ｉ部位を含んでおり、これは第６
図に示した如＜ＳＤ配列の２ｂｐ下流に位置している。

ｐＴｒＳ−３もまたＳＤ配列とＡＴＧイニシェーション
コードンの間にＣ１ａ　　１部位を含んでおり、このＣ
１ａ　　１部位は実施例３に記載した如（ｐＴｒＳ−３
およびＩＬ−２ｃＤＮＡを用いる事による発現プラスミ
ド構築中に破壊されないことから、Ｔｒｐプロモーター
をＬｕｆＢプロモーターに置き換える事はきわめて簡単
であり、その結果ＩＬ−２ｃＤＮＡはｔｕｆＢプロモー
ターの制御下で発現される。

それ故、プラスミドｐＴＩＬ２−２２　（３０ａｇ）は
制限酵素Ｃ１ａ　　Ｉとハ世■により通常の方法で切断
された。ＩＬ−２ｃＤＮＡを含む断片（約２．２　ｋｂ
）はアガロースゲル電気泳動により単離精製され、３μ
ｇのＤＮＡが回収された。他方、　ｐＴｕＢＩＰ　　５
ベクタ一２０ａｇが同様にり立ＩとＰｖｕ　ＩＩにより
切断され、アンピシリン耐性遺伝子を含む大きい方の断
片（約３．４　ｋｂ）がアガロースゲル電気泳動により
単離精製され、ＤＮＡ　３．５μｇが回収された。

次にこのようにして得られた２個の断片は１つはｔｕｆ
Ｂプロモーターを含み（約３．４ｋｂ）、他方はＩＬ−
２ｃＤＮＡを含んでおり（約２．２　ｋｂ）以下に示す
如く連結した。

ＩＬ−２ＣＤＮＡ（１，２ｕ　ｇ　）を含む断片および
ｔｕｆＢプロモーターを含む断片０．３ａｇを６．６ｍ
Ｍ　ＭｇＣｆｆ１　ｚｌ　ｍＭ　ＡＴＰおよび１０ｍＭ
　ＤＴＴを含むｐＨ７，５の６６ｍＭトリス−塩酸中で
、Ｔ４　ＯＮＡリガーゼ０．８単位と混合し、４°Ｃで
一晩反応した。次にこのようにして連結したプラスミド
は常法に従いエシェリヒア・コリＨＢ　１０１へ形質転
換された。

アンピシリンを含むＬ培地寒天プレート上に出現するｌ
・ランスホーマントの中で第６図のｐＴｕＩＬ２−２２
の如＜　ＩＬ　−２ｃＤＮＡ部分を含む組み換え体ＤＮ
Ａを持つ８個のコロニーが選択され、プラスミドＤＮＡ
は実施例３に記載された如く調製された。

ｐＴｕｌＬ２−２２を含むエシェリヒア・コリＨＢ　１
０１を３７°ＣでＬ培地（１００ｎｊ２）中で培養した
。

６５０ｍμの０．０．がおよそ０．５−１．０に達した
時、菌体を集め、３０１ＩＩＭ　ＮａＣ１！を含む２０
ｍＭトリス−塩酸（ｐ）Ｉ　７．５　＞で洗浄し、同じ
緩衝液２　ｍｌｔ中に再び懸濁した。このようにして産
生じた蛋白は実施例３と同様に抽出された。抽出液中の
ＩＬ−２活性は６，０００から５６．０００単位／ｌｌ
１ｌの範囲であった。

ｐＴｕＩＬ２−２２を含むエシェリヒア・コリ　ＨＢ　
１０１（ＡＪ１２０１０）はＦＥＲＭ−ＢＰ　２４６と
して寄託されている。

実施例５ １１−２ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＧＩＬ２−２２
はｐＧＬｌｏｌ（Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｔ、　Ｍ、　ａｎ
ｄ　Ｌａｕｃｅｒ　Ｇ、　Ｄ、、　Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚｙ
ｍ、＋６８、４７３−４８３．（１９７９）、Ｇａ１ｌ
　Ｌａｕｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｍｏｌ。

＾ｐｐ１．　Ｇｅｎｅｔ、、　１．　ＮｃＬ２．１３９
〜１４７（１９８１）、　Ｔ。

Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ。

７７、　ｋ　９．５２３０〜５２３３（１９８０）、Ｅ
ｇｏｎ　Ａ＋＋＋ａｎｎ、　ｅｔ　ａｌ。

Ｇｅｎｅ、　２５．１６７〜１７８（１９８３））と実
施例３に示されたｐＴＩＬ２−２２とから構築された。

すなわち、ｌａｃプロモーターを含むプラスミドｐＧＬ
　１０１（２０ａｇ）が制限酵素触■で常法により切断
され、引続きフェノール、クロロホルム処理およびエタ
ノール沈澱法により１７μｇのＤＮＡが回収された。他
方、ｐＴＩＬ２−２２　（７５μｇ）の方はＣ１ａ　　
ＩおよびＳａｌ　　Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳
動によりＩＬ２ｃＤＮ＾が含むＤＮＡ断片２．２ａｇを
回収した。この断片はＤＮＡポリメラーゼｌ（フレノウ
断片）で処理する事によりフラ・ソシュにされた。次に
このようにして得られた２個の断片（０，２５μｇおよ
び０．６６μｇ）を実施例４と同じ方法でＴ４　ＤＮＡ
リガーゼ１．０単位でもって連結した。かくしてこの連
結したプラスミドは常法に従いエシェリヒア・コリＨＢ
　１０１に形質転換された。トランスホーマントの中で
、ＩＬ−２ｃＤＮＡを含むＣ１ａ　　Ｉ　−３ａｌ　　
Ｉ断片の挿入を有するトランスホーマント３Ｚｐラベル
したＩＬ−２ｃＤＮ＾をプローブとして選択した。次に
これ等のトランスホーマントを、アンピシリン２５μｇ
／ｒａｎ、を含む１０ｍｊ２のχ培地中で培養し、実施
例３で記載した方法によりプラスミドＤＮＡを調製した
。かくしてＩａｃプロモーターの丁度下流にＩＬ−２ｃ
ＤＮＡの開始配列ＡＴＧを有するプラスミドＤＮＡはＰ
ｓｔ　　Ｉおよびη＞ａ　　Ｉでの切断部位を検定する
事により得られた。このようにして得られたｐＧＩＬ２
−２２を含むエシェリヒア・コリ）ＩＢ　１０１は２５
μｇ／１ｎ１７ンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌストレ
プトマイシンを含有するＬ培地１００＋ｓｊ！に接種し
培養した。６５０ｍμの０．Ｄ、が約０．５に達した時
イソプロピル−β−ローチオガラクトピラノサイド（Ｉ
ＰＴＧ）を１＋＋Ｈの濃度で加え、１時間後に菌体を集
め、実施例４に記載した方法に従って菌体抽出液を調製
した。抽出液のＩＬ−２活性は６．０００から８０．０
００単位／ｍｌの範囲であった。

ｐＧＩＬ２−２２を含むエシェリヒア・コリＪＩＢ　１
０１（ＡＪ１２０１１）はＦＥＲＭ−ＢＰ　２４７とし
て寄託されている。

実施例６ プラスミドｐＴｒＳ−３（１０ａｇ）を先ず制限酵素Ｓ
ａｌ　　Ｉで切断しＳａｌ　　Ｉ部位をＤＮＡポリメラ
ーゼ（フレノウ断片）あるいはＴ４　ＤＮＡポリメラー
ゼ処理によりフラッシュ（ｆｌｕｓｈ）にした。

Ｃ１ａ　　Ｉで切断後、Ｔｒｐプロモーター領域を有す
る大きい方の断片を常法に従ってアガロースゲル電気泳
動により単離精製し、ＤＮ＾３μｇを回収した。

他方、ｐｌＬ２−５ＯＡの翅Ｉ切断により得られるｃＤ
ＮＡインサート１１μｇがＩＡＩで切断され、Ｔ４　Ｄ
ＮＡポリメラーゼ処理され、大きい方の断片がアガロー
スゲル電気泳動により単離、精製された。このようにし
てＩＬ−２の１３２個のアミノ酸をコードするｃＤＮＡ
断片が７．２μｇ得られた。次に、ｔｒＰプロモーター
（上記）を含む断片０．４５μｇ。

ＩＬ−２ｃＤＮＡを含むＨｇ１ＡＩ−Ｐｓｔ　Ｉ断片０
．５　ｕ　ｇおよび合成オリゴヌクレオチド（５’）Ｃ
ＧＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＧＣ八（３゛）と（３’　）Ｔ
ＡＴＴＣＧＡＴＡＣＣＧＴ　（５’　）　（、各々２０
　ｐｍｏｌｅ）は両方とも５”末端でリン酸化されてい
るが、これ等を実施例３に記載されている方法と同じ方
法でＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位で連結した（第４図（ｂ
））。このように連結されたプラスミドはエシェリヒア
・コリＨＢ　１０１に形質転換された。出現したトラン
スホーマントの中で、目標とするトランスホーマントは
次のようにして選択した。まず最初に、ＩＬ−２ｃＤＮ
Ａおよび合成オリゴヌクレオチドの両方とハイブリダイ
ズ可能なトランスホーマントがコロニーハイブリダイゼ
ーション法により選択された０次に、ＡＴＧＧＣＡ配列
の丁度下流に第２図（ａ）の１１１から１１３の位置の
ＣＴＴ配列から始まるＤＮＡ断片（ＣＣＴＡＣＴ・・・
・・・・・・）が挿入されているプラスミドＤＮＡを持
ったトランスホーマントをＰｓｔ　　Ｉ　、Ｘｂａ　１
切断個所を検定することにより選択した。

ｐＴＩＬ２−２１ａまたはｐＴＩＬ２−２１ｂを含む上
記のトランスホーマントを実施例３に示す方法によりＬ
培地中で培養し、そして実施例３に示す方法により分析
した時トランスホーマントの菌体抽出物には高いＩＬ−
２活性が認められた。ｐＴＩＬ２−２１ａを有するエシ
ェリヒア・コリ　ＨＢ　１０１（ＡＪ　１２０１３）お
よびｐＴＩＬ２−２１ｂを有するエシェリヒア・コリ（
ＡＪ　１２０１４）を有するエシェリヒア・コリＨＢ　
１０１はそれぞれＦＥＲＭ−ＢＰ　２４８．ＦＥＲＭ−
ＢＰ　２４９として寄託されている。

上記の実施例で用いられた宿主、エシェリヒア・コリ　
χ１７７６およびＨＢ　１０１（Ｂｏｙｅｒ　ｆ（、Ｗ
、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４１．４５９．（１９６
９））は公知であり、容易に入手可能である。更につけ
加えれば、トランスホーマント中の組換えＤＮＡ体を遊
離させるためにＬ培地で３７°Ｃでトランスホーマント
を培養し、テトラサイクリンおよびアンピシリンに感受
性となった菌体を分離すれば寄託したトランスホーマン
トから宿主は容易に得られる。

プラスミドベクターｐＢＲ３２２（例えばベセスダリサ
ーチラボラトリーから購入可能）　、　ｐＣＥ−１，ｐ
ＴｒＳ−３およびｐｃｔ、　ｔｏｔは公知であり容易に
入手可能である。更に、常法によりトランスホーマント
中の組換え体プラスミドを分離することによってさらに
それぞれの実施例での説明から当然に明らかな如（プラ
スミドベクターを分離することによって寄託されたトラ
ンスホーマントからプラスミドベクターを得る事が出来
る。ｐＴｒｓ−３およびｐＴｕＢＩＰ−５はそれぞれエ
シェリヒア・コリ　ＦＥＲＭ−Ｐ６７３５（ＢＰ　３２
８）およびエシェリヒア・コリ　＾ＴＣＣ３１８７＆と
して寄託されている。

【図面の簡単な説明】

第１図はＩＬ−２活性を有するポリペプチドをコードし
たクローン化遺伝子の制限酵素エンドヌクレアーゼによ
る切断マツプを示し、第２図（ａ）はクローン化遺伝子
の塩基配列を示し、第２図（ｂ）はＩＬ−２活性を有す
るポリペプチドのアミノ酸配列ｒ、　　［ｒおよび■を
示す。 第３図はプラスミドベクターｐＴｒＳ−３を示す。 第４図（ａ）、第４図（ｂ）および第４図（ｃ）はベク
ターとしてｐＴｒＳ−３を使用している組換え口ＮＡｓ
　（ｐＴＩＬ２−２２．　ｐＴＩＬ２−２１．　ｐＴＩ
Ｌ２−１４およびｐＴＩＬ２−１５）の構成を示すフロ
ーチャートである。第５図はベクターとしてｐＫＴ　２
１Ｂを使用している組換えＤＮＡ　（ρＫＩＬ２−２１
）の構成を示すフローチャートである。第６図はベクタ
ーとしてｐＴｔｌＢＩＰ−５を使用しているＭｉ換えＤ
Ｎ八（ｐＴｕｌＬ２−２２）の構成を示すフローチャー
トである。 図中、“Ａ″、“Ｇ”、Ｃ′および＠　Ｔ　ＩＩはデオ
キシアデニル酸、デオキシグアニル酸、デオキシシチジ
ル酸およびチミジル酸をそれぞれ表わす。 特許出願人　財団法人　癌　研　究　会−Ｑ １−＋３ ｌ−１− ＝く 一 ツく ！已 −く ｊ：ｕ トく −く ご５ ご急。 Ｇば １４ＬＪ　　ｇａ三 ｓ＜１３ り　１＋Ｊ　　　　　り ！！ｌ：ｉ　　　５ シミ、ｅ （ｌｕｇ −ｕ” ｋＬＪ’：ｎ ＝　＋　　　　） ；２　３ 一〇　　− タ雛　　千 ｙ　（Ｊ　−ｍｅ　　ＩＩ ？：兵　　タ ｚＩ−り ２≦　　１ ｚ：！レコーコープ ｕｌ　　　３　　ぶ　　　Ｖ　　　Φ　　　Φ　　ぶ　
　　Φ＜−ト　　　−　　の　　−ト　　− Σ　　　Ｕ ラ　　２ べ　　Ｕ −コ ←− ：５ψ 一ニ 〇コ 一 区 ぐ 寸 憾

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトインターロイキン２活性をもつ、次のアミノ
   酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子。 【遺伝子配列があります】
2. （２）次の塩基配列を有する特許請求の範囲第１項記載
   の遺伝子。 【遺伝子配列があります】