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BREVET D'INVENTION formée par
Ajinomoto Co., Inc. et Japanese Foundation for Cancer Research pour :
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"Gène codé pour polypeptide d'interleukine-2, ADN recombinant portant ce gène, cellules vivantes contenant l'ADN recombinant et production d'interleukine-2"
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"Gène codé pour polypeptide d'interleukine-2, ADN recombi- nant portant ce gène, cellules vivantes contenant l'ADN recombinant et production d'interleukine-211
La présente invention est relative à un gène, en particulier à un gène cloné codant pour un polypeptide d'interleukine-2, à de l'ADN recombinant portant le gène, à une lignée cellulaire vivante comportant l'ADN recombinant ainsi qu'à un procédé de production d'interleukine- 2 utilisant la lignée cellulaire.
L'interleukine-2 (appelée ci-après"IL-2"), appelée antérieurement facteur de croissance des cellules T, est une protéine soluble (généralement connue sous le nom de"lymphokine"), et est obtenue à partir de cellules T activées par une lectine ou un antigène [Morgan D. A. et coll., Science, 193,1007-1008 (1976) et Gillis S. et coll., J. Immunol., 120,2027-2033 (1978)]. L'interleukine-2 (IL-2) est capable de moduler la réactivité des lymphocytes et de promouvoir la culture à long terme, in vitro de T-lymphocytes, effecteurs spécifiques d'antigène [Gillis S. et coll., Nature 268,154-156 (1977)]. On sait également que l'IL-2 manifeste d'autres activités biologiques significatives, telles qu'un accroissement de la mitogénèse des thymocytes [Chen. B. M. et coll., Cell. immunol., 22,211-224 (1977), Shaw J. et coll., J.
Immunol. 120, 1967-1973 (1978)], une induction de la réac-
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tivité des cellules T cytotoxiques [Wagner H. et coll., Nature, 284,278-280 (1980)] et des productions de cellules formatrices de plaques anti-SRBC [Gillis S. et coll., J. Exp. Med., 149,1960-1968 (1979)] dans des cultures de cellules de rate de souris, nues. Par conséquent, cette substance régulatrice des lymphocytes s'avère intéressante en potentialisant les réponses immunodéficitaires humorales et cellulaires et en ramenant les états immunodéficitaires vers des états immunitaires humoraux et cellulaires, normaux.
Ces activités
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immunologiques identifiées de l'IL-2 montrent nettement que l'IL-2 s'avère intéressante en immunothérapie médicale contre les troubles immunologiques, que les maladies néoplastiques, les infections bactériennes ou virales, les maladies immunodéficitaires, les maladies auto-immunes, etc [Papermaster B. et coll., Adv. Immunopharm., 507 (1980)]. Tous comme les interférons, on a montré que l'IL-2 favorisait l'activité des cellules tueuses naturelles, ce qui suppose une utilisation potentielle dans le traitement des maladies néoplastiques.
De plus, l'IL-2 permet la conservation de cultures de cellules T monoclonales, fonctionnelles et apparatt, par conséquent, jouer un rôle important dans l'étude de la nature moléculaire de la différentiation des cellules T, du mécanisme des fonctions des cellules T ainsi que du mécanisme des récepteurs pour antigène de cellules T.
Elle se révèle également intéressante pour produire, par une culture à long terme de cellules T monoclonales, un grand nombre d'autres lymphokines dérivées de cellules T, qui sont intéressantes dans une gamme étendue de domaines. De plus, la production d'IL-2 et la réponse de lym-
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phocytes à l'IL-2 peuvent être des paramètres importants de fonctions immunologiques, qui sont intéressants dans le diagnostic clinique d'immunité aberrante.
On a obtenu de l'IL-2 dans la technique antérieure en stimulant des lymphocytes de souris, de rat ou d'être humain avec un mitogène [Gillis S. et coll., Nature, 268,154-156 (1977), Farrar J. et coll., J. Immunol., 121, 1353-1360 (1978) et Gillis S. et coll., J.
Immunol., 120,2027-2033 (1978)]. Par une stimulation de lymphocytes mononucléaires de sang périphérique humain avec un mitogène {. Gillis S. et coll., J. Immunol., 124, 1954-1962 (1980)], Gillis et coll. ont obtenu la préparation d'IL-2 murine à partir d'une lignée de cellules de lymphomes de cellules T murines [Gillis S. et Coll., J. Immunol., 125,2570-2578 (1980)] et la préparation d'IL-2 humaine à partir d'une lignée de cellules de leucémie humaines [Gillis S. et Coll., J. Exp. Med., 152, 1709-1719, (1980)].
Les articles susmentionnés de Gillis et Coll. relatent un procédé de production d'IL-2 humaine à partir d'une lignée de cellules de leucémies de cellules T humaines, stimulées par un mitogène par des méthodes de culture de cellules. Toutefois, une technique de ce type conduit à des concentrations trop basses d'IL-2 humaine, et nécessite des processus de purification complexes pour obtenir des quantités même faibles d'IL-2 à partir de volumes très importants de milieu de culture.
De plus, puisque les lignées de cellules leucémiques de cellules T humaines produisent des quantités à l'état de traces d'un grand nombre d'autres substances biologiquement actives, qui sont analogues à l'IL-2 humaine, on rencontre des difficultés importantes pour isoler l'IL-2 de ces autres molécules immunologiquement actives, ou pour isoler
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l'IL-2 des lectines toxiques éventuellement présentes.
Comme autre technique, il semblerait désirable
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d'utiliser des techniques à l'ADN recombinant (ADN est l'abréviation pour acide désoxyribonucléique) telles que celles utilisées dans la production d'autres protéines humaines biologiquement actives, telles que les interférons [Gray E. W. et Coll., Nature, 295,503-508 (1981), Nagata S. et Coll., Nature, 284,316-320 (1980), Taniguchi T. et Coll., Gene, 10,11-15 (1980)], pour la production d'IL-2. Toutefois, les essais utilisés jusqu'à présent pour produire de l'IL-2 par des techniques à l'ADN recombinant ne se sont pas révélés satisfaisants.
Par exemple, on a relaté dans"Nikkei Biotechnology" (Japon), n 19, 5 juillet 1982, que des essais pour construire des organismes producteurs d'IL-2 par de l'ADN recombinant se sont révélés infructueux, probablement dû au fait que le gène codant pour le polypeptide d'IL-2 n'avait pas encore été cloné.
Il s'avère par conséquent toujours nécessaire
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de réaliser un gène cloné, codé pour l'interleukine-2, ainsi que de l'ADN produit par recombinaison, qui porte le gène. Il s'avère également nécessaire de réaliser une lignée de cellules vivantes qui comportent de l'ADN produit par recombinaison, ainsi qu'un procédé de production d'interleukine-2 utilisant la lignée cellulaire.
Ces buts et autres de la présente invention, qui ressortiront mieux de la description ci-après, ont été atteints en prévoyant un gène cloné codé pour un polypeptide, qui présente l'activité de l'IL-2, et en prévoyant un ADN produit par recombinaison qui comprend un gène codé pour un polypeptide possédant l'activité de l'IL-
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2, et un ADN de vecteur pouvant se répliquer dans une cellule procaryotique ou eucaryotique, la séquence codante du gène étant localisée en une position en aval d'une séquence de promoteurs.
De plus, suivant la présente invention, on prévoit des lignées cellulaires procaryotiques ou eucaryotiques qui ont été transformées pour produire de l'IL-2 par l'ADN, l'ADN de vecteur et le gène codé susmention- nés, l'ADN étant susceptible de répliquer dans la cellule, la séquence codante étant localisée en une position en aval d'une séquence de promoteurs.
Suivant la présente invention, on obtient de l'IL-2 par une culture aérobie d'un milieu contenant une lignée cellulaire eucaryotique ou procaryotique qui a été transformée pour produire de l'IL-2 par un ADN qui a été modifié par recombinaison suivant l'invention au moyen d'un gène codé pour produire un polypeptide qui possède l'activité de l'IL-2, et par l'introduction d'un ADN de vecteur, qui peut se répliquer dans la cellule, la séquence codante de ce gène étant localisée en une position en aval d'une séquence de promoteurs.
D'autres détails et particularités de l'invention ressortiront de la description ci-après, donnée à titre d'exemple non limitatif et en se référant aux dessins annexés, dans lesquels :
La figure l représente une carte montrant les points de clivage faits par des endonucléases de restriction d'un gène cloné codé pour produire un polypeptide qui possède l'activité de l'IL-2 (appelé ci-après"polypepti- de d'IL-2").
La figure 2 (a) représente la séquence de base du
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gène cloné. La figure 2 (b) représente la séquence d'aminoacides I, ainsi que les séquences d'aminoacides II et III, des polypeptides qui possèdent l'activité de l'IL-2.
La figure 3 est une représentation schématique montrant la construction d'un ADN recombinant (pCEIL-2), dans lequel est introduit le gène codé.
La figure 4 représente le plasmide vecteur pTrS-3.
Les figures 5 (a), 5 (b) et 5 (c) sont des représentations schématiques montrant la construction
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d'ADN recombinants (pTIL 2-22, pTIL2-21, pTIL2-14 et pTIL2-15) en utilisant le pTrS-3 comme vecteur.
La figure 6 est une représentation schématique montrant la construction d'un ADN recombinant (pKIL2- 21) en utilisant le pKT218 comme vecteur.
La figure 7 est une représentation schématique montrant la. construction d'un ADN recombinant (pTuIL2- 22) en utilisant le pTUBlP-5 comme vecteur.
La figure 8 représente des ADN de vecteur qui peuvent se répliquer dans une cellule de Saccharomyces cereviceae.
Dans les figures,"A","G","C"et"T"représen- tent respectivement l'acide désoxyadénylique, l'acide désoxyguanylique, l'acide désoxycytidylique et l'acide thymidylique.
Le gène cloné, codé pour un polypeptide d'IL- 2, peut être obtenu par transcription d'ARN messager (ARNm ;"ARN"est l'abréviation pour acide ribonucléique) correspondant à l'IL-2 (appelé ci-après"ARNm IL-2", et provenant d'une cellule de mammifère qui est caractérisée
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par la capacité de produire un polypeptide qui possède l'activité de l'IL-2, vers un ADN complémentaire (ADNc).
L'ADNc à brin unique (ss-ADNc) obtenu peut être converti en un ADNc à double brin (ds-ADNc).
L'ARNm utilisé comme modèle (template) pour la préparation d'ADNc peut être séparé de la manière usuelle d'une cellule de mammifère pouvant produire un polypeptide d'IL-2. L'ARN séparé est polyadénylé [Gillis et Coll., Immunological Rev., 63,167-209 (1982)], et l'ARN polyadénylé peut être fractionné, par exemple, par centrifugation sur un gradient de densité de sucrose sous la forme d'un sédiment de 11 à 12 brins. Occasionnellement, un ARNm de 13 brins montrera une activité d'ARNm IL-2, et, dans ce cas, on suppose que l'ARNm est
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sous une forme agrégée d'ARNm de 11 à 12 brins.
Les cellules de mammifère-capables de produire de l'IL-2, qui sont la source d'ARNm de la présente invention, peuvent être des lymphocytes T, tels que des cellules mononucléaires de sang périphérique, des cellules d'amygdale, des cellules de rate, etc, que l'on peut obtenir de mammifères. Les cellules peuvent être ordinairement préalablement traitées, par exemple par une colonne de Nylon, un complément d'antisérum, un fractionnement à gradient de densité, un traitement enzymatique multiple, tel qu'une combinaison de neuraminidase et de galactose oxydase, une irradiation par rayons X ou par de la trypsine pour conférer aux cellules la productivité d'IL-2 ou pour accroître l'activité de l'IL-2.
De même, on peut également utiliser comme source d'ARNm des lymphocytes T clonés, obtenus à partir de ces cellules de mammifère après culture en présence d'un facteur de
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croissance de cellules T, les lymphocytes T étant préférés. Des lignées de cellules de lymphocytes transformés, telles que les lymphocytes T dérivés de lignées de cellules de leucémies ou de lymphomes telles quelles ou de leurs dérivés obtenus par prétraitement ou mutation par les méthodes susmentionnées, ou bien encore les lignées cellulaires transformées, clonées sont préférables comme sources d'ARNm. Evidemment, les lignées de cellules clonées contiennent ordinairement de plus grandes quantités d'ARNm IL-2 comparativement aux lignées de cellules en vrac, parentérales.
Les hybridomes de cellules T, obtenus par fusion des cellules dérivées de lymphocytes mentionnées ci-dessus et de lignées de cellules de tumeurs, telles que CEM, Molt 4F et BW5147, sont également des lignées de cellules de mammifère préférées utilisables dans le cadre de la présente invention. Dans ce cas, les lignées de cellules dérivées de lymphocytes englobent (1) les producteurs constitutifs d'IL-2 et (2) celles qui sont des producteurs d'IL- 2 uniquement en présence d'un mitogène introduit dans la culture, soit en l'absence soit en présence d'autres cellules stimulant conjointement la production d'IL-2.
Afin de produire de l'ARNm IL-2 dans des cellules productrices d'IL-2, constitutives, les cellules productrices d'IL-2, constitutives sont cultivées sous les conditions habituellement rencontrées dans le domaine de la culture des cellules. Pour ce qui est de la production de l'ARNm dans des cellules produisant de l'IL-2 uniquement en présence d'un mitogène, on lave à fond les cellules cultivées avec du milieu de culture et on les remet en suspension dans un milieu de culture, tel que le
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milieu de Rosewell Park Memorial Institute (appelé ciaprès 1640"), le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (appelé ci-après"DMEM") ou dans un milieu de Click, qui peut ou non contenir du sérum.
Ces milieux de culture peuvent être complétés par divers additifs, tels que de la péniciline, de la streptomycine et d'autres antibiotiques, ou par de la L-glutamine fraîche, du tampon d'Hepes et du bicarbonate de sodium en des concentrations telles que celles généralement utilisées dans le domaine de la culture des cellules. La densité cellulaire préférée peut être de 0,5 à 4 x 106 cellules/ml. Pour induire l'activation de l'ARNm et la production d'IL-2, on ajoute des stimulants appropriés.
Des stimulants appropriés de ce type sont les mitogènes, la neuraminidase, la galactose oxydase, les dérivés de zinc, tels que le chlorure de zinc ou des substances activant les lymphocytes provenant de micro-organismes, telles que la protéine A, la streptolysine-O. Les cellules stimulées sont récupérées et lavées. La présence simultanée de macrophages ou de cellules dendritiques au cours de la stimulation mitogénique peuvent également activer l'ARNm, ou peuvent accroître la quantité d'ARNm activé. De la même manière, la présence simultanée de lignées cellulaires provenant de lymphocytes T ou de lignées de lymphocytes B, telles que Raji, Daudi, K562 et BALL-1, peuvent activer l'ARNm ou augmenter la quantité d'ARNm activé.
Pour propager les cellules de mammifères, on les maintient dans une culture de cellules in vitro ou dans des animaux concordants du point de vue de l'histocompatibilité, sous des conditions normales. Lorsqu'on les maintient dans une culture in vitro pour préparer
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la source d'ARNm, on peut faire croître les cellules dans l'un quelconque des milieux de culture utilisés jusqu'à présent pour favoriser la croissance des cellules T. Ces milieux de culture peuvent être ou non complétés de sérum de mammifère, d'un composant sérique ou d'albumine sérique. La période de culture pour l'activation de l'ARNm correspondra à la période nécessaire à l'activation des cellules pour produire l'ARNm. Cette période coïncide ordinairement avec le temps nécessaire pour amorcer l'excrétion d'IL-2 dans le milieu de culture.
La période préférée peut aller de 3 à 12 heures après l'addition d'un stimulant, tel qu'un mitogène. Une prolongation exagérée de la période de culture peut entraîner occasionnellement la décomposition de l'ARNm IL-2 produit. Au cours de l'activation des cellules productrices d'IL-2, il peut être préférable d'utiliser des esters de phorbol, tels que le PMA ou TPA, en une concentration de 10 à 50 ng/ml pour élever le niveau d'activation.
On peut réaliser le procédé d'activation d'ARNm IL-2 décrit ci-dessus à des températures de l'ordre de 320 à 380C dans une atmosphère humidifiée et à un pH d'approximativement 7,0 à 7,4.
On expliquera à présent les procédés d'obtention et de culture de cellules de mammifère susceptibles de produire de l'IL-2.
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( Acquisition d'une lignée cellulaire produisant constitutivement de l'IL-2.
(1)On met en suspension une lignée cellulaire de Jurkat formée de cellules T leucémiques, humaines (délivrées librement par le Fred Hutchinson Cancer Institute Seattle, Etats-Unis, le Salk Institute, San Diego, Etats-Unis
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le Centre du Cancer à Heidelberg, Allemagne de l'Ouest) dans du milieu de Click à une densité cellulaire de 1 x 106 cellules/ml et on irradie avec des rayons X de 8 x 103 R à un taux d'irradiation de 150 R/ minute. Ensuite, on inocule 0,1 cellule des cellules ainsi irradiées pour 200 ul de milieu dans du milieu de Click contenant 5% de FCS dans des microplaques à fond plat comportant 96 puits (Falcon 3072) et on les cultive pendant 3 semaines à 37 C dans un incubateur à 5% de C02 (clonage par méthode de dilution limitative).
Les cellules viables qui croissent sont transférées sur une plaque de culture à 24 puits (Nunc) avant que la couche cellulaire ne devienne confluente et sont à nouveau cultivées pendant 5 jours. Les cellules qui croissent sont encore cultivées dans un milieu de culture de synthèse à base de sérum et exempt d'albumine sérique pendant environ 2 jours à une densité cellulaire initiale se situant entre 1 et 2 x 106/ml. On recueille par centrifugation le surnageant de culture et on le filtre au moyen d'un papier filtre millipore à 0,22 micron pour séparer les débris et pour stériliser le surnageant, les mutants traités aux rayons X susceptibles de produire constitutivement de l'IL-2 étant ensuite sélectionnés et clonés en mesurant l'activité d'IL-2 présente dans le surnageant.
(2) Acquisition de cellules productrices d'IL-2 à partir de cellules mononucléaires de sang périphérique humain.
On récolte du sang périphérique humain et on isole des lymphocytes de sang périphérique (appelés ciaprès"PBL") au moyen d'une centrifugation à gradient de
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densité sur Ficoll-Hypaque. On inocule les PBL dans 2 ml de milieu de Click contenant 5% de FCS à une densité cellulaire de 1 x 106 cellules/ml dans une plaque de culture Nunc comportant 24 puits en même temps que 100 ul de phytohémaogLutinine-M (Gibco) (pHA ; 5 g/ml), et on les cultive pendant 48 heures sous les conditions décrites ci-dessus.
On lave et inocule à nouveau les cellules dans 1 ml de milieu de Click à une densité cellulaire de 1 x
105 cellules/ml en même temps qu'avec 1 ml d'un milieu conditionné qui a été préparé à partir de splénocytes humains stimulés par 2/5 g/ml de concanavaline A (appelée ci-après"Con A") pendant 48 heures, et on change le milieu de culture contenant 50% du milieu conditionné tous les 3 jours de manière à obtenir une culture à long terme de lymphocytes T humains à partir de PBL. Les lymphocytes T humains cultivés à long terme, ainsi obtenus sont clonés par la méthode de dilution limitative telle que décrite ci-dessus, en présence d'un milieu conditionné préparé à partir de splénocytes humains et les clones cellulaires sont propagés d'une façon similaire.
Ensuite, on inocule les lymphocytes T humains, clonés dans 1 ml de RPMI 1640 à une densité cellulaire de 1 x 106 cellules/ml dans une plaque de culture Nunc à 24 puits en présence de 10 pg/ml de PHA et on les cultive pendant 24 heures à 37 C dans un incubateur à 7,5% de CO. Les surnageants du liquide de culture sont recueillis, centrifugés, filtrés à travers un filtre millipore à 0,22 micron et examinés pour leur activité d'IL-2 de manière à déceler les clones de lymphocytes T normaux, humains producteurs d'IL-2.
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(3) Acquisition d'une lignée de cellules malignes dérivée de lymphocytes humains pouvant produire de l'IL-2 en présence de mitogè- ne.
La lignée cellulaire de Jurkat ou les lignées cellulaires clonées, telles que Jurkat lll, obtenues par la méthode de dilution limitative décrite ci-dessus, sont susceptibles de produire de 10 à 4000 unités/ml d'IL-2, lorsque cultivées pendant 24 heures dans le milieu de synthèse exempt de sérum décrit précédemment ou dans du RPMI 1640 contenant 1 à 2% de sérum de mammifère en présence d'un mitogène, tel que 10 g/ml de Con A ou 2,5 pg/ ml de PHA. Ces lignées cellulaires humaines malignes produisent également de l'IL-2 lorsque cultivées en présence de chlorure de zinc, de protéine A ou de picibanil.
(4) Acquisition de cellules susceptibles de pro- duire de l'IL-2 en la présence simultanée d'un mitogène et d'autres cellules co- stimulatrices ou de facteurs solubles co- stimulateurs.
La lignée de cellules malignes humaines de Molt 4F et certaines lignées cellulaires clonées, telles que Jurkat J99, obtenues suivant la méthode de dilution limitative, ne produisent pas d'IL-2, même lorsqu'elles sont cultivées pendant 24 à 72 heures en présence de lectines ou de mitogènes en une concentration quelconque. Toutefois, ces cellules deviennent susceptibles de produire de l'IL-2 en quantité significative (10 à 100 pg/ml) au cours d'une période de culture de 24 heures à 37 C, lorsqu'elles sont cultivées conjointement avec 5
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à 10 pg/ml d'interleukine-l, une des monokines, ou avec 50% de cellules K562 ou Raji.
L'extraction d'ARNm IL-2 de cellules activées de la manière susmentionnée, est réalisée suivant les procédés bien connus, habituels, quelle que soit la différence des sources de cellules. Par exemple, les cellules sont partiellement ou complètement rompues par l'addition d'un détergent, tel que le NP-40, le SDS, le Triton-X ou l'acide désoxycholique, ou par homogénéisation mécanique ou congélation-liquéfaction. Pour empêcher la dégradation de l'ARN par la ribonucléase au cours de l'extraction d'ARNm, il est préférable d'ajouter des inhibiteurs de RNase, tels que l'héparine, du polyvinylsulfate, de la bentonite, du macaroide, du diéthylpyrocarbonate ou un complexe vanadylé.
On peut obtenir de l'ARNm IL-2 à partir de polysome précipité dans la biosynthèse d'IL-2, que l'on précipite avec un anticorps anti-IL-2 parextraction au moyen d'un détergent.
Le poly A-contenant de l'ARNm peut être fractionné ou concentré par n'importe quelle méthode usuelle, telle que par chromatographie d'affinité ou par absorption discontinue sur oligo dT-cellulose, poly U-sépharose ou sépharose 2B, par centrifugation à gradient de densité de sucrose ou encore par électrophorèse sur gel d'agarose,
Les fractions d'ARNm sont ensuite examinées pour leur activité d'ARNm IL-2 en testant les activités biologiques des protéines traduites à partir des fractions d'ARNm ou en identifiant la protéine traduite en utilisant un anticorps monoclonal contre le peptide d'IL- 2. Par exemple, l'ARNm est ordinairement traduit pour
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former la protéine correspondante par microinjection dans des oeufs de grenouille (Xenopus laevis) [Gurdon J.
B. et Coll., Nature, 233,177-182 (1972)] ou en utilisant le lysat de réticulocytes dépendant de l'ARNm ou des systèmes acellulaires de traduction de germe de blé.
L'activité d'IL-2 peut être vérifiée par le processus de microessai décrit en détail par Gillis et Coll., [Gillis S. et Coll., J. Immunol., 120,2027- 2033 (1978)]. L'essai contrôle la prolifération cellulaire dépendant d'IL-2 d'une lignée de cellules de lymphocytes T cytotoxiques (appelée ci-après"CTLL") obtenue suivant les procédés décrits par Gillis et Coll., c'est- à-dire que l'on inocule 4 x 10 cellules CTLL dans 100 pl de milieu RPMl 1640 contenant 2% de FCS dans des microplaques à fond plat comportant 96 puits en même temps que
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100 ul des produits de traduction dilués en série.
Après 20 heures d'incubation à 370C dans un incubateur contenant 5% de Cules cellules sont exposées pendant 4 3 heures à 0, 5 pCi de H-TdR, recueillies sur des ban- des de fibres de verre à l'aide d'un dispositif de récolte de cellules automatisé et on mesure ensuite la radioactivité incorporée par un comptage à scintillation liquide. Par ces processus d'essai, on a constaté que les cellules CTLL cultivées en présence d'IL-2 incorporaient le H-TdR en fonction de la dose utilisée, ce qui permet ainsi de calculer de façon précise la quantité d'IL-2 contenue dans des échantillons d'essai.
L'IL-2 possède l'activité pour promouvoir la prolifération de lymphocytes T, ce qui permet de mesurer l'activité d'IL-2 en utilisant un indice d'activité de croissance de cellules T. C'est ainsi que l'on transfère 5
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cellules CTLL dans 100 ul de DMEM contenant 2% de FCS dans des microplaques à fond plat comportant 96 puits en même temps que 100 lil des produits de traduction dilués en série. Après une incubation de 72 à 96 heures à 37 C dans un incubateur contenant 5% de CO, on compte au microscope le nombre de cellules produites et activées.
Comme groupe contrôle extérieur positif, on ajoute 100 unités/ml, 10 unités/ml d'IL-2 et on calcule l'activité d'IL-2 de l'échantillon d'essai comparativement au nombre de cellules viables, produites dans ces groupes contrôles.
L'ARNm IL-2 ainsi obtenu de la fraction la plus active est utilisé comme modèle pour la synthèse de dsADNc et le ds-ADNc est relié à un ADN de vecteur. On réalise la synthèse d'ADNc par des processus usuels.
Tout d'abord, on prépare du ss-ADNc qui est complémentaire à l'ARNm en présence de dATP, dGTP, dCTP, dTTP en utilisant de la transcriptase réverse et en utilisant de l'ARNm comme modèle (template) et de l'oligodT comme amorçage (primer). On sépare ensuite le modèle d'ARNm par traitement alcalin et on obtient du ds-ADNc en utilisant de la transcriptase réverse ou de l'ADN polymérase et en utilisant le ss-ADNc synthétisé ci-dessus comme modèle (template).
On prépare de l'ADN obtenu par recombinaison à partir du ds-ADNc ainsi obtenu et d'un ADN de vecteur contenant un réplicon susceptible de se répliquer dans des cellules eucaryotiques ou procaryotiques. L'ADN recombinant est ensuite incorporée dans les cellules hôtes.
Le ds-ADNc et un ADN de vecteur susceptibles de se propager dans des cellules eucaryotiques ou pro-
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caryotiques sont, avant la ligation, modifiés par divers processus, tels qu'un traitement à l'exonucléase, une addition de fragments d'ADN synthétisés chimiquement avec attachement d'extrémités G, C pour donner des extrémités susceptibles de ligation aux extrémités du dsADNc et de l'ADN de vecteur. On réalise la ligation des ADN susceptibles de ligation au moyen, par exemple, d'ADN-ligase de phage T4 en présence d'ATP.
Avec l'ADN recombinant ainsi obtenu, on transforme des cellules vivantes pour amplifier l'ADNc cloné ou pour produire du polypeptide d'IL-2.
Des organismes hôtes les carpatiques intéressants, que l'on utilise ordinairement pour la production d'IL-2, sont les vertébrés, les levures, etc. Par exemple, on peut utiliser des cellules de singe, par exemple des cellules CV-1, transformées par un mutant défectueux, d'origine de SV-40 et exprimant l'antigène T SV-40 (cellules COS), comme discuté par Y. Gluzman (Cell, 23, 175-182,1981), des cellules dérivées de souris, telles que relatées par Ohno S et Taniguchi T [Nucleic Acids Research, 10, 967-977 (1982)], et les systèmes hôte (levure)-vecteur appliqués pour l'expression de gènes IFN, relatés par R. Hitzeman et Coll. [Nature, 293,717- 722 (1981)]. Des organismes hôtes procaryotiques intéressants sont les Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc.
Pour l'amplification d'ADN dans des organismes hôtes, il peut être préférable d'utiliser E. coli comme hôte ; toutefois, on peut utiliser d'autres hôtes.
Des vecteurs intéressants utilisés pour E. coli sont les plasmides de vecteurs de type EK (type serré) : pSC101, pRK353, pRK646, pRK248, pDF41, etc, les plasmides vecteurs de type EK (type relâché) : ColEl, pVH51,
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pAC105, RSF2124, pCRi, pMB9, pBR313, pBR322, pBR324, pBR325, pBR327, pBR328, pKY2289, pKY2700, pKN80,
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pKC7, pKB158, pMK2004, pACYCl, pACYC184, dul etc, les phages vecteurs : > gt. Ac, Àgt. B, ^ ZJvir., Ts622, J\. etc.. D'une manière générale, le pBR322 a souvent été utilisé comme vecteur pour E. coli et, dans ce cas, les meilleurs sites de clonage sont les sites Pst I et EcoRI.
On peut réaliser la transformation de la cellule hôte par l'ADN recombinant de la manière usuelle de la façon suivante :
Lorsque l'hôte est du type procaryotique, tel que E. coli, on prépare des cellules compétentes qui sont susceptibles de prélever de l'ADN à partir de cellules recueillies après une phase de croissance exponentielle et on les traite ensuite par la méthode au CaCl2 par des processus bien connus. Lorsque du MgCl ou du RbCl existe dans le milieu de réaction de transformation, l'efficacité de transformation augmente. On peut également réaliser la transformation après avoir formé un protoplaste de la cellule hôte.
Lorsque l'hôte utilisé est un. eucaryote, on peut utiliser une méthode de transfection d'ADN sous la forme de précipités de phosphate de calcium, des processus mécaniques usuels tels qu'une microinjection, une introduction d'un plasmide encapsulé dans des hôtes constitués par des globules rouges ou dans des liposomes, un traitement de cellules par des agents tels que de la lysophosphatidylcholine, ou encore des vecteurs de virus, etc.
Les cellules possédant le gène IL-2 peuvent être isolées après la transformation, par l'une des deux mé-
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thodes suivantes.
(1) Dans la méthode plus-moins, on obtient de l'ARNm IL-2 partiellement purifié par une centrifugation à gradient de densité de sucrose d'ARNm extrait de cellules de mammifère activées par un mitogène comme sédiment de Il à 12 brins et on synthétise ensuite du ssADNc marqué radio-activement par du 32P en utilisant l'ARNm partiellement purifié comme modèle. Après séparation du modèle d'ARNm par traitement alcalin, l'ADNc isolé est hybridé par de l'ARNm de 11 à 12 brins, partiellement purifié provenant de cellules de mammifère non activées par un mitogène. Ensuite, on fractionne les ADNc non hybridé et hybridé au moyen d'une chromatographie sur colonne d'hydroxylapatite. L'ADNc non hybridé et l'ADNc hybridé sont appelés respectivement sonde A et sonde B.
On fait croître les transformants sur deux filtres de nitrocellulose tout à fait de la même manière, et on fixe l'ADN des cellules sur le papier filtre par un traitement alcalin. La sonde A et la sonde B sont respectivement hybridées par l'ADN sur deux papiers filtres différents et on réalise ensuite un essai d'autoradiographie pour sélectionner les transformants qui réagissent positivement à la sonde A (plus), mais qui réagissent faiblement ou qui ne réagissent pas du tout à la sonde B (moins) (Taniguchi et Coll., Proc. Jpn. Acad., V 155B 464-469,1979).
(2) La seconde méthode consiste à diviser, par exemple, 1000 à 10000 clones transformants en plusieurs dizaines ou plusieurs centaines de groupes de clones. Les groupes de clones divisés sont respectivement cultivés par des moyens usuels pour obtenir des plasmides ADN.
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Ensuite, on convertit ces plasmides ADN en ss-ADNc, par exemple par dénaturation thermique, et les ss-ADNc obtenus sont fixés sur des papiers filtres de nitrocellulose pour réaliser l'hybridation d'ARNm complémentaire aux ADN fixés et préparé à partir de cellules de mammifère incorporant de l'ARNm IL-2 activé. Ou bien, les ARNm contenant de l'ARNm IL-2 sont hybridés par des plasmides ADN dénaturés à la chaleur et ensuite de l'ADN-ARNm hybride est fixé sur des papiers filtres de nitrocellulose.
Ces papiers filtres sont ensuite lavés avec un tampon à faible concentration en sel, tel que du HEPES 1 mM, ou bien avec du NaCl 10 mM, et l'ARNm adsorbé sur le papier filtre est extrait par un traitement avec une solution contenant 0,5 mM d'EDTA et 0, 1% d'une solution de SDS, par exemple pendant 1 minute à 95 C. On récupère l'ANRm purifié par élution au moyen d'une chromatographie sur 00- lonne d'oligo dT-cellulose. Ensuite, L'ARNm est traduit pour former une protéine par microinjection dans des oeufs de Xenopus laevis pour s'assurer de l'activité d'IL-2, ou bien l'ARNm est traduit pour former une protéine en utilisant des réticulocytes dépendant de l'ARNm ou un système de traduction acellulaire in vitro de germe de blé, pour analyser l'activité d'IL-2 en utilisant un anticorps anti-IL-2.
Suivant ces procédés, le groupe dans lequel la présence d'une activité d'IL-2 est décelée, est à nouveau divisé de façon répétée en groupes formés d'un plus petit nombre de clones transformants jusqu'à ce qu'un seul clone possédant de l'ADN IL-2 soit obtenu.
Pour obtenir de l'ADNc codant pour du polypeptide d'IL-2 à partir du transformant producteur d'IL-2, on sépare l'ADN recombinant dans le transformant et on le clive au moyen d'une endonucléase de restriction. On sé-
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pare la fraction d'ADNc d'insertion des fragments d'ADN formés par clivage.
La séquence complète des nucléotides de l'insertion d'ADN de PstI codant pour des polypeptides d'IL-2 à partir de l'ADN recombinant de pIL2-50A a été déterminée par le procédé de Maxam et Gilbert [Meth.
Enzym. 65,499-560 (1980)] et par la méthode de terminaison de chaîne par didésoxynucléotide [Smith A. J. M.
Meth. Enzym. 65, 560-580 (1980)].
La carte des clivages faits par des endonuléases de restriction de l'insertion d'ADNc et la séquence de base de l'insertion sont respectivement représentés par la figure 1 et la figure 2 (a), l'ADNc comportant des sites clivés par des endonucléases de restriction dans l'ordre de BstNI, XbaI etBstNI.
La séquence d'ADN de l'insertion contient un seul cadre de lecture ouvert de grande dimension. On trouve la première séquence d'ATG, qui sert ordinairement de séquence d'initiation dans les eucaryotes [Kozak M.
Cell, 15,1109-1123 (1978)], aux nucléotides 48-50 à partir de l'extrémité 5'. Cet ATG est suivi de 152 codons avant de rencontrer le triplet de terminaison TGA aux nucléotides 507 à 509. On trouve une succession de
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résidus A correspondant à l'extrémité 3'-poly (A) de l'ARNm à la fin de l'ADNccelle-ci étant précédée par l'hexanucléotide AATAAA (position 771-776), que l'on trouve ordinairement dans la plupart des ARNm eucaryotiques [Proudfoot N. J. et Brownlee C. G., Nature 263, 211-214 (1976)].
On pouvait déduire la séquence d'aminoacides, pour laquelle l'ADNc code, comme indiqué sur la figure
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2 (b) (séquence d'aminoacides I), le polypeptide de la séquence d'aminoacides I étant formé de 153 aminoacides et son poids moléculaire étant de 17631,7 daltons. Considérée comme une caractéristique commune dans la plupart des protéines de sécrétion connues jusqu'à présent [Blobel G. et Coll., Sym. Soc. exp. Med., 33,9-36 (1979)], la région N-terminale du polypeptide d'IL-2 déduit est également tout à fait hydrophobe et cette région sert probablement de peptide de détection qui est clivé au cours du processus de sécrétion de l'IL-2 mature.
Ce clivage se produit soit entre Ser et Ala respectivement aux positions 20 et 21 soit entre Ala et Pro respectivement aux positions 21 et 22, en formant le polypeptide comportant les séquences d'aminoacides II et III, puisqu'on a souvent trouvé des sites de clivage similaires dans d'autres protéines de sécrétion [Blobel G. et Coll., Symp. Soc., exp. Med. 33,9-36 (1979)]. Le polypeptide d'IL-2 mature contiendrait alors 133 ou 132 aminoacides, le poids moléculaire calculé étant de 15420,5 daltons ou de 15349,4 daltons. Cette valeur est ensuite comparée à la valeur rapportée pour la protéine d'IL-2 humaine provenant de cellules de Jurkat (15000 daltons) [Gillis S. et Coll., Immunological Rev., 63,67-209 (1982)].
De plus, il a été confirmé que le fragment d'ADN partant du codon CCT en position 111 à 113 dans la séquence de base, qui, par conséquent, code pour un polypeptide partant de Pro en position 22 [séquence d'aminoacides III sur la figure 2 (b)] exprimait un polypeptide possédant l'activité d'IL-2, comme représenté dans l'exemple 5. Il s'est également confirmé que le fragment d'ADN partant de la séquence GCA en position 107 à 110 dans la séquence de base, qui,
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par conséquent, code pour un polypeptide partant de Ala en position 21 [séquence d'aminoacides II sur la figure 2 (b)] exprime un polypeptide possédant l'activité d'IL-2, comme indiqué dans l'Exemple 8.
On sait que les gènes d'eucaryotes montrent souvent un polymorphysme, par exemple, dans les gènes d'interféron humains [Taniguchi et Coll., Gene 10,11-15 (1980), Ohno Taniguchi, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77, 5305-5309 (1986), et Gray et Coll., Nature, 295,501-508 (1981)]. Dans certains cas, le polymorphysme est accompagné d'un remplacement de certains aminoacides des produits protéiques et, dans d'autres cas, la structure du produit protéique reste inchangée. Dans le cas d'ADNc d'IL-2 humain, on peut déceler un autre clone d'ADNc (pIL2-503) dans lequel le résidu A en position 503 de l'ADNc pIL2-50A (figure 2) est remplacé par un résidu G. On peut également s'attendre à ce que d'autres clones d'ADNc aient me certaine substitution de bases comparée à l'ADNc pIL2-50A.
Comme on peut le voir d'après ce qui précède, les gènes de la présente invention englobent les ADN ayant la séquence de bams représentée par la figure 2 (a), les ADN partant de la séquence ATG en position 48 à 50 et dont les bases séquentielles suivent la séquence ATG au moins jusqu'à la séquence ATC en position 504-506, les ADN partant de la séquence GCA en position 108-110 et dont les bases séquentielles suivent la séquence GCA au moins jusqu'au codon ATC et les ADN partant de la séquence CCT en position 111-113 et dont les bases séquentielles suivent la séquence CCT au moins jusqu'à la séquence ACT.
Les gènes de la présente invention englobent égale-
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ment les ADN se terminant à la séquence ACT en position 504 à 506 et partant de A en position 1, de la séquence ATG en position 48 à 50, de la séquence GCA en position 108 à 110 ou de la séquence CCT en position 111 à 113.
Les gènes de la présente invention englobent en outre les ADN se terminant à la séquence TGA en position 507 à 509 et partant de A en position 1, de la séquence ATG en position 48 à 50, de la séquence GCA en position 108 à 110 ou de la séquence CCT en position 111 à 113. Les gènes de la présente invention englobent de plus les ADN se terminant en C en position 801 et partant de A en position 1, de la séquence ATG en position 48 à 50, de la séquence GCA en position 108 à 110 ou de la séquence CCT en position 111 à 113. Les gènes de la présente invention englobent de plus les ADN se terminant par poly (A) et partant du codon ATG en position 48 à 50, de la séquence GCA en position 108-110 ou de la séquence CCT en position 111 à 113.
Les gènes de la présente invention englobent également ceux dont les séquences de bases correspondent aux séquences d'aminoacides I, II et III. De plus, les polypeptides dont un ou plusieurs aminoacides de la séquence d'aminoacides I manquent, ou les polypeptides dont un ou plusieurs aminoacides de la séquence d'aminoacides I sont remplacés par un ou plusieurs aminoacides, peuvent avoir une activité d'IL-2.
Par conséquent, les gènes codés pour les polypeptides de ce type sont des gènes intéressants dans le cadre de la présente invention. De façon similaire, les gènes comportant une liaison additionnelle d'une ou plusieurs séquences de bases, susceptible d'exprimer un ou plusieurs aminoacides aux séquences d'aminoacides I, II ou III, sont appropriés dans le cadre de la présente invention, pour
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autant que les aminoacides liés additionnellement n'entravent pas l'action des polypeptides dans l'expression de l'activité d'IL-2. On peut utiliser dans le cadre de
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la présente invention une région d'aminoacides lias de façon additionnelle, modifié,, qui entrave la fonction des polypeptides en tant qu'IL-2, pour autant que la région liée de façon additionnelle puisse être aisément éliminée.
Cette situation est tout à fait la même pour la liaison additionnelle d'ADN à l'extrémité 3'de gènes correspondant aux séquences d'aminoacides I, II et III, codant des aminoacides additionnels au C terminal des séquences I, II et III ayant respectivement les séquences d'aminoacides I, II et III. Par conséquent, on peut considérer que l'utilisation de gènes codés pour de tels polypeptides entre dans le cadre de la présente invention.
Les ADN recombinants qui dirigent la production d'IL-2 dans les cellules vivantes peuvent être construits par différents procédés. Par exemple, la séquence codante d'ADNc d'IL-2 peut être introduite dans un véhicule d'expression en aval de la séquence de promoteurs.
Ou bien, un fragment d'ADNc portant une séquence de promoteurs peut être introduite en amont de la séquence codante d'IL-2, après ou avant l'introduction d'ADNc dans le véhicule d'expression.
Les procédés pour construire des cellules procaryotiques ou eucaryotiques qui expriment l'ADNc d'IL-2 et produisent des polypeptides d'IL-2 sont expliqués d'une façon plus détaillée ci-après : (1) Expression de l'ADNc IL-2 dans E. coli
Afin d'exprimer l'ADNc d'IL-2 dans E. coli, on soude l'ADNc à divers promoteurs bactériens et l'on ob-
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tient des plasmides hybrides contenant l'ADNc en aval des promoteurs. Les plasmides sont transfectés dans, par exemple, une souche d'E. coli HBlOl et les bactéries synthétisant un produit protéique avec une activité d'IL-2 humaine sont clonées. Essentiellement n'importe quel type de promoteur bactérien doit diriger l'expression d'ADNc d'IL-2 lorsqu'ils sont fixés séquentiellement à l'ADNc.
Des exemples de cette expression d'ADNc sont décrits dans le cas présent.
L'ADNc cloné pour l'IL-2 encode un polypeptide formé de 153 aminoacides, comme illustré par la figure 2. La région à N-terminal correspondant à environ 20 aminoacides de ce polypeptide est tout à fait hydrophobe et ceci est caractéristique de la plupart des protéines de sécrétion. Cette séquence hydrophobe, appelée également séquence de détection, est clivée au cours du procédé de sécrétion. Par conséquent, le polypeptide d'IL- 2 nature doit contenir moins de 153 aminoacides. Il est par conséquent souhaitable d'exprimer la portion d'ADNc encodant le polypeptide d'IL-2 mature mais non la portion correspondant à la séquence de détection d'IL-2.
(i) Construction d'un plasmide véhicule d'expression, pTrS-3, qui comprend un promoteur de Trp d'E. coli, son site de liaison aux ribosomes (séquence SD) pour le peptide de tête ayant été relaté antérieurement [G.
Miozzari et Yanofsky, C. J. Bacteriol. 133,1457-1466 (1978)] ainsi qu'un codon ATG situé 13 bp en aval de la séquence SD [Nishi et coll., Seikagaku, 54, nO 8,676 (1982)]. Le plasmide véhicule contient également un seul site SphI juste en aval de la séquence d'initiation d'ATG (figure 4).
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Pour exprimer l'ADNc d'IL-2, le plasmide est d'abord digéré par SphI et traité soit par de l'ADN- polymérase I d'E. coli (Fragment de Klenow) soit par de l'ADN-polymérase I de bactériophage T4 pour séparer les extrémités 3'qui dépassent [figure 5 (a)]. Le plasmide pIL2-50A est deux fois digéré par PstI et HgiAI, et on isole un plus grand fragment d'ADNc. On traite ensuite l'ADN soit par de l'ADN-polymérase I d'E. coli (fragment de Klenow) soit par de l'ADN-polymérase de bactériophage T4 de telle sorte que les extrémités 3'qui dépassent soient rendues affleurentes. L'ADNc traité cidessus encode un polypeptide d'IL-2 de 132 aminoacides, comme indiqué sur la figure 5 (a).
Cet ADNc est ensuite ligué à l'ADN du plasmide pTrS-3 prétraité tel que ci-dessus, de telle sorte que le codon d'initiation d'ATG soit fixé à la séquence CCT (Pro) de l'ADNc IL-2.
C'est ainsi que l'on obtient un plasmide pTIL2-22. La jonction entre la séquence du promoteur de trp et la séquence d'ADNc d'IL-2 du pTIL2-22 est également illustrée par la figure 5 (a).
Le plasmide pTIL2-22 doit diriger la synthèse dans E. coli d'un polypeptide d'IL-2 formé de 132 aminoacides en partant de la proline.
(ii) Puisqu'il est également possible que l'IL-2 re contienne de l'analine (position 21) comme aminoacide à N-terminal à la place de proline, on discutera du plasmide suivant qui dirige la synthèse de polypeptide d'IL- 2, formé de 133 aminoacides.
Le plasmide pTrS-3 contient un seul site ClaI entre la séquence SD et la séquence ATG (figure 4). Ce plasmide est digéré par Cla I et Sal Io Le plasmide
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pIL2-50A est partiellement digéré par PstI, traité par de l'ADN-polymérase I d'E. coli et on isole l'ADN linéaire le plus grand. L'ADN est ensuite ligué au moyen d'un liant d'ADN de synthèse contenant un site de clivage XhoI de restriction et on isole un clone contenant le plasmide pIL2-50A (Xho) qui est d'abord digéré par HgiAI, traité soit par un fragment de Klenow d'E. coli soit par de l'ADN-polymérase de T4, et digéré par XhoI et on isole le fragment d'ADNc. Le fragment d'ADNc est ensuite ligué par de l'ADN de pTrS-3 prétraité par ClaI et SalI et par un ADN de synthèse, comme indiqué sur la figure 5 (b).
C'est ainsi que l'on peut obtenir un plasmide de pTIL2-21 qui dirigera la synthèse dans E. coli d'un polypeptide d'IL-2 formé de 133 aminoacides partant de l'alanine, comme illustré sur la figure 5 (b). On peut également réaliser une construction similaire sans utilisation du liant XhoI.
(iii) On peut obtenir des polypeptides d'IL-2 de différentes dimensions avec différents aminoacides à N-terminal en utilisant le plasmide de véhicule d'expression pTrS-3 par le procédé suivant. L'ADNc d'IL-2 cloné dans le pIL2-50A contient un seul site DdeI en la position des nucléotides 81-85. Le plasmide pIL2-50A (Xho) est digéré par DdeI et on isole le fragment d'ADN conte-
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nant la plus grande portion d'ADNc. Le fragment contiendra également environ 3000 paires de bas$d'ADN prove- nant de pBR322 [figure 5 (c)]. Le fragment d'ADN est traité par de l'exonucléase Bal 31 et est ensuite digéré par XhoI.
L'ADN traité ci-dessus est ensuite ligué par du pTrS-3, qui est digéré par SphI, traité soit avec le fragment de Klenow soit avec de l'ADN-polymérase de T4
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et est ensuite digéré par SalI, comme illustré sur la figure 5 (c). L'ADN ligué est transfecté dans E. coli HB101 et les clones bactériens exprimant l'IL-2 humaine sont examinés. Ces clones doivent exprimer de l'IL-2 humaine de différentes dimensions puisque l'ADN correspondant à la région de N-terminal de l'IL-2 humaine est
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détruit de façon C'est ainsi que l'on pourrait obtenir des pTIL2-14 et pTIL2-15 portant de l'ADNc d'IL- 2.
(iv) L'ADNc d'IL-2 peut également être exprimé par l'utilisation de pKT218 (obtenu par K. Talmage) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pages 3369-3373 (1980)]. Le plasmide pKT218 est digéré par PstI et ligué au moyen d'une insertion d'ADNc IL-2 obtenue par digestion d'ADN de pIL2-50A par HgiAI et PstI (figure 6).
Le plasmide pKIL2-21 résultant a la séquence au commencement de l'initiation de la synthèse de protéine telle que représentée par la figure 6. C'est ainsi que le plasmide pKIL2-21 doit diriger la synthèse dans E. coli d'un polypeptide condensé formé de 133 aminoacides d'IL- 2 et d'un aminoacide de P-lactamase (la première méthionine est séparée par clivage dans E. coli).
(v) On a construit antérieurement un plasmide d'expression pTuBlP-5 dans lequel la séquence de promoteur pour tuf B est introduite dans pBR322 [Taniguchi et Coll., Seikagaku, 53,966 (1981)]. Le plasmide contient un seul site ClaI et celui-ci est localisé 2 bp en aval de la séquence de SD, tel que représenté par la figure 7.
Puisque le pTrS-3 contient également un site ClaI entre la séquence SD et la séquence d'initiation
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d'ATG, et puisque ce site Clal n'est pas détruit au cours de la construction du plasmide d'expression en utilisant pTrS-3 et l'ADNc d'IL-2, comme décrit ci-dessus, il est très simple de remplacer le promoteur de trp bactérien par celui de tufB, de telle sorte que l'ADNc d'IL-2 humain soit exprimé sous le contrôle du promoteur de tufB. Par exemple, le pTIL2-22 est digéré par ClaI et Pvull et on isole le fragment d'ADN contenant l'ADNc d'IL-2. Ce fragment est ensuite ligué par de l'ADN de pTuBlP-5, prédigéré par ClaI et Pvull et on construit un plasmide pTuIL2-22, tel qu'illustré par la figure 7.
L'activité d'IL-2 pouvait être décelée dans l'extrait de E. coli HB101 abritant le plasmide pTuIL2-22.
(vi) On peut également réaliser une construction similaire en utilisant, par exemple, pTIL2-21 et essentiellement la totalité des plasmides d'expression qui sont construits par l'utilisation de pTrS-3. Il est également possible d'optimaliser la distance entre les séquences SD et ATG par digestion, par exemple, de pTuIL2-22 par ClaI, séparation (ou addition) de quelques paires de bases d'ADN par Bal 31 ou SI ou par de l'ADNpolymérase 1 (E. Coli) et ensuite par religation du plasmide.
(2) Expression de l'ADNc d'IL-2 dans des levures.
L'ADNc d'IL-2 peut également être exprimé dans des levures en insérant l'ADNc dans des vecteurs d'expression appropriés et en introduisant le produit dans les cellules hôtes. Divers vecteurs de transfert pour l'expression de gènes étrangers dans des levures ont été rapportés. [Heitzman, R. et coll., Nature 293, 717-722 (1981), Valenzuela P. et coll., Nature 298, 347-350 (1982), Miyanohara et coll., Proc. Natl. Acad.
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Sci. USA 80,1-5 (1983)]. Les vecteurs sont susceptibles d'une réplication à la fois dans E. Coli et dans des levures hôtes et ils contiennent des séquences de promoteurs de gènes de levure. On peut utiliser essentiellement la totalité de ces vecteurs d'expression pour l'expression de l'ADNc IL-2.
Il est possible de réaliser des niveaux de production d'IL-2 plus élevés en utilisant une levure comparativement à l'utilisation de bactéries ou de cellules d'animal. On décrit à présent un exemple d'expression d'ADNc IL-2 humain dans une levure.
Les vecteurs de transfert pAT77 et pAM82 de levure et E. coli ont été décrits par Miyanohara et coll. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80,1-5 (1983)]. Le vecteur pAM82 est un dérivé de pAT77 et tous deux portent des marqueurs d'ars 1 [Stinchcomb D. T. et coll., Nature 282,39-43, (1979), de 2 pm ori (Broach J. R. et coll.
Gene 8, 121-133 (1979) et de leu 2 (Ratzkin B. et coll.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,474-491 (1979)] et le promoteur pour le gène d'acide phosphatase (APase) de levure. Ils portent également un segment d'ADN de 3,7 kb de pBR322 qui contient un marqueur de résistance à l'ampicilline (Apr) et l'origine de la réplication (Figure 8). Le promoteur d'APase est inductible en passant d'une concentration élevée de phosphate à une faible concentration dans le milieu de culture. Afin d'exprimer l'ADNc IL-2 humain, le pIL2-50A est digéré par PstI après traitement soit par le fragment de Klenow d'E. Coli soit par de l'ADN-polymérase de T4, l'ADNc est ligué au moyen de pAM82 préalablement digéré par XhoI et incubé par le fragment de Klenow d'E. Coli pour remplir les extrémités.
On choisit des plasmides hybrides dans lesquels la séquence codante d'ADNc est en aval de la séquence de promoteur d'APase de levure en les clonant dans E. Coli. On introduit le plasmide obtenu, pYIL-2a,
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dans la levure et, après introduction du promoteur d'APase, on mesure l'activité d'IL-2 dans l'extrait de levure. Le plasmide pYIL-2a contient une série de résidus GC entre le promoteur de levure et l'ADNc IL-2. Il est possible qu'une telle séquence inhibe l'expression de l'ADNc d'IL-2. Afin de pallier à ce problème, on réalise la construction suivante d'un plasmide ; le plasmide pIL2-50A est digéré par PstI et on isole l'insertion d'ADNc.
On traite ensuite cet ADNc par de l'ADN-polymé- rase de T4 en présence de dATP, dGTP et DTTP de telle sorte que les successions de résidus C aux deux extrémités de l'ADNc soient morcellées, et on le traite ensuite par de la nucléase SI, de manière à séparer les successions de résidus G. Cet ADN est ligué par un liant d'ADN de XhoI et le plasmide pBR322 dont le site EcoRI est clivé et est rendu affleurant par EcoRI et le fragment de Klenow, le plasmide résultant, pIL2-Xho, étant digéré par XhoI et l'insertion d'ADNc isolée. On introduit alors l'ADNc dans le site XhoI unique de pAM82 et on clone dans E. Coli un plasmide contenant la séquence codante d'IL-2 correctement orientée par rapport au promoteur d'APase de levure.
On introduit le plasmide pYIL-2b dans la levure et, après introduction du promoteur d'APase, on mesure l'activité d'IL-2 dans l'extrait de levure.
(3) Expression de l'ADNc dans des cellules de mammifère.
Un plasmide qui dirigerait la synthèse d'IL-2 humaine dans des cellules de mammifère peut être construit de la façon suivante. On construit un plasmide pCE-1 à partir de pKCR [O'Hare K. et coll., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA., 78,1527-1531, (1981)] et de pBR328 [Soberon X. et
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coll., Gene, 9, 287-305 (1980)] par une série de processus de modification tels qu'illustrés par la figure 2,
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et on relie une séquence d'initiation d'ATG du gène de IL-2 en aval du promoteur du gène précoce de SV40. Ce plasmide contient un seul site de PstI juste en aval du promoteur précoce de SV40 et en amont de la partie du gène chromosomial de p-globine de lapin contenant un intron. Le plasmide contient également l'origine de la réplication de SV40 ainsi que le site de polyadénylation pour le gène précoce. C'est ainsi que l'on obtient un plasmide pCEIL-2, dans lequel le gène structural d'IL-2 doit être transcrit du promoteur précoce de SV40 dans des cellules hôtes appropriées (figure 2).
Ce plasmide est digéré par Hhal et est ensuite introduit par transfection d'ADN dans la lignée de cellules de singe transformées COS-7, ce qui permet la réplication d'ADN contenant les séquences d'origine de SV40. Il apparaît comme étant important de faire digérer le plasmide par Hhal avant la transfection pour l'expression effective d'ADNc puisque les séquences qui pouvaient entraver la réplication de l'ADN transfecté dans les cellules COS peuvent être séparées de la partie essentielle du plasmide pour l'expression d'ADNc par ce processus. Après un à trois jours de culture sous des conditions de culture ordinaires après transfection de ce vecteur à des cellules cultivées de singe COS-7 [Gluzman Y. Cell, vol. 23,175-182 (1981)], l'IL-2 est ordinairement sécrétée et produite dans le milieu de cellules cultivées.
Afin d'insérer de l'ADN amplifié dans d'autres cellules eucaryotiques, un vecteur approprié aux organismes hôtes est relié de façon similaire à une insertion d'ADNc clivée et isolée de cellules procaryotiques et la cellule eucaryotique peut être transfectée avec le vecteur ainsi synthétisé et cultivée.
On cultive des cellules incorporant de l'ADN recombinant pour amplifier l'ADN recombinant ou
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pour produire un polypeptide d'IL-2. La culture est réalisée par des moyens usuels. Par exemple, on peut cultiver une levure transformée dans un milieu contenant une source de carbone, une source d'azote, des sels inorganiques et, suivant les nécessités, des agents nutritifs organiques, tels que des vitamines et des aminoacides, à une température de l'ordre de 200 à 370C et à un pH de l'ordre de 4 à 7 sous des conditions aérobies. On peut également cultiver des organismes procaryotiques transformés, tels que E. Coli ou B. subtilis sous des conditions ordinaires.
On récupère l'IL-2 produite intracellulairement on extracellulairement par n'importe quelle méthode connue, telle que par précipitation au sulfate d'ammonium, dialyse pour séparer les sels (à la pression ordinaire ou sous vide), filtration sur gel, chromatographie, focalisation isoélectrique sur lit plat préparatoire, électrophorèse sur gel, chromatographie liquide
EMI35.1
à haut rendement (appelée ci-après"CLHR") chromatographie par échange ionique, à filtration sur gel et à pha- se inversée, et chromatographie d'affinité sur support lié à un colorant, sur Sépharose 4B activé couplé avec un anticorps monoclonal vis-à-vis de l'IL-2 ou sur Sépharose 4B lié à de la lectine, etc. Des méthodes de récupération et de purification d'IL-2 sont décrites par Watson et coll., J. Exp. Med., 150,848-861 (1979), Gillis et coll., J.
Immunol., 124,1954-1962, (1980), Mochizuki et coll., J. Immunol Methods 39,185-201, (1980) et par Welte, K. et coll., J. Exp. Med., 156, 454-464 (1982).
Le polypeptide ainsi obtenu montre le même comportement biochimique et biologique que celui de l'IL-2 produite par des cellules de mammifère par stimulation au moyen d'un mitogène, et est doté de l'activité
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d'IL-2. Le poids moléculaire se situe aux alentours de 15.000 daltons et l'activité d'IL-2 est complètement neutralisée ou précipitée par des anticorps anti-IL-2 monoclonaux en présence ou en l'absence d'immunoadsorbants, tels que l'Igsorb (Enzyme Center). En immunoélectrophorèse, le polypeptide d'IL-2 ne montre qu'un seul précipité vis-à-vis de l'anticorps anti-IL-2 correspondant. L'activité d'IL-2 reste stable après réduction par du 2-mercaptoéthanol, et est résistante au traitement par la DNAse et la RNAse ainsi qu'au traitement à la chaleur à 560C pendant 30 minutes.
L'activité est stable à un pH se situant entre 2 et 9. L'IL-2 produite pourrait promouvoir la croissance de cellules T fonctionnelles monoclonales (lymphocytes T cytotoxiques), favoriser la mitogénèse des thymocytes, donner lieu à la production de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques antitumoraux à partir d'un état humoral en l'absence d'antigène, et pourrait être utilisée pour augmenter l'activité des cellules tueuses naturelles
EMI36.1
contre les cellules YAC-1 et RL 1.
La présente invention sera à présent décrite plus en détail au moyen de certains exemples spécifiques qui sont donnés uniquement à des fins d'illustration et non dans un but limitatif, sauf indication contraire.
Exemple 1.
(1) On met en suspension une lignée de cellules de leucémies T humaines, à savoir des cellules Jurkat (librement disponibles au Japon, en République Fédérale d'Allemagne et aux Etats-Unis) dans du milieu RPMI 1640 contenant 10% en volume/volume de FCS et on les irradie par des rayons X jusqu'à 10.000 roentgens à la température ambiante pendant 50 secondes en utilisant un appareil d'irradiation aux rayons X Exs 150/300-4
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(Toshiba, Japon), et on cultive ensuite les cellules irradiées pendant 5 jours à 37 C dans un incubateur con-
EMI37.1
tenant 5% de C02 à une densité cellulaire initiale de 1 5 x 105 cellules ml dans le milieu de culture susmention- né.
Les cellules mutées (0,2 cellule/puits) sont placées dans 10 microplaques à fond plat comportant 96 puits, et cultivées à 37 C dans un incubateur contenant 5% de C02 pendant 21 jours.
Les clones obtenus au départ des puits montrant une croissance sont transférés de façon répétée dans du milieu de culture frais pour propager les dimensions de clone, les clones propagés sont cultivés pendant 24 heures à une densité cellulaire initiale de 1 x
106 cellules/ml en présence de 50 g/ml de Con A et on mesure l'activité d'IL-2 suivant les procédés décrits précédemment. Par conséquent, on a sélectionné une lignée de cellules T humaines appelée Jurkat-111 (désignée ci-après par"J-lll") (ATCC CRL8129), clonée à partir de cellules de Jurkat d'origine, dont la productivité d'IL-2 a été accrue de 40 fois par rapport à celle de la souche de base.
La lignée de cellules clonées J-111 pourrait croître sous des conditions ordinaires et le taux de croissance est pratiquement similaire à celui des cellules de Jurkat ordinaires.
(2) On inocule des cellules (1 X 105/mol) de J-111 dans 1. 000ml de milieu de culture synthétique sans sérum RITC 55-9 [Sato T. et coll., Exp. Cell Res., 138,127-134 (1982)] dans des bouteilles de culture fixées dans des tambours tournants (Falcon 3027) et on les cultive pendant 4 jours à 37 C, les cellules qui se propagent étant recueillies par centrifugation. Les cellules recueillies sont à nouveau inoculées dans le milieu susmentionné auquel on ajouté 25 g/ml de Con A, de manière à obtenir 4 x 106 cellules/ml. On effectue qua-
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tre essais de bouteilles de culture sur tambours roulants (Falcon), en plaçant dans chaque essai 1.000 ml du milieu de culture inoculé.
On poursuit la culture pendant 6 heures avec rotation.
(3) Les cellules de Jurkat (1,2 x 10) ainsi stimulées par 25 g/ml de Con A pendant 6 heures sont mises en suspension dans 8.000 ml de tampon phosphate équilibré par une solution saline (appelé ci-après "PBS"). Les cellules sont lavées deux fois par centrifugation et sont ensuite remises en suspension dans 800
EMI38.1
ml de solution de RSB (10 millimoles de Tris-HCl ; pH de 7, 5 ; 10 millimoles de NaCl ; 1, 5 millimole de mgCl) con- tenant un complexe ribonucléosides-vanadyle (10 millimoles), un inhibiteur de nucléase. On ajoute alors un détergent NP-40 de manière à arriver à une concentration finale de 0,05%, on mélange doucement et on sépare les noyaux cellulaires par centrifugation pendant 5 minutes
EMI38.2
à 3. 000 tours par minute à 4 C.
On ajoute du SDS (0, 5%) et de l'EDTA (5 millimoles) au surnageant, et on extrait l'ARN cytoplasmique par addition d'un volume égale de phénol. Après trois extractions au phénol, on précipe l'ARN avec un volume double d'éthanol et on recueille les précipités par centrifugation, que l'on solubilise dans 10 millimoles de Tris-Hcl de pH 7,5. La quantité d'ARN obtenue est de 196 mg.
On réalise un fractionnement d'ARNm en utilisant une chromatographie d'affinité sur oligo (dT)-cellulose (P. L. Biochemicals, Type 7). La solution d'adsorption est une solution à pH 7,5 contenant 20 millimoles de Tris-HCl, 0,5 mole de NaCl, 1 millimole d'EDTA et 0,5% de SDS et on réalise l'élution successivement avec de l'eau et 10 millimoles de Tris-HCl (pH de 7,5) après lavage de la colonne avec le tampon (20 millimoles de Tris-HCl, pH de 7,5 ; 0,5 moles de NaCl ; 1
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EMI39.1
millimole d'EDTA). L'ARNm résultant élué s'élève à 3, 6 mg.
Ensuite, on fractionne 2, 4 mg de l'ARNm obtenu par une centrifugation à gradient de densité de sucrose (gradient de densité de sucrose de 5 à 2,5%) dans une solution à pH 7,5 contenant 50 millimoles de Tris-HCl, 1 millimole d'EDTA et 0,2 moles de NaCl, et on centrifuge à 26.000 tours par minute pendant 24 heures à 4 C, les fractions d'ARNm comportant 11 à 12 brins étant fractionnées comme fractions numéros 12,13 et 14 respectivement à raison de 59 g, 46 g et 60 g ; (4) L'ARNm obtenu dans la fraction nr. 13 est microinjecté dans l'oocyte de Xenopus laevis (50 ng d'ARNm/oeuf) et on se sert du surnageant de culture pour essayer l'activité d'IL-2.
Comme indiqué dans le Tableau 1, l'augmentation du nombre de lymphocytes T activés se voit confirmée, ce qui montre clairement que l'ARNm dans cette fraction contient de l'ARNm d'IL-2 humain.
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TABLEAU 1 (a)
EMI40.1
<tb>
<tb> Echantillon <SEP> Dilution <SEP> Fixation <SEP> de <SEP> Quantité <SEP> d'IL-2
<tb> 3H-TdR <SEP> (cmp) <SEP> (Unités/ml)
<tb> Contrôle <SEP> 1-553 <SEP> 0 <SEP>
<tb> (Milieu <SEP> pour
<tb> essai)
<tb> Contrôle <SEP> II <SEP> x <SEP> 2 <SEP> 590 <SEP> 0
<tb> (Surnageant <SEP> de
<tb> culture <SEP> d'oeuf
<tb> non <SEP> traitée)
<SEP> x <SEP> 32 <SEP> 572
<tb> Produit <SEP> de <SEP> traduction <SEP> de <SEP> la <SEP> x <SEP> 8 <SEP> 14.683 <SEP> 32
<tb> fraction <SEP> 13 <SEP> x <SEP> 32 <SEP> 10.165
<tb>
EMI40.2
EMI40.3
<tb>
<tb> Dilution <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> Quantité <SEP> d'IL-2
<tb> lymphocytes <SEP> (unités/ml)
<tb> T <SEP> (Nbre/puits)
<tb> Contrôle <SEP> I <SEP> x <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> (Milieu <SEP> pour
<tb> essai) <SEP> x <SEP> 16 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Contrôle <SEP> II <SEP> x <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> (Surnageant <SEP> de
<tb> culture <SEP> d'oeuf <SEP> x <SEP> 16 <SEP> 0
<tb> non <SEP> traitée)
<tb> Produit <SEP> de <SEP> traduction <SEP> de <SEP> la <SEP> x <SEP> 2 <SEP> 115 <SEP> 40
<tb> fraction <SEP> 13 <SEP> x <SEP> 16 <SEP> 55
<tb>
L'unité est calculée en comparant la quantité de 3H-TdR incorporée à celle d'IL-2 standard (10 unités/ml)
suivant une analyse statistique.
(5) Ensuite, on synthétise de l'ADNc in
<Desc/Clms Page number 41>
EMI41.1
vitro à partir de la fraction nr. 13 d'ARNm de 11 à 12 brins contenant de l'ARNm d'IL-2 et on reconstruit de l'ADN recombinant avec le plasmide vecteur PBR 322. Avec l'ADN recombinant, on transforme Escherichia coli, et on sélectionne le clone ayant acquis des clones d'ADNc d'IL-2 de la façon suivante : (5-1) 50 millimoles de tampon Tris-HCl (pH de 7, 5), 30 millimoles de NaCl, 6 millimoles de MgCI2'5 millimoles de dithiothréitol (appelé ci-après"DTT"), 0,5 millimole de chacun des composés dATP, dGTP, dCTP et
EMI41.2
32 dTTP (le dCTP est marqué radioactivement au P, 0, 7 pg d'oligo (dT) 10' 10 pg d'ARNm et 15 unités de transcriptidase réverse AMV (J. W. Beard) sont mélangés et maintenus pendant 90 minutes à 41 C.
Une fois la réaction terminée, on récupère l'ADN sous la forme de précipités éthanoliques après un traitement au phénol, et on solubilise l'ADN dans une solution de pH 7,5 contenant 20 millimoles de Tris-HCl et 1 millimole d'EDTA. On synthétise 2,5 pg de ss-ADNc. Pour séparer l'ARNm présent dans cette solution, on ajoute à la solution du NaOH jusqu'à ce qu'on obtienne une solution de NaOH 0,33 N, on la laisse au repos pendant 15 heures à la température ambiante, on neutralise ensuite la solution avec un volume égale de Tris-HCl 1M de pH 7,5 et on la fait passer dans une colonne de"Séphadex G-50". On récupère 1,8 g d'ADNc.
(5-2) On mélange 50 millimoles de tampon phosphate (pH de 7, 5), 10 mM de MgCI2'10 mM de DTT, 0,75 mM de chacun des composés suivants : dATP, dGTP,
EMI41.3
g dCTP et dTTP (le dCTP est marqué radioactivement au 3H), 1, 8 g de ss-ADNc et 8 unités de polymérase I (BRL, Etats-Unis) et on laisse réagir pendant 15 heures à 15 C. Une fois la réaction terminée, on récupère l'ADN sous la forme d'un précipité éthanolique, après trai-
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tement par du phénol et du chloroforme. On obtient 1, 10 pg de ds-ADNc. On incube un mélange de 50 mM d'a-
EMI42.1
cétate de sodium (pH de 4, 5), de 0, 2 M de NaCl, de lmM de ZnCI-et de 1, 10 g de ds-ADNc pendant 20 minutes à 35 C, on lui ajoute 0, 25 unité de nucléase S- (Sankyo, Japon), et on incube à nouveau pendant 15 minutes.
Une fois la réaction terminée, on applique le produit de réaction traité deux fois par du phénol sur du Séphadex G-50 pour donner 0,55 g de ds-ADNc.
(5-3) On incube un mélange de 0,14 M de cacodylate de potassium, de 30 mM de Tris-base, de 0,1
EMI42.2
mM de DTT, de 1 mM de COC12'de 64 mM de P-dCTP fi (activité spécifique de 2, 7 x cpm/n mole), de 0,55 pg de ds-ADNc et de 5 unités de transférase terminale (BRL) pendant 7 minutes à 350C, et on l'applique ensuite sur une colonne de Séphadex G-50 après traitement au phénol, ce qui donne 0,50 g d'ADN sous la forme de précipités éthanoliques. On constate que l'ADN récupéré s'est allongé d'environ 50 résidus de dCMP aux deux extrémités 3'.
On clive 10 g de pBR 322 par l'enzyme de restriction PstI, et on ajoute les extrémités 3'de l'ADN clivé à la chaîne de dGMP, par le même procédé que celui utilisé dans l'addition de dCMP au ds-ADNc susmentionné, à l'exception que l'on utilise du dGTP à la place de dCTP.
(5-4) Un mélange de 50 mM de Tris-HCl (pH de 7,5), de 0,1 M de NaCl, de 5 mM d'EDTA, de 0,05 pg de pBR 322 allongé par des résidus de dGMP et de 0,01 pg d'ADNc allongé par du dCMP est tout d'abord incubé pen-
EMI42.3
dant 2 minutes à 65 C, ensuite pendant 120 minutes à 46 C, pendant 60 minutes à 37 C et finalement pendant 60 minutes à la température ambiante. On inocule E. coli X 1776 [Curtiss III, R. et coll., dans Molecular Cloning o Recombinant DNA, édité par W. A. Scott & R.
Werner, Aca-
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demic Press (1977)] dans 50 ml de bouillon L contenant 100 pg/ml d'acide diaminopimélique, 50 pg/ml de thymidine, 1% de tryptophane, 0,5% d'extrait de levure, 0,5%
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de NaCl et 0, 1% de glucose et on effectue une culture à secousses à 37 C jusqu'à ce que l'absorption du liquide de culture à 562 nm se situe aux alentours de 0,3 de densité optique. Après avoir terminé la culture, on laisse le liquide de culture à 0 C pendant 30 minutes, et on recueille ensuite les cellules bactériennes par centrifugation suivie d'un double lavage avec 25 ml d'une solution contenant 5 mM de Tris-Hcl (pH de 7,6), 0, 1 M de NaCl, 5 mM de MgCl2 et 10 mM de RbCl.
Les cellules ainsi obtenues sont mises en suspension dans 20 ml d'une solution contenant 5 mM de Tris-HCl (pH de 7,6), 0,25 M de KC1, 5 mM de MgCI2'0, 1 M de CaCl et 10 mM de RbCl et laissées à 0 C pendant 25 minutes, on recueille ensuite les cellules pour les remettre en suspension dans 1 ml de la même solution, on ajoute l'ADN recombinant décrit ci-dessus dans 0,2 ml de la suspension cel-
EMI43.2
lulaire et on laisse la suspension à 0 C pendant 60 mi- nutes.
Ensuite, on ajoute 0,7 ml de bouillon L à la culture tout en secouant pendant 30 minutes à 37 C. Le milieu de culture ainsi obtenu (0,1 ml) est appliqué totalement sur la surface d'un milieu à 1,5% d'agarose, formé de bouillon L contenant 100 pg/ml d'acide diaminopimélique, 50 pg/ml de thymidine et 15 pg/ml de tétracycline, et est incubé à 37 C pendant 2 jours.
(5-5) Les quatre cent trente deux colonnies qui apparaissent sont divisées en 18 groupes, chaque groupe contenant 24 clones bactériens différents, inoculées dans 200 ml de bouillon L contenant 100 pg/ml d'acide diaminopimélique, 50 pg/ml de thymidine et 10 pg/ml de tétracycline et cultivées sous secousses à 37 C pendant 5 à 7 heures. Ensuite, on ajoute à nouveau
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à la culture pendant la nuit 200 ml de bouillon L frais contenant du chloramphénicol à une concentration finale de 170 pg/ml. On purifie l'ADN de plasmide ainsi amplifié par des moyens usuels. Les clones comportant l'ADNc IL-2 sont dépistés par un essai d'hybridation-traduction d'ARNm (appelé ci-après essai"H-T").
On utilise dans le cas présent l'essai H-T de la façon suivante : de l'ADN purifié (25 g) est clivé par une enzyme de restriction Hind III, traité trois fois par du phénol, traité respectivement par un mélange de phénol et de chloroforme et du chloroforme, précipité par de l'éthanol, lavé avec de l'éthanol à 80% et dissous dans 40 ; jl de formamide à 80%. On chauffe le mélange de réaction pour la dénatu-
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ration à 90 C pendant 5 minutes, et on le dilue ensuite à 1, 3 ml avec 10 X SSC (1, 5 M de NaCl, 0, 15 M de citrate de sodium).
L'ADN est ensuite fixé sur des filtres de nitrocellulose, lesquels filtres sont séchés à 80 C pendant 3 heures et incubés pendant 18 heures à 370C dans une solution contenant 50% de formamide, 20 mM de Pipes
EMI44.2
de pH 6, 5, 0, 75 M de NaCl, 5 mM d'EDTA, 0, 2% de SDS et 250 pg de poly (A) ARNm provenant de cellules J-111 induites de manière à hybrider l'ADN fixé sur les filtres par de l'ARNm d'IL-2. Ensuite, les filtres sont lavés à 650C trois fois avec une solution contenant 10 mM de Pipes de pH 6, 5 et 0, 15 M de NaCl, une solution contenant 1 mM de Pipes et 10 mM de NaCl et traités par une solution contenant 0, 5 mM d'EDTA et 0, 1% de SDS à 950C pen- dant 1 minute de manière à récuper l'ARNm hybridé des filtres.
On purifie l'ARNm ainsi extrait sur une colonne d'oligo dT-cellulose de la manière habituelle et on l'injecte dans des oocytes de Xenopus de manière à déterminer l'activité d'IL-2 des protéines traduites. Un seul des 18 groupes, chaque groupe comportant 24 clones, donne une activité d'IL-2 positive de 48 unités/ml dans
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EMI45.1
3 l'essai d'incorporation de H-TdR décrit ci-dessus, tous les autres groupes étant clairement négatifs. Ensuite, on inocule 24 colonies isolées appartenant au groupe positif dans 200ml de bouillon L répondant à la même composition que celle décrite ci-dessus, on les cultive aérobiquement pendant 5 à 7 heures à 370C et on leur ajoute à nouveau, de façon similaire, du bouillon L frais contenant du chloramphénicol.
Après amplification de l'ADN de plasmide au moyen d'une culture pendant la nuit, l'ADN de plasmide est purifié d'une façon similaire suivant les processus standards. Après clivage d'environ 5 pg de chaque ADN de plasmide par Hind III, chaque ADN de plasmide est lié d'une façon similaire à des filtres de nitrocellulose. Les filtres sont hybridés par de l'ARNm d'IL-2 et on récupère l'ARNm hybridé pour l'injecter dans des oocytes de Xenopus de manière à déterminer l'activité d'IL-2 des protéines traduites.
Comme indiqué dans le Tableau 2, seul l'ADN de plasmide purifié au départ d'une seule colonie, appelée p3-16, donne une activité d'IL-2 positive. Par conséquent, on identifie ce clone comme étant le clone possédant l'ADNc d'IL-2 [E. coli X 1776/p3-16 AJ 11995 (FERM-BP-225)].
EMI45.2
C'est ainsi qu'il se confirme que l'ADN de plasmide, p3-16, partage exactement l'ADN (gène IL-2) susceptible de former l'hybride spécifique avec l'ARNm d'IL-2.
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TABLEAU 2 (a)
EMI46.1
<tb>
<tb> *
<tb> Echantillon <SEP> Dilution <SEP> Fixation <SEP> de <SEP> Quantité <SEP> d'IL-2 <SEP>
<tb> 3H-TdR <SEP> (cpm) <SEP> (Unités/ml)
<tb> Contrôle <SEP> l <SEP> - <SEP> 2.
<SEP> 010 <SEP> 0
<tb> (Milieu <SEP> pour
<tb> essai)
<tb> Contrôle <SEP> II <SEP> x <SEP> 2 <SEP> 2.120 <SEP> 0
<tb> (Surnageant <SEP> de
<tb> liquide <SEP> de <SEP> cul-x <SEP> 32 <SEP> 2.482 <SEP> 0
<tb> ture <SEP> d'oeuf
<tb> non <SEP> traité)
<tb> Produit <SEP> de <SEP> traduction <SEP> d'ARNm <SEP> x <SEP> 8 <SEP> 20.453 <SEP> 58
<tb> x <SEP> 32 <SEP> 20.961
<tb>
EMI46.2
(b)
EMI46.3
<tb>
<tb> Echantillon <SEP> Dilution <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> Quantité <SEP> d'IL-2*
<tb> lymphocytes <SEP> T <SEP> (Unités/ml)
<tb> (Cellules/
<tb> puits)
<tb> Contrôle <SEP> l <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> (Milieu <SEP> pour
<tb> essai)
<tb> Contrôle <SEP> II <SEP> x <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> (Surnageant <SEP> de
<tb> liquide <SEP> de <SEP> cul-x <SEP> 32
<tb> ture <SEP> d'oeuf
<tb> non <SEP> traité)
<tb> Produit <SEP> de <SEP> traduction <SEP> d'ARNm <SEP> x <SEP> 2 <SEP> 88 <SEP> 32
<tb> x <SEP> 32 <SEP> 42
<tb> ARNm <SEP> hybridé <SEP> par <SEP> ADNc <SEP> provenant <SEP> du <SEP> plasmide <SEP> p3-16.
<tb>
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L'insertion d'ADNc du plasmide p3-16 montre des caractéristiques qui doivent être clivées par l'enzyme de restriction XbaI en un seul site et par BstNI en deux sites (en amont et en aval du site de clivage XbaI). Toutefois, le plasmide p3-16 contient une insertion d'ADNc formée d'environ 650 paires de bases, ce qui correspond apparemment à une partie de l'ARNm d'IL-2 de la dimension de 11 à 12 brins.
Par conséquent, on prépare une autre cuvée d'ADNc suivant le procédé de Land et coll. [Land et coll., Nucleic Acids Res., vol. 9, p. 2551, (1981)] en utilisant de l'ARNm d'IL-2 comme modèle ou matrice. On synthétise de l'ADNc à simple brin (1,6 pg) en utilisant 4 pg d'ARNm IL-2 allongé par des résidus de dCMP, et on synthétise du ds-ADNc en utilisant de l'oligo (dG) 12-18 comme amorceur pour ADN-polymérase 1 (fragment de Klenow). On obtient un ADNc (0,6 pg) plus long qu'un mar-
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queur d'ADN comportant 680 paires de bases par une centrifugation à gradient de sucrose et on l'introduit dans le site de PstI de pBR322 par la méthode aux extrémités G-C standard.
Après transformation de E. coli X 1776 par l'ADN recombinant, on détecte environ 2. 000 colonies par la méthode d'hybridation in situ de Grunstein-Hogness avec une insertion d'ADNc de p3-16 traduite (par entaille) comme sonde et on identifie la colonie contenant le plasmide pIL 2-50A contenant environ 850 paires de bases et le clone transformé [E. coli X 1776 pIL 2-50A, AJ 11996 (FERM-BP-226)]. Les cartes montrant les points de clivage faits par les endonucléases de restriction de l'insertion d'ADNc de pIL 2-50A sont représentées sur la figure 1.
Pour isoler un gène codant pour un peptide d'IL-2 à partir de pIL 2-50A d'E. coli X 1776 transformé, on fait digérer de l'ADN de plasmide par l'enzyme de
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PBS, et on ajoute ensuite 0,5 ml de PBS contenant 20% de glycérol en le laissant à la température ambiante pendant 3 minutes. A nouveau, on sépare le milieu par aspiration et on lave les cellules avec 1 ml de PBS et les cultive dans 1 ml de DMEM contenant 5% de FCS. Toutes les 24 heures, on substitue 500 pi de milieu par du milieu frais. Chaque milieu, recueilli à des intervalles de temps appropriés, est maintenu à 4 C jusqu'au moment de son utilisation. Deux à trois jours après la transfection, on examine le milieu de cellules cultivées pour son activité d'IL-2 humaine.
Comme indiqué dans le Tableau 3, le surnageant de culture résultant de cellules COS-7 transfectées par PCEIL-2 est doté d'une activité d'IL-2. On ne décèle aucune activité d'IL-2 dans le milieu de culture de cellules transfectées par pCE-l.
TABLEAU 3
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<tb>
<tb> ADN <SEP> transfecté <SEP> par <SEP> Activité <SEP> d'IL-2 <SEP> Croissance <SEP> de
<tb> mesurée <SEP> par <SEP> fi-lymphocites <SEP> T
<tb> xation <SEP> de
<tb> H-TdR <SEP> (p/ml)
<tb> PCEIL-2 <SEP> 12 <SEP> ++++ <SEP>
<tb> pCE-1 <SEP> 1
<tb>
L'activé d'IL-2 trouvée dans le milieu de culture de cellules après transfection des cellules COS-7 par pCEIL-2 est neutralisée depuis 12 unités/ml jusqu'à moins de 1 unité/ml par des anticorps monoclonaux anti-IL-2-humaine de souris (BALB/c).
Le fait que les cellules COS-7 transfectées par pCEIL-2 secrètent de l'IL-2 humaine montre clairement que les cellules d'eucaryote transformées par un ADN recombinant comprenant un gène codant pour du polypeptide d'IL-2 et un ADN de vecteur susceptible de réplication dans ces cellules, peuvent s'avérer très intéressantes pour la production
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tant contient un seul site de PstI juste en aval du promoteur précoce de SV40.
L'insertion d'ADNc de pIL 2-50 est excisée par clivage au moyen de PstI et liguée au pCE-1 clivé par pCTI pour la construction de pCEIL-2 dans lequel l'expression du gène structural d'IL-2 doit être sous le contrôle du promoteur précoce de SV40. Le plasmide pCE-1 est construit initialement pour le clonage d'ADNc par la méthode des extrémités G-C [Chang A. C. Y. et coll., Nature, 275,617-624, (1978)] dans des bactéries et l'expression directe dans des cellules de mammifère.
Ce plasmide est digéré par HhaI et est ensuite introduit par transfection d'ADN (McCutchan et coll., J. Natl. Cancer Inst. 41,351-357, 1968) dans une lignée de cellules de singe transformées COS-7, ce qui permet la réplication d'ADN contenant les séquences d'origine de SV40, voir Gluzman Y. (Cell 23,175-182, 1981). Il apparaît comme étant important de faire digérer le plasmide par HhaI avant la transfection pour l'expression effective d'ADNc puisque les séquences qui pourraient entraver la réplication de l'ADN transfecté dans les cellules COS peuvent être séparées de la partie essentielle du plasmide pour l'expression de l'ADNc par
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A ce processus.
Des cellules COS-7 (6 x sont mises en suspension dans 0,5 ml de DMEM contenant 5% de FCS dans une plaque de culture comportant 24 puits (Nunc) et incubées pendant 24 heures à 370C. Ensuite, on ajoute aux cultures cultivées un mélange de 1 pg du vecteur dé-
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crit ci-dessus, de 17, 6 pi de Tris-HCl 1mM contenant 0, 1 mM d'EDTA, de 2, 4 pi de CaCl2 2 M et de 120 pi de 2 x HBS contenant 50 mM de Pipes, 280 mM de NaCl et 1, 5 mM de (pH de 7, 10). Les cellules sont à nouveau incubées pendant 4 heures à 370C et on sépare par aspiration le milieu de culture, on le lave avec 1 ml de
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restriction PstI après avoir isolé la région d'ADN des cellules par des moyens usuels. C'est ainsi que le fragment le plus petit obtenu parmi les deux fragments d'ADN produits est le gène d'ADN codant pour le peptide d'IL 2.
La séquence nucléotidique complète de l'insertion de PstI à partir de pIL 2-50A est déterminée par le procédé de Maxam et Gilbert [Maxam A. W. et coll., Enzym. 65, 499-560 (1980)], la structure entière étant représentée par la figure 2.
Exemple 2
Le plasmide pKCR [O'Hare et coll. Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, vol. 78, No. 3,1527-1531 (1981)] se compose (i) de segments d'ADN de SV40 (représentés par les tronçons hachurés sur la figure 3) contenant un promoteur de gène précoce ainsi qu'une origine de réplication (0,725-0, 648 m. u. ) et un site de polyadénylation provenant du gène précoce (0,169-0, 144 m. u.), (ii) d'une partie du gène de y-globine de lapin (représenté par les tronçons ouverts (fragment BamHI-PvuII) et (iii) d'un segment provenant de pBT322 (fragment EcoRI-BamHI) contenant une origine de réplication et un gène de résistance à l'ampiciline. Ce plasmide est clivé par BamHI et, après avoir complété les deux extrémités de l'ADN clivé par de l'ADN-polymérase I (fragment de Klenow), on introduit un ADN de liant de PstI pour reconstruire le pKCR (PstI).
Le plasmide pKCR (PstI) est clivé par SalI, traité par le fragment de Klenow pour compléter les extrémités et est ensuite clivé partiellement par EcoRI de manière à obtenir un fragment EcoRI-SalI qui contient l'ADN total provenant de SV40 et le gène de globine. Ce fragment est ensuite ligué à un morceau d'ADN de pBR328, qui contient un gène de résistance à la tétracycline et une origine de réplication, comme montré sur la figure 3. Le plasmide pCE-1 résul-
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d'IL-2.
Le plasmide PCEIL-2 (AJ 12008) incorporé dans E. coli HB101 a été déposé sous le numéro d'inscription FERM-BP 244.
Exemple 3.
On inocule Escherichia coli X 1776/pIL 2-50A [AJ 11996 (FERM-BP-226)] préparé dans l'exemple 1 dans 250 ml de bouillon L, contenant 100 pg/ml d'acide
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diaminopimélique, 50 pg/ml de thymidine, 1% de tryptophane, 0, 5% d'extrait de levure, 0, 5% de NaCl et 0, 1% de glucose, et on le cultive sous secousses à 37 C jusqu'à ce que la densité optique à 562 nm du milieu cultivé soit de 0,5. Une fois la culture terminée, on laisse le milieu cultivé au repos à 0 C pendant 30 minutes, on récolte les cellules par centrifugation, on les lave une fois avec 20 mM de Tris-HCl contenant 30 mM de NaCl et on les remet en suspension dans 1, 8 ml du même tampon.
On ajoute ensuite aux cellules une solution contenant 0,2 pl de lysozyme (10 mg/ml) et 20 pl d'EDTA 0,5 M et on laisse le mélange au repos à 0 C pendant 20 minutes, le mélange étant ensuite congelé-dégelé trois fois successivement. Ensuite, on obtient des extraits de cellules (1, 5 ml) après centrifugation à 40.000 tours par minute pendant 30 minutes. On soumet l'extrait à un relarguage par des sulfates d'ammonium à 85%, on l'applique sur du Séphadex G15 pour séparer les sels, on le soumet ensuite à une chromatographie sur colonne de cellulose DEAE et on rassemble les fractions éluées par du tampon Tris-HCl 0,06 M (pH de 7,6).
Les fractions ainsi rassemblées sont séchées par congélation et sont ensuite soumises à une chromatographie sur perles de verre aux pores contrôlés (250Â, Funakoshi Pharmaceuticaly, Japon) de manière à ce que l'activité d'IL-2 soit conférée dans l'éluant avec un tampon de glycine-HCl 0,3 M, la frac-
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tion contenant l'IL-2 exerçant une activité de 12 unités/ml d'IL-2. Les résultats montrent clairement que E. coli X 1776/pIL 2-50A, AJ 11996 produit effectivement de l'IL-2.
Exemple 4.
On fait croître d'une façon similaire dans des bouteilles de culture sur tambours roulants une lignée cellulaire productrice d'IL-2 de manière constitutive J-Al886 (ATCC CRL8130), clonée à partir de cellules de Jurkat suivant les moyens décrits dans l'exemple 1.
On remet en suspension les cellules qui se sont développées dans du milieu synthétique frais RITC-55-9 à une densité cellulaire initiale de 1 x 106 cellules/ml et, 8 heures après le commencement de la culture, on se sert des cellules pour l'extraction des fractions d'ARNm d'IL-2 de Il à 12 brins, à partir de 3 x 109 cellules, suivant les étapes décrites dans l'exemple 1.
On synthétise de la même façon que dans l'exemple 1 de l'ADNc à double brin et on obtient un ADNc plus long que 600 paires de bases (2,4 pg) après fractionnement sur un gradient de densité de sucrose. On allonge ensuite l'ADNc avec des résidus de dCMP en utilisant une désoxynucléotidyl transférase terminale et on traite une portion de 50 ng avec 250 ng de pBR322 clivé par PstI, allongé par dGMP. On utilise les plasmides hybrides résultant pour transformer E. coli X 1776 et on obtient les transformants d'environ 4.000 clones. Suivant la méthode de Grunstein-Hogness, on sélectionne trois clones complémentaires avec l'ADNc de plasmide 3-16 utilisé comme sonde. Les clones ainsi sélectionnés sont donc des clones transformés comportant le gène IL-2 humain.
Exemple 5.
On construit un plasmide qui doit diriger
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la synthèse d'IL-2 humaine dans des cellules d'E. coli de la façon suivante. On construit un plasmide pTIL2-22 à partir de pTrS-3 [Nishi T., Taniguchi T. et coll., SEIKAGAKU 53,967 (1981)] et de pIL 2-50A contenant de l'ADNc d'IL-2 par une série de processus de modification tels qu'illustrés par la figure 5 (a). Le plasmide pTrS-3 contient une insertion de la région du promoteur de Trp et de Shine Dalgarno (appelée ci-après"SD") entre le site EcoRI et le site ClaI de pBR322. Le plasmide contient également un codon d'initiation d'ATG 13 bp en aval de la séquence SD ainsi qu'un seul site SphI, comme illustré par la figure 4.
Le vecteur s'avère très efficace pour produire cette protéine lorsque la séquence d'ADN correspondant à ladite protéine est introduite dans la phase juste en aval du codon d'ATG, qui est produit par digestion par SphI et par un traitement ultérieur au moyen d'ADN-polymérase de T4 de pTrS-3. Par conséquent, le plasmide pTrS-3 (30 pg) est clivé par l'enzyme de restriction SphI de la manière habituelle et, après un traitement par du phénol et ensuite par du chloroforme, on récupère les précipités éthanoliques, et on rend ensuite les deux extrémités affleurantes par traitement au moyen d'ADN polymérase de T4. Ensuite, on récupère l'ADN (21,4 pg) par un traitement similaire avec du phénol et ensuite avec du chloroforme et on précipite au moyen d'éthanol.
D'un autre côté, on clive 380 pg de pIL 2-50A contenant de l'ADNc d'IL-2 par PstI et on isole l'insertion d'ADNc d'IL-2 par électrophorèse sur gel d'agarose. L'insertion d'ADNc (ll pg) est clivée par HgiAI, traitée par de l'ADN-polymérase de T4 et on isole 10 pg de l'ADN du site le plus grand par électrophorèse sur gel d'agarose. On obtient de cette façon un ADNc (7,2 pg) codant pour 132 aminoacides et ce fragment d'ADN comporte des extrémités tronquées [figure 5
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(a)]. Ensuite, le fragment d'ADNc ainsi obtenu est ligué à un vecteur pTrS-3, préalablement digéré par SphI et traité par l'ADN-polymérase de T4 juste en aval de la séquence d'ATG. On utilise le plasmide ligué de la sorte, pour transformer E. coli HB101 suivant les processus habituels. On réalise la liguation de la façon suivante.
On mélange le plus grand fragment d'ADNc d'IL-2 (0,4 pg) et 0, 2 pg d'ADN de vecteur de pTRS-3 avec 0, 8 unité d'ADN-ligase de T4 dans 66 mM de Tris-HCl de pH 7,5 contenant 6,6 mM de MgC12'1 mM d'ATP et 10 mM de DTT, et on laisse le mélange réagir à 40C pendant la nuit. Parmi les transformants apparaissant sur la plaque d'agar et de bouillon L contenant de l'ampiciline, les colonies contenant la portion d'ADNc d'IL-2, qui encode 132 aminoacides, sont sélectionnées par un essai d'hybridation de colonies in situ. Les colonies ainsi sélectionnées sont cultivées (10 ml) à nouveau pour préparer de l'ADN de plasmide au moyen d'un traitement par lysozyme et par congélation-liquéfaction.
Les ADN de plasmide sont clivés par PstI et Xbal, et on analyse les produits résultant par électrophorèse sur gel d'agarose afin d'identifier le pTIL 2-22 dans lequel l'ADNc est lié à la séquence d'ATG de pTrS-3 suivant une orientation correcte.
On cultive E. coli HB101 contenant le pTIL 2-22 sous les conditions habituelles connues pour la propagation de micro-organismes. On fait croître les cellules dans 10 ml de bouillon X (2,5 % de Bactotrypton, 1,0% d'extrait de levure, 0,1% de glucose, 20 mM de MgSO., 50 mM de Tris-HCl, pH de 7,5) contenant 25 pg/ml de streptomycine et 25 pg d'ampicilline à 370C pendant la nuit. On inocule 1 ml de la suspension de culture dans le même bouillon X (100 ml) et on cultive à 370C. Lorsque la densité optique à 650 mp arrive aux alentours de 1, 5-2,0, on ajoute de l'acide 3-indole acrylique (IAA).
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Trois heures après l'addition de l'inducteur, on recueille les cellules, on les lave avec 20 mM de Tris-HCl (pH de 7,5 ; 30 mM de NaCl) et on les remet en suspension dans 8 ml du même tampon. Pour obtenir un fonctionnement efficace du promoteur de Trp, on ajoute des inducteurs tels que l'IAA à une concentration finale de 50 pg/ml.
Les protéines ainsi obtenues dans les cellules bactériennes sont extraites par sonication (0 C ; 2 minutes) ou au moyen d'une digestion par lysozyme (8 pg) (0 C ; 20 minutes) suivie de trois congélations-liquéfactions successives. Suivant ces processus, on réalise une extraction usuelle d'IL-2 des organismes. L'activité d'IL-2 extraite se situe entre 10. 000 et 120.000 unités/ml.
E. coli HB101 contenant le pTIL 2-22 (AJ 12009) a été déposée sous le numéro d'identification FERM-BP 245.
Exemple 6.
On construit un plasmide pTuIL 2-22, portant de l'ADNc d'IL-2, à partir de pTuBlP-5 [Taniguchi, T. et coll., Seikagaku, 53,966, (1981)] et du pTIL 2-22 représenté dans l'exemple 5, par les procédés tels qu'illustrés sur la figure 7. Le plasmide pTuBlP-5 comporte une insertion de la séquence de promoteurs pour tufB dans pBR322. Le plasmide contient également un seul site de ClaI et celui-ci est disposé 2bp en aval de la séquence SD, comme représenté sur la figure 2.
Puisque le pTrS-3 contient également un site ClaI entre la séquence SD et le codon d'initiation d'ATG, et puisque ce site ClaI n'est pas détruit au cours de la construction du plasmide d'expression en utilisant le pTrS-3 et l'ADNc d'IL-2 tels que décrits dans l'exemple 5, il est très simple de remplacer le promoteur de trp bactérien par celui de tufB, de telle sorte que l'ADNc d'IL-2 soit exprimé sous le contrôle du promoteur de tufB.
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Par conséquent, on clive le plasmide pTIL 2-22 (30 pg) avec les enzymes de restriction Clal et PvuII de la manière habituelle. On isole le fragment (environ 2,2 kb) contenant de l'ADNc d'IL-2 et on le purifie par une électrophorèse sur gel d'agarose de mani- ère à récupérer 3 pg d'ADN. D'un autre côté, on clive de façon similaire 20 pg de vecteur de pTuBIP-5 par Clal et PvuII, et on isole le fragment le plus grand (environ 3,4 kb) contenant le gène résistant à l'ampiciline et on le purifie par électrophorèse sur gel d'agarose pour récupérer 3,5 pg d'ADN. Ensuite, les deux fragments obtenus de cette façon, l'un (environ 3,4 kb) contenant le promoteur de tufB, l'autre (environ 2,2 kb) contenant l'ADNc d'IL-2, sont ligués de la façon suivante.
On mélange le fragment contenant l'ADNc d'IL-2 (1,2 pg) et 0,3 pg du fragment contenant le promoteur de tufB avec 0,8 unité d'ADN-ligase de T4 dans 66 mM de Tris-HCl de pH 7,5 contenant 6,6 mM de MgCI2'1 mM d'ATP et 10 mM de DTT, et on laisse le mélange réagir à 40C pendant la nuit. On utilise ensuite le plasmide ligué de cette fa- çon pour transformer E. coli HB101 suivant les processus habituels. Parmi les transformants aparaissant sur la plaque d'agar et de bouillon L contenant de l'ampiciline, on sélectionne huit colonies contenant la portion
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o d'ADNc d'IL-2, comme le pTuIL 2-22 sur la figure 7, et on prépare de l'ADN de plasmide comme décrit dans l'exemple 5.
On cultive E. coli HB101 contenant pTuIL 2-22 dans du bouillon L (100 ml) à 370C. Lorsque la densité optique à 650 mp se situe aux alentours de 0, 5-1, 0, on récolte les cellules bactériennes, on les lave avec 20 mM de Tris-HCl (pH de 7,5 ; 30 mM de NaCl) et on les remet en suspension dans 2 ml du même tampon. Les protéines ainsi obtenues sont extraites de la même façon que dans l'exemple 5. L'activité d'IL-2 extraite se situe
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entre 6.000 et 56.000 unités/ml.
Escherichia coli HB101 contenant pTuIL 2-22 (AJ 12010) a été déposée sous le numéro d'identification FERM-BP 246.
Exemple 7.
On construit un plasmide pGIL 2-22, portant de l'ADNc d'IL-2, à partir de pGL 101 [Roberts T. M. et Laucer G. D., Meth. Enzym., 68,473-483 (1979)] et de pTIL 2-22 de l'exemple 5.
Le plasmide pGL 101 (20 pg) contenant un promoteur de lac est clivé par l'enzyme de restriction PvuII de la manière habituelle de manière à récupérer 17 pg d'ADN par un traitement au phénol, ensuite au chloroforme et par une précipitation dans de l'éthanol. D'un autre côté, le pTIL 2-22 (75 pg) est clivé par Clal et SalI de manière à récupérer 2,2 pg d'un fragment d'ADN contenant de l'ADNc d'IL-2 par électrophorèse sur gel d'agarose. Le fragment est rendu affleurant en le traitant par de l'ADN-polymérase I (fragment de Klenow), et les deux fragments ainsi obtenus (0,25 pg et 0,066 pg) sont ligués avec 1, 0 unité d'ADN-ligase de T4 de la même manière que dans l'exemple 6. Le plasmide ligué ainsi est ensuite utilisé pour transformer E. coli HB101 de la manière habituelle.
Parmi les transformants, on sélectionne les transformants possédant l'insertion du fragment ClaI-SalI contenant de l'ADNc d'IL-2 comme sonde.
On cultive ensuite ces transformants dans du bouillon X (10 ml) contenant 25 pg/ml d'ampiciline et on prépare l'ADN de plasmide de la manière décrite dans l'exemple 5. C'est ainsi que l'ADN de plasmide possédant la séquence d'initiation d'ATG d'ADNc d'IL-2 juste en aval d'un promoteur de lac est obtenu par clivage par PstI et XbaI.
On inocule le pGIL 2-22 ainsi obtenu dans
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100 ml de bouillon L contenant 25 pg/ml d'ampiciline et 25 pg/ml de streptomycine et on le cultive. Lorsque la densité optique à 650 mp se situe aux alentours de 0,5,
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on ajoute de l'isopropyl-ss-D-thiogalactopyrannoside (IPTG) en une concentration de 1mM et une heure plus tard, on recueille les cellules bactériennes et on prépare les extraits cellulaires de la manière décrite dans l'exemple 6. L'activité d'IL-2 extraite se situe entre 6.000 et 80.000 unités/ml.
Escherichia coli HB101 contenant pGIL 2-22 (AJ 12011) a été déposé sous le numéro d'identification FERM-BP 247.
Exemple 8.
On a d'abord clivé le plasmide pTrS-3 (10 pg) avec l'enzyme de restriction SalI et on a rendu le site de SalI affleurant par un traitement par de l'ADN-polymérase (fragment de Klenow) ou par de l'ADNpolymérase de T4. Après clivage avec ClaI, on isole un plus grand fragment, contenant la région du promoteur de trp, par électrophorèse sur gel d'agarose de la manière usuelle pour récupérer 3 pg d'ADN.
D'un autre côté, 11 pg d'insertion d'ADNc obtenus par le clivage de PsTI de pIL2-50A sont clivés par HgiAI, traités par de l'ADN-polymérase de T4, on isole un plus grand fragment et on le purifie par électrophorèse sur gel d'agarose. C'est ainsi que l'on obtient un fragment d'ADNc codant pour 132 aminoacides d'IL-2 en une quantité de 7,2 pg. Ensuite, 0,45 pg du fragment contenant un promoteur de trp (décrit ci-dessus), 0,5 pg de fragment de HgiAI-PstI contenant de l'ADNc d'IL-2 et des oligonucléotides (5') CGATAAGCTATGGCA (3') et (3') TATTCGATACCGT (5') synthétiques (chacun de 20 pmoles), tous deux étant phosphorylés à l'extrémité 5', sont ligués par une unité
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d'ADN-ligase de T4 de la même manière que dans l'exemple 5 [figure 5 (b)].
On utilise ensuite le plasmide ligué de cette façon pour transformer E. coli HB 101. Parmi les transformants apparus les transformants visés sont choisis de la façon suivante.
Les candidats transformants susceptibles d'hybridation avec l'ADNc d'IL-2 et les oligonucléotides synthétiques sont tout d'abord choisis par une méthode d'hybridation de colonies, ensuite les transformants possédant l'insertion de fragment d'ADN partant de la séquence CCT en position 111 à 113 sur la figure 2 (a) (CCTACT-----) juste en aval de la séquence ATG GCA sont choisis par clivage avec PstI, XbaI.
Les transformants ci-dessus, qui contiennent pTIL2-21a ou pTIL2-21b, sont cultivés dans du bouillon L de la manière décrite dans l'exemple 5, et on peut trouver des activités élevées d'IL-2 dans des extraits cellulaires des transformants lorsqu'ils sont examinés de la manière indiquée dans l'exemple 5.
Escherichia coli HB101 contenant pTIL2-21a (AJ 12013) et Escherichia coli HB 101 contenant pTIL2-21b (AJ 12014) ont été déposés respectivement sous les numéros d'identification FERM-BP 248 et FERM-BP 249.
Les hôtes E. coli X 1776 et HB 101 [Boyer H. W. et coll., J. Mol. Biol. 41,459 (1969)], utilisés dans les exemples ci-dessus sont connus et accessibles au public. De plus, on peut obtenir les hôtes au départ des transformants déposés en cultivant les transformants dans du bouillon L à 37 C de manière à libérer les ADN recombinants respectifs dans les transformants et à séparer les souches qui deviennent sensibles à la tétracycline et à l'ampicilline comme hôtes.
Les plasmides vecteurs pBR322 (qui est dé-
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livré dans le commerce, par exemple, par Bethesda Research Laboratory), pCE-1, PTrS-3 et pGL101 sont connus et accessibles au public. De plus, on peut obtenir les plasmides vecteurs au départ des transformants déposés en séparant les ADN de plasmides recombinants dans les transformants de la manière usuelle et en séparant les plasmides vecteurs par des méthodes qui apparaissent comme évidentes en fonction des Exemples respectifs. Par exemple, on peut obtenir le pCE-1 par digestion de pCEIL-2 par PstI et par séparation du plus grand fragment d'ADN formé. De plus, les pTrS-3 et pTuBlP-5 ont été déposés respectivement sous les dénominations E. coli FERM-P 6735 et E. coli ATCC 31871.
Il doit être entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisation ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre du présent brevet.