JPH0832238B2 - ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチドの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトインターロイキン２活性をもつポリペ
プチドの製造法に関する。

インターロイキン２（以下、「IL−２」と略記す
る。）は、以前はＴ細胞増殖因子と呼ばれており、レク
チンあるいは抗原で活性化されたＴ細胞より産生される
可溶性たんぱく（一般には「リンホカイン」として知ら
れている）である（Morganら,Science,193,1007〜1008
（1976）,Gillisら,J.Immunol.,120,2027〜2033（197
8））.IL−２はリンパ球の反応性を調節でき、抗原特異
的なエフエクターＴ−リンパ球のin vitroにおける長期
培養を可能ならしめることができる（Gillisら,Nature,
268,154〜156（1977））。またIL−２は、胸腺細胞の分
裂の促進（Chenら,Cell Immunol.,22,221〜224（197
7）,Shawら,J.Immunol.,120,1967〜1973（1978）），ヌ
ードマウスの脾細胞の培養系での細胞障害性Ｔリンパ球
活性（Wagnerら,Nature,284,278〜280,（1980））や抗
−SRBCプラーク形成細胞反応の誘導（Gillisら,J.Exp.M
ed.149,1960〜1968（1979））等の関連する他の生物活
性をもつことが明らかにされている。従って、このリン
パ球調節因子は液体免疫や細胞性免疫反応を増強したり
免疫不全状態を正常な液体や細胞性免疫の状態に回復さ
せるのに有用である。これらの明らかにされたIL−２の
免疫学的活性は、IL−２が悪性腫瘍，細菌またはウイル
ス感染，免疫不全，自己免疫疾患等（Papermasterら,Ad
v.Immunopharm.,507,（1980））に対する医科免疫療法
に有用であることを示している。インターフェロンと同
様に、IL−２はナチュラルキラー細胞活性を増強するこ
とが示されてきたが、これは悪性腫瘍治療への有用性を
強く示唆している。更に、IL−２は単クローン性の活性
化Ｔ細胞の保持を可能とし、この事は、Ｔ細胞分化の分
子機構,T細胞機能の分化機構,T細胞の抗原リセプターの
機構を研究する上で重要な役割を担っていることを示し
ている。また、IL−２は単クローン性Ｔ細胞を長期培養
することにより、他の種々の分野で有用な様々なＴ細胞
由来のリンホカインを製造するためにも使用できる。更
に、IL−２の産生とリンパ球のIL−２に対する応答性
は、免疫学的機能の重要なパラメーターであり、免疫異
常の臨床診断に有用である。

IL−２は従来の技術では、マイトジェンでマウス，ラ
ットあるいはヒトのリンパ球を刺激することにより製造
されてきた（Gillisら,Nature,268,154〜156,（197
7））,Farrarら,J.Immunol.,121,1353〜1360,（1978）,
Gillisら,J.Immunol.,120,2027〜2033,（1978））。ヒ
トの末梢血リンパ球をマイトジェンで刺激することによ
り（Gillisら,J.Immunol.,124,1954〜1962,（198
0））、GillisらはＴリンホーマ細胞株からのマウスIL
−２の製造（Gillisら,J.Immunol.,125,2570〜2578（19
80））とヒト白血病細胞株からのヒトIL−２の製造（Gi
llisら,J.Exp.Med.,152,1709〜1719,（1980））を報告
している。

Gillisらによる上記の技法は、細胞培養法を用いてマ
イトジェンで活性化されたＴ白血病細胞株からヒトIL−
２を製造する方法に関するものである。しかしながら、
この方法では低濃度のヒトIL−２しか産生されないのが
難点で、大量の培養液から微量のIL−２を得るために、
複雑な精製工程を必要とする。更に、ヒトＴ白血病細胞
株は少量のヒトIL−２に酷似した他の生理活性物質も産
生するので、IL−２をこれらの他の免疫活性を有する分
子と分離、あるいは時として共存する細胞毒物質（toxi
c lectin）と分離するにはかなりの困難が伴う。

IL−２を製造する他の方法として、インターフェロン
のような他の生理活性ヒト由来たんぱくを製造するため
に用いられた組換えDNA（デオキシリボ核酸の略）法（G
rayら,Nature 295,503〜508,（1981）,Nagataら,Nature
284,316〜320（1980）,Taniguchiら,Gene 10,11〜15,
（1980））が好ましいと思われる。しかしながら、本発
明の以前には組替えDNA法によってIL−２を製造する試
みは成功していなかった。例えば、組換えDNA体によっ
てIL−２を産生する生命体を作成しようとする試みは、
恐らくIL−２ポリペプチドをコードする遺伝子が未だク
ローン化されていなかったために成功していないという
事が、“日経バイオテクノロジー，第19号,1982年７月
５日”に報告されていた。

従って、IL−２をコードするクローン化遺伝子とその
遺伝子を持った組換えDNA体が渇望されてきた。また、
組換えDNA体を有する生細胞株と、その細胞株を使ってI
L−２を製造する方法が渇望されてきた。

本発明の要旨は以下の記述から更に容易に明白とな
る。本発明の目的はIL−２活性を有するポリペプチドの
製造法を創出したことにある。

すなわち、本発明は原核細胞に適合しうるプラスミド
ベクターのDNA鎖の上流より、それぞれ原核細胞内で機
能するプロモーター，リボゾーム結合部位，翻訳開始コ
ドンおよび式 で示されるアミノ酸配列を含むヒトインターロイキン２
活性を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミ
ノ酸配列に対し１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、
付加あるいは置換がされたアミノ酸配列を有するヒトイ
ンターロイキン２活性を有するポリペプチドをコードす
る遺伝子を順次配列してなる組換えDNA体により形質転
換された原核生物の細胞を培地中で培養することを特徴
とする糖鎖を伴わず、ヒト由来の他の蛋白質を含有しな
いヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチドの製
造法を提供するものである。

本発明にいうヒトインターロイキン２活性を有するポ
リペプチドとしては、以下のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドが挙げられる。

上記配列は、特許請求の範囲に記載されるアミノ酸配
列のＮ末端のAlaが欠失したものである。

上記配列は特許請求の範囲に記載されるアミノ酸配列
のＮ末端にMetが付加されたものである。

上記配列は特許請求の範囲に記載されるアミノ酸配列
のＮ末端のAlaがMetに置換されたものである。

本発明により製造されるポリペプチドとしては、上記
アミノ酸配列の中で１個ないしそれ以上のアミノ酸を欠
くポリペプチド；上記アミノ酸配列の中の１個ないしそ
れ以上のアミノ酸が１個ないしそれ以上のアミノ酸で置
換されたポリペプチド；上記アミノ酸配列に対して１個
ないしそれ以上のアミノ酸が追加されたポリペプチドで
あって、インターロイキン２活性を有するものであって
もよい。

本発明における原核生物の細胞としてはエシェリヒア
属に属するものが好ましく、さらにエシェリヒア・コリ
に属するものが好ましい。

本発明によって、インターロイキン２活性を有するポ
リヘプチド（以下、IL−２と呼ぶことがある。）は、該
ポリペプチドを産生すべくコードされた遺伝子の挿入
と、細胞の中で複製され得るベクターDNAの挿入で組換
え法により修飾され、該遺伝子のコードシーケンスが、
プロモーターシーケンスの下流に位置するDNAによってI
L−２を産生すべく形質転換させた原核生物細胞株、特
にエシェリヒア・コリを培地に浮遊培養（好気的）する
ことによって製造される。

IL−２ポリペプチドをコードしたクローン化遺伝子
は、IL−２活性を有するポリペプチドを産生する能力を
もつことによって特徴づけられる哺乳動物細胞に由来す
るIL−２に相当するメッセンジャーRNA（mRNA;“RNA"は
リボ核酸の略，以下“IL−2 mRNA"という）を相補的DNA
（cDNA）に逆転写することによって得ても良い。得られ
た一重鎖cDNA（ss−cDNA）は２重鎖cDNA（ds−cDNA）に
変換させることができる。

cDNAを調製するための鋳型として用いるmRNAは、IL−
２ポリペプチドを産生する哺乳動物細胞から単離するこ
とができる。単離されたRNAはポリアデニル化され（GiL
Lisら,Immunological Rev.,63,167〜209（1982））、ポ
リアデニル化されたRNAは、例えばショ糖密度勾配遠心
法によって11〜12S画分に分画することができる。13Sの
mRNAにIL−2 mRNA活性が現われることがあるが、この場
合は11〜12S mRNAの凝集物であることが考えられる。

本発明に用いるmRNAの供給源となるIL−２を産生する
ことができる哺乳動物細胞は、哺乳動物より摘出できる
末梢血単核球，扁桃腺細胞，脾臓細胞のようなＴ−リン
パ球で良い。細胞にIL−２産生能を与えたり、またはIL
−２活性を増強するために、ナイロンカラム処理，抗血
清と捕体処理，密度勾配分画，ノイラミニダーゼとガラ
クトースオキシダーゼの組合せ処理，トリプシン処理の
ような様々な酵素処理,X線照射など従来知られた方法で
前処理しても良い。上記哺乳動物細胞をＴ細胞増殖因子
存在下で培養後得られるクローン化Ｔリンパ球もmRNAの
供給源として用いることができ、これはより好ましいＴ
−リンパ球である。白血病やリンパ腫細胞株に由来する
Ｔリンパ球それ自体または上記の方法で前処理または変
異したそれらの誘導体などの形質転換されたリンパ球細
胞株またはクローニングされた形質転換細胞株もmRNAの
供給源として好ましい。明らかに、クローン化した細胞
株は通常クローン化前の親株に比較して多量のIL−2 mR
NAを含んでいる。上記したリンパ球由来細胞とCEM,Molt
4F,BW5147のごとき腫瘍細胞株を融合することによって
得られたＴ細胞ハイブリドーマもまた本発明に使用する
のに好ましい哺乳動物細胞である。この場合のリンパ球
由来細胞は、（１）IL−２の自発産生細胞および（２）
IL−２産生を補助する他の細胞の存在下または非存在下
に培養液中にマイトジェンが導入され存在している時の
みIL−２を産生する細胞を含む。

IL−２自発産生細胞においてIL−2 mRNAを誘導するた
めに、IL−２自発産生細胞は、細胞培養の分野でよく知
られた方法で培養される。マイトジェン存在下のみでIL
−２を産生する細胞においてmRNAを産生する場合は、培
養した細胞は培地で良く洗った後、血清を含むかまたは
含まないローズウエルパークメモリアルインスティテュ
ート1640（以下、“RPMI 1640"と略す。），ダルベッコ
ウ変法イーグル培地（以下“DMEM"と略す。）またはク
リック培地のごとき培地に再び浮遊する。これらの細胞
培養培地には、ペニシリン，ストレプトマイシンまたは
他の抗生物質,L−グルタミン，ヘペス緩衝液，または炭
酸水素ナトリウムのような種々の添加物を細胞培養の分
野で一般に使われる濃度で加えても良い。好ましい細胞
濃度は0.5〜４×10⁶細胞/mlである。mRNAの活性化とIL
−２の産生を誘導するために適当な刺激剤が加えられ
る。この適当な刺激剤の中には、マイトジェン，ノイラ
ミニダーゼ，ガラクトースオキシダーゼ，塩化亜鉛の如
き亜鉛化合物またはプロテインA,ストレプトリシン−Ｏ
の如き細菌由来のリンパ球活性化因子が含まれる。刺激
された細胞は回収され、洗浄される。マイトジェン刺激
の際、マクロファージまたはデンドリティック細胞を共
存させるとやはりmRNAを活性化し、あるいは活性化mRNA
の収量を増大させ得る。同様にRaji,Daudi,K562,BALL−
１の如きＢリンパ球またはＢリンパ球細胞株に由来する
細胞株を共存させてもmRNAは活性化され、または活性化
mRNAの収量を増大させ得る。

哺乳動物細胞を増殖させるために、細胞は通常の条件
下でin vitroで細胞培養により、または組織適合動物の
体内で維持される。mRNAの供給源を調製するためにin v
itro培養による継代を行なう場合には、従来Ｔ細胞の生
育を促進することが知られている培地であればどのよう
な培地にもこれら細胞は生育する。これらの培地には哺
乳動物の血清，血清成分または血清アルブミンを添加し
ても良い。mRNAの活性化のための培養時間は、mRNAを生
成するための活性化に必要な時間に対応する。この時間
は、通常IL−２の培地中への産生が開始されるまでに必
要な時間と対応している。好ましい時間は、マイトジェ
ン等の刺激剤を添加してから３〜12時間である。培養時
間が長すぎる場合、生成したIL−2 mRNAが分解されるこ
とがある。IL−２産生細胞の活性化に際し、PMAまたはT
PAの如きホルボールエステル類を10〜50ng/ml添加して
活性化レベルを上昇させることもできる。

IL−2 mRNA活性化のための上記工程はpH7.0〜7.4,温
度範囲32〜38℃の飽和水蒸気の環境下で行なわれる。

IL−２を産生する哺乳動物細胞を取得し培養する方法
を以下に述べる。

（イ）IL−２自発産生株の取得 ヒトＴリンパ球由来白血病細胞であるジュルカット細
胞（フレッド・ハッチンソン・癌研究所／シアトル／ア
メリカ，ソーク研究所／サンジエゴ／アメリカ，西ドイ
ツ国立癌センター／ハイデルベルヒ／西ドイツ等で自由
に手に入る。）を１×10⁶個/mlの細胞密度でクリック培
地中に懸濁させ、150レントゲン／分の照射速度で合計
8,000レントゲンのＸ線照射を行なう。この後、本細胞
を0.1細胞/200μ培地の細胞密度で96穴の平底マイク
ロタイタープレート（「ファルコン3072」）に添加し、
５％牛胎児血清を含むクリック培地中で３週間37℃にて
５％CO₂インキュベーター中にて培養する（限界希釈法
によるクローニング）。細胞の生育が認められた培養ウ
エル中の細胞は、細胞が底面全体をおおう密度に到達す
る前に24穴のヌンク社製培養プレートに移し、クリック
培地中にて５日間細胞を増殖させる。さらに、本細胞を
１〜２×10⁶個/mlの細胞密度にて血清も血清由来アルブ
ミンも含まない無血清合成培地に懸濁して２日間培養
し、本培養上清を遠心分離操作で分離し、次いで0.22μ
のミリポアフィルターにてデブリス除去と無菌化を行な
った。このようにして得た培養上清のIL−２活性を測定
することによってIL−２を自発産生するＸ線処理変異株
が選択され、かつクローニングされた。

（ロ）ヒト末梢血単核細胞よりIL−２産生株の取得 ヒトの末梢血を採血し、フイコール・ハイパークの密
度勾配遠心法により末梢血リンパ球（以下、PBLと略
す。）を採取する。本PBLを１×10⁶個/mlの細胞密度で
５％FCSを含むクリック培地に懸濁し、各2ml宛24穴のヌ
ンクの培養プレートに接種する。ここにフイトヘマグル
チニン−Ｍ（ギブコ社製）を５μg/mlの終末濃度になる
ように100μ添加し、上述の条件下に48時間培養し、
次いで細胞を培養液で洗浄し、再び１×10⁵個/mlの細胞
密度でクリック培地1mlに接種する。さらに、コンカナ
バリンＡ（以下、ConAと略す。）2.5μg/mlで48時間刺
激したヒト脾細胞から調製したコンディショニングした
培地1mlを加え、該コンディショニングした培地50％を
含む培地を３日毎に取り換えて、PBLからのヒトＴリン
パ球を長期継代培養する。このように長期継代培養して
得たＴリンパ球を、前述と同様の限界希釈法でコンディ
ショニングした培地に由来するヒト脾細胞の存在下、ク
ローニングを行ない、かつ同様に細胞増殖を行なう。こ
うして得られたクローン化Ｔリンパ球を１×10⁶個/mlの
細胞密度に10μg/mlのフイトヘマグルチニン（以下、PH
Aと略す。）の存在下、24穴のヌンク培養プレート中のR
PMI 1640培地1mlに接種し、24時間,37℃で7.5％CO₂イン
キュベーター中にて培養した。本培養上清を遠心分離操
作で分離し、次いで0.22μのミリポアフィルターで無菌
化を行なった後、IL−２産生ヒト正常Ｔリンパ球クロー
ンを同定するために、IL−２活性検定を行なった。

（ハ）マイトジェン刺激でIL−２を生産するヒトリンパ
球由来悪性化細胞の取得 前述のジュルカット細胞や前記した限界希釈法により
クローン化されたＪ−111株は、前記の無血清培地や血
清１〜２％を含むBPMI 1640培地中にてConA 10μg/mlや
PHA 2.5μg/mlの存在下に24時間培養すると、10〜4,000
単位/mlのIL−２を産生することができる。また、これ
らヒト悪性化細胞は塩化亜鉛，プロテインA,ピシバニー
ル存在下に培養しても、IL−２を産生する。

（ニ）他の細胞もしくはその細胞の産生する因子の存在
下にマイトジェンで刺激することによりIL−２を産生す
る細胞の取得 ヒトリンパ球悪性化細胞Molt 4Fや前述の限界希釈法
でクローン化されたジュルカット細胞の１つのクロー
ン，ジュルカット99株は、上述のごときレクチンやマイ
トジェンを広い濃度範囲で加えて24〜72時間培養しても
IL−２を産生しない。ところが、この間モノカインの１
種であるインターロイキン１を５〜10u/mlまたは50％の
K562やラージ（Raji）細胞を共存させて37℃,24時間培
養すると、IL−２を確認しうる量（10〜100u/ml）産生
する。

このようにして活性化された細胞よりIL−2 mRNAを抽
出するには、細胞の種類を問わず常法によって行なえば
よい。たとえば、NP−40,SDS,Triton−X100,デオキシコ
ール酸などの界面活性剤を添加して細胞を部分的または
完全に分解するか、ホモゲナイザーや凍結融解などの物
理的方法を用いて、細胞を部分的あるいは完全に破壊，
可溶化する。その際に、RNaseによるRNAの分解を防ぐた
めに、抽出液中にRNaseインヒビター、たとえばヘパリ
ン，ポリビニル硫酸，ベントナイト，マカロイド，ジエ
チルピロカーボネート，バナジウム複合体などを添加し
ておくのが好ましい。また、場合に応じては、抗IL−２
抗体を用いてIL−２合成途上のポリゾームを沈降せし
め、これよりmRNAを界面活性剤などで抽出する方法も行
ない得る。

また、poliAを含むmRNAの精製についてはオリゴdT−
セルロース，セファロース2Bを担体とするポリＵ−セフ
ァロースなどのアフィニティ・カラムあるいはバッチ法
による精製法,SDG遠心法による分画，アガロースゲル電
気泳動法等によって行なうことができる。

上記の如くして得られたmRNAがIL−2 mRNA活性を有す
るものであることを確認するためには、mRNAを蛋白に翻
訳させ、その生理活性を調べるか、抗IL−２ペプチド単
クローン性抗体を用い該翻訳蛋白を同定する等の方法を
行なえばよい。たとえばmRNAは通常、アフリカツメガエ
ル（Xenopus laevis）の卵にマイクロインジェクション
することにより（Gurdonら,Nature,233,177〜182（197
2））あるいは網状赤血球または小麦胚無細胞翻訳シス
テムを使用することにより対応する蛋白に翻訳される。

IL−２活性は、先にGillisら（Gillisら,J.Immunol.,
120,2027〜2033（1978））によって基本的には述べられ
ているミクロ検定法によって確認できる。この検定法で
は、Gillisらによって確立された方法に従って作成した
細胞障害性Ｔリンパ球細胞株（以下、CTLLと略す。）の
IL−２に依存細胞のDNA合成上昇（IL−2 dependent cel
lular proliferation）を指標としている。即ち、４×1
0³個のCTLL細胞を２％のFCSを含むRPMI−1640培地100μ
に懸濁し、100μの連続希釈した翻訳産物と共に96
穴の平底マイクロプレートに接種する。37℃,5％CO₂下
で20時間培養した後、細胞を0.5μCi/ウエルの³H−TdR
で４時間ラベルし、自動細胞ハーベスターを用いて帯状
ガラス繊維上に細胞を回収し、細胞が取り込んだ放射能
を液体シンチレーション法で測定する。この検定によ
り、IL−２存在下に培養されたCTLL細胞が投与量に依存
して³H−TdRを取込むことが判明し、このことから検体
中に含まれるIL−２量を明確に計算することができる。

IL−２はＴリンパ球の増殖を促す活性を有するので、
IL−２活性をＴリンパ球の増殖を指標として測定するこ
とができる。即ち、５個のCTLL細胞を２％のFCSを含むD
MEM 100μに懸濁し、100μの連続希釈した翻訳産物
と共に96穴の平底マイクロプレートに接種する。72〜96
時間,37℃,5％CO₂下で培養した後、活性化し増殖した細
胞の数を顕微鏡下で計測する。対照群として100U/ml,10
U/mlのIL−２を用い、この対照群の増殖した生細胞数と
比較して検体のIL−２活性を求める。

このようにして最も高活性の画分から得られたIL−2
mRNAはds−cDNAを合成するための鋳型として用い、ds−
cDNAはベクターDNAと結合させる。cDNAの合成は従来の
方法によって行なう。

まず、mRNAを鋳型とし、オリゴdTをプライマーとして
dATP,dGTP,dCTP,dTTPの存在下で逆転写酵素によりmRNA
と相補的なss−cDNAを合成し、アルカリ処理で鋳型mRNA
を分解除去した後、今度は単鎖cDNAを鋳型にして逆転写
酵素あるいはDNAポリメラーゼを用いてds−cDNAを合成
する。

このようにして得られたds−cDNAと原核生物で複製で
きるレプリコンを含むベクターDNAから組み換えDNA体が
作られる。しかる後、この組み換えDNA体は宿主細胞に
組み込まれる。

このds−cDNA及び原核生物で増殖し得るベクターDNA
は、これらを結合させる前にエキソヌクレアーゼ処理，
化学合成DNA断片の追加,ds−cDNAやベクターDNAの末端
に連結可能な端末をつけるためにG,C−鎖を伸ばすなど
各種処理によって修飾される。これらの連結可能なDNA
は、例えばATP共存下にT4ファージのDNAライゲースによ
ってつぎ合せることが出来る。

このようにして調製された組換えDNA体によってクロ
ーン化されたcDNAを増巾させるため又はIL−２ポリペプ
チドを製造するために生細胞を形質転換する。

IL−２生産のための宿主細胞として、本発明ではバチ
ルス・ズブチリスなどの原核生物細胞またはエシェリヒ
ア・コリを用いる。宿主細胞中でのDNA増巾のためには
エシェリヒア・コリを宿主とすることが出来るが、その
他の宿主細胞とすることも出来る。

適当なエシェリヒア・コリ用ベクターとしてはEK型プ
ラスミドベクター（ストリンゼント型）としてpSC101,p
RK353,pRK646,pRK248,pDF41など.,EKタイププラスミド
ベクター（リラックスドタイプ）:ColE1,pVH51,pAC105,
RSF2124,pCR1,pMB9,pBR313,pBR322,pBR324,pBR325,pBR3
27,pBR328,pKY2289,pKY2700,pKN80,pKC7,pKB158,pMK200
4,pACYC1,pACYC184,dul等.,λgtタイプファージベクタ
ー：λgt.λc,λgt.λB,λWES,λC,λWES.λB,λZJvi
r.,λＢ′，λALO,λB,λWES.Ts622,λDam等が含まれて
いる。一般に、pBR322はエシェリヒア・コリ用ベクター
としてしばしば利用されてきたが、この場合最も良いク
ローニング部位はPst1ならびにEcoR1部位である。

組換えDNA体を用いた宿主細胞の形質転換には、通常
よく用いられる次の方法がある。エシェリヒア・コリの
如き原核生物が宿主の場合、このDNAを取り込むことの
出来るコンピテント細胞は対数増殖期における細胞を回
収後、良く知られているCaCl₂法によって形質転換出来
る。形質転換反応液中にMgCl₂又はRbClを共存させれば
形質転換効率は向上する。また、宿主細胞のプロトプラ
スト調製後形質転換させることも可能である。

IL−２遺伝子を保有する細胞は、次の２つの方法の何
れかを用いて形質転換後分離可能である。

（１） プラス−マイナス法：抗原刺激した哺乳動物細
胞抽出液より蔗糖密度勾配遠心分離にて11−12S画分と
して部分精製したIL−2 mRNAを調製し、この部分精製mR
NAを鋳型として³²P−放射性ss−cDNAを合成する。アル
カリ処理にて鋳型mRNAを除去後、単離されたcDNAは、抗
原刺激しない哺乳動物細胞から抽出され、部分精製した
11−12S mRNAでハイブリダイズする。引続いてハイブリ
ダイズしなかったcDNAとハイブリダイズしたcDNAはハイ
ドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで分画す
る。ハイブリダイズしなかったcDNAとハイブリダイズし
たcDNAをそれぞれプローブＡ、及びプローブＢと呼ぶ。
何れの組換え体も同一の方法によりそれぞれニトロセル
ロース濾紙上で生育させる。そして、細胞のDNAをアル
カリ処理にて濾紙上に固定する。プローブＡ及びＢをそ
れぞれ、二つの異った濾紙上でDNAとハイブリダイズさ
せる。その後、オートラジオグラフィーを行ってプロー
ブＡと陽性に反応する組換え体（プラス）、プローブＢ
と僅か又は全然反応しない組換え体（マイナス）を選別
する（谷口ら;Proc.Jap.Acad.,V155B 464〜469（197
9）． （２） 第２の方法は、例えば1000〜10,000の組換体ク
ローンを２〜30ないし２〜300クローン宛のクローング
ループに大別し、それぞれのクローングループをそれぞ
れ常法によって培養しプラスミドDNAsを調製する。次い
で、これらプラスミドDNAsを例えば熱変性してss−cDNA
をニトロセルロース濾紙上に固定し、活性化IL−２−mR
NAを含有する哺乳動物細胞から調製されたmRNAと相補的
にハイブリダイゼーションを行う。あるいはまた、IL−
2 mRNAを含有するmRNA（混合物）を熱変性したプラスミ
ドDNA（混合物）とハイブリダイズさせるとDNA−mRNAハ
イブリッドがニトロセルロース濾紙上に固定される。こ
の濾紙を1mMのHEPES、あるいは10mMの食塩水のごとき低
塩類緩衝液で洗浄し、濾紙上に吸着されたmRNAを0.5mM
EDTA;0.1％SDS溶液含有液で例えば95℃,1分間処理して
抽出する。精製mRNAはこれをoligodT−セルロースカラ
ムクロマトグラフィーにて溶出回収する。次いで、mRNA
をアフリカツメガエル卵母細胞にマイクロインジェクシ
ョンして蛋白質に翻訳してIL−２活性を確認する。ある
いはmRNAに依存性の網状赤血球又は小麦胚のin vitro無
細胞合成系を用いてこのmRNAを蛋白に翻訳させ、抗IL−
２抗体を用いてIL−２−活性を分析することが出来る。
これらの方法によってIL−２活性が検出されたグループ
をさらに少数の組換え体クローンを含有する群に類別し
最終的にはIL−2 DNAを有する単一クローンが得られる
まで繰返し実施する。

IL−２産生能のある組換え体よりIL−２ポリペプチド
をコードするcDNAを得るには、先ずトランスフォーマッ
ト中の組換えDNA体を分離し、これを制限酵素エンドヌ
クレアーゼで切断する。切断によって得られるDNA分画
より組込まれたcDNA画分を分離する。

pIL−２−50Aを組換えたDNAよりIL−２ポリペプチド
をコードするPst1 DNAインサートの全ヌクレオチド配列
は、Maxam and Gilbert法（Meth.Enzym.65,499〜560,
（1980））；ならびに二デオキシヌクレオチド鎖末端法
（Smith,A.J.M.Meth.Enzym.65,560〜580,（1980））に
て決定された。

cDNAインサートの制限酵素エンドヌクレアーゼによる
切断図を第１図及び第２図（ａ）に示す。第２図（ａ）
に示すごとく、このcDNAはそれぞれBstN1,Xba I,BstN I
なる制限酵素エンドヌクレアーゼで切断される構造を有
する。

本cDNAインサートのDNA配列は一つの大きなオープン
リーディングフレームを保有する。真核生物の読み取り
開始配列となることの多い第一のATG配列（Kozak,M.Cel
l.15,1109〜1123（1978））は、５′−端から48−50ヌ
クレオチド位に存在し、読み終り配列TGAが存在するヌ
クレオチド位507−509迄152の配列がこのATGにつながっ
ている。mRNAの３′−poly（Ａ）末端に相当するＡのつ
ながりがcDNA末端に見出され、通常真核生物mRNAのほと
んどに見出される６個からなるヌクレオチドAATAAA（77
1−776位）が先に位置する。（Proudfoot,N.J.＆ Brown
lee C.G.,Nature 263,211−214,（1976）） cDNAによってコードされるアミノ酸配列は第２図
（ｂ）（アミノ酸配列Ｉ）のごとく演えきでき、しかも
アミノ酸配列Ｉのポリペプチドは153個のアミノ酸から
なり、その分子量は17631.7ダルトンと計算される。今
日迄知られている分泌蛋白の殆んどに見られると報告さ
れているように（Blobel G.et al,Sym.Soc.Exp.Med.,3
3,9〜36（1979））、上記演えきIL−２ポリペプチドの
Ｎ末端領域はやはり疎水性である。本領域は成熟IL−２
の分泌時に切断されるシグナルペプチドの役割を果たし
ているであろう。切断は20−21位のSerとAla間で起るか
21−22位間のAla−Pro間で切断され、アミノ酸配列IIお
よびIIIを有するポリペプチドを生成する。何故ならば
同様な切断位置は今迄知られたその他の分泌蛋白にもし
ばしば見出されているからである（Blobel,G.et al,Sym
p.Soc.Exp.Med.,33,9〜36（1979））。従って、成熟IL
−２ポリペプチドは133ないし132個のアミノ酸から成
り、分子量は15420.5または15349.4ダルトンと算出され
る。本分子量値はジュルカット細胞から得られたヒトIL
−２蛋白の分子量（15000ダルトン）として報告された
ものを対比される（Gillis et al.,Immunological Re
v.,63,67〜209（1982））。また実施例３に示すごとく
塩基配列111〜113位にあるCCT配列から始まるDNA画分、
即ち、22位に位置するProから始まるポリペプチドに対
するコード（第２（ｂ）図中のアミノ酸配列III）はIL
−２活性を有するポリペプチドを表現していることが確
認された。塩基配列107〜110位にあるGCAから始まるDNA
画分、即ち第２（ｂ）図のアミノ酸配列IIに示すごと
く、21位に位置するAlaから始まるポリペプチドをコー
ドするDNA画分は、実施例６に示すごとくIL−２活性を
有するポリペプチドを表現していることが確認された。

有核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子でも
知られている様に多形現象を示すことが知られている
（谷口ら,Gene 10,11〜15（1980），大野，谷口.,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,77,5305〜5309（1981）;Gray et a
l,Nature 295,501〜508（1981））。この多形現象によ
って、蛋白生産物のアミノ酸のあるものが置換される場
合もあれば、塩基配列の変化はあっても全く変らない場
合もある。ヒトIL−２・cDNAの場合、pIL−２−50A cDN
Aの503位のＡ残基がＧ残基で置き換えられた他のcDNAク
ローン（pIL−２−503）も検出できる。pIL−２−50A c
DNAとは塩基配列が異なるその他のcDNAクローンの存在
も期待できる。

上記説明からも明らかなごとく、本発明に係る遺伝子
は、第２（ａ）図に示された塩基配列を有するDNA,48−
50位のATG配列から始まり、504〜506位にある少くともA
CT配列に至る連続塩基配列を有するDNAs,108−110位のG
CA配列から始まり、GCA配列から少くともACT配列に至る
連続塩基配列を有するDNA,また111−113位のCCT配列か
ら少くともACT配列に至る連続塩基配列を有するDNAを包
含する。本発明に係る遺伝子はまた、504〜506位のACT
配列に終り、１位のＡに始まるDNA,48−50位のATGで始
まるDNA,108−110位のGCA配列で始まるDNA又は111−113
位のCCT配列で始まるDNAを包含する。更に本発明に係る
遺伝子は、507〜509位のTGA配列に終り、１位のＡに始
まるDNA,48〜50位のATG配列で始まるDNA,108〜110位のG
CA配列で始まるDNAまたは111−113位のCCT配列で始まる
DNAを包含する。更に本発明に係る遺伝子は、801位のＣ
で終り、１位のＡで始まるDNA,48−50位のATGで始まるD
NA,108−110位のGCAで始まるDNAまたは111−113位のCCT
配列で始まるDNAを包含する。本発明に係る遺伝子はま
たpoly（Ａ）で終り、48−50位のATG配列から始まるDN
A,108−110位のGCA配列で始まるDNAまたは111−113位の
CCT配列で始まるDNAを含む。また、本発明は、アミノ酸
配列I,II,IIIに相当する塩基配列を有する遺伝子を含
む。アミノ酸配列Ｉの中で１個ないしそれ以上のアミノ
酸を欠くポリペプチド、あるいはアミノ酸配列Ｉの中の
１個ないしそれ以上のアミノ酸が１個ないしそれ以上の
アミノ酸で置換されたポリペプチドはIL−２活性を有す
ることもあり、従ってこの様なポリペプチドをコードす
る遺伝子は本発明に係る遺伝子として使える。同様にア
ミノ酸配列I,IIまたはIIIに対して１個ないしそれ以上
のアミノ酸を表現し得る１個ないしそれ以上の塩基を余
分に結合した遺伝子であっても追加されたアミノ酸が、
ポリペプチドのIL−２活性発現に邪魔しない限り本発明
の中に包含される。IL−２としてのポリペプチド機能を
阻害する追加アミノ酸配列を有する修飾領域であっても
新たに追加された領域が容易に除去出来るものならば本
発明に係る遺伝子として利用出来る。同じことはアミノ
酸配列I,IIおよびIIIに対応する遺伝子のアミノ酸配列
I,IIおよびIIIのＣ−末端にアミノ酸追加をコードするD
NAが３′−末端に追加結合せしめたDNAの場合にも言え
る。上記のようなアミノ酸の欠失，付加あるいは置換
は、出願前周知技術である部位特異的変異技術（Geneti
c Engineering,vol.3,pp1−32,Plenum Press,New York
（1981）,Nucleic Acid Research,vol.10,pp6487−6500
（1982）等）により実施することができ、１もしくは数
個のアミノ酸の欠失，付加あるいは置換とは、部位特異
的変異技術により欠失，付加あるいは置換できる程度の
数のアミノ酸を意味する。従って、この様なポリペプチ
ドをコードする遺伝子の利用は、本発明に包含される。

生細胞中でIL−２産生をする組換えDNA体は、次の各
種方法で作られる。例えば、IL−２・cDNAをコードする
配列を発現ベクターのプロモーター配列下流に挿入す
る。あるいはプロモーター配列を持つcDNA片を発現ベク
ターのcDNA挿入の前あるいは後にIL−２をコードする配
列の上流に挿入することが出来る。

IL−２−cDNAを発現し、IL−２−ポリペプチドを産生
する原核生物の造成法を詳述すれば以下の通りである。

（１） エシェリヒア・コリによるIL−２−cDNAの発現 エシェリヒア・コリ中でIL−２−cDNAを発現させるに
は、先ずcDNAを各種細菌プロモーターと結合せしめた
後、プロモーター下流にcDNAを含有するハイブリドプラ
スミドを作る。このプラスミドを、例えばエシェリヒア
・コリHB101に感染させ、ヒトIL−２活性を有する蛋白
を生合成する細菌がクローンされる。本来細菌のプロモ
ーターならば如何なるものでもcDNAに適当に接続されて
いればIL−２−cDNAを発現する。この様なcDNAの発現例
は以下のとおりである。

IL−２をコードするクローン化cDNAは第２図に示され
る様な153個のアミノ酸からなるポリペプチドをコード
する。本ポリペプチドの20個のアミノ酸に相当するＮ−
末端領域は極めて疎水性であり、殆んどの分泌蛋白の特
徴でもある。この様な疎水性配列はシグナル配列と称し
分泌過程で切断される。故に、成熟IL−２ポリペプチド
は、153個のアミノ酸より少ない筈である。このことか
ら、成熟IL−２ポリペプチドをコードするcDNA部分を発
現させることが望ましく、IL−２シグナル配列相当部分
を発現させるのは望ましくはない。

（ｉ） プラスミドベクターpTrS−３の構築 pTrS−３は、エシェリヒア・コリTrpプロモーターを
含み、pTrS−３のリーダーペプチドのためのリボソーム
結合部位（SD配列）は既に報告されている（G.Miozzari
and Yanofsky J.Bacteriol.133,1457〜1466（197
8））。SD配列の下流13塩基対にあるATGコードンの存在
も報告されている（Nishi et al,生化学54,No.8.676（1
982））。このプラスミドベクターはまた、ATG開始配列
（第３図）の下流に一つのSph I部位を含んでいる。

IL−２・cDNAを発現させるため、先ずプラスミドをSp
h Iで消化しエシェリヒア・コリDNAポリメラーゼＩ（ク
レノウ（Klenow）フラグメント）または、バクテリオフ
ァージT4 DNAポリメラーゼＩで処理し３′−位突き出し
末端を除去する（第４図（ａ））。プラスミドpIL−２
−50AをPst IおよびHgiA Iで２回消化し、より大きいcD
NA画分を単離する。次いでDNAをエシェリヒア・コリDNA
ポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）又はバクテリ
オファージT4 DNAポリメラーゼで処理して３′−突き出
し末端を切りはなす。この処理をしたcDNAは132個のア
ミノ酸のIL−２ポリペプチドをコードする第４（ａ）
図）。このcDNAを上述のごとく前処理したpTrS−３プラ
スミドDNAに結合せしめ、ATG開始コードンをIL−2 cDNA
のCCT（Pro）配列につなぎ合せる。こうしてプラスミド
pT IL−２−22が得られる。Trpプロモーター配列とpT I
L−２−22のIL−2 cDNA配列の結合は第４（ａ）図に示
す。

プラスミドpT IL−２−22はエシェリヒア・コリによ
りプロリンから始まる132個のアミノ酸からなるIL−２
ポリペプチド合成を指令する。

（ii）成熟IL−２はプロリンの代りにＮ−末端アミノ酸
としてアラニン（21位）を含むこともあり、133個のア
ミノ酸から成るIL−２ポリペプチド合成を指示するプラ
スミドを以下の如く作ることができる。

プラスミドpTrS−３はSD配列とATG配列との間に１つ
のCla I切断部位がある（第３図）。本プラスミドはCla
IとSal Iで切断される。プラスミドpIL−２−50AをPst
Iで部分分解し、エシェリヒア・コリDNAポリメラーゼ
Ｉで処理し、最も長いDNAを単離する。次いでDNAを制限
酵素Xho I切断部位を含む合成DNAリンカーと結合させ、
IL−２をコードする配列の３′−側下流にDNAリンカー
を導入したプラスミドpIL−２−50A（Xho）を含むクロ
ーンを単離する。プラスミドpIL−２−50A（Xho）を先
ずHgiA Iで切断し、エシェリヒア・コリ クレノウフラ
グメントまたはT4 DNAポリメラーゼで処理し、Xho Iで
消化すればcDNA画分が単離できる。このcDNAフラグメン
トをCla IおよびSal Iで前処理したpTrS−3 DNAに結合
させ第４（ｂ）図の如く合成DNAにつなげる。かくしてA
laからスタートする133個のアミノ酸から成るIL−２ポ
リペプチドをエシェリヒア・コリ中で合成させるプラス
ミドpTIL−２−21が得られる。（第４（ｂ）図）。同様
なことはXho Iリンカーを使用しなくとも作られる。

（iii）異ったＮ−末端アミノ酸を有する異った大きさ
のIL−２ポリペプチドはpTrS−３発現プラスミドベクタ
ーを用いても作られる。以下に示すごとく、pIL−２−5
0AにクローンされたIL−2 cDNAはヌクレオチド結合部位
81−85に唯一つだけDde I部分を有する。プラスミドpIL
−２−50A（Xho）を、Dbe Iで切断し、cDNAのより大き
い区分を含有するDNA画分を単離する。本画分はpBR322
より3000塩基対を有するDNAを含んでいる（第４（ｃ）
図）。DNA画分をエクソヌクレアーゼBal 31で処理し、
次いでXho Iで切断する。ここで得られたDNAをSph Iで
切断したpTrS−３と結合せしめ、Klenowフラグメントま
たはT4 DNAポリメラーゼで処理し次いでSal Iで消化す
る（第４（ｃ）図）。つなぎ合せたDNAをエシェリヒア
・コリHB 101に感染させ、ヒトIL−２を発現するクロー
ンを検索する。これらのクローンは色色な大きさのヒト
IL−２を発現する筈である。何故ならばヒトIL−２のＮ
−末端領域に相当するDNAは種々切断除去されるからで
ある。かくしてIL−2 cDNAを含有するpTIL−２−14と15
が得られる。

（iv）IL−2 cDNAはまたpKT 218（Talmageより提供を受
けた;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,P.3369〜3373（198
0））を用いても発現可能である。プラスミドpKT 218は
Pst Iで切断し、pIL−２−50AをHgiA IとPst Iで切断
（第５図）して得たIL−2 cDNA挿入部分とつなぎ合わせ
る。出来上ったプラスミドpKIL−２−21は第５図に示し
たように、蛋白合成開始の始発位に配列を有している。
したがって、このプラスミドpKIL−２−21はIL−２の13
3個のアミノ酸とβ−ラクタマーゼのアミノ酸からなる
両者が融合したポリペプチドからなり、これをエシェリ
ヒア・コリ中で合成することが出来る筈である（最初の
メチオニンはエシェリヒア・コリでは切断除去され
る）。

（ｖ）ｐ−BR・322にtufBに対するプロモーター配列を
挿入したプラスミドpTuBlp−５の発現は既に行なわれて
いる（谷口ら，生化学53 966（1981））。このプラスミ
ドは一つのCla I切断部位を含み、第６図に示すごとく
本切断部位はSD配列の２塩基対だけ下流に位置する。pT
rS−３もまたSD配列とATG始発配列の間にある一つのCla
I切断部位を含み、同時にこのCla I部位はpTrS−３とI
L−2 cDNAを用いて発現用プラスミドを作る過程で壊さ
れないので細菌TrpプロモーターをtufBプロモーターで
置き換えることは極めて簡単である。従ってヒトIL−2
cDNAはtufBプロモーターの制御下で発現される。例えば
pTIL−２−22をCla IとPvu IIで切断し、IL−2 cDNAを
含むDNA画分を分離する。次いでこの画分をpTuBIP−５
でつなぎ合わせ、Cla IとPvu IIで予め切断後、第６図
に図示される様にプラスミドpTuIL−２−22が造成され
る。IL−２活性はプラスミドpTuIL−２−22を含むエシ
ェリヒア・コリHB101の抽出液に検出できる。

（vi）例えばpTIL−２−21を使っても、また基本的には
pTrS−３を用いて達成したすべての発現用プラスミドを
用いることによっても同様に造成できる。また例えばpT
uIL−２−22をCla Iで切断し、Bal31またはSIまたはDNA
ポリメラーゼＩ（エシェリヒア・コリ）にてDNAの塩基
対２−３個を除去または補充し再度プラスミドをつなげ
ることによってSDおよびATG配列の距離を至適の長さに
することも可能である。

組換えDNA体を挿入したエシェリヒア・コリまたはバ
チルス・ズブチリスの如き形質転換された原核生物細胞
を培養して組換えDNA体を増巾し又はIL−２ポリペプチ
ドを生産する。この培養は通常の方法で行なわれる。

細胞内または細胞外に生産されたIL−２は硫安沈澱，
塩類除去のための透析（常圧または減圧下），ゲル濾
過，クロマトグラフィー，等電点平板上濃縮，ゲル電気
泳動，高速液体クロマトグラフィー（以下HPLCと略
記），（イオン交換，ゲル濾過並びに逆相クロマトグラ
フィー），及び色素結合担体,IL−２に対するモノクロ
ーナル抗体を結合した活性化セファロース4B又はレクチ
ン結合セファロース4B等によるアフィニティクロマトグ
ラフィー等，公知の方法によって回収することができ
る。IL−２の単離精製法はWatsonら（J.Exp.Med.,150,8
49−861（1979）,Gillis et al,J.Immunol.,124,1954−
1962（1980）,Mochizuki et al,J.Immunol.Methods 39,
185−201（1980）,Welte,K et al,J.Kxp.Med.,156,454
−464（1982））によって報告されている。

かくして得られたポリペプチドはマイトジェン刺激に
よって哺乳動物細胞から作られるIL−２について知られ
ているものと同一の生化学的並びに生物学的挙動を示し
IL−２活性を有する。分子量は約15000ダルトンでありI
L−２活性は、Igsorb（Enzyme Center）の様な免疫吸着
剤の有無にかかわらず完全に中和され、またはモノクロ
ーナル抗体IL−２抗体で沈澱した。免疫電気泳動におい
て、IL−２ポリペプチドは、対応する抗IL−２抗体に対
して唯１個の沈降線を示す。IL−２活性は２−メルカプ
トエタノールで還元後も安定であり、DNAse及びRNAse処
理しても、又56℃,30分熱処理しても安定である。活性
はpH2〜９で安定である。この様にして生産されたIL−
２はモノクローナルな機能を有するＴ細胞（細胞障害性
Ｔリンパ球）の増殖を促進し、胸腺細胞の分裂を強め、
更に抗原非存在下、メモリー状態から抗癌特異的細胞障
害Ｔリンパ球への分化を惹き起こす。また、YAC−１細
胞や 細胞に対するナチュラルキラー細胞の活性化の増強に役
立つ。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例１ （１） ヒトＴ細胞系白血病細胞株であるジュルカット
細胞（日本、西独および米国では自由に入手可能であ
る）を10％FCSを含むRPMI 1640培地にけん濁し、Ｘ線照
射装置Exs 150/300−４（東芝・日本）により50秒間、
室温で10,000レントゲンに達するまで照射した。その後
照射された細胞は上述の培地中、初期細胞密度１×10⁵
個/mlで５％炭酸ガス、37℃のインキュベーター中で５
日間培養した。

この変異細胞（0.2個／穴）を96穴の平底のマイクロ
プレートの10穴にまき、５％炭酸ガス、37℃のインキュ
ベーター中で21日間培養した。生育してくる穴から得ら
れるクローンはクローン量を増加させるため新たな培地
へ移し、その増加したクローンはConA 50μg/ml存在下
で初期細胞密度１×10⁶個/mlで24時間培養した。そして
IL−２活性は前述の方法に従って測定した。

この結果、ジュルカット−111（ATCC CRL 8129）（以
後“Ｊ−111"と称する）と命名されたヒトＴ細胞株が親
株のジュルカットからクローン化、選択され、この細胞
のIL−２産生能は親株の40倍に増加していた。

このクローン化したＪ−111細胞株は通常条件下で増
殖し、その増殖速度は通常のジュルカット細胞とほとん
ど同じであった。

（２） Ｊ−111細胞（１×10⁵個/ml）を無血清合成培
地RIT C 55−９（Sato,T.et al.,Exp.Cell Res.,138,12
7−134,（1982））1000mlに接種し、ローラー培養ボト
ル（ファルコン3027）内で37℃、４日間培養し、増殖し
た細胞を遠心分離により取得した。この細胞を再び４×
10⁶個/mlとなるよう上述のConA 25μg/ml含有培地に接
種した。ローラー培養ボトル（ファルコン）４バッチの
各々に細胞を接種した培養液100mlを入れ、６時間回転
培養した。

（３） このようにConA 25μg/mlで６時間刺激したジ
ュルカット細胞（1.2×10⁶）は生理食塩−リン酸緩衝液
（以後PBSと略す）8,000mlに懸濁した。この細胞は遠心
操作により２回洗浄し、ヌクレアーゼ阻害剤であるリボ
ヌクレオシド−バナデイル複合体（10mM）を含有するRS
B溶液（10mlトリス−塩酸緩衝液、pH7.5、10mM NaCl、
1.5mM MgCl₂）800mlに再懸濁した。その後、界面活性剤
NP−40を最終濃度0.05％となるように加え、ゆっくり混
合し、細胞核を3,000rpm、５分、４℃下で遠心し分離し
た。SDS（0.5％）及びEDTA（5mM）を上清液へ加え、細
胞質RNAを上清液と同量のフェノールを加え抽出した。
フェノールによる抽出を３回繰返した後、RNAは２倍量
のエタノールにより沈澱され、本沈澱物を遠心により集
め、pH7.5の10mMトリス−塩酸に溶解した。得られたRNA
量は196mgであった。

mRNAの分画はオリゴ（dT）−セルロース（P.L.Bioche
micals,Type 7）のアフィニティークロマトグラフィー
を使用し行った。吸着液は20mMトリス−塩酸、0.5M NaC
l、1mM EDTA及び0.5％SDSを含むpH7.5の溶液であり、溶
出はカラムを緩衝液（20mMトリス−塩酸、pH7.5、0.5M
NaCl、1mM EDTA）で洗浄後、水と10mMトリス−塩酸（pH
7.5）で交互に行った。溶出により得られたmRNAは3.6mg
であった。次にこの得られたmRNA 2.4mgを蔗糖密度勾配
遠心法（50mMトリス−塩酸、1mM EDTA、0.2M NaClを含
むpH7.5の溶液中で蔗糖密度勾配５−25％、26,000rpmで
４℃下24時間）により分画した。mRNAの11から12Sが分
画No.12、13、14へ分画され、各々59μｇ、46μｇ、60
μｇであった。

（４） No.13の分画に得られたmRNAをアフリカツメガ
エル（Xenopus Iaevis）の卵母細胞へ注入した（50ng m
RNA/卵母細胞）。この卵母細胞の培養液をIL−２活性測
定した。表１に示す如く、³H−チミジン（³H−TdR）の
取込みの上昇及び活性化Ｔリンパ球数の増加が確認さ
れ、明らかにこの分画中のmRNAはヒトIL−2 mRNAを含ん
でいる事が立証された。

（５） その後IL−2 mRNAを含む11〜12S mRNAのNo.13
分画からin vitroでcDNAを合成した。

組換え体DNAはプラスミドベクターpBR322と構成し
た。組換え体DNAをエシェリヒア・コリに形質転換し、I
L−2 cDNAクローンを獲得したクローンを以下に示す如
き方法により選択した。

（５−１）50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）、30mM Na
Cl、6mM MgCl₂、5mMジチオスレイトール（以後DTTと略
す）、0.5mMの各dATP、dGTP、dCTP、dTTP（dCTPは³²P放
射標識したものを含む）、0.7μｇオリゴ（dT）₁₀、10
μg mRNA及び15単位AMV逆転写酵素（J.W.Beard）を混合
し、41℃下で90分保った。反応終了後、DNAはフェノー
ル処理後エタノール沈澱物として回収し、このDNAを20m
Mトリスおよび1mM EDTAを含むpH7.5の溶液に溶解した。

ss−cDNA2.5μｇが合成された。本反応液よりmRNAを
除くために反応液にNaOH溶液を加えて0.33N NaOH溶液と
し、室温にて15時間置き、次いでpH7.5の1Mトリス−塩
酸緩衝液を同量加えて中和しセファデックスＧ−50カラ
ムをカラムを通した。回収されたcDNAは1.8μｇであっ
た。

（５−２）50mMリン酸緩衝液（pH7.5）、10mM MgCl₂、1
0mM DTT、0.75mMの各dATP、dGTP、dCTP、dTTP（dCTPは³
Hで標識したものを含む）、1.8μg ss−cDNAおよび８単
位ポリメレースＩ（BRL、米国）を混ぜ15時間、15℃で
反応を行った。反応終了後DNAをフェノール及びクロロ
ホルム処理後エタノール沈澱物として回収した。1.10μ
ｇのds−cDNAが生成した。50mM酢酸ソーダ（pH4.5）、
0.2M NaCl、1mM ZnCl₂および1.10μｇ二本鎖cDNAの混合
物を37℃で30分間インキュベートした後、0.25単位のヌ
クレアーゼS₁（三井、日本）を加え、さらに15分間イン
キュベートした。反応終了後、フェノール処理を２回行
った反応生成物をセファデックスＧ−50へ供し、二本鎖
cDNA 0.55μｇを得た。

（５−３）0.14Mカコジル酸カリウム、30mMトリス塩
基、0.1mM DTT、1mM CoCl₂、0.64mM ³²P−dCTP（比活性
2.7×10⁶cpm/n mol）、0.55μg ds−cDNAおよび５単位
のターミナルトランスフェラーゼ（BRL）を混合し、37
℃で７分間インキュベートした後フェノール処理し、次
いでセファデックスＧ−50カラムに供し、エタノール沈
澱物として0.50μg DNAを得た。回収したこのDNAは約50
個のdCMP残基が両３′末端に付加されている事が判明し
た。

pBR 322 DNA 10μｇを制限酵素Pst Iで切断したのちd
CTPのかわりにdGTPを用いたこと以外は前述のds−cDNA
にdCMP鎖を付加したときに用いた方法と全く同じ条件に
より、切断したDNAの両３′末端にdGMP鎖を付加した。

（５−４）50mMトリス−塩酸（pH7.5）0.1M NaCl、5mM
DETA、0.05μg dGMP残基付加pBR 322および0.01μg dCM
P残基付加cDNAをまず65℃で２時間、次いで46℃で120分
間、さらに37℃で60分間、そして室温で60分間インキュ
ベートした。

エシェリヒア・コリχ1776（Curtiss III,R.et al.,i
n Molecular Cloning of Recombinant DNA,（W.A.Scott
＆ R.Werner ed.）Academic Press,（1977））を50ml
のＬ培地（100μg/mlのジアミノピメリン酸、50μg/ml
のチミジン、１％トリプトファン、0.5％酵母エキス、
0.5％NaClおよび0.1％グルコースを含む）に接種し培養
液の吸光度が562nmで0.3付近になるまで37℃で振とう培
養した。培養終了後、培養液を30分間０℃に保持し、菌
体を遠心分離により集め、5mMトリス−塩酸（pH7.6）、
0.1M NaCl、5mM MgCl₂および10mM RbClを含む溶液25ml
で２回洗浄した。

得られた菌体を5mMトリス−塩酸（pH7.6）、0.25M KC
l、5mM MgCl₂、0.1M CaCl₂および10mM RbClを含む溶液2
0mlに懸濁し、０℃で25分間静置後、菌体を集め上記と
同じ溶液1mlに菌体を再懸濁し、得られた菌体懸濁液の
0.2mlに上記組換え体DNAを入れ、０℃で60分間静置し
た。その後Ｌ培地0.7mlを加え37℃で30分間振とう培養
した。こうして得られた培養液（0.1ml）を100μg/mlジ
アミノピメリン酸、50μg/mlチミジンおよび15μg/mlテ
トラサイクリンを含むＬ培地の1.5％寒天培地上に一面
に塗抹し、37℃で２日間インキュベートした。

（５−５）出現した432のコロニーを18のグループに分
け、（その各グループは24の異なるバクテリアクローン
を含む）100μg/mlのジアミノピメリン酸、50μg/mlの
チミジンおよび10μｇのテトラサイクリンを含むＬ培地
200mlに接種し、37℃で５〜７時間振とう培養した。次
に最終濃度170μg/mlとなるように加えられたクロラム
フェニコールを含む新たなＬ培地200mlを加え、さらに
一晩培養した。

このようにして増強されたプラスミドDNAを常法に従
い精製した。

IL−2 cDNAを有するクローンはmRNAハイブリダイゼー
ション−トランスレーションアッセイ（以後Ｈ−Ｔアッ
セイと略称する）により選択した。

ここで用いられたＨ−Ｔアッセイは以下に示す如く行
った。

純化したDNA（25μｇ）を制限酵素Hind IIIにより開
裂しフェノールで３回、フェノール−クロロホルムおよ
びクロロホルムで各々処理し、エタノールで沈澱させ80
％エタノールで洗浄し、80％ホルムアミド40mlに溶解し
た。

反応液を変性させるため90℃で５分間加熱後10×SSC
（1.5M NaCl、0.15Mクエン酸ソーダ）で1.3mlに希釈し
た。その後、本DNAをニトロセルロース濾紙上に固定
し、これを80℃で３時間乾燥させ、50％ホルムアミド、
20mM Pipes（pH6.5）、0.75M NaCl、5mM EDTA、0.2％SD
S及びＪ−111細胞由来のpoly（Ａ）mRNA 250μｇを含む
溶液中で37℃、18時間インキュベートし、濾紙上に固定
されたDNAとIL−2 mRNAをハイブリダイズした。

次にその濾紙を65℃で３回pH6.5の10mM Pipes,0.15M
NaCl溶液、1mM Pipes,10mM NaCl溶液で洗浄し0.5mM EDT
A、0.1％SDS溶液で95℃、１分間処理し濾紙からハイブ
リダイズしたmRNAを回収した。

このようにして抽出したmRNAを常法に従ってオリゴdT
−セルロースカラム上で精製し、アフリカツメガエル卵
母細胞へ注入し、翻訳された蛋白のIL−２活性を測定し
た。

各々24クローンからなる18グループのうちの１グルー
プが前述の³H−TdR取込みによるアッセイで48単位/mlの
IL−２活性陽性を示した。一方他のグループは明らかに
陰性であった。

次に、陽性のグループに属する24の各単一コロニーを
既述と同じ組成のＬ培地200mlへ接種し、37℃で５〜７
時間好気的に培養し、同様にクロラムフェニコール含有
のＬ培地をさらに添加した。

一晩培養して、プラスミドDNAを増強後、プラスミドD
NAを同様に標準法に従って精製した。Hind IIIで各プラ
スミドDNA約５μｇを開裂後、各プラスミドを同様にニ
トロセルロース濾紙へ固定した。その濾紙をIL−2 mRNA
とハイブリダイズし、ハイブリダイズしたmRNAをアフリ
カツメガエル卵母細胞へ注入し、翻訳された蛋白のIL−
２活性を測定するため回収した。

表２に示す如く、p3−16と表示した単一コロニーから
精製されたプラスミドDNAのみが陽性のIL−２活性を示
した。それ故、本クローンがIL−2 cDNAを有するクロー
ン（E.coli χ 1776/p3−16 AJ11995（FERM−BP−22
5））と同定された。このようにプラスミドDNA、p3−16
はIL−2 mRNAと特異的ハイブリッドを形成する能力のあ
るDNA（IL−２遺伝子）を確かに有している事が確認さ
れた。

プラスミドp3−16のcDNAインサートは制限酵素Xba I
により１部位で、又Bst N1により２部位（Xba I開裂部
位の上流及び下流）で切断されるという特徴を示した。
しかしながら、プラスミドp3−16は約650塩基対より構
成されるcDNAインサートを含んでおり、これは明らかに
11〜12Sの大きさのIL−2 mRNAの一部分に相当するもの
である。それ故、他のcDNAライブラリーを、鋳型として
IL−2 mRNAを用い、Land等の方法（Land et al.,Nuclei
c Acids Res.,vol.９,p2551,（1981））に従って作製し
た。一本鎖cDNA（1.6μｇ）を、dCMP残基を付加したIL
−2 mRNA 4μｇを用いて合成し、そしてds−cDNAを、DN
AポリメラーゼＩ（Klenow断片）によりプライマーとし
てオリゴ（dG）12＝18を用いる事により合成した。680
塩基対DNAサイズマーカー（size marker）より長いcDNA
（0.6μｇ）は蔗糖密度勾配遠心法によって得られ、標
準的なＧ−Ｃテイリング法によりpBR 322のPst I部位へ
挿入出来た。

組換えDNA体によるエシェリヒア・コリχ1776の形質
転換後、その場所でプローブとしてニック翻訳された
（nick−translated）p3−16 cDNAインサートを用いたG
runstein−Hognessのハイブリダイゼーション法により
約2000コロニーを選別し、およそ850塩基対を含むプラ
スミドpIL 2−50Aを含有するコロニー及び形質転換され
たクローン（エシェリヒア・コリχ1776/pIL2−50A、AJ
11996（FERM−BP−226））を同定した。pIL2−50AのcDN
Aインサートの制限酵素切断図を第１図に示した。

形質転換されたエシェリヒア・コリχ1776/pIL2−50A
からのIL−２ペプタイドをコードしている遺伝子を単離
するため、プラスミドDNAを通常法に従い、菌体からDNA
を単離後制限酵素Pst Iにより切断した。この処理によ
り生成する２つのDNA断片のうちより小さな断片はIL−
２ペプタイドをコードしているDNA遺伝子であった。pIL
2−50AからのPst Iインサートの完全なヌクレオチド配
列はMaxam and Gilbertの方法（Maxam,A.W.et al.,Enzy
m.65.,499−560,1980）により決定した。全構造を第２
図（ａ）に示す。

実施例２ 実施例１に記載された方法に従ってジュルカット細胞
からクローン化された構成的IL−２産生細胞株Ｊ−A 18
86（ATCC CRL 8130）は同様にローラー培養ボトルで生
育した。生育した細胞は初期細胞密度１×10⁶個/mlで新
鮮な合成培地RITC−55−９に再懸濁し、培養開始８時間
後に、実施例１で詳細に示したステップに従って３×10
⁹個の細胞から11〜12S分画としてのIL−2mRNA抽出のた
めに使用された。

ds−cDNAは実施例１と同様に合成され、600塩基対よ
り長いcDNA（2.4μｇ）が蔗糖密度勾配遠心法による分
画により得られた。次にこのcDNAをターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼを用い、dCMP残基で
伸長し、その50ngがdGMPで伸長したPst I切断pBR 322 2
50ngとアニールされた。

生成したハイブリッドプラスミドはエシェリヒア・コ
リχ1776に形質転換され、約4,000クローンのトランス
ホーマントが得られた。

Grunstein−Hognessの方法に従い、プローブとして用
いたプラスミド３−16 cDNAと相補的な３個のクローン
が選択された。すなわち、このようにして選択された形
質転換されたクローンはヒトIL−２遺伝子を有するクロ
ーンである。

実施例３ エシェリヒア・コリ細胞でヒトIL−２の合成を指令す
るプラスミドを以下の如き方法で構築した。

プラスミドpT IL2−22は第４（ａ）図で図解されてい
る如く、一連の改変の方法によりpTrS−３（Nishi T.,T
aniguchi T.et al.,SEIKAGAKU 53,967,（1981），同54,
676（1982））及びIL−2 cDNAを含むpIL2−50Aから構築
した。プラスミドpTrS−３はTrpプロモーターとpBR 322
のEco RI部位とCla I部位の間にShine Dalgarno（以後S
Dと略号する）の領域の挿入を含む。

本プラスミドはまた第３図で示した如く、単一のSph
I部位と同様にSD配列の下流13bpにATGイニシエーション
コードンを含んでいる。

言及している蛋白に対応するDNA配列がATGコードンの
丁度下流の部位に挿入されるとそのベクターはこの蛋白
を生産するには非常に効果的である。このATGコードン
はpTrS−３のSph I消化に引続きT4 DNAポリメラーゼに
よる処理によって生成される。それ故プラスミドpTrS−
３（30μｇ）は制限酵素Sph Iで、常法により切断さ
れ、引続きフェノール，クロロホルム処理，エタノール
沈澱法により回収され両末端がT4 DNAポリメラーゼ処理
によりフラッシュにされた。

次に、同様の方法によりフェノール，クロロホルム処
理及びエタノール沈澱法によりDNA（21.4μｇ）を回収
した。他方IL−2 cDNAを含むPIL2−50A 380μｇはPst I
により切断され、IL−2 cDNAインサートはアガロースゲ
ル電気泳動により単離された。cDNAインサート（11μ
ｇ）はHgiA Iにより切断され、T4 DNAポリメラーゼによ
って処理され、大きい方の部分のDNA 10μｇがアガロー
スゲル電気泳動により単離された。本法に従って132個
のアミノ酸をコードするcDNA（7.2μｇ）が得られ、こ
のDNA断片はブラントエンドを有していた（第４（ａ）
図）。

次に、このようにして得られたcDNA断片をATG配列の
丁度下流で、前もってSph Iにより消化されたT4 DNAポ
リメラーゼにより処理されたpTrS−３ベクターへ連結し
た。このように連結したプラスミドはそれから、常法に
従いエシェリヒア・コリHB 101へ形質転換された。この
連結は次のようにして行った。IL−2 cDNA（0.4μｇ）
の前述の大きい方の断片およびpTrS−３ベクターDNA 0.
2μｇを6.6mM MgCl₂,1mM ATPおよび10mM DTTを含むpH7.
5の66mMトリス−塩酸中でT4 DNAリガーゼ0.8単位と共に
混合し、混合物を４℃，一晩反応させた。アンピシリン
を含むＬ培地寒天プレート上に出現するトランスホーマ
ントの中で、132個のアミノ酸をコードしているIL−2 c
DNA部分を含むプラスミドを持つコロニーをその場でコ
ロニーハイブリダイゼーションアッセイ法により選択し
た。こうして選択したコロニーを再び培養（10ml）し、
リゾチーム処理および凍結，融解による処理によりプラ
スミドDNAを調製した。このプラスミドDNAをPst IとXba
Iで切断し、その結果の生成物をアガロースゲル電気泳
動により分析し、cDNAがpTrS−３のATG配列の後に正し
い方向で凍結しているpTIL−２−22を同定した。

pTIL−２−22を含むエシェリヒア・コリHB 101を微生
物の増殖のために知られている通常法の下に培養した。
細胞は25μg/mlストレプトマイシンおよび25μg/mlのア
ンピシリンを含むχ培地（2.5％バクトトリプトン,1％
酵母エキス,0.1％グルコース,20mM MgSO₄,50mMトリス−
塩酸,pH7.5）10ml中で37℃で一晩生育させた。ついで培
養懸濁液1mlを同じχ培地（100ml）へ接種し、37℃で培
養した。650mμのO.D.がおよそ1.5−2.0に達した時点で
３−インドールアクリル酸（IAA）を加えた。インデュ
ーサーの添加３時間後に、細胞を集め、20mMトリス−塩
酸（pH7.5,30mM NaClを含む）で洗浄し、同じ緩衝液8ml
中に再び懸濁した。

Trpプロモーターの効果的な機能発現のために、IAAの
如きインデューサーを最終濃度50μg/mlになるように添
加した。かくして細菌細胞中に産生される蛋白をソニッ
ク処理（０℃,2分間）またはリゾチーム（８μｇ）消化
（０℃,20分）に引き続き凍結融解を３回行う事により
抽出した。この方法により、一般的にIL−２は細胞から
抽出された。抽出されたIL−２活性は10,000から120,00
0単位/mlの範囲であった。

pTIL2−22を含むエシェリヒア・コリHB 101（AJ 1200
9）はFERM−BP245として寄託されている。

実施例４ IL−2 cDNAを有するプラスミドpTuIL2−22はpTuBlP−
５（Taniguchi,T.et al.,Seikagaku,53,966,1981）およ
び実施例３に示したpTIL2−22から第６図に図解した方
法により構築された。プラスミドpTuBlP−５はpBR322中
にtufBのプロモーター配列が挿入されている。このプラ
スミドはまた単一のCla I部位を含んでおり、これは、
第６図に示した如くSD配列の2bp下流に位置している。p
TrS−３もまたSD配列とATGイニシェーションコードンの
間にCla I部位を含んでおり、このCla I部位は実施例３
に記載した如くpTrS−３およびIL−2 cDNAを用いる事に
よる発現プラスミド構築中に破壊されないことから、Tr
pプロモーターをtufBプロモーターに置き換える事はき
わめて簡単であり、その結果IL−2 cDNAはtufBプロモー
ターの制御下で発現される。

それ故、プラスミドpTIL2−22（30μｇ）は制限酵素C
la IとPvu IIにより通常の方法で切断された。IL−2 cD
NAを含む断片（約2.2kb）はアガロースゲル電気泳動に
より単離精製され、３μｇのDNAが回収された。他方,pT
uBlP−５ベクター20μｇが同様にCla IとPvu IIにより
切断され、アンピシリン耐性遺伝子を含む大きい方の断
片（約3.4kb）がアガロースゲル電気泳動により単離精
製され、DNA3.5μｇが回収された。次にこのようにして
得られた２個の断片は１つはtufBプロモーターを含み
（約3.4kb）、他方はIL−2 cDNAを含んでおり（約2.2k
b）以下に示す如く連結した。

IL−2 cDNA（1.2μｇ）を含む断片およびtufBプロモ
ーターを含む断片0.3μｇを6.6mM MgCl₂,1mM ATPおよび
10mM DTTを含むpH7.5の66mMトリス−塩酸中で、T4 DNA
リガーゼ0.8単位と混合し、４℃で一晩反応した。次に
このようにして連結したプラスミドは常法に従いエシェ
リヒア・コリHB 101へ形質転換された。

アンピシリンを含むＬ培地寒天プレート上に出現する
トランスホーマントの中で第６図のpTuIL2−22の如くIL
−2 cDNA部分を含む組み換え体DNAを持つ８個のコロニ
ーが選択され、プラスミドDNAは実施例３に記載された
如く調製された。

pTuIL−２−22を含むエシェリヒア・コリHB 101を37
℃でＬ培地（100ml）中で培養した。650mμのO.D.がお
よそ0.5−1.0に達した時、菌体を集め、30mM NaClを含
む20mMトリス−塩酸（pH7.5）で洗浄し、同じ緩衝液2ml
中に再び懸濁した。このようにして産生した蛋白は実施
例３と同様に抽出された。抽出液中のIL−２活性は6,00
0から56,000単位/mlの範囲であった。

pTuIL2−22を含むエシェリヒア・コリHB 101（AJ 120
10）はFERM−BP 246として寄託されている。

実施例５ IL−2 cDNAを有するプラスミドpGIL2−22はpGL101（R
oberts,T.M.and Laucer G.D.,Meth Enzym.,68,473−48
3,（1979）,Gail Lauer,et al,J.Mol.Appl.Genet.,１,N
o.2,139〜147（1981）,T.Taniguchi,et al,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA,77,No.9,5230〜5233（1980）,Egon Amann,
et al,Gene,25,167〜178（1983））と実施例３に示され
たpTIL2−22とから構築された。

すなわち、lacプロモーターを含むプラスミドpGL 101
（20μｇ）が制限酵素Pvu IIで常法により切断され、引
続きフェノール，クロロホルム処理およびエタノール沈
澱法により17μｇのDNAが回収された。他方、pTIL2−22
（75μｇ）の方はCla IおよびSal Iで切断し、アガロー
スゲル電気泳動によりIL−2 cDNAが含むDNA断片2.2μｇ
を回収した。この断片はDNAポリメラーゼＩ（クレノウ
断片）で処理する事によりフラッシュにされた。次にこ
のようにして得られた２個の断片（0.25μｇおよび0.66
μｇ）を実施例４と同じ方法でT4 DNAリガーゼ1.0単位
でもって連結した。かくしてこの連結したプラスミドは
常法に従いエシェリヒア・コリHB 101に形質転換され
た。トランスホーマントの中で、IL−2 cDNAを含むCla
I−Sal I断片の挿入を有するトランスホーマント³²Pラ
ベルしたIL−2 cDNAをプローブとして選択した。次にこ
れ等のトランスホーマントを、アンピシリン25μg/mlを
含む10mlのχ培地中で培養し、実施例３で記載した方法
によりプラスミドDNAを調製した。かくしてlacプロモー
ターの丁度下流にIL−2 cDNAの開始配列ATGを有するプ
ラスミドDNAはPst IおよびXba Iでの切断部位を検定す
る事により得られた。このようにして得られたpGIL2−2
2を含むエシェリヒア・コリHB 101は25μg/mlアンピシ
リンおよび25μg/mlストレプトマイシンを含有するＬ培
地100mlに接種して培養した。650mμのO.D.が約0.5に達
した時イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノサイ
ド（IPTG）を1mMの濃度で加え、１時間後に菌体を集
め、実施例４に記載した方法に従って菌体抽出液を調製
した。抽出液のIL−２活性は6,000から80,000単位/mlの
範囲であった。

pGIL2−22を含むエシェリヒア・コリHB 101（AJ 1201
1）はFERM−BP 247として寄託されている。

実施例６ プラスミドpTrS−３（10μｇ）を先ず制限酵素Sal I
で切断しSal I部位をDNAポリメラーゼ（クレノウ断片）
あるいはT4 DNAポリメラーゼ処理によりフラッシュ（fl
ush）にした。

Cla Iで切断後、Trpプロモーター領域を有する大きい
方の断片を常法に従ってアガロースゲル電気泳動により
単離精製し、DNA 3μｇを回収した。

他方、pIL2−50AのPst I切断により得られるcDNAイン
サート11μｇがHgiAIで切断され、T4 DNAポリメラーゼ
処理され、大きい方の断片がアガロースゲル電気泳動に
より単離，精製された。このようにしてIL−２の132個
のアミノ酸をコードするcDNA断片が7.2μｇ得られた。
次に、trPプロモーター（上記）を含む断片0.45μg,IL
−2 cDNAを含むHgiAI−Pst I断片0.5μｇおよび合成オ
リゴヌクレオチド（５′）CGATAAGCTATGGCA（３′）と
（３′）TATTCGATACCGT（５′）（各々20pmole）は両方
とも５′末端でリン酸化されているが、これ等を実施例
３に記載されている方法と同じ方法でT4 DNAリガーゼ１
単位で連結した（第４図（ｂ））。このように連結され
たプラスミドはエシェリヒア・コリHB 101に形質転換さ
れた。出現したトランスホーマントの中で、目標とする
トランスホーマントは次のようにして選択した。まず最
初に、IL−2 cDNAおよび合成オリゴヌクレオチドの両方
とハイブリダイズ可能なトランスホーマントがコロニー
ハイブリダイゼーション法により選択された。次に、AT
GGCA配列の丁度下流に第２図（ａ）の111から113の位置
のCTT配列から始まるDNA断片（CCTACT………）が挿入さ
れているプラスミドDNAを持ったトランスホーマントをP
st I,Xba I切断個所を検定することにより選択した。

pTIL2−21aまたはpTIL2−21bを含む上記のトランスホ
ーマントを実施例３に示す方法によりＬ培地中で培養
し、そして実施例３に示す方法により分析した時トラン
スホーマントの菌体抽出物には高いIL−２活性が認めら
れた。pTIL2−21aを有するエシェリヒア・コリHB 101
（AJ 12013）およびpTIL2−21bを有するエシェリヒア・
コリ（AJ 12014）を有するエシェリヒア・コリHB 101は
それぞれFERM−BP 248,FERM−BP 249として寄託されて
いる。

上記の実施例で用いられた宿主，エシェリヒア・コリ
χ1776およびHB 101（Boyer H.W.et al.,J.Mol.Biol.41
459,（1969））は公知であり、容易に入手可能である。
更につけ加えれば、トランスホーマント中の組換えDNA
体を遊離させるためにＬ培地で37℃でトランスホーマン
トを培養し、テトラサイクリンおよびアンピシリンに感
受性となった菌体を分離すれば寄託したトランスホーマ
ントから宿主は容易に得られる。

プラスミドベクターpBR 322（例えばベセスダリサー
チラボラトリーから購入可能）,pCE−1,pTrS−３および
pGL 101は公知であり容易に入手可能である。更に、常
法によりトランスホーマント中の組換え体プラスミドを
分離することによってさらにそれぞれの実施例での説明
から当然に明らかな如くプラスミドベクターを分離する
ことによって寄託されたトランスホーマントからプラス
ミドベクターを得る事が出来る。pTrS−３およびpTuBlP
−５はそれぞれエシェリヒア・コリFERM−P6735（BP 32
8）およびエシェリヒア・コリATCC 31878として寄託さ
れている。

【図面の簡単な説明】 第１図はIL−２活性を有するポリペプチドをコードした
クローン化遺伝子の制限酵素エンドヌクレアーゼによる
切断マップを示し、第２図（ａ）はクローン化遺伝子の
塩基配列を示し、第２図（ｂ）はIL−２活性を有するポ
リペプチドのアミノ酸配列I,IIおよびIIIを示す。 第３図はプラスミドベクターpTrS−３を示す。第４図
（ａ），第４図（ｂ）および第４図（ｃ）はベクターと
してpTrS−３を使用している組換えDNAs（pTIL2−22,pT
IL2−21,pTIL2−14およびpTIL2−15）の構成を示すフロ
ーチャートである。第５図はベクターとしてpKT 218を
使用している組換えDNA（pKIL2−21）の構成を示すフロ
ーチャートである。第６図はベクターとしてpTUBlP−５
を使用している組換えDNA（pTuIL2−22）の構成を示す
フローチャートである。 図中、“A",“G",“C"および“T"はデオキシアデニル
酸，デオキシグアニル酸，デオキシシチジル酸およびチ
ミジル酸をそれぞれ表わす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＡ ＡＤＵ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡ (72)発明者 松井 裕 神奈川県横浜市金沢区並木１丁目19―16― 101 (72)発明者 鹿島 信一 神奈川県横浜市旭区若葉台２―21―603 (72)発明者 羽室 淳爾 神奈川県横浜市戸塚区深谷町241―32

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】原核細胞に適合しうるプラスミドベクター
   のDNA鎖の上流より、それぞれ原核細胞内で機能するプ
   ロモーター、リボゾーム結合部位、翻訳開始コドンおよ
   び式： で示されるアミノ酸配列を含むヒトインターロイキン２
   活性を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミ
   ノ酸配列に対し１もしくは数個のアミノ酸を欠失、付加
   あるいは置換がされたアミノ酸配列を有するヒトインタ
   ーロイキン２活性を有するポリペプチドをコードする遺
   伝子を順次配列してなる組換えDNA体により形質転換さ
   れた原核生物の細胞を培地中で培養することを特徴とす
   る、糖鎖を伴わず、ヒト由来の他の蛋白質を実質的に含
   有しないヒトインターロイキン２活性を有するポリペプ
   チドの製造法。