JPH02195886A - ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプ
チドを有する遺伝子に関する。

インターロイキン２（以下、ｒ［Ｌ−２Ｊと略記する。

）は、以前はＴ細胞増殖因子と呼ばれており、レクチン
あるいは抗原で活性化されたＴ細胞より産生される可溶
性たんばく　（一般には「リンホカイン」として知られ
ている）である（Ｍｏｒｇａｎ　ら。

５ｃｉｅｎｃｅ、　１９３．１００７〜１００８（１９
７６）、　Ｇ１１ｌｉｓら、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　　１２０．　２０２７〜２０３３
（１９７８））、ＩＬ−２はリンパ球の反応性を調節で
き、抗原特異的なエフェクターニーリンパ球のｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏにおける長期培養を可能ならしめることができ
る（Ｇｉｌｌｉｓら、　Ｎａｔｕｒｅ＋謝、１５４〜１
５６　（１９７７））、またＩＬ−２は、胸腺細胞の分
裂の促進（Ｃｈｅｎら、　Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
＋２２＋　２２１〜２２４（１９７７）、　Ｓｈａｗら
、　Ｊ、　　［ｍｍｕｎｏｌ、、　　１２０．　１９６
７〜１９７３　（１９７８））　、ヌードマウスの肺細
胞の培養系での細胞障害性Ｔリンパ球活性（Ｗａｇｎｅ
ｒら、　Ｎａ　ｔｕｒｅ＋　２８４　＋２７８〜２８０
．　（１９８０）　）や抗−５ＲＢＣプラ一ク形成細胞
反応の誘導（Ｇｉｌｌｉｓら、　　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍ
ｅｄ、　１４９．１９６０〜１９６８　（１９７９））
等の関連する他の生物活性をもつことが明らかにされて
いる。従って、このリンパ球調節因子は液体免疫や細胞
性免疫反応を増強したり免疫不全状態を正常な液体や細
胞性免疫の状態に回復させるのに有用である。これらの
明らかにされたＩＬ−２の免疫学的活性は、ＩＬ−２が
悪性腫瘍、細菌またはウィルス感染、免疫不全、自己免
疫疾患等（Ｐａｐｅｒｍａｓ　ｔｅｒら、　Ａｄｖ、　
Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ、＋５０７、　（１９８０））
に対する医科免疫療法に有用であることを示している。

インターフェロンと同様に、ＩＬ−２はナチュラルキラ
ー細胞活性を増強することが示されてきたが、これは悪
性腫瘍治療への有用性を強く示唆している。更に、ＩＬ
−２は単クローン性の活性化Ｔ細胞の保持を可能とし、
この事は、Ｔ細胞分化の分子機構、Ｔ細胞機能の分化機
構、Ｔ細胞の抗原リセプターの機構を研究する上で重要
な役割を担っていることを示している。また、ＩＬ−２
は単りローン性Ｔ細胞を長期培養することにより、他の
種々の分野で有用な様々なＴ細胞由来のリンホカインを
製造するためにも使用できる。更に、ｒＬ−２の産生と
リンパ球のＩＬ−２に対する応答性は、免疫学的機能の
重要なパラメーターであり、免疫異常の臨床診断に有用
である。

ＩＬ−２は従来の技術では、マイトジェンでマウス、ラ
ットあるいはヒトのリンパ球を刺激することにより製造
されてきた（ＧｉｌｈＳら、　Ｎａｔｕｒｅ＋　２６８
＋１５４〜１５６．　（１９７７））、　Ｆａｒｒａｒ
ら、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋１２Ｌ１３５３〜１３
６０．（１９７Ｂ）、　Ｇ１１ｌｉｓら、　Ｊ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、＋１２０＋２０２７〜２０３３．　（１９
７８））。ヒトの末梢血リンパ球をマイトジェンで刺激
することにより（Ｇｉｌｌｉｓら８Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２４．１９５４〜１９６２．　
（１９８０））、Ｇ１１ｌｉｓらはＴリンホーマ細胞株
からのマウスＩＬ−２の製造（Ｇｉｌｌｉｓら、　Ｊ、
　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２５．２５７０〜２５７８（
１９８０））とヒト白血病細胞株からのヒ）ｒＬ−２の
製造（Ｇｉｌｌｉｓら、　Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　
１５２．１７０９〜１７１９．　　（１９８０））を報
告している。

Ｇ１１ｌｉｓらによる上記の技法は、細胞培養法を用い
てマイトジェンで活性化されたＴ白血病細胞株からヒト
ＩＬ−２を製造する方法に関するものである。しかしな
がら、この方法では低濃度のヒＩ−ＩＬ２しか産生され
ないのが難点で、大量の培養液から微量のＩＬ−２を得
るために、複雑な精製工程を必要とする。更に、ヒｌ−
Ｔ白血病細胞株は少量のヒ）ＩＬ−２に酷似した他の生
理活性物質も産生ずるので、ＩＬ−２をこれらの他の免
疫活性を有する分子と分離、あるいは時として共存する
細胞毒物質（ｔｏｘｉｃ　１ｅｃｔｉｎ）と分離するに
はかなりの困難が伴う。

ＩＬ−２を製造する他の方法として、インターフェロン
のような他の生理活性ヒト由来たんばくを製造するため
に用いられた組換えＤＮ＾（デオキシリボ核酸の略）法
（Ｇｒａｙら、　Ｎａｔｕｒｅ　２９５．５０３〜５０
８゜（１９８１）、　Ｎａｇａｔａら、　Ｎａｔｕｒｅ
　２８４．３１６〜３２０　（１９８０）。

Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、　Ｇｅｎｅ　１０．１１〜１５
．　　（１９８０））が好ましいと思われる。しかしな
がら、本発明の以前には組換えＤＮＡ法によってＩＬ−
２を製造する試みは成功していなかった。例えば、組換
えＤＮＡ体によってＩＬ−２を産生ずる生命体を作成し
ようとする試みは、恐ら＜ＩＬ−２ポリペプチドをコー
ドする遺伝子が未だクローン化されていなかったために
成功していないという事が、“″日経バイオテクノロジ
ー、第１９号、　１９８２年７月５日”に報告されてい
た。

従って、ＩＬ−２をコードするクローン化遺伝子とその
遺伝子を持った組換えＤＮＡ体が渇望されてきた。また
、組換えＤＮＡ体を有する生細胞株と、その細胞株を使
ってＩＬ−２を製造する方法が渇望されてきた。

本発明の要旨は以下の記述から更に容易に明白となる。

本発明の目的はＩＬ−２活性を有するポリペプチドをコ
ードする遺伝子を創出したことにある。

すなわち、本発明はヒトインターロイキン２活性をもつ
、次のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
遺伝子を提供するものである。

Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓ
ｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＴｈｒＧＩＮ　Ｌｅｕ
　ＧＩＮ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　
Ｌｅｕ　Ａｓｐ　ＬｅｕＧＩＮ　　Ｍｅｔ　　ｌｉｅ　
　Ｌｅｕ　　ＡｓＮＡｓＮ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ
　ＴｈｒＰｈｅ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　ＬｙｓＨ４
ｓ　Ｌｅｕ　ＧＩＮ　Ｃｙｓ　ＬｅｕＬｅｕ　　Ｇｌｕ
　　Ｇｌｕ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ八ｓへ　　Ｐｈｅ　　
１（ｔｓ　　Ｌｅｕ　　ＡｒｇＡｓＮ　　ｌｉｅ　　Ａ
ｓＮ　　Ｖａｌ　　ｌ１ｅＳｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ
　　Ｔｈｒ　　ＰｈｅＧｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ａｌａ　　
Ｔｈｒ　　ｌ１ｅＴｒｐ　　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　
ＣｙｓＬｅｕ　　Ｔｈｒ 本発明の遺伝子は、 ＴＴＴ　　ＴＡＣＡＴＧ　　ＣＣＣＡＡＧＧｌｙ　　Ｉ
ｌｅ　ＡｓＮ Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　　Ａｌａ　Ｔｈｒ Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ ＡｓＮ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｐ Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　　Ｐｂｅ ＧＩＮ　　Ｓｅｒ　　ｌ１ｅ ＡｓＮ　　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

ＧＩＮ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ しｅｕ　　Ｉｌｅ　　５ｅｒ Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ Ｔｙｒ　　Ａｌａ　　Ａｓｐ Ｌｅｕ　　ＡｓＮ　　Ａｒｇ ｌｉｅ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ 次の塩基配列を有する。

へへＧ　　［；にＣＡにＡ らＡＡ　　にＴＵ　　ＡＡＡ ＧＡＧ　　ＡＣＡ　　ＧＣＡ　　ＡＣＣＡＴＴ　　ＧＴ
Ａ　　ＧＡＡ　　ＴＴＴ　　ＣＴＧ　　ＡＡＣＡＣ八へ
ＴＡ　　ＡＣＴ 本発明の遺伝子を利用することによって、ＩＬ２はＩＬ
−２活性を有するポリペプチドを産生ずべくコードされ
た遺伝子の挿入と、細胞の中で複製され得るベクターＤ
ＮＡの挿入で組換え法により修飾され、該遺伝子のコー
ドシーケンスが、プロモーターシーケンスの下流に位置
するＤＮＡによってＩＬ−２を産生ずべく形質転換させ
た原核生物細胞株、特にエシェリヒア・コリを培地に浮
遊培養（好気的）することによって製造される。

本発明のルー２ポリペプチドをコードしたクローン化遺
伝子は、ＩＬ−２活性を有するポリペプチドを産生ずる
能力をもつことによって特徴づけられる哺乳動物細胞に
由来するＩＬ−２に相当するメツセンジャーＲＮＡ（Ｉ
ＩＩＲＮＡ；”ＲＮＡ”はリボ核酸の略、以下“ＩＬ−
２ｍＲＮＡ”という）を相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）に
逆転写することによって得られる。得られた２重鎖ｃＤ
ＮＡ（ｓｓ−ｃＤＮＡ）は−重鎖ｃＤＮＡ　（ｄｓ−ｃ
ＤＮへ）に変換させることができる。

ｃＤＮＡを調製するための鋳型として用いるｍＲＮＡは
、１１、−２ポリペプチドを産生ずる哺乳動物細胞から
単離することができる。単離されたＲＮＡはポリアデニ
ル化され（ＧｉＬＬｉｓら、　Ｉｍｎ＋ｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　Ｒｅｖ、＋　６３＋１６７〜２０９（１９８２
））　、ポリアデニル化されたＲＮＡは、例えばシ＝Ｉ
Ｉａ！密度勾配遠心法によって１１〜１２Ｓ画分に分画
することができる。１３ＳのｍＲＮＡにＩＬ　−２ｍＲ
ＮＡ活性が現われることがあるが、この場合は１１〜１
２　ＳｍＲＮＡの凝集物であることが考えられる。

ｍＲＮＡの供給源となるＴＬ−２を産生ずることができ
る哺乳動物細胞は、哺乳動物より摘出できる末梢血単核
球、扁桃腺細胞、肺臓細胞のようなＴ−リンパ球で良い
。細胞にＩＬ−２産生能を与えたり、またはＩＬ−２活
性を増強するために、ナイロンカラム処理、抗血清と補
体処理、密度勾配分画、ノイラミニダーゼとガラクトー
スオキシダーゼの組合せ処理、トリプシン処理のような
様々な酵素処理、Ｘ線照射など従来知られた方法で前処
理しても良い。上記哺乳動物細胞をＴ細胞増殖因子存在
下で培養後得られるクローン化Ｔリンパ球もｍＲＮＡの
供給源として用いることができ、これはより好ましいＴ
−リンパ球である。白血病やリンパ腫細胞株に由来する
Ｔリンパ球それ自体または上記の方法で前処理または変
異したそれらの誘導体などの形質転換されたリンパ球細
胞株またはクローニングされた形質転換細胞株もｍＲＮ
Ａの供給源として好ましい。明らかに、クローン化した
細胞株は通常クローン化前の親株に比較して多量のＩＬ
　−２ｍＲＮＡを含んでいる。上記したリンパ球由来細
胞とＣＥＭ。

Ｍｏ１ｔ　４Ｆ、　ＢＷ５１４７のごときＩＩＩ瘍細胞
株を融合することによって得られたＴ細胞ハイブリドー
マもまた使用するのに好ましい哺乳動物細胞である。こ
の場合のリンパ球由来細胞は、（１）ＩＬ−２の自発産
生細胞および（２）ＩＬ−２産生を補助する他の細胞の
存在下または非存在下に培養液中にマイトジェンが導入
され存在している時のみＩＬ−２を産生ずる細胞を含む
。

ＩＬ−２自発産生細胞においてＴＬ−２ｍＲＮＡを誘導
するために、１Ｌ−２自発産生細胞は、細胞培養の分野
でよく知られた方法で培養される。マイトジェン存在下
のみで！Ｌ−２を産生ずる細胞においてｍＲＮＡを産生
ずる場合は、培養した細胞は培地で良く洗った後、血清
を含むかまたは含まないローズウエルバークメモリアル
インスティテニート１６４０（以下、“ｌ？ＰＭｒ　１
６４０”と略す。）、ダルベラコラ変法イーグル培地（
以下“ＤＭＥＭ”と略す。）またはクリック培地のごと
き培地に再び浮遊する。これらの細胞培養培地には、ペ
ニシリン、ストレプトマイシンまたは他の抗生物質、Ｌ
−グルタミン。

ヘペス緩衝液、または炭酸水素ナトリウムのような種々
の添加物を細胞培養の分野で一般に使われる濃度で加え
ても良い。好ましい細胞濃度は０．５〜４Ｘ１０ｂ細胞
／ｄである。ｍＲＮＡの活性化とＩし２の産生を誘導す
るために適当な刺激剤が加えられる。この適当な刺激剤
の中には、マイトジェン、ノイラミニダーゼ、ガラクト
ースオキシダーゼ。

塩化亜鉛の如き亜鉛化合物またはプロティンＡ。

ストレプトリジン−〇の如き細菌由来のリンパ球活性化
因子が含まれる。刺激された細胞は回収され、洗浄され
る。マイトジェン刺激の際、マクロファージまたはプン
トリティック細胞を共存させるとやはりａ＋ＲＮＡを活
性化し、あるいは活性化ｄＮＡの収量を増大させ得る。

同様にＲａｊＬ、口ａｕｄｉ、　Ｋ５６２＋ＢＡＬＬ−
１の如きＢリンパ球またはＢリンパ球細胞株に由来する
細胞株を共存させてもｍＲＮＡは活性化され、または活
性化ｍＲＮＡの収量を増大させ得る。

哺乳動物細胞を増殖させるために、細胞は通常の条件下
でｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞培養により、または組織適合
動物の体内で維持される。ｍＲＮＡの供給源を調製する
ためにｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養による継代を行なう場合に
は、従来Ｔ細胞の生育を促進することが知られている培
地であればどのような培地にもこれら細胞は生育する。

これらの培地には哺乳動物の血清、血清成分または血清
アルブミンを添加しても良い。ｍＲＮＡの活性化のため
の培養時間は、ｍＲＮ＾を生成するための活性化に必要
な時間に対応する。

この時間は１１通常ＩＬ−２の培地中への産生が開始さ
れるまでに必要な時間と対応している。好ましい時間は
、マイトジェン等の刺激剤を添加してから３〜１２時間
である。培養時間が長すぎる場合、生成したｒＬ−２ｍ
ＲＮＡが分解されることがある。ＩＬ２産生細胞の活性
化に際し、ＰＭＡまたはＴＰＡの如きホルボールエステ
ル類を１０〜５０ｎｇ／ｄ添加して活性化レベルを上昇
させることもできる。

ＩＬ−２ｍＲＮＡ活性化のための上記工程はｐＨ７，０
〜７．４．温度範囲３２〜３８°Ｃの飽和水蒸気の環境
下で行なわれる。

ＴＬ−２を産生ずる哺乳動物細胞を取得し培養する方法
を以下に述べる。

（イ）ｒＬ−２自発産生株の取得 ヒトＴリンパ球由来白血病細胞であるジュルカット細胞
（フレンド・ハッチンソン・癌研究所／シアトル／アメ
リカ、ソータ研究所／サンジエゴ／アメリカ、西ドイツ
国立癌センター／ハイデルベルヒ／西ドイツ等で自由に
手に入る。）を１×１０６個／戚の細胞密度でクリック
培地中に懸濁させ、１５０レントゲン／分の照射速度で
合計ａ、ｏ　ｏ　ｏレントゲンのＸ線照射を行なう。こ
の後、本細胞を０．１細胞／　２００　ｕ　１培地の細
胞密度で９６穴の平底マイクロタイタープレート（「フ
ァルコン３０７２Ｊ）に添加し、５％牛脂児血清を含む
クリック培地中で３週間３７°Ｃにて５％ＣＯｚインキ
ヱベーター中にて培養する（限界希釈法によるクローニ
ング）。細胞の生育が認められた培養ウェル中の細胞は
、細胞が底面全体をおおう密度に到達する前に２４穴の
ヌンク社製培養プレートに移し、クリック培地中にて５
日間細胞を増殖させる。さらに、本細胞を１〜２Ｘ１０
”個／ｄの細胞密度にて血清も血清由来アルブミンも含
まない無血清合成培地に懸濁して２日間培養し、本培養
上清を遠心分離操作で分離し、次いで０．２２μのミリ
ポアフィルタ−にてデブリス除去と無菌化を行なった。

このようにして得た培養上清のＩＬ−２活性を測定する
ことによってＩＬ−２を自発産生ずるＸ線処理変異株が
選択され、かつクローニングされた。

（０）ヒト末梢血単核細胞よりＩＬ−２産生株の取得ヒ
トの末梢血を採血し、フィコール・ハイバークの密度勾
配遠心法により末梢血リンパ球（以下、ＰＢＬと略す）
。を採取する。本ＰＢＬをｌＸｌ０’個／ｄの細胞密度
で５％ＦＣＳを含むクリック培地に懸濁し、各２　ｍｌ
宛２４穴のヌンクの培養プレートに接種する。ここにフ
ィトヘマグルチニン−Ｍ（ギブコ社製）を５μｇ　／　
ｍｉの終末濃度になるように１００μ！添加し、上述の
条件下に４８時間培養し、次いで細胞を培養液で洗浄し
、再び１×１０５個／戚の細胞密度でクリック培地１ｄ
に接種する。さらに、コンカナバリンＡ（以下、Ｃｏｎ
＾と略す。）２．５μｇ／ｒｔｄｌで４８時間刺激した
ヒト牌細胞から調製したコンディショニングした培地１
ｉを加え、該コンディショニングした培地５０％を含む
培地を３日毎に取り換えて、ＰＢＬからのヒトＴリンパ
球を長期継代培養する。このように長期継代培養して得
たＴリンパ球を、前述と同様の限界希釈法でコンディシ
ョニングした培地に由来するヒト牌細胞の存在下、クロ
ーニングを行ない、かつ同様に細胞増殖を行なう。こう
して得られたクローン化Ｔリンパ球を１×１０６個／−
の細胞密度に１０μｇ　／　ｍｌのフィトヘマグルチニ
ン（以下、ＰＨＡと略す。）の存在下、２４穴のタンク
培養プレート中のＲＰ旧１６４０培地１　ｍｌに接種し
、２４時間、３７°Ｃで７．５％ＣＯｚインキュベータ
ー中にて培養した。本培養上清を遠心分離操作で分離し
、次いで０．２２μのミリポアフィルタ−で無菌化を行
なった後、ＩＬ−２産生ヒト正常下リンパ球クローンを
同定するために、ＩＬ−２活性検定を行なった。

（ハ）マイトジェン刺激でＩＬ−２を生産するヒトリン
パ球由来悪性化細胞の取得 前述のジュルカット細胞や前記した限界希釈法によりク
ローン化されたＪ−１１１株は、前記の無血清培地や血
清１〜２％を含むＢＰＭＩ　１６４０培地中にてＣｏｎ
Ａ　　１０　ｕ　ｇ／ｍｌやＰＨＡ　２．５　ｔｔ　ｇ
／１ｒｄｌの存在下に２４時間培養すると、ｌＯ〜４，
０００単位／ｄのＩＬ−２を産生ずることができる。ま
た、これらヒト悪性化細胞は塩化亜鉛２プロテインＡ。

ビシバニール存在下に培養しても、ＩＬ−２を産生ずる
。

（ニ）他の細胞もしくはその細胞の産生ずる因子の存在
下にマイトジェンで刺激することによりＩＬ−２を産生
ずる細胞の取得 ヒトリンパ球悪性化細胞Ｍｏ１ｔ４Ｆや前述の限界希釈
法でクローン化されたジュルカット細胞の１つのクロー
ン、ジェルカット９９株は、上述のごときレクチンやマ
イトジェンを広い濃度範囲で加えて２４〜７２時間培養
してもＩＬ−２を産生じない。ところが、この間モノカ
インの１種であるインターロイキン１を５〜１０　ｕ　
／　ｍｌまたは５０％のに５６２やラージ（Ｒａｊｉ）
細胞を共存させて３７”Ｃ，２４時間培養すると、ＩＬ
−２を確認しうる蛍（１０〜１００　ｕ／ｄ）産生する
。

このようにして活性化された細胞よりＩＬ−２ｍＲＮ＾
を抽出するには、細胞の種類を問わず常法によって行な
えばよい。たとえば、ＮＰ　−４０、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔ
ｏｎ−Ｘ１００．デオキシコール酸などの界面活性剤を
添加して細胞を部分的または完全に分解するか、ホモゲ
ナイザーや凍結融解などの物理的方法を用いて、細胞を
部分的あるいは完全に破壊、可溶化する。その際にＲＮ
ａｓｅによるＲＮＡの分解を防ぐために、抽出液中にＲ
Ｎａｓｅインヒビター、たとえばヘパリン、ポリビニル
硫酸、ベントナイト、マカロイド、ジエチルピロカーボ
ネート、バナジウム複合体などを添加しておくのが好ま
しい。また、場合に応じては、抗ＩＬ−２抗体を用いて
ＩＬ−２合成途上のポリゾームを沈降せしめ、これより
ｍＲＮＡを界面活性剤などで抽出する方法も行ない得る
。

また、ｐｏｌｉＡを含むｍＲＮＡの精製についてはオリ
ゴｄＴ−セルロース、セファロース２Ｂを担体とするポ
リＵ−セファロースなどのアフィニティ・カラムあるい
はバッチ法による精製法、　ＳＤＧ遠心法による分画、
アガロースゲル電気泳動法等によって行なうことができ
る。

上記の如くして得られたｍＲＮＡがＩＬ　　２　ｍＲＮ
Ａ活性を有するものであることを確認するためには、ｍ
ＲＮＡを蛋白に翻訳させ、その生理活性を調べるか、抗
ＩＬ−２ペプチド単りローン性抗体を用い該翻訳蛋白を
同定する等の方法を行なえばよい。たとえばｍＲＮＡは
通常、アフリカッメガエル（−１ａｅｖｉｓ）の卵にマ
イクロインジェクションすることにより（Ｇｕｒｄｏｎ
ら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２３３．１７７〜１８２（１９
７２））あるいは網状赤血球または小麦胚無細胞翻訳シ
ステムを使用することにより対応する蛋白に翻訳される
。

ＩＬ−２活性は、先にＧ１１１ｉｓら（Ｇｉｌｌｉｓら
、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２０．２０２７〜２０３３（１９
７８））によって基本的には述べられているミクロ検定
法によって確認できる。この検定法では、Ｇ１１ｌｉｓ
らによって確立された方法に従って作成した細胞障害性
Ｔリンパ球細胞株（以下、ＣＴＬＬと略す。）のＩＬ−
２に依存細胞のＤＮＡ合成上昇（ＩＬ　−２ｄｅｐｅｎ
ｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏ
ｎ）を指標としている。即ち、４Ｘ１０’個のＣＴＬＬ
細胞を２％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地１０
０μ！に懸濁し、１００μ２の連続希釈した翻訳産物と
共に９６穴の平底マイクロプレートに接種する。３７°
Ｃ，５％ＣＯ２下で２０時間培養した後、細胞を０．５
μＣＬ／ウエルの’Ｈ−ＴｄＲで４時間ラベルし、自動
細胞ハーベスタ−を用いて帯状ガラス繊維上に細胞を回
収し、細胞が取り込んだ放射能を液体シンチレーション
法で測定する。

この検定により、ＩＬ−２存在下に培養されたＣＴＬＬ
細胞が投与量に依存して”Ｈ−ＴｄＲを取込むことが判
明し、このことから検体中に含まれるＩＬ−２量を明確
に計算することができる。

ＩＬ−２は１９７３球の増殖を促す活性を有するので、
ＩＬ−２活性を１９７３球の増殖を指標として測定する
ことができる。即ち、５個のＣＴＬＬ細胞を２％のＦＣ
Ｓを含むＤＭＥＭ　１００μ２に懸濁し、１００μ２の
連続希釈した翻訳産物と共に９６穴の平底マイクロプレ
ートに接種する。７２〜９６時間、３７°Ｃ，５％Ｃｏ
ｔ下で培養した後、活性化し増殖した細胞の数を顕微鏡
下で計測する。対照群として１００Ｕ／ｄ、ＩＯＵ／Ｍ
ｉ！のＩＬ−２を用い、この対照群の増殖した生細胞数
と比較して検体のＩＬ−２活性を求める。

このようにして最も高活性の両分から得られたＩＬ−２
ｍＲＮＡはｄｓ　−ｃＤＮＡを合成するための鋳型とし
て用い、ｄｓ　−ｃＤＮＡはベクターＤＮＡと結合させ
る。

ｃＤＮＡの合成は従来の方法によって行なう。

まず、ｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴをプライマーと
してｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰの
存在下で逆転写酵素によりｍＲＮＡと相補的な５ｓ−ｃ
ＤＮＡを合成し、アルカリ処理で鋳型ｎ＋ＲＮＡを分解
除去した後、今度は単鎖ｃＤＮＡを鋳型にして逆転写酵
素あるいはＤＮＡポリメラーゼを用いてｄｓ　−ｃＤＮ
Ａを合成する。

このようにして得られたｄｓ　−ｃＤＮＡと原核生物で
複製できるレプリコンを含むベクターＤＮＡから組み換
えＤＮＡ体が作られる。しかる後、この組み換えＤＮＡ
体は宿主細胞に組み込まれる。

このｄｓ　−ｃＤＮＡ及び原核生物で増殖し得るベクタ
ーＤＮＡは、これらを結合させる前にエキソヌクレアー
ゼ処理、化学合成りＮＡ断片の追加、　ｄｓ−ｃＤＮＡ
やベクターＤＮＡの末端に連結可能な端末をつけるため
にＧ、Ｃ−鎖を伸ばすなど各種処理によって修飾される
。これらの連結可能なりＮＡは、例えばＡＴＰ共存下に
Ｔ４ファージのＤＮＡライゲースによってつぎ合せるこ
とが出来る。

このようにして調製された組換えＤＮＡ体によってクロ
ーン化されたｃＤＮＡを増巾させるため又はＩＬ−２ポ
リペプチドを製造するために生細胞を形質転換する。

ＩＬ−２生産のための適当な原核生物宿主としてはエシ
ェリヒア・コリ、バチルス・ズブチリスなどが含まれる
。宿主細胞中でのＤＮＡ増中のためにはエシェリヒア・
コリを宿主とすることが出来るが、その他の宿主細胞と
することも出来る。

適当なエシェリヒア・コリ用ベクターとしてはＥＫ型プ
ラスミドベクター（ストリンゼント型）としてｐｓｃｌ
ｏｌ、　ｐＲＫ３５３．　ｐＲＫ６４６．　ｐＲＫ２４
Ｂ、　ｐＤＦ４１など、、ＥＫタイププラスミドベクタ
ー（リラックスドタイプ）　　：　Ｃｏ１Ｅ１．　ｐＶ
Ｈ５１，ｐＡｃ１０５．　Ｒ５Ｆ２１２４゜ｐｃＲｌ、
　　ｐＭＢ９．　　ｐＢＲ３１３，ｐＢＲ３２２，ｐＢ
Ｒ３２４，ｐＢＲ３２５゜ｐＢＲ３２７，ｐＢＲ３２８
，ｐＫＹ２２８９．　　ｐＫＹ２７００．　　ｐＫＮ８
０．　　ｐＫＣ７゜ｐＫＢ１５８．　ｐＭＫ２００４．
　ｐＡｃＹｃｌ、　ｐＡｃＹｃ１８４．　ｄｕｌ等、、
λｇｔタイプファージベクター：λｇｔ、λＣ２λｇｔ
、λＢ。

λＷＥＳ、λＣ１λＷＥＳ、λＢ、λＺＪｖｉｒ、＋　
　λＢ１．λＡＬＯ，λＢ。

λＷＥＳ、Ｔｓ６２２．λＤａｍ等が含まれている。一
般に、ｐＢＲ３２２はエシェリヒア・コリ用ベクターと
してしばしば利用されてきたが、この場合最も良いクロ
ーニング部位はＰｓｔｌならびにＥｃｏＲ１部位である
。

組換えＤＮＡ体を用いた宿主細胞の形質転換には、通常
よく用いられる次の方法がある。エシェリヒア・コリの
如き原核生物が宿主の場合、このＤＮＡを取り込むこと
の出来るコンピテント細胞は対数増殖期における細胞を
回収後、良く知られているＣａＣｆｚ法によって形質転
換出来る。形質転換反応液中にＭｇ１．又はＲｂ（／！
を共存させれば形質転換効率は向上する。また、宿主細
胞のプロトプラスト調製後形質転換させることも可能で
ある。

ＩＬ−２遺伝子を保有する細胞は、次の２つの方法の何
れかを用いて形質転換後分離可能である。

（１）プラス−マイナス法：抗原刺激した哺乳動物細胞
抽出液より蔗糖密度勾配遠心分離にて１ｌ−１２Ｓ画分
として部分精製したＩＬ　−２ａ＋ＲＮＡを調製し、こ
の部分精製ｍＲＮＡを鋳型として’ａｔｐ−放射性５ｓ
−ｃＤＮＡを合成する。アルカリ処理にて鋳型＊ＲＮＡ
を除去後、単離されたｃＤＮＡは、抗原刺激しない哺乳
動物細胞から抽出され、部分精製した１１−１２３ｍＲ
ＮＡでハイブリダイズする。引続いてハイフ゛リダイズ
しなかったｃＤＮＡとハイフ゛リダイズしたｃＤＮＡは
ハイドロキシアバフィトカラムクロマトグラフィーで分
画する。ハイブリダイズしなかったｃＤＮＡとハイフ゛
リダイズしたｃＤＮＡをそれぞれプローブＡ、及びプロ
ーブＢと呼ぶ。何れの組換え体も同一の方法によりそれ
ぞれニトロセルロース濾紙上で生育させる。そして、細
胞のＤＮＡをアルカリ処理にて濾紙上に固定する。プロ
ーブＡ及びＢをそれぞれ、二つの異った濾紙上でＤＮＡ
とハイブリダイズさせる。その後、オートラジオグラフ
ィーを行ってプローブＡと陽性に反応する組換え体（プ
ラス）、プローブＢと僅か又は全熱反応しない組換え体
（マイナス）を選別する（谷口ら；　Ｐｒｏｃ。

Ｊａｐ、　Ａｃａｄ、、　Ｖ１５５Ｂ　　４６４〜４６
９（１９７９）。

（２）第２の方法は、例えば１０００〜１ｏ、ＯｏＯの
組換体クローンを２〜３０ないし２〜３００クローン宛
のクローングループに大別し、それぞれのクローングル
ープをそれぞれ常法によって培養しプラスミドＤＮＡ５
を調製する。次いで、これらプラスミドＤＮＡ５を例え
ば熱変性してｓｓ　−ｃＤＮＡをニトロセルロース濾紙
上に固定し、活性化ＩＬ−２−ｍＲＮＡを含有する哺乳
動物細胞から調製されたｍＲＮＡと相補的にハイブリダ
イゼーションを行う。あるいはまた、ＩＬ−２ｍＲＮＡ
を含有するｍＲＮＡ　（混合物）を熱変性したプラスミ
ドＤＮＡ（混合物）とハイブリダイズさせるとＤＮＡ　
−ｍＲＮＡハイブリッドがニトロセルロース濾紙上に固
定される。この濾紙を１ｍＭの１１ＥＰＥｓ、あるいは
１０ｍＭの食塩水のごとき低塩類緩衝液で洗浄し、濾紙
上に吸着されたｍＲＮＡを０．５１１１Ｍ　ＥＤＴＡ；
０．１　％　ＳＯ３？＠液含有液で例えば９５°Ｃ２１
分間処理して抽出する。精製ｍＲＮＡはこれをｏｌｉｇ
。

ｄＴ−セルロースカラムクロマトグラフィーにて溶出回
収する。次いで、ｍＲＮＡをアフリカッメガエル卵母細
胞にマイクロインジェクションして蛋白質に翻訳してＩ
Ｌ−２活性を確認する。あるいはｍＲＮＡに依存性の網
状赤血球系又は小麦胚のｉｎ　ｖｉｔｒｏ無細胞合成系
を用いてこのｍＲＮＡを蛋白に翻訳させ、抗ＩＬ−２抗
体を用いてＩＬ〜２−活性を分析することが出来る。こ
れらの方法によってＴＬ−２活性が検出されたグループ
をさらに少数の組換え体クローンを含有する群に類別し
最終的にはＩＬ−２ＤＮＡを有する単一クローンが得ら
れるまで繰返し実施する。

ＩＬ−２産生能のある組換え体よりＩＬ−２ポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡを得るには、先ずトランスフォ
ーマント中の組換えＤＮＡ体を分離し、これを制限酵素
エンドヌクレアーゼで切断する。切断によって得られる
ＤＮＡ分画より組込まれたｃＤＮＡ画分を分離する。

ｐＩＬ−２−５０Ａを組換えたＤＩＪＡよりＩＬ−２ボ
リペフ″チドをコードするＰｓｔｌ　ＯＮ八へンサート
の全ヌクレオチド配列は、Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１
ｂｅｒｔ法（Ｍｅ　ｔｈ。

Ｂｎｚｙｍ、　６５．４９９〜５６０．　（１９８０）
）　；ならびにニブオキシヌクレオチド鎖末端法（Ｓｍ
ｔｔｈ、＾、　Ｊ、　Ｍ、　Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍ、　６５．５６０〜５８０．　（１９８０）
　）にて決定された。

ｃＤＮＡインサートの制限酵素エンドヌクレアーゼによ
る切断図を第１図及び第２図（ａ）に示す。第２図（ａ
）に示すごとく、このｃＤＮＡはそれぞれＢｓｔＮｌ、
　Ｘｂａ　Ｉ　、　ＢｓｔＮ　Ｉなる制限酵素エンドヌ
クレアーゼで切断される構造を有する。

本ｃＤＮＡインサートのＤＮＡ配列は一つの大きなオー
プンリーディングフレームを保有する。真核生物の読み
取り開始配列となることの多い第一のＡＴＧ配列（Ｋｏ
ｚａｋ、　Ｍ、　Ｃｅ１１．１５．１１０！Ｊ−１１２
３（１９７８）　）は、５′一端から４８−５０ヌクレ
オチド位に存在し、読み終り配列ＴＧＡが存在するヌク
レオチド位５０７−５０９迄１５２の配列がこのＡＴＧ
につながっている。ｍＲＮＡの３’−ｐｏｌｙ（Ａ）末
端に相当するＡのつながりがｃＤＮＡ末端に見出され、
通常真核体物ｍＲＮＡのほとんどに見出される６個から
なるヌクレオチドＡＡＴＡＡＡ　（７７１−７７６位）
が先に位置する。

（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、　　Ｎ、Ｊ、　　＆　Ｂｒｏｗ
ｎｌｅｅ　Ｃ，Ｇ、、　　Ｎａｔｕｒｅ　２６３゜２１
１−２１４．（１９７６）） ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列は第２図（
ｂ）（アミノ酸配列１）のごとく演えきでき、しかもア
ミノ酸配列Ｉのポリペプチドは１５３個のアミノ酸から
なり、その分子量は１７６３１．７ダルトンと計算され
る。今日迄知られている分泌蛋白の殆んどに見られると
報告されているように（ＢｌｏｂｅｌＧ、　ｅｔ　ａｌ
、　Ｓｙｍ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　３３
．９〜３６（１９７９））、上記演えきＩＬ−２ポリペ
プチドのＮ末端領域はやはり疎水性である。本領域は成
熟ＩＬ−２の分泌時に切断されるシグナルペプチドの役
割を果しているであろう。切断は２０−２１位のＳｅｔ
とＡｌａ間でで起るか２１−２２位間のＡｌａ−Ｐｒｏ
間で切断されアミノ酸配列■および■を有するポリペプ
チドを生成する。何故ならば同様な切断位置は今迄知ら
れたその他の分泌蛋白にもしばしば見出されているから
である（Ｂｌｏｂｅｌ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ’、　Ｓｙ
ｍｐ、　Ｓｏｃ、［Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、、　■、　９〜３６（１９７９））、従って、
成熟ＩＬ−２ポリペプチドは１３３ないし１３２個のア
ミノ酸から成り、分子量は１５４２０．５または１５３
４９．４ダルトンと算出される。本分子量値はジュルカ
ッＩ・細胞から得られたヒトＩＬ−２蛋白の分子量（１
５０００ダルトン）として報告されたものを対比される
（Ｇｉｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　Ｒｅｖ、＋　６３＋　６７〜２０９　（１９
８２）　）。また実施例３に示すごとく塩基配列１１１
〜１１３位にあるＣＣＴ配列から始まるＤＮＡ画分、即
ち、２２位に位置するＰｒｏから始まるポリペプチドに
対するコード（第２（ｂ）図中のアミノ酸配列■）はＩ
Ｌ−２活性を有するポリペプチドを表現していることが
確認された。塩基配列１０７〜１１０位にあるＧＣ＾か
ら始まるＤＮＡ画分、即ち第２（ｂ）図のアミノ酸配列
■に示すごとく、２１位に位置するＡｌａから始まるポ
リペプチドをコードするＤＮＡ画分は、実施例６に示す
ごと＜　ＴＬ−２活性を有するポリペプチドを表現して
いることが確認された。

有核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子でも知
られている様に多形現象を示すことが知られている（谷
口ら、　Ｇｅｎｅ　１０．１１〜１５（１９８０）、大
野、呑口、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ口、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃＶ　［ＩＳＡ＋　７７＋５３０５〜５３０９（１９８
１）；　Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、　　Ｎａｔｕｒｅ　２
９５．　５０１〜５０８　（１９８１））。この多形現
象によって、蛋白生産物のアミノ酸のあるものが置換さ
れる場合もあれば、塩基配列の変化はあっても全く変ら
ない場合もある。ヒトＩＬ−２・ｃＤＮへの場合、ｐｌ
Ｌ−２−５０Ａ　ｃＤＮＡの５０３位のＡ残基がＧ残基
で置き換えられた他のｃＤＮＡクローン（ｐｌＬ−２−
５０３）も検出できる。ｐｒｔ。

２−５０Ａ　ｃＤＮＡとは塩基配列が異なるその他のｃ
ＤＮＡクローンの存在も期待できる。

上記説明からも明らかなごとく、本発明の遺伝子は、第
２（ａ）図に示された塩基配列を有するＤＮＡ　。

４Ｂ　−５０位のＡＴＧ配列から始まり、５０４〜５０
６位にある少くともＡＣＴ配列に至る連続塩基配列を有
するＤＮＡ５．１０８−１１０位のＧＣＡ配列から始ま
り、ＧＣＡ配列から少くとも＾ｅＴ配列に至る連続塩基
配列を有するＤＮＡ、また１１１−１１３位のＣＣＴ配
列から少くともＡＣＴ配列に至る連続塩基配列を有する
ＤＮＡを包含する。本発明の遺伝子はまた、５０４〜５
０６位のＡＣＴ配列に終り、１位のＡに始まるＤＮＡ、
４８−５０位のＡＴＧで始まるＤＮＡ、１０８−１１０
位のＧＣＡ配列で始まるＤＮＡ又は１１１−１１３位の
ＣＣＴ配列で始まるＤＮＡを包含する。

更に本発明の遺伝子は、５０７〜５０９位のＴＧＡ配列
に終り、１位のＡに始まるＤＮＡ、４８〜５０位のＡＴ
Ｇ配列で始まるＤＮＡ、　１０８〜１１０位のＯＣＡ配
列で始まるＤＮＡまたは１１１−１１３位のＣＣＴ配列
で始まるＤＮＡを包含する。

更に本発明の遺伝子は、８０１位のＣで終り、１位のＡ
で始まるＤＮＡ、　４Ｂ−５０位のＡＴＧで始まるＤＮ
Ａ、　１０８１１０位のＧＣＡで始まるＤＮＡまたは１
１１−１１３位のＯＣＴ配列で始まるＤＮＡを包含する
。本発明の遺伝子はまたｐｏｌｙ（Ａ）で終り、４８−
５０位の＾ＴＧ配列から始まるＤＮＡ、　１０８−１１
０位のＧＣＡ配列で始まるＤＮＡまたは１１１−１１３
位のＣＣＴ配列で始まるＤＮＡを含む。また、本発明の
遺伝子は、アミノ酸配列ｔ、ｎ、ｍに相当する塩基配列
を有する遺伝子を含む。アミノ酸配列Ｉの中で１個ない
しそれ以上のアミノ酸を欠くポリペプチド、あるいはア
ミノ酸配列ｒの中の１個ないしそれ以上のアミノ酸が１
個ないしそれ以上のアミノ酸で置換されたポリペプチド
はＩＬ−２活性を有することもあり、従ってこの様なポ
リペプチドをコードする遺伝子は本発明の遺伝子として
使える。同様にアミノ酸配列１．ＩＩまたは■に対して
１個ないしそれ以上のアミノ酸を表現し得る１個ないし
それ以上の塩基を余分に結合した遺伝子であっても追加
されたアミノ酸が、ポリペプチドのＩＬ−２活性発現に
邪魔しない限り本発明の遺伝子の中に包含される。ＩＬ
−２としてのポリペプチド機能を阻害する追加アミノ酸
配列を有する修飾領域であっても新たに追加された領域
が容易に除去出来るものならば本発明の遺伝子として利
用出来る。同じことはアミノ酸配列１．Ｕおよび■に対
応する遺伝子のアミノ酸配列１．Ｕおよび■のＣ−末端
にアミノ酸追加をコードするＤＮＡが３°−末端に追加
結合せしめたＤＮＡの場合にも言える。

上記の如くして得られた本発明の遺伝子を利用してＩＬ
−２を生産するには、まず本発明の遺伝子を含存する組
換えＤＮＡ体を作り、次いで該組換えＤＮＡ体により宿
主細胞を形質転換し、該形質転換された生物細胞を培地
で培養すればよい。

生細胞中でＩＬ−２産生をする組換えＤＮＡ体は、次の
各種方法で作られる。例えば、ＩＬ−２・ｃＤＮＡをコ
ードする配列を発現ベクターのプロモーター配列下流に
挿入する。あるいはプロモーター配列を持つｃＤＮＡ片
を発現ベクターのｃＤＮＡ挿入の前あるいは後にＩＬ−
２をコードする配列の上流に挿入することが出来る。

ＩＬ−２−ｃＤＮＡを発現し、ＩＬ−２−ポリペプチド
を産生ずる原核生物の造成法を詳述すれば以下の通りで
ある。

（１）　　エシェリヒア・コリによるＩＬ−２−ｃＤＮ
Ａの発現 エシェリヒア・コリ中でＩＬ−２−ｃＤＮＡを発現させ
るには、先ずｃＤＮＡを各種細菌プロモーターと結合せ
しめた後、プロモーター下流にｃＤＮＡを含有するバイ
ブリドプラスミドを作る。このプラスミドを、例えばエ
シェリヒア・３１月ＩＢＩＯＩに感染させ、ヒ）ＩＬ−
２活性を有する蛋白を生合成する細菌がクローンされる
。本来細菌のプロモーターならば如何なるものでもｃＤ
ＮＡに適当に接続されていればＩＬ−２−ｃＤＮＡを発
現する。この様なｃＤＮＡの発現例は以下のとおりであ
る。

ＩＬ−２をコードするクローン化ｃＤＮＡは第２図に示
される様な１５３個のアミノ酸からなるポリペプチドを
コードする。本ポリペプチドの２０個のアミノ酸に相当
するＮ−末端領域は極めて疎水性であり、殆んどの分泌
蛋白の特徴でもある。この様な疎水性配列はシグナル配
列と称し分泌過程で切断される。故に、成熟ＩＬ−２ポ
リペプチドは、１５３個のアミノ酸より少ない筈である
。このことから、成１４ＩＬ　　２ポリペプチドをコー
ドするｃＤＮＡ部分を発現させることが望ましく、■シ
ー２シグナル配列相当部分を発現させるのは望ましくは
ない。

（１）　　プラスミドベクターｐＴｒＳ−３の構築ｐＴ
ｒＳ−３は、エシェリヒア・コリＴｒｐプロモーターを
含み、ｐＴｒＳ−３のリーダーペプチドのためのリポソ
ーム結合部位（ＳＤ配列）は既に報告されている（Ｇ、
Ｍｉｏｚｚａｒｉ　ａｎｄ　Ｙａｎｏｆｓｋｙ　Ｊ、　
８ａｃｔｅｒｉｏ１．１３３゜１４５７〜１４６６（１
９７８））、５０配列の下流１３塩基対にあるＡ７Ｇコ
ードンの存在も報告されている（Ｎｉｓｈｉ　ｅｔａｌ
、往化学５４．　Ｎｏ、８．６７６　（１９８２））。

このプラスミドベクターはまた、ＡＴＧ開始配列（第３
図）の下流に一つのｓｐｈ　　１部位を含んでいる。

ｒＬ−２・ｃＤＮＡを発現させるため、先ずプラスミド
をｓｐｈ　　［で消化しエシェリヒア・コリＤＮＡポリ
メラーゼＩ　（フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント
）または、バクテリオファージＴ４　ＤＮＡポリメラー
ゼｒで処理し３”−位突き出し末端を除去する（第４図
（ａ））。プラスミドｐｌＬ−２−５０４をＰｓｔ　　
ＩおよびＨｇｒＡ　Ｉで２回消化し、より大きいｃＤＮ
Ａ画分を単離する。

次いでＤＮＡをエシェリヒア・コリＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（フレノウフラグメント）又はバクテリオファージＴ
４　ＤＮＡポリメラーゼで処理して３゛−突き出し末端
を切りはなす。この処理をしたｃＤＮＡ！、ｔ　１３２
個のアミノ酸のＩＬ−２ポリペプチドをコードする（第
４（ａ）図）。このｃＤＮＡを上述のごとく前処理した
ｐＴｒＳ　　３プラスミドＤＮＡに結合せしめ、ＡＴＧ
開始コードンをＩＬ　−２ｃＤＮＡのＣＣＴ　（Ｐｒｏ
）配列につなぎ合せる。こうしてプラスミドｐ’ｒ　Ｉ
Ｌ−２−２２が得られる。Ｔｒｐプロモーター配列とｐ
Ｔ　ＩＬ−２−２２のＩＬ−２ｃＤＮ＾配列の結合は第
４（ａ）図に示す。

プラスミドｐＴ　ＩＬ−２−２２はエシェリヒア・コリ
によりプロリンから始まる１３２個のアミノ酸からなる
ＩＬ−２ポリペプチド合成を指令する。

（ｉｉ）成熟１１２はプロリンの代りにＮ−末端アミノ
酸としてアラニン（２１位）を含むこともあり、１３３
個のアミノ酸から成るＩＬ−２ポリペプチド合成を指示
するプラスミドを以下の如く作ることができる。

プラスミドｐＴｒＳ　　３はＳＤ配列とＡＴＧ配列との
間に１つのＣ１ａ　　Ｉ切断部位がある（第３図）、本
プラスミドはＣ１ａ　　ＩとＳａｔ　　Ｉで切断される
。プラスミドｐＩＬ−２−５０八をＰｓｔ　　Ｉで部分
分解し、エシェリヒア・コリＤＮＡポリメラーゼＩで処
理し、最も長いＤＮＡを単“離する。次いでＤＮＡを制
限酵素Ｘｈｏ　　Ｉ切断部位を含む合成りＮＡリンカ−
と結合させ、ＩＬ−２をコードする配列の３１−側下流
にＤＮへリンカ−を導入したプラスミドｐｌＬ−２−５
ＯＡ　（Ｘｈｏ）を含むクローンを単離する。プラスミ
ドｐＴ１．−２−５ＯＡ（Ｘｈｏ）を先ずＨｇ１ＡＩで
切断し、エシェリヒア・コリ　フレノウフラグメントま
たはＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理し、Ｘｈｏ　　Ｉ
で消化すればｃＤＮＡ画分が単離できる。

このｃＤＮＡフラグメントをＣ１ａ　　ｒおよびＳａｌ
　　Ｉで前処理したｐＴｒＳ−３ＤＮＡに結合させ第４
（ｂ）図の如く合成りＮＡにつなげる。かくしてＡｌａ
からスタートする１３３個のアミノ酸力）ら成るＩＬ−
２ポリペプチドをエシェリヒア・コリ中で合成させるプ
ラスミドｐＴＩＬ−２−２１が得られる。（第４（ｂ）
図）。同様なことはＸｈｏ　　Ｉリンカ−を使用しなく
とも作られる。

（ｉｉｉ　）異ったＮ−末端アミノ酸を有する異った大
きさのＩＬ−２ポリペプチドはｐＴｒＳ−３発現プラス
ミドベクターを用いても作られる。以下に示すごと＜　
、ｐｌＬ−２−５０八にクローンされたＩＬ　　２　ｃ
ＤＮＡはヌクレオチド結合部位８１−８５に唯一っだけ
Ｄｄｅ　１部分を有する。プラスミドｐｒＬ−２−５Ｏ
Ａ　（Ｘｈｏ）を、Ｄｂｅ　　Ｉで切断し、ｃＤＮＡの
より大きい区分を含有するＤＮＡ画分を単離する。本画
分はｐＢＲ３２２より３０００塩基対を有するＤＮＡを
含んでいる（第４（ｃ）図）。

ＤＮ八へ分をエクソヌクレアーゼ［ｌａｌ　３１で処Ｆ
ＩＬ、次いでＸｈｏ　　Ｉで切断する。ここで得られた
ＤＮＡをｓｐｈ　　Ｉで切断したｐＴｒＳ−３と結合せ
しめ、ＫｌｅｎｏｗフラグメントまたはＴ４　ＤＮＡポ
リメラーゼで処理し次いでＳａｌ　　Ｉで消化する（第
４（Ｃ）図）。つなぎ合せたＤＮＡをエシェリヒア・コ
リ８８１０１に怒染させ、ヒトＩＬ−２を発現するクロ
ーンを検索する。これらのクローンは色色な大きさのヒ
トＩＬ−２を発現。

する筈である。何故ならばヒ目Ｌ−２のＮ−末端領域に
相当するＤＮＡは種々切断除去されるからである。かく
してＩＬ−２ｃＤＮＡを含有するｐＴＩＬ−２−１４と
１５が得られる。

（ｉｖ）　ＩＬ−２ｃＤＮＡはまたｐＫＴ　２１Ｂ　（
Ｔａｌｍａｇｅより提供を受けた；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
目、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

？？、　Ｐ、３３６９〜３３７３　（１９８０）　）を
用いても発現可能である。プラスミドｐＫＴ　２１８は
Ｐｓｔ　　Ｉで切断し、ｐｌＬ２−５ＯＡをｔｌｇｉＡ
ＩとＰｓｔ　Ｉで切断（第５図）して得たＩＬ−２ｃＤ
ＮＡ挿入部分とつなぎ合わせる。出来上ったプラスミド
ｐＫＩＬ−２−２１は第５図に示したように、蛋白合成
開始の始発位に配列を有している。

したがって、このプラスミドｐＫＩＬ−２−２１は１ｔ
−２の１３３個のアミノ酸とβ−ラクタマーゼのアミノ
酸からなる両者が融合したポリペプチドからなり、これ
をエシェリヒア・コリ中で合成することが出来る筈であ
る（最初のメチオニンはエシェリヒア・コリでは切断除
去される）。

（ｖ　）　ｐ−ＢＲ・３２２にｔｕｆＢに対するプロモ
ーター配列を挿入したプラスミドｐＴｕＢｌｐ−５の発
現は既に行なわれている（呑口ら、生化学５３９６６（
１９８１））。

このプラスミドは一つのＣ１ａ　　Ｉ切断部位を含み、
第６図に示すごと（本切断部位はＳＤ配列の２塩基対だ
け下流に位置する。ｐＴｒＳ−３もまたＳＤ配列とＡＴ
Ｇ始発配列の間にある一つのＣ１ａ　　Ｉ切断部位を含
み、同時にこのＣ１ａ　　ｒ部位はｐＴｒＳ−３とＴＬ
、−２ｃＤＮＡを用いて発現用プラスミドを作る過程で
壊されないので細菌ＴｒｐプロモーターをｔｕｆＢプロ
モーターで置き換えることは極めて簡単である。従って
ヒトＴＬ−２ｃＤＮＡはｔｕｆＢプロモーターの制御下
で発現される。例えばｐＴＩＬ−２−２２をＣ１ａ　　
ＩとＰｖｕ　Ｉｆで切断し、ＩＬ−２ｃＤＮＡを含むＤ
ＮＡ画分を分離する。

次いでこの両分をｐＴｕＢＩＰ−５でつなぎ合わせ、Ｃ
１ａ　　ＩとＰｖｕ　ＩＩで予め切断後、第６図に図示
される様にプラスミドｐＴｕｌＬ−２〜２２が造成され
る。ｒＬ−２活性はプラスミドｐＴｕｌＬ−２−２２を
含むエシェリヒア・コリ１１８１０１の抽出液に検出で
きる。

（ｖｉ）例えばｐＴＩＬ−２−２１を使っても、また基
本的にはｐＴｒＳ−３を用いて達成したすべての発現用
プラスミドを用いることによっても同様に造成できる。

また例えばｐＴｕＩＬ−２−２２をＣ１ａ　　Ｉで切断
し、Ｂａ１３１またはＳｒまたはＤＮＡポリメラーゼ■
　（エシェリヒア・コリ）にてＤＮＡの塩基対２−３個
を除去または補充し再度プラスミドをつなげることによ
ってＳＤおよびＡＴＧ配列の距離を至適の長さにするこ
とも可能である。

次いで、組換えＤＮＡ体を挿入したエシェリヒア・コリ
、バチルス・ズブチリスの如き形質転換された原核生物
細胞を培養して組換えＤＮＡ体を増申し又はＩＬ−２ポ
リペプチドを生産する。この培養は通常の方法で行なわ
れる。

細胞内または細胞外に生産されたＩＬ−２は硫安沈澱、
塩類除去のための透析（常圧または減圧下）。

ゲル濾過、クロマトグラフィー、等電点平板上濃縮、ゲ
ル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬ
Ｃと略記）、（イオン交換、ゲル濾過並びに逆相クロマ
トグラフィー）、及び色素結合担体、ＩＬ−２に対する
モノクローナル抗体を結合した活性化セファロース４Ｂ
又はレクチン結合セファロース４Ｂ等によるアフィニテ
ィクロマトグラフィー等、公知の方法によって回収する
ことができる。

ＩＬ−２の単則精製法は−ａｔｓｏｎら（Ｊ、　Ｅｘｐ
、　Ｍｅｄ、。

１５０、８４９−８６１（１９７９）、　Ｇｉｌ！ｉｓ
　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１２４、１９５４−１９６２（１９８０）、　Ｍｏｃｈ
ｉｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　３９．１８５−２
０１（１９８０）、　Ｗｅｌｔｅ。

Ｋ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｋｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１５
６．４５４−４６４（１９８２））によって報告されて
いる。

かくして得られたポリペプチドはマイトジェン刺激によ
って哺乳動物細胞から作られるＩＬ−２について知られ
ているものと同一の生化学的並びに生物学的挙動を示し
ＩＬ−２活性を有する。分子量は約１５０００ダルトン
でありＩＬ−２活性は、Ｉｇｓｏｒｂ（Ｅｎｚｙｍｅ　
Ｃｅｎｔｅｒ）の様な免疫吸着剤の有無にかかねらず完
全に中和され、またはモノクローナル抗ＩＬ−２抗体で
沈澱した。免疫電気泳動において、！し一２ポリペプチ
ドは、対応する抗ＩＬ−２抗体に対して唯１個の沈降線
を示す。ＩＬ−２活性は２−メルカプトエタノールで還
元後も安定であり、ＤＮＡ５ｅ及びＲＮＡ５ｅ処理して
も、又５６°Ｃ１３０分熱処理しても安定である。活性
はｐＨ２〜９で安定である。この様にして生産されたＩ
Ｌ−２はモノクローナルな機能を有するＴ細胞（細胞障
害性Ｔリンパ球）の増殖を促進し、胸腺細胞の分裂を強
め、更に抗原非存在下、メモリー状態から抗癌特異的細
胞障害１９７３球への分化を惹き起こす。また、ＹＡＣ
−１細胞やＲＬ　　１細胞に対するナチュラルキラー細
胞の活性化の増強に役立つ。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例１ （１）　　ヒトＴ細胞系白血病細胞株であるジュルカッ
ト細胞（日本、西独および米国では自由に人手可能であ
る）を１０％ＦＣ５を含むＲＰ旧１６４０培地にけん濁
し、Ｘ線照射装置Ｅｘｓ　１５０／３００−４（東芝・
日本）により５０秒間、室温で１０．０００レントゲン
に達するまで照射した。その後照射された細胞は上述の
培地中、初期細胞密度１×１０ｓ個／戚で５％炭酸ガス
、３７℃のインキュベーター中で５日間培養した。

この変異細胞（０，２個／穴）を９６穴の平底のマイク
ロプレートの１０穴にまき、５％炭酸ガス、３７゛Ｃの
インキュベーター中で２１日間培養した。

生育してくる穴から得られるクローンはクローン量を増
加させるため新たな培地へ移し、その増加したクローン
はＣｏｎＡ　　５０　ｕ　ｇ／ｌｌ１１存在下で初期細
胞密度ｌＸｌ０”個／ｒｒｄ１．で２４時間培養した。

そしてＩＬ−２活性は前述の方法に従って測定した。

この結果、ジュルカット−１１１（ＡＴＣＣＣＲＬ８１
２９）　（以後”Ｊ−１１１”と称する）と命名された
ヒトＴ細胞株が親株のジュルカットからクローン化、選
択され、この細胞のＩＬ−２産生能は親株の４０倍に増
加していた。

このクローン化したＪ−１１１細胞株は通常条件下で増
殖し、その増殖速度は通常のジュルカット細胞とほとん
ど同しであった。

（２）Ｊ−１１１細胞（ＩＸＩＯ５個／　ｍｌ　）を無
血清合成培地ＲＩＴ　Ｃ５５−９（Ｓａｔｏ、　Ｔ、　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｘｐ。

Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、　１３８．１２７−１３４．（１
９８２））　１０１００Ｏに接種し、ローラー培養ボト
ル（フアシヨン３０２７）内で３７゛Ｃ１４日間培養し
、増殖した細胞を遠心分離により取得した。この細胞を
再び４Ｘ１０ｈ個／ｍβとなるよう上述のＣｏｎＡ　２
５μｇ／ｍｌ含有培地に接種した。ローラー培養ボトル
（フアシヨン）４バツチの各々に細胞を接種した培養液
１００　ｍｌを入れ、６時間回転培養した。

（３）　　このようにＣｏｎＡ　２５μｇａｒｎｅｔで
６時間刺激したジュルカット細胞（１，２ＸＩＯ”）は
生理食塩リン酸緩衝液（以後ＰＢＳと略す）８，０００
ｄに懸濁した。この細胞は遠心操作により２回洗浄し、
ヌクレアーゼ阻害剤であるリボヌクレオシドーバナデイ
ル複合体（１０ｍＭ）を含有するＲ５Ｂ溶液（１〇−ト
リス−塩酸緩衝液、ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＮａＣｌ２
．１、５　ｍＭ　ＭｇＣｌ　ｚ）　８００ｍ１に再懸濁
した。その後、界面活性剤ＮＰ−４０を最終濃度０．０
５％となるように加え、ゆっくり混合し、細胞核を３．
ＯＯＯｒｐｍ、５分、４　’Ｃ下で遠心し分離した。５
Ｏ５（０，５％）及びＥＤＴＡ　（５ｍＭ）を上清液へ
加え、細胞質ＲＮＡを上清液と同量のフェノールを加え
抽出した。フェノールによる抽出を３回繰返した後、Ｒ
ＮＡは２倍量のエタノールにより沈澱され、本沈澱物を
遠心により集め、ｐＨ７，５の１０ｍＭトリス−塩酸に
溶解した。得られたＲＮＪＩは１９６■であった。

ｍＲＮＡの分画はオリゴ（ｄＴ）−セルロース（Ｐ、Ｌ
。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｔｙｐｅ　？）のアフィ
ニティークロマトグラフィーを使用し行った。吸着液は
２０ｍＭトリス−塩酸、０．５ＭＮａＣ１，１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ及び０．５％ＳＤＳを含むｐＨ７，５の溶液で
あり、溶出はカラムを緩衝液（２０ｍＭｌ−リス−塩酸
、ｐＨ７，５，０，５ＭＮａＣｆ、１ｍＭＥＤＴ＾）で
洗浄後、水と１０ｍＭトリス−塩酸（ｐｌ＋　７．５　
）で交互に行った。溶出により得られたｍＲＮＡは３．
６＋ｎｇであった。次にこの得られたｍＲＮＡ　２．４
　ｍｇを蔗糖密度勾配遠心法（５０ｍＭ　　トリス−塩
酸、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２ＭＮａＣｊ！を含むｐ
Ｈ７，５の溶液中で蔗１１！密度勾配５−２５％、２６
．００Ｏｒｐｍで４°Ｃ下２４時間）により分画した。

ｍＲＮＡの１１から１２Ｓが分画Ｎｏ、１２．１３．１
４へ分画され、各々５９μｇ、４６μｇ、６０μｇであ
った。

（４）Ｎα１３の分画に得られたｍＲＮＡをアフリカッ
メガエル豆並並旦す腸１ａの卵母細胞へ注入した（　５
０　ｎｇ　ｍＲＮＡ／卵母細胞）、この卵母細胞の培養
液をＩＬ−２活性測定した。表１に示す如く、３Ｈ−チ
ミジン（１Ｉ−ＴｄＲ）の取込みの上昇及び活性化Ｔリ
ンパ球数の増加が確認され、明らかにこの分画中のｍＲ
ＮＡはヒトｒＬ−２ｍＲＮＡを含んでいる事が立証され
た。

表　　１ （ａ） 訳住ｊ戊窃 Ｘ３２　　　　　　１ＬＩ、Ｉｔ：１９（ｂ） 分画１３の翻　　Ｘ２　　　　１１５　　　４０訳生成
物　　　　Ｘ１６　　　　　５５＊　単位は標準ＩＬ−
２（１０単位／ｄ）の’Ｈ−ＴｄＲ取込み量と比較する
事により算出した。

（５）その後ｒＬ２ｍＲＮＡを含む１１〜１２Ｓ　ｍＲ
Ｎ＾の随１３分画からｉｎ　ｖｉｔｒｏでｃＤＮＡを合
成した。

組換え体ＤＮＡはプラスミドベクターｐＢＲ３２２と構
成した。組換え体ＤＮＡをエシェリヒア・コリに形質転
換し、ＩＬ　　２　ｃＤＮＡクローンを獲得したクロー
ンを以下に示す如き方法により選択した。

（５−１）　５０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
５）、３０ｍＭ　ＮａＣ１，６ｎ＋Ｍ　ＭｇＣｊ２ｚ　
、５ｍＭジチオスレイトール（以後ＤＴＴと略す）、０
．５ｍＭの各ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、　ｄＴ
ＴＰ　（ｄＣＴＰはｉｚｐ放射標識したものを含む）０
．７μｇオリゴ（ｄＴ）＋。、１０μｇ　ｍＲＮＡ及び
１５単位八ＭＶ逆転写酵素（Ｊ、　Ｗ、　Ｂｅａｒｄ）
を混合し、４１℃下で９０分保った。反応終了後、ＤＮ
Ａはフェノール処理後エタノール沈澱物として回収し、
このＤＮＡを２０ｍＭ　トリスおよび１　ｍＭ　ＥＤＴ
＾を含むｐＨ７，５の溶液に溶解した。

５ｓ−ｃＤＮＡ　２．５μｇが合成された。本反応液よ
りｍＲＮＡを除くために反応液にＮａＯＨ溶液を加えて
０、３３　Ｎ　ＮａＯＨ溶液とし、室温にて１５時間置
き、次いでｐｌ＋７．５のＬＭ）リス−塩酸緩衝液を同
量加えて中和しセファデックスＧ−５０カラムをカラム
を通した。回収されたｃＤＮＡは１．８Ｈｇであった。

（５−２）５０ｍＭ　　リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）、
１、　ＯｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、１０ｍＭ　ＤＴＴ、　０
．７５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、　ｄｃＴｒ’、　
ｄＴＴＰ　（ｄＣＴＰは３Ｈで標識したものを含む）　
、１．８　ｕ　ｇ　５ｓ−ｃＤＮＡおよび８単位ポリメ
レースＩ　（ＢＲＬ、米国）を混ぜ１５時間、１５°Ｃ
で反応を行った。反応終了後ＤＮＡをフェノール及びク
ロロホルム処理後エタノール沈澱物として回収した。１
．１０　ｕ　ｇのｄｓ　−ｃＤＮＡが生成した。５０ｍ
Ｍ酢酸ソーダ（ｐＨ４，５）　、０．２　Ｍ　ＮａＣｌ
！、、１　ｍＭ　ＺｎＣ１！および１．１０ｔ！ｇ二本
鎖ｃＤＮＡの混合物を３７°Ｃで３０分間インキュベー
トした後０．２５単位のヌクレアーゼＳ＋（三井、日本
）を加え、さらに１５分間インキュベートした。反応終
了後、フェノール処理を２回行った反応生成物をセファ
デックスＧ−５０へ供し、二本鎖ｃＤＮＡ　０．５５　
ｕ　ｇを得た。

（５−３）０．１４Ｍカコジル酸カリウム、３０１　ト
リス塩基、０．１　ｍＭ　ＤＴＴ、　　１　ｍＭ　Ｃｏ
Ｃ１ｚ、０．６４ｍＭ　”Ｐ−ｄＣＴＰ　（比活性２゜
７　Ｘ　１０　”　ｃｐｍ／ｎ　ｍｏｌ）、０、５５　
ｕ　ｇ　ｄｓ−ｃＤＮＡおよび５単位のターミナルトラ
ンスフェラーゼ（ＢＲＬ）を混合し、３７°Ｃで７分間
インキヱベートした後フェノール処理し、次いでセファ
デックスＧ−５０カラムに供し、エタノール沈澱物とし
て０．５０μｇ　ＤＮＡを得た。回収したこのＤＮＡは
約５０個のｄＣＭＰ残基が両３′末端に付加されている
事が判明した。

ｐＢＲ３２２ＤＮＡ　ｌ　Ｏｕ　ｇを制限酵素Ｐｓｔ　
Ｉで切断したのちｄＣＴＰのかわりにｄＧＴＰを用いた
こと以外は前述のｄｓ　−ｃＤＮＡにｄＣＭＰ鎖を付加
したときに用いた方法と全く同じ条件により、切断した
ＤＮＡの両３”末端にｄＧＭＰ鎖を付加した。

（５−４）　５０ｍＭ　）リス−塩酸（ｐＨ７，５）０
、１　Ｍ　ＮａＣｌ２．５ｍＭ　ＤＥＴＡ、　０．０５
　ＩＩ　ｇ　ｄＧＭＰ残基付加ｐＢＲ３２２および０．
０１Ｍｇ　ｄｃｌＩＰ残基付加残基付加金ＤＮＡ５°Ｃ
で２時間、次いで４６°Ｃで１２０分間、さらに３７°
Ｃで６０分間、そして室温で６０分間インキュベートし
た。

エシェリヒア・コリＺ　　１７７６（Ｃｕｒｔｉｓｓ　
ＩＩＩ　＋　Ｒ，ｅｔａｌ、ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｎ＋ｂｉｎａｎｔ　
ＤＮＡ。

（Ｗ、　Ａ、　５ｃｏｔｔ　＆　Ｒ，Ｗｅｒｎｅｒ　ｅ
ｄ、）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋（１９７７）
）を５０ｍ１のし培地（１００ａｇ／ｍｌのジアミノピ
メリン酸、５０Ｍｇ／−のチミジン、１％トリプトファ
ン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣ１および０．
１％グルコースを含む）に接種し培養液の吸光度が５６
２μｍで０．３付近になるまで３７°Ｃで振とう培養し
た。培養終了後、培養液を３０分間Ｏ′Ｃに保持し、菌
体を遠心分離により集め、５Ｉｌ１Ｍトリスー塩酸（ｐ
Ｈ７，６）　、０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣＲ１５ｍＭＭｇＣ
１ｚおよび１０ｍＭ　ＲｂＣｊ！を含む溶液２５ｄで２
回洗浄した。

得られた菌体を５ｍＭ　　トリス−塩酸（ｐＨ７，６＞
、０．２５Ｍ　　ＫＣｌ、、５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、０
．１　Ｍ　Ｃａ（ｆ！２および１０＋ｎＭ　ＲｂＣｌ１
を含む溶液２０戒に懸濁し、０°Ｃで２５分間静置後、
菌体を集め上記と同じ溶液１ｄに菌体を再懸濁し、得ら
れた菌体懸濁液の０．２成に上記組換え体ＤＮＡを入れ
、０°Ｃで６０分間静置した。その後り培地０．７ｍｌ
を加え３７°Ｃで３０分間振とう培養した。こうして得
られた培養液（０，１ｄ）を１００μｇ／ｄジアミノピ
メリン酸、５０ａｇ／ｄチミジンおよび１５ａｇ／ｍｌ
テトラサイクリンを含むし培地の１．５％寒天培地上に
一面に塗抹し、３７°Ｃで２日間インキュベートした。

（５−５）出現した４３２のコロニーを１８のグループ
に分け、（その各グループは２４の異なるバクテリアク
ローンを含む）１００μｇ　／　ｍｌｌのジアミノピメ
リン酸、５０Ｍｇ／ｍｆｌのチミジンおよび１０ａｇの
テトラサイクリンを含むし培地２００−に接種し、３７
°Ｃで５〜７時間振とう培養した。次に最終濃度１７０
μｇ／ｒａｉｌとなるように加えられたクロラムフェニ
コールを含む新たなし培地２００−を加え、さらに−晩
培養した。

このようにして増強されたプラスミドＤＮＡを常法に従
い精製した。

ＩＬ　　２　ｃＤＮＡを有するクローンはｍＲＮＡハイ
ブリダイゼーション−トランスレーションアッセイ（以
後Ｈ−Ｔアッセイと略称する）により選択した。

ここで用いられたＨ−Ｔアッセイは以下に示す如く行っ
た。

純化したＤＮＡ（２５μｇ）を制限酵素肛回皿により開
裂しフェノールで３回、フェノール−クロロホルムおよ
びクロロホルムで各々処理し、エタノールで沈澱させ８
０％エタノールで洗浄し、８０％ホルムアミド４０ｍ１
にン容解した。

反応液を変性させるため９０’Ｃで５分間加熱後１０　
Ｘ５ＳＣ（１，５Ｍ　ＮａＣｊ！、０．１５Ｍ　　クエ
ン酸ソーダ）で１．３滅に希釈した。その後、本ＤＮＡ
をニトロセルロース濾紙上に固定し、これを８０°Ｃで
３時間乾燥させ、５０％ホルムアミド、２０ｍＭ　Ｐｉ
ｐｅｓ（ｐＨ６，５）、０．７５　Ｍ　Ｍａｃｅ、　５
ｍＭ　ＥＤＴ＾、０．２％ＳＤＳ及びＪ−１１１細胞由
来のｐｏｌｙ　（＾）　ｍＲＮＡ２５０Ｍｇを含む溶液
中で３７°Ｃ１１８時間インキュベートし、濾紙上に固
定されたＤＮＡとＩＬ−２ｍＲＮＡをハイブリダイズし
た。

次にその濾紙を６５゛Ｃで３回ｐＨ６，５の１０ｍＭＰ
ｉｐｅｓ、　０．１５　Ｍ　ＮａＣ１溶液、１ｍＭ　Ｐ
ｉｐｅｓ、　　１０ｍＭＮａｃｊ！溶液で洗浄し０．５
　ｍＭ　ＩＥＤＴＡ、　Ｏ，１％ＳＤＳ溶液で９５°Ｃ
，１分間処理し濾紙からバイブ°リダイズしたｍＲＮＡ
を回収した。

このようにして抽出したｍＲＮＡを常法に従ってオリゴ
ｄＴ−セルロースカラム上で精製し、アフリカッメガエ
ル卵母細胞へ注入し、翻訳された蛋白のＩＬ−２活性を
測定した。

各々２４クローンからなる１８グループのうちの１グル
ープが前述の’Ｈ−ＴｄＲ取込みによるアッセイで４８
単位／　ｍｌのＩＬ−２活性陽性を示した。

一方他のグループは明らかに陰性であった。

次に、陽性のグループに属する２４の各単一コロニーを
既述と同じ組成のし培地２００−へ接種し、３７°Ｃで
５〜７時間好気的に培養し、同様にクロラムフェニコー
ル含有のし培地をさらに添加した。

一晩培養して、プラスミドＤＮＡを増強後、プラスミド
ＤＮＡを同様に標準法に従って精製した。…皿ｉで各プ
ラスミドＤＮＡ約５μｇを開裂後、各プラスミドを同様
にニトロセルロース濾紙へ固定した。

その濾紙をＩＬ−２ｍＲＮ八とハイブリダイズし、ハイ
ブリダイズしたｍＲＮＡをアフリカッメガエル卵母細胞
へ注入し、翻訳された蛋白のＩシー２活性を測定するた
め回収した。

表２に示す如く、ｐ３−ｔｓと表示した単一コロニーか
ら精製されたプラスミドＤＮＡのみが陽性のＴＬ２活性
を示した。それ故、本クローンがＩＬ−２ｃＤＮＡを有
するクローン（旦、ｃｏｌｉ　　Ｚ　　１７７６／ｐ３
　１６八Ｊ１１９９５　（ＰＥＲＭ−ＢＰ−２２５））
と同定された。このようにプラスミドＤＮＡ、　ｐ３−
ｔｓはＩＬ−２ｍＲＮＡと特異的ハイブリッドを形成す
る能力のあるＤＮ＾（ＩＬ−２遺伝子）を確かに有して
いる事が確認された。

表２ （ａ） ｍＲＮ＾の翻訳 生成物 ×　　２ ×３２ ２０．４５３ ２０．９６１ （ｂ） ｓ＋ＲＮＡ”の翻訳 ×　　２ 生成物 ×３２ ＊　プラスミドρ３−１６からのｃＤＮＡとハイブリダ
イズしたｎｌ？Ｎ八 プラスミドｐａ−１６のｃＤＮＡインサートは制限酵素
Ｘｂａ　　Ｉにより１部位で、又Ｂｓｔ　ＮＩにより２
部位（Ｘｂａ　　Ｉ開裂部位の上流及び下流）で切断さ
れるという特徴を示した。しかしながら、プラスミドｐ
３−１６は約６５０塩基対より構成されるｃＤＮＡイン
サートを含んでおり、これは明らかに１１〜１２Ｓの大
きさのＩＬ−２ｍＲＮＡの一部分に相当するものである
。それ故、他のｃＤＮＡライブラリーを、鋳型としてＩ
Ｌ−２ｍＲＮＡを用い、Ｌａｎｄ等の方法（Ｌａｎｄｅ
ｔ　ａｌ。Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　
ｖｏｌ　９．　ｐ２５５１．（１９８１））に従って作
製した。−本積ｃＤＮＡ（１，６μｇ）を、ｄＣＭＰ残
基を付加したＩＬ−２ｍＲＮ八４μへを用いて合成し、
そしてｄｓ−ｃＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌ
ｅｎｏ−断片）によりプライマーとしてオリゴ（ｄＧ）
１２’＝　１８を用いる事により合成した。６８０塩基
対ＤＮＡサイズマーカー（ｓｉｚｅ　ｍａｒｋｅｒ）よ
り長いｃＤＮＡ（０，６μｇ）は蔗糖密度勾配遠心法に
よって得られ、標準的なＧＣティリング法によりｐｎＲ
３２２のＰｓｔ　１部位へ挿入出来た。

組換えＤＮＡ体によるエシェリヒア・コリ　χ１７７６
の形質転換後、その場所でプローブとしてニック翻訳さ
れた（ｎｉｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）ｐ３−１６　
ｃＤＮＡインサートを用いたＧｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏ
ｇｎｅｓｓのハイブリダイゼーション法により約２００
０コロニーを選別し、およそ８５０塩基対を含むプラス
ミドｐｌＬ　２−５ＯＡを含有するコロニー及び形質転
換されたクローン（エシェリヒア・コリ　χ１７７６／
ρＩＬ　２−５０４、八Ｊ１１９９６（ＦＥＲＭ−ＢＰ
−２２６））を同定した。ｐｌＬ２−５０へのｃＤＮ＾
インサートの制限酵素切断図を第１図に示した。

形質転換されたエシェリヒア・コリ　χ１７７６／ｐｌ
Ｌ２−５ＯＡからのＩＬ−２ペプタイドをコードしてい
る遺伝子を単離するため、プラスミドＤＮＡを通常法に
従い、菌体からＤＮＡを単離後制限酵素Ｐｓｔ　１によ
り切断した。この処理により生成する２つのＤＮＡ断片
のうちより小さな断片はＩＬ−２ペプタイドをコードし
ているＤＮＡ遺伝子であった。ｐｌＬ２−５ＯＡからの
ＰｓＬ　　Ｉインサートの完全なヌクレオチド配列はＭ
ａｘａｒａａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔの方法（Ｍａｘａｍ
、八、　Ｗ、　ｅｔａｔ、、　Ｅｎｚｙｍ、　６５．、
４９９−５６０．１９８０）により決定した。全構造を
第２図（ａ）に示す。

実施例２ 実施例１に記載された方法に従ってジュルカット細胞か
らクローン化された構成的ＩＬ−２産住細胞株Ｊ−Ａ　
１８８６　（ＡＴＣＣＣＲＬ　８１３０）は同様にロー
ラー培養ボトルで生育した。生育した細胞は初期細胞密
度ｌＸｌ０’個／ｄで新鮮な合成培地ＲＩＴＣ−５５−
９に再懸濁し、培養開始８時間後に、実施例１で詳細に
示したステップに従って３Ｘ１０９個の細胞から１１〜
１２Ｓ分画としてのＩＬ−２１ｌｌＲＮＡ抽出のために
使用された。

ｄｓ　−ｃＤＮＡは実施例１と同様に合成され、６００
塩基対より長いｃＤＮＡ（２，４μｇ）が蔗糖密度勾配
遠心法による分画により得られた。次にこのｃＤＮＡを
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
を用い、ｄＣＭＰ残基で伸長し、その５０ｎｇがｄＧＭ
Ｐで伸長したＰｓｔ　　Ｉ切断ｐＢＲ３２２２５０ｎｇ
とアニールされた。

生成したハイブリッドプラスミドはエシェリヒア・コリ
　χ１７７６に形質転換され、約４．０００クローンの
トランスホーマントが得られた。

Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓの方法に従い、プ
ローブとして用いたプラスミド３−１６　ｃＤＮＡと相
補的な３個のクローンが選択された。すなわち、このよ
うにして選択された形質転換されたクローンはヒトＩＬ
２遺伝子を有するクローンである。

実施例３ エシェリヒア・コリ細胞でヒトＩＬ−２の合成を指令す
るプラスミドを以下の如き方法で構築した。

プラスミドｐＴＩＬ２−２２は第４（ａ）図で図解され
ている如く、一連の改変の方法によりｐＴｒＳ−３（Ｎ
ｉｓｈｉ　Ｔ、。

Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　Ｔ、　ｅＬ　ａｌ、、　５ＥＩＫ
ＡＧＡＫＵ　５３．９６７、　（１９８１）。

同５４．６７６（１９８２））及びＩＬ−２ｃＤＮＡを
含むｐｌＬ２−５０八から構築した。プラスミドｐＴｒ
Ｓ−３はＴｒｐプロモーターとｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ
１部位とＣ１ａ　　１部位の間に５ｈｉｎｅ　Ｄａｌｇ
ａｒｎｏ　（以後ＳＤと略号する）の領域の挿入を含む
。

本プラスミドはまた第３図で示した如く、単一のＳｐｈ
　　１部位と同様にＳＤ配列の下流１３ｂｐにＡＴＧイ
ニシェーションコードンを含んでいる。

言及している蛋白に対応するＤＮＡ配列がＡＴＧコード
ンの丁度下流の部位に挿入されるとそのベクターはこの
蛋白を生産するには非常に効果的である。

このＡＴＧコードンはｐＴｒＳ−３のＳＰ！ｉｌ消化に
引続きＴ４　ＤＮＡポリメラーゼによる処理によって生
成される。それ故プラスミドｐＴｒＳ−３（３０μｇ）
は制限酵素４ｒで、常法により切断され、引続きフェノ
ール、クロロホルム処理、エタノール沈澱法により回収
され両末端が７４　ＤＮＡポリメラーゼ処理によりフラ
ッシュにされた。

次に、同様の方法によりフェノール、クロロホルム処理
及びエタノール沈澱法によりＤＮＡ（２１，４μｇ）を
回収シｆ、−０他方ＩＬ　　２　ｃＤＮＡを含むｐｉＬ
２−５０Ａ３８０μｇはＰｓｔ　Ｉにより切断され、Ｉ
Ｌ−２ｃＤＮＡインサートはアガロースゲル電気泳動に
より単離された。ｃＤＮＡインサート（ｌｌｕｇ）はＨ
ＬｉＡＩにより切断され、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼに
よって処理され、大きい方の部分のＤＮＡｌ０μｇがア
ガロースゲル電気泳動により単離された。不法に従って
１３２個のアミノ酸をコードするｃＤＮＡ　（７，２μ
ｇ）が得られ、このＤＮＡ断片はプラントエンドを有し
ていた（第４（ａ）図）。

次に、このようにして得られたｃＤＮＡ断片をＡＴＧ配
列の丁度下流で、前もって力刈１により消化されたＴ４
　ＤＮＡポリメラーゼにより処理されたｐＴｒＳ−３ベ
クターへ連結した。このように連結したプラスミドはそ
れから、常法に従いエシェリヒア・コリＨＢ　１０１へ
形質転換された。この連結は次のようにして行った。Ｉ
Ｌ　−２ｃＤＮＡ（０，４ａ　ｇ　）の前述の大きい方
の断片およびｐＴｒＳ−３ベクターＤＮＡ　０．２μｇ
を６．６ｍＭ　ＭｇＣｆｆ１ｚ、１ｍＭ＾ＴＰおよびｌ
　ＯｍＭ　ＤＴＴを含むｐＨ７，５の６６ｍＭ）リス−
塩酸中でＴ４　ＤＮＡリガーゼ０．８単位と共に混合し
、混合物を４°Ｃ３−晩反応させた。アンピシリンを含
むし培地寒天プレート上に出現するトランスホーマント
の中で、１３２個のアミノ酸をコードしているＩＬ−２
ｃＤＮＡ部分を含むプラスミドを持つコロニーをその場
でコロニーハイブリダイゼーションアッセイ法により選
択した。こうして選択したコロニーを再び培養（１０ｍ
ｆ）し、リヅチーム処理および凍結。

融解による処理によりプラスミドＤＮＡを調製した。

このプラスミドＤＮＡをＰｓｔ　　ＩとＸｂａ　　Ｉで
切断し、その結果の生成物をアガロースゲル電気泳動に
より分析し、ｃＤＮＡがｐＴｒＳ−３のＡＴＧ配列の後
に正しい方向で凍結しているｐＴＩＬ−２−２２を同定
した。

ｐＴＩＬ−２−２２を含むエシェリヒア・コリＨＢ　１
０１を微生物の増殖のために知られている通常法の下に
培養した。細胞は２５μｇ／ｌｅｌストレプトマイシン
および２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むχ培地（２
，５％バタトトリプトン、１％酵母エキス、０．１％グ
ルコース、　　２０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、５０ｍＭ　トリ
ス−塩酸、　ｐＨ７，５）　ｌ　ＯＩＩ中で３７°Ｃで
一晩生育させた。ついで培養懸濁液１　ｍｌを同じχ培
地（１００ａ＋ｆｆ１）へ接種し、３７°Ｃで培養した
。

６５０ｍｕの０．０．がおよそ１．５−２．０に達した
時点で３−インドールアクリル酸（ＩＡ八）を加えた。

インデューサーの添加３時間後に、細胞を集め、２０ｍ
Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７，５、３０ｍＭ　ＮａＣｆｆ１
を含む）で洗浄し、同じ緩衝液Ｂ　ｒｍｌ中に再び懸濁
した。

Ｔｒｐプロモーターの効果的な機能発現のために、１面
の如きインデューサーを最終濃度５０μｇ／ｍｌになる
ように添加した。かくして細菌細胞中に産生される蛋白
をソニック処理（０°Ｃ，２分間）またはりゾチーム（
８μｇ）消化（０°Ｃｌ２Ｏ分）に引き続き凍結融解を
３回行う事により抽出した。

この方法により、−船釣にＩＬ−２は細胞から抽出され
た。抽出されたＩＬ−２活性は１０，０００から１２０
．０００単位／ｍｊ２の範囲であった。

ｐＴＩＬ２−２２を含むエシェリヒア・コリＨＢ　１０
１（ＡＪ１２００９）はＦＩＲＭ−ＢＰ２４５として寄
託されている。

実施例４ ＩＬ−２ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＴｕｌＬ２−２
２はｐＴｕＢＩＰ−５（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　　Ｔ、
　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｓｅｉｋａｇａｋｕ、　　５
３＋９６６、１９８１）および実施例３に示したｐＴＩ
Ｌ２−２２から第６図に図解した方法により構築された
。プラスミドｐＴｕＢＩＰ−５はｐＢＲ３２２中にｔｕ
ｆＢのプロモーター配列が挿入されている。このプラス
ミドはまた単一のＣ１ａ　　１部位を含んでおり、これ
は第６図に示した如くＳＤ配列の２ｂｐ下流に位置して
いる。ｐＴｒＳ−３もまたＳＤ配列とＡＴＧイニシェー
ションコードンの間にり１１部位を含んでおり、このり
」　■部位は実施例３に記載した如くｐＴｒＳ−３およ
びＩＬ−２ｃＤＮＡを用いる事による発現プラスミド構
築中に破壊されないことから、Ｔｒｐプロモーターをｔ
ｕｆＢプロモーターに置き換える事はきわめて簡単であ
り、その結果ＩＬ、−２ｃＤＮＡはｔｕｆＢプロモータ
ーの制御下で発現される。

それ故、プラスミドｐＴＩＬ２−２２　（３０μｇ）は
制限酵素Ｃ１ａ　　ＩとＰｖｕ　ＩＩにより通常の方法
で切断された。ＩＬ−２ｃＤＮＡを含む断片（約２．２
　ｋｂ）はアガロースゲル電気泳動により単離精製され
、３μｇのＤＮＡが回収された。他方、ｐＴｕＢＩＰ−
５ベクタ一２０μｇが同様にＣ１ａ　　ＩとＰｖｕ　Ｉ
ｆにより切断され、アンピシリン耐性遺伝子を含む大き
い方の断片（約３．４　ｋｂ）がアガロースゲル電気泳
動により単離精製され、ＤＮＡ　３．５μｇが回収され
た。

次にこのようにして得られた２個の断片は１つはｔｕｆ
Ｂプロモーターを含み（約３．４ｋｂ）、他方はＩｆ、
−２ｃＤＮＡを含んでおり（約２．２　ｋｂ）以下に示
す如く連結した。

ＩＬ　−２ｃＤＮＡ（１，２ｔｉ　ｇ　）を含む断片お
よびｔｕｆＢプロモーターを含む断片０．３　ｕ　ｇを
６．６　ｍＭ　ＭｇＣｆ　ｔ　。

１　ｍＭ　ＡＴＰおよび１０ｍＭ　ＤＴＴを含むｐＨ７
，５の６６ｍＭトリス−塩酸中で、Ｔ４　ＤＮＡリガー
ゼ０．８単位と混合し、４°Ｃで一晩反応した。次にこ
のようにして連結したプラスミドは常法に従いエシェリ
ヒア・コリＨＢ　１０１へ形質転換された。

アンピシリンを含むし培地寒天プレート上に出現するト
ランスホーマントの中で第６図のｐＴｕＴＬ２−２２の
如＜　ＴＬ　−２ｃＤＮＡ部分を含む組み換え体ＤＮＡ
を持つ８個のコロニーが選択され、プラスミドＤＮＡは
実施例３に記載された如く調製された。

ｐＴｕｌＬ２−２２を含むエシェリヒア・コリＩＩＢ　
１０１を３７°ＣでＬ培地（１００ｍｆｆｉ）中で培養
した。

６５０ｒｒｚｚの０．０、がおよそ０．５−１．０に達
した時、菌体を集め、３０ｍＭ　ＮａＣ１を含む２０ｍ
Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７，５”）で洗浄し、同じ緩衝液
２　ｍｌ中に再び懸濁した。このようにして産生じた蛋
白は実施例３と同様に抽出された。抽出液中のＩＬ−２
活性は６，０００から５６，０００単位／ｍｌの範囲で
あった。

ｐＴｕｌＬ２−２２を含む・エシェリヒア・コリ　ＨＢ
　ＩＯＨ八Ｊへ２０１０）はＦＩ：ＲＭ−ＢＰ　２４６
として寄託されている。

実施例５ ＩＬ−２ｃＤＮＡを存するプラスミドｐＧＩＬ２−２２
はｐＧＬｌｏｌ（Ｒｏｂｅｒｔｓ、　　Ｔ、　　Ｍ、　
　ａｎｄ　　Ｌａｕｃｅｒ　　Ｇ、　　ロ、、　　Ｍｅ
ｔｈ　　Ｅｎｚｙｍ、＋６８、４７３−４８３．（１９
７９）、Ｇａ１ｔ　Ｌａｕｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、
　Ｍｏｌ。

Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、、　１．　Ｎｏ、　２．１３
９〜１４７（１９８１）、　Ｔ。

Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、Δｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

７７、　ＮＧ、　９．５２３０〜５２３３（Ｌ９８０）
、ＥＢｏｎ　Ａｍａｎｎ、　ｅｔ　ａｔ。

Ｇｅｎｅ、　２５．１６７〜１７８（１９８３））と実
施例３に示されたｐＴＩＬ２−２２とから構築された。

すなわち、慝プロモーターを含むプラスミドｐＧＬ　ｌ
ＯＨ２０ａｇ）が制限酵素ハｒｕ　ＩＩで常法により切
断され、引続きフェノール、クロロホルム処理およびエ
タノール沈澱法により１７μｇのＤＮＡが回収された。

他方、ｐＴＩＬ２−２２　（７５ａｇ）の方はＣ１ａ　
　Ｉおよび影１１で切断し、アガロースゲル電気泳動に
よりＩＬ−２ｃＤＮΔが含むＤＮ＾断片２．２μｇを回
収した。この断片はＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウ断
片）で処理する事によりフラッシュにされた。次にこの
ようにして得られた２個の断片（０゜２５μｇおよび０
．６６μｇ）を実施例４と同じ方法でＴ４　ＤＮＡリガ
ーゼ１．０単位でもって連結した。かくしてこの連結し
たプラスミドは常法に従いエシェリヒア・コリＨＢ　１
０１に形質転換された。トランスホーマントの中で、Ｉ
Ｌ−２ｃＤＮＡを含むＣ１ａ　　Ｉ　−３ａｌ　　Ｉ断
片の挿入を有するトランスホーマン）３！ｐラベルした
ＴＬ−２ｃＤＮＡをプローブとして選択した。次にこれ
等のトランスホーマントを、アンピシリン２５μｇ／ｍ
ｅを含む１０ｍ１のχ培地中で培養し、実施例３で記載
した方法によりプラスミドＤＮＡを調製した。かくして
迅プロモーターの丁度下流にＩＬ２ｃＤＮ＾の開始配列
ＡＴＧを有するプラスミドＤＮＡはＰｓｔ　　Ｉおよび
Ｘｂａ　　Ｉでの切断部位を検定する事により得られた
。このようにして得られたｐｃｌＬ２−２２を含むエシ
ェリヒア・コリＨＢ　１０１は２５ａｇ／ｍｊ２アンピ
シリンおよび２５ａｇ７ｍｌストレプトマイシンを含有
するし培地１００ｍＡに接種し培養した。

６５０ｍμの０．Ｄ、が約０．５に達した時イソプロピ
ルーβ−Ｄ−チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を
１ｍＭの濃度で加え、１時間後に菌体を集め、実施例４
に記載した方法に従って菌体抽出液を調製した。抽出液
のＩＬ−２’活性は６．０００からｇｏ、ｏｏｏ単位／
ｌ１ｌｊ２の範囲であった。

ｐＧＩＬ２−２２を含むエシェリヒア・コリＩＩＢ　１
０１（ＡＪ１２０１１）はＦＩｌｉＲＭ−ＢＰ　２４７
として寄託されている。

実施例６ プラスミドｐＴｒＳ−３（１０ａｇ）を先ず制限酵素Ｓ
ａｌ　　ｆで切断しＳａｔ　　１部位をＤＮＡポリメラ
ーゼ（フレノウ断片）あるいはＴ４　ＯＮへポリメラー
ゼ処理によりフラッシュ（ｆｌｕｓｈ）にした。

Ｃ１ａ　　Ｉで切断後、Ｔｒｐプロモーター領域を有す
る大きい方の断片を常法に従ってアガロースゲル電気泳
動により単離精製し、ＤＮ＾３μｇを回収した。

他方、ｐＩＬ２−５ＯＡの加　Ｉ切断により得られるｃ
ＤＮＡインサー１−１１ａｇがＨＬｉ　Ａ　Ｔで切断さ
れ、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ処理され、大きい方の断
片がアガロースゲル電気泳動により単離、精製された。

このようにしてＩＬ−２の１３２個のアミノ酸をコード
するｃＤＮＡ断片が７．２μｇ得られた。次に、ｔｒＰ
プロモーター（上記）を含む断片０．４５μｇ。

ＩＬ−２ｃＤＮＡを含む）ＩｇｉＡＩ−Ｐｓｔ　Ｉ断片
０．５ａｇおよび合成オリゴヌクレオチド（５’　）Ｃ
ＧＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＧＣＡ（３゛）と（３’）ＴＡ
ＴＴＣＧＡＴＡＣＣＧＴ（５’）（各々２０　ｐｍｏｌ
ｅ）は両方とも５°末端でリン酸化されているが、これ
等を実施例３に記載されている方法と同し方法でＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ１単位で連結した（第４図（ｂ））。この
ように連結されたプラスミドはエシェリヒア・コリ１１
８１０１に形質転換された。出現したトランスホーマン
トの中で、目標とするトランスホーマントは次のように
して選択した。まず最初に、ＩＬ−２ｃＤＮＡおよび合
成オリゴヌクレオチドの両方とハイブリダイズ可能なト
ランスホーマントがコロニーハイブリダイゼーション法
により選択された。次に、ＡＴＧＧＣＡ配列の丁度下流
に第２図（ａ）の１１１から１１３の位置のＣＴＴ配列
から始まるＤＮＡ断片（ＣＣＴＡＣＴ・・・・・・・・
・）が挿入されているプラスミドＤＮＡを持ったトラン
スホーマントをＰｓｔ　　Ｉ　、Ｘｂａ　Ｔ切断個所を
検定することにより選択した。

ｐＴＩＬ２−２１ａまたはｐＴＩＬ２−２１ｂを含む上
記のトランスホーマントを実施例３に示す方法によりＬ
培地中で培養し、そして実施例３に示す方法により分析
した時トランスホーマントの菌体抽出物には高いＩＬ−
２活性が認められた。ｐＴｒＬ２−２１ａを有するエシ
ェリヒア・コリ　ＨＢ　１０１（ＡＪ　１２０１３）お
よびｐＴＩＬ２−２１ｂを有するエシェリヒア・コリ（
ＡＪ　１２０１４）を有するエシェリヒア・コリ　ＨＢ
　１０１はそれぞれＦＥＲＭ−ＢＰ　２４８．ＦＥＲＭ
−ＢＰ　２４９　として寄託されている。

上記の実施例で用いられた宿主、エシェリヒア・コリ　
ｚ　１７７６およびＨＢ　１０１（Ｂｏｙｅｒ　Ｉｌ、
　Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４Ｌ　４５９．　（１９
６９））は公知であり、容易に人手可能である。更につ
け加えれば、トランスホーマント中の組換えＤＮＡ体を
遊離させるためにＬ培地で３７°Ｃでトランスホーマン
トを培養し、テトラサイタリンおよびアンピシリンに感
受性となった菌体を分離すれば寄託したトランスホーマ
ントから宿主は容易に得られる。

プラスミドベクターｐＢＲ３２２（例えばベセスダリサ
ーチラボラトリーから購入可能）　、　ｐＣＥ−１，ｐ
ＴｒＳ−３およびｐａｔ、　１０１は公知であり容易に
入手可能である。更に、常法によりトランスホーマント
中の組換え体プラスミドを分離することによってさらに
それぞれの実施例での説明から当然に明らかな如くプラ
スミドベクターを分離することによって寄託されたトラ
ンスホーマントからプラスミドベクターを得る事が出来
る。ｐＴｒＳ−３およびｐＴｕＢＩＰ−５はそれぞれエ
シェリヒア・コリＦＥＲＭ−Ｐ６７３５（ＢＰ　３２８
）およびエシェリヒア・コリ　＾ＴＣＣ３１８７ｔとし
て寄託されている。

【図面の簡単な説明】

第１図はＩＬ−２活性を有するポリペプチドをコードし
たクローン化遺伝子の制限酵素エンドズクレアーゼによ
る切断マツプを示し、第２図（ａ）はクローン化遺伝子
の塩基配列を示し、第２図（ｂ）はＩＬ−２活性を有す
るポリペプチドのアミノ酸配列１．　１１および■を示
す。 第３図はプラスミドベクターｐＴｒＳ−３を示す。 第４図（ａ）、第４図（ｂ）および第４図（ｃ）はベク
ターとしてｐＴｒＳ−３を使用している組換えＤＮＡ５
（ｐＴＩＬ２−２２．　ｐＴＩＬ２−２１．　ｐＴＩＬ
２−１４およびｐＴＩＬ２−１５）の構成を示すフロー
チャートである。第５図はベクターとしてρＫＴ　２１
８を使用している組換えＤＮＡ　（ｐＫｆＬ２−２１）
の構成を示すフローチャートである。第６図はベクター
としてｐＴＵＢＩＰ−５を使用している組換えＤＮＡ（
ｐＴｕｌＬ２−２２）の構成を示すフローチャートであ
る。 図中、１ｌＡＺｌｌｃ”、“Ｃ″および“Ｔ″はデオキ
シアデニル酸、デオキシグアニル酸、デオキシシチジル
Ｍおよびチミジル酸をそれぞれ表わす。 特許出願人　財団法人　癌　研　究　会！巳 δ詳 ご乏。 Ｇば ＬＩＬＪ、コ ｇ（Ｊ＠Ｈ− 北　　３ ３ミ、ｅ ｕ２ ；乏　　３ Ｉ　　； りご′　ご 漏≦　　３ ！し りく　。ク コし ？：＝ ；已 Ｚ　　　コ　　　−　　　：Ｉ　　　−コ　　　−　　
　コｖ＋　　　　ｏｒ　　　　Ｊ：　　　　ａ＋　　　
　ａＩＷ　　　　Ａ　　　　＠１く　　−←　　−ψ　
　−ト　　− コ　　　絢 ＜　　　Ｑ ト 区 ＼ｉ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトインターロイキン２活性をもつ、次のアミノ
   酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子。 【遺伝子配列があります】
2. （２）次の塩基配列を有する特許請求の範囲第１項記載
   の遺伝子。 【遺伝子配列があります】