FI87802C - Foerfarande foer produktion av polypeptider som visar en flerlinjig daeggdjurscellers vaextfaktoraktivitet och nukleinsyrasekvens daerav - Google Patents

Description

1 87802

Menetelmä tuottaa polypeptidiä jolla on moni 1i n joi non nisäkässolun kasvutekijäaktiivisuus ja polypeptidin koodaava nuk1 eiinihapposek-venssi - Förfarande för produktion av polypeptider som visar en flerlinjig däggdjurscellers växtfaktoraktivitet och nukleinsyra-sekvens därav Tämän keksinnön kohteena on yleisesti sanoen rekombinantti-DNA-teknologian soveltaminen nisäkkään immuunireaktion säätelymekanismin selvittämiseen. Tarkemmin sanoen sen kohteena on menetelmä tuottaa polypeptidejä, joilla on monilinjainen solun kasvutekijäaktiivisuus ja/tai syöttösolun kasvuntekijä-aktiivisuus, koodaavien deoksiribonukleiinihappo (DNA)-kloonien eristäminen sekä tässä menetelmässä käytetty nukleiinihappo-sekvenssi.

Rekombinantti-DNA-teknologia tarkoittaa yleisesti tekniikkaa, jossa donorilähteestä saatu geneettinen informaatio yhdistetään vektoreihin, jotka sen jälkeen prosessoidaan isäntäeliöön, esimerkiksi viemällä siihen, jolloin siirretty geneettinen informaatio kopioituu ja/tai ekspressoituu uudessa ympäristössä. Geneettinen informaatio on yleensä lähetti-RNA:sta (mRNA) saatuna komplementtisena DNA:na (cDNA), joka koodaa haluttua proteiinituotetta. Kantaja on usein plasmidi, joka kykenee yhdistämään cDNA:n isäntäeliöön myöhempää replikaa-tiota varten ja eräissä tapauksissa myös säätelemään cDNA:n ekspressiota ja näin suoraan koodatun tuotteen synteesin i santäeliössä.

Tämä teknologia on edennyt viime vuosina äärimmäisen nopeasti, ·.·. ja monia erilaisia eksogeenisiä proteiineja on ekspressoitu monissa erilaisissa isäntäeliöissä. Seuraavassa on esimerkkinä : eräitä näin tuotettuja eukaryoottisia proteiineja: proinsuliini (Naber, S. et ai., Gene 21 : 95-104/1 983/); interferonit (Simon, L. et ai. , Proc. Nat Acad Sei. U.S.A., 80: 2059-2062/1983/ ja Dernynck, R. et ai♦, Nucl. Acids Res.

*·;·’ 1 : 1 819-1837 /1 983/; ja kasvuhormoni (Goeddel, D. , et ai. , *:**: Nature 281: 544-548/1979/). (Näiden julkaisujen • · 2 87802 ja muun referoidun aineiston tarkoituksena on antaa Iisaa yksityiskohtia kyseisen alan taustasta ja erikoistapauksissa keksinnön toteuttamisesta. Nämä julkaisut ja aineistot on tässä yhteydessä annettu viitemateriaalina.)

Jonkin aikaa on pidetty dogmina, että nisäkkään immuunireaktio johtui pääasiassa joukosta monimutkaisia solujen vuorovaikutuksia, nk. "immuuniverkostosta" . Vaikkakin edelleen on selvää, että suuri osa reaktiosta todella johtuu lymfosyyttien, makro faagien , granulosyytLien ja muiden solujen verkostomaisista vuorovaikutuksista, immunologit ovat yleisesti nykyään sitä mieltä, että liukoisilla proteiinein,, (esimerkiksi nk. 1 yml okiinei1 la ) on kriittinen rooli näiden solujen vuorovaikutusten säätelyssä.

Lymfokiinit ilmeisestikin välittävät so 1uak11ivisunksιa monella eri Lavalla. Niiden on osoitettu kykenevän Lukemaan erilaisten lymfosyyttien lisääntymistä ja kasvua ja itse asiassa niillä uskotaan olevan ratkaiseva osuus monipoten-tiaalisten hematopoieettisten kantasolujen perusdif'fercn-tioitumisessa valtavaksi joukoksi erilaisten solulinjojen edeltäjiä, jotka ovat syynä immuunireaktioon, iässä reaktiossa tärkeisiin solui in joihin kuuluu kaksi lymfosyyttiluokkua: 1-solut, jotka voivat tuottaa ja erittää immuno g lubu 1 ι ι ne j a (proteiineja, jotka kykenevät tunnistamaan vieraan aineksen * · · ja sitoutumaan siihen ja näin poistamaan sen), ja I-solul ··· (eri aliryhmiin kuuluvia), jotka indusoivat tai supressoiva l U-soluju ja eräitä muita immuun i ve r kos t on muodostavia soluja (mukaanlukien muita I-soluja).

... loinen tärkeä solulinju on sy o L L o so 1 u - t unia I t ι non sidekudos- solu, joka sijaitsee lähellä kapillaareja kaikkialla kellossa, "· erityisen suurina ko n se n tr autioin a keuhkoissa, itiöllä ! t ja ruoansulatuskanavassa ja sukup no 1 ι - v ι r l. sa-k ana v a ssa .

....; Syöt Lösolu i l i a on keskeinen osuus ui lergiama isisaa taudeissa, ... erityisesti anafylak vasaa, tämä osuus voidaan lyhyesti • · · , 87302 erityiset immunoglobuliinit, jotka ovat sitoutuneet syöttö-solun pinnalla oleviin reseptoreihin, syöttösolu poistaa tumansa ja vapauttaa väliteaineet (esimerkiksi histamiini, serotoniini, hepariini, kiniinit jne.), jotka aiheuttavat allergiareaktioita, esimerkiksi ana fylakseja.

Tutkimusta, jonka avulla on yritetty paremmin ymmärtää (ja siten mahdollisesti hoitaa terapeuttisesti) allergiaa, anafylaksiaa ja muita immuunitauteja tutkimalla immuuni-reaktioon liittyviä syöttösoluja, T-soluja ja muita soluja, on estänyt se, että yleisesti ei ole kyetty ylläpitämään näitä soluja in vitro. Useat immunologit ovat kuitenkin äskettäin havainneet, että tällaisia soluja voitaisiin eristää ja viljellä kasvattamalla niitä muista soluista saaduilla eritteillä, esimerkiksi käsitellyillä alustoilla, jotka on saatu konkanavaliini Ailia (ConA) stimuloiduista pernan lymfosyyteistä. Tästä työstä on nyt tullut ilmeiseksi, että solukloonien muodostuminen riippuu spesifisistä tekijöistä, kuten lymfokiineista.

Ilmeisestikin kaikkia veren solutyyppejä muodostuu koko ajan aikuisen selkärankaisen luuytimessä hematopoieettisten edel-··· täjäsolujen hierarkian kasvun ja erikoistumisen kautta.

IM» • j. Tämän hierarkian huipussa on monipotentiaa 1 inen kantasolu , joka voi varustaa kuolettavasti säteilytetyn eläimen uudelleen • · · • · suurimmalla osalla, jos ei kaikillakin, immunologisia • · solutyyppejä (esimerkiksi punasolut, verihiutaleet, lymfo-syytit, erilaiset qranulosy y t i t ja monosyy tit/makrofaagit ) .

• · · *·*·’ Tällä monipotentiaalisella solulla ei ole vain kyky regeneroida monipotentiaa 1is ten kantasolujen kammiot (itueuudir- • a ·.*·: tiimi nen), vaan myös muodostaa edel Lä jäso J uja , jotka tulevat « · a : kehittymään pitkin jotakin tiettyä linjaa. Jonkin tietyn tehtävöityneen kantasolun jälkeläisillä näyttää olevan • a » S··, sama solutehtävä kuin emäsolulla (Metcalf. D., "Hemopoietic « a *1* Colonies", Springer Publishing Co., New York, N,Y, /1977/)· e a a aa a • *.· Hematopoieesin in vitro tutkimukset ovat osoittaneet, että 4 87802 i monet liukoiset pesäkkeitä stimuloivat tekijät (CSF) voivat säädellä näiden erilaisten edeltäsolujen kasvua. Eräät näistä tekijöistä on osittain puhdistettu ja niiden on osoitettu vaikuttavan spesifisesti kyseiseen solulinjaan kuuluviin kantasoluihin. Esimerkiksi erytropoietiini stimuloi erytroidi-hie rarkian enemmän erikoistuneita jäseniä (Miyake, T., et ai. , J. Biol. Chem. 252: 5558 /1977/), ja eräs toinen tekijä (pesäkkeitä stimuloiva tekijä-makrofaagi eli CSF-1) stimuloi ensisijaisesti makrofaagin kasvua luuydinsolujen puo1ikiinteissä viljelmissä (Stanley, E., ja Heard, P., J. Biol. Chem. 252j_ 4305 /1977/). Vielä eräs toisen tyyppinen kasvutekijä näyttää kykenevän stimuloimaan hematopoieettisia pesäkkeitä, jotka muodostuvat yksistä ainoista solutyypeistä ja solujen seoksista. Niiden solujen erilaisuus, esimerkiksi erytrosyytit, megakaryosyytit, granulosyytit, syöttösolut ja monosyytti/makrofaagit, jotka reagoivat yhdelle toisen tyyppiselle tekijälle, ovat antaneet sille nimeksi moni Iinjäinen solun kasvutekijä (multi-CSF) (Iscove, N. et ai., J. Cell. PhysioL. Suppl., 1: 65-78 /1982/). Nimi osoittaa sen kykyä vaikuttaa moniin tehtävöityne isiin ede11äjäsoluihin ja mahdol1isesLi myös monipotentiaalisiin kantasoluihin.

*

Yksi paremmin karakterisoiduista tekijöistä on in t e r leuk i in i-1 '*** (IL-1), makrofaageista vapautunut tekijä, joka indusoi

III

*·*;* tymosyyttien ja peri f eraal isten T-solujen rep 1 i ko i t umisen : (Mizel, S. et ai . , J. Immunol. 120: 1497-1503 /1978/).

...: Interleukiini-2 (IL — 2 ) ja in t e r le uk i in i - 3 (I L — 3 ) ovat ·.·.· samoin kaksi paljon tutkittua lymfokiinia, jotka tietyt stimuloidut lymfosyytit vapauttavat. Erittäin merkittävä ;*·,· IL-2-tekijän ominaisuus on sen kyky lukea tiettyjen [-solujen • ♦ .*!*. jatkuvaa kasvua in vitro (Farrar et ai., Ann. N.Y. Acad

Sei. 332: 303-15 /1979/). Samoin lL-3-tekijän eräs tärkeä • m • ** ominaisuus on sen kyky tukea solu1 injojen, joilla on syöttö- • · "···* solujen fenotyyppisiä ominaisuuksia, kasvua (Ihle, J.

*:*·· et ai, , Immunological Rev. 63: 5-3 2 /1982/). IL-3-tekijästä !***: johtuvaksi on ilmoitettu myös joukko muita solujen kasvu- • · 5 87802 ominaisuuksia (kts. Ihle, J. et ai., J. Immunol. 131: 202-287 ja 129: 2431 /1981/), mutta sen suhde multi-CSF-tekijöän ei ole ollut täysin selvä.

Vaikkakin seka hiiren IL-2-tekijä että IL-3-tekijä on ainakin osittain karakterisoitu biokemiallisesti (Gillis, S. et ai ., J. Immunol. 124: 1954-1962 /1980/ ja Ihle, J. et ai·, J. Immunol. 129: 2431-2436 /1982/, lL-2-tekijää pidetään tällä hetkellä T-solujen kasvusta vastuussa olevana pääasiallisena tekijänä, kun taas samassa määrin ei ole päästy yli L u i symrnär rykseen proteiinista (proteiineista), joka on vast.uussa syöttösolujen kasvutekijästä (MCGF) ja (’1>I -akti i. v i suud e s t a . Nykyään uskotaan, että hiiren Il-2-tukijän moLekyy1ipaino (luultavasti dimeerinä) on noin 3U-35.U00 (Simon, P. et ai. , J. Immunol. 122: 127-132 1979/ ), vaikkakin eräitä variaatioita on havaittu (Robb, 9. ja Smith, K., Molec. Immun. 18: 1087-1094 /1981/); ja ihmisen 1L-2-1ekijän molekyylipaino on ilmeisesti noin 13.00U (Gillis, S. et ai., Immun. Rev. 63: 167-209 /1982/). Lisäksi äskettäin on raportoitu ihmisen lL-2-tekijää koodaava cDNA-klooni (Taniguchi, T. et ai.. Nature 302: 305-310 /1983/). Hiiren syöttösolujen kasvutekijöiden molekyyli-painoiksi on toisaalta toisista tiedoista poiketen ilmoitettu 45.000 (Nabel et ai. , Nature, 291: 332-334 /1981/), 35.000 (Yung, Y. et ai . , J. Immunol. 127: 794-799 /1981/) ja 28.000 (Ihle, 0. et ai. , J. Immunol. 129: 1377-1383 /1982/). Samankaltaisia epäjohdonmukaisuuksia liittyy CSF-teki j ään .

’ 1 Vaikkakin tällaiset molekyylipainon erot voitaisiin osittain selittää erisuurella glykosylaatiolla, asian selvittäminen *· 1: vaatii lisätietoja rakenteesta, esimerkiksi kyseessä olevien * molekyylien oleellisesti täyspitkän sekvenssianalyysin.

Proteiinin sekvenssointi on luonnollisesti eräs ongelman » iiiah d o 1.1 i nen ratkaisukeino, mutta tämä on erittäin vaikea kokeellinen työ eikä sillä 1ä 11 e s k ä ä n aina saada täysin ' ‘ Laikkoja tai täyspitkiä aminohapposekvenssejä. Lisäksi «« · V se, että kyetään valmistamaan suuria määriä polypeptidiä, 6 87802 · jolla on nisäkkään MCGF- tai CSF-aktiivisuutta, helpottaa suuresti syöttösolujen ja muiden immuunireaktioon liittyvien solujen biologian tutkimista; esimerkiksi siten, että solujen kasvun stimuloinnissa ei välttämättä tarvitse turvautua ConA-käsi-teltyihin alustoihin. MCGF-tai CSF-tekijää koskevat tarkat ja täydelliset sekvenssitiedot osaltaan myös yksinkertaistavat muiden immunlogisten tekijöiden etsimistä. Mistä tahansa lymfo-kiinista saatu lisätieto auttaa myös immuuniverkoston eri kasvutekijöiden ja solujen roolien arvioimista ja antaa siten kuvan koko immuunijärjestelmästä - ja samalla kertaa terapeuttisista eduista.

Näin ollen tarvitaan suuresti laajaa nukleotidisekvenssitiedos-toa sellaisista DNA-lajeista ja niiden aminohapposekvensseistä, jotka koodaavat proteiineja, joilla on MCGF- tai CSF-aktiivisuutta. Samoin on olemassa suuri tarve yksinkertaisesta ja taloudellisesta menetelmästä, jolla tällaisia aineita voidaan valmistaa tuntuvia määriä oleellisesti puhtaana. Esillä oleva keksintö täyttää nämä tarpeet.

Esillä oleva keksintö tuo esiin cDNA-kloonit, jotka koodaavat polypeptidejä, joilla on nisäkkään syöttösolujen kasvutekijäak- tiivisuutta (MCGF)-aktiivisuus ja monilinjainen solun kasvute- T*. kijäaktiivisuus. Kuviossa 1 on esitetty nukleotidisekvenssi • ·» · I cDNA:lle ja oletettu aminohapposekvenssi tähän liittyvälle : polypeptidille. cDNA-sekvenssi voi olla integroitunut erilai- siin vektoreihin, jotka vuorostaan voivat ohjata vastaavien -.* polypeptidien synteesiä erilaisissa isännissä, mukaanlukien eukaryoottisissa soluissa, kuten nisäkkään viljelmäsoluissa.

Tarkemmin sanoen keksintö tuo esiin menetelmän, jolla tuotetaan polypeptidiä, jolla on monilinjainen nisäkässolun kasvutekijä-... aktiivisuus ja joka sisältää seuraavan aminohapposekvenssin « · * • « 7 £7802

Asp - Thr - His - Arg - Leu - Thr - Arg - Thr -

Leu - Asn - Cys - Ser - Ser - Ile - Vai - Lys -

Glu - Ile - Ile - Gly - Lys - Leu - Pro - Glu -

Pro - Glu - Leu - Lys - Thr - Asp - Asp - Glu -

Gly - Pro - Ser - Leu - Arg - Asn - Lys - Ser -

Phe - Arg - Arg - Vai - Asn - Leu - Ser - Lys -

Phe - Vai - Glu - Ser - Gin - Gly - Glu - Vai -

Asp - Pro - Glu - Asp - Arg - Tyr - Vai - Ile -

Lys - Ser - Asn - Leu - Gin - Lys - Leu - Asn -

Cys - Cys - Leu - Pro - Thr - Ser - Ala - Asn -

Asp - Ser - Ala - Leu - Pro - Gly - Vai - Phe -

Ile - Arg - Asp - Leu - Asp - Asp - Phe - Arg -

Lys - Lys - Leu - Arg - Phe - Tyr - Met - Vai -

His - Leu - Asn - Asp - Leu - Glu - Thr - Vai -

Leu - Ala - Ser - Arg - Pro - Pro - Gin - Pro -

Ala - Ser - Gly - Ser - Vai - Ser - Pro - Asn -

Arg - Gly - Thr - Vai - Glu - Cys - ; jolle menetelmälle on tunnusomaista se, että se käsittää vaiheet, joissa a) muodostetaan vektori, joka käsittää mainittua polypeptidiä koodaavan nukleotidiseksvenssin, erityisesti mainittua poly-peptidiä koodaavasta mRNA-sekvenssistä saadun cDNA-sekvenssin, jolloin vektorin sisältävä nisäkäs- tai bekteeri-isäntä kykenee d\ ; ekspressoimaan nukleotidisekvenssin, joka kykenee koodaamaan ·' mainitun polypeptidin; - b) liitetään vektori isäntään; ja .· c) pidetään vektorin sisältävä isäntä olosuhteissa, jotka sopivat nukleotidisekvenssin ekspressoimiseen mainituksi ! polypeptidiksi.

cDNA-sekvenssit saadaan parhaiten polypeptidejä koodaavasta ... mRNA-sekvenssistä, ja isäntä on organismi, kuten vektorilla ,« » e 87802 transfektoitu tai transformoitu eukaryoottisolu, esimerkiksi nisäkässolu. Vektori käsittää lisäksi parhaiten myös toisen nukleotidisekvenssin, joka kykenee säätelemään poly-peptidiä koodaavan nukleotidisekvenssin ekspressoitumista.

Tämä toinen sekvenssikoodi voi sisältää promoottorisekvenssin, yhden tai useampia intronisekvenssejä ja polyadenylaatiosek-venssin, jolloin polypeptidiä koodaava nukleotidisekvenssi voidaan vastaavasti transkriptoida, lohkaista ja poly-adenyloida.

Erityisesti, kun isäntä on nisäkässolu, kuten apinan (munuainen) COS-7-solu, vektori sisältää SV40 viruksen (simian virus 40) alkualueen promoottorin promoottorisekvenssin ja SV40 jäl-kialueen polyadenylointisekvenssin.

Kuviossa 1 esitetty (kts. jäljempänä) hiiren cDNA-sekvenssi kykenee hybridisoitumaan muiden DNA-sekvenssien kanssa, kuten cDNA- tai genomikirjastosta saadun DNA:n kanssa, joka koodaa muita nisäkkään kasvutekijöitä. Huomattava on, että kuvatut cDNA-sekvenssit näyttävät sisältävän informaatiota johtosek-venssistä.

• « · 'I Esillä olevan keksinnön mukaiset polypeptidit kykenevät paran-Ί” tamaan nisäkkään syöttösolujen ja muiden solujen kasvua, eri-tyisesti in vitro viljelmissä. Sopivia farmaseuttisia seoksia : -’voidaan valmistaa lisäämällä polypeptidit (joiden preparaatit eivät oleellisesti sisällä muita nisäkkään kasvutekijöitä) terapeuttisesti yhteensopiviin kantajiin.

: Keksinnön muut tunnusmerkit ja edut ovat ilmeisiä seuraa- vasta yksityiskohtaisesta kuvauksesta, jossa esillä olevaa keksintöä on kuvattu mukaanliitettyjen piirustusten ja esimerkin avulla.

9 87802

Piirustuksissa:

Kuvio 1 esittää cDNA-kloonin, jolla on monilinjainen solun kasvutekijäaktiivisuus, nukleotidisekvenssiä ja oletettua vastaavaa aminohapposekvenssiä.

Kuvio 2 kuvaa MCGF-aktiivisuuden määrää ConA-stimuloiduisa CI.Ly 1+2-/9 soluista eristetyn mRNA:n sakkaroosi-gradientti-sedimentaation jakeissa. 18S ja 28S ribosomipiikkien sijaintikohdat on osoitettu.

Kuvio 3 esittää pcD-MCGF, cDNA-kloonin sisältävää plasmidia, jolla on syöttösolun kasvutekijäaktiivisuutta ja monilinjaista solun kasvutekijäaktiivisuutta.

Kuvio 4 on restriktioendonukleaasi-lohkaisukartta kuvion 3 mukaisesta cDNA-insertistä.

Kuviossa 3 on osoitettu nuolella 950 bp cDNA-insertin, joka on SV40-alkupromoottorista saadussa pcD-ekspressiovektorissa, transkriptio. Katkaisudonorin ja -akseptorin sijaintikohdat ·';· on annettu. Polyadenylointisignaali, joka myös on saatu SV40:stä, sijaitsee cDNA-insertin 3'-päässä. cDNA-insertti .·.·. on varjostettu tiheästi. Loput vektorisekvensseistä on saatu ·- ^ pBR322:sta, mukaanlukien β-laktamaasigeeni (AmpR) ja repli-I kaation alkukohta.

*-*·* Esillä olevan keksinnön mukaisesti tehdään komplementtiset DNA (cDNA) kloonit polypeptideille, joilla on nisäkkään syöttösolun kasvutekijä (MCGF)-aktiivisuutta ja/tai moni-::: linjaista solun kasvutekijän (multi-CSF)-aktiivisuutta. Sen jälkeen, kun cDNA-sekvenssit on liitetty replikoituviin ekspressiovektoreihin ja vektorit on transfektoitu sopivaan »· · *7802 isäntään (esimerkiksi nisäkässoluviljelmä), ekspressoitunut polypeptidi (tai polypeptidit) voi antaa syöttösolujen ja hemapoieettisten soiujen laajeta moniksi solulinjoiksi.

Kuviossa 1 on esitetty esimerkkinä oletettu aminohapposekvenssi, joka perustuu eristettyyn nukleotidisekvenssiin. Osa ennustetusta sekvenssistä (aminohapot 33 - 41) on identtinen hiiren interleukiini-3:n (IL-3), jolla on osoitettu olevan hiiren MCGF-aktiivisuutta ja multi-CSF-aktiivisuutta (Ihle, J. et ai., J. Immunol. 129, 2431-2436 /1982/; Ihle, J. et ai., J. Immunol. 131, 282-287 (1983); ja Garland, J. et ai., toim. Oppenheim, J. ja Cohen, S., "Interleukins, Lymphokines, and Cytosines" Proceedings of Third Int. Lymphokines Workshop, Academic Press, New York, sivut 123-129 /1983/), raportoidun NH2-terminaalisekvenssin kanssa. Koodialue, joka sijaitsee translaation lähtökodonin (ATG) ja IL-3:ssa olevan sekvenssin lähtökohdan välillä, sisältää runsaasti hydrofobisia aminohappoja, kuten on odotettavissa erittyneen proteiinin johto-sekvenssille. Sen vuoksi erittyneessä tilassa oleva polypep-tidin valmismuoto in vivo luultavavsti alkaa Asp-tähteellä, kuten IL-3, ja proteolyyttinen käsittely poistaa noin 20 edeltävää aminohappoa, jotka muodostavat oletetun johto-···· sekvenssin. Jos tämän oletetaan olevan oikein, niin MCGF-...:ja multi-CSF-aktiivisuuksia omaava valmis polypeptidi muo-V.dostuisi 134:stä aminohaposta lasketun molekyylipainon Ollessa noin 15.000. Lisäksi neljän potentiaalisen N-gly-kosylaatiokohdan, so. Asn-X-Ser (jossa X on aminohappotähde) polypeptidin oletetuissa aminohappokohdissa 42-44, 70-72, 77-79 ja 112-114 (kts. Neuberger et ai., Glycoproteins 5, . -450-490, Elsevier Publishing Co., U.S.A. /1972/) mukanaolo λ.viittaa siihen, että tämä olisi glykosyloitunut in vivo.

11 87802 COS-7 aμ inasoluihin transfektoituna yksi tämän keksinnön mukaisista cDNA-klooneista ohjaa biologisesti aktiivisen MCGF:n ja rnulti-CSF :n synteesiä. Tämän ekspressoituneen kloonatun geenituotteen lisääminen hiiren luuydinsoluvil-jelmiin mahdollistaa useisiin solulinjoihin tehtävöityneiden hematopoieettisten solujen laajenemisen; se tukee BFU-E-pesäk-keiden (burst-forming erytrhroid), CFU-G/M-pesäkkeiden (granulocyte/macrophage), syöttösolupesäkkeiden (CFU-mast) seka moninkertaisten solulinjojen (CFU-Mixed) pesäkkeiden muodostumista ja ylläpitää monipotentiaalisia kantasoluja , (CFU-S) nesteviljelmässä.

Esillä olevan keksinnön mukaisten cDNA-lajien valmistamiseen voidaan käyttää monia erilaisia menetelmiä. Esimerkiksi kukonais-mRNA uutetaan (esim. kuten Berger, S. et ai. , Biochemistry 18: 5143-5149 /1979/ solulinjasta (esimerkiksi hybridisolu1 injasta ) , joka ottaa polypeptidejä, joilla on nisäkkään syöttösolun kasvutekijäaktiivisuutta . Kaksi-siiike i set cDNA-lajit tästä kokonais-mRNA ; sta voidaan konstruoida käyttämällä primeerin initioimaa käänteistranskriptiota (Verma, 1., Biochim. Biophys. Acta, 473: 1-38 /1977/), jolloin saadaan ensin jokaisen mRNA-sekvenssin komplementti, ··· j n sen jälkeen priimaamalla toinen säiesynteesi (Land, * · · * .S. H. et ai. , Nucleic Acids Res., 9: 2251-2266 /1981/). Tämän jälkeen cDNA-lajit voidaan kloonata liittämällä ne sopiviin •·\·\ plasmidi- tai bakteeri faagivektoreihin (Tougeon, F. e_t I ai., Nucleic Acids Res., 2, 2365-2378 /1975/ tai Scherer, G. et ai ., Dev. Biol. 86, 438-447 /1981/) komplementtisten • · · '·*·* homopolymeeristen häntien avulla (E f strat iadis, A. et ai. , Cell, 10, 571-585 /1977/) tai kohesiivisten päiden :/·· avulla, jotka on muodostettu käyttämällä linkkerisegmenttejä, joissa on sopivat restriktiokohdat (Seeburg, P. et ai, ,

Nature, 270, 486-494 /1977/ tai Shine, J. et ai. . Nature, *... 270, 494-499 /1977/), ja sen jälkeen transformoimalla « t ·;* sopiva isäntä. (Kts. yleisesti Efstratiadis, A., ja

Vilia-Kormarof f, L., "Cloning of double stranded cDNA" : · : kirjassa b e 11 o w , J. ja Hollaender, A. (toim.) Genetic 1* 87802 engineering, Voi. 1, Plenum Publishing Corp., N.Y., U.S.A.

/)902/).

Parhaana pidetty menetelmä, jolla saadaan tämän keksinnön mukaisia täyspitkiä kloonattuja cDNA-lajeja, on H. Okayama'n ja P. Berg'in kehittämä menetelmä (Mol. and Cell. Biol., 2: 161-17B /1982/). Tämän menetelmän etuna on, että cDNA-j 11 u e r I il laitetaan link t e e r a k loonausvek t or i in sellaiseen kuhinan, että eDNA voi nisäkässoluissa myös suoraan UuimloituH ja prosessoitua. Lyhyesti sanoen priimataan ensimmäinen eONA-säie polydeoksitymidyylihapolla, joka on kova Ien11isesti liitetty lineaarisen plasmidivektori-DNA:n toiseen päähän. Sen jälkeen plasmidivektori syklisoidaan linkkeri-DNA-segmentin kanssa, joka siltaa plasmidin toisen pään cDNA-koodaussekvenssin 5'-päähän. Käyttämällä DNA-fragmenttia, joka sisältää SV 40 (Simian Virus 40) alkualueen promoottorin ja linkkerin, jossa on modifioitu SV40 jälki-alueen introni, voidaan cDNA ekspressoida in vitro C0S-7 hiiren munuaissoluissa ilman enempää modifiointia. (Kts. yleisesti Okayama, H. ja Berg, P,, Mol. and Cell. Biol., 5: 7MU-2H9 / I H 4 / ja Jolly, D. et ui., Proc. Nat. Acad Sei. U.S.A. , 8 U : 4 7 7-481 /198 3/).

Halutut cDNa-kloonit voidaan myös detektoida ja eristää : hybridisointiseulomalla sopivilla mRNA-näytteillä (Heindell, ·*·'. II. et ai . , Cell, 13: 43-34 /1978/). Vaihtoehtoisesti voidaan el)NA-kirjastot seuloa hybridiselektion avulla (Harpold, M. et ai., Nucleic Acid Res., 5: 2039-2053 /1978/ tai Parnes, J. et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 78: 2253-2257 /1981/) tiu Xenopus-oosyyteissä (Aurdon, J., Nature, 233: ’· I//-182 /1971/). (kts. yleisesti Vi 11 a-Komar o f f, L. et_ : u_K, P r u c . Nat . Acad. Sei. U.S.A., 75: 3727-3731 /1978/).

,··, Kun e DN a - k j r j a s I u Uka y aina/B e r g-p 1 a sm id i vek t o rissa on tehty, c UN a -kloonit ke rata iin ja haluttujen cDNA-lajien läsnäolo (random pools) tarkistetaan hybridiselektion, translaation ' .* ja määritysten avulla (esimerkiksi mittaamalla MCGF tai ,3 87802 mulL.i-CSF kasvutekijäaktiivisuus, antigeenideterminanttien läsnäolo tai muut biologiset aktiivisuudet). Näiden kriteereiden perusteelta positiiviset joukot voidaan sen jälkeen Lutkia sopivalla ke Intetyllä koettime 11a, esimerkiksi Li - soluli ojasta ja/ tai indusoimattomasta T-solulinjasta saadulla cDNA : 1]a. Tämän jälkeen positiiviset joukot, jotka on käsitelty koettimella, jaetaan yksittäisiksi klooneiksi, jotka testataan transfektoimalla sopivaan isäntään (kuten nisäkässoluviljelmään), ja haluttu aktiivisuus määritetään isännän supernatantista (esimerkiksi multi-CSF-I <n MCI li -a k t 11 v i suus ) . Sen jälkeen sek vensaoi da a n positiiviset k L o o n l L .

Kun seuraavassa kuvataan menetelmiä, jotka koskevat keksinnön mukaisten cDNA-kloonien valmistamista, käsitellään ensin syo11ösolu1 injat ja muut linjat, minkä jälkeen kuvataan yleisesti seuraavia: Menetelmät, joilla translatoidaan MCGF-aktiivisuutta omaavaa proteiinia koodaava mRNA; cDNA-sokvenssejä sisältävän cONA-kirjaston konstruointi; kirjaston hybridiselektio ; plasmidivektorin täyspitkien cDNA-kloonien eristäminen ja lyhempi ekspressointi nisäkässoluissa ; multi-CSF-mäöritykset ; ihmisen multi-CSF:n ja MCGFjn eristä-..[·* minen, subkloonaus ja ekspressointi bakteerissa ja hiivassa; “· jo puhdistaminen ja formulointi. Jäljempänä on esitetty *.V: yksityiskohtaisempi kuvaus kokeellisesta menetelmästä kokonaisuudessaan.

• • a 4 ""'* Syöttösolu- ja T-solulinjat

Suositeltuja tämän keksinnön yhteydessä käytettyjä soluja *. ovat solut, jotka on kehitetty Galli'n kuvaamalla tavalla, : j. et ai . (J. Cell Biol., 95: 435-444 /19 82/). Yksi kloonattu ;·. sy ö 11 ösolu 1 in j a , josta käytetään merkintää MC/9 ja joka [···. on tallennettu American Type Culture kokoelmaan (ATCC-numero ’·’ CKl 8 5U6) , kasvatettiin DME-alu3talla (Dulbecco'e modified :”r Cagle's medium), jota oli täydennetty 5 ?i:lla supernatant te ja 87802 14

ConA-aktivoidusta i-solulinjasta, josta käytetään merkintää Cl.Ly l+2~/9 ja joka on tallennettu American Type Culture kokoelmaan (ATCC-numero CRL 8179) (Nabel, G. et ai., Nature, 291: 332-334 /1981/). Tämä T-solulinja oli saatu C57B1/6 hiirestä (Nabel, G. et ai ., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 78: 1157-1161 /1981/), ja tämä ylläpidettiin modifioidussa täydennetyssä DME-alustassa (Nabel et ai. , Cell, 23: 19-28 /1981/). Se on tämän keksinnön mukaisille polypeptideille sopiva mRNA-lähde, mutta voidaan käyttää myös muita nisäkäs-solulähteitä (mukaanlukien ihmisen periferiaverta), jolla on kyseeseen tuleva aktiivisuus (esimerkiksi MCGF tai multi-CSF ) .

MC/9-soluja käytetään myös MCGF-aktiivisuuden määrittämiseen, parhaiten jo vakiintuneilla tavoilla suoritetun ^H-tymidiini-menetelmön avulla (esim. Nabel et ai., Nature, 291: 332-334 /1901/). MC/9-soluja (lG'Vkaivo) viljellään tasapohjaisilla falcon'in mi kr o t i i 11. er i le vy i llä DME-alustassa, jossa on t iiydennykueuä 4 “g vasikunaikiösoerumia, 5U μιιι 2-merkapto-etunolia i/2-ML), 2 mM glutamiinia, ei-oleelliaia aminohappoja, oleellisia vitamiineja ja eri konsentraatiota supernatanttia lopputilavuuden ollessa 0,1 ml. Jokaiseen viljelmään lisätään ...:* 0,9 Ci H-tymidiiniä 24 tunnin inkubointiajän viimeiseksi 4 Lunniksi. Sen jälkeen solut kerätään lasisuodattimien päälle ja radioaktiivisuus mitataan nestetuikespektrometrillä.

• · · mRNA ; n eristäminen ja fraktiointi koon mukaan • ♦ · · * · ·

Solun kokonais-mRNA voidaan eristää monella eri yleisesti tunnetulla menetelmällä, esimerkiksi käyttämällä Chirgwin'in et ai., (Biochemistry, 18: 5294-5299 /1979/). quanidinium-♦ * · ' V* Liosyanaatti-uuttomenetelmää. Jos käytetään tätä menetelmää,

• O

j·. 1-2 x 10 aktivoidusta apu-T-so.lusta, kuten Cl.Ly .···. 1 <’2_/9-soluista saadaan noin 100 pq polyA+ mRNA: ta valittuna • oL ujo-(di) se 1 luioosupyiväi 11ä . mRNA:n fraktioimiuekai koon perusteella iUU ug:n kerros polyA+ mRNA:ta laitetaan «· · : .* 1.U ml. 5-2 3 ?ό suk k a roos i grad i. en t in päälle (10 mM Tris.HCl, « 87802 pH 7,4, 10U mM Nalk, 1 mM LD1A) ja senLr i f utjoidaan 19 h/26.000 rpm Beckman SW41 roottorissa. Otetaan talteen 450 yt< 1 jakeet ja RNA seostetaan 2 tilavuudella etanolia.

Xenopus Jactyis oosyyttien hybridiselektio .ja mikroin.jisointi

Ouociatinhybrid.isoinnit suoritetaan parhaiten oleellisesti Parnes'in et ai. kuvaamalla tavalla (Proe. Natl. Acad.

Sei. U.S.A., 78: 2253:2257 /1981/). Alalla yleisesti tunnetuilla menetelmillä iqjisoidaan eluo.ituja mRNA-eriä yksittäisiin Xe.nopus laevis uosyytteihin. Elävistä oosyyteistä saadut, supernatant! t kerätään 48 tunnin kuluttua, yhdistetään ja niistä määritetään aktiivisuudet.

cDNA-kirjaston rakentaminen rDNA-kirjasto voidaan parhaiten rakentaa käyttämällä pcDVl vektori-primeeriä ja pLl linkkerifragmenttia /saatavissa P-L Biochemicals Inc.-yhtiöstä, Milwaukee, WI) menetelmillä, joilla saadaan mRNA-transkriptien suuresti rikastuneita täyspitkiä kopioita (esim. Okayama, H. ja Berg. P,. Mol.

Cell biol., 2, 161-170 /1982/ ja Mol. Cell biol., 3, 280-2Θ9 ...: /1983/). Plasmidivektori, joka sisältää S V 4 0 alkupromoottorin ..)·* ja SV 40 RNA-prosessointisignaalit, on tehty niin, että *. se edistän kloonatun cDNA-segmentin ekspressoitumista : · : M l U I i k ! I ! j ! U) I 11 l ! I;) ! I .

Okayama'n ja Bery'in menetelmällä transformoidaan syklisoitu vekLori-cDNA-prepä raa11i kompetenttiin bakteerisoluun, kuten E.coli MC1061 soluihin (Casadaban, M. and Cohen, * · » '· " S., J. Mol. Biol., 13B: 179-207 /1980/ käyttämällä Ualaium- ' kloridia (Cohen, S. et ai. , Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 69: 2110-2114 /1972/). Kun käytetään 5 pg ConA-stimuloiduieta .···. Cl.Ly l+2”/9 soluista saatua polyA+ RNA: ta saadaan noin • 1,5 x 10 itsenäistä transformanttia. Noin 10 kloonia • * poimitaan yksitellen ja siirrostetaan mikrotiitterilevyjen •« » ' .· kaivoihin (Flow Laboratories inc., McLean, Virginia), '· 87802 jut k it :.1.1 s.i J L sivu I Z CHI μ i I-lientä, 30 ug/ml arnpisi11iiniu j<! 7 % dimetyy 11su 1 fok sιdia . H. Okayama 1 n ja P. Berg'in, (Mol. Cell Bio 1 ., .5, 280-289 /1983/), kuvaamalla tavalla valmistetaan haluttaessa alikirjastoja cDNA-totaalikirjastosta oDNA-insertin koon perusteella. Lyhyesti sanoen plasmidi-DNA kas i Loi laari erikseen Ball-, C1 a 1 - ja Hindi II- entsyymeillä ja elektrofureaoidaan 1-prosenttisella agaroosigeelillä. Itidiumbrumidi-värjäyksen jälkeen geeli leikataan 7 osaan, jotka vastaavat cDNA-inserttikokoja 0-1, 1-2, 2-5, 5 - 4, 4 - b, b - 6 ja yli 6 kiloemästä (kb). DNA uutetaan jokaisesta leikkeestä, syklisoidaan uudelleen T4 DNA-ligaasilla ja tällä transformoidaan MC1Q61. Nukleotidisek-venssolnti kokonaisuudessaan voidaan suorittaa A. Maxam'in ja W. Gilbert'in menetelmällä (Methods Enzymol., 65: 499-560 /1980/).

Pienennetyn cDNA-koettimen valmistaminen ^P-cDNA-koetin rikastetaan haluttaessa ConA-indusoidun sekvenssin suhteen kahden cDNA-absorptiojakson avulla, joilla poistetaan cDNA-sekvenssit, jotka ovat yhteisiä . immuunijärjestelmän Cl.Ly l+2~/9 soluille ja lähisukuisille, * · 1 ··1· mutta teh t ävöi Ly nei 1 le soluille, kuten B-solumyeloomalle ·♦.: (kts. Davis, M. eL ai., "Isolation of B4 T-Cell Specific • 1 r

Genes", Vitteta, E. ja Fox, C. toim. UCLA Symp., s. 48 : /.t‘‘U2/) . Kulini,o.i ulmnakr iptausin templauttina käytetään ^ parhaiten noin 2 uy sakkaroosigradienttijakeesta saatua ;V.1 mRNA:ta, jolla on MCGF- ja multi-CSF-aktii visuutta, käyttämällä oligo (dl) 12-18 primeereja (saatavissa Collaborative « . Research-yhtiöstä, Walthma, Mass.). RNA:n alkalihydrolyysin jälkeen '^P-cDNA hy b r i d i so i da an 68°C:ssa 14 tuntia (cot-luku = * · · *. 1 5.000) 20 ug mRNA-erien kanssa, jotka on saatu seuraavista: ; WFH1-231, B-solu-lymfooma (kts. esim. Taussig et ai. ,

Immunology 39: 57-60 /1980/) ja NS-l-peräinen hybridoma • · i ( AI CC-numero HB-8113). Hybridisoitumaton cdNA erotetaan ... cDNA/RNA-hybrideistä pyiveskromatografoimalla hydroksiapa- * 4 t 1’ tiitilla. Toinen pienentäminen voidaan sen jälkeen suorittaa π 87802 edellä kuvatulla tavalla (cot- 1.100) hybridisoitumattomalla ;H - οϋΝ A : 1 1 a käy t L iiiniil 1 i.i yl i määrä inKNA : ta (10 ug ) , joka i)ii saatu 1 nduso i t unia L tomis t a Cl.Ly l+2~/9 soluista. ConA-mdusoitujen sekvenssien suhteen käytettyä yksisäikeistä ^P-cDNA:ta, joka muodostaa noin 1-2 % lähtöaineesta, käytetään sen jälkeen pesäkehybridisoinnissa (Maniatis, I. et ai., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold spring Harbor Laboratory, U.S.A. /1982/).

I) N A - l r a n s f e k t o i η η 11 a p i n a s o 1 u i h i n

Nam 1x10^ COS-7 apinan munuaissolua siirretään 60 mm maljoille päivää ennen trans fe kto intia . Transfektoinneissa käytetään parhaiten 15 ^jg plasmidi-DNA: ta 1,5 ml:ssa DMErtä, joka sisältää 50 itiM Iris.HCl, pH 7,4 ja 400 ^ig/ml DEAE- dekstraania (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi).

Sen jälkeen tämä liuos poistetaan 4 tunnin kuluttua ja kurvataan seoksella, jonka koostumus on 2,0 ml DME + 4 % vasika nsikiöseerumia. 72 tunnin kuluttua medium otetaan talteen ja siitä määritetään edellä kuvatulla tavalla MC OF- tai mu 11i-CSF-aktiivisuus. DNA-transfektoinnit voidaan , suorittaa myös monissa muissa erilaisissa solulähteissä * * · “*; (kts. jäljempänä).

• · » « » « « ·

Multi-CSF - määritykset * · « a • I, t “· Mu 11 i - CSF-a k t i i v i suuden määrityksessä testataan kyky vaikuttaa ;V: munipotentia ai isiin ede11äjäsoluihin tai useaan solulinjan suhteen rajoitettuun soluun tai testataan kumpikin kyky.

· (kts. yleisesti Iscuve, N. et ai. , J. Cell Physiol. Suppl.

1: 65-78 /1982/ ja Ruppert, S., Exp,. Hematol. 11: 154-161 * * · ** /1983/). Määritysolosuhteiden perustana on, että ne sallivat i OFU-E-pesäkkeiden (burst-forming erythroid), CFU-G/M- pesäkkeiden (yranulocy te/macrophuge ) ja solulin jaltaan . sekalaisten pesäkkeiden (CFU-Mixed) muodostumisen. Määritykset ... suoritetaan yleisesti D. Metcalf'in et ai. (J. Cell Physiol., : *' 98: 401-420 /1979/) ja 0. Johnson’in (J. Cell Physiol., '» 87802 103: 371-383 /1980/) menetelmillä.

CäT-c-määritys (Colony Forming Unit - culture)

Luuydinsoluja voidaan kerätä C57B1/6 hiirten reisiluista.

Oulut pestään kerran ja valmistetaan yksisoluinen suspensio Iscove'n modifioidussa Dulbecco'n alustassa, /MDM/ (G1BC0, Grand Island, New York), jossa on lisäksi 3 % vasikansikiö-sourumia /100/ (C.1BCU). Tämä yksisoluinen suspensio maljataan muovisiin kudosviljelymaljoihin ja inkuboidaan 1-2 tuntia 3 7t>C-lämpötilaisessa inkubaattorissa (jossa 6 % C 0 ^) niin, että solut voivat kiinnittyä maljaan. Sen jälkeen kiinni ttymättomät solut poistetaan ja laitetaan eräissä tapauksissa epäjatkuvaan Percoll (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO )-g ra d i e n 11 i in , jotka muodostuvat 2 ml:n kerroksista, joissa on 40 %, 50 %, 60 %, 70 S Percoll-liuosta (Kakiuchi et ai,, J. Immunol., 131: 109 /1983/). Eri välipinnoilla olevat solut kerätään erikseen ja pestään kaksi kertaa IMDM + 3 % FCS-seoksella. (Percoll-gradienttiin laittamattomat solut voidaan vaihtoehtoisesti pestä kerran IMDM + 3 % I CS-ueuksellu). Lrilliset solupelletit suspendoidaan sen ^ jälkeen IMDM + 15 % FCS-seokseen 4,5-6 x 10^ solua/ml ’ ’** k o n sent r aa liossa.

« • · » · • · ·.*.· CFU-c-viljelmät voidaan sen jälkeen määrittää käyttämällä »« · ; *„* lsoce'n et ai. (J. Cell Physiol., B3: 309 /1974/) metyyli-*:* selluloosa-menetelmän muunnelmaa. Sekoiteaan FCS (loppu-•V; konsentraatio 25 ?ό), 2-merkaptoetanli (5 x 10~^M), penisilliini-streptomysiini (1:100 GIBCO-perusliuoksia ), metyyli-4·. ► selluloosa (1,1 %, 4000 sen11ipoisea ) , solut (1,5-2 x 10^/ml) ja Cl-U-e-kyvyn suhteen testattavat erilaiset koetekijät • ♦ » (30 %) ja pienelle petrimaljalle laitetaan 1 ml seosta.

; Maijoja inkuboidaan 7 päivää 37°C/6 % CO^ inkubaattorissa.

:***: Sen jälkeen niistä lasketaan pesäkkeet käyttämällä leikkaus- - « ♦ mikroskooppia (4x). Pesäke määritellään siten, että se muodostuu 50 tai suuremmsta määrästä soluja. Yksittäiset • λ » 19 87 802 pesäkkeet voidaan uuttaa, laittaa mikroskooppilevyille, kiinnittää ja värjätä Wright/Geims-menetelmällä (kts.

Todd-San ford , Clinical Diagnosis By Laboratory Methods, 1!). painos, Davidsohn ja Henry (toim.) 137 /1974/). Sen jälkeen suoritetaan läsnäolevien solutyyppien morfologinen analyysi yhtä pesäkettä kohti.

OFU-E (Burst Forming Unit - Erythroid tai CFU-E)

Edellä oleva menetelmä kelpaa seuraavin modifikaatioin.

Joko hetkellä, jollain maljataan metyyliselluloosaan, tai 3 päivää my oli emmi n lisätään levyä kohti 0,5-1 yksikön kuusentraatiossa lampaan er y t. ropo i e t i i n i ä (vaihe III,

Cunnaught Medical Research Laboratories, Philadelphia, PA). Eytroidia sisältävät pesäkkeet (BFU-E tai CFU-E) lasketaan 10-14 päivän kuluttua (maljaushetkestä) pesäkkeinä, jutka sisältävät visuaalisesti luettavia elementtejä. Yksittäiset pesäkkeet uutetaan ja värjätään edellä kuvatulla tavulla morfologista analyysiä varten.

CFU-s (Colony Forming Unit - spleen) .Γ. Luuydin uutetaan C57B1/6 hiirten reisiluusta. Solut pestään kaksi kertaa DME - a lus t ai 1 a (Dulbecco ! s modified Eagle's medium) (GIBCO) ja joko injisoidaan välittömästi kuolettavasti .II sätei lytettyjen (1000 rad) C57B1/6 hiirten häntälaskimoon ' * tai käsitellään edelleen. Käsittely muodostuu seuraavista ··* g ·*·· eri menettelyistä: L) solut lyysataan anti- ;lla ja '·*·’ komplementilla, minkä jälkeen joko välittömästi injisoidaan elä imi in tai viljellään eri aikoja erilaisissa olosuhteissa Σ *.: ennen ι n j :i s u π 11 i a ; 2) vaihtoehtoisesti ei suoriteta mitään a n t i s e e r um i 1 y y s a u o L a , vaan soluja viljellään välittömästi erilaisissa olosuhteissa. Viljelyolosuhteet voivat olla seuraavat: soluja suspendoidaan uudelleen 1 x 10^ solua/ml alustaan, jonka koostumus on: DME (GIBCO) + 2-ME (5 x 10 ^ M) , *:**: MLM-vitamiinit (1:100) (GIBCO), ei-vä 111ämattömät aminohapot (1:100) (GIBCO), L-g 1 u t ami in i (1:100) (GIBCO), penisil- 20 8 7 8 0 2 iiini/streptomysiini (1:100) (GIBCO), arginiinin, asparagiinin j;i Tuoli hapon seos, 15% ICS (GIBCO), 2mM natriumpyruvaatti + οι.I tekijät, joilla CFU-s-solujen säilyminen testataan (.1 oppukunuonl. run L lo 25¾). I ämä solupreparaatti maljataan son j;i Ikeen 2 4 -ka ivo isille kudosviljelmälevyille (Falcon) ] ml/kaivo ja inkuboidaan eri aikoja (vähintään 7 päivää) 37uC/10?o CU2 - inkubaa t tor issa . K iinni11ymät tömät solut (luistetaan joka ,3.-4. päivä, sentrifugoidaan pohjalle, suspendoidaan uudelleen uuteen alustaan, joka sisältää kyseeseen tulevan tekijän, ja maljataan uudelleen. Määrityksiä varten, joissa inkubointi kestää yli 7 päivää, solut siirretään suurempiin muovisiin soluviljelmäastioihin, jotta kaikkien kiinnittämättömien solujen konsentraatio pysyisi alle 5 x 10^ solua/ml. Inkuboinnin loputtua solut pestään kaksi kertaa ja suspendoidaan uudelleen DME-alustaan (ilman täydentäviä aineita) ja injisoidaan kuolettavasti säteily-tettyjen C57B1/6 hiirten häntälaskimoon. Solut injisoidaan käyttämällä joko tietty määrä eläviä soluja tai tietty tijavuusjae viljelmästä. 9-12 päivää injisoinnin jälkeen pernat poistetaan ja laitetaan Borin'in kiinnittimeen (Ma 1 linkrodt. , St. Louis, MO). Pernapesäkkeistä lasketaan pernan pinnalla olevien näkyvien nodulien määrä leikkaus-·1· mikroskoopin (4x) avulla.

• · 1

Humaanin mu 11 i - CS1 : n ja MCGF cDNA:n eristäminen * 1 Jyrsijägeenien DNA-klooneja on käytetty identifioimaan ···· ja eristämään DNA:ta, joka koodaa homologisia ihmisgeenejä.

·.·.1 Koska ihmisen ja jyrsijän geenien välinen homologia on suhteellisen vähäinen, hybridiso intiolosuhteita on lieven- :1·.· ncttävii niin, että voidaan tehdä ristihybridisointi sek-venosien välillä, jotka ovat vain 75-80-prosenttisesti homologisia. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi on käytetty * ’1 useita erilaisia koeohjeita. Esimerkiksi ihmisen C^-immu- ’·1·" nog lobuii inin kevyen ketjun geeni on eristetty käyttämällä koettimena vastaavaa hiiren Ck-geeniä (Heiter, P. et ai. , · 21 37 802

Cell 22: J97-207 /1981/) ja hiiren transplantaatioanti- i)cen icjeen.il on eristetty hybridisoimalla DNA-klooneihin, jotka koodaavat humaanivastineitaan (Steinnetz, T. et a 1 , Cell 24: 125-134 /1981/).

1 räässä suositellussa menetelmässä maljataan humaani-d'Miom j - DNA-k i r j a s l o s t a (Maniatis, T. et al . , "Molecular 1 luiuiHj, A I abu r a t u r y Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Δ Λ o'. S . A , / 1982/) saatuja γ - fa a y i k 1 o one j a 2 x 10 - 5 x 10 plakkia l 3 U mm maljaa kohti sopivaan isäntäkantaan, kuten I .cull LL 392 bakteereihin. Yleensä riittää 10 - 20 maljaa.

Maljoja inkuboidaan 10 - 12 tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen ^ 'ail.ii pidetään jääkaapissa kaksi tuntia ja sen jälkeen lukaisen maljan uyar-pinnalle laitetaan 132 mm nitrone I !u1uosasuodaLin. Suodattimen annetaan pysyä kosketuksessa maljan kanssa vahuitaan 5 minuuttia, jona aikana suodattimet merkit aan maljoihin puhkaisemalla värillä täytetyllä numero 22 neula! ia. Olmi jälkeen suodattimet irroitetaan maljoilta m ni i. I. ä j nkubo .1 tlaan peräkkäin vähintään 2 minuuttia ensin '2 5 0 ml seosta, jonka koostumus un 0,1 N N a OH, 0,5 M NaCl ; ja sen jälkeen 250 ml :ssa seosta, jonka koostumus on 0,5 M iris.llCi, pH 7,5, 1,5 M NaCl. Suodattimet kuivataan paperi-)*’ pyyhkeillä ja sen jälkeen niitä paistetaan 4 - 8 tuntia ; ’; ’ · 8 U ° C : s s a .

Hybridisointia varten suodattimet kostutetaan lx SET-liuoksella (0,15 M NaCl, 30 mM Tris.HCl pH 8,0, 1 mM Na^EDTA) ja tämän jälkeen inkuboidaan 2 tuntia 65°C:ssa (1,5-2 m 1/suodatin) koko ajan sekoittaen liuoksessa, jonka koostumus eii 3x SEI, 5x Denhardt'in liuos (Denhardt, D.T., B.B.R.C.

: : - 2>: 6 4 J-446 /1966/), 10 % dekstraanisulfaatti, 0,1% natrium- ;·, i|(kIc k y y 1 l s n 1 laa I ( i (SOS), 30 ug/ml poly (rA), 50 ^ug/ml ... po lv v rC ) ja 3 h ui|/m L puiy ( rG) . Sen jälkeen tämä liuos in· ilot aan po i s ja suodattimia hybr idiooidaan 1 tunti 65°C:88a käyttämällä i), 3 mi ( · 1U^ cpm) nick-transioitua hiiren 22 37802 DNA-koetinta samassa liuoksessa (uusi) (1,5-2 ml/suodatin) ja tämän jälkeen 12-20 tuntia 55°C:ssa. Suodattimet pestään sen jälkeen peräkkäin yhden tunnin ajan 55°C:ssa lievästi sekoittaen seuraavissa liuoksissa: 3x SET, lx Denhardt'in liuos ; U,l?i SDS; ja lx SET, 0,1?ί SOS (10-15 ml/suodatin). Suodattimet kuivataan paperipyyhkei11ä ja sen jälkeen ,i u I o r a d i o rj r a (o i da a n 12-24 tuntia käyttämällä sopivaa vahvistavaa varjostinta. 11ybridisointiplakit poimitaan sen jälkeen a (ja r-levyil t a steriileillä pas teur-pipeteillä ja jokainen laitetaan 1 ml sian seosta, jonka koostumus on: 0,1 M NaCl, ti,Dl M Iris.HEI pH 7,5, 1U mm ljgCl9, 100 uy/ml gelatiini, ja Lisätään 50 ui kloroformia. Sen jälkeen, kun on pidetty vähintään 4-0 tuntia kylmässä, seulotaan faagit jokaisesta plakista uudelleen alhaisella tiheydellä (2000-4000 plakkiu/L5U mm malja) edellä kuvatun menetelmän kanssa identtisellä menetelmällä.

Positiivisesti hybridisoitune itä faagiklooneja, kun tämä un ensin vahvistettu seulomalla uudelleen, voidaan sen jälkeen käyttää humaani-cDNA-kirjastosta saatujen satun-iki ispesäkkoiden soul onLukoe11imena samalla tavoin kuin edellä on kuvattu hiirisysteemin yhteydessä. Humaani-cDNA-kirjasto tulisi valmistaa käyttämällä sopivasta solui äh teestä, *:* kuten per i feria veren T-lymfosyy teistä saatua RNA:ta (kts.

Gray, P. et ai . , Nature 295: 503-508 /1972/). Täyspitkät IV. cDNA-kloonit voidaan sen jälkeen identifioida ekspressoimalla .·. Los-7 soluissa, mikä jälleen tehdään samalla tavoin kuin

*.*! hiiren cDNA-k loonien yhteydessä. Eristetyt ihmisen multi-CSE

cDNA-kloonit pystyvät ekspressoimaan tekijän, joka kykenee stimuloimaan ihmisen luuydinso 1uja.

• ♦ · **>* Ekspressio E.coli:ssa, hiivassa ja soluviljelmässä • # .···_ Prnkaryoot.it, kuten E .co 1 i , sopivat erittäin hyvin esillä olevan k e k s 11 n iin i mukaisten poly pept idien ekspressoimiseen (kis. esimerkiksi II5-pateIitit 4,338,397 ja 4,411,994) : edellyttäen, että ylyko 1 ysaa1101a ei haluta. Korkeiden as 87802 el< s p r o s s i o t a s o j e n saavuttamiseksi tulisi käyttää promoottoreita, kuten β-laktamaasi (penisillinaasi) ja laktoosi-p r o m o o L t o r i s y s t e e m e i t ä (Chang et ai . , Nature, 275: 615 /19 78/,· l takura et ai. , Science , 198 : 1056 /1977/; Goddel c L a 1 ., Nature 2 81: 344 /1979/ tai tryptofaani (t r p ) -j i r o mo u 11 o r L s y s L e e m i ii (Goeddel et ai . , Nucleic Acids Res. , ti: 4U57 / 19 80/). Nämä ovat kaikkein yleisimmin käytettyjä n roinou 11 o re i t a , (nuttu saatavissa un myös muita mikrobi-pi Hiiliini Lonu l a .

,\lun ammattimiehet tietävät, että proteiinin tuottamisessa voidaan käyttää myös prokaryoottien lisäksi eukaryoottisia mikrobeja, kuten hiivaa. Parhaana pidetty eukaryoottinen mi k X o-organismi on Saccharomyces cerevisiae. Sopiviin promoottorisekvenssoihin hiivavektoreissa kuuluvat 3-fosfo-g1ys era att ikin a a sin promoottorit (Hitzeman et ai., J.

Hioi . them., 255: 2073 /1980/) tai muiden glykolyyttisen entsyymien promoottorit (Hess et ai., J. Adv. Enzyme Reg., /: 149 /1968/; Holland et ai. , Biochemistry, 17: 4900 /1978/). Voidaan käyttää myös muita promoottoreita, joiden lisäetuna on, ('Itä kasvuolosuhteet, kontrolloivat transkrip-’ min. Periaatteessa sopiva ori mikä tahansa plasinidi vektori , ·”· joka sisältää hiivan kanssa yhteensopivan promoottorin, ! i‘pl xkaal ion alkukohdan ja te rini n aa t i o sek v ens s i t .

.. ! ii 1 kru-organlsmien lisäksi isäntinä voidaan käyttää myös ] soluviljelmiä, jotka on saatu monisoluisista organismeista *··· (erityisesti nisakässoluis ta ) . Esimerkkejä tällaisista hyödyllisistä isäntasolulinjoista ovat HeLa-solut, kiinalaisen hamsterin munasarjan solulinjat ja nuoren hamsterin munuais-: solulinjat. Tällaisten solujen ekspressiovektorit sisältävät ;*)*_· Luvallisesti tarvittaessa replikaation alkukohdan, ekspres-snitavan geenin edellä sijaitsevan promoottorin sekä mahdol-• " L Isosti Lärvit l avat ribosotnin sitoutumiskohdat, RNA:n ’·;·* ka t ka i sukulula t , pu 1 y ude 1 y duin l ikoiidat ja transkr ip t ionaa 1 ise t *:··: l erin inaa 11 or i se k v e us s i L . Nisäkäs solu is sa käytettynä ekspres- s i o v e k t o risa a on usein virus aineen antamia kontrolli- *« 87802 funklioita. Yleisesti käytetyt promoottorit ovat esimerkiksi peräisin polyoma, Adenovirus 2 ja kaikkein useimmiten 51/-4 0 viruksista, (kts. yleisesti U.S.P. 4,399,216, W0 81/02425 ja WU 83/03239).

tsillä olevan keksinnön mukaisten cDNA-kloonien ekspressoi-miseksi E.coli bakteerissa fuusioidaan sopivat promoottorit (esim. trp, lac, tae, YpL, jne.) ja Shine-Dalgarno'n sekvenssit niiden plasmidien koko koodaussekvenssin kanssa, joissa on ATG-kodoni parhaiten signaalipeptidin katkaisukohdan edessä. Tarkemmin sanoen MCGF:n tai multi-CSF:n cDNA-klooni, esimrkiksi pcD-MCGF, digestoidaan ensin PstI ja XhoI endonuk-leaasilla ja noin 1 kb segmentti, jossa on koko proteiinia koodaava sekvenssi, alikloonataan sopiviin E.coli ekspres-siovektoreihin proteiini- ja signaalisekvenssin ekspres-soi m laeksi. Vai h toe ti toisesti voidaan vain valmiin proteiinin ekspressoimiseksi segmentti alikioonata M13mp8 Pst I - ja b a 1 1-endonukleaasikohtiin. Yksisäikeinen M13mp8 DNA, joka sisälLää proteiinia koudaavan sekvenssin komplementti säikeen, yhdiste tään synteettisen oliyonukleotidin kanssa ja sen jälkeen syntetisoidaan Klenoui'in fragmentin avulla kaksi-siiikeinen proteiinia koodaava sekvenssi. Digestoidaan ····* N e o 1 - e n d o n u k 1 e a a s lila ja käsitellään Sl-nukleaasilla , *..ί ininkä jälkeen tasapäinen DNA-segmentti, joka sisältää kaksisäikeisen MCGl :a koodaavan sekvensin tai multi-CSF:a koodaavan sekvenssin, insertoidaan sopivaan ekspressio- ··· vektoriin, kuten pDR54Q-vektoriin, jossa on tac-promootori ; (kts. Russel, D.R. ja Bennett, G.N., Gen 2j), 231-243 /1982/); ja deBoer, H. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80, . . 21-23 /1983/). (Kts. yleisesti Messing, J. et ai., Proc.

Nat. Acad. Sei. U.S.A, 7ji, 3642-3646 /1977/); Gronenborn, ** B. ja Messing, Nature 272: 375 /1978/; Messing, J.

: ·.. et ai . , Nucl . Acid Res. 9, 309 /1981/; ja Messing, J.

ja V ieira, j., Gone 19, 269-276 /1982/).

* * · MCGI - tai muiti-CSt cDNA-kloonin ekspressoimiseksi hiivassa • ·* eristetään pcD-MCGF piusmidista Pstl-XhoI-fragmentti, 25 3 7 8 0 2 jossa cDN A-1 n se r L t i , ja kloonataan tämän jälkeen pUC8 Pstl-Sall-kobtiin. Saatu plasmidi B8/pUC8 katkaistaan f' s 11 : 11 ä ja digestoidaan Bal 31 : llä , mikä poistaa cDNA:n vastapuolella olevan oligo (dG:dC) kappaleen. Xhol-linkkeri kiinnitetään Val31-digestoituun DNA:an ja plasmidit otetaan t.co 1i ' in . Deletion koko määritetään analysoimalla transform-nunl.il . XhoI-EcoRI-fraqmentti (jossa on MCGF tai multi-CSF cDNA) eristetään sen jälkeen yhdestä deletiojohdoksesta, jossa tulisi olla noin 20 emäsparin deletio, ja kloonataan ρΑΑΗ5:η Hindi 1I-kohtaan ja pAAR6:n EcoRl-kohtaan käyttämällä Klenow'in fragmenttia ja tasapää-ligaatiota. (puC8 on H13 m p 7 -p e r ä i n e n systeemi, joka on hyödyllinen insertiomu-tageno ι nnls sa ja sekvenssoitaessa synteettisten yleispri-[ii ee Lieri kanssa: Kts. Vieira, J. ja Messing, J., Gene 19: 239-268 /1982/); pcD-X:n suhteen, kts. Okayama, H. ja liery, P., Moi. Cell. Biol. 3: 280-289 /1983/); pAAH5 ja μ A A H 6 oval mi van ekspressiovektoreita, joissa on A D C1-promoottori ja -1erminaa11ori : Ammer, G., "Expression of Genes m Yoasl using the ADC I promoter", Methods in l.n/yinoloyy , ill 1. : 192-210 /1982/).

Puhdistaminen ja formulaatiot « » * *

Multi-CSF- ja MCGF-polypeptidit, jotka ekspressoitu *·»* E.coli:ssa, hiivassa tai muissa soluissa, voidaan puhdistaa • · · * - ...* alan standardimenetelmillä, mukaanlukien saostamalla ammo- * niumsulfaatilla, fraktioimalla pylväskromatograafisesti ·· · ··· (esimerkiksi ioninvaihto, geelisuodatus, elektroforeesi, * * *·*.* a f f ι n i t ee 111 k r oma t og r a f ia jne.) ja lopuksi kiteyttämällä (kts. yleisesti "Enzyme purification and Related Techniques", :/.: Methods in Enzymology, 22: 233-377 /1977/). Keksinnön :*·*; mukaisia μ o i y μ ep f i de j ö , jotka ensin on puhdistettu joko luittani kai homogeenisuuteen asti, voidaan käyttää farma-‘1M se ui. I isissä seoksissa (kts. jäljempänä), esiemrkiksi ruoan- ·/ sulatuskanavan parasii11i-in fektio iden hoitamiseen tai *:**: tutkimustarkoituksiin, esimerkiksi hematopoeettisten alustojen **·*· ι u ι sy ϋ t t ciso lua i u s L o j en sup 1 emon 111 n a ja antigeenisenä m 87802 aineena, valmistettaessa spesifisiä immunoglobuliineja, jotka ovat hyödyllisiä iinmunomäärityksissä, immuno-ΓJuorcsenssivärjayksissä jne. (kts. yleisesti "Immunological Methods", Voi». 1 & 11, toim. Lefkovits, 1. ja Pernis, B., Academic Press, New York, N.Y. /1979 & 1981/; ja "Handbook of Pxper iinental Immunology", toim. Weir, L)., Blackwell Scientific Publications, St. Louis, MO /1978/).

farmaseuttisten seosten valmistamiseksi, jotka sisältävät tämän keksinnön kuvaamia polypeptidejä, nämä polypeptidit seostetaan sekoittamalla ne parhaiten inerttien, farmaseuttisesti hyväksyttävien kantajien kanssa. Sopivat kantajat ja niiden valmistusmenetelmät ovat alalla yleisesti tunnettuja (kts. esim. Remington's Pharmaceutical Sciences ja U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company,

Loston, PA /1980/). Parenteraalista antamista pidetään parhaimpana, iässä antami stavassa voidaan käyttää myös moka »nisiä an t ami s j är j es t e Imi ä .

Farmaseuttinen seos on parhaiten yksikköannostusmuodossa.

Fail öisessä muodossa valmiste on jaettu yksikköannoksiin, jotka sisältävät sopivat määrät aktiivista komponenttia.

··* Aktiivisen yhdisteen määrä valmisteen yksikköannoksessa < ··· voi vaihdolla tai se voi olla säädetty välille 1 Aig - ti»· LUO mg riippuen kulloinkin käytetystä applikointitavasta »Il jo aktiivisen ainesosan tehosta. Seos voi haluttaessa * sisältää myös muita terapeuttisia aineita.

ψ * ·

Annostukset voivat vaihdella riippuen potilaan tarpeista, im i de11 avan tilan vakavuudesta ja kulloinkin käytetystä ·/·; y lul i »teosta . Uikeun annostuksen määrittäminen kulloinkin : : : kyseessä olevaan tilanteeseen on alalla tunnettua. Yleisesti sanoen hoito aloitetaan käyttämällä pienempiä annostuksia, jotka ovat pienempiä kuin yhdisteen optimaalinen annos.

**·* Sen jälkeen annostusta lisätään pienin lisäyksin, kunnes *"*! saavutetaan optimaalinen vaikutus näissä olosuhteissa.

: · : Käytön helppouden vuoksi voidaan päivittäinen kokonaisannostus < · « 87802 haluttunsa n jakaa ja antaa annoksittain päivän aikana.

Stuirauvn t kokeita knskeva i π f ormau lio ja koetulokset on annettu es imerkkιmäisesti ilman rajoittavaa tarkoitusta.

KOKEELLINEN OSA

A. Kloonatut indusori-T-solut 1) T-solujeri (Cl.Ly l+2-/9 (ATCC numero CRL 8179) kloonia, junka fenotyyppi on Thy 1+ Ly 12”, pidetään jatkuvasti 0,5 x 10^ solua/ml konsentraatiossa DME-alustalla (Dulbecco's Modified Cagle's medium), jossa on 10 % lämmön avulla maktivoilua vu s i ka ns l k i ös ee r umi a , 5 x 10~^ M 2-ME, 2mM i| ! ut iinii m i n , e i - v a 11. tämä t tiimi ä aminohappoja ja välttämättömiä vitamiineja, ja joka on käsitelty 25 %:lla supernatant teja, jotka on saatu hiiren ConA-aktivoiduista Balb/c pernasoluista.

2) Cl.Ly l + 2~/9 solujen ConA-aktivointi: Soluja viljellään 5 x 10^/ml konsentraatiossa DME alustalla, jossa on 4 % lämmön avulla inakl ivoitua vauikansikiöseerumia, 5 x 10” I! 2-ML , 2 md ylutainiinia, e i - v ä 111 ämä 11 öm i ä aminohappoja, ···♦ välttämättömiä vitamiineja ja 2 ug/ml ConA. Sen jälkeen, 0 kun on inkubaitu 12-14 tuntia 37°C:ssa 10-prosenttisessa • · hiilidioksidissa, solususpensio sentrifugoidaan 10 minuutin Γ’*ί ajan nopeudella 1500 rpm. Solupelletit otetaan talteen ·;· ja jäädytetään välittömästi -70°C:ssa. Supernatant it suoda- telaan (N a 1 gene - 0,2 2 mikronia) ja säilytetään -20°C:Ssa kasvutekijöiden lähteenä. Supernatant tien tasaosista määri- . . tetään MCGE-ak11ivisuus (kts. jäljempänä) ja vahvistetaan • · näin linjan indusoituminen ConA-kasitte1yn avulla.

# · · ·*·„ 13. Kloonatut syöttösolut 0 * · ! * * • 0 ]) Syöttosolulinja (MC/9) (ATCC numero CRL 8306) kloonattiin ’· ‘ r a j a 1 a i me n t ama 1 ia 13 päivän ikäisen hiirensikiön maksasta • « 0 * * · *· 87802 DME-alustalla, joka sisälsi 4 % lämmön avulla inaktivoitua vasikansikiöseerumia (FCS), 5 x 10^ M merkaptoetanolia ja 2 mM glutamiinia ja joka oli käsitelty ConA-aktivoidulla Balb/c-pernasoluilla (Nabel et ai., Nature 291: 332-334 /1981/). Solukloonilla on pintamembraanin glykoproteiinien suhteen Thy 1“, Ly l-, 2~, Ly 5+ fenotyyppi.

2) Syöttösolujen klooni pidetään jatkuvasti yllä 16-18 tunnin kahdentuniisa joi 1 la DME-alustalla , jossa on 10 % Järnmön avulla inaktivoitua vasikansikiöseerumia, 5 x 10”^ M 2-merkaptoetano 1 ia ja 2 mM glutamiinia, ei-välttämättömiä aminohappoja ja välttämättömiä vitamiineja ja joka on täydennetty 5 /“0:11a supernatanttia, joka on saatu ConA-aktivoidusta indusori-T-solukloonista (kts. edellä). Syöttö-soluklooniri kasvu riippuu aktiivisesta kasvutekijästä (tekijöistä), joka on saatu stimuloitujen Cl.Ly l+2”/9 solujen supernatantista.

C. MCGF-aktiivisuuden biologiset määritykset 1. Määritys littämällä tritioitua tymidiiniä.

a) J x 1 ϋ^ MC/9 solua viljeltiin tasapohjaisilla mikro- t i i L t e r i le v y i 11 a 0,1 ml :saa DME-alustaa, joka sisälsi 4 % lämmön avulla inaktivoitua vasikansikiöseerumia, 5 x 10^ *·’; M 2-merkaptoetanolia, 2 mM glutamiinia, ei-välttämättömiä aminohappoja, välttämättömiä vitamiineja ja kaksinkertaistuvat ·» * * ·

Laimennukset testattavaa supernatanttia.

. . b) Levyt inkuboitiin 37uC;ssa 10-prosenttisessa hiilidiok- f · · äidissä. 20 tunnin kuluttua jokaiseen viljelmään isättiin * * * T.

V 0,5 pCi H-tyinidi miä (New England Nuclear, Boston, Mass.).

Neljän tunnin kuluttua solut kerättiin suodatinpaperiliuskojen päälle käyttämällä automaattista solujen keräysyksikköä.

• m · *. Kuivatut näytteet dιspondoitiin tuikeskintillaationesteeseen ja cpm-arvot La skn Itiin normaalilla β-laskurilla.

« · · 29 87802 2. Kulor imetrinen tetratsoliumsuola-määritys (MTT).

a) 1 x 10^ MC/9 solua viljeltiin tasapohjaisilla mikrotiit-Lc r i 1 e uy i 11 ä 0,1 ml ,-ssa DME-alustaa, jota oli täydennetty ku-tekijöillä ja testattavalla supernatantilla, kuten jii kuvattu k n hd a s s a 1) u).

b) Levyjä inkuboiliin 37°C:ssa 10-prosenttisessa CO^rssa.

20 tunnin kuluttua jokaiseen viljelmään lisättiin 0,01 ml 5 mcj/inl liuosta, joka sisälsi 5 mg/ml MTT (3-(4,5-di metyylit iät sol-2-yyli)-2,5-difenyylitetrasoliumbromidi, digma Chemical ('o., St. Louis, MO) fos faat t ipuskuroidussa suolaliuoksessa (PB5). Neljän tunnin kuluttua jokaiseen viljelmään lisättiin 0,1 ml 0,04 N suolahappoa isopropanolissa ja sekoitettiin hyvin. Muutaman minuutin kuluttua levyt luettiin Dynatech MR580 Microelisa Auto Reader lukulaitteella (Dynatech Instruments, Inc., Torrance, CA) aallonpituudella 370 nm (re ferenssiaallonpituus 630 nm) ja kaiibrointiase-tuksella 1,99.

D. mRNA:n eristäminen Cl.Ly l+2-/9 soluista.

). Solun kokonais-RNA eristettiin soluista käyttämällä .:. Cbirgwin’in et ai. , (Biochemistry, 18: 5294-5299 /1979/) : ·! yuani di ini - iso t iosy anaa t ti-menetelinää. 1 + , t * * indusoimattornista tai ConA-indusoiduista Cl.Ly l+2 /9 ··-· soluista saadut pakastetut solupelletit suspendoitiin ***** 0 *.*.* guanidi ini-isotiosyanaatti-lyysausliuokseen. 1-2 x 10 soluu kohti käytettiin 20 ml lyysausliuosta. Pelletit

: suspendoitiin uudelleen pipetoimalla, minkä jälkeen DNA

1 e 1 k k a u s k ä s i t e 11 i i n johtamalla neljä kertaa ruiskun läpi käyttämällä neulaa, jonka koko oli 16 gaugea. Lysaatti • ’* kerrostettiin 40 ml polyallomeerisentrifuugiputkeen 20 *···* ml päälle 5,7 M CsCl, 10 mM EDTA-seosta. Tätä liuosta ·:*? senlnfugoitnn 25.000 kierr./min. Beckman SW28 roottorissa ·'.*· ;Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA) 40 tunnin ajan 30 87802 15°C:ssa. DNA:ta sisältävä guanidiini-isotiosyanaattifaasi pipe toi ti in yläosasta alas välipintaan. Putken seinämät ja välipinta pestiin 2-3 ml:lla guahidiini-isotiosyanaatti-lyysausliuosta. Putki katkaistiin saksilla välipinnan alapuolelta ja CsCl-liuos dekantoitiin. RNA-pelletit pestiin kaksi kertaa kylmällä 70-prosenttisella etanolilla. Sen jälkeen pelletit suspendoiti in uudelleen 500 ul:aan puskuria (10 mM Tr is.HCl pH 7,4, 1 mM FDTA, 0,05 % SDS). Lisättiin 50 ui 3M natriumasetaattia ja RNA saostettiin 1 mlslla etanolia. RNA otettiin talteen sentrifugoima11a ja pelletit pestiin kerran kylmällä etanolilla.

2) Poly A+ mRNA:n eristäminen:

Pesty ja kuivattu kokonais-RNA-pelletti suspendoitiin uudelleen 900 uljaan oligo (dT)-eluointipuskuria (10 mM Tris.HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,5¾ SDS). RNA:ta kuumennettiin 3 minuuttia 68 °C:ssa ja jäähdytettiin sen jälkeen jäillä. Lisättiin 100 ui 5 M natriumkloridia. RNA-näyte vietiin 1,0 ml:n oligo (dT)-selluloosapylvääseen (tyyppi 3, Collaborative Research, Waltham, MA), joka oli tasapainoitettu sidepuskurilla (10 mM Tris.HCl pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,5 M NaCi, 0,5¾ SDS). Pylvään läpivirta johdettiin pylvään läpi vielä kaksi kertaa. Sen jälkeen pylväs pestiin 20 ml : 11a sidepuskuria . Poly A+ mRNA otettiin talteen pesemällä .11 e 1 u öin t lpusku r i 11 a . RNA eluoitui tavallisesti ensimmäisessä * 1' 2 inl: ssa eluointipuskuria. RNA saostettiin 0,1 tilavuudella j M natriumasetaattia (pH 6) ja kahdella tilavuudella etanolia. RNA-pelletti otettiin talteen sentr i f ugoimalla , pestiin kaksi kertaa kylmällä etanolilla ja kuivattiin.

Sen jälkeen pelletti suspendoitiin uudelleen veteen. Tasaosat laimennettiin ja määritettiin absorbanssiaallonpituudella * 260 nm.

• · • · • 1» * · · *...1 L. Poly A+ mRNA:n fraktiointi sakkaroosigradientti- ·;1·· sentri f ugoinnin avulla: • · · • t « · 3' 37802 100 ^j1 liuosta, joka sisälsi 100 jig kohdasta 0. 2) saatua poly A+ mRNA:ta, kuumennettin 1 minuutti 65°C:ssa ja sen jälkeen kerrostettiin 10 ml päälle 5-25 % sakka-roosigradienttia (10 mM Tris.HCl pH 7,4, 100 mM NaCl, ja 1 mM EDTA). Gradientti sentrifugoitiin Beckman SW41 roottorisun 26.000 kierr./min. 19 tuntia 5°(':ssa. Rakeita otettiin talteen 450 /ui, säästettiin 2 tilavuudella etanolia ja suspendoiti in uudelleen injisointia varten oosyytteihin (kts. jäljempänä). Rinnakkainen gradientti kerrostettiin edellä kuvatulla tavalla sentrifugoidulla radio-leimatun (^H-uridiinin) ja ribosomaalisen RNA:n (BRL, Bethesda, MA) seoksella ja tuikelaskimessa laskettiin 450 jJl jakeet.

Xenopus oosyytteihin injisoinnin jälkeen saatiin koon perusteella fraktioidusta poly A+ mRNA:sta MCGF-aktii-visuuspiikki , joka kolorimetrisen määrityksen perusteella sedimentoitui hitaammin kuin IBS, kuten on esitetty kuviossa 2. Nämä jakeet olivat rikastuneet noin 10-kertaisesti MCGF-mRNA:n suhteen ja niitä käytettiin myöhemmin P-leimatun cDNA-koettimen valmistamiseen.

F. Oosyyttien injisointi ‘"1 Oosyytit poistettiin naaraspuolisista Xenopus laevis:sta ja inkuboitiin Barth'in liuoksessa (88 mM NaCl, 1 mM KC1, 0,33 mM Ca(N03)2, 0,41 mM CaCl2, 0,82 mM MgSO^, : 2,4 mM NaHCO^, 10 mM HEPES (pH 7,9) (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO). Valmistettiin 2-3 oosyytin in jektiorypäleet . : : : RNA-näytteet injisoitiin liuotettuna injisointipuskuriin (40 mM Tris.HCl pH 7,4, 0,35 M NaCl). Totaali poly A+ : mRNA suspendoitiin uudelleen in jisointipuskuriin 500 -·. jjg/ml konsentraatiossa, kun taas RNA-näytteet, jotka oli eluoitu hybridiselektioista (kts. jäljempänä) saaduista ; *·· DNA-suodattimista, ja jotka aina sisälsivät kantaja 5 ug vasikanmaksan tRNAjta, suspendoitiin uudelleen 2 Risaan in j isointipuskuria . Jokaiseen oosyyttiin injisoitiin 40 nl määrät käyttämällä käsin vedettyjä mikropipette j ä, 32 87802 joiden kärjet oli vedetty mikrovetolaitteen avulla. Pipetit kalibroitiin tunnetuilla tilavuuksilla steriiliä vettä. Jokaista mRNA-näytettä kohti injisoitiin noin 30-40 oosyyt-tiä. Injisoituja oosyyttejä inkuboitiin kahden tai kolmen ryhmissä 96-kaivoisten mikrotiitterimaljojen yksittäisissä kaivoissa, jotka sisälsivät oosyyttiä kohti 10 ^Jl Barth'in liuosta + IS naudanseerumialbumia. Oosyyttejä pidettiin 4B tuntia 19°C:tuiu ja uen jälkeen otettiin La J lemt ja yhdistettiin supernutuntit eläviä oosyyttejä sisältävistä kaivoista. Nämä supernatantit steriloitiin sentrifugoimalla 10 minuuttia mikrosentrifuugissa ja sen jälkeen niistä määritettiin edellä kuvatulla tavulla MCGF-aktiivisuus. Vertailuna otettiin aina talteen supernatantit injisoi-mattomista oosyyteistä.

Taulukossa I on esitetty määritystulokset käsittelemättömistä tai ConA-stimuloiduista Cl.Ly l+2~/9 soluista talteenote-tuista supernatanteista. Kaikkien näytteiden, mukaanlukien vertailustandardi, titraus suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Yksi MCGF-yksikkö on se tekijämäärä, jolla päästään 15 %:iin siitä ^H-tymidiinin maksimaalisesta liittymismää-rästä, joka saadaan käyttämällä Cl.Ly l+2”/9 supernatanttia.

TAULUKKO I

.1 Cl. Ly l + 2~/9-tuottama MCGF-aktiivisuus ( yksikköä/ml)

*··· Solu supernatantti Injisoitu mRNA

ilman ConA 50 40

ConA:n kanssa 26.3B3 1.403 G. cDNA-kirjaston muodostaminen: .··. 1) Vektoriprimeerin ja oligo dG-häntäisten 1inkkeri-DNA- • _ lajien valmistaminen: ·· » : V Okayama & Berg’in (Mol. & Cell. Biol. 2: 161-170 /1982/) 33 8 7 8 02 menetelmää käytettiin vain vähäisin muutoksin ja sovitettuna Okayama & Berg'in /Mol. & Cell. Biol. 3: 380-389 (1983/ kuvaamiin pcDVl- ja pLl-plasmideihin.

80 ug näyte pcDVl DNArta digestoitiin 30°C:ssa 20 yksikön kanssa Kpnl endonukleaasia 430 pulissa, jonka koostumus oli: 6 mM Tris.HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 6 mM NaCl, 6 mM 2-ME ja 0,1 mg BSA (naudanseerumialbumiini) ml:ssa.

16 tunnin kuluttua digestointi päätettiin 40 ul:lla 0,25 M EDTAita (pH 8,0) ja 20 ulilla 10% natriumdodekyylisul-faattia (SDS); DNA otettiin talteen sen jälkeen, kun ensin oli uutettu vedellä kyllästetyllä (1:1) fenoii-CHCl^illa (jäljempänä kutsutaan fenoli-CHCl^:ksi ) ja saostettu etanolilla. Homopolymeerihännät, joissa oli keskimäärin 60 mutta enintään 80 deoksitymidylaatti (dT) tähdettä päätä kohti, lisättiin seuraavalla tavalla:

Vasikan kateenkorvan avulla terminaalisen transferaasin avulla Kpnl endonukleaasilla muodostettuihin päihin: Reaktioseoksen (38/Jl) koostumus oli: natriumkakodylaatti-30 mM Tris.HCl pH 6,8 (puskuri), sekä 1 mM C0C12, 0,1 mM ditiotreiloli, 0,25 mM dTTP, Kpnl endonukleaasilla digeutoilu DNA, ja 68 U terminaalinen deoksinukleotidyylitransferaasi (P-L Biochemicals, Inc., Milwaukee, WI) . Sen jälkeen, kun oli pidetty 30 minuuttia 37°C:ssa, pysäytettiin reaktio 20 ulilla 0,25 M EDTA:ta (pH 8,0) ja 10 #ul:lla 10-prosentista ; natriumdodekyylisulfaattia ja useiden fenoli-CHC1^-uuttojen jälkeen DNA otettiin talteen saostamalla etanolilla.

Sen jälkeen DNA:ta digestoitiin 5 tuntia 37°C;ssa 15 ./ yksiköllä EcoRl endonukleaasia 50 ulissa seosta, jonka koostumus oli: 10 mM Tris.HCl pH 7,4, 10 mM MgCl^, 1 :'·/ mM ditiotreitoli ja 0,1 mg BSA ml:ssa. Suuri fragmentti, joka sisälsi SV40 polyadenylaatiokohdan ja replikaation pBR322 alkukohdan ja ampisilliiniresistanssin geenin, pulidistettiin agaroosigeelielektroforeesilla (1%) ja otettiin geelistä talteen lasijauhemenetelmän (Vogelstein, :·' B. & Gillespie, D., Proc. Nat. Acad. Sei. 76: 615-619 3« 87302 /1979/) muunnelman avulla. dT-häntäinen DNA puhdistettiin edelleen absorboimalla ja eluoimalla oligo (dA)-selluloosa-pylväästä seuraavasti: DNA liuotettiin 1 ml:aan 10 mM Tris.HCl pH 7,3 puskuria, joka sisälsi 1 mH EDTA ja 1 M NaCl, ja joka oli jäähdytetty 0°C:een, ja vietiin saman puskurin kanssa 0°C:ssa tasapainoitettuun oligo (dA)-sellu-loosapylvääseen (0,6 x 2,5 cm). Pylväs pestiin samalla puskurilla 0°C:ssa ja eluoitiin vedellä huoneen lämpötilassa. Eluoitunut DNA saostettiin etanolilla ja liuotettiin 1 mM EDTA:n avulla 10 mM Tris.HCl pH 7,3 puskuriin.

Oligo (dG)-häntäinen linkkeri-DNA valmistettiin digestoimalla 75 |ig pLl DNA:ta 20 yksiköllä Pst 1 endonukleaasia 450 ul:ssa seosta, jonka koostumus ml kohti oli: 6 mM Tris.HCl pH 7,4, 6 mM MgCl^, 6 mM 2-ME, 50 mM NaCl ja 0,01 mg BSA. Reaktioseosta pidettiin 16 tuntia 30°C:ssa, minkä jälkeen se uutettiin fenoli-CHCl^:lla ja DNA saostettiin alkoholilla. Häntiin, joissa oli 10 - 15 deoksiguanylaatti (dG)-tähdettä, lisättiin sen jälkeen päätä kohti 46 yksikköä terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasia samassa edellä kuvatussa reaktioseoksessa (38 /-il), jossa kuitenkin dTTP oli korvattu 0,1 mM dGTP:llä. Seos pidettiin 20 minuuttia 37°C:ssa, minkä jälkeen se uutettiin fenoli-_*:* CHCl^:lla, DNA saostettiin etanolilla ja sen jälkeen :Y: digestoitiin 4 tuntia 37°C:ssa 35 yksiköllä Hindi11 endo- nukleaasia 50 ul:ssa, jonka koostumus oli: 20 mM Tris.HCl pH 7,4, 7 mM MgCl^, 60 mM NaCl ja 0,1 mg BSA. Pieni oligo . - (dG)-häntäinen linkkeri-DNA puhdistettiin agaroosigeeli-olokt rofortuts in (1,11¾) avulla ja otettiin laiteen edellä kuvatulla tavalla.

"·' * 2) cDNA-kirjaston valmistaminen: * »

Vaihe 1. cDNA-synteesi .

Reaktioseoksen (10 μ 1) koostumus oli: 50 mM Tris.HCl ; -* pH 8,3, 8 mM MgCl , 30 mM KC1, 0,3 mM ditiotreitoli, 35 87802 2 mM dATP, 2 mM dTTP, 2 mM dGTP ja 2 mM dCTP, 20 uCi 32P-dCTP (3000 Ci/mmol), 2 ug poly A+ RNA Con-A indusoiduissa Cl.Ly l+2-/9 soluissa, 60 U RNaasi (Biotec, Inc., Madison, WI), ja 2 ug vektori-primeeri DNA (15 pmol primeeripäätä) ja 45 U käänteistranskriptaasi. Reaktioseosta inkuboitiin 60 minuuttia 42°C:ssa ja sen jälkeen reaktio pysäytettiin lisäämällä 1 ui 0,25 M EDTA (pH 8,0) ja 0,5 jJl 10?i SDS; lisättiin 40 ui fenoli-CHCl^ ja liuos sekoitettiin voimakkaasti Vortex-sekoittimessa ja sen jälkeen sentrifugoitiin. Vesifaasiin lisättiin 40 jul 4 M ammoniumasetaattia ja 160 ui etanolia, minkä jälkeen liuosta jäähdytettiin 15 minuuttia kuivajään avulla, jäähdyttämisen jälkeen saostuneet reagoimattomat deoksinukleosiditrifosfaatit liuotettiin lämmittämällä huoneen lämpötilaan ja samalla varovasti ravistellen. Tämän jälkeen sentrifugoitiin 10 minuuttia Eppendorf-mikrofuugissa. Pelletit liuotettiin seokseen, joka sisälsi 10 μΐ 10 mM Tris.HCl pH 7,3 puskuria ja 1 mM EDTA, sekoitettiin 10 μ1:η kanssa 4 M ammoniumase-taattia ja saostettiin 40 pililla etanolia. Tällä menetelmällä poistettiin reagoimattomista deoksinukleosiditrifosfaateista yli 99 %. Pelletti huuhdeltiin etanolilla.

Vaihe 2: Oligodeoksisytidylaatin /oligo (dC)/ lisääminen.

’· ' Plasmidi-cDNA:mRNA:n sisältävä pelletti liuotettiin 20 . pl:aan 140 mM natriumkakodylaatti-30 mM Tris.HCl pH 6,8 • ·' puskuria, joka sisälsi 1 mM CoCl^, 0,1 mM ditiotreitolia, 0,2 pig poly(A), 70 pM dCTPS, 5 pCi 32P-dCTP, 3000 Ci/mmol ja 60 yksikköä terminaalista deoksinukleotidyylitransfe-raasia. Reaktio suoritettiin 37°C:ssa 5 minuutin ajan, : · ; joka mahdollisti 10 - 15 dCMP-tähteen lisäämisen päätä kohti, ja sen jälkeen päätettiin reaktio 2 ulilla 0,25 M EDTA (pH 8,0) ja 1 yjltlla 10¾ SDS. Uutettiin 20 pilrlla fenoli-CHCl^, minkä jälkeen vesifaasi sekoitettiin 20 pl:n kanssa ammoniumasetaattia, DNA saostettiin ja saos· "··: tettiin uudelleen 80 ulilla etanolia. Lopullinen pelletti a» 87802 huuhdelttiin etanolilla.

Vaihe 3: Hindi 11 endonukleaasi-digestio.

Pelletti liuotettiin 30 uljaan puskuria, jonka koostumus ml kohti oli: 20 mM Tris.HCl pH 7,4, 7 mM MgCl^, 60 mM NaCl ja 0,1 mg ~BSA. Sen jälkeen digestoitiin 2 tuntia 5 7 0 U : ti ti n JO ykaikui Ja Hindi I i endonuk.l uum: Lu . Renki jo lopetettiin 3 ul:llu 0,25 M EDTA:ta (pH 8,0) ja 1,5 ulilla 10 °ό SDS. Tämän jälkeen uutettiin fenoli-CHCl^: 11a ja lisättiin 30 yul 4 M ammoniumasetaattia ja DNA saostettiin 120 1 :11a etanolia. Pelletti huuhdelttiin etanolilla ja liuotettiin sen jälkeen seokseen, jossa oli 10 ^il 10 mM Tris.HCl (pH 7,3) puskuria ja 1 mM EDTA:ta. Jäätyminen -20°C-lämpötilaisen säilytyksen aikana estettiin lisäämällä 3 ;U etanolia.

Vaihe 4: Oligo (dG)-häntäisen linkkeri-DNA:n välittämä syklisointi 9 μ1:η näytettä Hindi1I endonukleaasilla digestoitua oligo (dC )-häntäistä cDNA : mRNA-plasmiidia. (90 % näytteestä) inkuboitiin 5 minuuttia 65°C:ssa seoksessa (90 pl), jonka koostumus oli 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl ja 1,8 pmol oligo (dG)-häntäinen linkkeri-DNA, minkä .1. jälkeen laskettiin 42°C:een 60 minuutiksi ja tämän jälkeen *' jäähdytettiin 0°C:een. Seos (90 ui) säädettiin 900 yul:ksi ·--· seoksella, jonka koostumus ml kohti oli: 20 mM Tris.HCl pH 7,5, 4 mM MgCl 10 mM (NH ) S04, 0,1 M KC1, 50 ug BSA ja 0,1 mM β-NAD; lisättiin 6 ^ug E.coli DNA-ligaasia ja liuosta inkuboitiin sen jälkeen yön yli 12°C:ssa.

Vaihe 5: RNA-säikeen korvaaminen DNAjlla.

·-* Insertin RNA-säikeen korvaamiseksi ligatointiseos säädettiin :* * niin, että se sisälsi 40 ^uM kutakin neljää deoksinukleo- 3? »7 802 siditrifosfaattia, 0,15 mM (3-NAD, 4 fig vielä lisättyä E.coli DNA-ligaasia, 16 yksikköä E.coii DNA-polymeraasia I (Poli) ja 9 yksikköä E.coli RNaasia H, Tätä seosta (960 /ui) inkuboitiin peräkkäin 12°C:ssa ja huoneen lämpötilassa kussakin 1 tunti tarkoituksena edistää optimaalista korjautumissynteesiä ja nick-translaatiota Poli:n avulla.

Vaihe 6: E . coli 1 in transformointi

Trans formointi suoritettiin käyttämällä Cohen'in et ai, (Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 69: 2110-2114 /1972/) kuvaamaan menetelmää pienin muunnelmin. E.coli K-12 kania MC1Q61 (Casadaban, M. ja Cohen, S., J. Mol. Biol. 138; 179-207 /1980/) kasvatettiin 0,5 absorptioyksikön (600 nm) tiheyteen 37°C:ssa 20 ml:ssa L-lientä. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla, suspendoitiin 10 ml:aan 10 mM Tris.HCl pH 7,3 puskuria, joka sisälsi 50 mM CaCl^, ja sentrifugoitiin 5 minuuttia 0°C:ssa. Solut suspendoitiin uudelleen 2 ml:aan edellä mainittua puskuria ja inkuboitiin jälleen 5 minuuttia 0°C:ssa; sen jälkeen 0,2 ml:n kanssa solususpensiota sekoitettiin 0,1 ml DNA-liuosta (vaihe 5) ja inkuboitiin 15 minuuttia 0°C:ssa. Tämän jälkeen soluja pidettiin 2 minuuttia 27°C:osa ja tämän jälkeen 10 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen lisättiin -Z 0,5 ml L-lientä ja viljelmää inkuboitiin 30 minuuttia .' 37°C:ssa, sekoitettiin 42°C:ssa 2.5 ml:n kanssa L-liemen * pehmeälle agarille ja levitettiin L-liemen agarille, joka sisälsi 50 /ug ampisilliinia ml:ssa. Inkuboitiin .'. 37°C:ssa 12 - 24 tuntia ja pesäkkeet poimittiin steriileillä hammastikuilla.

Muodostui noin 1 x 10^ riippumatonta cDNA-kloonia, joista yksitellen poimittiin 10.000 kloonia ja siirrostettiin nämä mikrotiitterilevyjen kaivoihin, jotka sisälsivät ;· 200 /ui L-lientä, 50 /jg/ml ampisilliinia ja 7 % DM50.

Muodostui noin 1000 kloonin sattumapoolil, ja valmistettiin.

38 8 7 8 0 2 plasmidi-DNA-hybridien selektiokokeita varten.

H. Hybridiselektiot.

Hybridiselektiot suoritettiin kahdeksalla cDNA-plasmidival-misteella, jotka otettiin edellä kuvatuista sattumapooleista.

1) DNA-suodattimien valmistaminen

Kaikki plasmidi DNA-lajit linearisoitiin digestoimalla Clal:llä ennen sitomista nitroselluloosasuodattimiin. Digestiot suoritettiin 50 jjl:ssa seosta, jonka koostumus oli: 10 mM Tris.HCl pH 7,9, 10 mM MgCl^, 10 jjg plasmidi-DNA, 50 mM NaCl ja 10 yksikköä Clal. Inkuboitiin 2 tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen näytteet laimennettiin 200 ul:ksi TEillä (10 mM Tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) ja uutettiin yhtä suurella tilavuudella (200 ^ul) TE:llä kyllästettyä fenolia. Vesifaasiin lisättiin 20 yjl 3M natriumasetaattia (pH 6) ja tämä saostettiin 2 tilavuudella etanolia. DNA-pelletit otettiin talteen sentrifugoimalla ja sen jälkeen pestiin 70-prosenttisella etanolilla. Kuivattu pelletti suspendoitiin uudelleen 150 uljaan steriiliä vettä jokaista 10 jJl kohti DNA:ta. Jokaista ONA-näytettä kohti valmistettiin kaksoissuodattimet, 10 yjg DNA:ta suodatinta kohti. DNA 150 jJlissa vettä kiehutettiin 10 minuuttia, sen jälkeen lisättiin 150 ui IM natriumhydroksidia ja liuosta inkuboitiin 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Näyte jäähdytettiin jäillä, sen jälkeen lisättiin 150 jul IM HC1, IM natrium-kloridia, Q,3M natriumsitraattia ja 0,5M Tris.HCl pH

8,0 puskuria . 1 0,9 cm Millipore HAWP-suodattimet, jotka oli kostutettu !'· tislatulla vedellä, laitettiin Schleicher1in ja Schuell’in mikrosuoda tuslai t teeseen . Edellä saatu denaturoitu ja neutraloitu DNA-liuos suodatettiin sentrifugoimalla 5 minuuttia 500 kierr./min. Suodattimet pestiin 1 ml:lla 39 87802 6xSSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Na-sitraa11i ) ja sen jälkeen ilmakuivattiin, ennenkuin paistettiin 2 tuntia 80°C:ssa.

2) Hybridisoinnit

Hybridisoinnit suoritettiin 200 ul:ssa seosta, jonka koostumus oli: 65 % (v/v) uudistettu formamidi, 20 mM PIPES, pH 6,4, 0,4 M NaCl, 200 ug/ml vasikanmaksan tRNA ja 100 ug/ml polyA+ mRNA ConA-indusoiduista Cl.Ly l+2~/9 soluista. Jokaista hybridisointiliuosta kuumennettiin 3 minuuttia 70°C:ssa ja sen jälkeen kaksi DNA-suodatinta (10 /jg DNA/suodatin) leikattiin neljänneksiin ja lisättiin liuokseen. Hybridejä inkuboitiin 4 tuntia 50°C:ssa ja sen jälkeen inkuboitiin 4 tuntia 46°C:ssa ja 42°C:ssa.

Tämän jälkeen supernatantit poistettiin ja suodattimet pestiin kolme kertaa 1 ml:lla seosta, jonka koostumus oli: 10 mM Tris.HCl pH 7,4, 0,15M NaCl, 1 mM ED IA, 0,5 % SDS. Tämän jälkeen pestiin kolme kertaa 1 mlzlla samaa puskuria ilman SDS. Kumpaakin puskuria säilytettiin pesuja varten 65°C:ssa. Hybridisoidun mRNAm eluoimiseksi pikkupulloihin lisättiin 400 ui tislattua vettä ja 5 ug vasikanmaksan tRNA:ta. Putkia kiehutettiin 3 minuuttia ja sen jälkeen jäähdytettiin nopeasti kuivajää/etanolista. Näytteet '**; sulatettiin ja eluoitu RNA saostettiin 2 tilavuudella etanolia ja 0,1 tilavuudella 3M Na-asetaattia (pH 6).

• · *.1.1 RNA-pelletit otettiin talteen sentrifugoimalla ja pestiin • kaksi kertaa 70-prosenttisella etanolilla. Kuivatut pelletit :1 suspendoitiin uudelleen pl:aan oosyyttien injisointipuskuria ja koko näyte injisoitiin oosyytteihin (kts. edellä).

; Tällä tavoin seulotusta kahdeksasta lähtöpoolista useat ... olivat positiivisia ja jatkoanalyysiin valittiin 1 pooli, jossa MCGF-aktiivisuus oli korkein. Tämä pooli, joka : 1· muodostui 672:sta yksittäisestä kloonista, jaettiin edelleen neljäänteistä alipooliin, joissa kussakin oli 48 kloonia.

____: Näistä alipooleista saatu plasmidi-DNA käytettiin hybri- ^ sidiselektioiden toisessa sarjassa. Vain yhdestä näistä ** 87802 alipoleista saatiin positiivinen signaali. Sen jälkeen nämä 48 kloonia seulottiin jäljempänä kuvatulla tavalla pienennetyllä cDNA-koettimella.

I. Pienennetyn cDNA-koettimen valmistaminen 1) ^P-cDNA-synteesi : 2 pg polyA+ mRNAjta, joka oli saatu edellä saadun sakka- roosigradientin MCGF-huippujakeesta, suspendoitiin uudelleen 2 uljaan vettä. Tätä kuumennettiin 5 minuuttia 65°C:ssa, sen jälkeen lisättiin reaktioseokseen, jonka koostumus oli: 50 mM Tris.HCl pH B,3, 8 tnM MGC12, 30 mM KC1, 0,7 mM DTT, 1 mM dATP, 1 mM dGTP ja 1 mM dTTP, 34 uM dCTP, 10 ug/ml oligo-/12-18/-(dT) (Collaborative Research), 32 100 ug/ml Aktinomysiini D, 500 uCi a P-dCTP (Amersham, 3000 Ci/mmol) ja 150 yksikköä käänteistranskiptaasia (Life Sciences, Inc., St. Petersburg, FL), kokonaistilavuuden ollessa 100 ui. Inkuboitiin 2 tuntia 40°C:ssa, minkä jälkeen reaktioseoksesta poistettiin 0,5 ui, joka saostettiin 32 trikloorietikkahapolla liittyneen P-määrän määrittämiseksi. Sen jälkeen lisättiin 100 0,2 N natriumhydroksidia .:. ja RNA hydrolysoitiin kuumentamalla näytettä 20 minuuttia 70°C:ssa. Jäähdyttämisen jälkeen reaktioseos neutraloitiin 20 ul:lla 1 N suolahappoa ja lisättiin kantajana 4 ^j1 .li 1 mg/ml tRNA:ta. Näyte uutettiin kaksi kertaa yhtä suurella * *’ tilavuudella fenoli-kloroformia (1:1). Sen jälkeen se saostettiin yhtä suurella tilavuudella 4 M ammpniumasetaattia ja 2 tilavuudella etanolia. Pelletti suspendoitiin uudelleen 100 uljaan vettä, saostaminen toistettiin ja pelletti : pestiin kaksi kertaa 80-prosenttisella etanolilla.

2) Ensimmäinen pienentävä hybridisointi: : **: 32 *·· P-cDNA (syntetisoitiin kuten edellä) kerasaostettiin käyttämällä 20 jug polyA+ mRNA:ta WEHI-3:sta ja 20 jj! 41 37802 polyA+ mRNAjta B-soluhybridomasta. Pelletti suspendoitiin uudelleen seokseen, jossa oli 7 μΐ vettä, 1 ui 4 M Na-fos-faattia pH 7, 0,1 jjl 20¾ 5DS ja 0,1 ui 0,1M EDTArta, ja sen jälkeen koko näyte suljettiin kapillaariputkeen. Näytettä kuumennettiin 30 minuuttia 90°C:ssa, minkä jälkeen pidettiin 14 tuntia 68°C:ssa (Cot = 5000). Hybridisointiseos laimennettiin sen jälkeen 1 ml:ksi 0,12 M natriumfosfaatilla pH 7,0 ja 0,1% :11a 5DS ja seoksen lämpötila nostettiin 60°C:een. Seos vietiin sen jälkeen pylvääseen, joka sisälsi 0,4 g samassa puskurissa tasapainoitettua hydroksiapatiittia, ja pidettiin 60°C:ssa. Läpivirta otettiin talteen ja sen jälkeen pylväs pestiin 5 ml:lla samaa puskuria 60°C:ssa.

1 ml:n jakeet otettiin talteen ja kustakin jakeesta laskettiin 1 ul:n erät skintillaatiolaskimessa. Yksisäikeinen cDNA-piikki jakeessa 2, 3 ja 4 yhdistettiin. Tämä materiaali, 32 joka muodosti 66,5 % P-cDNA-lähtöaineesta, väkevöitiin 0,4 ml:ksi uutamalla 2-butanolilla ja sen jälkeen suolat poistettiin kromatograafisesti 2 ml:n Sephadex G-25-pyl-väässä.

3) Toinen pienentävä hybridisointi:

Edellä saatu näyte, josta suolat oli poistettu, väkevöitiin etanolisaostuksen avulla ja sen jälkeen kerasaostettiin ·’! käyttämällä 9,5 Jjg poly A+ mRNAsta indusoimattomista

Cl.Ly l+2~/9 soluista. Pesty ja kuivattu pelletti suspen-

• - doitiin uudelleen seokseen, jonka koostumus oli: 10 ui -- - vesi, 1,5 μΐ 4M natriumfos faatti pH 7, 0,15 ^1 20¾ SDS

· ja 0,15 ui 0,1 M EDTA. Näytettä inkuboitiin suljetussa kapillaariputkessa 30 minuuttia 90°C:ssa ja sen jälkeen 20 tuntia 68°C:ssa. Kromatografointi hydroksiapatiitilla toistettiin edellä kuvatulla tavalla. Yksisäikeinen cDNA, joka eluoitui pylväästä 60°C:ssa, muodosti 17 % lähtö- * *·* 32 ‘ aineista. Tällä P-cDNA:lla py1väshybridi soitiin 48 pesäkettä hybr ldioelekt ioiden ident i f innnausii alipooi iuua . t ·; Kolme pesäkettä hybridisoitui koettimen kanssa ja näitä käytettiin jatkossa hybridiselektoinnissa. Yksi näistä, «a *3 7802 jolle annettiin nimeksi klooni 5G, oli toistettavasta positiivinen.

J. Koon perusteella fraktioitu alikirjasto 30 /Ug plasmidi-DNA:ta, joka muodosti koko cDNA-kirjaston (pcD-X DNA), digestoitiin erikseen restriktioentsyymeillä Sali, Hindlll ja Clal plasmidin linearisoimiseksi. Käsitellyt DNA:t fraktioitiin koon perusteella 1% agaroosigeelillä, joka erotti plasmidit, joissa oli erikokoiset cDNA-insertit. Geelistä leikattiin segmentit, plasmideineen, joissa oli seuraajien kokoalueiden cDNA-insertit: 0 - lkb 1 - 2kb 3 - 4kb 4 - 5kb 5 - 6kb 6 kb ja pidemmät DNA eluoitiin jokaisesta geeliviipaleesta käyttämällä \

Vogelstein'in ja Gillespie'n lasijauhemenetelmää (Proc.

Nat. Acad. Sei. U.S.A., 76: 615-619 /1970/). Kolmesta digestiotuotteesta eluoidut DNA:t yhdistettiin koon perus-teella ja syklisoitiin uudelleen käsittelemällä T4 ligaasilla ,·.· yhteensä 15 ul:ssa seosta, jonka koostumus oli: 50 mM - Tris.HCl pH 7,4, 10 mM MgCl^, 10 mM DTT, 1 mM spermidiini, 1 mM ATP ja 100 ^ig/ml BSA. Ligatointiseoksia inkuboitiin 16 tuntia 12°C:ssa. C.coli-kanta MC 1061 transformoitiin Cohen1 in et ai.-menetelmällä (Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 69: 2110-2114 /1972/) käyttämällä 3 yul kutakin yhdistettyä fraktiokokoa. 1,1 x 10^ riippumatonta transformaatiota sisältävä kirjasto saatiin jakeelie, joka sisälsi 1-2 • ’*· kb pituisia cDNA-insert te jä. Tätä jaetta käytettiin myeihem-: mässä täyspitkien MCGF-kloonien seulonnassa.

-- - K. Koon perusteella fraktioidun alikirjaston seulonta 43 07102

Alustava resktriktioendonukleaasianalyysi sekä DNA-sekvens-sitiedot osoittivat, että kloonin 5G (identifioitu hybridise-lektion avulla) cDNA-insertti oli noin 650 emäsparin pituinen. Kloonista 5G eristettiin sisäinen BaroHl-NcoI restriktiofragmentti. Fragmentti de fosforyloitiin vasikan-suoliston alkalisella fosfataasilla G, Chacomas'in ja J. Sande'n menetelmällä (Mettiods Enzymol. 65: 75-79 /1980/). Sen jälkeen fragmentti leimattiin γ P-ATP:llä ja T4 polynukleotidikinaasilla A. Maxam'in ja W. Gilbert'in menetelmällä (Methods Enzymol. 65: 499-507 /1980/). Tätä leimattua fragmenttia käytettiin sen jälkeen ConA-indusoidun Cl.Ly l+2~/9 mRNA:n RNA-täplän koettimena. Detektoitiin noin 1 kb pituinen vyöhyke, mikä viittaa siihen, että klooni 5G ei ollut täyspitkä klooni.

Sen vuoksi samalla 5G cDNA-insertistä saadulla koettimella seulottiin 1-2 kb inserttien suhteen rikastettu alikirjasto (saatu edellä). Käytimme T. Maniatis'in et ai. (Molecular Chem., Cold Spring Harbor Laboratory /1982/) kuvaamaa Hanahan ja Moselson'in (Gene, 10: 63 /1980/) menetelmää.

Noin 500-1000 bakteeria levitettiin 80 mm nitroselluloosa-suodattimille ja inkuboitiin 37°C:ssa L-liemimaljoilla, ··· jotka sisälsivät 50 jul/ml ampisilliinia, ja bakteeripesäkkeet siirrettiin toiselle nitroselluloosasuodattimelle. Suodatti-• · mien kaksoiskappaleita inkuboitiin 37°C:ssa 8 tuntia ( L-liemellä (+ ampisilliini) , siirrettiin 10 /jg/ml kloramfeni-' ; kolia sisältäville L-liemimaljoi lie ja inkuboitiin yön '·* yli plasmidin kopiomäärän monistamiseksi. T. Maniatis'in et ai. , supra kuvaamalla tavalla lyysattiin pesäkkeet SDS:llä, denaturoitiin natriumnydroksidilla ja neutraloitiin, : minkä jälkeen pesäkkeistä saatu DNA sidottiin nitrosellu- : . ; 1 o o s a a n .

\ Seulottiin noin 20.000 pesäkettä, joista 19 pesäkettä *; oli toistettavasti positiivisia koettimen kanssa tehdyn uusintaseulonnan jälkeen. Näistä pesäkkeistä valmistettiin M 87802 plasmidi-DNA: ta ja käytettiin tätä transfektointikokeissa.

L. DNA-transfektoinnit

Yhtä päivää ennen trasfektointia laitettiin 10 6 COS-7 apinasolua yksittäisille 60 mm maljoille DMErssä, joka sisälsi 10 % vasikansikiöseerumia ja 2 M glutamiinia. Transfektoinnin suorittamiseksi alusta aspiroitiin jokaiselta maljalta ja korvattiin 1,5 ml :11a DME:tä, joka sisälsi 60 mM Tris.HCl pH 7,4 puskuria, 400 yug/ml DEAE-dekstraania .. ja 15 |ug testattavaa plasmidi-DNA: ta. Maljoja inkuboitiin 4 tuntia 37°C:ssa, sen jälkeen poistettiin DNA-pitoineri alusta ja maljat pestiin kaksi kertaa 2 ml:lla seerumivapaata DME:tä. 2,0 ml DME:tä, joka sisälsi 4¾ vasikansikiöseerumia ja 2 mM glutamiinia, lisättiin maljoille, joita sen jälkeen inkuboitiin 72 tuntia 37°C:ssa. Kasvualusta otettiin talteen ja siitä määritettiin edellä kuvatulla tavalla MCGF-aktiivisuus.

Viisi pesäkettä alkuaan kuudesta positiivisesta tutkittiin transfektoimalla. Tulokset on esitetty taulukossa 11.

Valeinfektoidut COS-7 solut käsiteltiin samalla tavoin, ·;· mutta jättämällä DNA pois.

‘v. TAULUKKKO II

*·’·* MCGF:n transientti ekspressoituminen apinasoluissa I cDNA Oiigo(dG)- MCGF-aktii-

Klooni lähtökohta palan pituus yks*/ml:ssa

Vale - - <20 . . B4 41 13 5.228 * · ' "· B5 ND ND 7.371 ’·' ; B6 1 13 3.307 ·*·.. B8 1 13 6.929 . —. B9 1 13 3.362

Cl.Ly l + 2“/9 - - 19.769 * » * 45 3 7 8 0 2 -* MCGF cDNA:n 5'-pää on esitetty nukleotiditähteenä kuviossa 1.

** Ei määritetty; cDNAjn lähtökohta sijaitsee kohdan 41 5'-puolella.

*** Oligo (dG)-pala MCGF cDNAjn 5'-päässä.

Kuviossa 3 on esitetty plasmidi (pcD-MCGF), jossa on täysipituinen MCGF- ja multi-CSF (kts. jäljempänä) cDNA-insertti. E.coli-bakteeri, jossa plasmidi on, on tallennettu ATCC-kokoelmaan (kokoelma numero 39467). 950 bp insertti on pcD-ekspressiovektorissa. Nuolella on osoitettu transkriptio SV40 alkupromoottorista. Myös katkaisun donori- ja akseptorikohtien sijainti on esitetty. Polyadelyointi-signaali, joka siis on peräisin SV40:stä, sijaitsee cDNA-insertin 3'-päässä. cDNA-insertti on viivoitettu tiheällä. Loput vektorisekvensseistä ovat peräisin pBR322:sta, joka sisältää (3-laktamasigeenin (Amp ) ja replikoitumisen alkukohdan.

Kuviossa 4 on esitetty esillä olevan keksinnön mukaisen cDNA-insertin restriktioendonukleaasin katkaisukartta. Kuviossa 1 on esitetty nukleotidisekvenssi ja oletettu ··. aminohapposekvenssi.

- Kolme cDNA-inserttiä sisältävät yhden ainoan avoimen .1 lukukehyksen, joka muodostuu 166:sta kodonista alkaen ‘ ; metioniinikodinilla kohdassa 28. Tämän oletetun aloitus-kodonin lisäksi ensimmäisen myötäpuolella sijaitsee 12 ja 18 kodonin päässä kaksi muuta metioniinikodonia. Neljäs cDNA-klooni 40 emäsparin verran myötäpuolella kolmen muun insertin 5'-päistä. Tässä lyhyessä cDNA-kloonissa : Γ; ei ole ensimmästä metioniinikodonia, mutta sillä kuitenkin saadaan aktiivinen MCGF vietäessä COS-soluihin. Toinen näistä kahdesta myötäpuolella sijaitsevasta ATG-kodonista • · voi siten ilmeisesti toimia aloituskodonina.

*·*; C0S-7 soluissa ekspressoidulla kloonilla B9 (CQS-MCGF) 46 87802 arvioitiin sen aktiivisuusspektri, kun mukana ei ollut muita T-solutuotteita. Ekspressoitu materiaali ei ole mitogeeninen T- tai B-soluille, se ei indusoi B-soluja tuottamaan immunoglobuliinia (taulukko III) eikä se indusoi makrofaagi IA:n ekspressiota. Tämä geenituote kuitenkin stimuloi hematopoieettisten pesäkkeiden muodostumista metyy1iselluloosaan suspendoiduissa luuydinsoluissa osoittaen, että yhdellä ainoalla geeni tuotteella voi olla sekä I1CGF - että pesäkettä stimuloiva aktiivisuus.

47 87802 ^ o ia α o iCDD<i ΙΛ Ζ\βΌ

\0 D cA

CJ Ο U. Μ Ο <ί α_ μ ro co = § , , ·Ρ -Η LJ > £

I *- H \ Q

CO U- Ή · Ο Ο 2 CM ο V 'Jil Β Ή UJ CJ -* -¥ ΙΑ " m en >, co ci) -1-} :C0 3 CO 5 co co .¾ _ ·· Ά * a f= Cl CJ E + -Ή '-N. o o z o o

I —) U. -H · CA

n dl U -u tl) CM

J U i ^ · CO

U I— CO >, IA —I

CJ “H

•p Ή - => * 5

1,3 5 D CM —I Ή -P

·· U_ - - - CO

UI "O C_) rH -U CM

I > I , . , CO

=> d ra +| +| o a a +| a m I . "0 —^ d; ,3 ra a- γα o -h m LO - - »s >

I CM -CT CD CO

•h co ’-M '—e ra 0 co £j -•O g ra o * en

E Ή LJ

•h 3 i r-* esi >> 4J ·—\ HD ·* **

m _i U. Ή 0*4 Ή 4J

Ui ^ CD 0) ra +| +| cd cd o +| o Mi

U CO *P

CJ -H IA IA O ^p CJ rp M ·. - O)

g χ la IA IA CO

1 > ·Ρ -P

CD -IJ 3 -H

. a cd -h jc

•: · CJ e o (H

-..: p ra

-P ιΛ Ό cm o E

-;. ’ >* ~ - m) 1—1 p CJ lA A' ·> lA IA cco

I—I <01 N H CD CM CM E

' -Hu. +1+1 co +| +| +1 o z

ui CJ

--.CD IA <t I— O" p- ·· - - - cflCM » O Ό . . ‘ iZ NN H ΙΛ 4 D) • :* _j = ra *"

* * Q r—( CM —ICM1—I’—I*—I

* : : i— ^ * • - * co ·> U) ♦ - » I ·· >, CO < M> >» M> C Z D M> ·. Mi co ο to Mi • , . ICO P O -P (0

CO 4J O -P

' *P Ή L_ -P Ή rp -P *· CJ JC ON p

1'.. -P -P CJ 0) -P \ CCO

CC D s: K- D I «O

ero ro —n co —i cm e ero -p o d e o +

Ero co jj ro en -p i—i -h ή e ·η p j ro ra . 0)P Γ'· O J-i Ή >> +? ..... ra i pj ra i o _j Ώ m »p a. ίο jc h co en »ra

•h 5 oracooi-H'j A

;· =»C0 ue- >U -1 CJ "M 2 48 37802

Selitykset taulukkoon III

* 5

Pesäkkeiden määrä 1,5 x 10 luuydinsolua kohti. Jokainen arvo tarkoittaa kolmesta rinnakkaisesta viljelmästä määritettyjen pesäkkeiden keskimäärää + SEM. 1,5 x 10^ ei-tarttuvaa, pienitiheyksistä (cj.,077 g/ml) luuydinsolua C57B1/6 hiiristä suspendoitiin 1 ml määriin 35 mm maljoissa, jotka sisälsivät 0,9 S metyyliselluloosaa, 20 % CFS, Iscove'n modifioitua Dulbecco'n alustaa, 50 pM 2-ME ja 30 % kasvatusalustaa, joka oli käsitelty annetuilla solusupernatanteilla. CSF:n, joka indusoi makrofaagipe-säkkeiden muodostumista, lähteenä käytettiin hiiren L-suluja; Inkuboitiin 5 päivää 37°C:ssa CO^tssa, minkä jälkeen jokaiseen maljaan lisättiin 0,5 - 1,0 yksikköä erytropoietiinia (Connaught, vaihe III). Maljoja inkuboitiin vielä 7 päivää, minkä jälkeen pesäkkeet laskettiin leikkausmikroskoopin avulla.

TCGF-aktiivisuus määritettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla. Yksi TCGF-aktiivisuusyksikkö on määritelty siksi määräksi, joka maksimaalisesta määrästä laskettuna 25 % 3H-tymidiinin liittymisen 5 x 103 HT-2 soluihin.

"** ^ B-solut puhdistettiin C57B1/6 hiirten pernasoluista •••j ja niistä määritettiin kuvatulla tavalla lisääntyminen.

< · t *·*·* Yksi BCGF-aktiivisuusyksikkö on määritelty siksi määräksi, 3 : .· joka aiheuttaa 50-prosenttisen H-tymidiinin liittymisen 1 x 10 3 B-soluihin, joita on stimuloitu 2 pg/ml LPSslla.

tt Immunoglobuliinia erittävien ja plakin muodostavien : solujen kokonaismäärä laskettiin hemolyyttisten plakkien määritysmenetelmän muunnelmalla.

: “ Tarkemmin sanoen ekspressoitunut B-9 klooni testattiin olosuhteissa, joissa BFU-E-, CFU-G/M- ja seka-CFU-pesäkkeiden ____: kehittyminen on mahdollista. Taulukko III osoittaa, että kolmen tyyppisiä pesäkkeitä voitiin identifioida ja laskea « 37802 i luuydinsolujen viljelmissä, joita oli inkuboitu ekspressoidun materiaalin kanssa. Lukuisin tyyppi muodostui värittömistä pesäkkeistä, joilta puuttuivat hemoglobinisoidut osat.

Niiden morfologia oli tyypillinen granulosyytti/makrofaagi-pesäkkeille, joiden olemassaolo vahvistettiin myöhemmin histokemiallisen värjäyksen avulla. Mukana oli myös joitakin suuria makroskooppisia pesäkkeitä, jotka sisälsivät monikes-kisesti järjestäytyneinä tasaisesti punaisia solurykelmiä, joille annettiin nimeksi BFU-E. Lisäksi havaitsimme muutamia pesäkkeitä, jotka sisälsivät hemoglobinisoituja soluja sekoittuneena suurten ja pienten läpikuultavien solujen kanssa, jotka laskettiin sekasoluina.

Näiden erilaisten pesäkkeiden koostumus analysoitiin viemällä valitut pesäkkeet lasilevyille ja värjäämällä Wright-Giemsa-värillä tai epäspesifisillä esteraasiväreillä. Yli 300 pesäkettä tutkittiin. Suurin osa näistä pesäkkeistä (89 3>) muodostui granulosyyteistä, makrofaageista tai granulosyy tti/makrofaagiseoksesta, kun taas 4 % muodostui syöttösoluista. Loput muodostuivat muista sekasolulinjoista kuin neutrofiili/makrofaagi. Taulukossa IV on esitetty eri tyyppien määrät 10 tyypilliselle sekapesäkkeelle, jotka oli kerätty useasta kokeesta. Useiden solutyyppien mukanaolo ' yhdessä ainoassa pesäkkeessä viittaa siihen, että nämä pesäkkeet ovat peräisin monipotentiaalisista edeltä jäsoluista.

* * · so 87802

Taulukko IV/

Hematopoieettisten sekapesäkkeiden, jotka oli otettu CQS-MCGF-käsitellyssä alustassa kasvatetuista luuydinviljelmistä, solujen koostumus ..........*Eri tyyppien määrät (?ό)............

Pesäkkeen numero E n m e syöttö M B1_ 1 21 76 3 2 36 35 29 9 3 97 1 2 4 22 78 5 17 74 9 6 64 15 21 7 IB 81 1 8 27 40 33 9 86 14 IOTj 9 6 3 1 *

Erilaisten tyyppien määrät, jotka suurempia kuin 200 tumallista solua/pesäke. Käytetyt lyhennykset ovat: E, erytrosyytti ; n, neutrofiili; m, makrofaagi/monosyytti; e, eosinofiili; syöttö, syöttösolu; M, megakaryosyytti; ·**; ja Bl, emosolu.

Ekspressoidun B-9 kloonin vaikutukset määritettiin tehtä- vöitymättömillä varhaisvaiheen kantasoluilla Tili'in ja -:· McCullock' in (Radiat. Res., 14: 213-222 /1961/) CFU-S-;V: menetelmällä J. Schrader'in ja 1. Clark-Levi/is' in (J. Immunol., 129: 30-35 /1982/) modifioimalla tavalla. Kun kiinnitty-; mättömiä luuydinsolu ja, joissa ei ollut T-soluja, inkuboitiin yksi viikko COS-MCGF-alustalla ja injisoitiin laskimon kautta kuolettavasti säteilytettyyn hiireen, pernaan ilmestyi * '·< makroskooppisia pesäkkeitä (taulukko \l) . Sen sijaan solut, : joita oli inkuboitu valetransfektoitujen C05-7 solujen sup erna t an t e i ssa , eivät muodostaneet pesäkkeitä.

si 8 7 802

TAULUKKO V

CFU-5-solujen havaitseminen luuydinsoluissa, joita viljelty yksi viikko COS-MCGF-käsitellyllä alustalla.

Viljelmään lisätty Koe Pernamodulit/

supernatantti n:o hiiri CFU-S

- COS-7 solut, transfektoitu 1 8,8 + 1,5 264 täyspitkällä MCGF cDNA:lla 2 6,2 + 2,8 186 C05-7 solut, trasfektoitu 2 0,8 + 0,7 24 epätäydellisellä MCGF cDNA:1la

Valetransfektoidut COS-7 1 0,87 + 0,7 24 solut 2 0,7 P. 0,6 21 L-solut 1 0,3+0,5 9 2 Ei tehty

Alusta 10,3+0,5 9 2 0,5 + 0,5 15 -· * Pernapesäkkeiden keskiarvo + SEM 5 eri hiiressä.

ft CFU-S-solujen laskettu keskiarvo, joka kuvaa CFU-S-solujen esiintymistaajuutta koko viljelmässä, jossa 3 x 10^ luuydinsolua.

t Epätäydellisellä MCGF cDNA-kloonilla ei ole aluetta, joka koodaa NH^-terminaalista 55 aminohappoa.

Tiheydeltään keveitä ( 1,077) C57B1/6 luuydinsoluja, jotka ·.· : oli käsitelty anti-Thyl-vasta-aineella ja komplementilla, maljattiin 1 x 10^ solua/ml Iscove'n modifioituun Dulbecco'n ,··*. alustaan, joka edellä kuvatulla tavalla oli täydennetty 20 ?i:lla vasikansikiöseerumia, 50 ^iM 2-ME:llä ja 30 ?i:lla käsiteltyä alustaa. Kiinnittymättömat solut poistettiin ; '.· kolme kertaa yhden viikon inkubointijakson aikana ja korvat- 52 87802 tiin uudella alustalla. Solut otettiin talteen viikon kuluttua, pestiin kaksi kertaa ja laimennettiin alkuperäiseen viljelytilavuuteen fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. Jokainen kuolettavasti säteilytetty (1.000 R) C57B1/6 eläin injiaoitiin i.v. 0,1 ml:lla aolususpensiota. 9 päivän kuluttua pernat poistettiin ja pernanodulit laskettiin käyttämällä leikkausmikroskooppia.

Yhteenvetona todettakoon, että aluksi karakterisoidun syöttösolun kasvutekijäaktiivisuuden lisäksi C0S-MCGF:llä on ebs (erythroid burst-promoting)-aktiivisuutta, mikä mahdollistaa monien solulinjojen, mukaanlukien monosyytti/ granulosyytti-, erytroidi- ja megakaryosyyttisolujen kanta-solujen ja varhaisvaiheen tehtävöityneiden edeltäjäsolujen kasvun. Tämä aktiivisuusalue osoittaa, että esillä olevan keksinnön mukaiset cDNA-kloonit kood^avat proteiineja, joilla on monisolulinjäisten hematopoieettisten solujen kasvutekijäominaisuudet.

Edellä olevasta havaitaan, että esillä olevan keksinnön mukaisista cDNA-klooneista saadaan täsmälliset ja täydelliset sekvenssitiedot nisäkkäiden multi-CSF:n ja syöttösolun kasvutekijöille. Keksintö antaa myös alan ammattimiehille keinot tuottaa merkittäviä määriä tällaisia tekijöitä " (jotka eivät oleellisesti sisällä muita hematopoieettisia tekijöitä) niin, että syöttösolut ja muut hematopoieettiset ; · solut voidaan ylläpitää paremmin in vitro. cDNA-klooneista saatu informaatio lisää lisäksi nisäkkäiden immuunireaktion ymmärtämistä ja parantaa näin hoitomahdollisuuksia.

Claims (5)

53 87802

1. Menetelmä tuottaa polypeptidiä, jolla on monilinjäinen nisä-kässolun kasvutekijäaktiivisuus ja joka sisältää seuraavan aminohapposekvenssin Asp - Thr - His - Arg - Leu - Thr - Arg - Thr - Leu - Asn - Cys - Ser - Ser - Ile - Vai - Lys - Glu - Ile - Ile - Gly - Lys - Leu - Pro - Glu - Pro - Glu - Leu - Lys - Thr - Asp - Asp - Glu - Gly - Pro - Ser - Leu - Arg - Asn - Lys - Ser - Phe - Arg - Arg - Vai - Asn - Leu - Ser - Lys - Phe - Vai - Glu - Ser - Gin - Gly - Glu - Vai - Asp - Pro - Glu - Asp - Arg - Tyr - Vai - Ile - Lys - Ser - Asn - Leu - Gin - Lys - Leu - Asn - Cys - Cys - Leu - Pro - Thr - Ser - Ala - Asn - Asp - Ser - Ala - Leu - Pro - Gly - Vai - Phe - Ile - Arg - Asp - Leu - Asp - Asp - Phe - Arg - Lys - Lys - Leu - Arg - Phe - Tyr - Met - Vai - His - Leu - Asn - Asp - Leu - Glu - Thr - Vai ~ Leu - Ala - Ser - Arg - Pro - Pro - Gin - Pro - Ala - Ser - Gly - Ser - Vai - Ser - Pro - Asn - Arg - Gly - Thr - Vai - Glu - Cys - ; tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet, joissa a) muodostetaan vektori, joka käsittää mainittua polypeptidiä koodaavan nukleotidisekvenssin, erityisesti mainittua polypeptidiä koodaavasta mRNA-sekvenssistä saadun cDNA-sekvenssin, jolloin vektorin sisältävä nisäkäs- tai bakteeri-isäntä kykenee ekspressoimaan nukleotidisekvenssin, joka kykenee koodaamaan mainitun polypeptidin; b) liitetään vektori isäntään; ja c) pidetään vektorin sisältävä isäntä olosuhteissa, jotka sopivat nukleotidisekvenssin ekspressoimiseen mainituksi polypeptidiksi - 87802 54

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidiä koodaavan nukleotidisekvenssin kaava on GAT - ACC - CAC - CGT - TTA - ACC - AGA - ACG - TTG - AAT - TGC - AGC - TCT - ATT - GTC - AAG - GAG - ATT - ATA - GGG - AAG - CTC - CCA - GAA - CCT - GAA - CTC - AAA - ACT - GAT - GAT - GAA - GGA - CCC - TCT - CTG - AGG - AAT - AAG - AGC - TTT - CGG - AGA - GTA - AAC - CTG - TCC - AAA - TTC - GTG - GAA - AGC - CAA - GGA - GAA - GTG - GAT - CCT - GAG - GAC - AGA - TAC - GTT - ATC - AAG - TCC - AAT - CTT - CAG - AAA - CTT - AAC - TGT - TGC “ CTG - CCT - ACA - TCT - GCG - AAT - GAC - TCT - GCG - CTG - CCA - GGG - GTC - TTC - ATT - CGA - GAT - CTG - GAT - GAC - TTT - CGG - AAG - AAA - CTG - AGA - TTC - TAC - ATG - GTC - CAC - CTT - AAC - GAT - CTG - GAG - ACA - GTG - CTA - GCC - TCT - AGA - CCA - CCT - CAG - CCC - GCA - TCT - GGC - TCC - GTC - TCT - CCT - AAC - CGT - GGA - ACC - GTG - GAA - TGT - .

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleotidisekvenssi alkaa ainakin osalla seuraavasta sekvenssistä ATG - GTT - CTT - GCC - AGC - TCT - ACC - ACC - AGC - ATC - CAC - ACC - ATG - CTG - CTC - CTG - CTC - CTG - ATG - CTC - TTC - CAC - CTG - GGA - CTC _ CAA - GCT - TCA - ATC - AGT - GGC - CGG - ; .T.joka koodaa vastaavan osan polypeptidin hydrofobisesta johtosekvenssistä: • m 1 • · • · 1 1 · • · · • f • · 55 87802 Met - Vai - Leu - Ala - Ser - Ser - Thr - Thr - Ser - Ile - His - Thr - Met - Leu - Leu - Leu - Leu - Leu - Met - Leu - Phe - His - Leu - Gly - Leu - Gin - Ala - Ser - lie - Ser - Gly - Arg - .

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä polypeptidin valmistamiseksi jossa vesipitoisessa ravintovällaineessa viljellään nisäkäs- tai bakteeri-isäntäsolua, joka on transfek-toitu tai transformoitu vektorilla, joka sisältää ja kykenee ekspressoimaan DNA-sekvenssin, joka koodaa mainitun polypeptidin, tunnettu siitä, että polypeptidillä on moni-linjainen nisäkässolun kasvutekijäaktiivisuus, jonka kaava on seuraava Asp - Thr - His - Arg - Leu - Thr - Arg - Thr - Leu - Asn - Cys - Ser - Ser - Ile - Vai - Lys - Glu - Ile - Ile - Gly - Lys - Leu - Pro - Glu - Pro - Glu - Leu - Lys - Thr - Asp - Asp - Glu - Gly - Pro - Ser - Leu - Arg - Asn - Lys - Ser - Phe - Arg - Arg - Vai - Asn - Leu - Ser - Lys - ;:· Phe - Vai - Glu - Ser - Gin - Gly - Glu - Vai - Asp - Pro - Glu - Asp - Arg - Tyr - Vai - Ile - Lys - Ser - Asn - Leu - Gin - Lys - Leu - Asn - Cys - Cys - Leu - Pro - Thr - Ser - Ala - Asn - ^ Asp - Ser - Ala - Leu - Pro - Gly - Vai - Phe - Ile - Arg - Asp - Leu - Asp - Asp - Phe - Arg - Lys - Lys - Leu - Arg - Phe - Tyr - Met - Vai - His - Leu - Asn - Asp - Leu - Glu - Thr - Vai - '· Leu - Ala - Ser - Arg - Pro - Pro - Gin - Pro - : Ala - Ser - Gly - Ser - Vai - Ser - Pro - Asn - Arg - Gly - Thr - Vai - Glu - Cys - ; • # 87802 56 ja vektori sisältää ja kykenee ekspressoimaan DNA-sekvenssin, jolla on kaava ATG - GTT - CTT - GCC - AGC - TCT - ACC - ACC - AGC - ATC " CAC - ACC - ATG - CTG - CTC - CTG - CTC - CTG - ATG - CTC - TTC - CAC - CTG - GGA - CTC - CAA - GCT - TCA - ATC - AGT - GGC - CGG - t~GAT - ACC - CAC - CGT - TTA - ACC - AGA - ACG - TTG - AAT - TGC - AGC - TCT - ATT - GTC - AAG - GAG - ATT - ATA - GGG - AAG - CTC - CCA - GAA - CCT - GAA - CTC - AAA - ACT - GAT - GAT - GAA - GGA - CCC - TCT - CTG - AGG - AAT - AAG - AGC - TTT - CGG - AGA - GTA - AAC - CTG - TCC - AAA - TTC - GTG - GAA - AGC - CAA - GGA - GAA - GTG - GAT - CCT “ GAG - GAC - AGA - TAC - GTT - ATC - AAG - TCC - AAT - CTT - CAG - AAA - CTT - AAC - TGT - TGC - CTG - CCT - ACA - TCT - GCG - AAT - GAC - TCT - GCG - CTG - CCA - GGG - GTC - TTC - ATT - CGA - GAT - CTG - GAT - GAC - TTT - CGG - AAG - AAA - CTG - AGA - TTC - TAC - ATG - GTC - CAC - CTT - AAC - GAT - CTG - GAG - ACA - GTG - CTA - GCC - TCT - AGA - CCA - CCT - CAG - CCC - GCA _ TCT - GGC - TCC - GTC - TCT - CCT - AAC - '1: CGT - GGA - ACC - GTG - GAA - TGT - .

: : :5. Nukleiinihapposekvenssi, joka koodaa polypeptidin, jolla on •‘•‘rmoni Iin jäinen nisäkässoluken kasvutekijäaktiivisuus ja jolla on •; .kaava ATG - GTT - CTT - GCC - AGC - TCT - ACC - ACC - AGC - ATC - CAC - ACC - ATG - CTG - CTC - CTG - CTC - CTG - ATG - CTC - TTC - CAC - CTG - GGA - CTC - CAA - G CT - TCA - ATC - AGT - GGC - CGG - GAT - ACC - CAC - CGT - TTA - ACC - AGA - ACG - » • · · « · 57 37802 TTG - AAT - TGC - AGO - TCT - ATT - GTC - AAG - GAG - ATT - ATA - GGG - AAG - CTC - CCA - GAA - CCT - GAA - CTC - AAA - ACT - GAT - GAT - GAA - GGA - CCC - TCT - CTG - AGG - AAT - AAG - AGC - TTT - CGG - AGA - GTA - AAC - CTG - TCC - AAA - TTC - GTG - GAA - AGC - CAA - GGA - GAA - GTG - GAT - CCT - GAG - GAC - AGA - TAC - GTT - ATC - AAG - TCC - AAT - CTT - CAG - AAA - CTT - AAC - TGT - TGC - CTG - CCT - ACA - TCT - GCG - AAT - GAC - TCT - GCG - CTG - CCA - GGG - GTC - TTC - ATT - CGA - GAT - CTG - GAT - GAC - TTT - CGG - AAG - AAA - CTG - AGA - TTC - TAC - ATG - GTC - CAC - CTT - AAC - GAT - CTG - GAG - ACA - GTG - CTA - GCC - TCT - AGA - CCA - CCT - CAG - CCC - GCA - TCT - GGC - TCC - GTC - TCT - CCT - AAC - CGT - GGA - ACC - GTG - GAA - TGT - TAA tai GAT - ACC - CAC - CGT - TTA - ACC - AGA - ACG - TTG - AAT - TGC - AGC - TCT - ATT - GTC - AAG - GAG - ATT - ATA - GGG - AAG - CTC - CCA - GAA - CCT - GAA - CTC - AAA - ACT - GAT - GAT - GAA - GGA - CCC - TCT - CTG - AGG - AAT - AAG - AGC - TTT - CGG - AGA - GTA - AAC - CTG - TCC - AAA - TTC - GTG - GAA - AGC - CAA - GGA - GAA - GTG - GAT - CCT - GAG - GAC - AGA - TAC - GTT - ATC - AAG - TCC - AAT - CTT - CAG - AAA - CTT - AAC - TGT - TGC - CTG - CCT - ACA - TCT - GCG - AAT - GAC - TCT - GCG - CTG - CCA - GGG - GTC - TTC - ATT - CGA - GAT - CTG - GAT - GAC - TTT - CGG - AAG - AAA - CTG - AGA - TTC - TAC - ATG - GTC - CAC - CTT - AAC - GAT - CTG - GAG - ACA - GTG - CTA - GCC - TCT - AGA - CCA - CCT - CAG - CCC - GCA - TCT - GGC - TCC - GTC - TCT - CCT - AAC - CGT - GGA - ACC - GTG - GAA - TGT - TAA - . 5β 87802