MXPA03002762A - Sistema de produccion de trombopoyetina humana por celulas de mamifero en cultivo. - Google Patents

Abstract

La presente invencion hace referencia a un sistema de produccion de Trombopoyetina Humana (hTPO) biologicamente activa por celulas de mamifero en cultivo, las cuales fueron modificadas geneticamente por introduccion del gen de la hTPO bajo forma de una construccion de ADN conteniendo todos los elementos necesarios para la expresion de una hTPO completa. Por otro lado la presente invencion concierne los usos potenciales del producto obtenido por este sistema (hTPO) en la estimulacion de la diferenciacion y proliferacion de celulas hematopoyeticas de la linea megacariocitica tanto in vitro como in vivo.

Description

SISTEMA DE PRODUCCIÓN DE TROMBOPOYETINA HUMANA POR CELULAS DE MAMÍFERO EN CULTIVO". TITULARES E INVENTORES Alfonso CAYOTA GUZIKOVSKY titular de la C.I. N° 1.397.120-8 Carlos Alberto ROBELLO PORTO titular de la C.I. N° 1.808.473-3 Otto Franz PRITSCH ALBISU titular de la C.I. N° 4.064.608-8 (2) ANTECEDENTES DE LA INVENCION En todo adulto normal, las células sanguíneas son producidas a nivel de la médula ósea a partir de células pluripotenciales indiferenciadas (del inglés: "stem cells") mediante un proceso denominado hematopoyesis . Luego de varias etapas de proliferación y diferenciación, dichas células progenitoras pluripotenciales son capaces de autoduplicarse sin diferenciarse (endoduplicación/autorregeneración) o de generar una serie de células progenitoras agrupadas en 4 principales vías de diferenciación: [a] eritroide (glóbulos rojos o eritrocitos) ; [b] mieloide (leucocitos polimorfonucleares y monocitos; [c] linfoide (linfocitos) y [d] megacariocítica (generadora de Megacariocitos/Plaquetas) .

La cantidad y tipo celular producido por la médula ósea es un proceso finamente regulado por una compleja red de citoquinas o factores de crecimiento que actuando a través . de receptores de membrana son producidos de acuerdo a las necesidades del organismo. Dichas citoquinas comprenden un grupo heterogéneo de factores como interleuquinas (incluyendo entre otras a TNF-OÍ , IL-3, IL-6, IL-8 e IL-11) y hormonas de naturaleza glicoproteica denominadas Factores Estimuladores de Colonias (Factores Estimuladores de Colonias de Granulocitos y Granulocito/Macrófagos [G-CSF y G -CSF respectivamente] ) ; Eritropoyetina como factor estimulador de progenitores eritrocitarios y Trombopoyetina como estimuladora de progenitores plaquetarios .

Un conocimiento creciente de la hematopoyesis y su regulación ha llevado a la utilización de diversas citoquinas hematopoyéticas en el tratamiento médico. Así, se han incorporado a la farmacología clínica tratamientos basados en: Eritropoyetina (EPO) para el tratamiento de anemias secundarias a la falla renal crónica; Factores Estimuladores de Colonias (G-CSF y GM-CSF) para acelerar la recuperación de las defensas inmunitarias de pacientes con cáncer sometidos a tratamientos antineoplásicos o bien en aquellos sometidos a transplante de médula ósea. IL-2 e Interferón- a . Ambos han sido ampliamente utilizados en tratamientos antineoplásicos conjuntamente con agentes quimioterápicos . Los Interferones están siendo utilizados con cierto éxito en el tratamiento de las hepatitis crónicas así como la IL-2 en SIDA asociada a agentes antirretrovirales .

Las plaquetas son componentes de la sangre producidos en la médula ósea esenciales en el proceso de la coagulación sanguínea. Las mismas adhieren a los sitios de lesión vascular reclutando otras plaquetas para formar el coágulo o tapón hemostático primario impidiendo hemorragias ó pérdidas sanguíneas anormales. Adicionalmente, actúan a modo de superficie sobre la cual los factores de la coagulación son reclutados y activados a fin de producir el coágulo de fibrina (1) . La generación de plaquetas implica la proliferación y diferenciación de células madre pluripotenciales {nstem cells") de la médula ósea en células Megacariocíticas las cuales a su vez generarán las plaquetas (trombocitos) maduras que circularán normalmente en sangre periférica. El proceso fisiológico de generación plaquetaria requiere de la presencia de factores denominados "Trombocitopoyéticos" como factores de crecimiento y desarrollo de la serie Megacariocítico/plaquetaria . En clínica médica, la disminución del número de plaquetas (trombocitopenia) es una complicación grave vinculada a dos situaciones relevantes : a) Enfermedades que afectan la generación plaquetaria normal (Trombocitopenias primarias) y b) como complicación de intervenciones terapéuticas en hemato-oncología especialmente aquellas resultantes de la intensificación terapéutica en el tratamiento del cáncer y en pacientes sometidos a transplante de médula ósea (Trombocitopenias secundarias) . El incrementado riesgo de hemorragias en estos pacientes requiere actualmente de la administración de concentrados plaquetarios provenientes de donantes normales a pesar de sus altos riesgos biológicos (complicaciones alérgicas, infecciosas y de sensibilización inmune) .

Desde la descripción temprana en el año 1958, de una actividad '"trombopoyetina" en animales trombocitopénicos atribuida a Kelemen y colaboradores (2) , ha sido necesario esperar hasta 1994 para que dicho factor fuese identificado, purificado y clonado por varios grupos, como una glicoproteína capaz de unir el receptor celular Mpl (oncogén responsable de la leucemia mieloproliferativa murina, (3)) la cual fue identificada como Trombopoyetina (denominada alternativamente: c-Mpl ligando; Megapoyetina; o Factor de crecimiento y diferenciación de Megacariocitos, [MGDF] ) por su capacidad de estimular específicamente la megacariocitopoyesis o trombocitopoyesis (4-8) . Otros factores con actividad trombocitopoyética han sido descritos (9) , los cuales incluyen IL-6 e IL-11 aunque los mismos no son específicos y tienen acciones pleiotrópicas . La administración de altas dosis de IL-11 e IL-6 en forma aislada sólo han resultado en modestos incrementos de plaquetas circulantes (10) .

El gen de la trombopoyetina humana (hTPO) ha sido localizado como una copia única en el cromosoma 3 (3q26-27) el cual codifica información para una proteína de 353 aminoácidos (marco abierto de lectura de 1059 pares de bases) que incluye un péptido señal de 21 aminoácidos (63 pares de bases) . La proteína madura tiene 332 aa (996 bp) y un peso molecular estimado de 38 kDa (forma no glicosilada) . Posee 6 sitios de N-glicosilación para dar la proteína glicosilada completa de 70-80 kDa y un sitio de clivaje entre las Argininas 153 y 154 el cual divide a la proteína en dos dominios: a) C-terminal con alta glicosilación sin homología con proteínas descritas, y b) EPO-like o N-terminal con 23% de identidad con EPO (50% con mutaciones sinónimas) . Es importante resaltar que la forma no glicosilada o truncada (hTP0153) tiene actividad completa in vitro pero no in vivo debido a una disminuida estabilidad y rápida depuración de la circulación. Además de la molécula nativa de 70-80 kDa, se han descrito diversas formas circulantes de la TPO producto de la proteólisis parcial de la misma y que consisten en formas de 30, 25 y 18 kDa, todas truncadas a nivel del sector C-terminal (9, 11, 12) Actualmente el único factor con actividad trombocitopoyética disponible y aprobado por la nFood and Drug Admínistration" (FDA) es la IL-11 humana recombinante .

DESCRIPCION GENERAL DE LA INVENCION: Desde un punto de vista general la presente invención concierne: En un primer aspecto, el diseño y construcción de un segmento de Acido Desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena, denominado plásmido, que tiene la capacidad de replicarse en una célula huésped mamífero. Este plásmido comprende los siguientes elementos ordenados de tal forma que aseguran la expresión del producto final: 1)- un promotor de la transcripción, 2) - un primer segmento de ADN que codifica para el péptido señal especifico de la hTPO natural, 3) un segundo segmento de ADN que codifica para la totalidad de los residuos aminoacldicos de la hTPO, 4) una secuencia aumentadora de la transcripción {"enhancer" ) , 5) una señal de poliadenilación, y 6) un terminador de la transcripción.

En un segundo aspecto, la obtención de una línea celular mamífero, la cual ha sido transfectada mediante la introducción en forma estable en su genoma de la construcción de ADN descrita en el párrafo precedente. La línea celular preferencial consiste en células de mamífero.

En un tercer aspecto, se describe un procedimiento' de producción de hTPO comprendiendo una linea celular murina de origen plasmocitario, transfectada con el plásmido descrito anteriormente. Mediante este procedimiento esta línea celular adquiere la capacidad de sintetizar y secretar al medio extracelular la hTPO recombinante humana, biológicamente activa e idéntica a su contraparte natural.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Antes de describir la presente invención y a fin de facilitar su comprensión, creemos útil realizar una descripción sumaria y explicativa de algunos términos y procedimientos utilizados para la presente invención: - Trombopoyetina (TPO) : Es un glucoproteína producida principalmente por células hepáticas y renales de individuos normales capaz de unirse específicamente al receptor Mpl de la misma especie y presente sobre células precursoras o pluripotenciales hematopoyéticas con el fin de estimular la producción de plaquetas sanguíneas. El prefijo "h" hace referencia a la TPO humana (hTPO) . El término hTPO es utilizado para identificar la proteína madura completa desprovista del péptido o secuencia señal y que es biológicamente activa.

- Proteína Recombinante : Cuando una célula de diverso origen es modificada genéticamente mediante tecnologías de ADN recom inante para producir preferencialmente una proteina no producida normalmente por la misma adquiere genéricamente el nombre de proteína recombinante. Habitualmente el sufijo "r" indica el origen recombinante de una biomolécula . - cDNA: Acido DesoxirriboNucleico (DNA) complementario . Representa una copia complementaria de Acido RiboNucleico (RNA) realizada mediante el proceso denominado transcripción reversa. En el mismo una DMA polimerasa dirigida por RNA (Transcriptasa Reversa) realiza una copia utilizando como matriz una molécula de ARN. El cDNA puede ser monohebra (moncatenario) o doblehebra (bicatenario) .

- Plásmido 6 Vector de Expresión: Representado por una molécula de DNA lineal o circular, comprendiendo un segmento capaz de codificar una proteína o polipéptido de interés asociado a segmentos que, adecuadamente seleccionados y en una secuencia lógicamente ordenada, aseguran la transcripción y traducción (generación de RNA mensajero y síntesis ribosomal de la proteína) del segmento codificante. Tales segmentos incluyen: secuencias promotoras (activadoras de la transcripción o síntesis de RNA mensajero a partir del DNA) ; señales de terminación; secuencias aumentadores o potenciadoras de la transcripción ( "enhancers" ) ; orígenes de replicación; señales de poliadenilación; y marcadores que permitan d la identificación y selección de los elementos celulares que exitosamente hayan incorporado dicho material genético. Estas moléculas derivan generalmente de plásmidos bacterianos, de origen viral o bien consisten de una combinación de ambos .

- Péptido o secuencia señal : En las proteínas de secreción (exportación al medio extracelular) existe una secuencia peptídica habitualmente aminoterminal capacitada para incorporarse y atravesar las membranas celulares "arrastrando o dirigiendo tras de sí" a la proteína madura. Durante el proceso de secreción el péptido señal es eliminado por degradación en una o mas etapas . Las proteínas que- no poseen un péptido señal tendrán un destino intracelular salvo que exista algún mecanismo alternativo de excreción.

- Promotor : Secuencia del DNA que es reconocida por la RNA polimerasa para iniciar la transcripción de un gen y generar el RNA mensajero correspondiente. - Transfección (Transformación) : Es el proceso por el cual una línea o clon celular es modificado genéticamente mediante la introducción de genes para producir proteínas que normalmente no son producidas por las mismas. Se les denomina indistintamente como Células Transfectantes ó Transformadas .

En la presente invención se aportan los materiales y métodos utilizados para la obtención de Trombopoyetina humana recombinante con actividad biológica demostrable cuyo esquema experimental general constó de las siguientes etapas: 1. A partir de un donante voluntario y a raiz de una cirugía hepatobiliar se obtiene un fragmento de hígado humano normal. A partir de dicho tejido se obtiene el ácido ribonucleico (AN) total . 2. Sobre dicho material se procede a amplificar las moléculas de ARN mensajero (AR m) que contienen la información genética adecuada para la síntesis de la Trombopoyetina Humana, asociado a una verificación de la secuencia de bases de dicho ARNm que deberá coincidir con la descrita para la Trombopoyetina Human . 3. Se procede a la construcción de un plásmido de expresión conteniendo el cDNA específico de la hTPO, capaz de ser introducido en una célula e inducir la expresión o producción de la Trombopoyetina Humana. 4. Dicho vector es introducido por técnicas convencionales de electroporación en una línea celular de mamífero cultivable in vi tro. 5. Las células "portadoras" del gen de la Trombopoyetina son seleccionadas debido a que se mantienen viables en un medio artificial de laboratorio al cual se le agregó el antibiótico neomicina. Las células "no portadoras" mueren progresivamente hasta perderse totalmente debido a que no poseen el gen de resistencia a la neomicina presente en el plásmido de expresión. 6. Por métodos de dilución límite se seleccionan diferentes células portadoras del plásmido y que a su vez producen cantidades significativas de Trompoyetina humana recombinante a los que se denomina "Clones Productores de Trombopoyetina Recombinante Humana (rhTPO) " . 7. La valoración de su actividad biológica se realiza mediantes bioensayos tanto in vitro como in vivo a partir de sobrenadantes de cultivos, los cuales evalúan la capacidad de dichos sobrenadantes de inducir alternativamente: a) la diferenciación de precursores hematopoyéticos hacia la progenie Megacariocítica; b) la proliferación de líneas celulares dependientes de la presencia de TPO; c) inducción de un aumento en el recuento plaquetario sanguíneo en animales de laboratorio trombocitopénicos (estimulación in vivo de la producción plaquetaria) .

La secuencia nucleotídica identificada como NM 000460 y la secuencia aminoacídica identificada como SEQ N°l correspondiente de la hTPO completa es representada en la Tabla I (5) . Las secuencias NM 000460 y SEQ N°l representan un alelo simple del gen de la TPO humana del cual diferentes variantes alélicas pueden existir. Dichas variantes alélicas puden ser obtenidas mediante su clonado a partir células, tejidos o preparaciones de DNA provenientes de diferentes individuos. Dicha secuencia fue utilizada para la obtención de oligonucleótidos o "primers" necesarios para la amplificación del material específico de la trombopoyetina y su posterior clonado y purificación. En la presente invención se procedió a clonar y obtener el cDNA correspondiente a la Trombopoyetina humana completa incluyendo su peptido señal a partir de tejido hepático adulto normal. No se utilizaron fragmentos parciales ni modificados de la misma secuencia.

El plásmido de expresión construido en la presente invención (replicable en células de mamífero) como se ha descrito anteriormente, contiene secuencialmente : a) un promotor de la transcripción, derivado de un gen variable de una cadena kappa de inmunoglobulina humana obtenido a partir de un clon genómico de linfocitos B humanos; b) un primer segmento de ADN que codifica para el peptido señal específico de la hTPO; c) un segundo segmento de ADN que codifica para la totalidad de los residuos aminoacídicos de la hTPO; d) una secuencia aumentadora de la transcripción ( "enhancer" ) , derivado de una región intrónica de un gen kappa humano (obtenido de un clon genómico de linfocitos B humanos) ; e) una señal de poliadenilación; f) un terminador de la transcripción; g) la secuencia completa del gen de resistencia al antibiótico ampicilina, que permite la selección en sistemas bacterianos; h) la secuencia completa del gen de resistencia al antibiótico neomicina, que permite la selección en sistemas celulares eucariotas; i) un origen de replicación bacteriano que permite su expansión en bacterias; j) un origen de replicación eucariota que permite su expansión en células de mamífero. El producto directo de la transcripción y traducción del segmento de DNA que codifica para el peptido completo de la hTPO puede estar sujeto a un procesamiento post-traduccional mediante la adición de diferentes grupos químicos que incluyen entre otros la unión de carbohidratos mediantes enlaces químicos denominados de "N-glicosilación u O-glicosilación" . La naturaleza exacta de estas modificaciones post-traduccionales va a estar determinada en gran parte aunque no exclusivamente por el tipo de célula huésped utilizada para producir la hTPO recombinante .

Las células más adecuadas para usar con la presente invención incluyen cualquier tipo de célula de origen murino de estirpe linfocitaria B y más específicamente plasmocitaria que pueda: a) ser modificada para expresar un DNA/proteína heteróloga; b) ser mantenida y expandida en cultivos "in vitro" y c) tener una eficiente' via secretoria de proteínas. Las células de origen murino que cumplen con estos requisitos son ampliamente conocidas y disponibles públicamente a partir de la "American Type Culture Collection, Rockville,Ma.ryland (ATCC) " las cuales fueron derivadas en su mayoría a partir de células de mieloma murino que incluyen entre otras y a modo de referencia la línea X-63 (P63X63Ag.563 (ATCC N° de acceso CRL-1580) y SP2 (ATCC N° de acceso CRL-1581 y CRL-8287) . Para dirigir o guiar la hTPO hacia las rutas secretorias de la célula huésped se utiliza una secuencia de ??? que codifica para una secuencia o péptido señal secretorio la cual es usada en combinación y adyacente a la secuencia de DNA que codifica para la hTPO. El péptido señal puede ser aquel de la propia hTPO o bien un péptido señal heterólogo correspondiente a proteínas de secreción de cualquier célula eucariota. Cuando se utiliza un péptido señal heterólogo, su segmento respectivo debe ser ligado al segmento codificante de la hTPO en un marco de lectura correcto. En la presente invención se utilizó el péptido señal correspondiente a la hTPO nativa y su secuencia aminoacídica se describe en negrita sobre la SEQ N°l de la Tabla I . En general se requieren de fuertes promotores de la transcripción tales como promotores de inmunoglobulinas, promotores virales derivados de SV40, adenovirus ó citomegalovirus los cuales son incluidos aquí a modo de referencia .

La selección por drogas es un método ampliamente utilizado para seleccionar aquellas células de mamífero en cultivo que han incorporado exitosamente el plásmido de expresión. Dichas células referidas en la presente invención como "transfectantes" ó "transformadas" son cultivadas y expandidas selectivamente en presencia del agente de selección. Las células que en estas condiciones son capaces de transmitir el gen de interés a su progenie de generación en generación sin pérdida del mismo son denominadas genéricamente "transfectantes estables" ó "células establemente transfectadas" . La droga o marcador de selección preferido en la presente invención es el gen que transmite resitencia a los antibióticos del tipo de la neomicina como lo es el G-418 o similares. Otros agentes o drogas de selección utilizables pueden ser higromicina, gen MDR o de múltiple resistencia a drogas y puromicina acetiltransferasa .

Existen diversos métodos para incorporar ADN exógeno en células de mamífero, dentro de los cuales podemos destacar: a) transfección mediada por fosfato de calcio (13) ; b) electroporacion (14) ; c) transfección mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., Y, 1987); y d) transfección mediada por lípidos catiónicos (Hawley-Nelson et al, Focus 15: 73-79, 1993). El método preferido en esta invención consistió en la transfección por electroporacion.

Las células transfectadas son cultivadas en medios de cultivo convencionales, los cuales contienen nutrientes esenciales para el crecimiento celular, así como los antibióticos necesarios para seleccionar las células que' incorporaron el ADN exógeno.

La rhTPO producida por el sistema descrito en la presente invención puede ser usada desde el punto de vista terapéutico con el objetivo de aumentar la proliferación de células de la línea megacariocítica y por ende aumentar el número de plaquetas sanguíneas, en patologías tales como anemia aplásica, síndromes mielodisplásicos , citopenias postquimioterapia o congénitas, y trombocitopenias .

La trom ocitopenia es una patología asociada a una serie de situaciones clínicas, caracterizada por una disminución en el número de plaquetas, la cual se manifiesta por un sangrado aumentado de piel y mucosas. Un bajo número de plaquetas puede estar asociado a un déficit en su producción, a una distribución anormal, a pérdidas dilucionales posttransfusión, o a una destrucción plaquetaria anormal. Tanto la quimioterapia como la radioterapia anti-tumoral , usualmente suprimen el desarrollo normal de los progenitores plaquetarios de la médula ósea, y este elemento usualmente limita la potencia del acto terapéutico, necesitándose muchas veces una transfusión plaquetaria compensadora. La trombocitopenia, también puede ser desarrollada a partir de fenómenos autoinmunes inducidos por drogas, por agentes infecciosos, y a aloinmunidad neonatal o transfusional . Una destrucción anormal de plaquetas puede resultar de: a) un incremento del consumo de plaquetas en injertos vasculares o tejidos traumatizados; b) mecanismos inmunes asociados con trombocitopenias inducidas por drogas, púrpura trombocitopénico idiopático, enfermedades autoinmunes, patologías hematológicas tales como linfornas o leucemias, o metástasis tumorales involucrando la médula osea.

Para usos terapéuticos, la rhTPO debe ser formulada para su administración por vías parenteral, intravenosa o subcutánea, en combinación con vehículos f rmacéuticos aceptables (suero fisiológico) y una serie de exipientes, preservantes, solubilizadores, agentes amortiguadores, albúmina, etc. Además, la rhTPO puede asociarse con otras citoquinas tales como SCF, IL-3, IL-6, IL-11 o GM-CSF. Las dosis terapéuticas de rhTPO están en el rango de 0,1 a 100 µ /k de peso al día (preferiblemente 0,5 - 50 µg/kg al día) . La dosis exacta debe ser determinada por evaluación clínica en cada caso particular. La rhTPO se administra por un período de 28 días siguiendo la quimioterapia o el transplante de médula ósea, o hasta que el conteo plaquetario sea > a 20.000/µ1, preferiblemente 50.000 / µ? .

La rhTPO también puede ser usada en la expansión ex vivo de precursores sanguíneos en casos de transplantes autólogos. Este procedimiento, que tiene el objetivo de aumentar el número de precursores plaquetarios de médula ósea, se realiza mediante cultivo celular de células autólogas provenientes de médula ósea o de sangre periférica, en presencia de rhTPO, en combinación con otros factores de crecimiento (p.e. G-CSF, IL-11 e IL-3, entre otros).

La rhTPO también puede ser utilizada como herramienta de investigación en el estudio in vitro de la diferenciación y proliferación de progenitores plaquetarios humanos .

Otro uso potencial de esta rhTPO, concierne a su utilización en diferentes métodos diagnósticos que tengan como objetivo detectar la presencia de anticuerpos circulantes anti-TPO, los cuales han sido demostrados en el origen de un grupo de trombocitopenias autoinmunes .

La presente invención se ilustra en forma detallada por los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS : Ejemplo 1. Obtención de mRNA a partir de tejido hepático adulto normal para la obtención del cDNA específico de la Trombopoyetina humana.. Un fragmento de tejido hepático humano normal (50 mgrs) proveniente del lecho hepático de una pieza quirúrgica de colecistectomía fue procesado para la obtención del A total . La extracción del AR total se realizó mediante método clásicos basados en la extracción con tiocianato de guanidinio/fenol/cloroformo (15). El grado de pureza y concentración total de ARN obtenido se realizó mediante lectura espectrofotométrica de la relación de absorbancia a 260/280.

Ejemplo 2. Síntesis del ADN copia o Transcripción reversa del A n específico de la TPO humana. Síntesis del ADN copia (cDNA) monohebra por transcripción reversa a partir de 5 microgramos de ARN total hepático, mediante utilización de oligonucleótidos sintéticos Oligo (dT) i2-i8 y Transcriptasa Reversa (SuperScript ™ II, Gibco-BRL-Life Technologies) . La reacción se realizó en un volumen total de 20 µ? conteniendo: 4 µ? de tampón de reacción 5x (250 mM Tris-HCl pH 8.3; 350 mM KC1; 15 mM MgCl2; 0.1 M DTT) ; 1 µ? de Oligo (dT) 500 jug/ml; 2 µ? DTT 0.1 M. ; 1 µ? 10 mM dNTPs; 5 g de ARN total y completando a 20 µ? con agua.

Ejemplo 3. Amplificación del cDNA codificante para la proteína madura completa (hTPO) . Amplificación de la secuencia de interés por técnicas estándar de "nested PCR" (Polymerase Chain Reaction) mediante el diseño de un doble juego de oligonuleótidos y una combinación de DNA polimerasas termoestables para amplificar la secuencia que codifica para la proteína madura con alta especificidad y fidelidad de lectura. Se utilizó con tal objetivo, un sistema de amplificación de alta fidelidad compuesto por una mezcla adecuada de Taq polimerasa y Pwo DNA polimerasa (EHF; ExpandTM High Fidelity PCR System, Boehringer Mannheim) . La secuencia oligonucleotídica de los cebadores o "primers" utilizados para las dos rondas de amplificación se detallan en la Tabla II.

Las reacciones de amplificación se realizaron en un volumen total de 100 µ? con la adición de: 2 µ? (dNTPs 200 µ?) 3 µ? (oligonucleótido directo) 3 µ? (oligonucleótido reverso) 10 µ? (tampón 10X) 0.75 µ? (Polimerasas termoestables EHF) 5 µ? (cDNA) 76.25 µ? (agua pura) La primera ronda de amplificación se realizó con los primers externos TPOEXT-FOw y TPOEXT-REV (ver Tabla II A) y la reacción se incubó durante 30 ciclos de amplificación previa incubación de 2 min. a 95 °C.

- Los ciclos 1-10 fueron: 30 seg. a 95 °C 30 seg.. a 58 °C y 120 seg. a 72 °C. - Los ciclos 10-20 fueron: 30 seg. a 95 °C 30 seg.. a 58 °C y 240 seg. a 72 °C. - Los ciclos 20-30 fueron: 30 seg. a 95 °C 30 seg.. a 58 °C y 360 seg. a 72 °C. - Etapa de elongación final : 10 minutos a 72 °C.

La segunda ronda de amplificación se realizó con los primers internos TPOFOw y TP0EEv (ver Tabla II B) en idénticas condiciones de reacción pero con la sustitución de los 5 µ? de cDNA de la primera ronda por 2 µ? de la primer reacción de amplificación. Las condiciones de la reacción fueron de 20 ciclos previa incubación de 2 min. a 95 °C en las siguientes condiciones : - Los ciclos 1-10 fueron: 30 seg. a 95 °C 30 seg.. a 62 °C y 120 seg. a 72 °C.

- Los ciclos 10-15 fueron: 30 seg. a 95 °C 30 seg.. a 62 °C y 240 seg. a 72 °C. - Los ciclos 15-20 fueron: 30 seg. a 95 °C 30 seg.. a 62 °C y 360 seg. a 72 °C. - Etapa de elongación final : 10 minutos a 72 °C.

Ejemplo 4. Purificació y preparación del fragmento de hTPO amplificado para su clonado.. El producto de amplificatión es separado e identificado mediante electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% . La región del gel conteniendo la banda de 1107 pares de bases fue cortada y el DNA aislado y purificado del gel (Nucleiclean, Sigma) por técnicas que utilizan la capacidad de microesferas de fibra de vidrio para unir fuertemente el DNA en un medio saturante de ioduro de sodio el cual a su vez es capaz de disolver la agarosa y liberar el DNA para su aislamiento (16) . Posteriormente se realiza la extracción del DNA con fenol/cloroformo asociado a su lavado y precipitación en etanol, siendo finalmente resuspendido en 10 1 de agua. Con el objetivo de incorporar los nucleósidos de Adenina a los extremos 3 ' OH para el posterior clonado en vector A-T se procede a una incubación del fragmento purificado durante 10 minutos a 72 °C en presencia de Taq DNA polimerasa, tampon de reacción y dATP. El fragmento es nuevamente extraído y purificado mediante extracción en fenol-cloroformo, precipitación en etanol y posteriormente resuspendido en 20 µ? de agua pura. El fragmento queda asi preparado para su ligación en el vector de clonado A-T.

Ejemplo 5. Clonado del fragmento amplificado de hTPO en plásmido de clonado A-T. El fragmento purificado en el experimento 4 fue ligado con el plásmido pCR 2.1 (Original TA Cloning Kit; Invitrogen) . La ligación se realizó con el uso de la enzima T4 DMA ligasa (Boehringer Mannheim) , el vector pC 2 y el cDNA purificado de la TPO humana en un medio salino adecuado recomendado por los fabricantes según el siguiente esquema de reacción: - 2 fil de fragmento TPO purificado en Experimento 4. - 1 /íl de t mpón de ligación lOx - 2 µ? de vector pCR2.1 (25 ng/µ?) - 1 µ? de T4 DNA ligasa (4 unidades) - 4 µ? de agua pura La ligación enzimática se incubó a 14 °C durante 16 horas .

Con dichos plásmidos se procedió a transformar cepas competentes de E coli (One Shot™ TOP10F' ; Invitrogen) para la propagación de los mismos. Este tipo de vectores permitieron: a) Obtención de colonias bacterianas que incluyen el plásmido debido a la presencia de un gen de resistencia a la ampicilina; b) Identificación de colonias bacterianas con plásmidos que incluyen insertos de ADNc provenientes del material conteniendo el fragmento TPO. La misma se realiza en función de la presencia del gen lacZa.por el vector el cual es inducible por IPTG (IsoPropilTioGalactósido) permitiendo un rastreo de las mismos mediante identificación de colonias bacterianas blancas/azules según la hidrólisis de X-Gal; c) Expansión de las colonias positivas por minicultivo bacteriano en medio LB (Luria-Bertani) y purificación de plásmidos para estudios de restricción y secuenciación nucleotidíca de los insertos mediante uso de iniciadores de secuenciación M13) con el fin de verificar su secuencia nucleotídica . Luego del análisis por restricción se obtienen 10 colonias positivas denominadas correlativamente pCR2 TPO-1 hasta pCR2 TPO-10. De acuerdo a dicho análisis las colonias aisladas fueron distribuidas en 3 grupos : - Los clones pCR2-l, -2, -4 y -9 se corresponden con la secuencia correspodiente a la TPO humana con deleción de 12 bases (4 aa) idénticas a la isoforma denominada TP02_(17) Los clones' pCR2-5, -6, -7, -8 y -10 se corresponden con una secuencia correspodiente a la TPO humana completa nativa sin ninguna sustitución aminoacídica (17) . - El clon pCR2-9 se corresponde con la secuencia correspodiente a la TPO humana con una deleción de 116 bases idéntica a la isoforma TPO 3 (17) . La identidad de los insertos se realizó por secuenciación mediante el método clásico descrito por Sanger y colaboradores (18) utilizando un secuenciador automatizado (ALF-EXPRESS ; Pharmacia) . El secuenciado se realizó en forma total y sobre ambas hebras del ADN. La preparación plasmídica correspondiente al clon pCR2 TPO-5 fue seleccionada para continuar con las siguientes etapas experimentales.

Ejemplo 6. Construcción de un Plásmido (Vector) de expresión eucar ota (pK) . Se procede a construir un vector de expresión eucariota que cumple con las siguientes características: 1. Gen de resistencia a la neomicina (Meor) para la selección positiva de las células efectivamente transformadas en medio conteniendo neomicina (G-418) . 2. Secuencia promotora para genes de Inmunoglobulinas . 3. Región de clonado conteniendo los sitios de corte o restricción Cía I y Not I . 4. Secuencia Enhancer de la Transcripción de Inmunoglobulina Humana. 5. Origen de replicación procariota para E. coli (ColEl ori) . 6. Gen de resistencia a la ampicilina (Ampr) . 7. Origen de replicación eucariota derivado del SV40 (SV40 ori) Todos estos sectores se ordenaron en una forma lógica de forma de asegurar la transcripción y traducción del gen correspondiente a la rhTPO. Dicha construcción de DNA o de vector de expresión fue identificado como pK y se esquematiza gráficamente en la Figura 1.

Ejemplo 7. Estrategia de construcción del vector con la secuencia codificante para la TPO humana madura (pK-eTPO) . La construcción del vector pK con la inserción del fragmento de DNA codificante para la TPO humana y cuya secuencia fue totalmente verificada es denominado pK-eTPO. Un mapa gráfico de la estructura del vector pK-eTPO, incluyendo todos los segmentos funcionales relevantes del mismo se representan en la Figura 1 de la presente invención. Para su construcción se realizaron las siguientes etapas experimentales : Etapa 1. En una primera etapa se procedió al diseño de oligonucleótidos o primers de expresión (ver Tabla II C) , los cuales han sido denominados Cla-eTPOFOW Y Not-eTPOREV. Los mismos permitieron: 1. Amplificar la secuencia codificante de la TPO humana (hTPO) contenida en la preparación plasmidica pCR2 TPO- 5 2. Introducción de dos sitios de restricción {Cía I y Not I) con el fin de introducir la secuencia codificante completa de la hTPO incluyendo su péptido señal original en el vector pK luego de un proceso de ligación enzimática.

El fragmento amplificado de la TPO humana contenido en la fracción plasmídica pCR2 TPO-5 y que ha sido modificado para contener los sitios de restricción o corte Cía I y Not I fue denominado fragmento eTPO-5. La reacción de amplificación se realizaré en un volumen total de 50 µ? (Taq DNA polimerase kit; Gibco BRL-Life Technologies) : - 2.5 /il (dNTPs 10 mM) - 2.5 µ? (10 µ,? de Cla-eTPOFOW ) - 2.5 µ? (10 µ? de Not-eTPOREV) - 5 µ? (tampón 10X) - 0.5 l (Taq polimerasa) - 5 µ? (dilución 1/100.000 de pCR2 TPO-5) - 1.5 /il MgCl2 (50 mM) - 30.5 µ? (agua pura) Las condiciones de incubación fueron: 1 ciclo de 4 min. a 95 °C; 25 ciclos a 95 °C 30", 65 °C 30", 72 °C 30"; 1 ciclo final de 10 min. a 72 °C.

Etapa 2. Luego de la amplificación génica con la introducción de los sitios Cía I y Not I, el producto de amplificación es separado e identificado mediante electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% . La región del gel conteniendo la banda de 1090 pares de bases fue cortada y el DNA aislado y purificado del gel (Nucleiclean, Sigma) por técnicas que utilizan la capacidad de microesferas de fibra de vidrio para unir fuertemente el DNA en un medio saturante de ioduro de sodio el cual a su vez es capaz de disolver la agarosa y liberar el DNA para su aislamiento (16) Posteriormente se realiza la extracción del DNA con fenol/cloroformo asociado a su lavado y precipitación en etanol, siendo finalmente resuspendido en 15 µ? de agua.

Etapa 3. Se procede a la ligación del fragmento eTPO purificado en el vector pCR2.1 para análisis de restricción enzimática y secuenciado nucleotidico con el fin de verificar la identidad total del fragmento con la de la TPO humana nativa según el siguiente esquema de reacción: - 1 µ? de fragmento eTPO . - 1 µ? de tampón de ligación lOx - 2 /il de vector pCR2.1 (25 ng/µ?) - 1 µ? de T4 DNA ligasa (4 u.) - 5 µ? de agua pura La reacción se incuba a 14 °C por 16 hs . El producto de ligación fue utilizado para transformar cepas competentes de E coli (One Shot™ TOP10F' ; Invitrogen) para la propagación de los mismos de acuerdo a las especificaciones técnicas de su fabricante . Se procede a la identificación y aislamiento de 6 colonias bacterianas con plásmidos que incluyen insertos del fragmento eTPO y que fueron denominadas pCR2-eTPO 1 a 6. Se procede a minicultivos en medio LB en presencia de ampicilina y subsiguiente obtención del material plasmídico de cada una de ellas.

Etapa 4. La identidad y secuencia de los insertos eTPO-1 a 6 fueron verificados mediante el perfil de restricción con BanH I y posteriormente secuenciado para verificar la secuencia nucleotídica en forma total y sobre ambas hebras del ADN, mediante el método clásico descrito por Sanger y colaboradores (18) utilizando un secuenciador automatizado (ALF-EXPRESS ; Pharmacia) . La Tabla I muestra la secuencia nucleotídica identificada como "ETPO", correspondiente al plásmido pCR2 -eTPO 2 en comparación con la secuencia de referencia N 000460 (de Sauvage et al, 1994) . Como se demuestra en dicha tabla la secuencia obtenida presenta una identidad total con la secuencia de referencia. El plásmido pCR2-eTPO 2 fue seleccionado para las etapas subsiguientes.

Etapa 5. El vector de expresión eucariota pK fue digerido enzimaticamente con el uso de las enzimas Cía I y Not I como etapa previa a la ligación del fragmento eTPO. Para tal digestión se realizó la siguiente reacción enzimática e incubado a 37 °C durante 4 horas: - 10.0 µ? de preparación plasmídica del vector pK 2.0 /il de preparación enzimática de Cía I (Sigma) 1.5 /il de preparación enzimática de Not I (Sigma) 5.0 µ? tampón 10X - 31.5 /il de agua pura El vector linearizado luego de la digestión enzimática es separado e identificado mediante electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% . La región del gel conteniendo el vector fue cortada y el DNA aislado y purificado del gel por electroelución en membranas de diálisis. Posteriormente se realiza la extracción del DNA con fenol/cloroformo asociado a su lavado y precipitación en etanol, siendo finalmente resuspendido en 15 µ? de agua.

Etapa 6. El plásmido pCR2-eTP0 2 fue digerido enzimáticamente con el uso de las enzimas Cía I y Not I para la obtención del fragmento eTPO-2. Para tal digestión se realizó la siguiente reacción enzimática e incubado a 37 °C durante 4 horas: 5.0 µ? de preparación plasmídica del plásmido pCR2-eTPO 2 2.0 µ? de preparación enzimática de Cía I (Sigma) 1.5 µ? de preparación enzimática de Not I (Sigma) 5.0 µ? tampón 10X - 36.5 de agua pura El fragmento eTPO-2 es separado mediante electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% . La región del gel conteniendo el fragmento fue cortada y el DNA aislado y purificado del gel (Nucleiclean, Sigma) por técnicas que utilizan la capacidad de microesferas de fibra de vidrio para unir fuertemente el DNA en un medio saturante de ioduro de sodio el cual a su vez es capaz de disolver la agarosa y liberar el DNA para su aislamiento (16) Posteriormente se realiza la extracción del DNA con fenol/cloroformo asociado a su lavado y precipitación en etanol, siendo finalmente resuspendido en 15 µ? de agua.

Etapa 7. Se realiza la ligación del vector pK con el fragmento eTPO-2 purificados. La reacción de ligación se realiza mediante el uso de T4 DNA ligasa (Pharmacia) según las especificaciones técnicas del fabricante. El producto de ligación denominado pKeTPO es purificado mediante métodos clásicos de extracción en fenol -cloroformo y precipitación con etanol siendo finalmente recuperado en 15 µ? de agua pura.

Etapa 8. Se procede a la transformación de E. coli cepa XL-1 con la construcción pKeTPO mediante electroporacion. En cubeta de 1 mm se colocan 40 µ? de XL-1 electrocompetentes mas 2 µ? de ligación purificada en la etapa 5. Se dispara un pulso de 1380 V con una resistencia de 129 O; capacitancia 50 µ¥ durante 5 milisegundos . Luego del pulso se agregan 800 µ? de medio LB (Luria-Bertani) . Luego de una incubación de 45 minutos a 37 °C en incubador orbital a 200 rpm, se procede a sembrar placas de LB-agar-ampicilina. Se aislan 2 colonias positivas las cuales son expandidas por minicultivo en medio LB con ampicilina. Sobre las mismas se realiza extracción del material plasmídico mediante métodos convencionales ("miniprep") para ensayos de verificación del inserto mediante amplificación génica y análisis con enzimas de restricción. Se obtiene así una fracción plasmídica purificada de pKeTPO.

Ejemplo 8. Linearización del vector pKeTPO con Pvu I y selección de la línea celular de mamífero. Una vez obtenido el vector de expresión eucariota pKeTPO se procedió a la selección de la línea celular de mamífero derivada de mieloma murino comúnmente conocida como X-63 (P3X63Ag8.653 , ATCC N° CRL 1580) aunque cualquier célula derivada de mamífero puede eventualmente ser utilizada con la presente plásmido de expresión. Su selección ofrece como ventajas, sobre otras células de mamífero: a) la presencia de un sistema de síntesis y secreción de proteínas (Inmunoglobulinas) de alta eficiencia y que se adapta perfectamente al vector de expresión diseñado en el presente trabajo el cual incluye un promotor de genes de inmunoglobulinas asociado a un segmento génico aumentador de su transcripción ( "enhancer" ) . Adicionalmente es capaz de crecer indefinidamente in vitro en medios de cultivo tales como RPMI-1640 suplementado con Suero Fetal Bovino al 10% usado para la presente invención. .El vector pKeTPO fue previamente linearizado mediante corte de restricción con la enzima Pvu I (Boehringer Mannheim) según el siguiente esquema de reacción: - 20 µ? de fracción plasmídica pKeTPO - 5 µ? de tampón H (10X) - 2 /il de Pvu I - 23 /il de agua pura La reacción se incubó a 37 °C durante 4 horas y el material se purificó mediante extracción en fenol- cloroformo, precipitación con etanol y recuperado en 10 µ? de agua pura.

E emplo 9. Transformación de células X-63 (mieloma murino) con el vector pKeTPO. Las células de mamífero X-63 descritas en el ejemplo 8 precedente se prepararon mediante expansión in vi tro en RPMI-1640 (Gibco BRL-Life Technologies) al 10% Suero Bovino Fetal. Luego fueron lavadas en RPMI-1640 sin suero fetal. Las células se resuspenden a una concentración de 1.5 millones de células en 800 µ? de RPMI-1640 sin suero fetal. Los 800 µ? de células son traspasadas a una cubeta de electroporación de 2 mm y se agrega 10 microgramos del plásmido pKeTPO.

La electroporación (BTX Electroporation System 600; Genetronics Biomedical LTD) se realizó con un pulso de 13 milisegundos en las siguientes condiciones: - C: 1200 µ ; R: 48 O; V: 210 V; E: 1.050 kV/cm Las células electroporadas (transformadas) son cultivadas durante 24 horas en medio RPMI-1640 al 20% de Suero Bovino Fetal (SBF) a 37°C y una atmósfera de C02 del 5% saturada en vapor de agua Ejemplo 10. Rastreo y selección de clones celulares productores de TPO recombinante humana. Luego de la transformación de células X-63 con el vector pKeTPO las mismas se distribuyeron en 3 grupos de cultivo diferentes (cultivos madre I, II y III) en presencia de Neomicina (lmg/ml) . El medio de cultivo base consistió en RPMI-1640 al 10% de SBF con la adición de estreptomicina-penicilina (50 mcg/ml y y 100 Ul/ml respectivamente) 2 m L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio y Hepes 10 mM (Medio de crecimiento) . Luego de 15 dias de expansión con un recambio semanal de medio de cultivo se procedió al análisis de secreción de TPO recombinante en los respectivos sobrenadantes, mediante western-blot con la utilización de anticuerpos anti-TPO humana (RDI; Research Diagnostic Inc.)- Como controles negativos se utilizaron sobrenadantes de células X-63 transformadas con el vector pKkappa (por procedimientos idénticos a los de la TPO) que incluye la cadena liviana kappa humana de inmunoglobulina en lugar del inserto correspondiente a la rhTPO. El cultivo madre II resultó ser débilmente positivo a la presencia de rhTPO por lo que se procedió al clonado por dilución límite (dilución celular a razón de 0,3 célula/pocilios en placas de 96 pocilios en medio RPMI-1640 de crecimiento con 20% de suero bovino fetal y de 1 mg/ml neomicina. Luego de 15 días se observó el desarrollo de 58 clones resistentes a la neomicina cuyos sobrenadantes fueron procesados para evaluar la presencia de rhTPO por western-blot. Dicho análisis reveló la presencia de 16 clones productores y secretores de rhTPO. Un clon denominado 2A4 fue aislado debido a la presencia de cantidades significativas de hrTPO en los sobrenadantes de cultivo y nuevamente clonado por dilución límite para asegurar la clonalldad. Como se muestra en la Figura 2 de la presente invención, luego del análisis por Western-blot anti-trombopoyetina humana se seleccionó el subclon N° 16 de 2A4 y por tanto se le denominó clon 2A4-16. La estabilidad en la producción de rhTPO por el subclon 2A4-16 fue evaluada luego de 8 semanas de cultivo ininterrumpido (ver Figura 2) . Este clon de células X-63 denominado 2A4-16 y productor de trombopoietina humana recombinante soluble y en forma estable fue denominado en adelante Clon X-63eTPO.

Ejemplo 11. Análisis de la presencia y actividad biológica de la trombopoyetina humana recombinante producida en el presente sistema de expresión. Se procedió a realizar los ensayos de actividad biológica in vi tro a partir de sobrenadantes de cultivos de X-63eTPO a una concentración de 0.6xl06 células/ml en presencia de RPMI-1640 10% SBF y neomicina: - Determinación de la concentración de TPO por test de ELISA. Se realizó un test de ELISA utilizando un kit para TPO humana (Quantikine, R&D Systems) . La concentración determinada fue de aprox. 0.5 mcg/ml en condiciones de cultivo estándar de laboratorio.

- Test de proliferación in vitro de la linea Baf-mpl.

La línea Baf-mpl (depositada el 28 de setiembre de 1994, bajo los términos del tratado de Budapest de la ATCC con número de acceso asignado CRL-11723) correponde a la línea murina Baf-B03 transfectada con el receptor mpl (receptor de la TPO) . La línea parental Baf-B03 es dependiente de IL-3 y la línea transfectada Baf-mpl es dependiente de IL-3 o TPO. El test consiste en incubar las células en presencia de diferentes concentraciones de citoquinas o del sobrenadante a testar durante 48 horas. Luego de este período se incuba con timidina tritiada durante 4 horas al cabo de las cuales se recuperan las células sobre un filtro y que luego se pasan a viales determinándose la radioactividad de las muestras en contador de centelleo líquido. Se realizaron 2 experiencias en placa de 96 pocilios testando los sobrenadantes a diferentes concentraciones 10%, 3%, 1%, 0.3%, 0.1%, 0.03%, 0.01% y 0.003% por triplicado sobre las células Baf-mpl (30.000 células/pocilio). Se realizó curva dosis-respuesta con TPO estándar a concentraciones de 10 ng/ml, 3 ng/ml, 1 ng/ml, 0.3 ng/ml, 0.1 ng/ml, 0.03 ng/ml, 0.01 ng/ml y 0.003 ng/ml. Se realizó un control interno con IL-3 para asegurarse que la línea celular responde a las citoquinas analizadas. Se realizó control negativo sin factores de crecimiento. Se testó la presencia de inhibidores en el sobrenadante agregando TPOrhu y el sobrenadante a testar. Se realizó igual procedimiento con la línea parental Baf-B03 para descartar un efecto IL-3 en los sobrenadantes testados. Ambas experiencias mostraron resultados similares indicando una actividad próxima a 0.4 mcg/ml de la rhTPO estándar en el sobrenadante de cultivo de X-63eTPO.

- Ensayos in vitro de diferenciación y proliferación de progenitores megacariocíticos a partir de células CD34+ de médula ósea. Las células CD34+ de médula ósea son obtenidas mediante centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque y posterior selección por procedimiento inmunomagnético (Miltenyi, MiniMACS) . Estas células son cultivadas en medio líquido en condiciones que permiten la diferenciación hacia la línea megacariocítica . Estas condiciones incluyen medio de cultivo sin suero fetal bovino (FCS) compuesto por medio Iscove suplementado con transferrina, insulina, seroalbúmina bovina y liposomas y en presencia de trombopoyetina. Se realizaron cultivos en placas de 24 pocilios de células CD34+ de médula ósea (100.000 células/pocilio) en presencia de diferentes diluciones de rhTPO estándar o sobrenadantes del clon X-63eTPO . Al cabo de 10 dias se analiza la proliferación celular (número de células) y porcentaje de megacariocitos producidos mediante marcado con anticuerpo fluorescente CD41 FITC y analizado por citometría de flujo. Se testaron 4 concentraciones para la rhTPO (20 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml, 2.5 ng/ml) obteniéndose una conservación en el número de células con un porcentaje de megacariocitos (células CD41postivas) del 70%. Los sobrenadante de X-63eTPO se testaron en 3 concentraciones: 10%, 5% y 2.5% obteniéndose un aumento en la proliferación de 3, 2 y 1,5 veces, respectivamente. En cuanto a la maduración megacariocítica obtuvimos un porcentaje células CD41+ del 75 % en los tres casos, es decir que el número absoluto de megacariocitos varía según la concentración del sobrenadante estando relacionado con la proliferación celular. Resultados representativos obtenidos mediante citometría de flujo son representados gráficamente en la Figura 3 , en donde se puede apreciar que el sobrenadante de cultivo al 2.5% es capaz de inducir un nivel de expresión equivalente a aquel inducido con 5 ng/ml de TPO humana estándar Tabla I . Comparación de la secuencia nucleotidica y aminoacídica de eTPO con la secuencia de referencia NM 000460 [de Sauvage et al, Nature 369, 533-538 (1994)] SEQ N°l M E L T E L L L V V M L L L T A NM 000460 CATATCGATTTCTCACAATGGAGCTGACTGAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCTCCTAACTGCA ETPO SEQ N°l R L T L S S P A P P A C D L R V L S L L R NM 000460 AGGCTAACGCTGTCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGT ETPO SEQ N°l D S H V L H S R L S Q C P E V H P L P T P V NM 000460 GACTCCCATGTCCTTCACAGCAGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTC ETPO SEQ N°l L L P A V D F S L G E W T Q M E E T A Q NM 000460 CTGCTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCACAG ETPO SEQ N°l D I L G A V T L L L E G V M A A R G Q L G P NM 000460 GACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAACTGGGACCC ETPO SEQ N°l T C L S S L L G Q L S G Q V R L L L G A L Q NM 000460 ACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTCCTTGGGGCCCTGCAG ETPO SEQ ?? S L L G T Q L P P Q G R T T A H K D P N A I M 000460 AGCCTCCTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCTCACAAGGATCCCAATGCCATC ETPO SEQ N°l F L S F Q H L L R G K V R F L M L V G G S T NM 000460 TTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGTTTGCTGATGCTTGTAGGAGGGTCCACC ETPO SEQ N°l L C V R R A P P T T A V P S R T S L V L T L NM 000460 CTCTGCGTCAGGCGGGCCCCACCCACCACAGCTGTCCCCAGCAGAACCTCTCTAGTCCTCACACTG ETPO SEQ N°l N E L P N R T S G L L E T N F T A S A R T T M 000460 AACGAGCTCCCAAACAGGACTTCTGGATTGTTGGAGACAAACTTCACTGCCTCAGCCAGAACTACT ETPO SEQ N°l G S G L L K W Q Q G F R A K I P G L L N Q T 000460 GGCTCTGGGCTTCTGAAGTGGCAGCAGGGATTCAGAGCCAAGATTCCTGGTCTGCTGAACCAAACC ETPO SEQ N°l S R S L D Q I P G Y L N R I H E L I- N G T R M 000460 TCCAGGTCCCTGGACCAAATCCCCGGATACCTGAACAGGATACACGAACTCTTGAATGGAACTCGT ETPO SEQ W°l G L F P G P S R R T L G A P D I S S G T S D M 000460 GGACTCTTTCCTGGACCCTCACGCAGGACCCTAGGAGCCCCGGACATTTCCTCAGGAACATCAGAC ETPO SEQ N°l T G S L P P N L Q P G Y S P S P T H P P T G KM 000460 ACAGGCTCCCTGCCACCCAACCTCCAGCCTGGATATTCTCCTTCCCCAACCCATCCTCCTACTGGA ETPO SEQ N°l Q Y T L F P L P P T L P T P V V Q L H P L L NM 000460 CAGTATACGCTCTTCCCTCTTCCACCCACCTTGCCCACCCCTGTGGTCCAGCTCCACCCCCTGCTT ETPO SEQ N°l P D P S A P T P T P T S P L L N T S Y T H S KM 000460 CCTGACCCTTCTGCTCCAACGCCCACCCCTACCAGCCCTCTTCTAAACACATCCTACACCCACTCC ETPO SEQ N"l Q N L S Q E G # M 000460 CAGAATCTGTCTCAGGAAGGGTAAGCGGCCGCTCT ETPO Los puntos (.) indican identidad nucleotídica, los guiones (-) identidad aminoacídica, (#) representa el codon stop final . En subrayado se encuentran señalados el primer Cla-eTPOFow y el reverso complementario de Not-eTPOREV. En negrita se representa la secuencia aminoacídica correspondiente al péptido señal .

Tabla II . Oligonucleótidos usados para la amplificación por "nested PCR" de la TPO humana y para su clonado en vector de expresión.

A. Juego de oligonucleótidos externos usados en la primera ronda de amplificación.

- TPOEXT-FO - Oligonucleotido externo directo (5' -3') CAG GAA GGA TTC AGG GGA GAG G - ??????-REV· Oligonucleotido externo reverso (5'-3') GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA C B. Juego de oligonucleótidos internos usados en la segunda ronda de amplificación.

- TPOFOW- Oligonucleotido interno directo (5' -3') AGC CAC GCC AGC CAG ACA CCC C - TPOREV Oligonucleotido interno reverso (5' -3') GCA GTG TCT GAG AAC CTT ACC C Juego de oligonucleótidos usados para amplificar fragmento de TPO a ser clonado en vector de expresión con sitios de restricción Clal y Not I.

- Cla- eTPOpow - CAT ATC GAT TTC TCA CAA TGG AGC TGA CTG AAT TGC TCC - Not- eTPOREV .

AGA GCG GCC GCT TAC CCT TCC TGA GAC AGA TTC TGG G PRINCIPALES REFERENCIAS BIBLIOGR FICAS CITADAS Kuter, D. J. 1996. Thrombopoietin : Biology and Clinical Applications. The Oncologist 1:98. Kelemen, E., I. Cserhati, and B. Taños. 1958.

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Claims (3)

(5) .REIVINDICACIONES Se solicita la Protección intelectual de la Patente de Invención denominada "SISTEMA. DE PRODUCCION DE TROMBOPOYETINA HUMANA POR CELULAS DE MAMIFERO EN CULTIVO"

1. Un plásmido de expresión replicable en células de mamífero conteniendo los siguientes elementos agrupados de forma de asegurar una correcta y eficiente transcripción, el cual incluye: a) un promotor de la transcripción correspondiente a un gen variable de inmunoglobulinas humanas b) un segmento de DNA codificante para el polipéptido completo de la Trombopoyetina Humana incluyendo su propio péptido señal c) un segmento de DNA aumentador o potenciador de la transcripción a partir del promotor de Inmunoglobulina denominado " enhancer" el cual deriva de un sector intrónico del gen variable kappa de inmunoglobulinas humanas d) una señal de terminación de la transcripción e) una señal de poliadenilación f) un segmento génico que confiere resistencia a la neomicina g) un segmento génico que confiere resistencia a la ampieilina h) un origen de replicación para E. coli (ColEl ori) .

2. - Una línea celular derivada de mieloma murino denominada X-63eTPO, la cual fue obtenida mediante modificación genética de la línea X-63 (designación de la ATCC: P3X63Ag8.653 , CRL 1580) a través de la transfección en forma estable de la construcción de DNA descrita en la reivindicación 1, y que es capaz de producir y secretar al medio de cultivo el polipéptido trombopoyetina humana recombinante biológicamente activa.

3. Los procedimientos para la preparación de hTPO que utilicen a la línea celular descrita en la Reivindicación 2.