CZ346799A3

CZ346799A3 - Chimérické proteiny jako flt3 ligandy

Info

Publication number: CZ346799A3
Application number: CZ19993467A
Authority: CZ
Inventors: Dennis A. Bennet; Nicholas R. Staten; Christopher S. Bauer; John P. Mckearn
Original assignee: G. D. Searle & Co. Corporate Patentdepartment
Priority date: 1998-04-10
Filing date: 1998-04-10
Publication date: 2000-03-15

Abstract

Nové chimérické proteiny nebo též proteiny multifunkčmch - agonistů hematopoietických receptorů obsahujících flt3 agonistu, DNA, které kódují proteinymultifunkčmch agonistů hematopoietických receptorů, způsoby přípravy proteinů multifúnkčních agonistů hematopoietických receptorů a způsoby použití proteinů multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů. ·

Description

Přihláška je částenou pokračovácí přihláškou 08/837,026 podanou 11. dubna 1997, čímž je zde zahrnuta odkazem.

Oblast techniky ’ / .......

> · Vynález se týká chimérických proteinů nebo multi-funkčních agonistů hematopoietických > receptorů, zahrnujících agonistů lidského flt3. Tyto chimérické proteiny si ponechávají jednu, nebo více aktivit nativních flt3 ligandů a zároveň jednu, nebo více aktivit druhé ze složek chimérického · proteinu. Chimérické proteiny mohou též vykazovat zvýšené hematopoietické buňky stimulující aktivity,' nebo aktivity, které nepozorujeme u flt3 ligandu a dalšího faktoru, jsouli· podávány současně. Chimérické proteiny mohou rovněž vykazovat výhodnější profil aktivity, cóž může zahrnovat redukci nežádoucích biologických účinků spojených s nativním flt3 ligandem a/nebo může vykazovat výhodnější fyzikální vlastnosti, což může zahrnovat zvýšenou . rozpustnost, stabilitu a účinnost správného znovusvinutí. '

Dosavadní stav techniky ‘ ^L

Kolonie stimulující faktory, které stimulují diferenciaci a/nebo proliferaci buněk kostní dřeně vyvolávají mnoho zájmu pro jejich terapeutický potenciál obnovovat snížené hladiny hémátopoietických buněk pocházejících z kmenových buněk. Kolonie stimulující faktory v lidském i myším systému byly identifikovány a rozlišeny podle svých aktivit. Například granulocytový-CSF (G-CSF) a makrofágový-CSF (M-CSF) stimulují in-vitro tvorbu kolonií neutrofilních granulocytů a makrofágů, zatímco GM-CSF a interleukin-3 (IL-3) mají širší aktivity a stimulují tvorbu kolonií makrofágů, neutrofilních a eosinofilních granulocytů. Jisté faktory jako

IV jsou flt3 ligandy jsou schopné působit převážně na kmenové buňky.

_s Tyrosinkinasové receptory jsou receptory růstových faktorů regulujících proliferaci a diferenciaci mnoha typů buněk. Jisté tyrosinkinasové receptory mají funkci i systému krvetvorby. Flt3 (Roseate et al., Oncogene, 6:1641-1650, 1991) a flk-2 (Matthews et al., Cell, 65:1143-1152, 1991) jsou formy tyrosinkinasových receptorů příbuzných c-fins a c-kit receptorů. Receptory flk-2 a flt3 jsou si podobné svou aminokyselinovou sekvencí a liší se dvěma aminokyselinovými zbytky v extracelulámí doméně a také v 31 aminokyselinovém segmentu umístěném blízko Ckonce.

* -·.·< ' ' Ftl3 ligand je hematopoietický růstový faktor, který má schopnost regulovat růst a diferenciaci hematopoietických prekurzorových a kmenových buněk. Pro svou schopnost podporovat růst a proliferaci prekurzorových buněk mají agonisté ftl3 receptoru potenciální terapeutické použití při léčbě poruch krvetvorby jako je aplastická anemie a myelodisplastické syndromy. Navíc budou agonisté flt3 receptoru použitelní pro obnovu hematopoietických buněk k normálním množstvím v těch případech, kdy byl počet těchto buněk snížen z důvodu nemoci, nebo terapeutického zásahu jako je radiace nebo chemoterapie.

WO 94/28391 uveřejňuje proteinové sekvence nativních ftl3 ligandů a cDNA sekvence ·; kódující ftl3 ligandy, metody exprese flt3 ligandů v hostitelských buňkách transfekovaných cDNA a metody léčby pacientů s poruchami krvetvorby pomocí ftl3 ligandů.

US patent číslo 5,554,512 je zaměřen na lidský flt3 ligand jako izolovaný protein, DNA kódující flt3 ligand, hostitelské buňky transfekované cDNA kódující flt3 ligand a metody léčby pacientů pomocí flt3 ligandů.

WO 94/26891 uvádí savčí flt3 ligandy, včetně isolátu který obsahuje insert s 29 aminokyselinami nebo jeho fragmenty.

Lidský systém krvetvorby (hematopoese) je schopen nahradit různé typy bílých krvinek (včetně neutrofilů, makrofágů a basofílů (žímých buněk), červených krvinek (erytrocytů) a buněk podílejících se na tvorbě sraženiny (megakaryocytů/destiček). Odhaduje se, že hematopoietický systém průměrného savce je schopen vyprodukovat řádově asi 4,5 x 10¹¹ granulocytů a erytrocytů každý rok, což je ekvivalentní celkové hmotnosti těla (Dexter et al., BioEssays, 2:154-158, 1985).

US patent 4,999,291 uveřejňuje DNA a metody pro přípravu G-CSF, které jsou zde uvedeny ve formě úplného odkazu.

US patent 4,810,643 se týká DNA a metod přípravy G-CSF a varianty G-CSF se substitucí Ser za Cys.

Kuga et al. (Biochem. + Biophys. Res. Comm. 159:103-111, 1988) připravil sérii variant fe G-CSF částečně ukazující vztah struktury a funkce. Kuga et al. zjistil, že vnitřní a C-terminální delece ruší aktivitu, zatímco N-terminální delece až do 11 aminokyselin a aminokyselinové substituce na pozicích 1, 2, a 3 byly aktivní.

Watanabe et al. (Anal. Biochem. 195: 38-44, 1991) zkonstruoval pro studium jeho vazby na receptor variantu G-CSF, kde 1 a 3 aminokyselina byla zaměněna za tyrosin kvůli radiojodaci proteinu. Watanabe et al. zjistil, že Tyr¹, Tyr³ varianta G-CSF byla aktivní..

• ·

Erythropoietin je přirozeně se vyskytující glykoproteinový hormon jehož molekulová hmotnost byla nejprve stanovena na 39 000 daltonů (T. Miyaki et al., J. Biol. Chem. 252:55585564 (1977)). Hotový hormon je 166 aminokyselin dlouhý a „preprotein“ tohoto hormonu s jeho vedoucím peptidem je 193 aminokyselin dlouhý (F. Lin, U.S. patent č. 4,703,008). Hotový hormon má molekulovou hmotnost, vypočítanou z jeho aminokyselinové sekvence, 18 399 daltonů (K. Jakobs et al., Nátuře 313:806-810 (1985); J.K. Browne et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 5:1693-702 (1986)).

První mutantní erythropoietiny (tj. analoga erythropoietinu), připravené aminokyselinovými substitucemi a delecemi, vykazovaly sníženou nebo nezměněnou aktivitu. Jak bylo popsáno v U.S. patentu č. 4,703,008, nahrazení tyrosinového zbytku na pozici 15, 40, a 145 fenylalaninovými zbytky, nahrazení cysteinových zbytků na pozici 7 histidinem, substituce prolinu na pozici 2 asparaginem, delecě zbytků 2-6, delece zbytků 163-166, delece zbytků 27-55 nezpůsobila nárůst biologické aktivity. Nahrazení Cys⁷ za Hys⁷ zruší biologickou aktivitu. Serie mutantních erythropoietinů s jednou aminokyselinovou substitucí asparaginových zbytků 24, 38, nebo 83 vykazovala několikanásobně sníženou aktivitu (substituce na pozici 24) nebo rychlou intracelulárrií degradaci a zdánlivou nepřítomnost sekrece (substituce zbytků 38 nebo 183). Eliminace O-glykosylačního místa, šeřinu 126, vede k rychlé degradaci nebo ztrátě sekrece analoga erythropoietinu (S. Dube et al., J. Biol. Chem. 33: 17516-17521 (1988)). Tito autoři shrnuli své poznatky tak, že glykosylační místa na zbytcích 38, 83, a 126 jsou nezbytná pro správnou sekreci, a že glykosylační místa na zbytcích 24 a 38 mohou být zapojena do biologické aktivity hotového erythropoietinu.

Deglykosylovaný erythropoietin je plně aktivní v in vitro stanovení (M. S. Dorsdal et al., Endokrinology 116:2293-2299 (1985); U.S. patent č. 4,703, 008; E. Tsunda et al., Eur. J. Biochem. 266:20434-20439 (1991). Ačkoliv je glykosylace erythropoietinu široce přijímána jako faktor hrající klíčovou úlohu při in vivo aktivitě hormonu (P. H. Lowy et al., Nátuře 185:102-105 (1960); E. Goldwasser a C. K. H. Kung, Ann. N. Y. Acad. Science 149:49-53 (1968); W. A. Lukowsky a R. H. Painter, Can. J. Biochem. :9é9-917 (1972); D. W. Briggs et al., Amer. J. Phys. 201:1385-1388 (1974); J. C. Schooley, Exp. Hematol. 13:994-998; N. Imai et al., Eur. J. Biochem. 1994: 454-462 (1990); M. S. Dordal et al., Endokrinology 116: 2293-2299 (1985); E. Tsunda et al. , Eur. J. Biochem. 188: 405-411 (1990); U.S. patent č. 4,703,008; J. K. Brown et aí, Cold Spring Harbor Symposia on Quant. Biol. 51:693-702 (1986); a K. Yamaguchi et al., J. Biol. Chem. 266: 20434-20439 (1991). Ztráta in vivo biologické aktivity deglykosylovaných analog erythropoietinu je připisována rychlému clearens deglykosylovaného hormonu z oběhu testovaných zvířat. Tento názor je podpořen přímým srovnáním poločasu glykosylováného a deglykosylováného erythropoietinu v plasmě (J. C. Spivak a B. B. Hoyans, Blood 73: 90-99 (1989), a Μ. N. Fukuda, et al., Blood 73: 84-89 (1989).

Oligonukleotidem řízená mutagenese erythropoietinových glykosylačních míst účinně prověřila funkci giykosylace, ale dosud neposkytla návod na efektivní strategii pro signifikantní

Ž vylepšení charakteristik hormonu pro terapeutické aplikace.

Série mutantů erythropoietinu s jednou aminokyselinovou substitucí nebo delecí se týká aminokyselinových zbytků 15, 24, 49, 76, 78, 83, 143, 145, 160, 162, 163, 164, 165, a 166. V v

těchto mutantech jsou pozměněny karboxykonec, glykosylační místa a tyrosinové zbytky μ , erythropoietinu. Mutantní formy byly podávány pokusným zvířatům a přitom byly sledovány , hladiny hemoglobinu, hematokritu a retikulocytů (EP č. 0409113). Zatímco mnoho z těchto mutantních forem si zachovalo biologickou aktivitu in vivo, žádný nevykazoval signifikantní nárůst v jejich schopnosti zvyšovat hladiny hemoglobinu, hematokritu nebo retikulocýtů (přímých prekursorů erythrocytů) v porovnání s nativním erythropoietinem.

Jiná sada mutantů byla zkonstruována pro ověření funkce zbytků 99-199 (doména 1) a zbytků 111-129 (doména 2) (Y. Chem et al., Eur. J. Biochem. 202:225-230 (1991)). Mutanti v doméně 1 jsou rychle degradováni a inaktivní při in vitro stanovení, zatímco mutanti v doméně 2 si přinejlepším zachovávají svou in vitro aktivitu. Tito mutanti také vykazují nezvýšenou in vivo biologickou aktivitu v porovnání s divokým typem lidského erythropoietinu. Autoři shrnuli, že zbytky 99-199 hrají kritickou úlohu ve struktuře erythropoietinu.

Molekula lidského erythropoietinu obsahuje dva disulfidické můstky, jeden spojuje cysteinové zbytky na pozicích 7 a 161 a druhý spojuje cysteiny na pozicích 29 a 33 (P. El. Lai et al., J. Biol. Chem. 261:3116-3121 (1986)). Pro zjištění funkce disulfidických můstků spojujících ₍ cysteiny na pozicích 29 a 33 lidského erythropoietinu byla použita oligonukleotidem řízená mutagenese. Cystein na pozici 33 byl zaměněn za prolinový zbytek, který simuloval strukturu myšího erithropoietinu v tomto zbytku. Vzniklý mutant měl silně sníženou in vitro aktivitu. Ztráta aktivity byla tak prudká, že autoři vyvodili, že disulfidický můstek mezi zbytky 29 a 33 je ₍ esenciální pro funkci erythropoietinu (F. K. Lin, Molecular and Cellular Aspects of Erythropoietin and Erythropoiesis, str. 23-26, ed. I. N. Rich, Springer-Verlag, Berlin (1987)).

U. S. patent č. 4,703,008 autora Lin, F-K. (zde uvedený jako patent „008“) spekuluje o širokém spektru modifikací EPO, včetně inzerčních, delečních a substitučních analog EPO. Patent „008“ nenaznačuje, že by některá z navrhovaných modifikací měla zvýšenou biologickou aktivitu, ačkoliv bylo zjištěno, že delece glykosylačních míst může zvýšit aktivitu EPO produkovaného v ' t . , . . , '' i ' si, . ’ *· kvasnicích (viz „008“ patent, oddíl 37, řádek 25-28). Patent „008“ rovněž spekuluje o tom, že analoga EPO, které měli jeden, nebo více tyrosinových zbytků nahrazeno fenylalaninem mohou vykazovat zvýšenou, nebo sníženou afinitu k receptoru.

Australská patentová přihláška č. AU-A-59145/90 autorů Fibi, M et al. rovněž diskutuje velký počet modifikovaných EPO proteinů (EPO muteinů). Byly zkoumány záměny aminokyselin 10-55, 70-85 a 130-166 EPO. Zvláště připojení kladně nabitých aminokyselin na karboxykonec .znamenalo zvýšení biologické aktivity EPO.

U.S. patent č. 4,835,260 autora Shomaker, C. B. diskutuje modifikované EPO proteiny s aminokyselinovými substitucemi methioninu na pozicích 54 a asparaginu na pozici 38. Tyto EPO muteiny mají patrně zvýšenou stabilitu, ale nevykazují zvýšenou biologickou aktivitu v porovnání s divokým typem EPO.

WO 91/05867 uveřejnil analoga lidského erythropoietinu majících zvýšený počet míst pro připojení cukrů ve srovnán s lidským erythropoietinem, jsou to EPO (Asn⁶⁹), EPO (Asn¹²⁵, Ser¹²⁷), EPO (Thr¹²⁵), a EPO (Pro¹²⁴, Thr¹²⁵).

WO 94/24160 uveřejňuje mutanty erythropoietinu, které mají zvýšené aktivity, zvláště u aminokyselinových substitucí na pozicích 20, 49, 73,140,143,146,147 a 154.

WO 94/25055 uveřejňuje analoga erythropoietinu včetně EPO (X³³, Cys¹³⁹, des-Arg¹⁶⁶) a EPO (Cys¹³⁹, des-Arg¹⁶⁶).

• Faktory kmenových buněk mají schopnost stimulovat růst raných stadií hematopoietických buněk, které jsou schopné dospívat na erythroid, megakaryocyt, granulocyt, lymfocyt a makrofágy. Působení faktory kmenových buněk na savce vede k nárůstu hladin hematopoietických myeloidních i lymfoidmch buněk.

EP 0423980 uvádí ve známost nové polypeptidy odvozené od faktoru kmenových buněk (SCF) zahrnující SCF¹ ¹⁴⁸, SCF¹’¹⁵⁷, SCF¹'¹⁶⁰, SCF¹’¹⁶¹, SCF¹'¹⁶², SCF¹'¹⁶⁴, SCF¹’¹⁶⁵, SCF¹'¹⁸³, SCF¹'¹⁸⁵, SCF¹’¹⁸⁸, SCF¹’¹⁸⁹, SCF¹’²²⁰, SCF¹’²⁴⁸.

U.S. 4,877,729 a U.S. 4,959,455 uveřejňuje proteinové a cDNA sekvence lidského IL-3 a giboního IL-3. Uvedený hIL-3 má ve své proteinové sekvenci na pozici 8 serin spíše než-li prolin.

Mezinárodní patentová přihláška (PCT) WO 88/00598 uvádí ve známost analoga lidského a giboního IL-3. HL-3 obsahuje záměnu Ser⁸ ->Pro⁸. Byl také učiněn návrh na záměnu Cys za Ser, tedy zrušení disulfidického můstku a záměny jedné nebo více aminokyselin v glykosylačpích místech.

·· · ··· • · • · · ·

U.S. 4,810,643 zveřejňuje fuzní protein zahrnující GM-CSF a IL-3, který má zvýšenou biologickou aktivitu v porovnání s GM-CSF a IL-3 samotnými. Rovněž zveřejňuje neglykosylovaný analog GM-CSF jako, složky multifunkčního agonisty hematopoietických receptorů.

WO 92/04455 uveřejňuje fuzní protein složený z IL-3 spojeného s lymfokinem zvoleným ze skupiny obsahující IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, EPO a G-CSF. .

WO 95/21197 a WO 95/21254 uveřejňují fuzní proteiny schopné širokého spektra hematopoietických účinků.

GB 2,285,446 se týká c-mpl ligandu (thrombopoietinu) a různých forem thrombopoietinu, o kterých bylo zjištěno, že mají vliv na replikaci, diferenciaci a maturaci megakaryocytů a prekurzorů megakaryocytů, které mohou být použity pro léčbu thrombocytopenie.

EP 675,201 AI se týká c-mpl ligandu, megakaryocytového růstového a vývojového faktoru (MGDF), alelických variant c-mpl ligandu a c-mpl ligandu připojeného k ve vodě rozpustným polymerům jako je polyethylenglykol.

WO 95/21920 uvádí myší a lidský c-mpl ligand a jejich polypetidové fragmenty. Tyto proteiny jsou vhodné pro in-vivo a ex-vivo terapii pro stimulaci výroby destiček.

Podstata vynálezu

Vynález se týká rekombinantních chimérických proteinů zahrnujících flt3 agonistu a další faktor. Tímto dalším faktorem může být, bez omezení tímto výčtem, kolonie stimulující faktor fy (CSF), cytokin, lymfokin, interleukin, hematopoietický růstový faktor, kterým může být GMCSF, c-mpl ligand (také označovaný TPO nebo MGDF), M-CSF, erythropoietin (EPO), IL-1, IL' 4, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, LIF, flt3 ligand, lidský růstový hormon, růstový faktor B-buněk, diferenciační faktor B-buněk, diferenciační faktor ' eosinofilů, faktor kmenových buněk (SCF) také známý jako Steel faktor, nebo c-kit ligand, i- růstový faktor kmenových buněk (SCGH) (Hiraoka, A. et al. Proč. Nati. Acad. Sci USA

94:7577-7582, 1997) a buňkami stromatu produkovaný faktor-1 (SDF-1) (Bleul, C.C. et al., J. EXP. Med 184:1101-1109, 1996), (zde společně označované jako „hematopoietické růstové faktory“. Chimemí proteiny mohou být také spolupodávány nebo následně podávány spolu s jedním nebo více dalších faktorů zahrnujících kolonie stimulujících faktor, cytokin, lymfokin, interleukin, hematopoietický růstový faktor, kterým může být GM-CSF, c-mpl ligand (také * označovaný TPO nebo MGDF), M-CSF, erythropoietin (EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-3, IL-5, IL6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, LIF, flt3 ligand, lidský růstový hormon, í ' , í

i. .

•f '. ' . ' ► · ·· • · 1 ' · · 1 ► · · · · I • « »· ·· růstový faktor B-buněk, diferenciační faktor B-buněk, diferenciační faktor eosinofilů, faktor kmenových buněk (SGF) také známý jako Steel faktor, nebo c-kit ligand, růstový faktor kmenových bůněk (SCGH) (Hiraoka, A. et al. Proč. Nati. Acad. SciUSA 94:7577-7582, 1997) a buňkami stromatu produkovaný faktor-1 (SDF-1) (Bleul, C.C. et al., J. EXP. Med 184:11011109, 1996), (zde společně označované jako „hematopoietické růstové faktory“. Tyto společně podávané.směsi mohou mít obvyklou aktivitu obou peptidů, nebo dále mohou mít biologickou a íyziologickou aktivitu vyšší než prostý součet účinků agonisty G-CSF receptoru a druhého hematopoietického růstového faktoru samotných. Chimérické proteiny mohou rovněž vykazovat zvýšenou aktivitu, nebo aktivitu odlišnou než je očekávána od přítomnosti £Lt3 ligandu, nebo i druhého koloriie stimulujícího faktoru. Chimérické proteiny mohou rovněž mít zlepšený profil aktivit, což může zahrnovat redukci nežádoucích biologických aktivit spojených s nativním lidským fit 3.

Výnález se týká multiíunkčních agonistů hematopoietických receptorů, nebo též chimérických proteinůvytvořených kovalentním spojením polypeptidů, z nichž každý může ' působit na jiný specifický buněčný receptor iniciující vzájemně se doplňující biologické aktivity. Hematopoese vyžaduje komplexní série buněčných událostí, při kterých kmenové buňky generují kontinuálně velké populace dospívajících buněk ve všech hlavních liniích. Existuje nejméně 20 v současnosti známých regulátorů hematopoietické proliferační aktivity. Většina těchto proliferačních regulátorů může stimulovat pouze jeden typ tvorby kolonií in vitro, přesný způsob stimulace tvorby kolonií každým z regulátorů je dosti rozdílný. Neexistují dva regulátory stimulující tvorbu kolonií přesně stejným způsobem, vyhodnoceno podle počtu kolonií, nebo což · ř je důležitější, podle linií a způsobu maturace buněk, které tvoří vznikající kolonie. Proliferační . odpovědi mohou být snadno analyzovány jednoduchých in vitro kultivačních systémech. Mohou být stanoveny tři v podstatě nezávislé parametry: rozdíly v počtu kolonií, rozdíly v počtu buněk a

- rozdíly v liniích buněk. Na prekurzorové buňky mohou působit dva nebo více faktorů, indukce i* tvorby velkého počtu prekurzorových buněk vede k větším koloniím. Dva nebo více faktorů mohou způsobit expansi prekurzorových buněk vzniklých proliferací, buď proto, že různé podskupiny prekurzorových buněk reagují exklusivně na jeden faktor, nebo proto, že některé prekurzorové buňky vyžadují stimulaci dvěma nebo více faktory. Aktivace dalších receptorů buňky za použití dvou, nebo více faktorů pravděpodobně zvyšuje mitotický signál, což je Ϊ ’ ^r· .. · · způsobeno splýváním na počátky rozdílných signálních drah do společné dráhy, která vstupuje do jádra · (Metcalf, Nátuře 339: 27, 1989). Další mechanismy mohou být vysvětleny sinergií.

. Například je-li jedna signální dráha limitována nutností aktivace svého meziproduktu, který je ' ¹ * .· J ’ ' t • · součástí další signální dráhy spouštěné druhým faktorem, pak tato situlace může vést k super áditivní odpovědi. V některých případech může aktivace jednoho typu receptorů vést k indukci zvýšené exprese jiných receptorů (Metcalf, Blood 82:3515-3523, 1993). Dva nebo více faktorů mohou vést k odlišnému typu buněčných linií, než by způsobil jeden faktor. Použití multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů může mít potenciální klinické výhody plynoucí z proliferační odpovědi, kterou není dosažitelná při použití jediného faktoru.

Receptory hematopoietických a ostatních růstových faktorů mohou být zařazeny do dvou rodin příbuzných proteinů: (1) tyrosinkinasové receptory, zahrnující epidermální růstový faktor, M-CSF (Sherr, Blood 75:1, 1990) a SCF (Yarden et al., EMBO J. 6:3341, 1987): a (2) hematopoietické receptory neobsahující tyrosinkynasovou doménu, ale vykazující obvykle homologii ve své extracelulámí doméně (Bazan, PNAS USA 87: 6934-6938, 1990). V této druhé skupině jsou erithropoietin (EPO) (D'Andrea et al., Cell 57:277, 1989), GM-CSF (Gearing et al., EMBO J. 8:3667, 1989), IL-3 (Kitamura et al., Cell 66: 1165, 1991), G-CSF (Fukunata et al., J. Biol. Chem. 265: 14008-15, 1990), IL-4 (Harada et al., PNAS USA 87:857, 1990), IL-5 (Takali et al., EMBO J. 9:4367, 1990), IL-6 (Yamasaki et al., Science 241: 825,1988)*IL-7 (Goodwin et al., Cell 60: 941-951, 1990), LIF (Gearing et al., EMBO J. 10: 2839, 1991) a IL-2 (Cosman et al., Mol-Immunol. 23:935-94, 1986). Většina později zmíněných receptorů existuje ve vysokoaťinitní formě jako heterodimery. Po vazbě ligandu dochází k asociaci specifického α-řetězce s nejméně jedním dalším receptorovým řetězcem (β-řetězec, γ-řetězec). Mnoho z těchto faktorů sdílí společnou receptorovou podjednotku. α-řetězec pro GM-CSF, IL-3 a IL-5 sdílí společný β' řetězec (Kitamura et al., Cell, 66:1165, 1991), Takaki et al., EMBO J. 10,2833-8, 1991) a receptorové komplexy pro IL-6, LIF a IL-11 sdílí také společný β-řetězec (gpl30)(Taga et al., Cell 58:573-81, 1989; Gearing et al., Sciece 255:1443-7, 1992). Receptorové komplexy IL-2, IL♦ 4, IL-7, IL-9 a IL-15 sdílí společný γ-řetězec (Kondo et al., Science 265:1874, 1993; Russell et al., Science 266: 1042-1045, 1993; Noguchi et al., Science 262: 1877, 1993; Giri et al., EMBO J. 13:2822-2830,1994).

Použití vícenásobně působících hematopoietických faktorů může mít také potenciální • -výhodu ve snížených nárocích na faktory produkující buňky a systém jejich indukce. Existují-li limitace ve schopnosti buněk produkovat faktor, pak snížením požadovaných koncentrací každého z faktorů a jejich použitím v kombinaci může dojít ke snížení nároků na faktoryprodukující buňky. Použití vícenásobně působícího hematopoietického faktoru může snížit množství faktorů, které by byly potřebné a pravděpodobně snížit případné nežádoucí vedlejší účinky.

)·.

* · • · • · ·

Nové látky podle vynálezu jsou representovány vzorcem vybraným ze skupiny obsahující:

R1-L1-R2, R2-L1-R1, R1-R2, R2-R1, i kde Ri je flt3 agonista a R₂ j_e hematopoietický růstový faktor. S výhodou je R₂ hematopoietický růstový faktor s rozdílnou, ale komplementární aktivitou ve srovnání s R]. Komplementární aktivitou se myslí aktivita, která zvyšuje, nebo mění odpověď druhého buněčného modulátoru. Polypeptid Ri je připojen buď přímo, nebo přes spojovníkový segment k polýpeptidu R2. Termín „přímo“ se týká multifunkěních agonistů hematopoietických receptorů, ve kterém jsou poíypeptidy spojeny bez peptidového. Li tedy představuje chemickou vazbu, nebo polypeptidový segment, ke kterému jsou oba Ri i R₂ připojeny , za zachování čtecího rámce, a Li je obvykle polypeptid, ke kterému jsou Ri a R2 připojeny amidiěkými vazbami spojujícími karboxy konec Ri š aminokoncem Li a karboxy konec Li aminokoncem R₂. Připojeny za zachování čtecího rámce znamená, že zde nedochází k terminaci translace, nebo přerušení mezi čtecími rámci DNA kódujícími Rja R₂.

Neomezující výčet dalších růstových faktorů, tedy kolonie stimulujících faktorů (CSF) zahrnuje cytokiny, lymfokiny, interleukiny, hematopoietickými růstovými faktory, které mohou být připojeny k Ri mohou být GM-CSF, c-mpl ligand (také označovaný TPO nebo,MGDF), MCSF, erythropoieťin (EPO), IL-l, IL-4, IL-2,1L-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8,1L-9, IL-10, IL-11, IL12, IL-13, IL-15, LIF, flt3 ligand, lidský růstový hormon, růstový faktor B-bunčk, difeřenciační faktor B-buněk, difeřenciační faktor eosinofilů, faktor kmenových buněk (SCF) také známý jako Steel faktor, nebo c-kit ligand. Tento vynález rovněž zahrnuje použití modifikovaných Ri nebo R2, . nebo mutovaných, nebo modifikovaných DNA sekvencí kódujících tyto Rj nebo R2 molekuly. Jako „varianty c-mpl ligandu“ ze označujeme molekuly c-mpl ligandu, které obsahují aminokyselinové substituce a/nebo jsou části c-mpl ligandu deletovány, jak jé to uvedeno v U.S.

1.' patentové přihlášce č. 08/383,035, stejně tak jako další známé varianty. „Varianty G-CSF“ jsou , definovány jako molekuly G-CSF, které obsahují aminokyselinové substituce a/nebo jsou části GCSF deletovány, jak je to uvedeno zde, stejně tak jako další známé varianty. S výhodou je R2 GČSF, GM-CSF, c-mpl ligand nebo EPO.

, ; Spojovací skupinou (Li) je obecně polypeptid od 1 do 500 aminokyselin délky.

Spojovníky spojují dvě molekuly jsou s výhodou zkonstruovány tak, aby (1) umožnit oběma molekulám svinovat se a působit navzájem nezávisle, (2) neměly sklon formovat se do uspořádané ^L sekundární struktury, která může interferovat s funkčními doménami obou proteinů, (3) měla '. minimální hydrofobní charakter, který by mohl interferovat s funkčními doménami proteinů a (4) zajišťovali sterickou separaci Ri a R2 tak, že Ri a R2 mohou interagovat současně s • · · ·· . ·· • · · • · · ··· ··· • · • · · · odpovídajícími receptory na jediné buňce. Obvykle zahrnují povrchové amino kyseliny v ohebném regionu proteinů Gly, Asn a Ser. Zdá se, že jakákoli kombinace aminokyselinových sekvencí obsahujících Gly, Asn, a Ser by mohla splnit výše zmíněná kriteria pro spojovníkovou sekvenci. V spojovníkové sekvenci mohou být také použity další neutrální aminokyseliny jako jsou Thr a Ala. V aminokyselinových sekvencích spojovníků mohou být rovněž zahrnuty další aminokyseliny pro začlenění unikátních restrikčních míst do spojovníkových sekvencí, aby byla' umožněná konstrukce multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů.

Výhodnými spojovníky Li podle vynálezu jsou sekvence zvolené ze skupiny vzorců obsahující:

(GlySer) (SEQ ID Č:l), (Gly⁴Ser)ⁿ (SEQ ID Č:2), (Gly⁵Ser)ⁿ (SEQ ID Č:3), (Gl/Ser) (SEQ ID Č:4), nebo (AlaGIySer) (SEQ ID Č:5), kde n kladné celé číslo (společně zde nazývány „GlySer“ spojovníky).

Příkladem vysoce flexibilního spojovníku je na glycin a serin bohatý spacerový region nacházející se uvnitř plil proteinu vláknitých bakteriofágů , například bakteriofága M 13 nebo fd (Schaller et al., PNAS USA 72: 737-741, 1975). Tento region se chová jako dlouhý ohebný spacer mezi dvěma doménami plil povrchového proteinu. Spacerová oblast se skládá . z aminokyselinové sekvence:

GlyGlyGlySer GlyGlyGlySer GlyGlyGlySerGlu GlyGlyGlySerGlu GlyGlyGlySerGlu

GlyGlyGlySerGlu GlyGlyGlySer GlyGlyGlySer (SEQ ID Č:6). . ^;

Vynález rovněž zahrnuje spojovníky, ve kterých je začleněna rozpoznávací sekvence pro endopeptidasu. Takové štěpící místo může být využito pro oddělení jednotlivých komponent multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů, aby mohlo být zjištěno zda jsou správně svinuty a aktivní in-vitro. Příklady různých endopeptidas jsou, kromě jiných, plasmin, enterokinasa, kallikrein, urokinasa, tkáňový aktivátor plasminogenu, clostripain, chymosin, kolagenasa, Russelova proteasa z hadího jedu, postprolinový štěpící enzym, V8 proteasa, thrombin a faktor Xa.

Peptidové spojovníkové segmenty z pantových oblastí těžkých řetězců imunoglobulinů IgG, IgA, IgM, IgD nebo IgE zajišťují správný úhel mezi připojenými polypeptidy. Zvláště výhodné jsou takové pantové oblasti, kde byly cysteiny nahrazeny šeřiny. Výhodnými spojovníky podle vynálezu jsou sekvence odvozené od myšího IgG gama 2b pantového regionu, kde byly cysteiny zaměněny za šeřiny (Bell et al., U.S. patent 4,936,233). Tyto spojovníky mohou rovněž obsahovat štěpící místo endopeptidasy. Příklady takových spojovníků zahrnují následující sekvence:

• ·· * ·· ·· • · · ··« · · ·· · ··· · · ··· · • · · · · · · ··· ··· • · · · · · ·· ·· ······· ·· ··

IleSerGluProSerGlyProIleSerThrlleAsnProSerProProSerLysGluSerHisLysSerPro (SEQ ID Č:7) a

IleGluGlyArglleSerGluProSerGlyProIleSerThrlleAsnProSerProProSerLysGluSerHisLysSerPro (SEQ ID Č:8) (společně zde nazývané ,JgG2b“ spojovníky).

Vynález však není omezen formou, velikostí, nebo počtem spojovníkových použitých sekvencí a je vyžadováno pouze, aby spojovník funkčně neinterferoval při svinování a funkci jednotlivých molekul multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů.

Hematopoietické růstové faktory mohou být charakterizovány svou schopností stimulovat tvorbu kolonií lidských hematopoietických prekurzorových buněk. Kolonie mohou být tvořeny erythroidy, granulocyty, megakaryocyty, granulocytické makrofágy a jejich směsi. Mnoho hematopoietických růstových faktorů projevuje schopnost obnovovat funkci kostní dřeně a populace buněk periferní krve na terapeuticky prospěšné úrovně ve studiích prováděných nejprve na primátech a posléze na lidech. Mnoho ze všech těchto biologických aktivit hematopoietických růstových faktorů zahrnuje přenos signálu a vysokoafínitm vazbu na receptor. Multifunkční agonisté hematopoietických receptorů podle vynálezu mohou vykazovat výhodné vlastnosti jako je podobná, nebo větší biologická aktivita ve srovnání s jediným faktorem, nebo mají vyšší poločas života, nebo snížené nežádoucí vedlejší účinky, nebo kombinace těchto vlastností.

Multifunkční agonisté hematopoietických receptorů, kteří mají menší, nebo žádnou aktivitu agonisty mohou být výhodní jako antagonisté, jako antigeny pro produkci protilátek použitelných v imunologii, nebo imunoterapii, jako genetické sondy, nebo jako meziprodukty použitelné pro konstrukci jiných výhodných hIL-3 muteinů.

Vynález také zahrnuje DNA sekvence, které kódují proteiny multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů, DNA sekvence, které jsou svou podstatou podobné a mají v podstatě stejnou funkci a DNA sekvence, které liší od DNA kódující multifunkční agonisty hematopoietických receptorů podle vynálezu jen vlivem degenerace genetického kódu. Vynález také zahrnuje oligonukleotidové intermediáty používané pro konstrukci mutantních DNA a polypeptidy kódované těmito oligonukleotidy.

Techniky genetického inženýrství nyní standardně používané (U. S. patent 4,935,233 a Sambrook et al., „Molecular cloning A laboratory manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) mohou být použity pro konstrukci DNA sekvencí kódujících flt3 ligand, EPO, G-CSF, GM-CSF, další hematopoietické růstové faktory a chimérické proteiny podle vynálezu. Jednou z těchto metod je kazetová mutagenese (Wells et al., Gene 34:315-323, 1985), při které je část »·· · ·· ·· ·· » · · · » · · · ·· · ··· 9 · ·· ·· kódující sekvence v plasmidu nahrazena syntetickými oligonukleotidy, které kódují žádané aminokyselinové substituce v části genu mezi dvěma restrikčními místy. Páry komplementárních syntetických oligonukleotidů kódujících žádaný gen, mohou být spárovány. DNA sekvence oligonukleotidů budou kódovat sekvence aminokyselin žádaného genu s výjimkou substitucí a/nebo delecí sekvence.

Plasmidová DNA může být štěpena restrikčními endonukleasami, poté spojeny se spárovanými oligonukleotidy. Směs po ligaci může být poté použita pro transformaci kompetentních bakteriálních buněk, jako např. E. coli kmeme JMI01 resistentním k příslušnému antibiotiku. Určitá kolonie může být přenesena, -kultivována a plasmidová DNA může být podrobena restrikční analýze a/nebo DNA sekvenaci, aby mohly být identifikovány plasmidy s žádoucími geny.

Klonování DNA sekvencí nových multiíunkčních hematopoietických agonistů, kde alespoň v jedné z nich je obsažena sekvence dalšího hematopoietického růstového faktoru může být spojeno s použitím dalšího vektoru. Případně může být jeden gen klonován přímo do vektoru obsahujícího druhý gen. Mohou být použity spojovníky a adaptory pro spojem. DNA sekvencí, stejně jako nahrazení ztracených sekvencí, v případě, že se v místě našeho zájmu nachází restrikční místo. Genetický materiál (DNA) kódující jeden polypeptid je tedy vložen do vhodného expresního vektoru, který je použit pro transformaci bakterií, kvasinek, hmyzích buněk, nebo savčích buněk. Transformovaný organismus je kultivován a protein izolován standardními technikami. Vzniklý produkt je tedy novým proteinem, který obsahuje hematopoietický růstový faktor připojený spojovníkovým regionem k druhému kolonie stimulujícímu faktoru.

Dalším aspektem vynálezu je získání plasmidových DNA vektorů použitelných pro expresi těchto nových multiíunkčních agonistů hematopoietických receptorů. Tyto vektory obsahují nové DNA sekvence popsané výše, které kódují nové polypeptidy podle vynálezu. Příslušné vektory, které mohou transformovat mikroorganismy schopné exprimovat multifunkční agonisty hematopoietických receptorů, zahrnují expresní vektory obsahující nukleotidové sekvence kódující multifunkční agonisty hematopoietických receptorů připojené k transkripčním a translačním regulačním sekvencím, které jsou zvoleny podle použité hostitelské buňky.

Vektory s inkorporovánými modifikovanými sekvencemi, jak jsou popsány jsou součástí vynálezu a jsou vhodné pro produkci polypetidů multiíunkčních agonistů hematopoietických receptorů. Vektory používané v těchto metodách také obsahují vybrané regulační sekvence v účinném asociaci s DNA kódujícími sekvencemi podle vynálezu, a které jsou schopny řídit jejich replikaci a expresi ve zvolené hostitelské buňce.

·'· ·· fc et ··. *· • 9 · 9 9 9 9 9 · · · 9

9 9 9 9 9 · · · • 9 9 9 t · 9 999 999

9 9 9 9 9 9

9999 99 9999999 99 99

Dalším aspektem vynálezu je poskytnout způsob pro produkci nových multifunkčních agoňistů hematopoietických receptorů. Metody podle vynálezu zahrnují kultivaci vhodných buněk, nebo buněčných linií, které byly transformovány vektorem obsahujícím DNA sekvence kódující expresi nových multifunkčních agoňistů hematopoietických receptorů. Vhodnými buňkami, nebo buněčnými liniemi mohou být bakteriální buňky. Například jsou jako hostitelské buňky v biotechnologii dobře známé různé kmeny E. coli. Příklady takových kmenů zahrnují kmeny E. coli JM101 (Yanish-Perron et. al. Gene 33: 103-119, 1985) a MON105 (Obukovicz et al., Applied Environmental Microbiology 58: 1511-1523, 1992). Ve vynálezu je zahrnuta také exprese proteinů multifunkčních agoňistů hematopoietických receptorů využívající chromosomální expresní vektory pro E. coli založené na bakteriofágu Mu (Weinberg et al., Gene 126: 25-33, 1993). Mohou být použity také různé kmeny B. subtilis. Jako hostitelské buňky jsou dostupné rovněž různé kmeny kvasinek známé odborníkům v oboru a použitelné pro expresi polypeptidů podle vynálezu. Jsou-li exprimovány v cytoplasmě E. coli mohou být geny kódující multifunkčníagonisty hematopoietických receptorů podle vynálezu mohou také konstruovány tak, že k 5' konci kodonů genu jsou přidány kodoňy Meť²-Ala’¹ nebo Met¹ na N-konci proteinu. Nkonec proteinů syntesovaných v cytoplasmě E. coli prodělává post-třanslační procesing pomocí methionin aminopeptidasy (Ben Bassat et al., J. Bac. 169: 751-757, 1987) a snad i dalších peptidas tak, že po expresi je methionin odštěpen s N-konce proteinu. Multifiinkční agonisté hematopoietických receptorů podle vynálezu mohou zahrnovat < polypeptidy multifunkčních agoňistů hematopoietických receptorů mající Meť¹-Ala'¹ nebo Meť²-Ala¹ na svém N-konci. Tito mutanti multifunkčních agoňistů hematopoietických receptorů mohou být také exprimováni v E. coli po připojení sekrečního signálního peptidu k N-konci. Tento signální peptid je odštěpen z . polypeptidů v průběhu procesu sekrece.

Pro použití ve vynálezu jsou vhodné rovněž savčí buňky, například vaječné buňky čínského křečka (CHO). Nejdůležitějšími metodami pro expresi cizích genů v savčích buňkách jsou popsány v publikaci Kaufman, R. J., 1987 Genetics Engineering, Principles and Methods, Vol. 9, J.K. Setlow, editor, Plenům Press, New York. Byl zkonstruován expresní vektor i!.

obsahující silný promotor schopný funkce v savčích buňkách řídící transkripci kódující oblasti eukaryotického sekrečního signálního peptidu, který je translačně spojen s kódující oblastí multifunkčních agoňistů hematopoietických receptorů. Například mohou být použity plasmidy jako pcDNA I/Neo, pRc/RSV, a pRc/VMC (získané od Invitrogen Corp., San Diego, Kalifornie). Kódující oblast eukaryotického sekrečního signálního peptidu může pocházet z jiného sekrečního savčího proteinu (Bayně, M. L. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 2638-2642; 1987). Po ' ' ’ i - . . ' • ·

konstrukci vektoru obsahujícího gen je vektorová DNA transfekována do savčí buňky. Těmito buňkami mohou být například COS7, HeLa, BHK, CHO, nebo myší L linie. Buňky mohou být kultivovány například v DMEM mediu (JRH Scientific). Polypeptid sekretovaný do média může být získán standardními biochemickými přístupy, které nastupují po přechodné expresi trvající 2472 hodin po transfekci buněk, nebo po získání stabilní buněčné linie po selekci na resistenci k antibiotiku. Selekce vhodných hostitelských savčích buněk a metody pro transformaci, kultivaci, amplifikaci, screening a produkci produktu a purifikaci jsou známy. Viz např. Gethig and Sambrook, Nátuře, 293: 620-625, 1981), nebo případně, Kaufinan et al., Mol. Cell. Biol., 5(7): 1750-1759, 1985) nebo Howley et al., U.S. patent č. 4,419,446. Další vhodnou buněčnou linií je opičí COS-1 buněčná linie. Podobně je vhodná savčí buněčná linie CV-1.

Je-li to žádoucí mohou být jako hostitelské buňky ve způsobech podle vynálezu použity buňky hmyzí. Viz. např. Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277-298 (Plenům Press 1986) zde citované reference. Navíc jsou hlavní metody pro expresy cizích genů ve hmyzích buňkách pomocí baculovirového vektoru jsou popsány v: Summers, M. D. a Smith, G. E., 1987, A manual of methods for Baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agriculture Experiment Station Bulletin No. 1555. Expresní vektor obsahuje Baculovirový přenosový vektor, ve kterém silný Baculovirový promotor (jako je polyhedronový promotor) řídí transkripci kódující oblasti eukariotického sekrečního signálního peptidu, který je translačně spojen s kódující oblastí multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů. Například může být použit plasmid jako pVL1392 (získaný z Invitrogen Corp., San Diego, Kalifornie). Po konstrukci vektoru nesoucího gen kódující polypeptid multifunkčního agonisty hematopoietických receptorů jsou dva mikrogramy této DNA kotransfekovány s jedním mikrogramem Baculovirové DNA (viz Summers & Smith, 1987) do hmyzích buněk, kmene SF9. Čistý rekombinantní Baculovirus nesoucí multifunkční agonisty hematopoietických receptorů je používán pro infikování buněčné kultury, například v Excell 401 sérum neobsahujícím médiu (JHR Biosciences, Lenexa, Kansas). Multifunkční agonisté hematopoietických receptorů sekretovaní do média mohou být získám standardními biochemickými přístupy. Supematanty pocházející z savčích, nebo hmyzích buněk exprimujících proteiny multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů mohou být nejprve zakoncentrovány pomocí některé z komerčně dostupných zahušťovacích jednotek.

Multifunkční agonisté hematopoietických receptorů podle vynálezu mohou být výhodné pro léčbu nemocí provázených poklesem hladin myeloidních, erythroidních, lymfoidních, nebo megakaryocytových buněk hematopoietického systému, nebo kombinací poklesu hladin více různých z těchto buněk. Navíc mohou být použity pro aktivaci dozrávání myeloidních a/nebo • · ι< ······· ··· ·· ^A ····· · ···· ·· ··· ···· ·· ·· lymfoidních buněk. Mezi stavy citlivými k léčbě polypeptidy podle vynálezu je leukopenie, redukce počtu cirkulujících leukocytů (bílých krvinek) v periferní krvi. Leukopenie může být způsobena působením různých virů, nebo radiace. Je často vedlejším efektem různých forem protirakovinné terapie, například působení chemoterapeutických léků, ozáření a infekce, nebo krvácení. Léčba leukopenie těmito multifunkčními agonisty hematopoietických receptorů podle vynálezu mohou vyloučit nežádoucí vedlejší účinky způsobované v současnosti dostupnými léky. Multiíunkční agonisté hematopoietických receptorů podle vynálezu mohou být výhodné pro léčbu neuropenie a například pro léčbu takových stavů jako je aplastická anemie, cyklická neuropenie, idiopathická neuropenie, Chediak-Higashi syndrom, systémový lupus erythematosus (SLE), « leukemie, myelodysplastického syndromu a myelofibrosy.

Multiíunkční agonisté hematopoietických receptorů podle vynálezu mohou být výhodné pro léčbu a prevenci thrombocytopenie. V současné době je jediným způsobem léčby thrombocytopenie transfuze krevních destiček, která je drahá a přináší sebou významné riziko infekce (HIV, HBV) a aloimunizace. Multiíunkční agonisté hematopoietických receptorů podle vynálezu mohou zmírnit nebo zcela odstranit potřebu transfuze krevních destiček. Některé případy thrombocytopenie mohou mít příčinu v genetickém defektu např. Fanconiho anemie, Wiscott-Aldrich syndrom nebo May Hegglik syndrom. Získaná thrombocytopenie může mít příčinu v auto- nebo allo- protilátkách jako např. Imunní thrombocytopenie purpura, systémová lupus erythromatosis, hemolytická anemie, nebo imunitní neslučitelnost mezi matkou a plodem. Do thrombocytopenie mohou navíc vyústit i splenomegalitida, roztroušená intravaskulámí koagulace, thrombotická thrombocytopenická purpura, infekce nebo umělé náhrady srdeční stěny. Některé thrombocytopenie mohou mít příčinu také v chemoterapii a/nebo ozáření jako terapii rakoviny. Thrombocytopenie může být způsobena také invazí karcinomu do kostní dřeně, lymfomem, leukémií nebo fibrózou.

Multiíunkční agonisté hematopoietických receptorů podle vynálezu mohou být výhodné * pro mobilizaci hematopoietických prekurzorových a kmenových buněk v periferní krvi. V periferní krvi produkované prekursorové buňky jsou výhodné pro zlepšení stavu pacientů po autologní transplantaci kostní dřeně. Bylo prokázáno, že hematopoietické růstové faktory zahrnující G-CSF a GM-CSF zvyšují počet cirkulujících prekursorových a kmenových buněk v periferní krvi. Tak byla zjednodušena procedura získávání periferních kmenových buněk a byla dramaticky snížena cena procedury snížením počtu potřebných odběrů. Multiíunkční agonisté hematopoietických receptorů mohou být výhodné pro mobilizaci kmenových buněk a dalšího zvýšení eficience transplantace periferních kmenových buněk.

i'

Multifunkční agonisté hematopoietických receptorů podle vynálezu mohou být výhodné pro ex-vivo zvyšování počtu hematopoietických prekurzorových a kmenových buněk. Kolonie stimulující faktory (CSF), jako jsou hIL-3 mohou být podávány samostatně, společně s dalšími CSF, nebo v kombinaci s transplantací kostní dřeně následující po vysokých dávkách chemoterapeutik při léčbě neutropenie a thrombocytopenie, které jsou často následkem takové léčby. Období neutropenie a thrombocytopenie však nemůže být zcela eliminována. Myeloidm linie, které zahrnují monocyty (makrofágy), granulocyty (včetně neutrofílů) a megakaryocyty a jsou kritické pro prevenci infekcí a krvácení, které mohou ohrožovat život. Neutropenie a thrombocytopenie mohou být také následkem nemoci, genetických poruch, léků, toxinů, ozáření a mnoha terapeutických zásahů jako je konvenční onkologická terapie.

Pro léčbu této skupiny pacientů je používána transplantace kostní dřeně. S použitím kostní dřeně pro rekonstituci vyrovnání hematopoietického systému a je však spojeno několik problémů: 1) počet kmenových buněk v kostní dřeni, slezině, nebo periferní krvi je omezený, 2) vzájemná reakce štěpu a příjemce, 3) odvržení štěpu a 4) možná kontaminace nádorovými buňkami. Kmenové buňky tvoří velmi malé procento jaderných buněk v kostní dřeni, slezině a periferní krvi. Je jasné, že existuje závislost na dávce, a že vyšší počet kmenových buněk zvýší hematopoietickou obnovu. In-vitro expanse kmenových buněk může tedy zlepšit obnovu krvetvorby a zvýšit pacientovu šanci na přežití. Pro transplantaci kostní dřeně je používána kostní dřeň od alogenního dárce. Vzájemná reakce příjemce a štěpu a odmítnutí štěpu však omezuje použití transplantace kostní dřeně dokonce i od sourozeneckého dárce se shodnými HLA. Alternativou k alogenní transplantaci kostní dřeně jsou autologní transplantace. Při autologní transplantaci kostní dřeně je část pacientovi vlastní kostní dřeně odebrána před myeloblativní terapií např. vysokými dávkami chemoterapeutik, a poté je transplantována zpět pacientovi. Autologní transplantace eliminuje riziko vzájemné reakce příjemce a štěpu a odmítnutí štěpu. Autologní transplantace kosím dřeň však stále způsobuje problémy vyplývající s omezeného počtu kmenových buněk v kostní dřeni a možné kontaminaci tumorovými buňkami. Omezený počet kmenových buněk může být překonán pomocí ex-vivo expanse kmenových buněk. Kmenové buňky mohou být navíc specificky izolovány, na základě přítomnosti specifických povrchových antigenů jako je CD34+ a tak snížena možnost kontaminace dřeňového štěpu tumorovými buňkami.

Následující patenty obsahují další detaily týkající se separace kmenových buněk CD34+ buněk, kultivace těchto buněk s hematopoietickými faktory, použití buněk pro léčbu pacientů s poruchami krvetvorby a použití hematopoietických faktorů pro expansi buněk a genovou terapii.

• · • ·

5,. 061, 620 se týká směsí obsahujících lidské hematopoietické kmenové buňky získané separací kmenových buněk z určených buněk.

Dokument 5, 199, 942 popisuje metodu pro autologní transplantaci hematopoietických buněk zahrnující: (1) získávání hematopoietických prekurzorových buněk od pacienta; (2) ex-vivo expanse buněk pomocí faktorů zvolených ze skupiny obsahující IL-3, flt3 ligand, c-kit ligand, GM-CSF, IL-1, GM-CSF/IL-3 chimérický protein a jejich kombinace; (3) podávání buněčných preparátů pacientovi.

Dokument 5, 240, 856 se týká separace buněk, která zahrnuje přístroj pro automatické řízem procesu separace buněk.

WO 91/16116 popisuje zařízení a metody pro selektivní isolaci a separaci cílových buněk ze směsi buněk.

WO 91/18972 popisuje způsoby pro in-vitro kultivaci kostní dřeně inkubací suspenze buněk kostní dřeně v bioreaktoru z dutých vláken.

WO 92/18615 se týká procesu pro uchovávání a expansi buněk kostní dřeně v kultiačním médiu obsahujícím specifické směsi cytokinů pro použití při transplantaci.

WO 93/08268 popisuje způsoby pro selektivní expansi kmenových buněk, zahrnující kroky (a) separace CD34+ kmenových buněk od jiných buněk a (b) inkubace izolovaných buněk v selektivním médiu, takže kmenové buňky jsou selektivně pomnoženy.

WO 93/18136 popisuje proces pro in-vitro podporu savčích buněk získaných z periferní krve.

WO 93/18648 se týká směsi obsahující lidské neutrofilní prekursorové buňky s vysokým ^«Ί-^ηι myeloblastů a promyeloblastů pro léčbu genetické, nebo získané neutropenie.

» WO 94/08039 popisuje metodu pro obohacení lidských hematopoietických kmenových ouněk selekcí buněk, které exprimují c-kit protein.

WO 94/11493 popisuje populaci kmenových buněk exprimující CD34+ a malých co do velikosti, které jsou izolovány pomocí metod průtokové cytometrie.

WO 94/27698 se týká metody kombinující imunoafínitní separaci a kontinuální průtokovou centrifiigaci pro selektivní separaci heterogenní populace jaderných buněk z heterogenní směsi buněk.

WO 94/25848 popisuje separační zařízení pro získávám a manipulaci s cílovými buňkami.

• · « · • · · · • · · · ··· ···

Dlouhodobá kultivace vysoce obohacených CD34+ prekursorových hematopoietických buněk z buněk kostní dřeně v kulturách obsahujících IL-la, IL-3, IL-6 nebo GM-CSF je diskutována v Brant et al., J. Clin. Invest. 86:932-941, 1990).

Jedním z aspektů vynálezu je, že poskytuje způsoby pro selektivní ex-vivo expansi kmenových buněk. Termín „kmenové buňky“ označuje totipotentní hematopoietické kmenové buňky stejně jako rané prekursorové buňky , které mohou být izolovány z kostní dřeně, sleziny, nebo periferní krve. Termín „expanse“ označuje diferenciaci a proliferaci buněk. Vynález poskytuje způsoby pro selektivní ex-vivo expansi kmenových buněk, zahrnující kroky: (a) separaci kmenových buněk od jiných buněk, (b) kultivaci těchto separovaných buněk ze selektivního média, které obsahuje protein či proteiny multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů a (c ) sklízení těchto kmenových buněk. Kmenové buňky, stejně jako prekurzorové buňky, které jsou předurčeny, aby se vyvinuly v neutrofily, erythrocyty, destičky apod. mohou být rozlišeny od ostatních buněk na základě přítomnosti, nebo nepřítomnosti určitých antigenů prekursorových buněk, jako je CD34+, které jsou přítomny na povrchu těchto buněk a/nebo na základě morfologických charakteristik. Fenotyp charakterizující vysoce obohacenou frakci lidských kmenových buněk je typický přítomností CD34+, Thy-1+ a lin-, ale je třeba zdůraznit, že vynález není omezen pouze na expansi takové populace kmenových buněk. CD34+ obohacená frakce kmenových buněk může být separována velkým počtem známých metod, včetně afinitních kolon nebo částic, magnetických částic, nebo průtokové cytometrie využívající protilátky proti povrchovým antigenům jako jsou CD34+. Dále mohou být pro obohacení hematopoietických ' prekurzorů použity fyzikální separační metody jako je protisměrná elutriace. CD34+ prekursory jsou heterogenní a mohou být rozděleny na několik subpopulací charakterizovaných přítomností, -nebo absencí ko-exprese různých linií příbuzných buněčných povrchových molekul. Nejnezralejší prekursorové buňky neexprimují žádnou ze známých linií souvisejících markérů, jako je HLA-DR nebo CD38, ale mohou exprimovat CD90 (thy-1). Pro selektivní isolaci hematopoietických prekursorů mohou být použity také další povrchové antigeny jako jsou CD33, CD38, CD41, CD71, HLA-DR nebo c-kit. Oddělené buňky mohou být inkubovány ve zvoleném médiu v kultivační láhvi, sterilním sáčku, nebo v dutých vláknech. Pro expansi zvolených buněk mohou být použity různé kolonie stimulující faktory. Příklady takových faktorů použitelných pro ex-vivo expansi kostní dřeně jsou, c-kit ligand, IL-3, G-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-6, IL-11, flt3 ligand, nebo jejich kombinace. Proliferace kmenových buněk může být monitorována sčítáním počtu kmenových buněk a dalších buněk, standardními technikami (např. hemacytometr, CFU, LTCIC), nebo pomocí průtokové cytometrie před a po inkubaci.

Bylo popsáno několik metod pro ex-vivo expansi kmenových buněk využívajících kolonie stimulující faktory včetně c-kit ligandu (Brandt et al., Blood 83: 1507-1514 (1994), McKenna et al., Blood 86: 3413-3420 (1995), IL-3 (Brandt et al., Blood 83: 1507-1514 (1994), Sáto et al., Blood 82: 3600-3609 (1993)), G-CSF (Sáto et al., Blood 82: 3600-3609 (1993), IL-1 (Muench et al., Blood 81: 3463-3473 (1993), IL-6 (Sáto et al., Blood 82: 3600-3609, (1993), IL-11 (Lemoli et al., Exp. Hem. 21: 1668-1672, (1993), Sáto et al., Blood 82: 3600-3609, (1993), flt3 ligand ( McKenna et al., Blood 86: 3413-3420 (1995) a/nebo jejich kombinace (Brandt et al„ Blood 83: 1507-1514 (1994), Hayloch et al., Blood 80: 1405-1412 (1992), Koller et al., Biotechnology 11: 358-363 (1993), Lemoli et al., Exp. Hem. 21: 1668-1672, (1993), McKenna et al., Blood 86: 3413-3420 (1995), Muench et al., Blood 81: 3463-3473 (1993), Patchen et al., Biotherapy 7: 1326 (1994), Sáto et al., Blood 82: 3600-3609, (1993), Smith et al., Exp. Hem. 21: 870-877 (1993), Steen et al., Exp. Hem. 21: 1379-1386 (1993)). Mezi jednotlivými kolonie stimulujícími faktory byl jako jeden z nejúčinnějších pro expanzi CD34+ buněk periferní krve označen hIL-3 (Sáto et al., Blood 82: 3600-3609, (1993), Kobayashi et al., Blood 73: 1836-1841 (1989)). Bylo však ukázáno, že kterýkoli jediný faktor není tak účinný jako kombinace více faktorů. Vynález poskytuje způsob pro ex-vivo expansi, která využívá multifunkční agonisty hematopoietických receptorů, které jsou účinnější, než jediný samotný faktor.

Dalším aspektem vynálezu je poskytnutí způsobů pro uchovávání a/nébo expansi hematopoietických prekursorových buněk, které zahrnují inokulaci buněk do kultivační nádoby, která obsahuje kultivační médium, které bylo upraveno působením buněčné linie buněk stromatu jako jsou např HS-5 (WO 96/02662, Roecklein a Torok-Strob, Blood 85: 997-1105, 1995), které bylo doplněno o multifunkční agonisty hematopoietických receptorů podle vynálezu.

Dalším zamýšleným terapeutickým použitím růstových faktorů je ίη-vitro aktivace hematopoietických prekursorových a kmenových buněk pro účely genové terapie. Vzhledem k

Č dlouhému času života hematopoietických prekursorových buněk a distribuci jejich dceřiných 4 buněk do celého těla jsou hematopoietické prekursorové buňky dobrým kandidátem pro ex-vivo genovou transfekci. Máme-li žádaný gen inkorporovaný do genomu hematopoietické prekursorové, nebo kmenové buňky potřebujeme stimulovat buněčné dělení a replikaci DNA.

Buněčný cyklus hematopoietické kmenové buňky má velmi nízkou frekvenci, což znamená, že růstové faktory mohou být výhodné k vyvolání transdukce genu a tak zvýšit klinické vyhlídky genové terapie. Potenciálními aplikacemi genové terapie (review Crystal, Science 270: 404-410 (1995)) zahrnuje 1) léčbu mnoha vrozených metabolických poruch a imunodeficiencí (Kay a Woo,

- Trends Genet. 10: 253-257 (1994)), 2) neurologických poruch (Friedmann, Trends Genet. 10:

• ·

Ofi · · · ·· - * - * ······ ♦······ ·· ··

210-214 (1994)), 3) rakoviny (Culver a Blaese, Trends Genet. 10: 174-178 (1994)) a 4) infekčních chorob (Gilboa and Smith, Trends Genet. 10: 139-144 (1994)).

Existuje mnoho způsobů, známých odborníkům, pro vnášení genetického materiálu do hostitelských buněk. Byl vyvinut velký počet vektorů virových i nevirových pro přenos terapeutických genů do primárních buněk. Na virech založené vektory zahrnují 1) replikačně deficientní rekombinantm retro virus (Boris-Lawrie a Temin, Curr. Opin. Genet. Dev. 3: 102-109 (1993), Boris-Lawrie a Temin, Annal. New York Acad. Sci. 716: 59-71 (1994), Miller, Current Top. Microbiol. Immunol. 158: 1-24 (1992)) a replikačně deficientní rekombinantní adenovirus r(Berkner, BioTechniques 6: 616-629 (1988), Berkner, Current Top. Microbiol. Immunol. 158: 39-66 (1992), Brody a Crystal, Annal. New York Acad. Sci. 716: 90-103 (1994)). Nevirové vektory zahrnující komplexy proteinů a DNA (Cristiano et al., PNAS USA. 90: 2122-2126 (1993(, Curriel et al., PNAS USA 88: 8850-8854 (1991), Curriel, Annal. New York Acad. Sci. 716: 36-58 (1994)), elektroporace a na liposomech založený přenos nanř pomocí kationických liposomů (Farhood et al., Annal. New York Acad. Sci. 716: 23-35 (1994)).

Vynález poskytuje zlepšení existujících metod expanse hematopoietických buněk, do kterých může být vložen nový genetický materiál, v takovém případě poskytuje způsoby využití multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů, které mají zvýšenou biologickou aktivitu včetně aktivit nepozorovaných u žádného jednotlivého kolonie stimulujícího faktoru.

Mnoho léků může způsobit supresi kostní dřeně, nebo hematopoietické deficience. Příklady takových léků jsou AZT, DDI, alkylační činidla a antimetabolity používané v | chemoterapii, antibiotika jako jsou chloramfenikol, penicilín, gancyclovir, daunomycin a sulfonamidy, fenothiazony, trankvilizery jako je meprobamat, analgetika jako je aminopyrin a dipyron, anti-konvulsanty jako je fenytoin nebo karbamazepin, antithyroidika jako je propylthiouracil a methimazol a diuretika. Multifunkční agonisté hematopoietických receptorů podle vynálezu mohou být výhodné pro prevenci, nebo léčbu suprese kostní dřeně, nebo deficiencí krvetvorby, které se často objevují u pacientů léčených těmito léky.

Hematopoietické deficience se často mohou objevovat jako důsledek virové, mikrobiální, nebo parasitické infekce a jako důsledek léčby ledvinových chorob, nebo selhání ledvin, např. dialysy, Multifunkční agonisté hematopoietických receptorů podle vynálezu mohou být výhodné pro léčbu takovýchto hematopoietických deficiencí.

Různé imunodeficience např. deficience v T a/nebo B lymfocytech, nebo poruchy imunity, např. revmatická arthritida mohou být rovněž prospěšně ovlivněny léčbou pomocí multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů podle vynálezu. Imunodeficience mohou být výsledkem

·· · • · virových infekcí např. HTLVI, HTLVII, HTLVIII, silného vystavení radiaci, terapie rakoviny, nebo důsledkem dalších lékařských zákroků. Multifunkční agonisté hematopoietických receptorů podle vynálezu mohou být rovněž využity, sami, nebo v kombinaci s dalšími kolonie stimulujícími faktory pro léčbu dalších deficiencí krevních buněk, včetně thrombocytopenie (nedostatečnost krevních destiček), nebo anemie. Dalšími použitími těchto nových polypeptidů je in vivo a ex vivo léčba pacientů v rekonvalescenci po transplantaci kostní dřeně a při vývoji monoklonálních a polyklonálních protilátek generovaných standardními metodami pro diagnostiku, nebo terapeutické použití.

(·

Dalším aspektem vynálezu jsou způsoby a terapeutické směsi pro léčbu stavů uvedených výše. Takové směsi obsahují terapeuticky efektivní množství jednoho, nebo více multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů podle vynálezu ve směsi s terapeuticky přijatelným nosičem. Tato směs může být podávána buď parenterálně, intravenózně, nebo subkutálně. Je-li podávána, pak je tato terapeutická směs podle vynálezu ve formě neobsahující pyrogeny, parenterálně přijatelném vodném roztoku. Příprava takové parenterálně přijatelného roztoku proteinu majícího vhodné pH, isotonického, stabilního a podobně je v techonologii známá. Léčba hematopoietické deficience může zahrnovat podávání farmaceutických směsí obsahující multifunkční agonisty hematopoietických receptorů pacientům. Multifunkční agonisté hematopoietických receptorů podle vynálezu mohou být výhodné pro aktivaci a amplifikaci hematopoietických prekursorových buněk léčbou těchto buněk in vitro proteiny multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů podle vynálezu před podáním buněk pacientovi.

Dávkovači režim zahrnutý ve způsobu léčby výše popsaných stavů bude stanoven s ohledem na názor lékaře, protože účinek léků může být modifikován řadou faktorů např. stavem, tělesnou váhou, pohlavím a výživou pacienta, závažností případné infekce, dobou podání a dalšími klinickými faktory. Obecně může být denní režim podávání v rozsahu od 0,2 - 150 pg/kg C multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů na kilogram tělesné váhy. Dávkování bude také přispůsobeno aktivitě daného proteinu multifunkčního agonisty hematopoietických receptorů a je třeba poznamenat že, mohou nastat situlace, kdy je odůvodněné i dávkování menší než 0,1 pg a vyšší než 1 mg na kilogram tělesné váhy za den. Navíc existují specifické okolnosti, kdy dávkování multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů mohou být stanoveny vyšší, nebo nižší, než v rozmezí 0,2 -150 pg na kilogram tělesné váhy. To zahrnuje spolupodávání s dalšími hematopoietickými růstovými faktory, nebo IL-3 variantami, nebo růstovými faktory; spolupodávání s chemoterapeutickými léky a/nebo ozářením; používáním glykosylovaných proteinů multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů; a různých pacienta se týkajících ·· ·« » · · • · • · • · ···· ·· • · • · ·« · ·· ·· • · · · » · · ·

Λ ··· ··· • · • · · » problémů zmíněných výše v tomto oddílu. Jak je poznamenáno výše mohou zahrnovat terapeutické způsoby a směsi spolupodávání dalších hematopoietických růstových faktorů. Neomezující výčet dalších případných hematopoietických růstových faktorů, kolonie stimulujících faktorů (CSF), cytokinů, lymfokinů a interleukinů pro současné nebo sekvenční podávání spolu s chimérickými proteiny podle vynálezu zahrnují GM-CSF, G-CSF, G-CSF Ser¹⁷, c-mpl ligand (také označovaný TPO nebo MGDF), M-CSF, erythropoietin (EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-3, varianty IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, LIF, růstový faktor B-buněk, diferenciační faktor B-buněk, diferenciační faktor eosinofilů, faktor kmenových buněk (SCF) také známý jako Steel faktor, nebo c-kit ligand, SCSF, SDF-1, nebo jejich kombinace. „hIL-3 varianta“ je definována jako hIL-3 molekula, která obsahuje aminokyselinové substituce, nebo části hIL-3 deletovány, jak bylo uvedeno v WO 94/12638, WO 94/12639 a WO 95/00646, stejně jako další známé varianty. Výše uvedené dávkování bude přizpůsobeno, aby byl kompenzován obsah dalších složek v terapeutických směsích. Vývoj léčby pacientů může být sledován periodickým stanovováním hematopoietického profilu např. porovnáním počtu buněk a podobně.

Stanovení aktivity chimérických proteinů

Biologická aktivita proteinů multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů podle vynálezu může být stanovena na základě syntesy DNA ve faktor dependentních buněčných linií, nebo počítáním vytvořených kolonu v in-vitro stanovení buněk kostní dřeně. Chimérické proteiny mohou být stanoveny pomocí mnoha in-vitro a in-vivo modelů známých odborníkům. Neomezující výčet takových stanovém zahrnuje:

Methylcelulosové stanovení

Toto stanovení odráží schopnost kolonie stimulujících faktorů stimulovat normální buňky kostní dřeně k produkci odlišných typů hematopoietických kolonií in vitro (Bradley et al., Aust. Exp Biol. Sci. 44: 287-300, 1966), Pluznik et al., J. Cell Comp. Physio 66: 319-324, 1965).

Metody

Přibližně 30 ml čerstvé, normální, aspirátu zdravé kostní dřeně je získáno od osob po jejich informovaném souhlasu. Za sterilních podmínek jsou vzorky zředěny 1:5 roztokem IX PBS (#14040.059 Life Technologies, Gaithesburg, MD.) v 50 ml kónických zkumavkách (#25339-50 ·· ·· • · · · • · · • · · · • · · ···· «· ·· • · · · • « · « ··· ··· • « ·· ··

Corning, Corning MD). Pod zředěné vzorky je podvrstven Ficoll (Histopaque 1077 Sigma H8889) a vzorky jsou zcentrifugovány při 300 x g 30 min. Vrstva jednojademých buněk je odděleny dvakrát promyta v IX PBS a jednou v 1% BSA PBS (CellPro Co., Bothel, WA). Mononukleáry jsou spočteny a CD34+ buňky jsou odděleny pomocí Ceprate LC (CD34) Kit (CellPro Co., Bothel, WA) kolony. Tato frakcionace je prováděna jelikož všechny prekurzorové a kmenové buňky kostní dřeně nesou CD34 povrchový antigen.

Kultury byly připraveny v trojím provedení ve finálním objemu 1,0 ml v 35x10 mm petriho miskách (Nunc č. 174926). Kultivační médium bylo získáno z Terry Fox Laboratoří (HCC-4230 <· médium, Terry Fox Labs, Vancouver, B.C., Kanada) do kultivačního média je přidán i erythropoietin (Amgen, Thousand Oaks, CA.). Na jednu misku bylo přidáno 3000-10000 CD34+ bunčk. Je přidán rekombinantní IL-3, purifikovaný ze savčích buněk, nebo E. coli, a proteiny multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů v kondiciovaném médiu od transfekovaných savčích buněk, nebo purifikovaných z kondiciovaného média od transfekováných savčích buněk, nebo E. coli, v finální koncentraci od 0,001 nM do 10 nM.

Rekombinantní hIL-3, GM-CSF, c-mpl ligand a- multifunkční agonisté hematopoietických receptorů jsou vlastní výroby. G-CSF (Neupogen) byl získán od Amgen (Thousand Oaks Calf.).

Kultury byly resuspendovány pomocí 3 ml stříkačky po 1 ml na misku. Kontrolní (slepý pokus) kultury neobsahovaly žádné stimulační faktory. Kultury pro pozitivní kontrolu obsahovaly kondiciované médium (PHA stimulované lidské buňky: Terry Fox Lab. H2400). Kultury jsou inkubovány při 37°C, 5% CO2 ve zvlhčeném vzduchu. Hematopoietické kolonie, které jsou definovány jako větší než 50 buněk byly spočítány v den nejvyšší odpovědi (po 10-11 dnech) pomocí Nikon fázově inverzního mikroskopu s 40x objektivem. Skupiny buněk obsahující méně než 50 buněk byly označeny jako klastry. Alternativně mohou být kolonie identifikovány přenesením kolonií na sklíčko a barveny, nebo mohou být sklizeny resuspendovány a stočeny na C cytospinové sklíčko pro barvení.

Stanovení růstových faktorů pomocí krve z lidské pupeční šňůry

Buňky kostní dřeně jsou tradičně používány pro in vitro stanovém aktivity hematopoietických kolonie stimulujících faktorů (CSF). Lidská kostní dřeň však není vždy dostupná a navíc existuje významná variabilita mezi jednotlivými dárci. Krev z pupeční šňůry je s kostní dření srovnatelná jako zdroj hematopoietických a prekurzorových buněk (Broxmeyer et al., PNAS USA 89: 4109-113, 1992; Mayani et al., Blood 81: 3252-3258, 1993). Na rozdíl od kostní dřeně je však krev z pupeční šňůry mnohem snadněji a pravidelněji dostupná. Existuje zde rovněž • · • · · · · ·

možnost redukovat variabilitu stanovení smíšením buněk čerstvě získaných od několika dárců, nebo vytvořením banky zmražených buněk pro tento účel. Modifikováním kultivačních podmínek a/nebo analyzováním specifických znaků linií je možné specificky stanovovat granulocytové í makrofágové kolonie (CFU-GM), aktivitu megakaiyocytového CSF, nebo aktivitu buněk s vysokým potenciálem tvorby kolonií (HPP-CFC).

Metody

Mononukleámí buňky (MNC) byly izolovány z krve z pupeční šňůry v průběhu 24 hodin od odběru pomocí standardního hustotního gradientu (1,077 g/ml Histopaque). MNC z krve pupeční ř šňůry byly dále obohaceny o kmenové buňky a prekurzory pomocí několika postupů zahrnující imunomagnetickou selekci CD 14-, CD34+ buněk; získání SBA-CD34+ frakce pomocí láhve pokryté speciální vrstvou od Aplied Imune Science (Santa Clara, CA); a CD34+ selekce pomocí

CellPro (Bothell, WA) avidinové kolony. Ke stanovení jsou použity buď čerstvě izolované nebo zmražené CD34+ obohacené frakce. Kultury ve dvojím provedení pro každé ředění vzorku (koncentrace od 1 pM do 1204 pM) jsou připraveny s 1 x 104 buňkami v 1 ml 0,9% methylcelulosu obsahujícího média bez dalších růstových faktorů (Methocult H4230 od Stem Cell Technologies, Vancouver, BC.). V některých experimentech byl použit místo Methocult H4230 použit Methocult H4330 obsahující erythropoietin (EPO), nebo byl přidán faktor kmenových buněk (SCF), 50 ng/ml (Biosource International, Camarillo, CA). Po 7-9 denní kultivaci byly kolonie obsahující více než 30 buněk spočítány. Abychom dodrželi objektivitu vyhodnocení byly jednotlivá stanovém vyhodnocována na slepo.

AML proliferační stanovení biaktivního lidského interleukinu-3

Faktor-dependentní buněčná linie AML 193 byla získána od American Type Culture C

Collection (ATCC, Rockville, MD). Tato buněčná linie pocházející od pacienta s akutní myeloidní leukémií, je buněčná linie dependentní na růstovém faktoru, která vykazuje zvýšený růst v médiu doplněném o GM-CSF (Lange, B. et al., Blood 70: 192, 1987; Valtieri, M., et al., J. Immunol. 138: 4042, 1987). Byla použita varianta této buněčné linie AML 193 1.3, která byla adaptována na dlouhodobý růst v IL-3 vymytím růstových faktorů a ponecháním buněk bez růstových faktorů po 24 hodin. Buňky jsou poté přemístěny na 24 jamkovou destičku lxl 0⁵ buněk/jamku v médiu obsahujícím 100 U/ml IL-3. Trvá přibližně 2 měsíce než jsou buňky začnou v přítomnosti IL-3 rychle růst. Tyto buňky jsou uchovávány stejně jako AML 193 1.3 tedy v tkáňové kultuře doplněné lidským IL-3 (viz níže)'.

• · ··· · · ···· ·· ·· · · · ······ · · · · · · ·

Buňky AML 193 1.3 byly 6 krát promyty studeným vyváženým Hanksovým solným roztokem (HBSS, Gipco, Grand Island, NY) centrifugací buněčné suspenze při 250 x g po 10 minut následované dekantací supematantu. Pelet buněk je resuspendován v HBSS a procedura je opakována dokud není uskutečněno šest promývacích cyklů. Buňky promyté šestkrát pomocí tohoto postupu jsou resuspendovány v médiu pro tkáňovou kulturu na hustotu pohybující se od 2 x 10⁵ do 5 x 10⁵ živých buněk na ml. Toto médium je připraveno doplněním Iscove modifikovaného Dulbecco media (IMDM, Hazelton, Lenexa, KS) o albumin, transferin, lipidy a 2-merkaptoethanol. Hovězí albumin (Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN) je přidán v koncentraci 500 pg/ml; lidský transferin (Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN) v koncentraci “ 100 pg/ml; lipid ze sóji (Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN) při 50 pg/ml; a 2merkaptoethanol (Sigma, St. Louis, MG) je přidán v koncentraci 5 x 10'⁵ M.

Série ředění lidského interleukinu-3, nebo chimérických proteinů multifiinkčních agonistů hematopoietických receptorů jsou připraveny ve třech provedeních v médiu pro tkáňové kultury⁷ doplněném, jak je uvedeno výše, na 96 jamkových destičkách Costar 3596 pro tkáňové kultury.

Každá jamka obsahovala 50 μΐ média obsahujícího interleukin-3, nebo chimérického proteinu multifunkčního agonisty hematopoietických receptorů dokud není série ředění úplná. Kontrolní jamky obsahovaly samotné médium pro tkáňové kultury (negativní kontrola). AML 193 1.3 buněčná suspenze popsaná výše je přidána do každé jamky odpipetováním 50μ1 (2,5 x 10⁴ buněk) do každé jamky. Destičky s tkáňovými kulturami jsou inkubovány při 37°C, 5% CO2 v zvlhčeném vzduchu tři dny. Třetí den je přidáno 0,5 pCi ³H-thymidinu (2 Ci/mM, New England Nuclear,

Boston, MA) v 50 μΐ média pro tkáňové kultury. Kultury jsou inkubovány při 37°C, 5% CO2 v zvlhčeném vzduchu 18-24 hodin. Buněčná DNA je sklizena na smotek skleněných vláken (Pharmacia LKB, Gaithersburg, MD) pomocí systému pro sklízení buněk TOMTEC (TOMTEC,

Orange, CT), které využívají cyklus promytí vodou následovaný promytím 70% ethanolem.

Filtrační smotky jsou ponechány k vysušení na vzduchu a poté umístěny do vzorkových sáčků, do I kterých je přidána scintilační kapalina (Scintiverse II, Fisher Scientific, St. Louis, MO, nebo BetaPlate Scintilační kapalina, Pharmacia LKB, Gaithersburg, MD).

Beta emise z jednotlivých jamek s tkáňovými kulturami je změřena LKB BetaPlate 1205 scintilační počítač (Pharmacia LKB, Gaithersburg, MD) a data jsou vyjádřena jako impulzy do buněk začleněného H³-thymidinu za minutu v každé z jamek s tkáňovou kulturou. Aktivita lidského interleukinu-3 nebo proteinů multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů je kvantifikována měřením proliferace buněk (začlenění H³-thymidinu) indukovaném zvyšujícími se koncentracemi interleukinu-3, nebo proteinů multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů. Obvykle se koncentrace při tomto stanovení pohybovala od 0,05 pM do 10⁵ pM. Aktivita byla určena změřením dávky interleukinu-3 nebo proteinů multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů, které způsobí 50% maximální proliferace (ECso= 0,5 x (maximální mezi třemi provedeními průměrný počet impulsů do buněk začleněného H³-thymidinu za minutu v jedné jamce u všech testovaných koncentrací interleukinu-3 - pozadí (průměrný počet impulsů do buněk začleněného H³-thymidinu za minutu v jedné jamce u kultur bez interleukinu-3)). Tato hodnota EC50 je rovněž ekvivalentní 1 jednotce bioaktivity. Každé stanovení je prováděno s nativním interleukinem-3 jako referenčním standardem, takže může být stanovena relativní velikost aktivity.

Obvykle byly proteiny multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů testovány v koncentracích od 2000 pM do 0,06 pM kdy v řadě ředění byla vždy sousední koncentrace dvakrát zředěnější.

Aktivita každého vzorku byla stanovena jako koncentrace, která způsobila 50% maximální odpovědi, kdy při stanovém této hodnoty byl použit pro proložení dat čtyř parametrový matematický model. Bylo pozorováno, že horní plato (maximální odpověď) pro vzorek a standard, se kterým byl porovnáván se neliší. Výpočet relativní aktivity pro každý vzorek byl tedy proveden ze stanovení EC50 pro vzorek a standard jak jsou uvedeny výše. AML 193.1.3 buňky proliferací reagovaly na hIL-3, hGM-CSF a hG-CSF.

TF1 c-mpl ligand dependentní proliferační stanovení

C-mpl ligand proliferační aktivita může být stanovena pomocí subklonu pluripotentní lidské buněčné linie TF1 (Kitamura et al., J. Cell Physiol 140: 323-334. (1989)). TF1 buňky jsou udržovány v hIL-3 (100 U/ml). Pro získání sub-klonu reagujícího na c-mpl ligand jsou buňky udržovány v přechodovém médiu obsahujícím 10% supematant z BHK buněk trasfekováných genem exprimujícím 1-153 formu c-mpl ligandu (pMON26448). Většina buněk zahyne, ale část přežije. Po zředění klonů je vyselektován k c-mpl citlivý klon a tyto buňky jsou rozděleny do přechodového média na hustotu 0,3 x 10⁶ buněk/ml den před zahájením stanovení. Přechodové médium pro tyto buňky má následující složení: RPMI 1640 (Gipco), 10% FBS (Harlan, Lot #91206), 10% c-mpl ligand supematant z transťekováných BHK buněk, 1 mM pyruvát sodný (Gipco), 2 mM glutamin (Gipco), a 100 pg/ml penicilin-streptomycin (Gipco). Další den jsou buňky sklizeny a dvakrát promyty v RPMI, nebo IMDM médiu a nakonec promyty v ALT, nebo médiu pro stanovení. ALT médium obsahuje: IMDM (Gibco), 500 pg/ml lidského sérového albuminu, 100 pg/ml lidského transferům, 50 pg/ml sójového lipidu, 4 x 10-8M beta27

9 9 9

¢. do o o o 3 o 3 0 a ooo.

O O O O 09

O o o 0 o o o

O 5 O o o

O O O 0 90 0

C 9 O

000 000 a o <5 3 O O merkaptoethanol a 2 ml A9909 (Sigma, roztok antibiotik) na 1000 ml ALT. Buňky jsou zředěny v médiu pro stanovení na finální koncentraci 0,25 x 10⁶ buněk/ml na 96 jamkové destičce s.malým odparem (Costar) a finální objem 50 μΐ. Supematanty (kondiciovaná média( od transfekovaných klonů jsou přidány v objemu ·50 μΐ ve dvojím provedení vzorků v koncetraci 50% a dále vždy v trojnásobném zředění až do konečného zředění 1,8%.. Trojí provedení sady ředění IL-3 varianty pMON13288 začínající na 1 ng/ml a ředěné , třikrát po-koncentraci 0,0014 ng/ml je použita jako pozitivní kontrola. Destičky jsou inkubovány při 5% CO2 a 37°C._; Šestý den kultivace je na destičky aplikován puls 0,5 Ci 3H / jamku (NEN) v objemu 20 μΐ/jamku a ponechány inkubovat

A při 5% CO2 a 37°C po čtyři hodiny. Destičky jsou sklizeny a proměřeny na Betaplate čítači.

MUTZ-2 buněčné proliferační stanovení *

Buněčná linie jako je MUTZ-2, což je lidská linie myeloidních buněk (German Collection of Microorganism and Cell Cultures, DSM ACC 271), může být použita pro stanovení buněčné proliferační aktivity agonistů flt3 receptorů. Kultury MUTZ-2 jsou udržovány v přítomnosti rekombinantního nativního flt3 ligandu (20-100 ng/ml) v růstovém médiu. Devatenáct hodin před zahájením stanovení jsou MUTZ-2 buňky třikrát promyty IMDM médiem (Gipco) a resupendovány v samotném IMDM médiu v koncentraci 0,5-0,7 x 10⁶ buněk/ml a inkubovány při 37°C a 5% CO2 takže hladový v nepřítomnosti flt3 ligandu. V den stanovení jsou standardy a agonisté flt3 receptorů naředěny na koncentraci dvakrát vyšší než je žádaná finální koncentrace ve sterilním médiu pro tkáňové kultury určené pro stanovení na 96 jamkové destičce. Agonisté flt3 receptorů a standardy jsou testovány třikrát vedle sebe. Je vneseno 50 μΐ média pro stanovení do každé jamky kromě řádku A. Do řádku A je přidáno 75 μΐ agonisty flt3 receptorů nebo standardů | ' a poté je z řádku A odebráno vždy 25 μΐ je provedena série ředění (1:3) ha celém zbytku destičky (řádky B až G). Řádek H zůstává a obsahuje pouze médium jako kontrolu. Hladovějící MUTZ-2

X , buňky jsou dvakrát promyty v IMDM médiu a resuspendovány v 50 μΐ média pro stanovení. Do každé jamky je přidáno 50 μΐ suspeze buněk tak, aby výsledná koncentrace byla 0,25 x 10 . buněk/ml. Destičky pro stanovení obsahující buňky jsou inkubovány při 37°C a 5% CO2 44 hodin.

Na každou jamku je pak aplikován puls 1 μ(Ζν)ηηύαχ triciovaného thymidinu v objemu 20 μΐ na čtyři hodiny. Poté jsou destičky sklizeny a vyhodnoceny.

Další in vitro na buňkách založené proliferační stanovení

Další in vitro na buňkách založené proliferační stanovém, známá odborníkům, mohou být rovněž vhodná pro stanovém aktivity chimérických proteinů multifunkčních agonistů • · ·· · · · · · · · » · · · · · · · · · · · • * · · · · · · · · · · · ········

J-ϋ · · · · · · · ···· ·· «···»·· ·* «· hematopoietických receptorů a to v závislosti na různých faktorech podobně jako bylo popsáno pro AML 193.1.3 buněčnou proliferační stanovení. Následují příklady dalších použitelných stanovení.

TF1 proliferační stanovení: TF1 je pluripotentní lidská buněčná linie (Kitamura et al., J. Cell Physiol 140: 323-334. (1989)), které jsou citlivé k hIL-3.

32D proliferační stanovení: 32D je myší IL-3 dependentní buněčná linie, která není citlivá k lidskému IL-3, aleje citlivá k lidskému G-CSF, který není druhově specifický.

Baf/3 proliferační stanovení: Baf/3 je myší IL-3 dependentní buněčná linie, která není citlivá k lidskému IL-3, lidskému flt3 ligandu, nebo lidskému c-mpl ligandu, ale je citlivá k lidskému G-CSF, který není druhově specifický.

TI 165 proliferační stanovení: TI 165 buňky jsou IL-6 dependentní myší buněčná linie (Nordan et al., 1986), která je citlivá k IL-6 a IL-11.

Na lidské sraženině plasmy založené meg-CSF stanovém': Využívá ke stanovém tvorbu klonů megakaryocytů (Mazur et al., 1981).

Transfekované buněčné linie:

Buněčné linie jako je myší Baf73 buněčná linie mohou být transfekovány, receptory hematopoietických růstových faktorů, jako je lidský G-CSF receptor, nebo lidský c-mpl receptor, které tato buňky normálně neobsahují. Tyto transfekované buněčné linie mohou být použity ke stanovení aktivity ligandu, pro který je receptor transfekovaný do buněčné linie určen.

Jednou takovou transfekovanou buněčnou linií je Baf/3 buněčná linie byla připravena klonováním cDNA kódující c-mpl z knihovny připravené z c-mpl citlivé buněčné linie a kolonované do mnohonásobného klonovacího místa plasmidu pcDNA3 (Invitrogen, San Diego Ca.). Baf/3 buňky byly transfekovány plasmidem pomocí elektroporace. Buňky byly selektovány v přítomnosti G418 v přítomnosti myšího IL-3 ve Wehi kondiciovaném médiu. Klony byly připraveny omezeným zředěním.

Podobným způsobem může být do Baf/3 buněčné linie transfekován i lidský G-CSF receptor a tato může být použita pro stanovení bioaktivity chimérických proteinů multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů.

Analýza proliferační aktivity c-mpl ligandu Metody « ·

1. Proliferační stanovení s použitím kostní dřeně

a. Purifikace CD34+ buněk:

Odebraná kostní dřeň (15-20) ml byla získaná od normálních alogenních dárců po informovaném souhlasu. Buňky byly zředěny 1:3 fosfátovým pufrem s chloridem sodným (PBS, Gibco-BRL), 30 ml bylo navrstveno nad 15 ml Histopaque-1077 (Sigma) a centrifugováno 30 minut při 300 RCF. Vrstva mononukleárů byla odebrána a promyta PBS. CD34+ buňky byly z připravených mononukleárů získány pomocí afinitm kolony podle instrukcí výrobce (CellPro, lne., Bothell WA). Po purifikaci byla čistota CD34+ buněk průměrně 70% jak bylo stanoveno pomocí průtokové cytometrie s využitím anti CD34 monoklonální protilátky konjugované s fluoresceinem a antiCD38 konjugované s fykoerythrinem (Becton Dickinson, San Jose CA).

Buňky byly resuspendovány v hustotě 40000 buněk na ml v X-vivo 10 médiu (BioWhittaker, Walkersville, MD) a jeden ml suspeze byl vyset na 12 jamkové destičky pro tkáňové kultury (Costar). Do některých jamek byl přidán růstový faktor hIL-3 v množství 100 ng/ml (pMON5873). hIL-3 varianty byly použity v množství 10 ng/ml až 100 ng/ml. Byly testována kondiciovaná média pocházející od BHK buněk transfekovaných plasmidem kódujícím c-mpl ligand, nebo chimérické proteiny multifunkčních agonistů hematopoietických receptorů po přídavku 100 μΐ supematantu od těchto buněk do 1 ml kultur (asi 10% zředění). Buňky byly inkubovány při 37°C 8-14 dnů v 5% CO2 ve vlhkém inkubátoru,

b. Sklizeň buněk a analysa:

I Na konci doby kultivace byl stanoven celkový počet buněk pro každé podmínky. Pro fluorescenční analýzu a určení ploidity byly buňky promyty v megakaryocytovém pufru (MK pufr, 13,6 mM citrát sodný, 1 mM theofylin, 2,2 pm PGE1, 11 mM glukosa, 3% hmotn./obj. BSA, v PBS, pH 7,4) (Tomer et al., Blood 70: 1735-1742, 1987) resuspendovány v 500 μΐ MK pufru obsahujícího anti-CD41 a FITC protilátky (1:200, AMAC, Westbrook, ME) a promyty v MK ⁹ pufru obsahujícího 0,5% Tween 20 (Fisher, Fair Lawn NJ) 20 min. na ledu následně fixovány v

0,5% Tween-20 a 1% paraformaldehydu (Fisher Chemical) 30 minut a poté inkubovány v propidium jodidu (Calbiochem, La Jolla, Ca) (50 pg/ml) s RNAsou (400 U/ml) v 55% v/v MK pufru (200 mOsm) 1-2 hodiny na ledu. Buňky byly analyzovány na FACScan, nebo Vantage průtokovém cytometru (Becton Dickinson, San Jose, CA). Zelená fluorescence (CD41a-FITC) byla oddělena a zárověň byl sledován lineární a log signál červené fluorescence (PI) pro stanovení ploidity DNA. Pro všechny buňky bylo stanoveno procento buněk, které obsahují CD41+. Analýza dat byla provedena pomocí software LYSIS (Becton Dickinson, San Jose, CA). Procento

buněk exprimujících CD41 antigen bylo zjištěno pomocí průtokové cytometrie (Percent). Absolutní počet (Abs) CD41+ buněk/ml byl vypočítán jako: (Abs)=(Počet buněk)* (procento)/100.

Stanovém megakaryocytů pomocí fibrinové sraženiny

CD34+ obohacená frakce buněk byla izolována, jak bylo popsáno výše. Buňky byly rozsuspendovány na hustotu 25 000 buněk/ml s, nebo bez cytokinu(cytokinů) v médiu obsahujícího bazické Iscoves IMDM médium doplněné o 0,3% BSA, 0,4 mg/ml apo-transferinu, 6,67 μΜ FeCl₂, 25 pg/ml CaCl₂, 25 pg/ml L-asparaginu, 500 pg/ml e-amino-n-kapronová kyselina a penicilin/streptomycin. Před vysetím na 35 mm destičky byl přidán thrombin (0,25 jednotek/ml) pro iniciaci tvorby sraženiny. Buňky byly inkubovány při 37°C 13 dnů v 5% CO₂ ve vlhkém inkubátoru.

Na konci doby kultivace byly destičky fixovány směsí methanoF.aceton (1:3), vysušeny na vzduchu a před barvením uchovávány při -200°C. Bylo použito peroxidasové imunochemické barvení (Zymed, Histostain-SP. San Francisco, CA) využívající směs primárních monoklonálních protilátek obsahujících anti-CD41a, CD42 a CD61. Kolonie byly po barvení spočteny a klasifikovány jako negativní, CFU-MK (malé kolonie, 1-2 ohniska a méně než přibližně 25 buněk), BFU-MK (velké, mnoho-ohniskové kolonie s >25 buňkami), nebo směsné kolonie (směs pozitivních a negativních buněk).

Příklady provedení vynálezu

Příklady 1 a 2

Konstrukce expresních vektorů pMÓN32364 a pMON32377 obsahujících DNA sekvence kódující multiíunkční agonisty receptorů zahrnující IL-3 (15-125) variantu připojenou přes IgG2b spojovník k flt-3 (1-134) ligandu, respektive IL-3 (15-125) variantu připojenou přes IgG2b spojovník k flt-3 (1-134) ligandu. Plasmidy pMON32364 a pMON32377 byly připraveny klonováním pomocí gelu purifikovaného NcoI/HindlII DNA fragmentu pocházejícího s pMON30237 SEQ ID Č.: 53 a pMON30238 SEQ ID Č.: 54 obsahujícího flt-3 (1-134) ligand a flt-3 (1-139) do vektorové DNA pMON30311 (derivátu pMON13058-WO 95/21254) štěpené AflIII/HindlII a upravené pomocí SAP s použitím standardních ligačních podmínek. Ligační směs byla použita k transformaci kompetentních DH5a buněk (Gibco BRL cat #18265-017) podle postupu doporučeného výrobcem a vektorová DNA byly izolována z ampicilin resistentních ··· · · ···· • · · · · · · «····· • · · · · · · «··· ·· «······ ·· ·· kolonií. DNA sekvence získaných genů (SEQ ID Č.: 21 respektive SEQ ID Č.: 22) byly stanoveny automatickým fluorescenčním DNA sekvencováním na ABI 373/377 DNA sekvenátoru (Perkin Elmer ABI) a Sequencher (Gene Codes) software. Výsledné vektory pMON32364 a pMON32377 kódují proteiny SEQ ID Č.: 42 respektive SEQ ID Č.: 43.

Příklady 3 a 4

Konstrukce expresních vektorů pMON30247 a pMON30246 obsahujících DNA sekvence kódující multifiinkčm agonisty receptorů zahrnující IL-3 (15-125) variantu připojenou přes IgG2b spojovník k flt-3 (1-134) ligandu, respektive IL-3 (15-125) variantu připojenou přes GlySer spojovník k flt-3 (1-134) ligandu. Plasmidy pMON30246 a pMON30247 byly připraveny klonováním pomocí gelu purifikovaného NcoI/AflIII DNA fragmentu pocházejícího, s pMON30244 (GlySer spojovník) SEQ ID Č.: 65 a pMON30245 (IgG2b spojovník) SEQ ID Č.: 66 do vektorové DNA pMON30237 štěpené Ncol (která obsahuje hFlt3L 1-34) jak je popsáno v příkladech 1 a 2. DNA sekvence získaných genů SEQ ID Č.: 13 respektive SEQ ID Č.: 14 kódují proteiny SEQ ID Č.: 42 respektive SEQ ID Č.: 43.

Příklady 5 a 6

Konstrukce expresních vektorů pMON30249 a pMON30248 obsahujících DNA sekvence kódující multifiinkční agonisty receptorů zahrnující IL-3 (15-125) variantu připojenou přes IgG2b spojovník k flt-3 (1-139) ligandu, respektive IL-3 (15-125) variantu připojenou přes GlySer spojovník k flt-3 (1-139) ligandu. Plasmidy pMON30248 a pMON30249 byly připraveny klonováním pomocí gelu purifikovaného NcoI/AflIII DNA restrikčního fragmentu pocházejícího s pMON30244 (GlySer spojovník) respektive pMON30245 (IgG2b spojovník) do vektorové DNA pMON30238 štěpené Ncol (která obsahuje hFlt3L 1-39) jak je popsáno v příkladech 1 a 2. DNA

Γ „ .

sekvence získaných genů SEQ ID Č.: 15 respektive SEQ ID C.: 16 kódují proteiny SEQ ID C.: va 36 respektive SEQ ID Č.: 37.

Příklady 7 a 8

Konstrukce expresních vektorů pM0N32392 a pMON32393 obsahujících DNA sekvence kódující multifiinkční agonisty receptorů zahrnující flt3 (1-134) ligand připojený přes IgG2b spojovník k IL-3 (15-125) variantě respektive flt3 (1-134) ligand připojený přes IgG2b spojovník k IL-3 (15-125) variantě. Plasmidy pMON32392 a pMON32393 byly připraveny pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Jako templát pro PCR reakci byla použita plasmidová • · · · · ···· · · ·· · · ·

DNA pMON30237 a pMON30238 a jako primery páry N-term SEQ ID Č.: 29/134rev SEQ ID Č.: 30 respektive N-term SEQ ID Č.: 29/139rev SEQ ID Č.: 31 aby bylo na C-konec ve čtecím rámci vloženo restrikční místo SnaBI. PCR reakční směs byla sestavena standardním způsobem pomocí Invitrogen PCR Optomizer kitu (Invitrogen). Podmínky amplifikačního cyklu byly následující: sedm cyklů 95°C jedna minuta, 65°C dvě minuty, 72°C 2 a 1/2 minuty následovaných jedním cyklem 94°C jedna minuta, 70°C dvě minuty, 72°C 2 a 1/2 minuty. Produkt PCR reakce byl purifikován pomocí Wizard PCR Purification kitu (Promega), a eluován 50 μΐ dH₂O. 20 μΐ

i. každého z purifiko váných PCR produktů bylo štěpeno 50 μΐ reakční směsi s 10 U Ncol a 10 U

SnaBI 90 minut při 37°C. Jeden pg vektoru pMON26431 (derivát pMON13061 - WO 95/21254) bylo štepeno 7,5 U Ncol a 7,5 U SnaBI v 20 μΐ reakční směsi 90 minut při 37°C a následně byla přidána 1 U krabí alkalické fosfatasy. Reakční směs byla inkubována dalších 10 minut při 37°C a oba inzerty a vektor byly purifikovány na gelu, jak bylo popsáno výše. Ligační čas a teplota byly modifikovány na inkubaci 3 hodiny při 16°C, následovanou 2 hodinami za pokojové teploty. Transformace a ověření DNA sekvence byly provedeny jak bylo popsáno v příkladech 1 a 2. DNA sekvence získaných genů SEQ ID Č.: 23 respektive SEQ ID Č.: 24 kódují proteiny SEQ ID Č.: 44 respektive SEQ ID Č.: 45.

Příklad 9

Konstrukce expresního vektoru pMON30328 obsahujícího DNA sekvenci kódující multifiinkčního agonistů receptorů zahrnujícího flt3 (1-134) ligand připojený přes IgG2b spojovník k agonistovi G-CSF receptorů. Plasmid pMON30328 byl připraven subklonováním na gelu purifikovaného NcoI/HindlII restrikčního fragmentu z pMON30237 do plasmidu pMON30309 (derivátu pMON13149 - WO 95/21254) rozštěpeného AfHII/HindlII (obsahujícího f G-CSF/IgG2b-AflIII/HindIII), jak je popsáno v příkladu 1 a 2. DNA sekvence získaného genu

SEQ ID Č.: 50 kóduje protein SEQ ID Č.: 60.

Příklad 10

Konstrukce expresního vektoru pMON30329 obsahujícího DNA sekvenci kódující multifiinkčního agonistů receptorů zahrnujícího agonistů G-CSF receptorů připojený přes IgG2b spojovník k flt3 (1-139) ligandu. Plasmid pMON30329 byl připraven subklonováním na gelu purifikovaného NcoI/HindlII restrikčního fragmentu z pMON30238 do plasmidu pMON30309 rozštěpeného AťlIII/HindlII (obsahujícího G-CSF/IgG2b-AflIII/HindIII), jak je popsáno v příkladu 1 a 2. DNA sekvence získaného genu SEQ ID Č.: 17 kóduje protein SEQ ID Č.: 38.

• ·

Příklad 11

Konstrukce expresního vektoru pMON32175 obsahujícího DNA sekvenci kódující multifunkčního agonistu receptorů zahrnujícího flt3 (1-139) ligand připojený přes IgG2b spojovník k agonistovi G-CSF receptorů. Plasmid pMON32175 byl připraven subklonováním na gelu purifikovaného NcoI/SnaBI restrikčního fragmentu z pMON32393 do plasmidu pMON26430 (derivátu pMON13060 - WO 95/21254) rozštěpeného NcoI/SnaBI, jak je popsáno v příkladu 1 a 2. DNA sekvence získaného genu SEQ ID Č.: 19 kóduje protein SEQ ID Č.: 40.

Příklad 12

Konstrukce expresního vektoru pMON32191 obsahujícího DNA sekvenci kódující multifunkčního agonistu receptorů zahrnujícího £Lt3 (1-139) ligand připojený přes IgG2b spojovník k agonistovi G-CSF receptorů. Plasmid pMON32175 byl připraven subklonováním na gelu purifikovaného NcoI/SnaBI restrikčního fragmentu z pMON32393 SEQ ID Č.: 58 do plasmidu pMON31123 rozštěpeného NcoI/SnaBI (který obsahuje GlySer/G-CSF seskupení), jak je popsáno v příkladu 1 a 2. DNA sekvence získaného genu SEQ ID Č.: 20 kóduje protein SEQ IDČ.:41.

Příklad 13

Konstrukce expresního vektoru pMON35767 obsahujícího DNA sekvenci kódující multifunkčního agonistu receptorů zahrnujícího flt3 (1-139) ligand připojený přes IgG2b spojovník k agonistovi G-CSF receptorů. Plasmid pMON35767 byl připraven subklonováním na gelu purifikovaného NcoI/HindlII restrikčního fragmentu z pMON32191 SEQ ID Č.: 20 do expresního vektoru pMON3934, který je derivátem pMON3359. pMON3359 je na pUC18

Γ založený vektor obsahující savčí expresní kazetu. Kazeta zahrnuje herpes simplex virový promotor IE110 (-800 až +120) následovaný modifikovaným IL-3 signálním peptidovou sekvencí a SV40 polyadenilačním signálem (poly-A), který byl subklonován do pUC18 polyspojovníku (viz Hippenmeyer et al., Bio/Technology, 1993, pp. 1037-1041). DNA sekvence získaného genu SEQ ID Č.: 20 kóduje protein SEQ ID Č.: 41.

• ·

Příklad 14

Konstrukce expresního vektoru pMON32173 obsahujícího DNA sekvenci kódující multifunkčního agonistů receptorů zahrnujícího flt3 (1-139) ligand připojený přes IgG2b spojovník k flt3 (1-139) ligandu. Plasmid pMON32173 byl připraven subklonováním na gelu purifikovaného -130 kbp NcoI/SacI restrikčního fragmentu z pMON32342 SEQ ID Č.: 52 a -290 kbp SacI/SnaBI restrikčního fragmentu z pMON32393 do plasmidu pMON30329 rozštěpeného NcoI/SnaBI, jak je popsáno v příkladu 1 a 2. DNA sekvence získaného genu SEQ ID Č.: 18 kóduje protein SEQ ID Č.: 39.

Příklad 15

Konstrukce expresního vektoru pMON45419 obsahujícího DNA sekvenci kódující multifunkčního agonistů receptorů zahrnujícího c-mpl (1-153) ligand připojený přes IgG2b spojovník k flt3 (1-139) ligandu. Plasmid pMON45419 byl připraven subklonováním NcoI/SnaBI restrikčního fragmentu z pMON26474 (derivátu pMON26472 - WO 95/21254) do plasmidu pMON32173 SEQ ID Č.: 56 rozštěpeného NcoI/SnaBI, jak je popsáno v příkladu 1 a 2. DNA sekvence získaného genu SEQ ID Č.: 25 kóduje protein SEQ ID Č.: 46.

Příklad 16

Konstrukce expresního vektoru pMON45420 obsahujícího DNA sekvenci kódující multifunkčního agonistů receptorů zahrnujícího flt3 (1-139) ligand připojený přes IgG2b spojovník k c-mpl (1-153) ligandu. Plasmid pMON45420 (derivát pMON26471 - WO 95/21254) byl připraven subklonováním NcoI/SnaBI restrikčního fragmentu z pMON32191 do plasmidu pMON26473 rozštěpeného NcoI/SnaBI, jak je popsáno v příkladu 1 a 2. DNA sekvence získaného genu SEQ ID Č.: 26 kóduje protein SEQ ID Č.: 47.

Příklad 17

Konstrukce plasmidu pMON46408, který kóduje multifunkčního agonistů hematopoietických receptorů obsahujícího EPO připojený přes GlySer spojovník k flt3 (1-139) ligandu.

Plasmid pMON46408 byl zkonstruován pomocí dvou krokové klonovací procedury . Nejprve byl zkonstruován meziproduktový plasmid pMON46406. Tento plasmid kóduje lidskou EPO sekvenci připojenou k GlySer spojovníkové sekvenci obsahující restrikční místa AflIII a HindlII. Následující tři DNA fragmenty byly ligo vány za vzniku plasmidu pMON46406:

• ·

1. 480 pb Ncol/Stul fragment kódující EPO vyjma 6 koncových aminokyselin.

2. Zpárované oligonukleotidy epostu-xma.seq SEQ ID Č.: 32 a epostu.ma.rev SÉQ ID Č.: 33, které obsahují Stul-Xmal fragment kódující 6 terminálních aminokyselin EPO a část GlySer polypeptidové spojovníkové sekvence.

3. 3 052 bp Ncol/Xmal vektorový fragment plasmidu pMON13180

Ligační směs byla použita pro transformaci kompetentních MON105 buněk a transformanti byly selektováni na LB Amp miskách. Kolonie byly odebrány a analyzovány sekvenací DNA, aby byl identifikován správný klon. Tento klon byl označen pMON46406.

Pro přípravu pMON46408 byl plasmid pMON46406 štěpen AflITI a HindlII a fragment vektoru byl purifikován. Fragment byl ligován s 423 bp NcoI/HindlII fragmentem plasmidu pMON32342 SEQ ID Č.: 52, který kóduje flt-3 (1-139) ligand. Ligační směs byla použita pro transformaci kompetentních MON105 buněk a transformanti byly selektováni na LB Amp miskách. Kolonie byly odebrány a analyzovány sekvenací DNA, aby byl identifikován správný klon. Tento klon byl označen pMON46408. DNA sekvence získaného genu SEQ ID Č.: 28 kóduje protein SEQ ID Č.: 49.

Příklad 18 φ Stanovém bioaktivity vybraných chimemích proteinů

Vybrané chimérické proteiny podle vynálezu byly zkoumány pomocí BaG buněčné linie transfekované flt3/flk2 receptorem (BaG/flt3), aby byla stanovena £lt3 ligandová bioaktivita.

C

Tabulka 1 BaG/flt3 stanovení pMON30249

PMON32173 pMON32392

PMON32393

PMON32364 pMON32377

Srovnatelný se samotným nativním flt3 ligandem Srovnatelný se samotným nativním flt3 ligandem Srovnatelný se samotným nativním flt3 ligandem Srovnatelný se samotným nativním flt3 ligandem Srovnatelný se samotným nativním flt3 ligandem Srovnatelný se samotným nativním flt3 ligandem

Další detaily týkající se rekombinantních DNA metod, které mohou být použity pro vytvoření variant, jejich expresi v bakteriích, savčích buňkách, nebo hmyzích buňkách, purifikaci a znovusbalení žádaných proteinů a stanoveních bioaktivity těchto proteinů mohou být nalezeny v WO 95/00646, WO 94/12639, WO 94/12638, WO 95/20976, WO 95/21197, WO 95/20977, WO 95/21254, a US 08/383,035, jejichž úplné odkazy jsou zde uvedeny.

Další detaily známé odborníkům mohou být nalezeny v T. Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 a tam uvedených odkazech, začleněných zde jako odkazy; a v J. Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydání Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 a tam uvedených odkazech, začleněných zde jako odkazy. Metody purifikace proteinů, odborníkům známé, jsou detailně popsány v Methods in Enzymology, Vol. 182, Guide to Protein Purification zpracovaný Murrayem Deutscher, Academie Press, San Diego, CA (1990).

Všechny odkazy, patenty, nebo přihlášky zde uvedené jsou zde začleněny ve své úplnosti.

Různé další příklady v duchu a rozsahu vynálezu budou odborníkovi v oboru zřejmé po přečtení tohoto textu. Je zřejmé, že všechny takové další příklady jsou zahmúty v rozsahu vynálezu a připojených nároků.

SEZNAM SEKVENCI (1) OBECNÉ INFORMACE (i) PŘIHLAŠOVATEL: G. D. Searle Corporate, Oddělení pro patenty (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Chimérické proteiny jako Flt3 ligandy (iii) POČET SEKVENCÍ: 65 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

(A) ADRESÁT: G. D. Searle Corporate Patent Department (B) ULICE: P.O. Box 55110 (C) MĚSTO: Chicago (D) STÁT: IL (E) ZEMÉ: USA (F) ZIP: 60680 (v) POČÍTAČOVĚ ZPRACOVATELNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM Kompaktibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: DOS (D) SOFTWARE: FastSEQ pro Windows Verse 2.0 (vi) SOUČASNÉ ÚDAJE O PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:

(B) DATUM PODÁNÍ: 10-DUBEN-1998 (C) KLASIFIKACE:

(vii) PŘEDBĚŽNÉ ÚDAJE O PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: 08/837,026 (B) DATUM PODÁNÍ: ll-DUBEN-1997 (viii) ZÁSTUPCE/ÚDAJE O AGENTOVI:

(A) JMÉNO: Bennett, Dennis A (B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 34,547 (C) REFERENCE/JEDNACÍ ČÍSLO: C-3018/1/PCT (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

(A) TELEFON: 314-737-6986 (B) TELEFAX: 314-737-6972 (C) TELEX:

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:l:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 4 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:l:

Gly Gly Gly Ser 1 • · (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č: 2:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin ' (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární

	(ii)	TYP MOLEKULY: peptid
	(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č: 2:
	Gly 1	Gly Gly Gly Ser 5
!*	(2)	INFORMACE PRO SEQ ID Č: 3:
(	(i)	POPIS SEKVENCE: (A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární
	(ii)	TYP MOLEKULY: peptid
	(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č: 3:
	Gly 1	Gly Gly Gly Gly Ser 5
	(2)	INFORMACE PRO SEQ ID Č: 4:
	(i)	POPIS SEKVENCE: (A) DÉLKA: 2 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární -
	(ii)	TYP MOLEKULY: peptid
	(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č: 4:
	Gly 1	Ser
	(2)	INFORMACE PRO SEQ ID Č: 5:
r i	(i)	POPIS SEKVENCE: (A) DÉLKA: 3 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární
	(ii)	TYP MOLEKULY: peptid
	(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:5:
	Ala 1	Gly Ser
	(2)	INFORMACE PRO SEQ ID Č:6:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová ··· ··· (C) POČET ŘEŤEZCÓ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:6:

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Glu

Gly

1

5

10

15

Ser

Glu

Gly

Ser

Glu

'Gly

Gly

Ser

Glu

Gly

Ser

20

25

30

Gly Gly Gly Ser 35 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:7: t

£	(i)	POPIS (A) (B) (C) (D)	SEKVENCE: DÉLKA: 24 aminokyselin TYP: aminokyselinová POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová TOPOLOGIE: lineární
	(ii)	TYP	MOLEKULY: peptid
	(xi)	D/ODTC OrVUPMCr. ΤΠ ň . Π · £ í. j. kj ijuiv v υίΊ'νυ « kj j. i_z i ·

Ile	Ser	Glu	Pro	Ser	Gly	Pro	Ile Ser	Thr	Ile Asn Pro Ser Pro Pro
1				5				10	15
Ser	Lys	Glu	Ser	His	Lys	Ser	Pro

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:8:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:8:

Ile 1 Pro

Glu Gly Arg

Ile 5 Ser

Ser Lys

Glu Glu

Pro Ser

Ser Gly

Pro Ser

Ile Pro

Ser Thr Ile Asn 15

His

10 Lys

Ser

Pro Pro

20

25

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:9:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 349 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:9:

Ala

Thr

Gin

Asp

Cys

Ser

Phe

Gin

His

Ser

Pro

Ile

Ser

Asp

Phe

1

5

10

15

Ala

Val

Lys

Ile

Arg

Glu

Leu

Ser

Asp

Tyr

Leu

Gin

Asp

Tyr

Pro

20

25

30

Val

Thr

Val

Ala

Ser

Asn

Leu

Gin

Asp

Glu

Leu

Cys

Gly

Leu

35

40

45

Trp

Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Gin

Arg

Trp

Met

Glu

Arg

Leu

Lys

Thr

Val

·· ·· ·· • · · ··

50

55

60

Ala

Gly

Ser

Lys

Met

Gin

Gly

Leu

Glu

Arg

Val

Asn

Thr

Glu

Ile

65

70

75

80

His

Phe

Val

Thr

Lys

Cys

Ala

Phe

Gin

Pro

Ser

Cys

Leu

Arg

85

90

95

Phe

Val

Gin

Thr

Asn

Ile

Ser

Arg

Leu

Gin

Glu

Thr

Ser

Glu

Gin

100

105

110

Leu

Val

Ala

Leu

Lys

Pro

Trp

Ile

Thr

Arg

Gin

Asn

Phe

Ser

Arg

Cys

115

120

125

Leu

Glu

Leu

Gin

Cys

Gin

Pro

Asp

Ser

Thr

Leu

Tyr

Val

Glu

Gly

130

135

140

Gly

Ser

Pro

Gly

Glu

Pro

Ser

Gly

Pro

Ile

Ser

Thr

He

Asn

145

150

155

160

Pro

Ser

Pro

Ser

Lys

Glu

Ser

His

Lys

Ser

Pro

Asn

Met

Ala

Thr

165

170

175

Pro

Leu

Gly

Pro

Ala

Ser

Leu

Pro

Gin

Ser

Phe

Leu

Lys

Ser

180

185

190

Leu

Glu

Gin

Val

Arg

Lys

Ile

Gin

Gly

Asp

Gly

Ala

Leu

Gin

Glu

190

200

205

Lys

Leu

Cys

Ala

Thr

Tyr

Lys

Leu

Cys

His

Pro

Glu

Leu

Val

Leu

210

215

220

Leu

Gly

His

Ser

Leu

Gly

Ile

Pro

Trp

Ala

Pro

Leu

Ser

Cys

Pro

225

230

235

240

Ser

Gin

Ala

Leu

Gin

Leu

Ala

Gly

Cys

Leu

Ser

Gin

Leu

His

Ser

Gly

245

250

255

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gin

Gly

Leu

Gin

Ala

Leu

Glu

Gly

Ile

Ser

Pro

260

265

270

Glu

Leu

Gly

Pro

Thr

Leu

Asp

Thr

Leu

Gin

Leu

Asp

Val

Ala

Asp

Phe

275

280

285

Ala

Thr

Ile

Trp

Gin

Met

Glu

Leu

Gly

Met

Ala

Pro

Ala

290

295

300

Leu

Gin

Pro.

.. Thr

Gin

Gly

Ala

Met

Pro

Ala

Phe

Ala

Ser

Ala

Phe

Gin

305

310

315

320

Arg

Ala

Gly

Val

Leu

Val

Ala

Ser

His

Leu

Gin

Ser

Phe

Leu

325

330

335

Glu

Val

Ser

Tyr

Arg

Val

Leu

Arg

His

Leu

Ala

Gin

Pro

340

345

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:10:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1047 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:10:

GCCACCCAGG 60 CGTGAGCTGT 120	ACTGCTCCTT	TCAACACAGC	CCCATCTCCT	CCGACTTCGC	TGTCAAAATC
CTGACTACCT	GCTTCAAGAT	TACCCAGTCA	CCGTGGCCTC	CAACCTGCAG
GACGAGGAGC 180	TCTGCGGGGG	CCTCTGGCGG	CTGGTCCTGG	CACAGCGCTG	GATGGAGCGG
CTCAAGACTG 240	TCGCTGGGTC	CAAGATGCAA	GGCTTGCTGG	AGCGCGTGAA	CACGGAGATA
CACTTTGTCA 300	CCAAATGTGC	CTTTCAGCCC	CCCCCCAGCT	GTCTTCGCTT	CGTCCAGACC
AACATCTCCC 360	GCCTCCTGCA	GGAGACCTCC	GAGCAGCTGG	TGGCGCTGAA	GCCATGGATC
ACTCGCCAGA 420	ACTTCTCCCG	GTGCCTGGAG	CTGCAGTGTC	AGCCCGACTC'	CTCAACCCTG
TACGTAGAGG 4 80	GCGGTGGAGG	CTCCCCGGGT	GAACCGTCTG	GTCCAATCTC	TACTATCAAC
CCGTCTCCTC 540	CGTCTAAAGA	ATCTCATAAA	TCTCCAAACA	TGGCTACACC	ATTGGGCCCT

«· ··

	41	* • ·*·	• · « · * · « > ·· ··· ·
GCCAGCTCCC TGCCCCAGAG 600	CTTCCTGCTC AAGTCTTTAG	AGCAAGTGAG	AAAGATCCAG
GGCGATGGCG CAGCGCTCCA 660	GGAGAAGCTG TGTGCCACCT	ACAAGCTGTG	CCACCCCGAG
GAGCTGGTGC TGCTCGGACA 720	CTCTCTGGGC ATCCCCTGGG	CTCCCCTGAG	CTCCTGCCCC
AGCCAGGCCC TGCAGCTGGC 780	AGGCTGCTTG AGCCAACTCC	ATAGCGGCCT	TTTCCTCTAC
CAGGGGCTCC TGCAGGCCCT 840	GGAAGGGATA TCCCCCGAGT	TGGGTCCCAC	CTTGGACACA
CTGCAGCTGG ACGTCGCCGA 900	CTTTGCCACC ACCATCTGGC	AGCAGATGGA	AGAACTGGGA
ATGGCCCCTG CCCTGCAGCC 960	CACCCAGGGT GCCATGCCGG	CCTTCGCCTC	TGCTTTCCAG
CGCCGGGCAG GAGGGGTCCT	GGTTGCTAGC CATCTGCAGA	GCTTCCTGGA	GGTGTCGTAC

1020

CGCGTTCTAC GCCACCTTGC GCAGCCC

1047 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:ll:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 349 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:ll:

Ala

Thr

Pro

Leu

Gly

Pro

Ala

Ser Ser

Leu

Pro

Gin

Ser

Phe

Leu

1

5

10

15

Lys

Ser

Leu

Glu

Gin

Val

Arg

Lys

Ile

Gin

Gly

Asp

Gly

Ala

Leu

20

25

30

Gin

Glu

Lys

Leu

Cys

Ala

Thr

Tyr

Lys

Leu

Cys

His

Pro

Glu

Leu

35

40

45

Val

Leu

Gly

His

Ser

Leu

Gly

Ile

Pro

Trp

Ala

Pro

Leu

Ser

50

55

60

Cys

Pro

Ser

Gin

Ala

Leu

Gin

Leu

Ala

Gly

Cys

Leu

Ser

Gin

Leu

His

65

70

75

80

Ser

Gly

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gin

Gly

Leu

Gin

Aia

Leu

Glu

Gly

Ile

85

90

95

Ser

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Thr

Leu

Asp

Thr

Leu

Gin

Leu

Asp

Val

Ala

100

105

110

Asp

Phe

Ala

Thr

Ile

Trp

Gin

Met

Glu

Leu

Gly

Met

Ala

115

120

125

Pro

Ala

Leu

Gin

Pro

Thr

Gin

Gly

Ala

Met

Pro

Ala

Phe

Ala

Ser

Ala

130'

135

140

Phe

Gin

Arg

Ala

Gly

Val

Leu

Val

Ala

Ser

His

Leu

Gin

Ser

145

150

155

'160

Phe

Leu

Glu

Val

Ser

Tyr

Arg

Val

Leu

Arg

His

Leu

Ala

Gin

Pro

Tyr

165

170

175

Val

Glu

Gly

Ser

Pro

Gly

Glu

Pro

Ser

Gly

Pro

Ile

Ser

180

185

190

Thr

Ile

Asn

Pro

Ser

Pro

Ser

Lys

Glu

Ser

His

Lys

Ser

Pro

Asn

195

200

205

Met

Ala

Thr

Gin

Asp

Cys

Ser

Phe

Gin

His

Ser

Pro

Ile

Ser

Asp

210

215

220

Phe

Ala

Val

Lys

Ile

Arg

Glu

Leu

Ser

Asp

Tyr

Leu

Gin

Asp

Tyr

225

230

235

240

Pro

Val

Thr

Val

Ala

Ser

Asn

Leu

Gin

Asp

Glu

Leu

Cys

Gly Gly

245

250

255

Leu

Trp

Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Gin

Arg

Trp

Met

Glu

Arg

Leu

Lys

Thr

260

265

270

Val

Ala

Gly

Ser

Lys

Met

Gin

Gly

Leu

Glu

Arg

Val

Asn

Thr

Glu

·· • · · · , · · · • · · · • · · ···· ·· • ·· ·· · · • · • » w · ··· ·<« · «· ·» • · · · • · · · • ··· ·*« • · «· ··

275

280

285

Ile

His

Phe

Val

Thr

Lys

Cys

Ala

Phe

Gin

Pro

Ser

Cys

Leu

290

295

300

Arg

Phe

Val

Gin

Thr

Asn

Ile

Ser

Arg

Leu

Gin

Glu

Thr

Ser

Glu

305

310

315

320

Gin

Leu

Val

Ala

Leu

Lys

Pro

Trp

Ile

Thr

Arg

Gin

Asn

Phe

Ser

Arg

325

330

335

Cys

Leu

Glu

Leu

Gin

Cys

Gin

Pro

Asp

Ser

Thr

Leu

340

345

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:12:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1047 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:12:

GCTACACCAT 60 CAAGTGAGAA 120	TGGGCCCTGC	CAGCTCCCTG	CCCCAGAGCT	TCCTGCTCAA	GTCTTTAGAG
AGATCCAGGG	CGATGGCGCA	GCGCTCCAGG	AGAAGCTGTG	TGCCACCTAC
AAGCTGTGCC 180	ACCCCGAGGA	GCTGGTGCTG	CTCGGACACT	CTCTGGGCAT	CCCCTGGGCT
CCCCTGAGCT 240	CCTGCCCCAG	CCAGGCCCTG	CAGCTGGCAG	GCTGCTTGAG	CCAACTCCAT
AGCGGCCTTT 300	TCCTCTACCA 1	GGGGCTCCTG	CAGGCCCTGG	AAGGGATATC	CCCCGAGTTG
GGTCCCACCT 360	TGGACACACT	GCAGCTGGAC	GTCGCCGACT	TTGCCACCAC	CATCTGGCAG
CAGATGGAAG 420	AACTGGGAAT	GGCCCCTGCC	CTGCAGCCCA	CCCAGGGTGC	CATGCCGGCC
TTCGCCTCTG 480	CTTTCCAGCG	CCGGGCAGGA	GGGGTCCTGG	TTGCTAGCCA	TCTGCAGAGC
TTCCTGGAGG 540	TGTCGTACCG	CGTTCTACGC	CACCTTGCGC	AGCCCTACGT	AGAGGGCGGT
GGAGGCTCCC 600	CGGGTGAACC	GTCTGGTCCA	ATCTCTACTA	TCAACCCGTC	TCCTCCGTCT
AAAGAATCTC 660	ATAAATCTCC	AAACATGGCT	ACCCAGGACT	GCTCCTTCCA	ACACAGCCCC
ATCTCCTCCG 720	ACTTCGCTGT	CAAAATCCGT	GAGCTGTCTG	ACTACCTGCT	TCAAGATTAC
CCAGTCACCG 780	TGGCCTCCAA	CCTGCAGGAC	GAGGAGCTCT	GCGGGGGCCT	CTGGCGGCTG
GTCCTGGCAC 840	AGCGCTGGAT	GGAGČGGCTC	AAGACTGTCG	CTGGGTCCAA	GATGCAAGGC
TTGCTGGAGC 900	GCGTGAACAC	GGAGATACAC	TTTGTCACCA	AATGTGCCTT	TCAGCCCCCC
CCCAGCTGTC 960	TTCGCTTCGT	CCAGACCAAC	ATCTCCCGCC.	TCCTGCAGGA	GACCTCCGAG
CAGCTGGTGG 1020 CAGTGTCAGC 1047	CGCTGAAGCC CCGACTCCTC	CTGGATCACT AACCCTG	CGCCAGAACT	TCTCCCGGTG	CCTGGAGCTG

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:13:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 798 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:13:

ř'

-

			43 -	• :· • ·	<· >· · '· 't
GCTAACTGCT 60	CTATAATGAT	CGATGAAATT-	ATACATCACT	TAAAGAGACC	ACCTGCACCT
TTGCTGGACC 120 ‘	CGAACAACCT	CAATGACGAA	GACGTCTCTA	TCCTGATGGA	CCGAAACCTT
CGACTTCCAA 180 ' ’·	ACCTGGAGAG	CTTCGTAAGG	GCTGTCAAGA	ACTTAGAAAA	TGCATCAGGT
ATTGAGGCAA 240	TTCTTCGTAA	TCTCCAACCA	TGTCTGCCCT	CTGCCACGGC	CGCACCCTCT
CGACATCCAA 300	TCATCATCAA	GGCAGGTGAC	TGGCAAGAAT	TCCGGGAAAA	ACTGACGTTC
TATCTGGTTA 360	CCCTTGAGCA	AGCGCAGGAA	CAACAGTACG	TAGAGGGCGG	TGGAGGCTCC
CCGGGTGGTG 420	GTTCTGGCGG	CGGCTCCAAC	ATGGCCACCC	AGGACTGCTC	CTTCCAACAC
AGCCCCATCT	CCTCCGACTT	CGCTGTCAAA	ATCCGTGAGC	TGTCTGACTA	CCTGCTTCAA
480			' . -.-.0		1 “ A, ’
GATTACCCAG 540	TCACCGTGGC	CTCCAACCTG	CAGGACGAGG . s.	AGCTCTGCGG ' *· -.i	GGCGCTCTGG
CGGCTGGTCC 600	TGGCACAGCG	CTGGATGGAG	CGGCTCAAGA	CTGTCGCTGG	GTCCAAGATG
CAAGGCTTGC 660	TGGAGCGCGT	GAACACGGAG	ATACACTTTG	TCACCAAATG	TGCCTTTCAG
CCCCCCCCCA 720	GCTGTCTTCG	CTTCGTCCAG	ACCAACATCT	CCCGCCTCCT	GCAGGAGACC
TCCGAGCAGC 780 GAGCTGCAGT 798	TGGTGGCGCT GTCAGCCC	GAAGCCCTGG	ATCACTCGCC	AGAACTTCTC	CCGGTGCCTG

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:14:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 843 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:14:

GCTAACTGCT 60 TTGCTGGACC 120	CTATAATGAT	CGATGAAATT	ATACATCACT	TAAAGAGACC	ACCTGCACCT
CGAACAACCT	CAATGACGAA	GACGTCTCTA	TCCTGATGGA	CCGAAACCTT
CGACTTCCAA 180	ACCTGGAGAG	CTTCGTAAGG	GCTGTCAAGA	ACTTAGAAAA	TGCATCAGGT
ATTGAGGCAA 240	TTCTTCGTAA	TCTCCAACCA	TGTCTGCCCT	CTGCCACGGC	CGCACCCTCT
CGACATCCAA 300	TCATCATCAA	GGCAGGTGAC	TGGCAAGAAT	TCCGGGAAAA	ACTGACGTTC
TATCTGGTTA 360	CCCTTGAGCA	AGCGCAGGAA	CAACAGTACG	TAGAGGGCGG	TGGAGGCTCC
CCGGGTGAAC 420	CGTCTGGTCC	AATCTCTACT	ATCAACCCGT	CTCCTCCGTC	TAAAGAATCT
CATAAATCTC 480	CAAACATGGC	CACCCAGGAC	TGCTCCTTCC	AACACAGCCC	CATCTCCTCC
GACTTCGCTG 540	TCAAAATCCG	TGAGCTGTCT	GACTACCTGC	TTCAAGATTA	CCCAGTCACC
GTGGCCTCCA 600	ACCTGCAGGA	CGAGGAGCTC	TGCGGGGCGC	TCTGGCGGCT	GGTCCTGGCA
CAGCGCTGGA 660	TGGAGCGGCT	CAAGACTGTC	GCTGGGTCCA	AGATGCAAGG	CTT.GCTGGAG
CGCGTGAACA 720	CGGAGATACA	CTTTGTCACC	AAATGTGCCT	TTCAGCCCCC	CCCCAGCTGT
CTTCGCTTCG	TCCAGÁCCAA	CATCTCCCGC	CTCCTGCAGG	AGACCTCCGA	GCAGCTGGTG

φ · · · « · ·· ··

780

GCGCTGAAGC CCTGGATCAC TCGCCAGAAC TTCTCCCGGT GCCTGGAGCT GCAGTGTCAG

840

CCC

843 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:15:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 813 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:15:

GCTAACTGCT CTATAATGAT	CGATGAAATT	ATACATCACT	TAAAGAGACC	ACCTGCACCT
60 TTGCTGGACC CGAACAACCT	CAATGACGAA	GACGTCTCTA	TCCTGATGGA	CCGAAACCTT
120 CGACTTCCAA ACCTGGAGAG	CTTCGTAAGG	GCTGTCAAGA	ACTTAGAAAA	TGCATCAGGT
180 ATTGAGGCAA TTCTTCGTAA	TCTCCAACCA	TGTCTGCCCT	CTGCCACGGC	CGCACCCTCT
240 CGACATCCAA TCATCATCAA	GGCAGGTGAC	TGGCAAGAAT	TCCGGGAAAA	ACTGACGTTC
300 TATCTGGTTA CCCTTGAGCA	AGCGCAGGAA	CAACAGTACG	TAGAGGGCGG	TGGAGGCTCC
360 CCGGGTGGTG GTTCTGGCGG	CGGCTCCAAC	ATGGCCACCC	AGGACTGCTC	CTTCCAACAC
420 AGCCCCATCT CCTCCGACTT	CGCTGTCAAA	ATCCGTGAGC	TGTCTGACTA	CCTGCTTCAA
480 GATTACCCAG TCACCGTGGC	CTCCAACCTG	CAGGACGAGG	AGCTCTGCGG	GGCGCTCTGG
540 CGGCTGGTCC TGGCACAGCG	CTGGATGGAG	CGGCTCAAGA	CTGTCGCTGG	GTCCAAGATG
600 CAAGGCTTGC TGGAGCGCGT	GAACACGGAG	ATACACTTTG	TCACCAAATG	TGCCTTTCAG
660 CCCCCCCCCA GCTGTCTTCG	CTTCGTCCAG	ACCAACATCT	CCCGCCTCCT	GCAGGAGACC
720 TCCGAGCAGC TGGTGGCGCT	GAAGCCCTGG	ATCACTCGCC	AGAACTTCTC	CCGGTGCCTG
780 GAGCTGCAGT GTCAGCCCGA	CTCCTČAACC	CTG
813 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:16: (i) POPIS SEKVENCE: (A) DÉLKA: 858 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová
(D) TOPOLOGIE: lineární

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:16:

GCTAACTGCT 60 TTGCTGGACC	CTATAATGAT	CGATGAAATT	ATACATCACT	TAAAGAGACC	ACCTGCACCT
CGAACAACCT	CAATGACGAA	GACGTCTCTA	TCCTGATGGA	CCGAAACCTT
120 CGACTTCCAA	ACCTGGAGAG	CTTCGTAAGG	GCTGTCAAGA	ACTTAGAAAA	TGCATCAGGT
180 ATTGAGGCAA	TTCTTCGTAA	TCTCCAACCA	TGTCTGCCCT	CTGCCACGGC	CGCACCCTCT
240 CGACATCCAA	TCATCATCAA	GGCAGGTGAC	TGGCAAGAAT	TCCGGGAAAA	ACTGACGTTC
300 TATCTGGTTA	CCCTTGAGCA	AGCGCAGGAA	CAACAGTACG	TAGAGGGCGG	TGGAGGCTCC

v	»	45 ,	o o e 0 © o 7 3 . 3 0 » » ·#	5 3 »3 O O O 7 Ί» O >3 O O 0,3 Ο 7 05703
$		360 CCGGGTGAAC	CGTCTGGTCC	AATCTCTACT	ATCAACCCGT	CTCCTCCGTC	TAAAGAATCT
1		420 CATAAATCTC	CAAACATGGC	CACCCAGGAC	TGCTCCTTCC	AACACAGCCC	CATCTCCTCC
		480	L 1 J.
r		GACTTCGCTG	TCAAAATCCG	TGAGCTGTCT	GACTACCTGC	TTCAAGATTA	CCCAGTCACC
ř p		‘ 54 0		.-•v
R		GTGGCCTCCA	ACCTGCAGGA	CGAGGAGCTC	TGCGGGGCGC	TCTGGCGGCT	GGTCCTGGCA
		600		..* ? A 7
i...		CAGCGCTGGA	TGGAGCGGCT	CAAGACTGTC	GCTGGGTCCA	AGATGCAAGG	CTTGCTGGAG
		660		A-VCil'
		CGCGTGAACA	CGGAGATACA	CTTTGTCACC	AAATGTGCCT	TTCAGCČCCC	CCCCAGCTGT
		720				— 7 ^: iL*C	. v .
		CTTCGCTTCG	TCCAGACCAA	CATCTCCCGC	CTCCTGCAGG	AGACCTCCGA	GCAGCTGGTG
		780				,-,//-·	I .
		GCGCTGAAGC	CCTGGATCAC	TCGCCAGAAC	TTCTCCCGGT	GCCTGGAGCT	GCAGTGTCAG
		840 CCCGACTCCT	CAACCCTG				* , *·
	λ	858		ID Č:17:			' r.'·
		(2) INFORMACE PRO SEQ
		(i) POPIS SEKVENCE:
		- (A) DÉLKA: 1047	párů baží
		(B) TYP: nukleová kyselina
		(C) POČET ŘEŤEZCU: jednořetězcová
		(D) TOPOLOGIE: lineární
		(xi) POPIS	SEKVENCE: SEQ ID Č:17
		GCTACACCAT 60	TGGGCCCTGC	CAGCTCCCTG	CCCCAGAGCT	TCCTGCTCAA	GTCTTTAGAG
li-		CAAGTGAGAA	AGATCCAGGG	CGATGGCGCA	GCGCTCCAGG	AGAAGCTGTG	TGCCACCTAC
		120 AAGCTGTGCC	ACCCCGAGGA	GCTGGTGCTG	CTCGGACACT	CTCTGGGCAT	CCCCTGGGCT
		180 CCCCTGAGCT 240	CCTGCCCCAG	CCAGGCCCTG	CAGCTGGCAG	GCTGCTTGAG	CCAACTCCAT
		AGCGGCCTTT	TCCTCTACCA	GGGGCTCCTG	CAGGCCCTGG	AAGGGATATC	CCCCGAGTTG
		300 GGTCCCACCT	TGGACACACT	GCAGCTGGAC	GTCGCCGACT	TTGCCACCAC	CATCTGGCAG
		360 CAGATGGAAG 420	AACTGGGAAT	GGCCCCTGCC	CTGCAGCCCA	CCCAGGGTGC	CATGCCGGCC
		TTCGCCTCTG	CTTTCCAGCG	CCGGGCAGGA	GGGGTCCTGG	TTGCTAGCCA	TCTGCAGAGC
		480 TTCCTGGAGG 540	TGTCGTACCG	CGTTCTACGC	CACCTTGCGC	AGCCCTACGT	AGAGGGCGGT
::	r	GGAGGCTCCC 600	CGGGTGAACC	GTCTGGTCCA	ATCTCTACTA	TCAACCCGTC	TCCTCCGTCT
-	v·	AAAGAATCTC 660	ATAAATCTCC	AAACATGGCC	ACCCAGGACT	GCTCCTTCCA	ACACAGCCCC
		ATCTCCTCCG	ACTTCGCTGT	CAAAATCCGT	GAGCTGTCTG	ACTACCTGCT	TCAAGATTAC
L		720 CCAGTCACCG 780	TGGCCTCCAA	CCTGCAGGAC	GAGGAGCTCT	GCGGGGGCCT	CTGGCGGCTG
		GTCCTGGCAC 840	AGCGCTGGAT	GGAGCGGCTC	AAGACTGTCG	CTGGGTCCAA	GATGCAAGGC
		TTGCTGGAGC 900	GCGTGAACAC	GGAGATACAC	TTTGTCACCA	AATGTGCCTT	TCAGCCCCCC
		CCCAGCTGTC 960	TTCGCTTCGT	CCAGACCAAC	ATCTCCCGCC	TCCTGCAGGA	GACCTCCGAG
		CAGCTGGTGG 1020	CGCTGAAGCC	CTGGATCACT	CGCCAGAACT	TCTCCCGGTG	CCTGGAGCTG
		CAGTGTCAGC	CCGACTCCTC	AACCCTG ·;

1047

Γ:

í

L ^r<iL.

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:18:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 942 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:18:

GCCACTCAGG 60 CGTGAGCTGT 120	ACTGCTCTTT	TCAACACAGC	CCCATCTCCT	CCGACTTCGC	TGTCAAAATC
CTGACTACCT	GCTTCAAGAT	TACCCAGTCA	CCGTGGCCTC	CAACCTGCAG
GACGAGGAGC 180	TCTGCGGGGG	CCTCTGGCGG	CTGGTCCTGG	CACAGCGCTG	GATGGAGCGG
CTCAAGACTG 240	TCGCTGGGTC	CAAGATGCAA	GGCTTGCTGG	AGCGCGTGAA	CACGGAGATA
CACTTTGTCA 300	CCAAATGTGC	CTTTCAGCCC	CCCCCCAGCT	GTCTTCGCTT	CGTCCAGACC
AACATCTCCC 360	GCCTCCTGCA	GGAGACCTCC	GAGCAGCTGG	TGGCGCTGAA	GCCCTGGATC
ACTCGCCAGA 420	ACTTCTCCCG	GTGCCTGGAG	CTGCAGTGTC	AGCCCGACTC	CTCAACCCTG
TACGTAGAGG 480	GCGGTGGAGG	CTCCCCGGGT	GAACCGTCTG	GTCCAATCTC	TACTATCAAC
CCGTCTCCTC 540	CGTCTAAAGA	ATCTCATAAA	TCTCCAAACA	TGGCTACCCA	GGACTGCTCC
TTCCAACACA 600	GCCCCATCTC	CTCCGACTTC	GCTGTCAAAA	TCCGTGAGCT	GTCTGACTAC
CTGCTTCAAG 660	ATTACCCAGT	CACCGTGGCC	TCCAACCTGC	AGGACGAGGA	GCTCTGCGGG
GGCCTCTGGC 720	GGCTGGTCCT	GGCACAGCGC	TGGATGGAGC	GGCTCAAGAC	TGTCGCTGGG
TCCAAGATGC 780	AAGGCTTGCT	GGAGCGCGTG	AACACGGAGA	TACACTTTGT	CACCAAATGT
GCCTTTCAGC 840	CCCCCCCCAG	CTGTCTTCGC	TTCGTCCAGA	CCAACATCTC	CCGCCTCCTG
CAGGAGACCT CCGAGCAGCT GGTGGCGCTG AAGCCCTGGA 900 CGGTGCCTGG AGCTGCAGTG TCAGCCCGAC TCCTCAACCC 942 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:19: (i) POPIS SEKVENCE: (A) DÉLKA: 1047 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:19:	TCACTCGCCA TG	GAACTTCTCC
GCCACCCAGG 60 CGTGAGCTGT 120	ACTGCTCCTT	TCAACACAGC	CCCATCTCCT	CCGACTTCGC	TGTCAAAATC
CTGACTACCT	GCTTCAAGAT	TACCCAGTCA	CCGTGGCCTC	CAACCTGCAG
GACGAGGAGC 180	TCTGCGGGGG	.CCTCTGGCGG	CTGGTCCTGG	CACAGCGCTG	GATGGAGCGG
CTCAAGACTG 240	TCGCTGGGTC	CAAGATGCAA	GGCTTGCTGG	AGCGCGTGAA	CACGGAGATA
CACTTTGTCA 300	CCAAATGTGC	CTTTCAGCCC	CCCCCCAGCT	GTCTTCGCTT	CGTCCAGACC
AACATCTCCC 360	GCCTCCTGCA	GGAGACCTCC	GAGCAGCTGG	TGGCGCTGAA	GCCATGGATC
ACTCGCCAGA	ACTTCTCCCG	GTGCCTGGAG	CTGCAGTGTC	AGCCCGACTC	CTCAACCCTG

I • ·

	47	• · · • · « · • ·	• · · · ♦ · • · · • · ·
420
TACGTAGAGG 480	GCGGTGGAGG	CTCCCCGGGT	GAACCGTCTG	GTCCAATCTC	TACTATCAAC
CCGTCTCCTC 540	CGTCTAAAGA	ATCTCATAAA	TCTCCAAACA	TGGCTACACC	ATTAGGCCCT
GCCAGCTCCC 600	TGCCCCAGAG	CTTCCTGCTC	AAGTGCTTAG	AGCAAGTGAG	GAAGATCCAG
GGCGATGGCG 660	CAGCGCTCCA	GGAGAAGCTG	TGTGCCACCT	ACAAGCTGTG	CCACCCCGAG
GAGCTGGTGC 720	TGCTCGGACA	CTCTCTGGGC	ATCCCCTGGG	CTCCCCTGAG	CTCCTGCCCC
AGCCAGGCCC 780	TGCAGCTGGC	AGGCTGCTTG	AGCCAACTCC	ATAGCGGCCT	TTTCCTCTAC
CAGGGGCTCC 840	TGCAGGCCCT	GGAAGGGATA	TCCCCCGAGT	TGGGTCCCAC	CTTGGACACA
CTGCAGCTGG 900	ACGTCGCCGA	CTTTGCCACC	ACCATCTGGC	AGCAGATGGA	AGAACTGGGA
ATGGCCCCTG 960	CCCTGCAGCC	CACCCAGGGT	GCCATGCCGG	CCTTCGCCTC	TGCTTTCCAG
CGCCGGGCAG 1020	GAGGGGTCCT	GGTTGCTAGC	CATCTGCAGA	GCTTCCTGGA	GGTGTCGTAC
CGCGTTTTAC	GCCACCTTGC	GCAGCCC

1047 (2) INFORMACE PRO SEO ID Č:20:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1003 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ:. jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi)POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:20:

	GGCCACTCAG 60 CCGTGAGCTG 120	GACTGCTCTT	TTCAACACAG	CCCCATCTCC	TCCGACTTCG	CTGTCAAAAT
	TCTGACTACC	TGCTTCAAGA	TTACCCAGTC	ACCGTGGCCT	CCAACCTGCA
	GGACGAGGAG 180	CTCTGCGGGG	GCCTCTGGCG	GCTGGTCCTG	GCACAGCGCT	GGATGGAGCG
»	GCTCAAGACT 240	GTCGCTGGGT	CCAAGATGCA	AGGCTTGCTG	GAGCGCGTGA	ACACGGAGAT
-4.	ACACTTTGTC 300	ACCAAATGTG	CCTTTCAGCC	CCCCCCCAGC	TGTCTTCGCT	TCGTCCAGAC
	CAACATCTCC 360	CGCCTCCTGC	AGGAGACCT	CGAGCAGCTG	GTGGCGCTGA	AGCCCTGGAT
r	CACTCGCCAG 420	AACTTCTCCC	GGTGCCTGGA	GCTGCAGTGT	CAGCCCGACT	CCTCAACCCT
	GTACGTAGAG 480	GGCGGTGGAG	GCTCCCCGGG	TGGTGGTTCT	GGCGGCGGCT	CCAACATGGC
TACACCATTG 540	GGCCCTGCCA	GCTCCCTGCC	CCAGAGCTTC	CTGCTCAAGT	CTTTAGAGCA
	AGTGAGAAAG 600	ATCCAGGGCG	ATGGCGCAGC	GCTCCAGGAG	AAGCTGTGTG	CCACCTACAA
	GCTGTGCCAC 660	CCCGAGGAGC	TGGTGCTGCT	CGGACACTCT	iCTGGGCATCC	CCTGGGCTCC
	CCTGAGCTCC 720	TGCCCCAGCC	AGGCCCTGCA	GCTGGCAGGC	TGCTTGAGCC	AACTCCATAG
	CGGCCTTTTC 780	CTCTACCAGG	GGCTCCTGCA	GGCCCTGGAA	GGGATATCCC	CCGAGTTGGG
	TCCCACCTTG 840	GACACACTGC	AGCTGGACGT	CGCCGACTTT	GCCACCACCA	TCTGGCAGCA
	GATGGAAGAA 900	CTGGGAATGG	CCCCTGCCCT	GCAGCCCACC	CAGGGTGCCA	TGCCGGCCTT
	CGCCTCTGCT	TTCCAGCGCC	GGGCAGGAGG	GGTCCTGGTT	GCTAGCCATC	TGCAGAGCTT

960

CCTGGAGGTG TCGTACCGCG TTCTACGCCA CCTTGCGCAG CCG 1003 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:21:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 843 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:21:

GCTAACTGCT 60 TTGCTGGACC 120	CTATAATGAT	CGATGAAATT	ATACATCACT	TAAAGAGACC	ACCTAACCCT
CGAACAACCT	CAATTCTGAA	GACATGGATA	TCCTGATGGA	ACGAAACCTT
CGAACTCCAA 180	ACCTGCTCGC	ATTCGTAAGG	GCTGTCAAGC	ACTTAGAAAA	TGCATCAGGT
ATTGAGGCAA 240	TTCTTCGTAA	TCTCCAACCA	TGTCTGCCCT	CTGCCACGGC	CGCACCCTCT
CGACATCCAA 300	TCATCATCAA	GGCAGGTGAC	TGGCAAGAAT	TCCGGGAAAA	ACTGACGTTC
TATCTGGTTA 360	CCCTTGAGCA	AGCGCAGGAA	CAACAGTACG	TAGAGGGCGG	TGGAGGCTCC
CCGGGTGAAC 420	CGTCTGGTCC	AATCTCTACT	ATCAACCCGT	CTCCTCCGTC	TAAAGAATCT
CATAAATCTC 480	CAAACATGGC	GACTCAGGAC	TGTTCTTTCC	AACACAGCCC	CATCTCCTCC
GACTTCGCTG 540	TCAAAATCCG	TGAGCTGTCT	GACTACCTGC	TTCAAGATTA	CCCAGTCACC
GTGGCCTCCA 600	ACCTGCAGGA	CGAGGAGCTC	TGCGGGGGCC	TCTGGCGGCT	GGTCCTGGCA
CAGCGCTGGA 660	TGGAGCGGCT	CAAGACTGTC	GCTGGGTCCA	AGATGCAAGG	CTTGCTGGAG
CGCGTGAACA 720	CGGAGATACA	CTTTGTCACC	AAATGTGCCT	TTCAGCCCCC	CCCCAGCTGT
CTTCGCTTCG 780	TCCAGACCAA	CATCTCCCGC	CTCCTGCAGG	AGACCTCCGA	GCAGCTGGTG
GCGCTGAAGC	CCTGGATCAC	TCGCCAGAAC	TTCTCCCGGT	GCCTGGAGCT	GCAGTGTCAG

840

CCC

843 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č: 22:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 858 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:22:

GCTAACTGCT 60 TTGCTGGACC	CTATAATGAT	CGATGAAATT	ATACATCACT	TAAAGAGACC	ACCTAACCCT
CGAACAACCT	CAATTCTGAA	GACATGGATA	TCCTGATGGA	ACGAAACCTT
120 CGAACTCCAA	ACCTGCTCGC	ATTCGTAAGG	GCTGTCAAGC	ACTTAGAAAA	TGCATCAGGT
180 ATTGAGGCAA	TTCTTCGTAA	TCTCCAACCA	TGTCTGCCCT	CTGCCACGGC	CGCACCCTCT
240 CGACATCCAA	TCATCATCAA	GGCAGGTGAC	TGGCAAGAAT	TCCGGGAAAA	ACTGACGTTC
300 TATCTGGTTA	CCCTTGAGCA	AGCGCAGGAA	CAACAGTACG	TAGAGGGCGG	TGGAGGCTCC

·'· • · 4 • · « • · «

I · · · · ·

360

CCGGGTGAAC 420	CGTCTGGTCC	AATCTCTACT	ATCAACCCGT	CTCCTCCGTC	TAAAGAATCT
CATAAATCTC 480	CAAACATGGC	AACCCAGGAC	TGCTCTTTTC	AACACAGCCC	CATCTCCTCC
GACTTCGCTG 540	TCAAAATCCG	TGAGCTGTCT	GACTACCTGC	TTCAAGATTA	CCCAGTCACC
GTGGCCTCCA 600	ACCTGCAGGA	CGAGGAGCTC	TGCGGGGGCC	TCTGGCGGCT	GGTCCTGGCA
CAGCGCTGGA 660	TGGAGCGGCT	CAAGACTGTC	GCTGGGTCCA	AGATGCAAGG	CTTGCTGGAG
CGCGTGAACA 720	CGGAGATACA	CTTTGTCACC	AAATGTGCCT	TTCAGCCCCC	CCCCAGCTGT
CTTCGCTTCG 780	TCCAGACCAA	CATCTCCCGC	CTCCTGCAGG	AGACCTCCGA	GCAGCTGGTG
GCGCTGAAGC 840 CCCGACTCCT	CCTGGATCAC CAACCCTG	TCGCCAGAAC	TTCTCCCGGT	GCCTGGAGCT	GCAGTGTCAG

858 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:23:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 843 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE:. SEQ ID Č:23:

GCCACTCAGG 60 CGTGAGCTGT 120	ACTGCTCCTT	CCAACACAGC	CCCATCTCCT	CCGACTTCGC	TGTCAAAATC
CTGACTACCT	GCTTCAAGAT	TACCCAGTCA	CCGTGGCCTC	CAACCTGCAG
GACGAGGAGC 180	TCTGCGGGGG	CCTCTGGCGG	CTGGTCCTGG	CACAGCGCTG	GATGGAGCGG
CTCAAGACTG 240	TCGCTGGGTC	CAAGATGCAA	GGCTTGCTGG	AGCGCGTGAA	CACGGAGATA
CACTTTGTCA 300	CCAAATGTGC	CTTTCAGCCC	CCCCCCAGCT	GTCTTCGCTT	CGTCCAGACC
AACATCTCCC 360	GCCTCCTGCA	GGAGACCTCC	GAGCAGCTGG	TGGCGCTGAA	Gccctggatc
ACTCGCCAGA 420	ACTTCTCCCG	GTGCCTGGAG	CTGCAGTGTC	AGCCCTACGT	AGAGGGCGGT
GGAGGCTCCC 480	CGGGTGAACC	GTCTGGTCCA	ATCTCTACTA	TCAACCCGTC	TCCTCCGTCT
AAAGAATCTC 5.40	ATAAATCTCC	AAACATGGCT	AACTGCTCTA	TAATGATCGA	TGAAATTATA
CATCACTTAA 600	AGAGACCACC	TAACCCTTTG	CTGGACCCGA	ACAACCTCAA	TTCTGAAGAC
ATGGATATCC 660	TGATGGAACG	AAACCTTCGA	ACTCCAAACC	TGCTCGCATT	CGTAAGGGCT
GTCAAGCACT 720	TAGAAAATGC	ATCAGGTATT	GAGGCAATTC	TTCGTAATCT	CCAACCATGT
CTGCCCTCTG 780	CCACGGCCGC'	ACCCTCTCGA	CATCCAATCA	TCATCAAGGC	AGGTGACTGG
CAAGAATTCC	GGGAAAAACT	GACGTTCTAT	CTGGTTACCC	TTGAGCAAGC	GCAGGAACAA

840

CAG

843 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:24:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 858 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina • · έ»·

Š• · · · · · · · · · ·· · · · ········ jU · · · · · · · (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:24:

GCCACCCAGG 60	ACTGCTCCTT	CCAACACAGC	CCCATCTCCT	CCGACTTCGC	TGTCAAAATC
CGTGAGCTGT 120	CTGACTACCT	GCTTCAAGAT	TACCCAGTCA	CCGTGGCCTC	CAACCTGCAG
GACGAGGAGC 180	TCTGCGGGGG	CCTCTGGCGG	CTGGTCCTGG	CACAGCGCTG	GATGGAGCGG
CTCAAGACTG 240	TCGCTGGGTC	CAAGATGCAA	GGCTTGCTGG	AGCGCGTGAA	CACGGAGATA
CACTTTGTCA 300	CCAAATGTGC	CTTTCAGCCC	CCCCCCAGCT	GTCTTCGCTT	CGTCCAGACC
AACATCTCCC 360	GCCTCCTGCA	GGAGACCTCC	GAGCAGCTGG	TGGCGCTGAA	GCCCTGGATC
ACTCGCCAGA 420	ACTTCTCCCG	GTGCCTGGAG	CTGCAGTGTC	AGCCCGACTC	CTCAACCCTG
TACGTAGAGG 480	GCGGTGGAGG	CTCCCCGGGT	GAACCGTCTG	GTCCAATCTC	TACTATCAAC
CCGTCTCCTC 540	CGTCTAAAGA	ATCTCATAAA	TCTCCAAACA	TGGCTAACTG	CTCTATAATG
ATCGATGAAA 600	TTATACATCA	CTTAAAGAGA	CCACCTAACC	CTTTGCTGGA	CCCGAACAAC
CTCAATTCTG 660	AAGACATGGA	TATCCTGATG	GAACGAAACC	TTCGAACTCC	AAACCTGCTC
GCATTCGTAA 720	GGGCTGTCAA	GCACTTAGAA	AATGCATCAG	GTATTGAGGC	AATTCTTCGT
AATCTCCAAC 780	CATGTCTGCC	CTCTGCCACG	GCCGCACCCT	CTCGACATCC	AATCATCATC
AAGGCAGGTG ACTGGCAAGA ATTCCGGGAA AAACTGACGT 840' CAAGCGCAGG AACAACAG 858 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:25: (i) POPIS SEKVENCE: (A) DÉLKA: 939 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:25:	TCTATCTGGT	TACCCTTGAG
GCCACTCAGG 60	ACTGCTCTTT	TCAACACAGC	CCCATCTCCT	CCGACTTCGC	TGTCAAAATC
CGTGAGCTGT 120	CTGACTACCT	GCTTCAAGAT	TACCCAGTCA	CCGTGGCCTC	CAACCTGCAG
GACGAGGAGC 180	TCTGCGGGGG	CCTCTGGCGG	CTGGTCCTGG	CACAGCGCTG	GATGGAGCGG
CTCAAGACTG 240	TCGCTGGGTC	CAAGATGCAA	GGCTTGCTGG	AGCGCGTGAA	CACGGAGATA
CACTTTGTCA 300	CCAAATGTGC	CTTTCAGCCC	CCCCCCAGCT	GTCTTCGCTT	CGTCCAGACC
AACATCTCCC 360	GCCTCCTGCA	GGAGACCTCC	GAGCAGCTGG	TGGCGCTGAA	GCCCTGGATC
ACTCGCCAGA 420	ACTTCTCCCG	GTGCCTGGAG	CTGCAGTGTC	AGCCCGACTC	CTCAACCCTG
TACGTAGAGG 480	GCGGTGGAGG	CTCCCCGGGT	GGTGGTTCTG	GCGGCGGCTC	CAACATGGCG
TCTCCGGCGC 540	CGCCTGCTTG	TGACCTCCGA	GTCCTCAGTA	AACTGCTTCG	TGACTCCCAT
GTCCTTCACA	GCAGACTGAG	CCAGTGCCCA	GAGGTTCACC	CTTTGCCTAC	ACCTGTCCTG

• ·

	51	• · • · · • * • · • ·	·· · ·· ·· ·» • · · · · · · ♦ · • · · * ♦ · · « · · * ·' · · · · · « • · · · ·
600 CTGCCTGCTG	TGGACTTTAG CTTGGGAGAA TGGAAAACCC	AGATGGAGGA	GACCAAGGCA
660 CAGGACATTC	TGGGAGCAGT GACCCTTCTG CTGGAGGGAG	TGATGGCAGC	ACGGGGACAA
720 CTGGGACCCA	CTTGCCTCTC ATCCCTCCTG GGGCAGCTTT	CTGGACAGGT	CCGTCTCCTC
780 CTTGGGGCCC	TGCAGAGCCT CCTTGGAACC CAGCTTCCTC	CACAGGGCAG	GACCACAGCT
840 CACAAGGATC	CCAATGCCAT CTTCCTGAGC TTCCAACACC	TGCTCCGAGG	AAAGGTGCGT .. .
900 TTCCTGATGC TTGTAGGAGG GTCCACCCTC TGCGTCAGG 939 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č: 26: (i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 996 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární

(xi) POPIS	SEKVENCE: i	SEQ ID Č:26:
GCGTCCCCAG 60 CATGTCCTTC	CTCCACCTGC	TTGTGACCTC	CGAGTCCTCA	GTAAACTGCT	TCGTGACTCC
ACAGCAGACT	GAGCCAGTGC	CCAGAGGTTC	ACCCTTTGCC	TACACCTGTC
120
CTGCTGCCTG	CTGTGGACTT	TAGCTTGGGA	GAATGGAAAA	CCCAGATGGA	GGAGACCAAG
180 GCACAGGACA 240	TTCTGGGAGC	AGTGACCCTT	CTGCTGGAGG	GAGTGATGGC	AGCACGGGGA
CAACTGGGAC 300	CCACTTGCCT	CTCATCCCTC	CTGGGGCAGC	TTTCTGGACA	GGTCCGTCTC
CTCCTTGGGG 360	CCCTGCAGAG	CCTCCTTGGA	ACCCAGCTTC	CTCCACAGGG	CAGGACCACA
GCTCACAAGG	ATCCCAATGC	CATCTTCCTG	AGCTTCCAAC	ACCTGCTCCG	AGGAAAGGTG
420 CGTTTCCTGA 480	TGCTTGTAGG	AGGGTCCACC	CTCTGCGTCA	GGGAATTCCA	TGCATACGTA
GAGGGCGGTG	GAGGCTCCCC	GGGTGAACCG	TCTGGTCCAA	TCTCTACTAT	CAACCCGTCT

540

	CCTCCGTCTA	AAGAATCTCA	TAAATCTCCA	AACATGGCTA	CCCAGGACTG	CTCCTTCCAA
	600 CACAGCCCCA	TCTCCTCCGA	CTTCGCTGTC	AAAATCCGTG	AGCTGTCTGA	CTACCTGCTT
0	660 CAAGATTACC 720	CAGTCACCGT	GGCCTCCAAC	CTGCAGGACG	AGGAGCTCTG	1 CGGGGGCCTC
o	TGGCGGCTGG	TCCTGGCACA	GCGCTGGATG	GAGCGGCTCA	AGACTGTCGC	TGGGTCCAAG
	780 ^J ATGCAAGGCT 840	TGCTGGAGCG	CGTGAACACG	GAGATACACT	TTGTCACCAA	ATGTGCCTTT
	CAGCCCCCCC 900	CCAGCTGTCT	TCGCTTCGTC	CAGACCAACA	TCTCCCGCCT	CCTGCAGGAG
	ACCTCCGAGC 960	AGCTGGTGGC	GCTGAAGCCC	TGGATCACTC	GCCAGAACTT	CTCCCGGTGC
	CTGGAGCTGC	AGTGTCAGCC	CGACTCCTCA	ACCCTG

996 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:27:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1020 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina ·· ·· · ·· ·· ·· » · · 9 ·· · · · · · · • 9 · · · · · · · ♦ · · Λ · · · ······ • · · « · · « ··· ·» «····«· ·· ·* (C) POČET RETEZCU: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:27:

GCCACTCAGG ACTGCTCTTT TCAACACAGC CCCATCTCCT CCGACTTCGC TGTCAAAATC 60

CGTGAGCTGT CTGACTACCT GCTTCAAGAT TACCCAGTCA CCGTGGCCTC CAACCTGCAG 120

GACGAGGAGC TCTGCGGGGG CCTCTGGCGG. CTGGTCCTGG CACAGCGCTG GATGGAGCGG 180

CTCAAGACTG TCGCTGGGTC CAAGATGCAA GGCTTGCTGG AGCGCGTGAA CACGGAGATA 240

CACTTTGTCA CCAAATGTGC CTTTCAGCCC CCCCCCAGCT GTCTTCGCTT CGTCCAGACC 300

AACATCTCCC GCCTCCTGCA GGAGACCTCC GAGCAGCTGG TGGCGCTGAA GCCCTGGATC 360

ACTCGCCAGA ACTTCTCCCG GTGCCTGGAG CTGCAGTGTC AGCCCGACTC CTCAACCCTG 420

TACGTAGAGG GCGGTGGAGG CTCCCCGGGT GAACCGTCTG GTCCAATCTC TACTATCAAC 480

CCGTCTCCTC CGTCTAAAGA ATCTCATAAA TČTCCAAACA TGGCCCCACC ACGCCTCATC 540 .

TGTGACAGCC GAGTCCTGGA GAGGTACCTC TTGGAGGCCA AGGAGGCCGA GAATATCACG 600

ACGGGCTGTG CTGAACACTG CAGCTTGAAT GAGAATATCA CTGTCCCAGA CACCAAAGTT 660

AATTTCTATG CCTGGAAGAG GATGGAGGTC GGGCAGCAGG CCGTAGAAGT CTGGCAGGGC 720

CTGGCCCTGC TGTCGGAAGC TGTCCTGCGG GGCCAGGCCC TGTTGGTCAA CTCTTCCCAG 780

CCGTGGGAGC CCCTGCAGCT GCATGTGGAT AAAGCCGTCA GTGGCCTTCG CAGCCTCACC 840

ACTCTGCTTC GGGCTCTGCG AGCCCAGAAG GAAGCCATCT CCCCTCCAGA TGCGGCCTCA 900

GCTGCTCCAC TCCGAACAAT CACTGCTGAC ACTTTCCGCA AACTCTTCCG AGTCTACTCC 960

AATTTCCTCC GGGGAAAGCT GAAGCTGTAC ACAGGGGAGG CCTGCAGGAC AGGGGACAGA 1020 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:28:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 975 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEÍEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:28:

GCCCCACCAC 60 GAGGCCGAGA	GCCTCATCTG	TGACAGCCGA	GTCCTGGAGA	GGTACCTCTT	GGAGGCCAAG
ATATCACGAC	GGGCTGTGCT	GAACACTGCA	GCTTGAATGA	GAATATCACT
120 GTCCCAGACA	CCAAAGTTAA	TTTCTATGCC	TGGAAGAGGA	TGGAGGTCGG	GCAGCAGGCC
180 GTAGAAGTCT 240 TTGGTCAACT	GGCAGGGCCT	GGCCCTGCTG	TCGGAAGCTG	TCCTGCGGGG	CCAGGCCCTG
CTTCCCAGCC	GTGGGAGCCC	CTGCAGCTGC	ATGTGGATAA	AGCCGTCAGT
300 GGCCTTCGCA	GCCTCACCAC	TCTGCTTCGG	GCTCTGCGAG	CCCAGAAGGA	AGCCATCTCC
360 CCTCCAGATG	CGGCCTCAGC	TGCTCCACTC	CGAACAATCA	CTGCTGACAC	TTTCCGCAAA

fef r

• · » * ·.

• · · • ·· · ·· • ·

·. · · »

420

CTCTTCCGAG TCTACTCCAA TTTCCTCCGG GGAAAGCTGA AGCTGTACAC AGGGGAGGCC 480

TGCAGGACAG GGGACAGATA CGTAGAGGGC GGTGGAGGCT CCCCGGGTGG TGGTTCTGGC 540

GGCGGCTCCA ACATGGCCAC TCAGGACTGC TCTTTTCAAC ACAGCCCCAT CTCCTCCGAC 600

TTCGCTGTCA AAATCCGTGA GCTGTCTGAC TACCTGCTTC AAGATTACCC AGTCACCGTG 660

GCCTCCAACC TGCAGGACGA GGAGCTCTGC GGGGGCCTCT GGCGGCTGGT CCTGGCACAG 720

CGCTGGATGG AGCGGCTCAA GACTGTCGCT GGGTCCAAGA TGCAAGGCTT GCTGGAGCGC 780

GTGAACACGG AGATACACTT TGTCACCAAA TGTGCCTTTC AGCCCCCCCC CAGCTGTCTT 840

CGCTTCGTCC AGACCAACAT CTCCCGCCTC CTGCAGGAGA CCTCCGAGCA GCTGGTGGCG 900

CTGAAGCCCT GGATCACTCG CCAGAACTTC TCCCGGTGCC TGGAGCTGCA GTGTCAGCCC 960 ·

GACTCCTCAA CCCTG

975 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:29:

(1) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:29:

GTAGTCCATG GCCACCCAGG ACTGCTCC (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:30:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ:. jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:30:

GCATTACGTA GGGCTGACAC TGCAGCTCCA G 31 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:31:

(1) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:31:

GCATTACGTA CAGGGTTGAG GAGTCGGGCT G 31 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:32:

SČ jí

54.

3

3 >

30 3

3

3 >

Ϊ > 5 1 3 ΐ 3 »

> 3‘ e 33 3 3 ti 3 3

J

O *

3 3 ► »3

3 a 3

Ti

Φ » 3 ť>

(1) POPIS SEKVENCE: ' .

(A) DÉLKA: 4 4 párů baží . . .«, (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová . ^m,;r Li · , , (D) TOPOLOGIE: lineární '·.

' '.· . ·.;··.·?. řr, (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:32: C5 ,

CCTGCAGGAC AGGGGACAGA TACGTAGAGG GCGGTGGAGG CTCC

... __________ ________ .... . - .

(2) INFORMACE'PRO SEQ ID Č:33: > n-TVis (1) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 48 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA ' X.« b < : : Lv·.: I y (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID C:33: 11

-. -.3Γ ' ; í-u A.·

CCGGGGAGCC TCCACCGCCC TCTACGTATC TGTCCCCTGT CCTGCAGG :

8 .;· (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:34:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 266 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: žádný (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č: 34:

Z^f

Ala 1

Asn

' Cys

Ser

Ile 5

Met

Ile Asp

Glu

Ile 10

Ile

His

Leu

Lys 15

Arg

Pro

Ala

Pro

Leu

Asp

Pro

Asn

Leu

Asn

Asp

Glu

Asp

Val

20

25

30

Ser

Ile

Leu

Met

Asp

Arg

Asn

Leu

Arg

Leu

Pro

Asn

Leu

Glu

Ser

Phe

35

40

45

Val

Arg

Ala

Val

Lys

Asn

Leu

Glu

Asn

Ala

Ser

Gly

Ile

Glu

Ala

Ile

50

55

60

Leu

Arg

Asn

Leu

Gin

Pro

Cys

Leu

Pro

Ser

Ala

Thr

Ala

Pro

Ser

65

70

75

80

Arg

His

Pro

Ile

Lys

Ala

Gly

Asp

Trp

Gin

Glu

Phe

Arg

Glu

85

90

95

Lys

Leu

Thr

Phe

Tyr

Leu

Val

Thr

Leu

Glu

Gin

Aia

Gin

Glu

Gin

100

105

110

Tyr

Val

Glu

Gly

Ser

Pro

Gly

Ser

Gly

115

120

125

Ser

Asn

Met

Ala

Thr

Gin

Asp

Cys

Ser

Phe

Gin

His

Ser

Pro

Ile

Ser

130

135

140

Ser

Asp

Phe

Ala

Val

Lys

Ile

Ařg

Glu

Leu

Ser

Asp

Tyr

Leu

Gin

145

150

155

160

Asp

Tyr

Pro

Val

Thr

Val

Ala

Ser

Asn

Leu

Gin

Asp

Glu

Leu

Cys

165

170

175

Gly

Ala

Leu

Trp

Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Gin

Arg

Trp

Met

Glu

Arg

Leu

180

i

190

Lys

Thr

Val

Ala

Gly

Ser

Lys

Met

Gin

Gly

Leu

Glu

Arg

Val

Asn

195

200

205

Thr

Glu

Ile

His

Phe

Val

Thr

Lys

Cys

Ala

Phe

Gin

Pro

Ser

• * ·

210

215

220

Cys

Leu

Arg

Phe

Val

Gin

Thr

Asn

Ile

Ser

Arg

Leu

Gin

Glu

Thr

225

230

235

240

Ser

Glu

Gin

Leu

Val

Ala

Leu

Lys

Pro

Trp

Ile

Thr

Arg

Gin

Asn

Phe

245

250

255

Ser

Arg

Cys

Leu

Glu

Leu

Gin

Cys

Gin

Pro

260

265

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:35:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 281 aminokyselinovás (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: žádný (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:35:

Ala

Asn

Cys

Ser

Ile

Met

Ile

Asp

Glu

Ile

His

Leu

Lys

Arg

1

5

10

15

Pro

Ala

Pro

Leu

Asp

Pro

Asn

Leu

Asn

Asp

Glu

Asp

Val

20

25

30

Ser

Ile

Leu

Met

Asp

Arg

Asn

Leu

Arg

Leu

Pro

Asn

Leu

Glu

Ser

Phe

35

40

45

Val

Arg

Ala

Val

Lys

Asn

Leu

Glu

Asn

Ala

Ser

Gly

Ile

Glu

Ala

Ile

50

55

60

Leu

Arg

Asn

Leu

Gin

Pro

Cys

Leu

Pro

Ser

Ala

Thr.

Ala

Pro

Ser

65

70

75

80

Arg

His

Pro

Ile

Lys

Ala

Gly

Asp

Trp

Gin

Glu

Phe

Arg

Glu

85

90

95

Lys

Leu

Thr

Phe

Tyr

Leu

Val

Thr

Leu

Glu

Gin

Ala

Gin

Glu

Gin

100

105

110

Tyr

Val

Glu

Gly

Ser

Pro

Gly

Glu

Pro

Ser

Gly

Pro

Ile

115

120

125

Ser

Thr

Ile

Asn

Pro

Ser

Pro

Ser

Lys

Glu

Ser

His

Lys

Ser

Pro

130

135

140

Asn

Met

Ala

Thr

Gin

Asp

Cys

Ser

Phe

Gin

His

Ser

Pro

Ile

Ser

145

150

155

160

Asp

Phe

Ala

Val

Lys

Ile

Arg

Glu

Leu

Ser

Asp

Tyr

Leu

Gin

Asp

165

170

175

Tyr

Pro

Val

Thr

Val

Ala

Ser

Asn

Leu

Gin

Asp

Glu

Leu

Cys

Gly

180

185

190

Ala

Leu

Trp

Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Gin

Arg

Trp

Met

Glu

Arg

Leu

Lys

195

200

205

Thr

Val

Ala

Gly

Ser

Lys

Met

Gin

Gly

Leu

Glu

Arg

Val

Asn

Thr

210

215

220

Glu

Ile

His

Phe

Val

Thr

Lys

Cys

Ala

Phe

Gin

Pro

Ser

Cys

225

230

235

240

Leu

Arg

Phe

Val

Gin

Thr

Asn

Ile

Ser

Arg

Leu

Gin

Glu

Thr

Ser

2.4 5

250

255

Glu

Gin

Leu

Val

Ala

Leu

Lys

Pro

Trp

Ile

Thr

Arg

Gin

Asn

Phe

Ser

260

265

270

Arg

Cys

Leu

Glu

Leu

Gin

Cys

Gin

Pro

275

280

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:36:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 271 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: žádný • · • · * « · 4 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č: 36:

Ala

Asn Cys

Ser

Ile

Met

Ile

Asp

Glu

Ile

His

Leu

Lys

Arg

1

5

10

15

Pro

Ala

Pro

Leu

Asp

Pro

Asn

Leu

Asn

Asp

Glu

Asp

Val

20

25

30

Ser

Ile

Leu

Met

Asp

Arg

Asn

Leu

Arg

Leu

Pro

Asn

Leu

Glu

Ser

Phe

35

40

45

Val

Arg

Ala

Val

Lys

Asn

Leu

Glu

Asn

Ala

Ser

Gly

Ile

Glu

Ala

Ile

50

55

60

Leu

Arg

Asn

Leu

Gin

Pro

Cys

Leu

Pro

Ser

Ala

Thr

Ala

Pro

Ser

65

70

75

80

Arg

His

Pro

Ile

Lys

Ala

Gly

Asp

Trp

Gin

Glu

Phe

Arg

Glu

85

90

95

Lys

Leu

Thr

Phe

Tyr

Leu

Val

Thr

Leu

Glu

Gin

Ala

Gin

Glu

Gin

100

105

110

Tyr

Val

Glu

Gly

Ser

Pro

Gly

Ser

Gly

115

120

125

Ser

Asn

Met

Ala

Thr

Gin

Asp

Cys

Ser

Phe

Gin

His

Ser

Pro

Ile

Ser

130

135

140

Ser

Asp

Phe

Ala

Val

Lys

Ile

Arg

Glu

Leu

Ser

Asp

Tyr

Leu

Gin

145

150

155

160

Asp

Tyr

Pro

Val

Thr

Val

Ala

Ser

Asn

Leu

Gin

Asp

Glu

Leu

Cys

165

170

175

Gly

Ala

Leu

Trp

Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Gin

Arg

Trp

Met

Glu

Arg

Leu

180

185

190

Lys

Thr

Val

Ala

Gly

Ser

Lys

Met

Gin

Gly

Leu

Glu

Arg

Val

Asn

195

200

205

Thr

Glu

Ile

His

Phe

Val

Thr

Lys

Cys

Ala

Phe

Gin

Pro

Ser

210

215

220

Cys

Leu

Arg

Phe

Val

Gin

Thr

Asn

Ile

Ser

Arg

Leu

Gin

Glu

Thr

225

230

235

240

Ser

Glu

Gin

Leu

Val

Ala

Leu

Lys

Pro

Trp

Ile

Thr

Arg

Gin

Asn

Phe

245

250

255

Ser

Arg

Cys

Leu

Glu

Leu

Gin

Cys

Gin

Pro

Asp

Ser

Thr

Leu

260 265 270 (2) INFORMACE PRO SEQ· ID Č:37:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 286 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová

(C) POČET ŘEŤEZCÓ: jednořetězcová
	(D) TOPOLOGIE	: lineární
(u:	) TYP MOLEKULY:	žádný
(xi:	) POPIS SEKVENCE	: SEQ ID Č:37:
Ala	Asn Cys Ser Ile	Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg
1	5	10 15
Pro	Pro Ala Pro Leu	Leu Asp Pro Asn Asn Leu Asn Asp Glu Asp Val
	20	25 30
Ser	Ile Leu Met Asp	Arg Asn Leu Arg Leu Pro Asn Leu Glu Ser Phe
	35	40 45
Val	Arg Ala Val Lys	Asn Leu Glu Asn Ala Ser Gly Ile Glu Ala Ile
	50	55 60
Leu	Arg Asn Leu Gin	Pro Cys Leu Pro Ser Ala Thr Ala Ala Pro Ser
65		70 75 80
Arg	His Pro Ile Ile	Ile Lys Ala Gly Asp Trp Gin Glu Phe Arg Glu
	85	90 95
Lys	Leu Thr Phe Tyr	Leu Val Thr Leu Glu Gin Ala Gin Glu Gin Gin
	100	105 110
Tyr	Val Glu Gly Gly	Gly Gly Ser Pro Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile

115 120 125 ffcv ř

Ser

Thr

Ile

Asn

Pro

Ser

Pro

Ser

Lys

Glu

Ser

His

Lys

Ser

Pro

130

135

140

Asn

Met

Ala

Thr

Gin

Asp

Cys

Ser

Phe

Gin

His

Ser

Pro

Ile

Ser

145

150

155

160

Asp

Phe

Ala

Val

Lys

Ile

Arg

Glu

Leu

Ser

Asp

Tyr

Leu

Gin

Asp

165

170

175

Tyr

Pro

Val

Thr

Val

Ala

Ser

Asn

Leu

Gin

Asp

Glu

Leu

Cys

Gly

180

185

190

Ala

Leu

Trp

Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Gin

Arg

Trp

Met

Glu

Arg

Leu

Lys

195

200

205

Thr

Val

Ala

Gly

Ser

Lys

Met

Gin

Gly

Leu

Glu

Arg

Val

Asn

Thr

210

215

220

Glu

Ile

His

Phe

Val

Thr

Lys

Cys

Ala

Phe

Gin

Pro

Ser

Cys

225

230

235

240

Leu

Arg

Phe

Val

Gin

Thr

Asn

Ile

Ser

Arg

Leu

Gin

Glu

Thr

Ser

245

250

255

Glu

Gin

Leu

Val

Ala

Leu

Lys

Pro

Trp

Ile

Thr

Arg

Gin

Asn

Phe

Ser

260

265

270

Arg

Cys

Leu

Glu

Leu

Gin

Cys

Gin

Pro

Asp

Ser

Thr

Leu

275

280

285

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:38:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 349 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii:	) TYP MOLEKULY: :	žádný
(xí:	) POPIS SEKVENCE	: SEQ ID	Č:38:
Ala	Thr Pro Leu Gly	Pro Ala	Ser	Ser	Leu	Pro	Gin	Ser	Phe	Leu	Leu
1	5				10					15
Lys	Ser Leu Glu Gin	Val Arg	Lys	Ile	Gin	Gly	Asp	Gly	Ala	Ala	Leu
	20			25					30
Gin	Glu Lys Leu Cys	Ala Thr	Tyr	Lys	Leu	Cys	His	Pro	Glu	Glu	Leu
	35		40					45
Val	Leu Leu Gly His	Ser Leu	Gly	Ile	Pro	Trp	Ala	Pro	Leu	Ser	Ser
	50	55					60
Cys	Pro Ser Gin Ala	Leu Gin	Leu	Ala	Gly	Cys	Leu	Ser	Gin	Leu	His
65		70				75					80
Ser	Gly Leu Phe Leu	Tyr Gin	Gly	Leu	Leu	Gin	Ala	Leu	Glu	Gly	Ile
	85				90					95
Ser	Pro Glu Leu Gly	Pro Thr	Leu	Asp	Thr	Leu	Gin	Leu	Asp	Val	Ala
	100			105					110
Asp	Phe Ala Thr Thr	Ile Trp	Gin	Gin	Met	Glu	Glu	Leu	Gly	Met	Ala
	115		120					125
Pro	Ala Leu Gin Pro	Thr Gin	Gly	Ala	Met	Pro	Ala	Phe	Ala	Ser	Ala
	130	135					140
Phe	Gin Arg Arg Ala	Gly Gly	Val	Leu	Val	Ala	Ser	His	Leu	Gin	Ser
¹⁴⁵		150				155					160
Phe	Leu Glu Val Ser	Tyr Arg	Val	Leu	Arg	His	Leu	Ala	Gin	Pro	Tyr
	165				170					175
Val	Glu Gly Gly Gly	Gly Ser	Pro	Gly	Glu	Pro	Ser	Gly	Pro	Ile	Ser
	180			185					190
Thr	Ile Asn Pro Ser	Pro Pro	Ser	Lys	Glu	Ser	His	Lys	Ser	Pro	Asn
	195		200					205
Met	Ala Thr Gin Asp	Cys Ser	Phe	Gin	His	Ser	Pro	Ile	Ser	Ser	Asp
	210	215					220
Phe	Ala Val Lys Ile	Arg Glu	Leu	Ser	Asp	Tyr	Leu	Leu	Gin	Asp	Tyr
225		230				235					240
Pro	Val Thr Val Ala	Ser Asn	Leu	Gin	Asp	Glu	Glu	Leu	Cys	Gly	Gly
	245				250					255

·· ·· ·· • · · · ♦· • · · · · • · · · · · · ·

Leu Val Ile

Trp Ala His 290

Arg Leu 260 Gly Ser

Val Lys Thr

Leu Met Lys

Ala Gin

Arg Trp Met 265 Leu Leu Glu

Glu Arg Leu Lys

Thr Glu Leu

Arg Val 285

270 Asn Thr

Gin Cys 295

Gly 280 Ala

275 Phe

Val

Phe

Gin

Pro

Pro 300

Pro

Ser

Cys

Arg

Phe

Val

Gin

Thr

Asn

Ile

Ser

Arg

Leu

Gin

Glu

Thr

Ser

Glu

305

310

315

320

Gin

Leu

Val

Ala

Leu

Lys

Pro

Trp

Ile

Thr

Arg

Gin

Asn

Phe

Ser

Arg

325

330

335

Cys

Leu

Glu

Leu

Gin

Cys

Gin

Pro

Asp

Ser

Thr

Leu

340

345

(2)

INFORMACE PRO SEQ ID Čt

39:

(i)

POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA:

314

aminokyseliny

(B) TYP: aminokyselinová

(C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová
	(D) TOPOLOGIE	: lineární
(ii)	i TYP MOLEKULY: žádný
(xi;	i POPIS SEKVENCE	: SEQ ID Č:39:
Ala	Thr Gin Asp Cys	Ser Phe Gin His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe
1	5	10 15
Ala	Val Lys-Ile Arg	Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gin Asp Tyr Pro
	20	25 30
Val	Thr Val Ala Ser	Asn Leu Gin Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu
	35	40 45
Trp	Arg Leu Val Leu	Ala Gin Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val
	50	55 60
Ala	Gly Ser Lys Met	Gin Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile
65		70 75 80
His	Phe Val Thr Lys	Cys Ala Phe Gin Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg
	85	90 95
Phe	Val Gin Thr Asn	Ile Ser Arg Leu Leu Gin Glu Thr Ser Glu Gin
	100	105 110
Leu	Val Ala Leu Lys	Pro Trp Ile Thr Arg Gin Asn Phe Ser Arg Cys
	115	120 125
Leu	Glu Leu Gin Cys	Gin Pro Asp Ser Ser Thr Leu Tyr Val Glu Gly
	130	135 _s 140
Gly	Gly Gly Ser Pro	Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn
145		150 155 160
Pro	Ser Pro Pro Ser	Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Thr
	165	170 175
Gin	Asp Cys Ser Phe	Gin His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val
	180	185 190
Lys	Ile Arg Glu Leu	Ser Asp Tyr Leu Leu Gin Asp Tyr Pro Val Thr
	195	200 205
Val	Ala Ser Asn Leu	Gin Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg
	210	215 220
Leu	Val Leu Ala Gin	Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly
225		230 235 240
Ser	Lys Met Gin Gly	Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe
	245	250 255
Vai	Thr Lys Cys Ala	Phe Gin Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val
	2 60	265 270
Gin	Thr Asn Ile Ser	Arg Leu Leu Gin Glu Thr Ser. Glu Gin Leu Val
	275	280 285
Ala	Leu Lys Pro. Trp	Ile Thr Arg Gin Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu
	290	295 300
Leu	Gin Cys Gin Pro	Asp Ser Ser Thr Leu
305		310

• · · · · • · ··· ··# (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:40:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 349 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: žádný (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:40:

Ala 1

Thr

Gin Asp

Cys 5

Ser

Phe

Gin His

Ser 10

Pro

Ile

Ser

Asp 15

Phe

Ala

Val

Lys

Ile

Arg

Glu

Leu

Ser

Asp

Tyr

Leu

Gin

Asp

Tyr

Pro

20

25

30

Val

Thr

Val

Ala

Ser

Asn

Leu

Gin

Asp

Glu

Leu

Cys

Gly

Leu

35

40

45

Trp

Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Gin

Arg

Trp

Met

Glu

Arg

Leu

Lys

Thr

Val

50

55

60

Ala

Gly

Ser

Lys

Met

Gin

Gly

Leu

Glu

Arg

Val

Asn

Thr

Glu

Ile

65

70

75

80

His

Phe

Val

Thr

Lys

Cvs J

Ala

Phe

Gin

Pzro

Pro

Ser

Cys

Leu

A.rg

85

90

95

Phe

Val

Gin

Thr

Asn

Ile

Ser

Arg

Leu

Gin

Glu

Thr

Ser

Glu

Gin

100

105

110

Leu

Val

Ala

Leu

Lys

Pro

Trp

Ile

Thr

Arg

Gin

Asn

Phe

Ser

Arg

Cys

115

120

125

Leu

Glu

Leu

Gin

Cys

Gin

Pro

Asp

Ser

Thr

Leu

Tyr

Val

Glu

Gly

130

135

140

Gly

Ser

Pro

Gly

Glu

Pro

Ser

Gly

Pro

Ile

Ser

Thr

Ile

Asn

145

150

155

160

Pro

Ser

Pro

Ser

Lys

Glu

Ser

His

Lys

Ser

Pro

Asn

Met

Ala

Thr

165

170

175

Pro

Leu

Gly

Pro

Ala

Ser

Leu

Pro

Gin

Ser

Phe

Leu

Lys

Cys

180

185

190

Leu

Glu

Gin

Val

Arg

Lys

Ile

Gin

Gly

Asp

Gly

Ala

Leu

Gin

Glu

195

200

205

Lys

Leu

Cys

Ala

Thr

Tyr

Lys

Leu

Cys

His

Pro

Glu

Leu

Val

Leu

210

215

220

Leu

Gly

His

Ser

Leu

Gly

Ile

Pro

Trp

Ala

Pro

Leu

Ser

Cys

Pro

225

230

235

240

Ser

Gin

Ala

Leu

Gin

Leu

Ala

Gly

Cys

Leu

Ser

Gin

Leu

His

Ser

Gly

245

250

255

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gin

Gly

Leu

Gin

Ala

Leu

Glu

Gly

Ile

Ser

Pro

260

265

270

Glu

Leu

Gly

Pro

Thr

Leu

Asp

Thr

Leu

Gin

Leu

Asp

Val

Ala

Asp

Phe

275

280

285

Ala

Thr ·

Thr

Ile

Trp

Gin

Met

Glu

Leu

Gly

Met

Ala

Pro

Ala

290

295

300

Leu

Gin

Pro

Thr

Gin

Gly

Ala

Met

Pro

Ala

Phe

Ala

Ser

Ala

Phe

Gin

305

310

315

320

Arg

Ala

Gly

Val

Leu

Val

Ala

Ser

His

Leu

Gin

Ser

Phe

Leu

325

330

335

Glu

Val

Ser

Tyr

Arg

Val

Leu

Arg

His

Leu

Ala

Gin

Pro

340

345

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:41:

‘T, i (i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 334 aminokyselin

Γ $

II, ··· · ·· ·« • · ·> * • · (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: žádný (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:41:

Ala 1

Thr Gin Asp

Cys 5

Ser

Phe

Gin

His

Ser 10

Pro

Ile

Ser

Asp 15

Phe

Ala

Val

Lys

Ile

Arg

Glu

Leu

Ser

Asp

Tyr

Leu

Gin

Asp

Tyr

Pro

20

25

30

Val

Thr

Val

Ala

Ser

Asn

Leu

Gin

Asp

Glu

Leu

Cys

Gly

Leu

35

40

45

Trp·

?Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Gin

Arg

Trp

Met

Glu

Arg

Leu

Lys

Thr

Val

'50

55

60

Ala

Gly

Ser

Lys

Met

Gin

Gly

Leu

Leů

Glu

Arg

Val

Asn

Thr

Glu

Ile

65

70

75

80

His

Phe

Val

Thr

Lys

Cys

Ala

Phe

Gin

Pro

Ser

Cys

Leu

Arg

85

’ 90

95

Phe

Val

Gin

Thr

Asn

Ile

Ser

Arg

Leu

Gin

Glu

Thr

Ser

Glu

Gin

100

105

110

Leu

Val

Ala

Leu

Lys

Pro

Trp

Ile

Thr

Arg

Gin

Asn

Phe

Ser

Arg

Cys

115

1 ΟΛ X

125

Leu

Glu

Leu

Gin

Cys

Gin

Pro

Asp

Ser

Thr

Leu

Tyr

Val

Glu

Gly

130

135

140

Gly

Ser

Pro

Gly

Ser

Gly

Ser

Asn

Met

Ala

145

150

155

160

Thr

Pro

Leu

Gly

Pro

Ala

Ser

Leu

Pro

Gin

Ser

Phe

Leu

Lys

165

170

175

Ser

Leu

Glu

Gin

Val

Arg

Lys

Ile

Gin

Gly

Asp

Gly

Ala

Leu

Gin

180

185

190

Glu

Lys

Leu

Cys

Ala

Thr

Tyr

Lys

Leu

Cys

His

Pro

Glu

Leu

Val

195

200

205

Leu

Gly

His

Ser

Leu

Gly

Ile

Pro

Trp

Ala

Pro

Leu

Ser

Cys

210

215

220

Pro

Ser

Gin

Ala

Leu

Gin

Leu

Ala

Gly

Cys

Leu

Ser

Gin

Leu

His

Ser

225

230

235

240

Gly

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gin

Gly

Leu

Gin

Ala

Leu

Glu

Gly

Ile

Ser

245

250

255

pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Thr

Leu

Asp

Thr

Leu

Gin

Leu

Asp

Val

Ala

Asp

260

265

270

Phe

Ala

Thr

Ile

Trp

Gin

Met

Glu

Leu

Gly

Met

Ala

Pro

275

280

285

Ala

Leu

Gin

Pro

Thr

Gin

Gly

Ala

Met

Pro

Ala

Phe

Ala

Ser

Ala

Phe

290

295

300

Gin

Arg

Ala

Gly

Val

Leu

Val

Ala

Ser

His

Leu

Gin

Ser

Phe

305

310

315

320

Leu

Glu

Val

Ser

Tyr

Arg

Val

Leu

Arg

His

Leu

Aia

Gin

Pro

325

330

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:42:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 281 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: žádný (xi) POPIS SEKVENCE:'SEQ ID Č:42:

Ala Asn Cys Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg ··

·· ·· * · « · • · · ·

1

5

10

15

Pro

Asn

Pro

Leu

Asp

Pro

Asn

Leu

Asn

Ser

Glu

Asp

Met

20

25

30

Asp

Ile

Leu

Met

Glu

Arg

Asn

Leu

Arg

Thr

Pro

Asn

Leu

Ala

Phe

35

40

45

Val

Arg

Ala

Val

Lys

His

Leu

Glu

Asn

Ala

Ser

Gly

Ile

Glu

Ala

Ile

50

55

60

Leu

Arg

Asn

Leu

Gin

Pro

Cys

Leu

Pro

Ser

Ala

Thr

Ala

Pro

Ser

65

70

75

80

Arg

His

Pro

Ile.

Ile

Lys

Ala

Gly

Asp

Trp

Gin

Glu

Phe

Arg

Glu

85

90

95

Lys

Leu

Thr

Phe

Tyr

Leu

Val

Thr

Leu

Glu

Gin

Ala

Gin

Glu

Gin

100

105

110

Tyr

Val

Glu

Gly

Ser

Pro

Gly

Glu

Pro

Ser

Gly

Pro

Ile

115

120

125

Ser

Thr

Ile

Asn

Pro

Ser

Pro

Ser

Lys

Glu

Ser

His

Lys

Ser

Pro

130

135

140

Asn

Met.

Ala

Thr

Gin

Asp

Cys

Ser

Phe

Gin

His

Ser

Pro

Ile

Ser

145

150

155

160

Asp

Phe

Ala

Val

Lys

Ile

Arg

Glu

Leu

Ser

Asp

Tyr

Leu

Gin

Asp

165

170

175

Tyr

Pro

Val

Thr

Val

Ala

Ser

Asn

Leu

Gin

Asp

Glu

Leu

Cys

Gly

180

185

190

Gly

Leu

Trp

Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Gin

Arg

Trp

Met

Glu

Arg

Leu

Lys

195

200

205

Thr

Val

Ala

Gly

Ser

Lys

Met

Gin

Gly

_: Leu

Leu

Glu

Arg

Val

Asn

Thr

210

215

220

Glu

Ile

His

Phe

Val

Thr

Lys

cys

Ala

Phe

Gin

Pro

Ser

Cys

225

230

235

240

Leu

Arg

Phe

Val

Gin

Thr

Asn

Ile

Ser

Arg

Leu

Gin

Glu

Thr

Ser

245

250

255

Glu

Gin

Leu

Val

Ala

Leu

Lys

Pro

Trp

Ile

Thr

Arg

Gin

Asn

Phe

Ser

260

265

270

Arg

Cys

Leu

Glu

Leu

Gin

Cys

Gin

Pro

275

280

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:43:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 286 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: žádný (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:43:

Ala

Asn

Cys

Ser

Ile

Met

Ile

Asp

Glu

Ile

His

Leu

Lys

Arg

1

5

10

15

Pro

Asn

Pro

Leu

Asp

Pro

Asn

Leu

Asn

Ser

Glu

Asp

Met

20

25

30

Asp

Ile

Leu

Met

Glu

Arg

Asn

Leu

Arg

Thr

Pro

Asn

Leu

Ala

Phe

35

40

45

Val

Arg

Ala

Val

Lys

His

Leu

Glu

Asn

Ala

Ser

Gly

Ile

Glu

Ala

Ile

50

55

60

Leu

Arg

Asn

Leu

Gin

Pro

Cys

Leu

Pro

Ser

Ala

Thr

Ala

Pro

Ser

65

70

75

80

Arg

His

Pro

Ile

Lys

Ala

Gly

Asp

Trp

Gin

Glu

Phe

Arg

Glu

85 ,

90

95

Lys

Leu

Thr

Phe

Tyr

Leu

Val

Thr

Leu

Glu

Gin

Ala

Gin

Glu

Gin

100

105

110

Tyr

Val

Glu

Gly

Ser

Pro

Gly

Glu

Pro

Ser

Gly

Pro

Ile

115

120

125

Ser

Thr

Ile

Asn

Pro

Ser

Pro

Ser

Lys

Glu

Ser

His

Lys

Ser

Pro

130

135

140

·* ·· » · · « ♦ · « ···· ·· ·* ·· » · · 1

I · · <

··♦ ··« • <

·* «·

Asn

Met

Ala

Thr

Gin

Asp

Cys

Ser

Phe

Gin

His

Ser

Pro

Ile

Ser

.145

150

155

160

Asp

Phe

Ala

Val

Lys

Ile

Arg

Glu

Leu

Ser

Asp

Tyr

Leu

Gin

Asp

165

170

175

Tyr

Pro

Val

Thr

Val

Ala

Ser

Asn

Leu

Gin

Asp

Glu

Leu

Cys

Gly

180

185

190

Gly

Leu

Trp

Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Gin

Arg

Trp

Met

Glu

Arg

Leu

Lys

195

200

205

Thr

Val

Ala

Gly

Ser

Lys

Met

Gin

Gly

Leu

Glu

Arg

Val

Asn

Thr

210

215

220

Glu

Ile

His

Phe

Val

Thr

Lys

Cys

Ala

Phe

Gin

Pro

Ser

Cys

225

230

235

240

Leu

Arg

Phe

Val

Gin

Thr

Asn

Ile

Ser

Arg

Leu

Gin

Glu

Thr

Ser

245

250

255

Glu

Gin

Leu

Val

Ala

Leu

Lys

Pro

Trp

Ile

Thr

Arg

Gin

Asn

Phe

Ser

260

265

270

Arg

Cys

Leu

Glu

Leu

Gin

Cys

Gin

Pro

Asp

Ser

Thr

Leu

275

280

285

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:44:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 281 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: žádný (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:44:

Ala

Thr

Gin

Asp

Cys

Ser

Phe

Gin

His

Ser

Pro

Ile

Ser

Asp

Phe

1

5

10

1.5

Ala

Val

Lys

Ile

Arg

Glu

Leu

Ser

Asp

Tyr

Leu

Gin

Asp

Tyr

Pro

20

25

30

Val

Thr

Val

Ala

Ser

Asn

Leu

Gin

Asp

Glu

Leu

Cys

Gly

Leu

35

40

45

Trp

Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Gin

Arg

Trp

Met

Glu

Arg

Leu

Lys

Thr

Val

50

55

60

Ala

Gly

Ser

Lys

Met

Gin

Gly

Leu

Glu

Arg

Val

Asn

Thr

Glu

Ile

65

70

75

80

His

Phe

Val

Thr

Lys

Cys

Ala

Phe

Gin

Pro

Ser

Cys

Leu

Arg

85

90

95

Phe

Val

Gin

Thr

Asn

Ile

Ser

Arg

Leu

Gin

Glu

Thr

Ser

Glu

Gin

100

105

110

Leu

Val

Ala

Leu

Lys

Pro

Trp

Ile

Thr

Arg

Gin

Asn

Phe

Ser

Arg

Cys

115

120

125

Leu

Glu

Leu

Gin

Cys

Gin

Pro

Tyr

Val

Glu

Gly

Ser

Pro

130

135

140

Gly

Glu

Pro

Ser

Gly

Pro

Ile

Ser

Thr

Ile

Asn

Pro

Ser

Pro

Ser

145

150

155

160

Lys

Glu

Ser

His

Lys

Ser

Pro

Asn

Met

Ala

Asn

Cys

Ser

Ile

Met

Ile

165

170

175

Asp

Glu

Ile

His

Leu

Lys

Arg

Pro

Asn

Pro

Leu

Asp

180

185

190

Pro

Asn

Leu

Asn

Ser

Glu

Asp

Met

Asp

Ile

Leu

Met

Glu

Arg

Asn

195

200

205

Leu

Arg

Thr

Pro

Asn

Leu

Ala

Phe

Val

Arg

Ala

Val

. Lys

His

Leu

210

215

220

Glu

Asn

Ala

Ser

Gly

Ile

Glu

Ala

Ile

Leu

Arg

Asn

Leu

Gin

Pro

Cys

225

230

235

240

Leu

Pro

Ser

Ala

Thr

Ala

Pro

Ser

Arg

His

Pro

Ile

Lys

245

250

255

Ala

Gly

Asp

Trp

Gin

Glu

Phe

Arg

Glu

Lys

Leu

Thr

Phe

Tyr

Leu

Val

260

265

270

Thr

Leu

Glu

Gin

Ala

Gin

Glu

Gin

k· r

·« • · « ···· ·· • · • · • · ·

«* * ·· ·· ·· ·· « · · · · · • · · · · · • « « ··· ··· • · · · ··· ··<€ ·· ·.· 'P

J

275 280 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č: 45:

(i) POPIS SEKVENCE:

(Á) DÉLKA: 286 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: žádný (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č: 45:

Ala

Thr

Gin

Asp Cys

Ser

Phe

Gin

His

Ser

Pro

Ile

Ser

Asp

Phe

1

5

10

15

Ala

Val

Lys

Ile Arg

Glu

Leu

Ser

Asp

Tyr

Leu

Gin

Asp

Tyr

Pro

20

25

30

Val

Thr

Val

Ala Ser

Asn

Leu

Gin

Asp

Glu

Leu

Cys

Gly

Leu

35

40

45

Trp

Arg

Leu

Val Leu

Ala

Gin

Arg

Trp

Met

Glu

Arg

Leu

Lys

Thr

Val

50

55

60

Ala

Gly

Ser

Lys Met

Gin

Gly

Leu

Glu

Arg

Val

Asn

Thr

Glu

Ile

65

70

75

80

His

Phe

Val

Thr T.vq ***. j ~

Ρνς '-'J —

Ala

Phe

Gin

Pro

Pro'

Pro

Ser

Cys

Leu

Arg

85

90

95

Phe

Val

Gin

Thr Asn

Ile

Ser

Arg

Leu

Gin

Glu

Thr

Ser

Glu

Gin

100

105

110

Leu

Val

Ala

Leu Lys

Pro

Trp

Ile

Thr

Arg

Gin

Asn

Phe

Ser

Arg

Cys

115

120

125

Leu

Glu

Leu

Gin Cys

Gin

Pro

Asp

Ser

Thr

Leu

Tyr

Val

Glu

Gly

130

135

140

Gly

Ser Pro

Gly

Glu

Pro

Ser

Gly

Pro

Ile

Ser

Thr

Ile

Asn

145

150

155

160

Pro

Ser

Pro

Pro Ser

Lys

Glu

Ser

His

Lys

Ser

Pro

Asn

Met

Ala

Asn

165

170

175

Cys

Ser

Ile

Met Ile

Asp

Glu

Ile

His

Leu

Lys

Arg

Pro

180

185

190

Asn

Pro

Leu

Leu Asp

Pro

Asn

Leu

Asn

Ser

Glu

Asp

Met

Asp

Ile

195

200

205

Leu

Met

Glu

Arg Asn

Leu

Arg

Thr

Pro

Asn

Leu

Ala

Phe

Val

Arg

210

215

220

Ala

Val

Lys

His Leu

Glu

Asn

Ala

Ser

Gly

Ile

Glu

Ala

Ile

Leu

Arg

225

230

235

240

Asn

Leu

Gin

Pro Cys

Leu

Pro

Ser

Ala

Thr

Ala

Pro

Ser

Arg

His

245

250

255

Pro

Ile

Ile Lys

Ala

Gly

Asp

Trp

Gin

Glu

Phe

Arg

Glu

Lys

Leu

260

265

270

Thr

Phe

Tyr

Leu Val

Thr

Leu

Glu

Gin

Ala

Gin

Glu

Gin

275

280

285

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:46:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 313 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: žádný (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:46:

Ala 1

Thr

Gin

Asp

Cys 5

Ser

Phe

Gin

His

Ser 10

Pro

Ile

Ser

Asp 15

Phe

Ala

Val

Lys

Ile

Arg

Glu

Leu

Ser

Asp

Tyr

Leu

Gin

Asp

Tyr

Pro

• ·

	20	25	30
Val Thr Val	Ala	Ser Asn Leu Gin Asp Glu Glu	Leu Cys Gly Gly Leu
35		40	45
Trp Arg Leu	Val	Leu Ala Gin Arg Trp Met Glu	Arg Leu Lys Thr Val
50		55	60
Ala Gly Ser	Lys	Met Gin Gly Leu Leu Glu Arg	Val Asn Thr Glu Ile
65		70 75	80
His Phe Val	Thr	Lys Cys Ala Phe Gin Pro Pro	Pro Ser Cys Leu Arg
		85 90	95
Phe Val Gin	Thr	Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gin	Glu Thr Ser Glu Gin
	100	¹⁰⁵	110
Leu Val Ala	Leu	Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gin	Asn Phe Ser Arg Cys
115		120	125
Leu Glu Leu	Gin	Cys Gin Pro Asp Ser Ser Thr	Leu Tyr Val Glu Gly
130		135	140
Gly Gly Gly	Ser	Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly	Gly Ser Asn Met Ala
145		150 155	160
Ser Pro Ala	Pro	Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val	Leu Ser Lys Leu Leu
		165 170	175
Arg Asp Ser	His	Val Leu His Ser Arg Leu Ser	Gin Cys Pro Glu Val
	180	185	190
His Pro Leu	Pro	Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala	Val Asp Phe Ser Leu
195		200	205
Gly Glu Trp	Lys	Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys	Ala Gin Asp Ile Leu
210		215	220
Gly Ala Val	Thr	Leu Leu Leu Glu Gly Val Met	Ala Ala Arg Gly Gin
225		230 235	240
Leu Gly Pro	Thr	Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly	Gin Leu Ser Gly Gin
		245 250	255
Val Arg Leu	Leu	Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu	Leu Gly Thr Gin Leu
	260	265	270
Pro Pro Gin	Gly	Arg Thr Thr Ala His Lys Asp	Pro Asn Ala Ile Phe
275		280	285
Leu Ser Phe	Gin	His Leu Leu Arg Gly Lys Val	Arg Phe Leu Met Leu
290		295	300
Val Gly Gly	Ser	Thr Leu Cys Val Arg
305		310
(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:47:
(i) POPIS SEKVENCE:
(A) DÉLKA:	: 332 aminokyselin
(B) TYP: aminokyselinová
(C) POČET	RETEZCU: jednořetězcová
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: žádný

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:47:

Ala

Ser.

Pro

Ala

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

1

5

10

15

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

20

25

30

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser

35

40

45

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

50

55

60

Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Arg

Gly

65

70

75

80

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

85

90

95

Gin

Val

Arg

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

100

105

110

Leu

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Ile

115

120

125

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Met

130

135

140

Leu

Val

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

Glu

Phe

His

Ala

Tyr

Val

145

150

155

160

Glu

Gly

Ser

Pro

Gly

Glu

Pro

Ser

Gly

Pro

Ile

Ser

Thr

165

170

175

Ile

Asn

Pro

Ser

Pro

Ser

Lys

Glu

Ser

His

Lys

Ser

Pro

Asn

Met

180

185

190

Ala

Thr

Gin

Asp

Cys

Ser

Phe

Gin

His

Ser

Pro

Ile

Ser

Asp

Phe

195

200

205

Ala

Val

Lys

Ile

Arg

Glu

Leu

Ser

Asp

Tyr

Leu

Gin

Asp

Tyr

Pro

210

215

220

Val

Thr

Val

Ala

Ser

Asn

Leu

Gin

Asp

Glu

Leu

Cys

Giy

Gly

Leu

225

230

235

240

Trp

Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Gin

Arg

Trp

Met

Glu

Arg

Leu

Lys

Thr

Val

245

250

255

Ala

Gly

Ser

Lys

Met

Gin

Gly

Leu

Glu

Arg

Val

Asn

Thr

Glu

Ile

260

265

270

His

Phe

Val

Thr

Lys

Cys

Ala

Phe

Gin

Pro

Ser

Cys

Leu

Arg

275

280

285

Phe

Val

Gin

Thr

Asn

Ile

Ser

Arg

Leu

Gin

Glu

Thr

Ser

Glu

Gin

290

OQR

300

Leu

Val

Ala

Leu

Lys

Pro

Trp

Ile

Thr

Arg

Gin

Asn

Phe

Ser

Arg

Cys

305

310

315

320

Leu

Glu

Leu

Gin

Cys

Gin

Pro

Asp

Ser

Thr

Leu

325 330 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:48:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 340 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselinová.

	(C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová
(D) TOPOLOGIE	: lineární
(ii:	) TYP MOLEKULY:	žádný
(xí:	) POPIS SEKVENCE	: SEQ ID Č:48:
Ala	Thr Gin Asp Cys	Ser Phe Gin His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe
1	5	10 15
Ala	Val Lys Ile Arg	Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gin Asp Tyr Pro
	20	25 30
Val	Thr Val Ala Ser	Asn Leu Gin Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu
	35	40 45
Trp	Arg Leu Val Leu	Ala Gin Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val
	50	55 60
Ala	Gly Ser Lys Met	Gin Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile
65		70 75 80
His	Phe Val Thr Lys	Cys Ala Phe Gin Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg
	85	90 95
Phe	Val Gin Thr Asn	Ile Ser Arg Leu Leu Gin Glu Thr Ser Glu Gin
	100	105 110
Leu	Val Ala Leu Lys	Pro Trp Ile Thr Arg Gin Asn Phe Ser Arg Cys
	115	120 125
Leu	Glu Leu Gin Cys	Gin Pro Asp Ser Ser Thr Leu Tyr Val Glu Gly
	130	135 140
Gly	Gly Gly Ser Pro	Gly Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn
145		150 155 160
Pro	Ser Pro Pro Ser	Lys Glu Ser His Lys Ser Pro Asn Met Ala Pro
	165	170 175
Pro	Arg Leu Ile Cys	Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu
	180	185 190

i

Q i;

fe.

Ala	Lys	Glu 195	Ala	Glu	Asn	Ile	Thr 200
Leu	Asn 210	Glu	Asn	Ile	Thr	Val 215	Pro
Trp 225	Lys	Arg	Met	Glu	Val 230	Gly	Gin
Leu	Ala	Leu	Leu	Ser 245	Glu	Ala	Val
Asn	Ser	Ser	Gin 260	Pro	Trp	Glu	Pro
Val	Ser	Gly. 275	Leu	Arg	Ser	Leu	Thr 280
Gin	Lys 290	Glu	Ala	Ile	Ser	Pro 295	Pro
Arg 305	Thr	Ile	Thr	Ala	Asp 310	Thr	Phe
Asn Thr	Phe Gly	Leu Asp	Arg Arg 340	Gly 325	Lys	Leu	Lys

Thr	Gly	Cys	Ala	Glu 205	His	Cys	Ser
Asp	Thr	Lys	Val 220	Asn	Phe	Tyr	Ala
Gin	Ala	Val 235	Glu	Val	Trp	Gin	Gly 240
Leu	Arg 250	Gly	Gin	Ala	Leu Leu 255	Val
Leu 2 65	Gin	Leu	His	Val	Asp 270	Lys	Ala
Thr	Leu	Leu	Arg	Ala 285	Leu	Arg	Ala
Asp	Ala	Ala	Ser 300	Ala	Ala	Pro	Leu
Arg	Lys	Leu 315	Phe	Arg	Val	Tyr	Ser 320
Leu	Tyr 330	Thr	Gly	Glu	Ala	Cys 335	Arg

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č: 49:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 325 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ:. jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: žádný (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:49:

Ala

Pro

Arg

Leu

Ile

Cys

Asp

Ser

Arg

Val

Leu

Glu

Arg

Tyr

Leu

1

5

10

15

Leu

Glu

Ala

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gly

Cys

Ala

Glu

His

20

25

30

Cys

Ser

Leu

Asn

Glu

Asn

Ile

Thr

Val

Pro

Asp

Thr

Lys

Val

Asn

Phe

35

40

45

Tyr

Ala

Trp

Lys

Arg

Met

Glu

Val

Gly

Gin

Ala

Val

Glu

val

Trp

50

55

60

Gin

Gly

Leu

Ala

Leu

Ser

Glu

Ala

Val

Leu

Arg

Gly

Gin

Ala

Leu

65

70

75

80

Leu

Val

Asn

Ser

Gin

Pro

Trp

Glu

Pro

Leu

Gin

Leu

His

Val

Asp

85

90

95

Lys

Ala

Val

Ser

Gly

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Leu

Arg

Ala

Leu

100

105

110

Arg

Ala

Gin

Lys

Glu

Ala

Ile

Ser

Pro

Asp

Ala

Ser

Ala

115

120

125

Pro

Leu

Arg

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Thr

Phe

Arg

Lys

Leu

Phe

Arg

Val

130

135

140

Tyr

Ser

Asn

Phe

Leu

Arg

Gly

Lys

Leu

Lys

Leu

Tyr

Thr

Gly

Glu

Ala

145

150

155

160

Cys

Arg

Thr

Gly

Asp

Arg

Tyr

Val

Glu

Gly

Ser

Pro

Gly

165

170

175

Gly

Ser

Gly

Ser

Asn

Met

Ala

Thr

Gin

Asp

Cys

Ser

Phe

180

185

190

Gin

His

Ser

Pro

Ile

Ser

Asp

Phe

Ala

Val

Lys

Ile

Arg

Glu

Leu

195

200

205

Ser

Asp

Tyr

Leu

Gin

Asp

Tyr

Pro

Val

Thr

Val

Ala

Ser

Asn

Leu

210

215

220

Gin

Asp

Glu

Leu

Cys

Gly

Leu

Trp

Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Gin

225

230

235

240

Arg

Trp

Met

Glu

Arg

Leu

Lys

Thr

Val

Ala

Gly

Ser

Lys

Met

Gin

Gly

245

250

255

Leu

Glu

Arg

Val

Asn

Thr

Glu

Ile

His

Phe

Val

Thr

Lys

Cys

Ala

k i• · · · • · ·

67

9 9 9 9999 ··

• · ·

• • 9 9 9

260

265

270

Phe

Gin

Pro

Ser

Cys

Leu

Arg

Phe

Val

Gin Thr Asn

Ile

Ser

275

280

• 285

Arg

Leu

Gin

Glu

Thr

Ser

Glu

Gin

Leu

Val

Ala Leu Lys

Pro

Trp

290

295

300

Ile

Thr

Arg

Gin

Asn

Phe

Ser

Arg

Cys

Leu

Glu

Leu Gin Cys

Gin

Pro

305

310

315

320

Asp

Ser

Thr

Leu

• · · · » · · · » » · · • ·· · 9 9 • · e ♦ · ·

325 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:50:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1032 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární ‘Λ

(xi) POPIS	SEKVENCE: SEQ ID Č:50:
GCTACACCAT 60 CAAGTGAGAA 120	TGGGCCCTGC	CAGCTCCCTG	CCCCAGAGCT	TCCTGCTCAA	GTCTTTAGAG
AGATCCAGGG	CGATGGCGCA	GCGCTCCAGG	AGAAGCTGTG	TGCCACCTAC
AAGCTGTGCC 180	ACCCCGAGGA	GCTGGTGCTG	CTCGGACAC-T	CTC-TGGGCAT	CCCCTGGGCT
CCCCTGAGCT 240	CCTGCCCCAG	CCAGGCCCTG	CAGCTGGCAG	GCTGCTTGAG	CCAACTCCAT
AGCGGCCTTT 300	TCCTCTACCA	GGGGCTCCTG	CAGGCCCTGG	AAGGGATATC	CCCCGAGTTG
GGTCCCACCT 360	TGGACACACT	GCAGCTGGAC	GTCGCCGACT	TTGCCACCAC	CATCTGGCAG
CAGATGGAAG 420	AACTGGGAAT	GGCCCCTGCC	CTGCAGCCCA	CCCAGGGTGC	CATGCCGGCC
TTCGCCTCTG 480	CTTTCCAGCG	CCGGGCAGGA	GGGGTCCTGG	TTGCTAGCCA	TCTGCAGAGC
TTCCTGGAGG 540	TGTCGTACCG	CGTTCTACGC	CACCTTGCGC	AGCCCTACGT	AGAGGGCGGT
GGAGGCTCCC 600	CGGGTGAACC	GTCTGGTCCA	ATCTCTACTA	TCAACCCGTC	TCCTCCGTCT
AAAGAATCTC 660	ATAAATCTCC	AAACATGGCC	ACCCAGGACT	GCTCCTTCCA	ACACAGCCCC
ATCTCCTCCG 720	ACTTCGCTGT	CAAAATCCGT	GAGCTGTCTG	ACTACCTGCT	TCAAGATTAC
CCAGTCACCG 780	TGGCCTCCAA	CCTGCAGGAC	GAGGAGCTCT	GCGGGGGCCT	CTGGCGGCTG
GTCCTGGCAC 84 0	AGCGCTGGAT	GGAGCGGCTC	AAGACTGTCG	CTGGGTCCAA	GATGCAAGGC
ŤTGCTGGAGC 900	GCGTGAACAC	GGAGATACAC	TTTGTCACCA	AATGTGCCTT	TCAGCCCCCC
CCCAGCTGTC 960	TTCGCTTCGT	CCAGACCAAC	ATCTCCCGCC	TCCTGCAGGA	GACCTCCGAG
CAGCTGGTGG 1020	CGCTGAAGCC	CTGGATCACT	CGCCAGAACT	TCTCCCGGTG	CCTGGAGCTG

CAGTGTCAGCCC

1032 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:51:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1005 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:51 • · • ·

			68	• · · • · ·	« · · · • ·
ATGGCCACTC 60	AGGACTGCTC	TTTTCAACAC	AGCCCCATCT	CCTCCGACTT	CGCTGTCAAA
ATCCGTGAGC 120	TGTCTGACTA	CCTGCTTCAA	GATTACCCAG	TCACCGTGGC	CTCCAACCTG
CAGGACGAGG 180	AGCTCTGCGG	GGGCCTCTGG	CGGCTGGTCC	TGGCACAGCG	CTGGATGGAG
CGGCTCAAGA 240	CTGTCGCTGG	GTCCAAGATG	CAAGGCTTGC	TGGAGCGCGT	GAACACGGAG
ATACACTTTG 300	TCACCAAATG	TGCCTTTCAG	CCCCCCCCCA	GCTGTCTTCG	CTTCGTCCAG
ACCAACATCT 360	CCCGCCTCCT	GCAGGAGACC	TCCGAGCAGC	TGGTGGCGCT	GAAGCCCTGG
ATCACTCGCC 420	AGAACTTCTC	CCGGTGCCTG	GAGCTGCAGT	GTCAGCCCGA	CTCCTCAACC
CTGTACGTAG 480	AGGGCGGTGG	AGGCTCCCCG	GGTGGTGGTT	CTGGCGGCGG	CTCCAACATG
GCTACACCAT 540	TGGGCCCTGC	CAGCTCCCTG	CCCCAGAGCT	TCCTGCTCAA	GTCTTTAGAG
CAAGTGAGAA 600	AGATCČAGGG	CGATGGCGCA	GCGCTCCAGG	AGAAGCTGTG	TGCCACCTAC
AAGCTGTGCC 660	ACCCCGAGGA	GCTGGTGCTG	CTCGGACACT	CTCTGGGCAT	CCCCTGGGCT
CCCCTGAGCT 720	CCTGCCCCAG	CCAGGCCCTG	CAGCTGGCAG	GCTGCTTGAG	CCAACTCCAT
AGCGGCCTTT 780	TCCTCTACCA	GGGGCTCCTG	CAGGCCCTGG	AAGGGATATC	CCCCGAGTTG
GGTCCCACCT 840	TGGACACACT	GCAGCTGGAC	GTCGCCGACT	TTGCCACCAC	CATCTGGCAG
CAGATGGAAG 900	AACTGGGAAT	GGCCCCTGCC	CTGCAGCCCA	CCCAGGGTGC	CATGCCGGCC
TTCGCCTCTG CTTTCCAGCG 960 TTCCTGGAGG TGTCGTACCG 1005 (2) INFORMACE PRO SEQ (i) POPIS SEKVENCE:	CCGGGCAGGA CGTTCTACGC ID Č:52:	GGGGTCCTGG CACCTTGCGC	TTGCTAGCCA AGCCG	TCTGCAGAGC

(A) DÉLKA: 420 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi)POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:52:

GCCACTCAGG ACTGCTCTTT TCAACACAGC CCCATCTCCT CCGACTTCGC TGTCAAAATC 60

CGTGAGCTGT CTGACTACCT GCTTCAAGAT TACCCAGTCA CCGTGGCCTC CAACCTGCAG 120

GACGAGGAGC TCTGCGGGGG CCTCTGGCGG CTGGTCCTGG CACAGCGCTG GATGGAGCGG 180

CTCAAGACTG TCGCTGGGTC CAAGATGCAA GGCTTGCTGG AGCGCGTGAA CACGGAGATA 240

CACTTTGTCA CCAAATGTGC CTTTCAGCCC CCCCCCAGCT GTCTTCGCTT CGTCCAGACC 300

AACATCTCCC GCCTCCTGCA GGAGACCTCC GAGCAGCTGG TGGCGCTGAA GCCCTGGATC 360

ACTCGCCAGA ACTTCTCCCG GTGCCTGGAG CTGCAGTGTC AGCCCGACTC CTCAACCCTG 420 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č: 53:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 405 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina ·· ·· • · 4 • · 4 (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:53:

	GCCACCCAGG 60 CGTGAGCTGT 120	ACTGCTCCTT	CCAACACAGC	CCCATCTCCT	CCGACTTCGC	TGTCAAAATC
	CTGACTACCT	GCTTCAAGAT	TACCCAGTCA	CCGTGGCCTC	CAACCTGCAG
	GACGAGGAGC 180	TCTGCGGGGC	GCTCTGGCGG	CTGGTCCTGG	CACAGCGCTG	GATGGAGCGG
	CTCAAGACTG 240	TCGCTGGGTC	CAAGATGCAA	GGCTTGCTGG	AGCGCGTGAA	CACGGAGATA
	CACTTTGTCA 300 '	CCAAATGTGC	CTTTCAGCCC	CCCCCCAGCT	GTCTTCGCTT	CGTCCAGACC
P	AACATCTCCC 360	GCCTCCTGCA	GGAGACCTCC	GAGCAGCTGG	TGGCGCTGAA	GCCCTGGATC
i	ACTCGCCAGA 405	ACTTCTCCCG	GTGCCTGGAG	CTGCAGTGTC	AGCCC
	(2) INFORMACE PRO SEQ	ID Č:54:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 420 párů baží (B) TYP: nukleová kyselině (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:54:

GCCACCCAGG 60 CGTGAGCTGT 120	ACTGCTCCTT	CCAACACAGC	CCCATCTCCT	CCGACTTCGC	TGTCAAAATC
CTGACTACCT	GCTTCAAGAT	TACCCAGTCA	CCGTGGCCTC	CAACCTGCAG
GACGAGGAGC 180	TCTGCGGGGG	CCTCTGGCGG.	CTGGTCCTGG	CACAGCGCTG	GATGGAGCGG
CTCAAGACTG 240	TCGCTGGGTC	CAAGATGCAA	GGCTTGCTGG	AGCGCGTGAA	CACGGAGATA
CACTTTGTCA 300	CCAAATGTGC	CTTTCAGCCC	CCCCCCAGCT	GTCTTCGCTT	CGTCCAGACC
AACATCTCCC 360	GCCTCCTGCA	GGAGACCTCC	GAGCAGCTGG	TGGCGCTGAA	GCCCTGGATC
ACTCGCCAGA ACTTCTCCCG 420 (2) INFORMACE PRO SEQ	GTGCCTGGAG ID Č:55:	CTGCAGTGTC	AGCCCGACTC	CTCAACCCTG

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 420 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární

(xi) POPIS	SEKVENCE:	SEQ ID Č:55:
GCCACTCAGG 60 CGTGAGCTGT	ACTGCTCTTT	TCAACACAGC	CCCATCTCCT	CCGACTTCGC	TGTCAAAATC
CTGACTACCT	GCTTCAAGAT	TACCCAGTCA	CCGTGGCCTC	CAACCTGCAG
120 GACGAGGAGC	TCTGCGGGGG	CCTCTGGCGG	CTGGTCCTGG	CACAGCGCTG	GATGGAGCGG
180 CTCAAGACTG	TCGCTGGGTC	CAAGATGCAA	GGCTTGCTGG	AGCGCGTGAA	CACGGAGATA
240 CACTTTGTCA	CCAAATGTGC	CTTTCAGCCC	CCCCCCAGCT	GTCTTCGCTT	CGTCCAGACC
300 AACATCTCCC	GCCTCCTGCA	GGAGACCTCC	GAGCAGCTGG	TGGCGCTGAA	GCCCTGGATC

• · • *

360

ACTCGCCAGA ACTTCTCCCG GTGCCTGGAG CTGCAGTGTC AGCCCGACTC CTCAACCCTG ř. 420

ú. (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:56:

t

e;

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 942 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová

(D) TOPOLOGIE: .	lineární
(xi) POPIS	SEKVENCE:	SEQ ID Č:56:
GCCACTCAGG 60 CGTGAGCTGT	ACTGCTCTTT	TCAACACAGC	CCCATCTCCT	CCGACTTCGC	TGTCAAAATC
CTGACTACCT	GCTTCAAGAT	TACCCAGTCA	CCGTGGCCTC	CAACCTGCAG
120
GACGAGGAGC 180	TCTGCGGGGG	CCTCTGGCGG	CTGGTCCTGG	CACAGCGCTG	GATGGAGCGG
CTCAAGACTG 240	TCGCTGGGTC	CAAGATGCAA	GGCTTGCTGG	AGCGCGTGAA	CACGGAGATA
CACTTTGTCA 300-	CCAAATGTGC	CTTTCAGCCC	CCCCCCAGCT	GTCTTCGCTT	CGTCCAGACC
AACATCTCCC 360	GCCTCCTGCA	GGAGACCTCC	GAGCAGCTGG	TGGCGCTGAA	GCCCTGGATC
ACTCGCCAGA	ACTTCTCCCG	GTGCCTGGAG	CTGCAGTGTC	AGCCCGACTC	CTCAACCCTG
420 TACGTAGAGG 480	GCGGTGGAGG	CTCCCCGGGT	GAACCGTCTG	GTCCAATCTC	TACTATCAAC
CCGTCTCCTC 540	CGTCTAAAGA	ATCTCATAAA	TCTCCAAACA	TGGCTACCCA	GGACTGCTCC
TTCCAACACA	GCCCCATCTC	CTCCGACTTC	GCTGTCAAAA	TCCGTGAGCT	GTCTGACTAC
600					-
CTGCTTCAAG	ATTACCCAGT	CACCGTGGCC	TCCAACCTGC	AGGACGAGGA	GCTCTGCGGG
660 GGCCTCTGGC 720	GGCTGGTCCT	GGCACAGCGC	TGGATGGAGC	GGCTCAAGAC	TGTCGCTGGG
TCCAAGATGC	AAGGCTTGCT	GGAGCGCGTG	AACACGGAGA	TACACTTTGT	CACCAAATGT
780 GCCTTTCAGC 840	CCCCCCCCAG	CTGTCTTCGC	TTCGTCCAGA	CCAACATCTC	CCGCCTCCTG
CAGGAGACCT	CCGAGCAGCT	GGTGGCGCTG	AAGCCCTGGA	TCACTCGCCA	GAACTTCTCC
900 CGGTGCCTGG	AGCTGCAGTG	TCAGCCCGAC	TCCTCAACCC	TG

942 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:57:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1003 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:57:

GGCCACTCAG GACTGCTCTT TTCAACACAG CCCCATCTCC TCCGACTTCG CTGTCAAAAT 60

CCGTGAGCTG TCTGACTACC TGCTTCAAGA TTACCCAGTC ACCGTGGCCT CCAACCTGCA 120

GGACGAGGAG CTCTGCGGGG GCCTCTGGCG GCTGGTCCTG GCACAGCGCT GGATGGAGCG 180

GCTCAAGACT 240	GTCGCTGGGT	CCAAGATGCA	AGGCTTGCTG	GAGCGCGTGA	ACACGGAGAT
ACACTTTGTC 300	ACCAAATGTG	CCTTTCAGCC	CCCCCCCAGC	TGTCTTCGCT	TCGTCCAGAC
CAACATCTCC 360	CGCCTCCTGC	AGGAGACCTC	CGAGCAGCTG	GTGGCGCTGA	AGCCCTGGAT
CACTCGCCAG 420	AACTTCTCCC	GGTGCCTGGA	GCTGCAGTGT	CAGCCCGACT	CCTCAACCCT
GTACGTAGAG 480	GGCGGTGGAG	GCTCCCCGGG	TGGTGGTTCT	GGCGGCGGCT	CCAACATGGC
TACACCATTG 540	GGCCCTGCCA	GCTCCCTGCC	CCAGAGCTTC	CTGCTCAAGT	CTTTAGAGCA
AGTGAGAAAG 600	ATCCAGGGCG	ATGGCGCAGC	GCTCCAGGAG	AAGCTGTGTG	CCACCTACAA
GCTGTGCCAC 660	CCCGAGGAGC	TGGTGCTGCT	CGGACACTCT	CTGGGCATCC	CCTGGGCTCC
CCTGAGCTCC 720	TGCCCCAGCC	AGGCCCTGCA	GCTGGCAGGC	TGCTTGAGCC	AACTCCATAG
CGGCCTTTTC 780	CTCTACCAGG	GGCTCCTGCA	GGCCCTGGAA	GGGATATCCC	CCGAGTTGGG
TCCCACCTTG 840	GACACACTGC	AGCTGGACGT	CGCCGACTTT	GCCACCACCA	TCTGGCAGCA
GATGGAAGAA 900 -	CTGGGAATGG	CCCCTGCCCT	GCAGCCCACC	CAGGGTGCCA	TGCCGGCCTT
CGCCTCTGCT 960	TTCCAGCGCC	GGGCAGGAGG	GGTCCTGGTT	GC T AGCk_rt.i'G	TGCAGAGCTT
CCTGGAGGTG 1003	TCGTACCGCG	TTCTACGCCA	CCTTGCGCAG	CCG

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:58:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 858 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SĚQ ID Č:58:

GCCACCCAGG 60 CGTGAGCTGT 120	ACTGCTCCTT	CCAACACAGC	CCCATCTCCT	CCGACTTCGC	TGTCAAAATC
CTGACTACCT	GCTTCAAGAT	TACCCAGTCA	CCGTGGCCTC	CAACCTGCAG
GACGAGGAGC 180	TCTGCGGGGG	CCTCTGGCGG	CTGGTCCTGG	CACAGCGCTG	GATGGAGCGG
CTCAAGACTG 240.	TCGCTGGGTC	CAAGATGCAA	GGCTTGCTGG	AGCGCGTGAA	CACGGAGATA
CACTTTGTCA 300	CCAAATGTGC	CTTTCAGCCC	CCCCCCAGCT	GTCTTCGCTT	CGTCCAGACC
AACATCTCCC 360	GCCTCCTGCA	GGAGACCTCC	GAGCAGCTGG	TGGCGCTGAA	GCCCTGGATC
ACTCGCCAGA 420	ACTTCTCCCG	GTGCCTGGAG	CTGCAGTGTC	AGCCCGACTC	CTCAACCCTG
TACGTAGAGG 480	GCGGTGGAGG	CTCCCCGGGT	GAACCGTCTG	GTCCAATCTC	TACTATCAAC
CCGTCTCCTC 540	CGTCTAAAGA	ATCTCATAAA	TCTCCAAACA	TGGCTAACTG	CTCTATAATG
ATCGATGAAA 600	TTATACATCA	CTTAAAGAGA	CCACCTAACC	CTTTGCTGGA	CCCGAACAAC
CTCAATTCTG 660	AAGACATGGA	TATCCTGATG	GAACGAAACC	TTCGAACTCC	AAACCTGCTC
GCATTCGTAA 720	GGGCTGTCAA	GCACTTAGAA	AATGCATCAG	GTATTGAGGC	AATTCTTCGT
AATCTCCAAC 780	CATGTCTGČC	CTCTGCCACG	GCCGCACCCT	CTCGACATCC	AATCATCATC
AAGGCAGGTG	ACTGGCAAGA	ATTCCGGGAA	AAACTGACGT	TCTATCTGGT	TACCCTTGAG

840

CAAGCGCAGG AACAACAG

858 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:59:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 402 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C ) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:59:

ATGGCTCCAA 60	TGACTCAGAC	TACTTCTCTT	AAGACTTCTT	GGGTTAACTG
ATCGATGAAA	TTATAACACA	CTTAAAGCAG	CCACCTTTGC	CTTTGCTGGA
120 CTCAATGGGG	AAGACCAAGA	CATTCTGATG	GAAAATAACC	TTCGAAGGCC
180 GCATTCAACA 240	GGGCTGTCAA	GAGTTTACAG	AATGCATCAG	CAATTGAGAG
AATCTCCTGC 300	CATGTCTGCC	CCTGGCCACG	GCCGCACCCA	CGCGACATCC
AAGGACGGTG	ACTGGAATGA	ATTCCGTCGT	AAACTGACCT	TCTATCTGAA
360 AACGCGCAGG 402	CTCAACAGAC	CACTCTGTCG	CTAGCGATCT	TT
(2) INFORMACE PRO SEQ	ID Č: 60:

CTCTAACATG

CTTCAACAAC

AAACCTGGAG

CATTCTTAAA

AATCCATATC

AACCTTGGAG (i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 344 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: žádný (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:60:

Ala

Thr

Pro

Leu

Gly

Pro Ala

Ser

Leu

Pro

Gin

Ser

Phe

Leu

1

5

10

15

Lys

Ser

Leu

Glu

Gin

Val

Arg

Lys

Ile

Gin

Gly

Asp

Gly

Ala

Leu

20

25

30

Gin

Glu

Lys

Leu

Cys

Ala

Thr

Tyr

Lys

Leu

Cys

His

Pro

Glu

Leu

35

40

45

Val

Leu

Gly

His

Ser

Leu

Gly

Ile

Pro

Trp

Ala

Pro

Leu

Ser

50

55

60

Cys

Pro

Ser

Gin

Ala

Leu

Gin

Leu

Ala

Gly

Cys

Leu

Ser

Gin

Leu

His

65

70

75

80

Ser

Gly

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gin

Gly

Leu

Gin

Ala

Leu

Glu

Gly

Ile

85

90

95

Ser

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Thr

Leu

Asp

Thr

Leu

Gin

Leu

Asp

Val

Ala

100

105

110

Asp

Phe

Ala

Thr

Ile

Trp

Gin

Met

Glu

Leu

Gly

Met

Ala

115

120

125

Pro

Ala

Leu

Gin

Pro

Thr

Gin

Gly

Ala

Met

Pro

Ala

Phe

Ala

Ser

Ala

130

135

140

Phe

Gin

Arg

Ala

Gly

Val

Leu

Val

Ala

Ser

His

Leu

Gin

Ser

145

150

155

160

Phe

Leu

Glu

Val

Ser

Tyr

Arg

Val

Leu

Arg

His

Leu

Ala

Gin

Pro

Tyr

165

170

175

Val

Glu

Gly

Ser

Pro

Gly

Glu

Pro

Ser

Gly

Pro

Ile

Ser

··

9 ♦ · • · · · • · 9 9 ·

£	180	185	190
s Thr Ile Asn	Pro Ser Pro	Pro Ser Lys Glu Ser His Lys	Ser Pro Asn
< 195		200 205
I Met Ala Thr	Gin Asp Cys	Ser Phe Gin His Ser Pro Ile	Ser Ser Asp
i 210		215 220
ř Phe Ala Val	Lys Ile Arg	Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu	Gin Asp Tyr
225	230	235	240
Pro Val Thr	Val Ala Ser	Asn Leu Gin Asp Glu Glu Leu	Cys Gly Gly
í~-··	245	250	255
Leu Trp Arg	Leu Val Leu	Ala Gin Arg Trp Met Glu Arg	Leu Lys Thr
b-	260	265	270
Val Ala Gly	Ser Lys Met	Gin Gly Leu Leu Glu Arg Val	Asn Thr Glu
L· 275		280 285
Ile His Phe	Val Thr Lys	Cys Ala Phe Gin Pro Pro Pro	Ser Cys Leu
* ζ-'ν 290		295 300
ΐ S Arg Phe Val	Gin Thr Asn	Ile Ser Arg Leu Leu Gin Glu	Thr Ser Glu
í 305	310	315	320
? Gin Leu Val	Ala Leu Lys	Pro Trp Ile Thr Arg Gin Asn	Phe Ser Arg
	32.5	330	335
? Cys Leu Glu	Leu Gin Cys	Gin Pro
	340
(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:61:
I (i) POPIS SEKVENCE:
L (A) DÉLKA: 133 aminokyseliny

(B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: žádný (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:61:

Pro 1

Met

Thr

Gin

Thr 5

Thr

Ser

Leu Lys

Thr 10

Ser

Trp

Val Asn

Cys 15

Ser

Asn

Met

Ile

Asp

Glu

Ile

Thr His

Leu

Lys

Gin

Pro Pro

Leu

Pro

20

25

30

Leu

Asp

Phe

Asn

Leu

Asn Gly

Glu

Asp

Gin

Asp Ile

Leu

Met

35

40

45

Glu

Asn

Leu

Arg

Pro

Asn Leu

Glu

Ala

Phe

Asn Arg

Ala

Val

50

55

60

Lys

Ser

Leu

Gin

Asn

Ala

Ser

Ala Ile

Glu

Ser

Ile

Leu Lys

Asn

Leu

65

70-

75

80

Leu

Pro

Cys

Leu

Pro

Leu

Ala

Thr Ala

Ala

Pro

Thr

Arg His

Pro

Ile

85

90

95

His

Ile

Lys

Asp

Gly

Asp

Trp

Asn Gly

Ile

Phe

Arg

Arg Lys

Leu

Thr

100

105

110

Phe

Tyr

Leu

Lys

Thr

Leu

Glu

Asn Ala

Gin

Ala

Gin

Gin Thr

Thr

Leu

115 120 125

Ser Leu Ala Ile Phe 130 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:62:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 287 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: žádný <k.

v /3¾

TS

	74	• •	·* ·« • · ·	* • * * •	• · • · • • •
• · • · » · ·· ·	• * · * « ·
(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:62:
Pro Met Thr Gin Thr Thr Ser Leu Lys 1 5	Thr Ser 10	Trp	Val	Asn	Cys 15	Ser
Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His 20 25	Leu Lys	Gin	Pro	Pro 30	Leu	Pro
Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly 35 40	Glu Asp	Gin	Asp 45	Ile	Leu	Met
Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu 50 55	Glu Ala	Phe 60	Asn	Arg	Ala	Val
Lys Ser Leu Gin Asn Ala Ser Ala Ile 65 70	Glu Ser 75	Ile	Leu	Lys	Asn	Leu 80
Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala 85	Ala Pro 90	Thr	Arg	His	Pro 95	Ile
His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Gly 100 105	Ile Phe	Arg	Arg	Lys 110	Leu	Thr
Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala 115 120	Gin Ala	Gin	Gin 125	Thr	Thr	Leu
Ser Leu Ala Ile Phe Tyr Val Glu Gly 130 135	Gly Gly	Gly 140	Ser	Pro	Gly	Gly
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Met Ala 145 150	Thr Gin 155	Asp	Cys	Ser	Phe	Gin 160
His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 165	Val Lys 170	Ile	Arg	Glu	Leu 175	Ser
Asp Tyr Leu Leu Gin Asp Tyr Pro Val 180 185	Thr Val	Ala	Ser	Asn 190	Leu	Gin
Asp Glu Glu Leu Cys Gly Ala Leu Trp 195 200	Arg Leu	Val	Leu 205	Ala	Gin	Arg
Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 210 215	Gly Ser	Lys 220	Met	Gin	Gly	Leu
Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 225 230	Phe Val 235	Thr	Lys	Cys	Ala	Phe 240
Gin Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 245	Val Gin 250	Thr	Asn	Ile	Ser 255	Arg
Leu Leu Gin Glu Thr Ser Glu Gin Leu 260 265	Val Ala	Leu	Lys	Pro 270	Trp	Ile
Thr Arg Gin Asn Phe Ser Arg Cys Leu 275 280 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:63:	Glu Leu	Gin	Cys 285	Gin	Pro

·’ · · • · · ·· · ··· (i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 302 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová

	(C) POČET ŘEČEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární	-
(ii)	TYP MOLEKULY: žádný
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:63:
Pro	Met Thr Gin Thr Thr Ser Leu Lys Thr	Ser	Trp	Val	Asn	Cys	Ser
1	5 10					15
Asn	Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu	Lys	Gin	Pro	Pro	Leu	Pro
	,20 25				30
Leu	Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu	Asp	Gin	Asp	Ile	Leu	Met
	35 40			45
Glu	Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu	Ala	Phe	Asn	Arg	Ala	Val
	50 55		60
Lys	Ser Leu Gin Asn Ala Ser Ala Ile Glu	Ser	Ile	Leu	Lys	Asn	Leu
65	. 70	75					80
Leu	Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala	Pro	Thr	Arg	His	Pro	Ile
	85 90					95
His	Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Gly Ile	Phe	Arg	Arg	Lys	Leu	Thr

100 105 110

Phe

Tyr Leu Lys 115

Thr

Leu Glu

Asn Ala Gin Ala Gin Gin Thr Thr Leu

120

125

Ser

Leu

Ala

Ile

Phe

Tyr

Val

Glu

Gly

Ser

Pro

Gly

Glu

130

135

140

Pro

Ser

Gly

Pro

Ile

Ser

Thr

Ile

Asn

Pro

Ser

Pro

Ser

Lys

Glu

145

150

155

160

Ser

His

Lys

Ser

Pro

Asn

Met

Ala

Thr

Glh

Asp

Cys

Ser

Phe

Gin

His

165

170

175

Ser

Pro

Ile

Ser

Asp

Phe

Ala

Val

Lys

Ile

Arg

Glu

Leu

Ser

Asp

180

185

-190

Tyr

Leu

Gin

Asp

Tyr

Pro

Val

Thr

Val

Ala

Ser

Asn

Leu

Gin

Asp

195

200

205

Glu

Leu

Cys

Gly

Ala

Leu

Trp

Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Gin

Arg

Trp

210

215

220

Met

Glu

Arg

Leu

Lys

Thr

Val

Ala

Gly

Ser

Lys

Met

Gin

Gly

Leu

225

230

235

240

Glu

Arg

Val

Asn

Thr

Glu

Ile

His

Phe

Val

Thr

Lys

Cys

Ala

Phe

Gin

245

250

255

Pro

Ser

Cys

Leu

Arg

Phe

Val

Gin

Thr

Asn

Ile

Ser

Arg

Leu

260

265

270

Leu

Gin

Glu

Thr

Ser

Glu

Gin

Leu

Val

Ala

Leu

Lys

Pro

Trp

Ile

Thr

275

280

285

Arg

Gin

Asn

Phe

Ser

Arg

Cys

Leu

Glu

Leu

Gin

Cys

Gin

Pro

290

295

300

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:64:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 407 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č:64:

CCATGGCTAA CTGCTCTATA ATGATCGATG AAATTATACA TCACTTAAAG AGACCACCTG 60

CACCTTTGCT GGACCCGAAC AACCTCAATG ACGAAGACGT CTCTATCCTG ATGGATCGAA 120

ACCTTCGACT TCCAAACCTG GAGAGCTTCG TAAGGGCTGT CAAGAACTTA GAAAATGCAT 180

CAGGTATTGA GGCAATTCTT CGTAATCTCC AACCATGTCT GCCCTCTGCC ACGGCCGCAC 240

CCTCTCGACA TCCAATCATC ATCAAGGCAG GTGACTGGCA AGAATTCCGG GAAAAACTGA 300 CGTTCTATCT GGTTACCCTT GAGCAAGCGC AGGAACAACA GTACGTAGAG GGCGGTGGAG 360

GCTCCCCGGG TGGTGGTTCT GGCGGCGGCT CCAACATGTA AGGTACC

407 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č:65:

(i) POPIS SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 452 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘEŤEZCÚ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

• ·

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č: 65:

CCATGGCTAA 60 CACCTTTGCT	CTGCTCTATA	ATGATCGATG	AAATTATACA	TCACTTAAAG	AGACCACCTG
GGACCCGAAC	AACCTCAATG	ACGAAGACGT	CTCTATCCTG	ATGGATCGAA
120 ACCTTCGACT	TCCAAACCTG	GAGAGCTTCG	TAAGGGCTGT	CAAGAACTTA	GAAAATGCAT
180 CAGGTATTGA	GGCAATTCTT	CGTAATCTCC	AACCATGTCT	GCCCTCTGCC	ACGGCCGCAC
240 CCTCTCGACA	TCCAATCATC	ATCAAGGCAG	GTGACTGGCA	AGAATTCCGG	GAAAAACTGA
300 CGTTCTATCT	GGTTACCCTT	GAGCAAGCGC	AGGAACAACA	GTACGTAGAG	GGCGGTGGAG
360 GCTCCCCGGG	TGAACCGTCT	GGTCCAATCT	CTACTATCAA	CCCGTCTCCT	CCGTCTAAAG

420

AATCTCATAA ATCTCCAAAC ATGTAAGGTA CC

Claims

1. Chimérický protein obsahující flt3 agonistů.

fe.

&

r

2. Chimérický protein obsahující polypeptid vzorce zvoleného ze skupiny vzorcůsestávající z: Ri-L- R2, R2-L- Ri, R,- R2, R2-R1, Met-Ala-Rj-L- R2, Met-Ala-R2-L- Rj, Met-Ala-Ri-R2, MetAla-Rr Ri, Met -Ri-L- R2, Met-R2-L- Ri, Met -R_r R₂, Met-R₂-Ri, Ala-Ri-L- R2, Ala-Rz-L- R_bAla-Ri-Rž, Ala-Rí-Ri;

kde Ri je flt3 ligand;

R2 je hematopoietický růstový faktor a L je spojovník schopný spojovat Ri a R2.

3. Chimérický protein podle nároku 2, kde hematopoietický růstový faktor je zvolen ze skupiny sestávající se z:

GM-CSF, G-CSF, G-CSF Serl7, c-mpl ligand, M-CSF, EPO, IL-1, IL-4, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, LIF, flt3 ligand, růstový faktor Bbuněk, diferenciační faktor B-buněk, diferenciační faktor eosinofilů, SCSF, SDF-1 a SCF.

4. Chimérický protein podle nároku 3, kde hematopoietický růstový faktor je zvolen ze skupiny sestávající z: G-CSF, G-CSF Ser¹⁷.

5. Chimérický protein podle nároku 4, kde hematopoietický růstový faktor je zvolen ze skupiny sestávající z:

proteinu majícího sekvenci SEQ ID Č.: 9;

proteinu majícího sekvenci SEQ ID Č.: 11;

proteinu majícího sekvenci SEQ ID Č.: 38;

proteinu majícího sekvenci SEQ ID Č.: 40; a proteinu majícího sekvenci SEQ ID Č.: 41.

6. Chimérický protein podle nároku 3, kde hematopoietický růstový faktor je GM-CSF.

7. Chimérický protein podle nároku 3, kde hematopoietický růstový faktor je EPO.

'

8. Chimérický protein podle nároku 7 vybraný ze skupiny sestávající z:

í ř

proteinu majícího sekvenci SEQ ID Č.: 48; a proteinu majícího sekvenci SEQ ID Č.: 49.

9. Chimérický protein podle nároku 3, kde hematopoietický růstový faktor je flt3 ligand.

10. Chimérický protein podle nároku 9, mající sekvenci SEQ ID Č.: 39.

11. Chimérický protein podle nároku 3, kde hematopoietický růstový faktor je c-mpl ligand.

12. Chimérický protein podle nároku 11, vybraný ze skupiny sestávající z:

proteinu majícího sekvenci SEQ ID Č.: 46; a proteinu majícího sekvenci SEQ ID Č.: 47.

13. Chimérický protein podle nároku 3, kde hematopoietický růstový faktor je IL-3 ligand.

14. Chimérický protein podle nároku 13 vybraný ze skupiny sestávající z:

proteinu majícího sekvenci SEQ ID Č.: 62; a proteinu majícího sekvenci SEQ ID Č.: 63.

15. Farmaceutická směs obsahující chimérické proteiny podle nároků 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, nebo 14 a farmaceuticky přijatelný nosič.

16. Farmaceutická směs obsahující chimérické proteiny podle nároků 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, nebo 14 a hematopoietický růstový faktor a farmaceuticky přijatelný nosič.

17. Farmaceutická směs podle nároku 16, kde hematopoietický růstový faktor je zvolen ze skupiny sestávající z:

GM-CSF, G-CSF, G-CSF Ser 17, c-mpl ligand, M-CSF, EPO, IL-1, IL-4, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, LIF, £Lt3 ligand, růstový faktor Bbuněk, diferenciační faktor B-buněk, diferenciačm faktor eosinofilů, SCSF, SDF-1 a SCF.

18. Molekula nukleové kyseliny kódující chimérický protein podle nároku 1.

9 9 9

999 999

99 ·« • · 9 9

19. Molekula nukleové kyseliny kódující chimérický protein podle nároku 2.

20. Molekula nukleové kyseliny kódující chimérický protein podle nároku 3.

21. Molekula nukleové kyseliny kódující chimérický protein podle nároku 4.

22. Molekula nukleové kyseliny kódující chimérický protein podle nároku 5.

23. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 22 zvolené ze skupiny sestávající z: DNA sekvence mající sekvenci SEQ ID Č.: 10;

DNA sekvence mající sekvenci SEQ ID Č.: 12;

DNA sekvence mající sekvenci SEQ ID Č.: 17;

DNA sekvence mající sekvenci SEQ ID Č.: 19; a

DNA sekvence mající sekvenci SEQ ID Č.: 20.

24. Molekula nukleové kyseliny kódující chimérický protein podle nároku 6.

25. Molekula nukleové kyseliny kódující chimérický protein podle nároku 7.

26. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 25 zvolené ze skupiny sestávající z: DNA sekvence mající sekvenci SEQ ID Č.: 27; a

DNA sekvence mající sekvenci SEQ ID Č.: 28.

27. Molekula nukleové kyseliny kódující chimérický protein podle nároku 9.

28. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 27 mající DNA sekvenci SEQ ID Č.: 18.

29. Molekula nukleové kyseliny kódující chimérický protein podle nároku 11.

30. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 29 zvolené ze skupiny sestávající z: DNA sekvence mající sekvenci SEQ ID Č.: 25; a

DNA sekvence mající sekvenci SEQ ID Č.: 26.

·· ·· ř ί t80 • · · ·

31. Molekula nukleové kyseliny kódující chimérický protein podle nároku 13.

32. Způsob výroby chimérických proteinů zahrnující: kultivaci hostitelských buněk transferovaných nebo transformovaných replikovatelným vektorem za vhodných podmínek výživy, kde vektor obsahuje molekuly nukleových kyselin podle nároků 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, nebo 31 tak, že umožňuje expresi chimérických proteinů a jejich získání.

33. Způsob zvýšení výroby hematopoietických buněk v organismu savců využívající podávání farmaceuticky účinného množství chimérického proteinu podle nároků 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12,13,14.

34. Způsob zvýšení výroby hematopoietických buněk v organismu savců využívající podávání farmaceuticky účinného množství směsi podle nároku 15.

35. Způsob zvýšení výroby hematopoietických buněk v organismu savců využívající podávání farmaceuticky účinného množství směsi podle nároku 16.

36. Způsob zvýšení výroby hematopoietických buněk v organismu savců využívající podávání farmaceuticky účinného množství směsi podle nároku 17.

v í¹·

In

37. Způsob ex-vivo expansi kmenových buněk zahrnující následující kroky:

(a) kultivaci kmenových buněk ve zvoleném růstovém médiu obsahujícím chimérické proteiny podle nároků 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11, 12,13 a 14; a (b) sklízení kultivovaných kmenových buněk.

38. Způsob zvýšení výroby hematopoietických buněk v organismu savců využívající podávání farmaceuticky efektivního množství expandovaných kmenových buněk podle nároku 37.

39. Způsob genové terapie lidí, zahrnující kroky:

(a) odebrání kmenových buněk pacientovi, nebo dárci (b) kultivace kmenových buněk ve zvoleném růstovém médiu obsahujícím chimérické proteiny podle nároků 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12,13a 14; .

í ¹ ·· ·· » · · ι • · 4 ·· · · ·· ·· ·· » · · · » · · · ··· .··· ·· (c) transdukce DNA do kultivovaných buněk;

(d) sklízení transdukováných buněk; a (e) transplantace transdukovaných buněk pacientovi.