KR100456212B1 - 다기능성조혈수용체아고니스트 - Google Patents

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KR100456212B1 KR10-1998-0702547A KR19980702547A KR100456212B1 KR 100456212 B1 KR100456212 B1 KR 100456212B1 KR 19980702547 A KR19980702547 A KR 19980702547A KR 100456212 B1 KR100456212 B1 KR 100456212B1
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바바라 큐레 클레인
스테븐 씨. 리
찰즈 에이. 맥웨르터
주디스 지. 기리
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Abstract

신규한 다기능성 조혈 수용체 아고니스트 단백질, 다기능성 조혈 수용체 아고니스트 단백질을 코딩하는 DNA, 다기능성 조혈 수용체 아고니스트 단백질의 제조방법 및 다기능성 조혈 수용체 아고니스트 단백질의 사용방법이 기술된다.

Description

다기능성 조혈 수용체 아고니스트{MULTI-FUNCTIONAL HEMATOPOIETIC RECEPTOR AGONISTS}
골수세포의 분화 및/또는 증식을 자극하는 콜로니형성자극인자(CSFs)는 혈액간세포유도된 세포의 약화된 레벨을 회복시키는 치료효과때문에 많은 관심을 일으켰다. 사람과 쥐계 둘 다에 있어서 CSFs는 그 활성에 따라 동정되고 구별되어왔다. 예를 들면 과립구-CSF(G-CSF) 및 마크로파지-CSF(M-CSF)는 각각 호중성 과립구 및 마크로파지 콜로니의 시험관내 형성을 자극하고, GM-CSF 및 인터루킨-3(IL-3)은 더 광범위한 활성을 갖고, 마크로파지, 호중성 및 호산성 과립구의 두 콜로니의 형성을 모두 자극한다. 또한 IL-3는 매스트, 거핵구 및 순수 및 혼합 에리스로이드 콜로니의 형성을 자극한다.
U.S. 4,877,729 및 U.S. 4,959,455에는 사람 IL-3 및 긴팔원숭이 IL-3 cDNAs 및 그것이 코딩하는 단백질서열이 기술되어있다. 기술된 hIL-3은 단백질서열의 위치 8에서 프롤린 대신 세린을 갖는다.
국제특허출원(PCT) WO 88/00598에는 긴팔원숭이- 및 사람유사 IL-3이 기술되어있다. hIL-3은 Ser8-> Pro8교체를 포함한다. 이황화결합을 끊어서 Cys을 Ser으로 교체하기 위한, 그리고 글리코실화 부위에서의 하나 이상의 아미노산을 교체하기 위한 제안이 되어있다.
U.S. 4,810,643에는 사람 G-CSF를 코딩하는 DNA서열이 기술되어있다.
WO 91/02754에는 GM-CSF 또는 IL-3 단독에 비해 증가된 생물학적 활성을 갖는 GM-CSF 및 IL-3로 이루어진 융합단백질이 기술되어있다. 또한 다기능성 조혈 수용체 아고니스트의 구성성분으로서 글리코실화되지 않은 IL-3 및 GM-CSF 아날로그 단백질이 기술되어있다.
WO 92/04455에는 IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, EPO 및 G-CSF로 이루어진 군에서 선택된, 림포카인에 융합된 IL-3으로 이루어진 융합단백질이 기술되어있다.
WO 95/21197 및 WO 95/21254에는 광범위한 다기능성 조혈 특성이 가능한 융합단백질이 기술되어있다.
GB 2,285,446은 거핵구 및 거핵구 선구체의 복제, 분화 및 성숙에 영향을 주는 것으로 보이고, 혈소판감소증 치료에 사용되는 c-mpl 리간드(트롬보포이에틴) 및 다양한 형태의 트롬보포이에틴에 관한 것이다.
EP 675,201 A1은 c-mpl 리간드거핵구 성장 및 발생인자(MGDF), c-mpl 리간드의 대립유전자성 변형물 및 폴리에틸렌글리콜과 같은 수용성 폴리머에 부착된 c-mpl 리간드에 관한 것이다.
WO 95/21920은 쥐과 및 사람 c-mpl 리간드 및 그 폴리펩티드 단편을 제공한다. 그 단백질은 혈소판 생산을 자극하기 위한 생체내 및 생체외 치료에 유용하다.
단백질 서열의 재배열
진화에 있어서, DNA 서열의 재배열은 단백질 구조 및 기능의 다양성을 발생시키는 데 중요한 역할을 제공한다. 유전자중복 및 엑손뒤섞임은 다양성을 신속히 발생시키는데 중요한 기작을 제공하고, 그것에 의해서, 특히 기초적 돌연변이율은 낮기때문에, 유기체에 경쟁적 장점을 제공한다(Doolittle,Protein Science1: 191-200, 1992).
재조합DNA법의 개발은 단백질 접힘, 구조 및 기능에 대한 서열 트랜스포지션 효과의 연구를 가능하도록 하였다. 새로운 서열의 생산에 사용된 방법은 단백질의 자연적으로 발생하는 쌍(그 아미노산 서열의 선상 재편성에 의해 관련됨)의 그것과 공통점이 있다(Cunningham, 등,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.76:3218-3222, 1979; Teather & Erfle,J. Bacteriol.172:3837-3841, 1990; Schimming 등,Eur. J. Biochem.204:13-19, 1992; Yamiuchi and Minamikawa,FEBS Lett.260:127-130, 1991; MacGregor 등,FEBS Lett.378:263-266). 이러한 형태의 단백질의 재배열의 첫번째 시험관내 적용이 Goldengerg and Creighton에 의해 기술되었다(J. Mol. Biol.165:407-413, 1983). 새로운 N-말단은 원래의의(original) 서열 내부 부위(브레이크포인트)에서 선택되고, 새로운 서열은 그것이 브레이크포인트에서부터 원래의 C-말단의 또는 그 근처의 아미노산에 도달할 때까지, 원래의과 같은 순서를 갖는다. 이 포인트에서, 새로운 서열은, 직접적이든지 추가부분의 서열(링커)을 통해서든, 원래의 N-말단의 또는 그 근처의 아미노산에 연결되고, 새로운 서열은 원래의 서열의 브레이크포인트 부위에의 N-말단이었던 아미노산의 또는 그 근처의 포인트에 도달할 때까지 원래의과 같은 서열로 계속되고, 이 잔기는 사슬의 새로운 C-말단을 형성한다.
이러한 방법은 58 내지 462 아미노산 크기에 걸친 단백질에 적용되어왔다(Goldenberg & Creighton,J. Mol. Biol.165:407-413, 1983; Li & Coffino,Mol. Cell. Biol.13:2377-2383, 1993). 시험된 단백질은 α-헬릭스(인터루킨-4; Kreitman 등,Cytokine7:311-318, 1995), β-시트(인터루킨-1; Horlick 등,Protein Eng.5:427-431, 1992), 또는 둘의 혼합물(효모 포스포리보실안트라닐레이트 이소머라제; Luger 등,Science243:206-210, 1989)을 주로 함유하는 단백질을 포함하는 광범위한 구조적 클라스를 대표하였다. 단백질 기능의 광범위한 카테고리가 이들 서열 재편성 연구에 나타나있다:
효소
이들 연구결과는 매우 다양하였다. 많은 경우에 있어서, 실질적으로 낮은 활성도, 용해도 또는 열동력학적 안정성이 관찰되었다(E.coli디히드로폴레이트 리덕타제, 아스파르테이트 트랜스카르바모일라제, 포스포리보실안트라닐레이트 이소머라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 오르니틴 디카르복실라제, omp A, 효모포스포글리세레이트 디히드로게나제). 다른 경우에 있어서, 서열재배열된 단백질은 그것의 천연 상대물과 거의 동일한 성질을 많이 갖는 것으로 나타났다(염기성췌장트립신저해제, T4 리소짐, 리보누클레아제 T1, 바실러스 β-글루카나제, 인터루킨-1β, α-스펙트린 SH3 도메인, 펩시노겐, 인터루킨-4). 예외적인 경우에 있어서, 천연 서열의 몇몇 성질을 상회하는 의외의 향상이 관찰되었는데, 예를 들면 재배열된 α-스펙트린 SH3 도메인서열에 대한 용해도 및 재접힘율, 그리고 트랜스포지션된 인터루킨-4-슈도모나스 엑소톡신 융합체분자의 수용체친화성 및 항암활성 등이 있다(Kreitman 등,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.91:6889-6893, 1994; Kreitman 등,Cancer Res.55:3357-3363, 1995).
이들 연구에 대한 일차적 동기는 단백질 접힘 및 안정성에서의 좁은 범위 및 넓은 범위의 상호작용의 역할의 연구를 하는 것이었다. 이러한 유형의 서열 재배열은 원래의 서열내의 넓은 범위인 상호작용의 하위세트를 새로운 서열내의 좁은 범위 상호작용으로, 그리고 그 반대로도 전환시킨다. 이들 서열재배열의 대부분은 적어도 얼마간의 활성이 있는 구조를 얻을 수 있다는 사실은 단백질 접힘이 복수의 접힘 경로로 발생한다는 설득력있는 증거이다(Viguera, 등,J. Mol. Biol.247:670-681, 1995). α-스펙트린의 SH3 도메인의 경우에 있어서, β-머리핀 턴에 대응하는 위치에서의 새로운 말단을 선택하는 것은 약간 더 적은 안정성을 갖는 단백질을 가져왔음에도 불구하고, 접힐 수는 없었다.
여기서 인용된 연구에서 사용된 내부적 브레이크포인트의 위치는 오로지 단백질의 표면상에서만 관찰되었고, 끝이나 중간에만 치우치지 않고 선형 서열의 전체를 통해 분산되어있다(원래의 N-말단에서부터 브레이크포인트까지의 상대적 거리의 변화량은 전체 서열길이의 약 10 내지 80%이다). 이들 연구에서의 원래의 N- 및 C-말단을 연결하는 링커는 0 내지 9 잔기범위이다. 한 경우(Yang & Schachman,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.90:11980-11984, 1993), 서열의 일부는 원래의 C-말단세그먼트로부터 삭제되었고, 끝이 잘린 C-말단으로부터 원래의 N-말단으로의 연결이 만들어졌다. Gly 및 Ser과 같은 유연한 친수성 잔기가 링커에 자주 사용된다. Viguera, 등(J. Mol. Biol.247:670-681, 1995)는 3- 또는 4-잔기 링커로 원래의 N- 및 C-말단을 결합하는 것을 비교하였는데, 3-잔기 링커가 열동력학적으로 덜 안정하였다. Protasova 등(Protein Eng.7:1373-1377, 1994)는E.coli디히드로폴레이트 리덕타제의 원래의 N-말단을 연결하는데 3- 또는 5-잔기 링커를 사용하였는데, 3-잔기 링커만이 좋은 수율로 단백질을 생산하였다.
발명의 개요
본 발명의 신규한 조혈 단백질은 다음식으로 표현된다:
R1-L1-R2, R2-L1-R1, R1-R2, 또는 R2-R1
상기 식에서 R1및 R2는 독립적으로 하기 (I), (II), (III), (IV) 또는 (V)로 구성되는 군으로부터 선택되고,
여기서 L1은 R1을 R2에 연결할 수 있는 링커이고;
단 적어도 R1또는 R2는 식 (I), (II), 또는 (III)의 폴리펩티드로부터 선택되고; 그리고
상기 조혈 단백질은 임의로 (메티오닌-1), (알라닌-1) 또는 (메티오닌-2, 알라닌-1)이 바로 앞에 올 수 있다.
(I) 다음 식의 변형된 사람 G-CSF 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
[서열 1]
상기 서열에서
위치 1의 Xaa는 Thr, Ser, Arg, Tyr 또는 Gly이고;
위치 2의 Xaa는 Pro 또는 Leu이고;
위치 3의 Xaa는 Leu, Arg, Tyr 또는 Ser이고;
위치 13의 Xaa는 Phe, Ser, His, Thr 또는 Pro이고;
위치 16의 Xaa는 Lys, Pro, Ser, Thr 또는 His이고;
위치 17의 Xaa는 Cys, Ser, Gly, Ala, Ile, Tyr 또는 Arg이고;
위치 18의 Xaa는 Leu, Thr, Pro, His, Ile 또는 Cys이고;
위치 22의 Xaa는 Arg, Tyr, Ser, Thr 또는 Ala이고;
위치 24의 Xaa는 Ile, Pro, Tyr 또는 Leu이고;
위치 27의 Xaa는 Asp 또는 Gly이고;
위치 30의 Xaa는 Ala, Ile, Leu 또는 Gly이고;
위치 34의 Xaa는 Lys 또는 Ser이고;
위치 36의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
위치 42의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
위치 43의 Xaa는 His, Thr, Gly, Val, Lys, Trp, Ala, Arg, Cys 또는 Leu이고;
위치 44의 Xaa는 Pro, Gly, Arg, Asp, Val, Ala, His, Trp, Gln 또는 Thr이고;
위치 46의 Xaa는 Glu, Arg, Phe, Arg, Ile 또는 Ala이고;
위치 47의 Xaa는 Leu 또는 Thr이고;
위치 49의 Xaa는 Leu, Phe, Arg 또는 Ser이고;
위치 50의 Xaa는 Leu, Ile, His, Pro 또는 Tyr이고;
위치 54의 Xaa는 Leu 또는 His이고;
위치 64의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
위치 67의 Xaa는 Gln, Lys, Leu 또는 Cys이고;
위치 70의 Xaa는 Gln, Pro, Leu, Arg 또는 Ser이고;
위치 74의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
위치 104의 Xaa는 Asp, Gly 또는 Val이고;
위치 108의 Xaa는 Leu, Ala, Val, Arg, Trp, Gln 또는 Gly이고;
위치 115의 Xaa는 Thr, His, Leu 또는 Ala이고;
위치 120의 Xaa는 Gln, Gly, Arg, Lys 또는 His이고;
위치 123의 Xaa는 Glu, Arg, Phe 또는 Thr이고;
위치 144의 Xaa는 Phe, His, Arg, Pro, Leu, Gln 또는 Glu이고;
위치 146의 Xaa는 Arg 또는 Gln이고;
위치 147의 Xaa는 Arg 또는 Gln이고;
위치 156의 Xaa는 His, Gly 또는 Ser이고;
위치 159의 Xaa는 Ser, Arg, Thr, Tyr, Val 또는 Gly이고;
위치 162의 Xaa는 Glu, Leu, Gly 또는 Trp이고;
위치 163의 Xaa는 Val, Gly, Arg 또는 Ala이고;
위치 169의 Xaa는 Arg, Ser, Leu, Arg 또는 Cys이고;
위치 170의 Xaa는 His, Arg 또는 Ser이고;
여기서 임의적으로 N-말단으로부터 1-11아미노산이, 그리고 C-말단으로부터 1-5 아미노산이 삭제될 수 있고;
여기서 N-말단은 C-말단에 직접, 또는 N-말단을 C-말단에 연결할 수 있고 다음 아미노산들에서 새로운 C-및 N-말단을 가질 수 있는 링커를 통해 연결된다.
(II) 다음식의 변형된 hIL-3 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
[서열 2a]
[서열 2b]
상기 서열에서 위치 17의 Xaa는 Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln 또는 Arg이고;
위치 18의 Xaa는 Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg 또는 Gln이고;
위치 19의 Xaa는 Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala 또는 Cys이고;
위치 20의 Xaa는 Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro 또는 Ala이고;
위치 21의 Xaa는 Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, Glu, Gln, Asn, Thr, Ser 또는 Val이고;
위치 22의 Xaa는 Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu, Val 또는 Gly이고;
위치 23의 Xaa는 Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, Phe, Leu, Ser 또는 Arg이고;
위치 24의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe 또는 Leu이고;
위치 25의 Xaa는 Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro 또는 Ala이고;
위치 26의 Xaa는 His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala 또는 Trp이고;
위치 27의 Xaa는 Leu, Gly, Arg, Thr, Ser 또는 Ala이고;
위치 28의 Xaa는 Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, Val 또는 Trp이고;
위치 29의 Xaa는 Gln, Asn, Leu, Pro, Arg 또는 Val이고;
위치 30의 Xaa는 Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, Ser, Leu 또는 Lys이고;
위치 31의 Xaa는 Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu 또는 Gln이고;
위치 32의 Xaa는 Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, Ala 또는 Glu이고;
위치 33의 Xaa는 Pro, Leu, Gln, Ala, Thr 또는 Glu이고;
위치 34의 Xaa는 Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, Gln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile 또는 Met이고;
위치 35의 Xaa는 Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln 또는 Val이고;
위치 36의 Xaa는 Asp, Leu 또는 Val이고;
위치 37의 Xaa는 Phe, Ser, Pro, Trp 또는 Ile이고;
위치 38의 Xaa는 Asn 또는 Ala이고;
위치 40의 Xaa는 Leu, Trp 또는 Arg이고;
위치 41의 Xaa는 Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met 또는 Pro이고;
위치 42의 Xaa는 Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, Thr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met 또는 Ala이고;
위치 43의 Xaa는 Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, Ala, Cys, Gln, Arg, Thr,Gly 또는 Ser이고;
위치 44의 Xaa는 Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, Met, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala 또는 Pro이고;
위치 45의 Xaa는 Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, Thr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, Glu 또는 His이고;
위치 46의 Xaa는 Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val 또는 Gly이고;
위치 47의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro 또는 His이고;
위치 48의 Xaa는 Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, Phe, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val 또는 Asn이고;
위치 49의 Xaa는 Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, His 또는 Asp이고;
위치 50의 Xaa는 Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, Asn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met 또는 Gln이고;
위치 51의 Xaa는 Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr 또는 His이고;
위치 52의 Xaa는 Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser 또는 Thr이고;
위치 53의 Xaa는 Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, Lys, Ser 또는 Met이고;
위치 54의 Xaa는 Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, His, Ala 또는 Leu이고;
위치 55의 Xaa는 Arg, Thr, Val, Ser, Leu 또는 Gly이고;
위치 56의 Xaa는 Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, Arg, His, Thr, Ala, Tyr,Phe, Leu, Val 또는 Lys이고;
위치 57의 Xaa는 Asn 또는 Gly이고;
위치 58의 Xaa는 Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val 또는 Cys이고;
위치 59의 Xaa는 Glu, Tyr, His, Leu, Pro 또는 Arg 이고;
위치 60의 Xaa는 Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn 또는 Thr이고;
위치 61의 Xaa는 Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg 또는 Ser이고;
위치 62의 Xaa는 Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, Asp 또는 Ile이고;
위치 63의 Xaa는 Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, Pro 또는 Val이고;
위치 64의 Xaa는 Ala, Asn, Pro, Ser 또는 Lys이고;
위치 65의 Xaa는 Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe 또는 Ser이고;
위치 66의 Xaa는 Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu 또는 Ser이고;
위치 67의 Xaa는 Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, Ile, Pro 또는 His이고;
위치 68의 Xaa는 Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, Thr 또는 His이고;
위치 69의 Xaa는 Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly 또는 Leu이고;
위치 70의 Xaa는 Asn, Leu, Val, Trp, Pro 또는 Ala이고;
위치 71의 Xaa는 Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, Thr, Gln, Trp 또는 Asn;
위치 72의 Xaa는 Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, Arg 또는 Asp이고;
위치 73의 Xaa는 Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, Thr 또는 Arg이고;
위치 74의 Xaa는 Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, Ala이고;
위치 75의 Xaa는 Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln 또는 Leu이고;
위치 76의 Xaa는 Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly 또는 Asp이고;
위치 77의 Xaa는 Ile, Ser, Arg, Thr 또는 Leu이고;
위치 78의 Xaa는 Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly 또는 Arg이고;
위치 79의 Xaa는 Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, Gly 또는 Asp이고;
위치 80의 Xaa는 Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, Glu 또는 Arg이고;
위치 81의 Xaa는 Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, Val 또는 Lys이고;
위치 82의 Xaa는 Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, Met 또는 Val이고;
위치 83의 Xaa는 Pro, Ala, Thr, Trp, Arg 또는 Met이고;
위치 84의 Xaa는 Cys, Glu, Gly, Arg, Met 또는 Val이고;
위치 85의 Xaa는 Leu, Asn, Val 또는 Gln이고;
위치 86의 Xaa는 Pro, Cys, Arg, Ala 또는 Lys이고;
위치 87의 Xaa는 Leu, Ser, Trp 또는 Gly이고;
위치 88의 Xaa는 Ala, Lys, Arg, Val 또는 Trp이고;
위치 89의 Xaa는 Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, His, Asn 또는 Ser이고;
위치 90의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, Ile 또는 Met이고;
위치 91의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Asp 또는 His이고;
위치 92의 Xaa는 Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile 또는 Leu이고;
위치 93의 Xaa는 Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, Leu 또는 Arg이고;
위치 94의 Xaa는 Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala 또는 Pro이고;
위치 95의 Xaa는 His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile 또는 Tyr이고;
위치 96의 Xaa는 Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile 또는 Thr이고;
위치 97의 Xaa는 Ile, Val, Lys, Ala 또는 Asn이고;
위치 98의 Xaa는 His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, Thr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, Tyr 또는 Pro이고;
위치 99의 Xaa는 Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, Gln, Gly, Ser, Phe 또는 His이고;
위치 100의 Xaa는 Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln 또는 Pro이고;
위치 101의 Xaa는 Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu 또는 Gln이고;
위치 102의 Xaa는 Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr 또는 Pro이고;
위치 103의 Xaa는 Asp 또는 Ser이고;
위치 104의 Xaa는 Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe 또는 Gly이고;
위치 105의 Xaa는 Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp 또는 His이고;
위치 106의 Xaa는 Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly 또는 Pro이고;
위치 108의 Xaa는 Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala 또는 Pro이고;
위치 109의 Xaa는 Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser 또는 Gly이고;
위치 110의 Xaa는 Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser 또는 Trp이고;
위치 111의 Xaa는 Leu, Ile, Arg, Asp 또는 Met이고;
위치 112의 Xaa는 Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser 또는 Phe 이고;
위치 113의 Xaa는 Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val 또는 Asp이고;
위치 114의 Xaa는 Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg 또는 Leu이고;
위치 115의 Xaa는 Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp 또는 Met이고;
위치 116의 Xaa는 Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln 또는 Ile이고;
위치 117의 Xaa는 Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys 또는 Pro이고;
위치 118의 Xaa는 Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp 또는 Tyr이고;
위치 119의 Xaa는 Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr 또는 Arg이고;
위치 120의 Xaa는 Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val 또는 Gln이고;
위치 121의 Xaa는 Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp 또는 Gly이고;
위치 122의 Xaa는 Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr 또는 Cys이고;
위치 123의 Xaa는 Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr 또는 Leu이고;
여기서 N-말단으로부터 임의로 1 내지 14 아미노산이 삭제될 수 있고/있거나 C-말단으로부터 1 내지 15 아미노산이 삭제될 수 있으며; Xaa로 표시된 아미노산의 0 내지 44는 천연(1 - 133) 사람 인터루킨-3의 대응하는 아미노산과 다르며;
여기서 N-말단은 C-말단에 직접 또는 N-말단을 C-말단에 연결할 수 있고 다음 아미노산들에서 새로운 C-말단 및 N-말단을 가질 수 있는 링커(L2)를 통해 연결된다;
(III) 다음식의 변형된 사람 c-mpl 리간드 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
[서열 3a]
[서열 3b]
상기 서열에서
위치 112의 Xaa는 삭제되거나 Leu, Ala, Val, Ile, Pro, Phe, Trp 또는 Met이고;
위치 113의 Xaa는 삭제되거나 Pho, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp 또는 Met이고;
위치 114의 Xaa는 삭제되거나 Pro, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp 또는 Met이고;
위치 115의 Xaa는 삭제되거나 Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr 또는 Asn이고;
여기서 N-말단을 C-말단에 직접, 또는 N-말단을 C-말단에 연결할 수 있고 다음 아미노산들에서 새로운 C- 및 N-말단을 가질 수 있는 링커(L2)를 통해 연결된다;
(IV) 다음식의 변형된 hIL-3 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(서열 2)
상기 서열에서 위치 17의 Xaa는 Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln 또는 Arg이고;
위치 18의 Xaa는 Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg 또는 Gln이고;
위치 19의 Xaa는 Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala 또는 Cys이고;
위치 20의 Xaa는 Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro 또는 Ala이고;
위치 21의 Xaa는 Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, Glu, Gln, Asn, Thr, Ser 또는 Val이고;
위치 22의 Xaa는 Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu, Val 또는 Gly이고;
위치 23의 Xaa는 Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, Phe, Leu, Ser 또는 Arg이고;
위치 24의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe 또는 Leu이고;
위치 25의 Xaa는 Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro 또는 Ala이고;
위치 26의 Xaa는 His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala 또는 Trp이고;
위치 27의 Xaa는 Leu, Gly, Arg, Thr, Ser 또는 Ala이고;
위치 28의 Xaa는 Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, Val 또는 Trp이고;
위치 29의 Xaa는 Gln, Asn, Leu, Pro, Arg 또는 Val이고;
위치 30의 Xaa는 Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, Ser, Leu 또는 Lys이고;
위치 31의 Xaa는 Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu 또는 Gln이고;
위치 32의 Xaa는 Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, Ala 또는 Glu이고;
위치 33의 Xaa는 Pro, Leu, Gln, Ala, Thr 또는 Glu이고;
위치 34의 Xaa는 Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, Gln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile 또는 Met이고;
위치 35의 Xaa는 Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln 또는 Val이고;
위치 36의 Xaa는 Asp, Leu 또는 Val이고;
위치 37의 Xaa는 Phe, Ser, Pro, Trp 또는 Ile이고;
위치 38의 Xaa는 Asn 또는 Ala이고;
위치 40의 Xaa는 Leu, Trp 또는 Arg이고;
위치 41의 Xaa는 Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met 또는 Pro이고;
위치 42의 Xaa는 Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, Thr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met 또는 Ala이고;
위치 43의 Xaa는 Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, Ala, Cys, Gln, Arg, Thr,Gly 또는 Ser이고;
위치 44의 Xaa는 Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, Met, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala 또는 Pro이고;
위치 45의 Xaa는 Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, Thr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, Glu 또는 His이고;
위치 46의 Xaa는 Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val 또는 Gly이고;
위치 47의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro 또는 His이고;
위치 48의 Xaa는 Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, Phe, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val 또는 Asn이고;
위치 49의 Xaa는 Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, His 또는 Asp이고;
위치 50의 Xaa는 Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lsy, Asn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met 또는 Gln이고;
위치 51의 Xaa는 Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr 또는 His이고;
위치 52의 Xaa는 Asn, His, Arg, Leu, GLy, Ser 또는 Thr이고;
위치 53의 Xaa는 Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, Lys, Ser 또는 Met이고;
위치 54의 Xaa는 Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, His, Ala 또는 Leu이고;
위치 55의 Xaa는 Arg, Thr, Val, Ser, Leu 또는 Gly이고;
위치 56의 Xaa는 Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, Arg, His, Thr, Ala, Tyr,Phe, Leu, Val 또는 Lys이고;
위치 57의 Xaa는 Asn 또는 Gly이고;
위치 58의 Xaa는 Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val 또는 Cys이고;
위치 59의 Xaa는 Glu, Tyr, His, Leu, Pro 또는 Arg이고;
위치 60의 Xaa는 Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn 또는 Thr이고;
위치 61의 Xaa는 Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg 또는 Ser이고;
위치 62의 Xaa는 Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, Asp 또는 Ile이고;
위치 63의 Xaa는 Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, Pro 또는 Val이고;
위치 64의 Xaa는 Ala, Asn, Pro, Ser 또는 Lys이고;
위치 65의 Xaa는 Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe 또는 Ser이고;
위치 66의 Xaa는 Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu 또는 Ser이고;
위치 67의 Xaa는 Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, Ile, Pro 또는 His이고;
위치 68의 Xaa는 Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, Thr 또는 His이고;
위치 69의 Xaa는 Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly 또는 Leu이고;
위치 70의 Xaa는 Asn, Leu, Val, Trp, Pro 또는 Ala이고;
위치 71의 Xaa는 Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, Thr, Gln, Trp 또는 Asn이고;
위치 72의 Xaa는 Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, Arg 또는 Asp이고;
위치 73의 Xaa는 Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, Thr 또는 Arg이고;
위치 74의 Xaa는 Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, Ala이고;
위치 75의 Xaa는 Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln 또는 Leu이고;
위치 76의 Xaa는 Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly 또는 Asp이고;
위치 77의 Xaa는 Ile, Ser, Arg, Thr 또는 Leu이고;
위치 78의 Xaa는 Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly 또는 Arg이고;
위치 79의 Xaa는 Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, Gly 또는 Asp이고;
위치 80의 Xaa는 Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, Glu 또는 Arg이고;
위치 81의 Xaa는 Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, Val 또는 Lys이고;
위치 82의 Xaa는 Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, Met 또는 Val이고;
위치 83의 Xaa는 Pro, Ala, Thr, Trp, Arg 또는 Met이고;
위치 84의 Xaa는 Cys, Glu, Gly, Arg, Met 또는 Val이고;
위치 85의 Xaa는 Leu, Asn, Val 또는 Gln이고;
위치 86의 Xaa는 Pro, Cys, Arg, Ala 또는 Lys이고;
위치 87의 Xaa는 Leu, Ser, Trp 또는 Gly이고;
위치 88의 Xaa는 Ala, Lys, Arg, Val 또는 Trp이고;
위치 89의 Xaa는 Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, His, Asn 또는 Ser이고;
위치 90의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, Ile 또는 Met이고;
위치 91의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Asp 또는 His이고;
위치 92의 Xaa는 Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile 또는 Leu이고;
위치 93의 Xaa는 Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, Leu 또는 Arg이고;
위치 94의 Xaa는 Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala 또는 Pro이고;
위치 95의 Xaa는 His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile 또는 Tyr이고;
위치 96의 Xaa는 Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile 또는 Thr이고;
위치 97의 Xaa는 Ile, Val, Lys, Ala 또는 Asn이고;
위치 98의 Xaa는 His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, Thr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, Tyr 또는 Pro이고;
위치 99의 Xaa는 Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, Gln, Gly, Ser, Phe 또는 His이고;
위치 100의 Xaa는 Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln 또는 Pro이고;
위치 101의 Xaa는 Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu 또는 Gln이고;
위치 102의 Xaa는 Gly, Leu, Glu, Lys, Set, Tyr 또는 Pro이고;
위치 103의 Xaa는 Asp 또는 Ser이고;
위치 104의 Xaa는 Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe 또는 Gly이고;
위치 105의 Xaa는 Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile,Asp 또는 His이고;
위치 106의 Xaa는 Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly 또는 Pro이고;
위치 108의 Xaa는 Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala 또는 Pro이고;
위치 109의 Xaa는 Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser 또는 Gly이고;
위치 110의 Xaa는 Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser 또는 Trp이고;
위치 111의 Xaa는 Leu, Ile, Arg, Asp 또는 Met이고;
위치 112의 Xaa는 Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser 또는 Phe이고;
위치 113의 Xaa는 Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val 또는 Asn이고;
위치 114의 Xaa는 Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg 또는 Leu이고;
위치 115의 Xaa는 Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp 또는 Met이고;
위치 116의 Xaa는 Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln 또는 Ile이고;
위치 117의 Xaa는 Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys 또는 Pro이고;
위치 118의 Xaa는 Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp 또는 Tyr이고;
위치 119의 Xaa는 Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr 또는 Arg이고;
위치 120의 Xaa는 Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val 또는 Gln이고;
위치 121의 Xaa는 Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp 또는 Gly이고;
위치 122의 Xaa는 Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr 또는 Cys이고;
위치 123의 Xaa는 Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr 또는 Leu이고;
여기서 N-말단으로부터 임의로 1 내지 14 아미노산이 삭제될 수 있고/있거나 C-말단으로부터 1 내지 15 아미노산이 삭제될 수 있으며; Xaa로 표시된 아미노산의 0 내지 44는 천연(1 - 133) 사람 인터루킨-3의 대응하는 아미노산과 다르다;
(V) 콜로니형성자극인자.
새로운 C-말단 및 N-말단이 만들어질 수 있는, 상기 폴리펩티드(I)에서의 더욱 바람직한 브레이크포인트는; 38-39, 39-40, 40-41, 41-42, 48-49, 53-54, 54-55, 55-56, 56-57, 57-58, 58-59, 59-60, 60-61, 61-62, 62-63, 64-65, 65-66, 66-67, 67-68, 68-69, 69-70, 96-97, 125-126, 126-127, 127-128, 128-129, 129-130, 130-131, 131-132, 132-133, 133-134, 134-135, 135-136, 136-137, 137-138, 138-139, 139-140, 140-141 및 141-142이다.
새로운 C-말단 및 N-말단이 만들어질 수 있는, 상기 폴리펩티드(I)에서의 가장 바람직한 브레이크포인트는; 38-39, 48-49, 96-97, 125-126, 132-133 및 141-142이다.
새로운 C-말단 및 N-말단이 만들어질 수 있는, 상기 폴리펩티드(II)에서의 더욱 바람직한 브레이크포인트는; 28-29, 29-30, 30-31, 31-32, 32-33, 33-34, 34-35, 35-36, 36-37, 37-38, 38-39, 39-40, 66-67, 67-68, 68-69, 69-70, 70-71, 84-85, 85-86, 86-87, 87-88, 88-89, 89-90, 90-91, 98-99, 99-100, 100-101 및 101-102이다.
새로운 C-말단 및 N-말단이 만들어질 수 있는, 상기 폴리펩티드(II)에서의 가장 바람직한 브레이크포인트는; 34-35, 69-70 및 90-91이다.
새로운 C-말단 및 N-말단이 만들어질 수 있는, 상기 폴리펩티드(III) 또는 서열 256의 아미노산서열에서의 더욱 바람직한 브레이크포인트는; 80-81, 81-82, 82-83, 83-84, 84-85, 85-86, 86-87, 108-109, 109-110, 110-111, 111-112, 112-113, 113-114, 114-115, 115-116, 116-117, 117-118, 118-119, 119-120, 120-121, 121-122, 122-123, 123-124, 124-125, 125-126 및 126-127이다.
새로운 C-말단 및 N-말단이 만들어질 수 있는, 상기 폴리펩티드(III) 또는 서열 256의 아미노산서열에서의 가장 바람직한 브레이크포인트는; 81-82, 108-109, 115-116, 119-120, 122-123 및 125-126이다.
또한 본 발명의 다기능성 수용체 아고니스트는 하기 식으로 표현될 수도 있다.
(T1)a-(L1)b-X1-(L)c-X2-(L2)d-(T2)e
X1-(L)c-X2-(L)-Y1-(L)c-Y2
상기 식에서:
X1은 잔기 1에 아미노말단을 갖는 1에서 J까지의 연속된 숫자의 아미노산 잔기를 갖는 원래의 단백질의 잔기 n+1에서 J까지의 서열에 대응하는 아미노산을 포함하는 펩티드이고;
L은 임의의 링커이고;
X2는 원래의 단백질의 잔기 1에서 n까지의 아미노산서열을 포함하는 펩티드이고;
Y1은 잔기 1에 아미노말단을 갖는 1에서 K까지의 연속된 숫자의 아미노산 잔기를 갖는 원래의 단백질의 잔기 n=1에서 K까지의 서열에 대응하는 아미노산을 포함하는 펩티드이고;
Y2는 원래의 단백질의 잔기 1에서 n까지의 아미노산서열을 포함하는 펩티드이고;
L1및 L2는 임의의 펩티드 스페이서이고;
n은 1 내지 J-1 범위의 정수이고;
b, c 및 d는 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
a 및 e는 0이든지 1이고, 단 a 및 e 둘다 모두 0일 수는 없고; 그리고
T1및 T2는 단백질이다.
추가적으로 본 발명은 다기능성 조혈 수용체 아고니스트를 코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 재조합발현벡터, 관련된 미생물 발현시스템, 그리고 다기능성 조혈 수용체 아고니스트의 제조방법에 관한 것이다. 또한 발명은 다기능성 조혈 수용체 아고니스트를 함유하는 약학적 조성물, 그리고 다기능성 조혈 수용체 아고니스트의 사용방법에 관한 것이다.
본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트의 생체내 사용에 추가하여, 시험관내 사용이 환자에 주입하기 전에 골수세포 및 혈구의 활성화 및 성장을 자극하는 능력을 포함할 것으로 기대된다.
본 발명은 다기능성 조혈 수용체 아고니스트에 관한 것이다.
도 1은 단백질의 서열 재배열을 모식적으로 설명한다. 천연 단백질의 N-말단(N)과 C-말단(C)은 링커를 통해 연결되거나 직접 연결된다. 단백질은 새로운 N-말단(새로운 N) 및 새로운 C-말단(새로운 C)을 생산하는 브레이크포인트에서 열려서 새로운 선형 아미노산 서열을 갖는 단백질을 가져온다. 재배열된 분자는 선형 분자로 새로이 합성되고, 원래의 N-말단과 C-말단을 연결하는 단계 및 브레이크포인트에서 단백질이 열리는 단계로 진행하지 않는다.
도 2는 새로운 단백질 생산방법 I의 모식도를 보이고, 방법에서 천연 단백질의 원래의 N-말단과 C-말단은 링커로 연결되고, 단백질의 다른 N-말단과 C-말단이 생산된다. 보인 예에서, 서열 재배열은 원래의 단백질의 아미노산 97에 생산된 새로운 N-말단, 링커부분을 통해 아미노산 11(a.a. 1 - 10은 삭제됨)에 연결된 원래의 C-말단, 그리고 원래의 서열의 아미노산 96에 생산된 새로운 C-말단을 갖는 단백질을 코딩하는 새로운 유전자를 가져온다.
도 3은 새로운 단백질 생산방법 II의 모식도를 보이고, 방법에서 천연 단백질의 원래의 N-말단과 C-말단은 링커없이 연결되고, 단백질의 다른 N-말단과 C-말단이 생산된다. 보인 예에서, 서열 재배열은 원래의 단백질의 아미노산 97에 생산된 새로운 N-말단, 원래의 N-말단에 연결된 원래의 C-말단(a.a. 174), 그리고 원래의 서열의 아미노산 96에 생산된 새로운 C-말단을 갖는 단백질을 코딩하는 새로운 유전자를 가져온다.
도 4는 새로운 단백질 생산방법 III의 모식도를 보이고, 방법에서 천연 단백질의 원래의 N-말단과 C-말단은 링커로 연결되고, 단백질의 다른 N-말단과 C-말단이 생산된다. 보인 예에서, 서열 재배열은 원래의 단백질의 아미노산 97에 생산된 새로운 N-말단, 링커부분을 통해 아미노산 1에 연결된 원래의 C-말단(a.a. 174), 그리고 원래의 서열의 아미노산 96에 생산된 새로운 C-말단을 갖는 단백질을 코딩하는 새로운 유전자를 가져온다.
본 발명은 공유적으로 결합된 폴리펩티드들로 형성되는 다기능성 조혈 수용체 아고니스트를 포함하고, 폴리펩티드 각각은 상이하고 특이적인 세포 수용체를 통해 작용하여 상보적 생물학적 활성을 개시한다. 조혈은 복잡한 일련의 세포적 사건을 필요로 하며, 이 사건에서 간세포는 모든 주요 계통(lineage)으로 성숙하는 세포의 큰 개체군을 연속적으로 생산한다. 그것들은 일반적으로 적어도 20가지의, 조혈증식활성을 갖는 공지의 레귤레이터이다. 이들 증식성 레귤레이터의 대부분은 시험관내적으로 하나 또는 또다른 형태의 콜로니형성을 자극할 수 있을 뿐이고, 각각의 레귤레이터로 자극된 콜로니형성의 정확한 패턴은 매우 독특하다. 콜로니 수에 의해서 또는, 더욱 중요하게는 발생하는 콜로니를 만드는 세포의 계통 및 성숙패턴에 의해 평가되는 바와 같이, 두 레귤레이터는 정확히 동일한 콜로니형성패턴을 자극하지는 않는다. 증식성 반응은 단순화된 시험관내 배양계로 가장 용이하게 분석될 수 있다. 아주 상이한 세 파라미터: 콜로니 크기 변화, 콜로니 수 변화 및 세포 계통이 구분될 수 있다. 둘 이상의 인자가 선구체 세포에 대해 작용하여 많은 수의 자손의 형성을 유도하고, 이것에 의해 콜로니 크기를 증가시킨다. 한 인자에 배타적으로 반응하는 선구체 세포의 별개의 하위세트가 존재하기 때문이든지, 또는 몇몇의 선구체가, 반응할 수 있기 전에 둘 이상의 인자에 의한 자극을 필요로 하기 때문에, 둘 이상의 인자는 증가된 수의 선구체 세포가 증식하도록 허용한다. 초기에 다른 시그날경로를 핵에 도달하는 공통의 최종 경로에 합체시키는 것 때문에, 둘 이상의 인자의 사용에 의한 세포에 대한 추가적 수용체의 활성화는 유사분열 시그날을 강화하는 듯하다(Metcalf,Nature339:27, 1989). 기타 기작은 공동작용을 설명할 수 있을 것이다. 예를 들면 한 시그날링경로가 제2인자로 말미암는 추가적 시그날링경로의 중간작용에 의해 제한되면, 이것은 부가반응을 가져온다. 몇몇의 경우에 있어서, 한 수용체 형태의 활성화는 기타 수용체의 강화된 발현을 유도할 수 있다(Metcalf,Blood82:3515-3523, 1993). 둘 이상의 인자는 단일 인자의 그것과 다른 패턴의 세포 계통을 가져온다. 다기능성 조혈 수용체 아고니스트의 사용은 어떤 단일 인자에 의해서는 불가능한 증식성 반응으로부터 결과되는 잠재적 임상적 장점을 갖는다. 조혈 및 기타 성장인자의 수용체는 관련된 단백질의 별개의 두 종류: (1) 표피성장인자, M-CSF(Sherr,Blood75:1, 1990) 및 SCF(Yarden 등,EMBO J.6:3341, 1987)을 포함하는 티로신 키나제 수용체: 그리고 (2) 티로신 키나제 도메인은 포함하지 않고, 그것들의 세포외 도메인내에서 명백한 상동성을 나타내는 조혈 수용체(Bazan,PNAS USA87:6934-6938, 1990)로 나뉠 수 있다. 에리스로포이에틴(EPO)(D'Andrea 등,Cell57:277, 1989), GM-CSF(Gearing 등,EMBO J.8:3667, 1989), IL-3(Kitamura 등,Cell66:1165, 1991), G-CSF(Fukunaga 등,J. Bio. Chem.265:14008-15, 1990), IL-4(Harada 등,PNAS USA87:857, 1990), IL-5(Takaki 등,EMBO J.9:4367, 1990), IL-6(Yamasaki 등,Science241:825, 1988), IL-7(Goodwin 등,Cell60:941-51, 1990), LIF(Gearing 등,EMBO J.10:2839, 1991) 및 IL-2(Cosman 등,Mol-Immunol. 23:935-94, 1986)가 후자의 군에 포함된다. 수용체의 후자의 군의 대부분은 높은 친화성 형태로, 헤테로다이머로서 존재한다. 리간드 결합후, 특정 α-사슬이 적어도 하나의 다른 수용체 사슬(β-사슬, γ-사슬)과 결합된다. 이들 인자의 대부분은 일반적 수용체 하위유니트를 공유한다. GM-CSF, IL-3 및 IL-5에 대한 α-사슬은 동일한 β-사슬(Kitamura 등,Cell66:1165, 1991)(Takaki 등,EMBO J.10:2833-8, 1991)을 공유하고, IL-6, LIF 및 IL-11에 대한 수용체 복합체는 일반적 β-사슬(gp130)(Taga 등,Cell58:573-81, 1989; Gearing 등,Science255:1434-7, 1992)을 공유한다. IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 및 IL-15의 수용체 복합체는 일반적 γ-사슬(Kondo 등,Science262:1874, 1993; Russell 등,Science266:1042-1045, 1993; Noguchi 등,Science262:1877, 1993; Giri 등,EMBO J.13:2822-2830, 1994)을 공유한다.
또한 복합적으로 작용하는 조혈인자의 사용은 인자생산 세포 및 그것들의 유도시스템에 대한 요구사항을 감소시키는 것에 의한 잠재적 장점이 있다. 인자를 생산하기 위한 세포의 능력에 한계가 있다면, 각 인자의 요구되는 농도를 낮추는 것과, 그것들을 조합하여 사용하는 것에 의해서 인자생산 세포에 대한 요구사항을 유용하게 감소시킨다. 복합적으로 작용하는 조혈인자의 사용은 인자의 필요량을 낮추어 아마도 불리한 부작용의 가능성을 감소시킨다.
본 발명의 신규한 화합물은 다음으로 이루어지는 군에서 선택되는 식으로 표시된다.
R1-L1-R2, R2-L1-R1, R1-R2, 및 R2-R1
여기서 R1및 R2는 상기한 바와 같다.
바람직하게는 R2는 R1과는 다른 활성이지만 상보적인 활성을 갖는 콜로니형성자극인자이다. 상보적 활성은 또다른 세포 모듈레이터에 대한 반응을 강화하거나 변화시키는 활성을 의미한다. R1폴리펩티드는 직접이든지 아니면 링커세그먼트를 통해서 R2폴리펩티드에 연결된다. 용어 "직접"은 다기능성 조혈 수용체 아고니스트에서 폴리펩티드가 펩티드링커없이 연결되는 것을 의미한다. 따라서 L1은 화학결합 또는 폴리펩티드 세그먼트를 의미하고, 이것에 R1및 R2둘다 프레임내에서 연결되며, 가장 일반적으로는 L1은 선형 펩티드이고, R1의 카르복시말단을 L1의 아미노말단에 연결하고 L1의 카르복시말단을 R2의 아미노말단에 연결하는 아미드결합에 의해, R1및 R2가 이 선형펩티드에 연결된다. "프레임내에서 연결된"은 R1및 R2를 코딩하는 DNA의 판독프레임들 사이에 번역 종결 또는 방해가 없음을 의미한다.
기타 성장인자, 즉 콜로니형성자극인자(CSFs)의 비한정적 목록은 사이토킨, 림포카인, 인터루킨, 조혈성장인자이고, 이들은 (I), (II) 또는 (III)에 연결될 수 있고, GM-CSF, G-CSF, c-mpl 리간드(TPO 또는 MGDF로도 공지됨), M-CSF, 에리스로포이에틴(EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, LIF, flt3/flk2 리간드, 사람성장호르몬, B-세포성장인자, B-세포분화인자, 호산성분화인자 및 간세포인자(SCF)(스틸인자 또는 c-키트리간드로도 공지됨)을 포함한다. 추가적으로 본 발명은 변형된 R1또는 R2분자의 사용 또는 이들 R1또는 R2분자를 코딩하는 변이되거나 변형된 DNA서열의 사용을 포함한다. 또한 본 발명은 R1또는 R2가 hIL-3 변이체, c-mpl 리간드 변이체, 또는 G-CSF 변이체인 다기능성 조혈 수용체 아고니스트를 포함한다. "hIL-3 변이체"는 본 분야 공지의 기타 변이체뿐만 아니라 WO 94/12638, WO 94/12639 및 WO 95/00646에 기술된 바와 같이 아미노산 치환 및/또는 결실된 hIL-3의 부분을 갖는 hIL-3 분자로 정의된다. "c-mpl 리간드 변이체"는 본 분야 공지의 기타 변이체뿐만 아니라미국 출원번호 08/383,035에 기술된 바와 같이 아미노산 치환 및/또는 결실된 c-mpl 리간드의 부분을 갖는 c-mpl 리간드 분자로 정의된다. "G-CSF 변이체"는 본 기술 공지의 기타 변이체뿐만 아니라 여기에 기술된 바와 같이 아미노산 치환 및/또는 결실된 G-CSF의 부분을 갖는 G-CSF 분자로 정의된다.
연결기(L1)는 일반적으로 1 내지 500 아미노산 길이의 폴리펩티드이다. 두분자를 연결하는 링커는 바람직하게는 (1) 두 분자가 접히도록 하고 서로에 독립적으로 작용하고, (2) 두 단백질의 기능적 도메인과 충돌할 수 있는 정렬된 2차구조를 전개시키는 경향이 없고, (3) 기능성 단백질 도메인과 상호작용할 수 있는 최소한의 소수성 성질을 갖고, 그리고 (4) R1및 R2가 그들의 상응하는 수용체와 단일 세포에 대해 동시에 상호작용할 수 있도록 R1및 R2의 입체적 분리를 제공하도록 설계된다. 유연한 단백질 부분에서의 표면 아미노산은 전형적으로 Gly, Asn 및 Ser을 포함한다. 사실상 Gly, Asn 및 Ser을 포함하는 아미노산서열의 어떤 교환은 링커 서열에 대한 상기 표준을 만족할 것으로 기대될 것이다. Thr 및 Ala와 같은 기타 중성 아미노산도 링커 서열로 사용된다. 다기능성 조혈 수용체 아고니스트의 구성을 용이하게 하기 위한 링커 서열내에 독특한 제한부위의 첨가에 의해, 추가적인 아미노산이 링커에 포함될 수도 있다.
본 발명의 바람직한 L1링커는 다음 식의 군으로부터 선택된 서열을 포함한다:
[서열 4]
(Gly3Ser)n
[서열 5]
(Gly4Ser)n
[서열 6]
(Gly5Ser)n
[서열 7]
(GlynSer)n
또는
[서열 8]
(AlaGlySer)n
고도로 유연한 링커의 일례는 섬유상 박테리오파지, 예를 들면 박테리오파지 M13 또는 fd의 pIII 단백질내에 존재하는 글리신 및 세린이 풍부한 스페이서부분이다(Schaller 등,PNAS USA72:737-741, 1975). 이러한 부분은 pIII 표면 단백질의 두 도메인 사이에 길고, 유연한 스페이서부분을 제공한다. 스페이서부분은 다음 아미노산 서열로 이루어진다:
[서열 9]
본 발명은 또한 엔도펩티다제 인식서열이 포함되어있는 링커도 포함한다. 그러한 절단부위는 다기능성 조혈 수용체 아고니스트의 개별적 구성성분을 분리하여 그것들이 적절히 접히고 시험관내 활성인지를 측정하기 위해서 유용하다. 다양한 엔도펩티다제의 예는 플라스민, 엔테로키나제, 칼리크레인, 유로키나제, 조직 플라스미노겐 액티베이터, 클로스트리페인, 키모신, 콜라게나제, Russell의 독사 독액프로테아제, 포스트프롤린 절단효소, V8 프로테아제, 트롬빈 및 인자 Xa를 포함하지만 이들에 제한되지는 않는다.
중쇄 면역글로불린 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE의 힌지부분으로부터의 펩티드링커 세그먼트는 부착된 폴리펩티드사이에 각을 이룬 관계를 제공한다. 시스테인이 세린으로 대체된 이들 힌지부분이 특히 유용하다. 본 발명의 바람직한 링커는 시스테인이 세린으로 바뀐 쥐과 IgG 감마 2b 힌지부분으로부터 유도된 서열을 포함한다. 이들 링커는 또한 엔도펩티다제 절단부위도 포함한다. 그러한 링커의 예는 다음 서열을 포함한다:
[서열 10]
및
[서열 11]
그러나 본 발명은 사용된 링커 서열의 형태, 크기 또는 수에 제한되지 않고, 링커의 필요사항은 단지, 다기능성 조혈 수용체 아고니스트의 개별적 분자의 접힘 및 기능과 기능적으로 충돌하지 않는다는 것이다.
링커 L 2 의 결정
R1및/또는 R2에서 사용될 링커 L2의 아미노산서열의 길이는 경험적으로 또는 구조 정보로부터의 가이드에 의해서, 또는 두 방법의 조합을 이용하여 선택될 수 있다.
구조정보가 유용하지 않을 때, 그 길이를 0 내지 50Å 범위에 있도록 다양화시키며 표면노출이 일치하도록 그 서열이 선택되는 설계(친수성, Hopp & Woods, Mol.Immunol.20:483-489, 1983, Kyte & Doolittle,J. Mol. Biol.157:105-132; 용매에 노출된 표면적, Lee & Richards,J. Mol. Biol.55:379-400, 1971)와 R1또는 R2의 구조를 혼란시키지 않고 필요 구조를 채용하는 능력(구조적으로 유연함; Karplus & Schulz,Naturwissenschaften72:212-213, 1985)을 사용하여 시험을 위해 링커의 작은 시리즈를 제조할 수 있다. 번역의 평균이 잔기당 2.0 내지 3.8 Å인 것으로 가정하면, 이것은 시험할 길이는 0 내지 30잔기, 바람직하게는 0 내지 15잔기일 것이라는 것을 의미할 것이다. 그러한 경험적 시리즈의 예는 n회 반복된
[서열 12]
Gly-Gly-Gly-Ser
(여기서 n은 1, 2, 3 또는 4)과 같은 카세트서열을 사용하여 링커를 구성하는 것일 것이다. 본 분야의 당업자는 과다하게 길거나 짧지 않다는 일차적 요건을 갖춘 링커로서 제공될 수 있는 길이나 조성이 다른 그러한 서열이 많이 있음을 인식할 것이고(비교, Sandhu,Critical Rev. Biotech.12:437-462, 1992); 만약 그것들이 너무 길다면, 엔트로피 효과는 3차원 접힘을 불안정하게 할 수 있을 것이고,또한 접힘을 동력학적으로 실행불능하게 하고, 그리고 만약 그것들이 너무 짧다면, 그것들은 비틀림 또는 입체적 변형때문에 분자를 아마도 불안정하게 할 것이다.
단백질 구조정보의 분석의 숙련자는 c-알파탄소간 거리로 정의되는 사슬단부간 거리가 사용될 서열의 길이를 정의하기 위해서, 또는 적어도 링커의 경험적 선택에서 시험되어야 할 가능성의 수를 제한하기 위해서 이용될 수 있음을 인식할 것이다. 또한 그들은, 폴리펩티드 사슬의 단부의 위치가 x-선 회절 또는 핵자기공명분광데이터로부터 유도된 구조모델에서 잘못 규정되는 경우가 종종 있으며, 그리고 이것이 사실일 때, 이 상황은 따라서 필요한 링커의 길이를 적절히 산정하기 위해서 고려될 필요가 있을 것이라는 것을 인식할 것이다. 위치가 잘 규정된 이들 잔기들로 부터 서열상 사슬단부에 가까운 두 잔기가 선택되고, 그것들의 c-알파탄소들간의 거리는 그들간의 링커에 대한 대략적 길이를 계산하기위해 이용된다. 계산된 길이를 지침으로 이용하면, 잔기수의 범위를 갖는 링커(잔기당 2 내지 3.8 Å을 이용하여 계산됨)가 선택된다. 이들 링커는 원래의 서열로, 필요에 따라 짧거나 길게 하여 이루어지고, 길게 할 때의 추가적 잔기는 상기한 바와 같이 유연성이고 친수성이도록 선택하거나; 임의로 원래의 서열은 링커의 시리즈를 사용을 위해 치환하거나(일례로는 상기한 Gly-Gly-Gly-Ser(서열 12) 카세트 방법); 또는 임의로 원래의 서열과 적절한 총길이를 갖는 새로운 서열의 조합을 사용한다.
R 1 및 R 2 의 아미노 및 카르복실말단의 측정
접힘하여 생물학적 활성상태로 될 수 있는 R1및 R2의 서열은 상기한 바와같은 링커서열 L2를 사용하면서 시작(아미노말단) 및 끝(카르복실말단)위치를 원래 폴리펩티드 사슬중에서 선택하는 것에 의해 제조할 수 있다. 아미노 및 카르복실말단은 하기한 가이드를 이용하여, 브레이크포인트 부분으로 일컬어지는 서열의 공통적 신장물(stretch) 중에서 선택된다. 따라서 동일한 브레이크포인트 부분 중에서 아미노 및 카르복실말단을 선택하는 것에 의해 신규한 아미노서열이 생산된다. 많은 경우에 있어서, 카르복실말단의 원래 위치가 아미노말단의 그것의 바로 앞에 오도록 새로운 말단을 선택한다. 그러나 본 분야의 당업자는 부분 중에서 어느 곳에서도 말단의 선택이 기능하고, 이들이 결실이든지, 또는 새로운 서열의 아미노 또는 카르복실부분에의 결실이나 아니면 첨가를 효과적으로 유도할 것이라는 것을 인식할 것이다.
분자생물학의 중심사상은 단백질의 일차적 아미노산서열은 그것의 생물학적 기능의 표현을 위해 필요한 3차원 구조로 접힘하는 것을 지시한다는 것이다. 단일 단백질 결정의 x-선 회절 또는 단백질 용액의 핵자기공명분광을 이용하여 3차원구조 정보를 얻고 해석하기 위한 방법은 본 분야의 당업자에게 공지되어있다. 브레이크포인트 부분의 동정에 관련된 구조정보의 예는 단백질 2차구조의 위치 및 형태(알파 및 3-10 헬릭스, 평행 및 역평행 베타시트, 사슬 역전 및 회전, 및 루프; Kabsch & Sander,Biopolymers22:2577-2637, 1983), 아미노산잔기의 용매 노출정도, 잔기간의 상호작용의 정도 및 형태(Chothia,Ann. Rev. Biochem.53:537-572, 1984) 및 폴리펩티드 사슬을 따른 구성의 정적 및 동적 분포(Alber & Mathews,Methods Enzymol.154:511-533, 1987)를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 잔기의 용매 노출에 대해 추가정보가 알려져있는데, 일례로 반드시 단백질의 표면에 있는 탄수화물의 번역후 부착의 부위이다. 실험적 구조정보를 입수할 수 없거나, 얻을 수 없을 것 같을 때, 단백질 3차 및 2차구조, 용매 접촉도 및 회전 및 루프의 발생의 예언을 하기 위해서 일차적 아미노산 서열을 분석하는 방법도 유용하다. 직접적인 구조적 방법이 실행불가능할 때 표면노출을 경험적으로 측정하기 위해 종종 생화학적 방법을 적용할 수도 있고; 예를 들면 사슬절단 부위의 동정에 이어서 표면노출을 추론하기 위한, 제한된 단백질분해를 이용하는 것이다(Gentile & Salvatore,Eur. J. Biochem.218:603-621, 1993). 따라서 실험적으로 유도된 구조정보나 예측 방법(예를 들면 Srinivisan & RoseProteins: Struct., Funct. & Genetics,22:81-99, 1995)을 이용하여, 친아미노산서열을 조사하여 부분이 2차 및 3차 구조의 유지에 반드시 필요한지 아닌지에 따라 부분을 구별하였다. 주기적 2차 구조(알파 및 3-10헬릭스, 평행 및 역평행 베타시트)에 포함되는 것으로 알려진 부분내에서의 서열의 존재는 회피되어야할 부분이다. 유사하게, 낮은 용매노출 정도를 갖는 것으로 관찰되거나 예측되는 아미노산서열 부분은 소위 단백질의 소수성핵의 일부일 가능성이 더 많고, 또한 아미노 및 카르복실말단의 선택을 위해서 회피되어야 할 것이다. 반대로, 표면회전 또는 루프내에 있는 것으로 알려지거나 예측되는 부분, 그리고 특히 생물학적 활성에 필요하지않은 것으로 알려진 부분은 폴리펩티드 사슬의 말단의 위치에 바람직한 부위이다. 상기 기준에 기초하여 바람직한 아미노산서열의 연속적 신장부들은 브레이크포인트 부분으로 언급된다.
비공유 다기능성 조혈 성장인자
두 조혈 성장인자를 연결하기 위한 대안적 방법은 비공유 상호작용에 의한 것이다. 그러한 복합체 단백질은 다음 식중의 하나로 기술될 수 있다:
R1-C1+ R2-C2; 또는 C1-R1+ C2-R2; C1-R1+ R2-C2; 또는 C1-R1+ R2-C2.
R1및 R2는 상기한 바와 같다. 도메인 C1및 C2는 비공유적, 특이적 결합을 형성할 수 있는 전형적으로 단백질성의, 동일하거나 동일하지않은 화학구조이다. C1및 C2간의 복합체는 각 복합체에 대하여 R1및 R2간의 일대일 화학양론적 관계를 가져온다. 관련된 도메인의 예는 전사인자의 "류신 지퍼(zipper)" 도메인, 세균성 전사리프레서의 다이머화 도메인 및 면역글로불린 일정 도메인이다. 공유결합은 R1과 C1, 및 R2와 C2를 각각 연결한다. 식에 지시된 바와 같이, 도메인 C1및 C2가 그 상응하는 조혈 성장인자(R)의 N-말단이나 아니면 C-말단에 존재할 수 있다. 이들 멀티머화 도메인(C1및 C2)은 단백질의 bZIP족으로부터 유도된 것들(Abel 등,Nature341:24-25, 1989; Landshulz 등,Science240:1759-1764, 1988; Pu 등,Nuc. Acid Res.21:4348-4355, 1993; Kozarides 등,Nature336:646-651, 1988)뿐만아니라, 단백질의 헬릭스-루프-헬릭스족의 멀티머화 도메인(Abel 등,Nature341:24-25, 1989; Murre 등,Cell56:777-783, 1989; Tapscott 등,Science242:405-411, 1988; Fisher 등,Genes & Dev.5:2342-2352, 1991)도 포함한다. 본 발명의 바람직한 다기능성 조혈 수용체 아고니스트는, bZIP족 단백질 Fos 및 Jun의 류신 지퍼 다이머화 도메인과의 번역 다기능성 조혈 수용체 아고니스트로서의 그것들의 조합에 의해 다이머화된 콜로니형성자극인자를 포함한다. Jun의 류신 지퍼 도메인은 동일한 도메인과 상호작용할 수 있다. 또한 Fos의 류신 지퍼 도메인은 Jun 류신 지퍼 도메인과 상호작용하지만, 기타 Fos 류신 지퍼 도메인과는 상호작용하지 않는다. Fos 및 Jun 혼합물은 Fos-Jun 헤테로다이머를 지배적으로 형성한다. 결과적으로, 콜로니형성자극인자에 결합할 때, Jun 도메인은 호모-나 아니면 헤테로다이머의 형성을 주도하기위해 사용될 수 있다. 만약 콜로니형성자극인자 파트너 중의 하나를 Jun 류신 지퍼 도메인을 갖도록 처리하고, 다른 것을 Fos 지퍼를 갖도록 처리한다면, 헤테로다이머의 우선적 형성을 달성할 수 있다.
다기능성 조혈 수용체 아고니스트 단백질(예를 들면 폴리-His)의 정제 또는 동정을 용이하게하기 위한 추가적 펩티드 서열을 첨가할 수도 있다. 특정 모노클로날 항체에 의한 다기능성 조혈 수용체 아고니스트 단백질의 신속한 분석 및 용이한 정제를 가능하게 할 고 항원성 펩티드를 첨가할 수도 있다.
"돌연변이 아미노산서열", "돌연변이 단백질", "변이체 단백질", "뮤테인(mutein)" 또는 "돌연변이 폴리펩티드"는 아미노산 결실, 치환, 또는 이 둘다로 인해 천연 서열과 다른 아미노산 서열, 또는 천연서열로부터 계획적으로 만들어진 변이체의 누클레오티드 서열로 코딩되는 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드를 일컫는다. "천연 서열"은 야생형 또는 천연형태의 유전자 또는 단백질과 동일한 아미노산 또는 핵산서열을 일컫는다.
조혈 성장인자는 사람 조혈 선구체 세포에 의한 콜로니형성자극능력에 의해특성화될 수 있다. 형성된 콜로니는 에리스로이드, 과립구, 거핵구, 과립구 마크로파지 및 그 혼합물을 포함한다. 초기에는 영장류에서, 차후에는 사람에서 수행된 연구에서, 조혈 성장인자의 대부분은 골수기능 및 말초혈구 개체수를 치료학적으로 유익한 레벨로 회복시키는 능력을 보였다. 조혈 성장인자의 이들 생물학적 활성의 대부분 또는 모두는 시그날 트랜스덕션 및 고친화성 수용체 결합을 포함한다. 본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트는 단일 인자와 비교하여 같거나 더 큰 생물학적 활성을 갖는 것과 같은, 또는 향상된 반감기나 감소된 불리한 부작용을 갖는 것에 의한 유용한 성질 또는 이들 성질의 조합을 나타낸다.
아고니스트 활성이 거의 또는 전혀 없는 다기능성 조혈 수용체 아고니스트는 안타고니스트로서, 면역학 또는 면역치료학에서의 사용을 위한 항체의 생산을 위한 항원으로서, 유전자 프로브로서, 또는 기타 유용한 hIL-3 뮤테인을 구성하기 위해 사용되는 중간물질로서 유용할 것이다.
본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트 단백질의 생물학적 활성을 인자의존성 세포주에서의 DNA 합성에 의해서, 또는 시험관내 골수 분석에서 콜로니 형성단위를 계수함으로써 측정할 수 있다.
본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트는 단일 작동의 조혈 아고니스트에 비하여 향상된 치료적 프로파일을 갖는다. 예를 들면, 본 발명의 몇몇의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트는 부작용에 있어서 유사하거나 대응하는 증가가 없이 기타의 조혈 아고니스트에 비하여 같거나 더 큰 성장인자 활성을 갖는다.
또한 본 발명은 다기능성 조혈 수용체 아고니스트 단백질을 코딩하는 DNA 서열, 실질적으로는 유사하고 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 DNA 서열, 본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트를 코딩하는 DNA들과는 단지 유전 코드의 축퇴(degeneracy)때문에 다른 DNA 서열을 포함한다. 또한 본 발명은 돌연변이 DNA를 조립하기위해 사용된 올리고누클레오티드 중간물질과 이들 올리고누클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함한다.
본 분야에 현재 확립된 유전자공학기술(미국특허 4,935,233 및 Sambrook 등, "Molecular Cloning A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)은 본 발명의 DNA 서열의 조립에 사용된다. 그러한 한 방법은 카세트 돌연변이(Wells 등,Gene34:315-323, 1985)이고, 여기서 플라스미드 내의 코딩서열의 일부를 두 제한부위 사이의 유전자의 부분내의 소망의 아미노산 치환체를 코딩하는 합성 올리고누클레오티드로 교체한다.
소망의 유전자를 코딩하는 상보적 합성 올리고누클레오티드의 쌍을 만들고 각각에 어닐링할 수 있다. 올리고누클레오티드의 DNA 서열은, 서열로부터 치환 및/또는 삭제된 것들은 제외하고 소망의 유전자의 아미노산에 대한 서열을 코딩할 것이다.
플라스미드 DNA를 선택된 제한 엔도누클레아제로 처리하고, 이어서 어닐링된 올리고누클레오티드에 라이게이션할 수 있다. 라이게이션된 혼합물은 적절한 JM101 세포를 적절한 항생제에 저항성으로 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다. 단일 콜로니를 채취하고 소망의 유전자를 갖는 플라스미드를 동정하기 위한 제한 분석 및/또는 DNA 서열결정에 의해 플라스미드 DNA를 시험하였다.
신규의 다기능성 조혈 아고니스트의 DNA 서열들의 클로닝(여기서 그것들의 적어도 하나는 기타 콜로니형성자극인자의 DNA 서열을 갖는다)을 중간물질 벡터의 사용에 의해 달성할 수 있다. 대신에 한 유전자를 다른 유전자를 함유하는 벡터내로 직접 클로닝할 수 있다. 링커 및 어댑터를 DNA 서열을 연결하기 위해서뿐만 아니라, 손실된 서열을 교체하기 위해서도 사용할 수 있고, 여기서 제한부위는 관심있는 부분의 내부이다. 따라서 한 폴리펩티드, 펩티드 링커, 및 기타 폴리펩티드를 코딩하는 유전물질(DNA)은 세균, 효모, 곤충세포 또는 포유류 세포를 형질전환시키기 위해 사용되는 적합한 발현벡터내에 삽입된다. 형질전환된 유기체를 성장시키고 표준 기술로 단백질을 분리한다. 따라서 결과의 생산물은 링커부분에 의해 제2콜로니형성자극인자에 연결된 콜로니형성자극인자를 갖는 새로운 단백질이다.
본 발명의 또다른 견해는 이들의 신규한 다기능성 조혈 수용체 아고니스트의 발현에서의 사용을 위한 플라스미드 DNA 벡터를 제공한다. 이들 벡터는 본 발명의 신규한 폴리펩티드를 코딩하는 상기의 신규한 DNA 서열을 함유한다. 다기능성 조혈 수용체 아고니스트를 발현할 수 있는 미생물을 형질전환시킬 수 있는 적절한 벡터는 사용된 숙주세포에 따라 선택된 전사 및 번역 조절서열에 연결된 다기능성 조혈 수용체 아고니스트를 코딩하는 누클레오티드 서열을 함유하는 발현벡터를 포함한다.
상기한 바와 같이 변형된 서열을 포함하는 벡터는 본 발명에 포함되고 다기능성 조혈 수용체 아고니스트 폴리펩티드의 생산에 유용하다. 또한 방법에서 사용된 벡터는 본 발명의 DNA 코딩 서열을 갖는 작동성 결합물내에, 선택된 조절서열을함유하고, 이 조절서열은 선택된 숙주세포내에서 그 전사 및 발현을 주도할 수 있다.
본 발명의 또다른 견해로는, 신규한 다기능성 조혈 수용체 아고니스트의 제조방법이 제공된다. 본 발명의 방법은 신규한 다기능성 조혈 수용체 아고니스트의 발현을 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 벡터로 형질전환된 적절한 세포 또는 세포주를 배양하는 것을 포함한다. 적절한 세포 또는 세포주는 세균세포이다. 예를 들면,E.coli의 다양한 균주가 생물공학 분야에서의 숙주세포로서 공지되어 있다. 그러한 균주의 예는E.coli균주 JM101(Yanish-Perron 등,Gene33:103-119, 1985) 및 MON105(Obukowicz 등,Applied Environmental Microbiology58:1511-1523, 1992)를 포함한다. 또한 박테리오파지 Mu에 기초한E.coli에 대한 염색체성 발현벡터를 사용하는, 다기능성 조혈 수용체 아고니스트 단백질의 발현도 본 발명에 포함된다(Weinberg 등,Gene126:25-33, 1993).B.subtillis의 다양한 균주도 본 발명에서 사용된다. 또한 본 분야의 당업자에게 공지된 효모세포의 많은 균주도 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주세포로서 유용하다.E.coli세포질내에 발현될 때, 본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트를 코딩하는 유전자는 또한 그 유전자의 5'단부에서 코돈이 첨가되어 단백질의 N-말단에서 Met-2-Ala-1- 또는 Met-1를 코딩하도록 조립될 수 있다.E.coli의 세포질내에 만들어진 단백질의 N 말단은 메티오닌 아미노펩티다제(Ben Bassat 등,J. Bac.169:751-757, 1987) 및 혹은 기타 펩티다제에 의한 번역후 처리로 영향받아 발현시 메티오닌이 N-말단으로부터 절단되어나오게 된다. 본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트는 N-말단에서 Met-1, Ala-1또는 Met-2-Ala-1을 갖는 다기능성 조혈 수용체 아고니스트 폴리펩티드를 포함한다. 또한 이들 돌연변이 다기능성 조혈 수용체 아고니스트는 분비 시그날 펩티드를 N-말단에 융합시켜E.coli내에 발현된다. 이러한 시그날 펩티드는 분비 과정의 일부로서 폴리펩티드로부터 절단된다.
또한 본 발명에 있어서의 사용에 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO)와 같은 포유류 세포가 적절하다. 외래 유전자의 포유류 세포내에서의 일반적 발현방법은 Kaufman, R.J.(1987,Genetic Engineering, Principles and Methods,Vol. 9, J. K. Setlow, editor, Plenum Press, New York)에 의해 재조사되었다. 포유류 세포내에서 작동가능한 강력한 프로모터가 진핵성 분비시그날펩티드 코딩 부분의 전사를 유도하는 발현벡터가 구성되는데, 이 프로모터는 다기능성 조혈 수용체 아고니스트에 대한 코딩 부분에 번역적으로 연결된다. 예를 들면, pcDNA I/Neo, pRc/RSV, 및 pRc/CMV와 같은 플라스미드(Invitrogen Corp., San Diego, California로부터 구입)를 사용할 수 있다. 진핵성 분비시그날펩티드 코딩 부분은 그 유전자 자체유래일 수 있거나, 또는 또다른 분비된 포유류 단백질유래일 수 있다(Bayne, M.L. 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA84: 2638-2642, 1987). 그 유전자를 함유하는 벡터의 조립후, 벡터 DNA를 포유동물세포내에 트랜스펙션시켰다. 그런 세포는 예를 들면, COS7, HeLa, BHK, CHO, 또는 마우스 L 라인일 수 있다. 세포를 예를 들면, DMEM 배지(JRH Scientific)에서 배양할 수 있다. 배지내로 분비된 폴리펩티드를, 세포의트랜스펙션 이후 또는 항생제 저항성에 대한 선택에 이은 안정한 세포주의 확립 이후 24 내지 72시간동안의 일시적 발현에 따른 표준생화학적 방법에 의해 회수할 수 있다. 적합한 포유동물숙주세포의 선택 및 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 생산물 생산 및 정제방법은 본 분야에 공지이다. 예를 들면 Gething and Sambrook,Nature,293:620-625, 1981, 또는 대신에, Kaufman 등,Mol. Cell. Biol., 5(7):1750-1759, 1985 또는 Howly 등, 미국특허 4,419,446호를 참조할 것. 또다른 적절한 포유동물 세포주는 원숭이 COS-1 세포주이다. 유사한 유용한 포유동물 세포주는 CV-1 세포주이다.
요망되는 경우, 곤충 세포를 본 발명의 방법에서 숙주세포로서 사용한다. 예를 들면 Miller 등,Genetic Engineering,8:277-298(Plenum Press 1986) 및 거기에 인용된 참고문헌을 참조할 것. 더욱이, 바쿨로바이러스(Baculovirus) 벡터를 사용하는 곤충세포내에서의 외래 유전자의 일반적 발현방법은 다음에 기술되어있다: Summers, M.D. and Smith, G.E., 1987) -A Manual of methods for Baculovirus vectors and insect cell culture procedures,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555. (폴리헤드론 프로모터와 같은)강력한 바쿨로바이러스 프로모터가, 다기능성 조혈 수용체 아고니스트에 대한 코딩 부분에 번역적으로 연결되는 진핵성 분비시그날펩티드 코딩부분의 전사를 유도하는 바쿨로바이러스 운반 벡터를 함유한 발현벡터가 조립된다. 예를 들면 플라스미드 pVL1392(Invitrogen Corp., San Diego, California로부터 구입)를 사용할 수 있다. 다기능성 조혈 수용체 아고니스트 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 갖는 벡터의 조립 이후, 이 DNA 2마이크로그램을 바쿨로바이러스 DNA 1마이크로그램(Summers & Smith, 1987 참조)으로 곤충세포, 균주 SF9내에 공동트랜스펙션시킨다. 다기능성 조혈 수용체 아고니스트를 갖는 순수한 재조합 바쿨로바이러스를 예를 들면 Excell 401 무혈청배지(JRH Biosciences, Lenexa, Kansas)내에서 배양된 세포에 감염시키기 위해 사용한다. 배지내로 분비된 다기능성 조혈 수용체 아고니스트를 표준 생화학적 방법으로 회수할 수 있다. 다기능성 조혈 수용체 아고니스트 단백질을 발현하는 포유동물 또는 곤충세포로부터의 상청액을 먼저 많은 시판 농축 유니트중의 어떤것을 사용하여 농축할 수 있다.
본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트는 조혈계의 골수, 적혈구, 임파, 또는 거핵구 세포나 아니면 그 조합의 감소된 레벨로 특성화된 질병의 치료에 유용하다. 또한 그것들은 성숙한 골수 및/또는 임파 세포를 활성화시키기 위해 사용된다. 본 발명의 폴리펩티드에 의해 치료될 수 있는 상태중에서는 말초혈액내에서 순환하는 백혈구(white cell) 수의 감소, 즉 백혈구감소증이 있다. 백혈구감소증은 특정 바이러스에의 또는 방사선에의 노출에 의해 유도된다. 그것은 종종, 예를 들면 화학요법 약품이나 방사능에의 노출과 같은 다양한 형태의 암치료의, 그리고 감염 또는 뇌출혈의 부작용이다. 본 발명의 이들 다기능성 조혈 수용체 아고니스트에 의한 백혈구감소증의 치료학적 처치는 현재에 유용한 약품에 의한 처치로 말미암는 바람직하지 않은 부작용을 회피한다.
본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트는 호중구의 치료, 그리고 예를 들면 무형성빈혈, 순환적 호중구감소증, 특발성 호중구감소증, Chediak-Higashi 증후군, 전신성 홍반성낭창(SLE), 백혈병, 척수이형성 증후군 및 골수섬유증과 같은 상태의 치료에 유용하다.
본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트는 혈소판감소증의 치료 또는 예방에 유용하다. 현재 혈소판감소증에 대한 유일한 치료는 감염(HIV, HBV) 및 동종면역의 중대한 위험을 수반하고 비용이 많이 드는 혈소판 수혈이다. 다기능성 조혈 수용체 아고니스트는 혈소판 수혈에 대한 필요를 경감하거나 감소시킨다. 심한 혈소판감소증은 Fanconi's 빈혈증, Wiscott-Aldrich, 또는 May Hegglin 증후군과 같은 유전적 결함을 가져온다. 후천성 혈소판감소증은 면역성 혈소판감소증 자반병, 전신성 홍반성낭창, 용혈성 빈혈증, 또는 태아 모성 부적합과 같은 자가- 또는 동종-항체로부터 유발된다. 또한, 비종, 전염성 혈관내 응고, 혈전성 혈소판감소 자반병, 감염 또는 인공 심장판막이 혈소판감소증을 가져온다. 또한 심한 혈소판감소증은 화학요법 및/또는 방사선 치료 또는 암으로부터 유발된다. 또한 혈소판감소증은 암, 임파종, 백혈병 또는 섬유증에 의한 골수침입으로부터 유발된다.
본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트는 말초혈액에서의 조혈 선구체 및 간세포의 유통에 유용하다. 선구체로부터 유도된 말초혈액은 환자를 자가 골수이식의 환경으로 복구하는데 유효한 것으로 보여져왔다. G-CSF 및 GM-CSF를 포함하는 조혈 성장인자는 말초혈액내의 순환성 선구체 및 간세포의 수를 증가시키는 것으로 보여져왔다. 이것은 필요한 페레시스의 수를 감소시킴으로써 말초 간세포 수집절차를 간소화하였고 절차의 비용을 극적으로 감소시켰다. 다기능성 조혈 수용체 아고니스트는 간세포의 유통에 유용하고, 말초 간세포 이식의 효율을 강화하였다.
또한 본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트는 조혈 선구체 및 간세포의 생체외 확장에 유용하다. 높은 투여량의 화학요법의 다음에 종종 그러한 치료의 결과인 호중구감소증 및 혈소판감소증을 치료하기 위해 hIL-3과 같은 콜로니형성자극인자(CSFs)는 단독으로 투여되거나, 기타 CSFs와 함께 투여되거나, 또는 골수 이식과 조합하여 투여되었다. 그러나 심한 호중구감소증 및 혈소판감소증의 주기는 완전히 제거되는 것은 아니다. 단구(마크로파지), (호중구를 포함하는)과립구 및 거핵구로 이루어진 골수 계통이 생명을 위협할 수 있는 감염 및 출혈을 예방하는데 중요하다. 또한 호중구감소증 및 혈소판감소증은 질병, 유전적 장해, 약품, 독소, 방사선 및 종래의 종양학적 치료와 같은 많은 치료학적 치료의 결과일 수도 있다.
골수 이식은 이러한 환자 개체군의 치료를 위해서 사용되어왔다. 그러나 몇몇의 문제가 다음을 포함하는 위태롭게된 조혈계를 복구하기 위한 골수의 사용과 관련되어있다: 1) 골수, 비장, 또는 말초혈액 내의 간세포수가 제한되어 있음, 2) 이식조직 대 숙주 질병, 3) 이식조직 거부반응 및 4) 종양세포의 가능한 오염. 간세포는 골수, 비장 및 말초혈액내에 매우 낮은 백분율의 유핵 세포를 만든다. 많은 수의 간세포가 조혈성 회복을 강화하도록 하는 투여량 반응이 명백히 존재한다. 따라서 간세포의 시험관내 확장은 조혈성 회복 및 환자 생존을 강화해야 한다. 동종면역 도너유래의 골수는 이식용 골수를 제공하기 위해 사용되어왔다. 그러나 이식조직 대 숙주 질병 및 이식조직 거부반응은, HLA-매칭된 자손 도너를 갖는 수용자에서 일지라도, 골수 이식을 제한한다. 동종면역 골수 이식의 대체법은 자가 골수이식이다. 자가 골수이식에 있어서, 환자의 골수의 약간을 예를 들면 높은 투여량의 화학요법인, 골수탈격(myeloablative)치료에 앞서 수확하고, 나중에 환자에게 다시 이식한다. 자가 이식은 이식조직 대 숙주 질병 및 이식조직 거부반응의 위험을 제거한다. 그러나 자가 골수 이식은 골수내에 제한된 수의 간세포 및 종양세포에 의한 가능한 오염의 관점에서 문제가 존재한다. 간세포의 제한된 수는 간세포의 생체외 확장에 의해 극복할 수 있다. 또한 골수 이식조직의 종양세포 오염을 감소시키기 위해서, CD34+와 같은 특정 표면 항원의 존재의 기초하에, 간세포를 특이적으로 분리할 수 있다.
하기하는 특허는 간세포, CD34+ 세포의 분리, 조혈인자로의 세포 배양, 조혈 장해를 갖는 환자의 치료를 위한 세포의 사용 및 세포 확장 및 유전자 치료를 위한 조혈인자의 사용에 관한 더욱 상세한 것을 포함한다.
5,061,620은 제공된 세포로부터 간세포를 분리하여 얻어진 사람 조혈 간세포를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
5,199,942는 다음을 포함하는 자가 조혈 세포이식 방법에 관한 것이다: (1) 환자로부터 조혈 선구체 세포를 얻는 것; (2) IL-3, flt3 리간드, c-kit 리간드, GM-CSF, IL-1, GM-CSF/IL-3 융합 단백질 및 그 조합으로 이루어진 군에서 선택된 성장인자에 의한 세포의 생체외 확장; (3) 환자에 세포질 조제를 투여하는 것.
5,240,856은 세포 분리 방법을 자동조절하기 위한 장치를 포함하는 세포 분리기에 관한 것이다.
WO 91/16116은 세포 혼합물로부터 목적 세포를 선택적으로 단리하고 분리하기 위한 장치 및 방법을 기술한다.
WO 91/18972는 중공사 생물반응기를 사용하여, 골수세포의 현탁물을 인큐베이팅하여 골수의 시험관내 배양을 위한 방법을 기술한다.
WO 92/18615는 이식에서의 사용을 위해 골수세포를, 사이토킨의 특정 혼합물을 함유하는 배지내에서 유지하고 확장시키는 방법에 관한 것이다.
WO 93/08268은 (a) 기타 세포로부터 CD34+간세포를 분리하는 단계 및 (b) 분리된 세포를 선별배지내에서 인큐베이팅하여 간세포를 선택적으로 확장시키도록 하는 단계를 포함하는, 간세포를 선택적으로 확장시키는 방법을 기술한다.
WO 93/18136은 말초혈액으로부터 유도된 포유동물세포의 시험관내 지지를 위한 방법을 기술한다.
WO 93/18648은 유전적 또는 후천성 호중구감소증을 치료하기 위한, 사람 호중구 전구체 세포와 높은 함유량의 골수아구 및 전골수구를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
WO 94/08039는 c-kit 단백질을 발현하는 세포의 선택에 의한 사람 조혈 간세포 풍부화 방법을 기술한다.
WO 94/11493은 역류식 일루트리에이션법을 이용하여 단리하는, CD34+이고 작은 규모의 간세포 개체군을 기술한다.
WO 94/27698은 불균일한 세포혼합물로부터 유핵의 불균일한 세포 개체군을 선택적으로 분리하기 위해서 면역친화적 분리와 연속류 원심분리를 조합한 방법에 관한 것이다.
WO 94/25848은 목적 세포의 수집 및 조작을 위한 세포 분리장치를 기술한다.
IL-1a, IL-3, IL-6 또는 GM-CSF를 함유하는 배양에서의, 사람 골수유래의 조혈 선구체 세포의 고도로 풍부화된 CD34+ 전구체의 장기간 배양이 Brandt 등J. Clin. Invest.86:932-941, 1990에 기술되어있다.
본 발명의 한 견해는 간세포의 선택적 생체외 확장 방법을 제공한다. 용어 "간세포"는 전능성 조혈 간세포 뿐만아니라, 골수, 비장 또는 말초혈액으로부터 단리할 수 있는 조기 전구체 및 선구체 세포도 일컫는다. 용어 "확장"은 세포의 분화 및 증식을 일컫는다. 본 발명은 간세포의 선택적 생체외적 확장방법을 제공하며, 이는 다음의 단계를 포함한다: (a) 기타 세포로부터 간세포를 분리하는 단계, (b) 다기능성 조혈 수용체 아고니스트 단백질(들)을 함유하는 선택적 배지로 상기의 분리된 간세포를 배양하는 단계 및 (c) 상기 간세포를 수확하는 단계. 간세포 뿐만아니라 호중구, 에리스토사이트, 혈소판 등이 될 예정인, 언급된 선구체 세포는 이들 세포 표면에 존재하는 CD34와 같은 특정 선구체 마커 항원의 존재 또는 부재에 의해서, 그리고/또는 형태학적 특성에 의해서 대부분의 다른 세포들과 구분된다. 고도로 풍부화된 사람 간세포 분획에 대한 표현형은 CD34+, Thy-1+ 및 lin-로서 보고되지만, 본 발명은 이 간세포 개체군의 확장에 한정되지 않는 것으로 이해된다. CD34+ 풍부화된 사람 간세포 분획을 CD34+와 같은 표면 항원에 관한 항체를 사용하는, 친화성 칼럼이나 비드, 자성 비드 또는 플로우혈구계산을 포함하는 많은 보고된 방법으로 분리할 수 있다. 또한 역류형 경사법과 같은 물리적 분리법을 사용하여 조혈 선구체를 풍부화 할 수도 있다. CD34+ 선구체는 불균일하며, 상이한 계통관련의 세포표면관련분자의 공동 발현의 존재 또는 부재에 의해 특성화된 몇몇의하위 개체군으로 나뉜다. 대부분의 미숙 선구체 세포는 HLA-DR이나 CD38과 같은 어떤 공지의 계통관련 마커도 발현하지 않지만, 그것들은 CD90(thy-1)을 발현한다. CD33, CD38, CD41, CD71, HLA-DR 또는 c-kit와 같은 기타 표면항원도 조혈 선구체를 선택적으로 분리하기위해서 사용할 수 있다. 분리된 세포를 배양 플라스크내, 멸균백 또는 중공사내의 선택된 배지에서 배양할 수 있다. 다양한 콜로니형성자극인자를 선택적으로 세포를 확장시키기 위해서 사용한다. 골수의 생체외 확장을 위해 사용된 대표적 인자는 c-kit 리간드, IL-3, G-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-6, IL-11, flt-3 리간드 또는 그 조합을 포함한다. 간세포의 증식을 간세포 및 기타 세포를 계수하는 것에 의해서, 표준 기술(예를 들면 혈구계산기, CFU, LTCIC)에 의해서, 또는 배양 이전 그리고 이후의 플로우혈구계산에 의해서 모니터할 수 있다.
간세포의 생체외 확장을 위한 몇가지 방법이 보고되었는데, 많은 선택법을 이용하는 것 그리고 다양한 콜로니형성자극인자를 사용하는 확장이고, 이 인자는 다음을 포함한다: c-kit 리간드(Brandt 등.,Blood83:1507-1514 [1994], McKenna 등,Blood86:3413-3420 [1995]), IL-3(Brandt 등,Blood83:1507-1514 [1994], Sato 등,Blood82:3600-3609 [1993]), G-CSF (Sato 등,Blood82:3600-3609 [1993]), GM-CSF (Sato 등,Blood82:3600-3609 [1993]), IL-1 (Muench 등,Blood81:3463-3473 [1993]), IL-6 (Sato 등,Blood82:3600-3609 [1993]), IL-11 (Lemoli 등,Exp. Hem.21:1668-1672 [1993], Sato 등,Blood82:3600-3609 [1993]), flt-3 리간드 (McKenna 등Blood86:3413-3420 [1995]), 및/또는 그 조합(Brandt 등,Blood83:1507-1514 [1994], Haylock 등,Blood80:1405-1412 [1992],Koller 등,Biotechnology11:358-363 [1993], (Lemoli 등,Exp. Hem.21:1668-1672 [1993], (McKenna 등Blood86:3413-3420 [1995]), (Muench 등,Blood81:3463-3473 [1993]), Patchen 등,Biotherapy7:13-26 [1994], Sato 등,Blood82:3600-3609 [1993]), Smith 등,Exp. Hem.21:870-877 [1993], Steen 등,Stem Cells12:214-224 [1994], Tsujino 등,Exp. Hem.21:1379-1386 [1993]). 개별적 콜로니형성자극인자들 중에서, hIL-3이 말초 혈액 CD34+ 세포의 확장에서 가장 강력한 것중의 하나로 나타났다(Sato 등,Blood82:3600-3609 [1993]), Kobayashi 등,Blood73:1836-1841 [1989]). 그러나 어떤 단일 인자도 복수의 인자의 조합보다 효과적인 것으로 나타나지는 않았다. 본 발명은 단일 인자단독으로 보다 더 효과적인 다기능성 조혈 수용체 아고니스트를 이용하는 생체외 확장을 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 견해는 본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트로 보충된 HS-5와 같은 지질(stromal)세포주(WO 96/02662, Roecklein and Torok-Strob,Blood85:997-1105, 1995)에 노출시켜 콘디쇼닝시킨 배지를 함유하는 배양 용기에 세포를 접종시키는 것을 포함하는 조혈 선구체 세포를 성장시키는, 그리고/또는 확장시키는 방법을 제공한다.
또한 유전자 치료를 위한 조혈 선구체 및 간세포의 시험관내 활성화에 있어서의 성장인자의 임상적 사용을 계획하였다. 조혈 선구체 세포의 긴 수명 및 신체 전반에 걸친 그 자손 세포의 분포때문에, 조혈 선구체 세포는 생체외 유전자 트랜스펙션에 대한 좋은 후보이다. 관심 있는 유전자를 조혈 선구체 또는 간세포내로조합시키기 위해서 세포 분열 및 DNA 복제를 자극할 필요가 있다. 조혈 간세포는 매우 낮은 빈도의 주기를 갖는데, 이는 성장인자가 유전자 형질도입에 유용하고 그것에 의해서 유전자 치료를 위한 임상적 전망을 강화함을 의미한다. 유전자 치료(review Crystal,Science270:404-410 [1995])의 가능한 적용은 다음을 포함한다: 1) 많은 선천성 대사장해 및 면역결핍의 치료(Kay and Woo,Trends Genet.10:253-257 [1994]), 2) 신경학적 장해(Friedmann,Trends Genet.10:210-214 [1994]), 3) 암 (Culver and Blaese,Trends Genet.10:174-178 [1994]) 및 4) 감염성 질병 (Gilboa and Smith,Trends Genet.10:139-144 [1994]).
유전물질을 숙주세포로 도입하기 위한 본 분야의 당업자에 공지된 다양한 방법이 있다. 바이러스성과 비바이러스성 둘다의 많은 벡터들이 치료유전자를 일차세포내에 운반하기 위해서 개발되어왔다. 바이러스를 기초로한 벡터는 다음을 포함한다; 1) 복제결핍 재조합 레트로바이러스 (Boris-Lawrie and Temin,Curr. Opin. Genet. Dev.3:102-109 [1993], Boris-Lawrie and Temin,Annal. New York Acad. Sci.716:59-71 [1994], Miller,Current Top. Microbiol. Immunol.158:1-24 [1992]) 및 복제결함 재조합 아데노바이러스 (Berkner,BioTechniques6:616-629 [1988], Berkner,Current Top. Microbiol. Immunol.158:39-66 [1992], Brody and Crystal,Annal. New York Acad. Sci.716:90-103 [1994]). 비바이러스 기초의 벡터는 다음을 포함한다; 단백질/DNA 복합체 (Cristiano 등,PNAS USA.90:2122-2126 [1993], Curiel 등,PNAS USA88:8850-8854 [1991], Curiel,Annal. New York Acad. Sci.716:36-58 [1994]), 양이온성 리포좀과 같은, 전기영동 및 리포좀 중개의 운반 (Farhood 등,Annal. New York Acad. Sci.716:23-35 [1994]).
본 발명은 어떤 단일 콜로니형성자극인자에 의해서는 보이지 않는 활성을 포함하여 개선된 생물학적 활성을 갖는 다기능성 조혈 수용체 아고니스트 단백질을 이용하는 방법을 제공하는 점에서 새로운 유전물질이 도입된 조혈세포를 확장하는 현존하는 방법에 개선점을 제공한다.
많은 약품이 골수억압 또는 조혈 결핍을 발생시킨다. 그러한 약품의 예는 화학요법에서 사용되는 AZT, DDI, 알킬화제 및 항대사물, 클로르암페니콜, 페니실린, 간시클로버(gancyclovir), 다우노마이신 및 설파드러그와 같은 항생제, 메프로바메이트와 같은 정신안정제, 아미노피린 및 디피론과 같은 진통제, 페니토인 또는 카르바마제핀과 같은 진경제, 프로필티오우라실 및 메티마졸과 같은 항갑상선물질 및 이뇨제이다. 본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트는 이들 약품으로 치료한 환자들에게서 종종 일어나는 골수억압 또는 조혈 결핍을 예방 또는 치료하기에 유용하다.
조혈 결핍은 바이러스, 미생물 또는 기생충 감염의 결과로 그리고 투석과 같은 신장병 또는 신부전의 치료의 결과로서 일어나기도 한다. 본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트는 그러한 조혈 결핍의 치료에 유용하다.
조혈 결핍의 치료는 다기능성 조혈 수용체 아고니스트를 함유하는 약제 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 또한 본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트는 환자에게 세포를 주입하기에 앞서 본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트 단백질로 이들 세포를 시험관내 처치하는 것에 의한 조혈 선구체의 활성화 및 증폭에 유용하다.
예를 들면 T 및/또는 B 임파구에 있어서의 다양한 면역결핍 또는 예를 들면 류마티스성 관절염과 같은 면역 장해도 본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트에 의한 치료에 의해 유익하게 영향받을 수 있다. 면역결핍은 예를 들면 HTLVI, HTLVII, HTLVIII과 같은 바이러스성 감염의 결과, 방사선에의 심한 노출, 암치료 또는 기타 의학적 치료의 결과이다. 또한 본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트는 단독으로 또는 기타 콜로니형성자극인자와 조합하여 혈소판감소증(혈소판 결함)을 포함하는 기타 혈구 결핍, 또는 빈혈의 치료에도 사용된다. 이들 신규한 폴리펩티드에 대한 다른 용도는 골수이식으로부터 회복하는 환자의 생체내 및 생체외 치료와 진단적 또는 치료적 사용을 위한 표준방법으로 생산된 모노클로날 및 폴리클로날 항체의 개발에서의 사용이다.
본 발명의 다른 견해는 상기한 상태의 치료를 위한 방법 및 치료적 조성물이다. 그러한 조성물은 약학적으로 수용가능한 담체와의 혼합물형태로, 치료학적 유효량의, 하나 이상의 본 발명의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트를 함유한다. 이러한 조성물은 경구, 정맥내 또는 피하투여될 수 있다. 투여시, 본 발명에서의 사용을 위한 치료적 조성물은 발열원이 없는, 경구적으로 수용가능한 수용액의 형태가 바람직하다. pH, 등장성, 안정성 등을 적절히 고려한 그러한 경구적으로 수용가능한 단백질 용액의 조제는 본 분야의 기술내용이다.
상기 상태의 치료법에 포함되는 투여량 양생법은 주치의가 예를 들면 환자의 상태, 체중, 성별 및 식이, 감염의 심한 정도, 투약시기 및 기타 임상 인자를 고려하여 결정될 것이다. 일반적으로, 일일 양생법은 체중 킬로그램당 0.2 내지 150 μg/kg 범위의 다기능성 조혈 수용체 아고니스트 단백질이다. 투여량은 주어진 다기능성 조혈 수용체 아고니스트 단백질의 활성과 관련하여 조절될 것이며, 투여량 양생법은 1일당 체중 킬로그램당 0.1 마이크로그램의 낮은, 그리고 1 밀리그램의 높은 투여량을 포함하는 것은 비합리적이지 않을 것이다. 또한 체중 킬로그램당 0.2 내지 150 마이크로그램의 범위보다 높거나 낮게 조절되는 특별한 상황도 있을 수 있다. 이들은 기타 콜로니형성자극인자 또는 IL-3 변체 또는 성장인자와의 공동 투여; 화학요법 약 및/또는 방사선과의 공동 투여; 글리코실화 다기능성 조혈 수용체 아고니스트 단백질의 사용; 및 본 단원에서 앞서 언급된 다양한 환자관련 이슈를 포함한다. 또한 상기한 바와 같이, 치료적 방법 및 조성물은 기타 사람 인자와의 공동 투여를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드와의 동시 또는 일련의 공동 투여를 위한 기타의 적절한 콜로니형성자극인자(CSFs), 사이토킨, 림포카인, 조혈성장인자 및 인터루킨의, 비한정적 목록은 GM-CSF, G-CSF, c-mpl 리간드(TPO 또는 MGDF로도 공지됨), M-CSF, 에리스로포이에틴(EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, LIF, flt3/flk2 리간드, B-세포성장인자, B-세포분화인자 및 호산성분화인자, 간세포인자(SCF)(스틸인자 또는 c-kit 리간드로도 알려짐), 또는 그 조합을 포함한다. 상기 열거한 투여량은 치료학적 조성물에 이러한 추가성분들을 보충하기 위해 조절될 것이다. 처치된 환자의 경과는 혈액학적 프로파일, 예를들어 감별혈구계산등의 주기적 평가 의해 관찰될 수 있다.
재료와 방법
만약 달리 표기되지 않았다면, 모든 전문 화학제품은 Sigma, Co.(St. Louis, MO)로부터 얻은 것이다. 제한 엔도누클레아제와 T4 DNA 리가아제는 New England Biolabs(Beverly, MA)또는 Boehringer Mannheim(Indianaplis, IN)로부터 얻은 것이다.
E. coli 균주의 형질전환
DH5αTM(Life Technologies, Gaithersburg, MD)와 TG1(Amersham Corp., Alington Heights, IL)같은E. coli균주는 라이게이션 반응의 형질전환에 사용되고 포유동물 세포를 트랜스펙션시키기 위한 플라스미드 DNA의 공급원이 된다. JM101(Yanisch-Perron, et al.,Gene, 33: 103-119, 1985)와 MON105(Obukowicz, et al.,Appl. and Envir. Micr., 58: 1511-1523, 1992)같은E. coli균주는 세포질 또는 주변세포질 공간에서 다기능 조혈 수용체 아고니스트를 발현시키는데 사용할 수 있다.
MON105 ATCC#55204: F-, lambda-, IN(rrnD, rrE)1, rpoD+, rpoH358
DH5αTM: F-, phi80dlaczdeltaM15, delta(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44lamda-thi-1, gyrA96, relA1
TGl: delta(lac-pro), supE, thi-1, hsdD5/F'(traD36, proA+B+, lacIq, lacZdeltaM15)
JM101 ATCC#33876: delta(pro lac), supE, thi, F'(traD36, proA+B+, lacIq,lacZdeltaM15)
DH5αTMSubcloning 효능 세포를 콤피턴트세포로서 구입하고 제조자의 프로토콜을 사용하여 형질전환을 준비하고 한편E. coli균주 TG1과 MON105모두를 콤피턴트하게 만들어 CaCl2방법을 사용하여 DNA를 삽입한다. 전형적으로 20 내지 50mL의 세포를 L13배지(1% 박토-트립톤, 0.5% 박토-이스트 추출물, 150mM NaCl)에서 Baush & Lomb Spectronic 분광 광도계(Rochester, NY)로 측정된 600 나노미터에서의 약 1.0의 광 밀도단위(OD600)의 밀도까지 성장시킨다. 세포를 원심분리로 수집하고 CaCl2용액(50mM CaCl2, 10mM Tris-Cl, pH 7.4) 1/5배양부피에서 재현탁시키고 4℃에서 30분동안 유지시킨다. 세포를 다시 원심분리로 수집하고 CaCl2용액 1/10 배양부피에서 재현탁시킨다. 라이게이션된 DNA를 이 세포 0.2mL에 첨가하고 샘플을 4℃에서 30-60분동안 유지시킨다. 샘플을 2분동안 42℃까지 승온시키고 1.0mL의 LB를 첨가한 후 샘플을 37℃에서 1시간동안 흔든다. 이 샘플로부터의 세포를, 암피실린-저항성 형질전환세포를 선별한 경우는 암피실린(100 마이크로그램/mL, ㎍/mL)을 또는 스펙티노마이신-저항성 형질전환세포를 선택할 경우는 스펙티노마이신(75㎍/mL)을 함유하는 플레이트(LB배지와 1.5% 박토-한천)상에 펼친다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션한다.
콜로니를 취하고 LB와 적당한 항생제(100㎍/mL 암피실린 또는 75㎍/mL 스텍티노마이신)에 접종하고 흔들면서 37℃에서 성장시킨다.
새로운 N-말단/C-말단을 갖는 유전자의 생산방법
방법 I. 링커부분(L2)을 함유하는 새로운 N-말단/C-말단을 갖는 유전자 생산
원래의 C-말단과 N-말단을 분리하는 링커부분(L2)을 함유하는 새로운 N-말단/C-말단을 갖는 유전자는 본질적으로 L.S. Mullins, et alJ. Am. Chem. Soc.116, 5529-5533, 1994에 기술된 다음 방법에 따라 만들어질 수 있다. 다단계의 중합효소 연쇄반응(PCR)증폭을 단백질의 제 1아미노산 서열을 코딩하는 DNA서열을 재배열하는데 사용한다. 단계들을 도 2에 나타냈다.
첫번째 단계에서, 제 1프라이머 세트("New Start" 및 "링커 Start")를 원래의 유전자서열로부터, 새로운 단백질의 새로운 N-말단부분과 이어서 원래의 단백질의 C-말단과 N-말단을 연결하는 링커(L2)를 코딩하는 서열을 함유하는 DNA단편("단편 Start")을 생산시키고 증폭시키는데 사용한다. 두번째 단계에서, 제 2프라이머 세트("New Stop" 및 "링커Stop")는 원래의 유전자 서열로부터 상기 사용한 것과 동일한 링커와 이어서 새로운 단백질의 새로운 C-말단부분을 코딩하는 DNA 단편("단편 Stop")을 생산시키고 증폭시키는데 사용된다. "New Start"와 "New Stop"프라이머는 새로운 유전자를 발현 플라스미드로 클로닝시키는 적당한 제한 부위를 포함하도록 설계된다. 전형적인 PCR조건은 2분동안 95℃ 용융 1사이클; 1분동안 94℃ 변성, 1분동안 50℃ 어닐링 및 1분동안 72℃ 신장 25사이클; 그리고 7분동안 72℃ 신장 1사이클이다. Perkin Elmer GeneAmp PCR Core Reagent 키트를 사용한다. 100㎕반응물은 각 프라이머 100pmol과 주형 DNA 1㎍; 및 1×PCR완충액, 200μM dGTP, 200μM dATP, 200μM dTTP, 200μM dCTP, 2.5유니트 AmpliTaq DNA 중합효소 및 2mMMgCl2를 함유한다. PCR 반응은 모델 480 DNA 열 사이클러(Perkin Elmer Corporation, Norwalk, CT)에서 수행한다.
링커 부분에서의 상보적 서열과 링커의 양쪽에서 두 아미노산에 대한 코딩서열을 갖는 "단편 Start"와 "단편 Stop"을 세번째 PCR단계에서 함께 연결하여 새로운 단백질을 코딩하는 전-길이 유전자를 만든다. DNA단편 "단편 Start"와 "단편 Stop"을 1% TAE 겔상에서 분해시키고 에티듐 브로마이드로 염색하고 Qiaex Gel Extraction 키트(Qiagen)를 사용하여 단리한다. 이 단편들을 등몰량으로 합하고 10분동안 70℃에서 가열하고 서서히 냉각하여 "링커 Start"와 "링커 Stop"에서 그것들의 공유 서열을 통하여 어닐링한다. 세번째 PCR 단계에서 프라이머 "New Start"와 "링커 Stop"을 어닐링된 단편에 첨가하여 전-길이의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 발생시키고 증폭시킨다. 전형적인 PCR 조건은 2분동안 95℃ 용융 1사이클; 1분동안 94℃ 변성, 1분동안 60℃ 어닐링 및 1분동안 72℃ 신장 25사이클; 그리고 7분동안 72℃ 신장 1사이클이다. Perkin Elmer GeneAmp PCR Core Reagents 키트를 사용한다. 100㎕ 반응물은 각 프라이머 100pmol과 DNA 약 0.5㎍; 그리고 1×PCR 완충액, 200μM dGTP, 200μM dATP, 200μM dTTP, 200μM dCTP, 2.5유니트 AmpliTaq DNA 중합효소 및 2mM MgCl2를 함유한다. PCR 반응물을 Wizard PCR Preps 키트(Promega)를 사용하여 정제한다.
방법 II. 링커부분이 없는 새로운 N-말단/C-말단을 갖는 유전자의 생산
원래의 N-말단과 C-말단을 연결하는 링커가 없는 새로운 N-말단/C-말단 유전자는 PCR 증폭과 블런트단부 라이게이션의 두 단계를 사용하여 만들어질 수 있다. 이 단계는 도 3에 나타냈다. 첫번째 단계에서, 프라이머 세트("New Start" 및 "P-bl Start")는 원래의 유전자 서열로 부터, 새로운 단백질의 새로운 N-말단부분을 코딩하는 서열을 함유하는 DNA 단편("단편 Start")을 생산시키고 증폭시키는데 사용된다. 두번째 단계에서 프라이머 세트("New Stop" 및 "P-bl Stop")를 유전자 서열로부터, 새로운 단백질의 새로운 C-말단부분을 코딩하는 서열을 함유하는 DNA 단편("단편 Stop")을 생산시키고 증폭시키는데 사용된다. "New Start"와 "New Stop"프라이머는 새로운 유전자를 발현 벡터로 클로닝시키는 적당한 제한 부위를 포함하도록 설계된다. 전형적인 PCR 조건은 2분동안 95℃용융 1사이클; 1분동안 94℃ 변성, 45초동안 50℃ 어닐링 및 45초 동안 72℃ 신장 25사이클이다. 제조자에 의해 제시된 조건에서 돌출부의 발생을 감소시키는데는 Deep Vent 중합효소(New England Biolabs)를 사용한다. "P-bl Start"와 "P-bl Stop" 프라이머를 5'말단에서 인산화시켜 그 다음의 블런트 말단에서 "단편 Start"와 "단편 Stop"을 각각에 라이게이션하는 것을 돕는다. 100㎕의 반응물은 각 프라이머 150pmol과 주형 DNA 1㎍; 그리고 1×Vent 완충액(New England Biolabs), 300μM dGTP, 300μM dATP, 300μM dTTP, 300μM dCTP, 및 1유니트 Deep Vent 중합효소를 함유한다. PCR 반응은 모델 480 DNA 열 사이클러(Perkin Elmer Corporation, Norwalk, CT)에서 수행한다. PCR 반응생산물을 Wizard PCR 키트(Promega)를 사용하여 정제한다.
프라이머는 새로운 유전자를 발현 벡터로 클로닝시키는 적당한 제한 부위를 포함하도록 설계된다. 전형적으로 "단편 Start"는 NcoI 제한부위를 발생시키도록설계되고 "단편 Stop"은 HindIII제한 부위를 발생시키도록 설계된다. 제한 소화 반응물을 Magic DNA Clean-up System 키트(Promega)를 사용하여 정제한다. 단편 Start와 Stop을 1% TAE 겔상에서 분해시키고 에티듐 브로마이드로 염색하고 Qiaex Gel Extraction 키트(Qiagen)를 사용하여 단리한다. 이 단편들을 합하고 10분동안 50℃에서 가열하고 천천히 냉각시킴으로써 pMON 3934의 ∼3800 염기쌍 NcoI/HindIII벡터 단편의 단부에 어닐링한다. 3개의 단편을 T4 DNA 리가아제(Boehringer Mannheim)를 사용하여 함께 라이게이션시킨다. 결과는 전-길이의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 함유하는 플라스미드이다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α 세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환 시키는데 사용한다. 플라스미드 DNA를 정제하고 서열을 하기한 바와같이 확인한다.
방법 III. 직렬 중복 방법에 의한 새로운 N-말단/C-말단 유전자 생산
새로운 N-말단/C-말단 유전자는 R. A. Horlick, et al 5: 427-431, 1992에 기술된 방법을 기초로하여 만들어질 수 있다. 새로운 N-말단/C-말단 유전자의 중합효소 연쇄반응(PCR)증폭을 직렬로 중복된 주형 DNA를 사용하여 수행한다. 이 단계들을 도 3에 나타냈다.
직렬로 중복된 주형 DNA는 클로닝에 의해 발생되고 유전자의 2개의 카피의 원래의 C-와 N-말단을 연결하는 링커를 코딩하는 DNA 서열에 의해 분리된 2개의 유전자 카피를 함유한다. 특정 프라이머 세트를 직렬로 중복된 주형 DNA로 부터 전-길이의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 생산시키고 증폭시키는데 사용한다. 이 프라이머는 새로운 유전자를 발현 벡터로 클로닝이시키는 적당한 제한부위를 포함하도록 설계된다. 전형적인 PCR 조건은 2분동안 95℃ 용융 1사이클; 1분동안 94℃ 변성, 1분동안 50℃ 어닐링 및 1분동안 72℃ 신장 25사이클; 그리고 7분동안 72℃ 신장 1사이클이다. Perkin Elmer GeneAmp PCR Core Reagents 키트(Perkin Elmer Corporation, Norwalk, CT)를 사용한다. 100㎕의 반응물은 각 프라이머 100pmole과 주형 DNA 1㎍; 그리고 1×PCR 완충액, 200μM dGTP, 200μM dATP, 200μM dTTP, 200μM dCTP, 2.5유니트 AmpliTaq DNA 중합효소 및 2mM MgCl2를 함유한다. PCR 반응은 모델 480 DNA 열 사이클러(Perkin Elmer Corporation, Norwalk, CT)에서 수행한다. PCR반응물을 Wizard PCR Preps 키트(Promega)를 사용하여 정제한다.
다기능 수용체 아고니스트 발현 벡터로의 새로운 N-말단/C-말단 유전자의 클로닝
새로운 N-말단/C-말단 유전자를 제한 엔도누클레아제로 소화시켜 또 다른 콜로니형성 자극인자 유전자를 함유하는 발현 벡터로의 삽입에 적합한 단부를 생산시킨다. 이 발현 벡터를 또한 제한 엔도누클레아제로 소화시켜 적합성 단부를 형성시킨다. 정제후 유전자와 벡터 DNA들을 합하고 T4 DNA 리가아제를 사용하여 라이게이션시킨다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli.를 형질전환시키는데 사용한다. 플라스미드 DNA를 정제하고 이어서 올바른 삽입물을 확인하기 위해 서열 결정 한다. 올바른 클론을 단백질 발현을 위하여 성장시킨다.
DNA 단리와 특성화
플라스미드 DNA는 수많은 상이한 방법으로 그리고 본 분야에 숙련된 사람에게 공지된 시중 구입가능한 키트를 사용함으로써 단리할 수 있다. 그런 방법들 중 몇가지를 여기에 나타냈다. 플라스미드 DNA를 Promega WizardTMMiniprep 키트(Madison, WI), Qiagen QIAwell Plasmid isolation 키트(Chatsworth, CA)또는 Qiagen Plasmid Midi 키트를 사용하여 단리한다. 이 키트들은 동일한 일반 플라스미드 DNA단리방법을 따른다. 간단히 세포를 원심분리(5000×g)에의해 펠릿으로 만들고 플라스미드 DNA를 일련의 NaOH/산 처리로 해제하고 원심분리(10000×g)로 세포질 잔해를 제거한다. 상청액(플라스미드 DNA함유)을 DNA-결합수지를 함유하는 칼럼상에 로딩하고 칼럼을 세척하고 플라스미드 DNA를 TE로 용출시킨다. 관심있는 플라스미드를 갖는 콜로니를 스크리닝한 후E.coli세포를 50-100 mls의 LB와 적당한 항생물질에 접종하여 흔들면서 에어 인큐베이터내 37℃에서 밤새 성장시킨다. 정제된 플라스미드 DNA를 DNA서열결정, 더 이상의 제한효소 소화, DNA단편의 추가 서브클로닝 및 포유동물,E.coli또는 그외 세포에의 트랜스펙션에 사용한다.
서열확인
정제된 플라스미드 DNA를 dH2O에 재현탁시키고 Bausch and Lomb Spectronic 601 UV분광계에서의 260/280nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량화하였다. DNA 샘플을 서열결정하는 혼합물에 5% DMSO의 첨가에 의해 보통 변성된 제조자 제안 프로토콜을 따른 ABI PRISMTMDyeDeoxyTM터미네이터 시퀀싱 케미스트리(Applied Biosystems Division of Perkin Elmer Corporation, Lincoln City, CA)키트(부품 번호 401388 또는 402078)를 사용하여 서열결정한다. 서열결정하는 반응을 제시된증폭 조건에따라 모델 480 DNA 열 사이클러(Perkin Elmer Corporation, Norwalk, CT)에서 수행한다. 샘플을 Centri-SepTM스핀 칼럼(Princeton Separations, Adelphia, NJ)으로 정제하여 과량의 염료 터미네이터를 제거하고 동결건조시킨다. 형광 염료가 표지된 서열결정 반응물을 탈이온 포름아미드에 재현탁시키고 ABI 모델 373A 자동 DNA 시퀀서를 사용하여 변성하는 4.75%폴리아크릴아미드-8M 우레아 겔상에서 서열결정한다. 중첩 DNA 서열단편을 Squencher v2.1 DNA 분석 소프트웨어(Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI)를 사용하여 분석하고 마스터 DNA 콘티그로 조립하였다.
포유동물 세포내에서의 다기능 수용체 아고니스트의 발현
컨디셔닝된 배지의 포유동물 세포 트랜스펙션/제조
BHK-21세포주를 ATCC(Rockville, MD)로부터 얻을 수 있다. 세포를 2mM(mM) L-글루타민과 10% 우태아혈청(FBS)에 보충된 Dulbecco's 변성 Eagle 배지(DMEM/고농도 글루코스)에서 배양한다. 이 조제물을 BHK증식배지라 칭한다. 선택배지는 453유니트/mL 하이그로마이신 B(Calbiochem, San Diego, CA)가 보충된 BHK증식배지이다. BHK-21세포주는 플라스미드 pMON3359(Hippenmeyer et al.,Bio/Technology, pp.1037-1041, 1933 참고)상에서 발견된 IE110프로모터를 활성전이 시키는 HSV활성전이 단백질 VP16으로 미리 안정하게 트랜스펙션시켰다. VP16 단백질은 IE110프로모터뒤에 삽입된 유전자의 발현을 유발한다. 활성전이 단백질 VP16을 발현하는 BHK-21세포를 BHK-VP16이라 칭한다. 플라스미드 pMON1118(Highkin et al.,PoultrySci., 70: 970-981, 1991 참고)은 SV40 프로모터로부터 하이그로마이신 저항성 유전자를 발현시킨다. 비슷한 플라스미드가 ATCC, pSV2-hph로부터 구입가능하다.
BHK-VP16 세포를 트랜스펙션시키기 24시간전에 디쉬당 3×105세포로 60밀리미터(mm)조직 배양 디쉬에 시딩한다. 디쉬당 관심있는 유전자를 함유하는 플라스미드 DNA 10㎍, 하이그로마이신 저항성 플라스미드, pMON1118 3㎍, 및 Gibco-BRL "LIPOFECTAMINE"TM을 함유하는 "OPTIMEM"TM(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) 3mL에서 16시간동안 세포를 트랜스펙션시킨다. 이어서 배지를 흡인하고 3mL 증식배지로 바꾼다. 48시간의 후트랜스펙션에서 각 디쉬로부터 배지를 수집하고 활성에 대하여 분석하였다(임시 컨디셔닝된 배지). 세포를 트립신-EDTA에의해 디쉬로부터 제거하고 1:10으로 희석하고 선택배지 10mL를 함유하는 100㎜ 조직배양 디쉬에 옮긴다. 선택배지에서 약 7일 후, 내성 세포가 직경이 수 밀리미터인 콜로니로 성장한다. 콜로니를 여과지(콜로니와 거의 같은 크기로 자르고 트립신/EDTA에 담근다)를 가지고 디쉬로부터 제거하고 선택배지 1mL를 함유하는 24웰 플레이트의 각 웰에 옮긴다. 클론들이 성장하여 집밀하게 된 후 컨디셔닝된 배지를 재분석하고 양성 클론을 증식배지에 도포한다.
E.coli 에서의 다기능 수용체 아고니스트의 발현
관심있는 플라스미드를 포함하는E.coli균주 MON105 또는 JM101을 New Brunswick Scientific(Edison, New Jersey)로부터의 에어 인큐베이터 모델 G25에서 흔들면서 M9 와 카사미노산 배지내 37℃에서 성장시킨다. 성장을 OD600에서 1.0의값에 도달할때까지 모니터하고 이때 0.1N NaOH중의 날리딕스산(Nalidixic acid)(10 밀리그램/mL)을 최종 농도 50㎍/mL로 첨가한다. 그런다음 배양물을 3 내지 4시간 더 37℃에서 흔든다. 원하는 유전자생산물의 최대 생산을 달성하기 위하여 높은 폭기정도를 배양기간 내내 유지한다. 세포를 봉입체(IB)의 존재에 대해 광학 현미경하에 검사한다. 펠릿화된 세포를 끓임으로써 단백질 함량을 분석하기 위하여 1mL 배양분액들을 취하고 그것들을 환원 완충액으로 처리하고 SDS-PAGE(Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982 참고)를 통하여 전기이동 시킨다. 배양물을 원심분리(5000×g)하여 세포를 펠릿으로 만든다.
E.coli 에서 봉입체로서 축적하는 다기능 조혈 수용체 아고니스트의 봉입체 형성, 추출, 재접힘, 투석, DEAE크로마토그래피, 및 특성화
봉입체의 단리:
E.coli배양물 330mL로부터의 세포 펠릿을 초음파처리 완충액(10mM 2-아미노-2-(히드록시메틸) 1, 3-프로판디올 히드로클로라이드(Tris-HCL), pH8.0 + 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA))15mL에 재현탁시킨다. 이 재현탁된 세포를 Sonicator Cell Disruptor의 마이크로팁 프로브(모델 W-375, Heat System-Ultrasonics, Inc., Farmingdale, New York)를 사용하여 초음파처리한다. 초음파처리 완충액에서 3차례 초음파처리한 후 원심분리하여 세포를 파열하고 봉입체(IB)를 세척한다. 첫번째 차례의 초음파처리는 3분파열 후 1분파열이고 마지막 2차례의 초음파처리는 각각 1분동안이다.
봉입체 펠릿으로부터의 단백질의 추출과 재접힘:
마지막 원심분리 단계 다음에, IB펠릿을 10mL의 50mM Tris-HCl, pH 9.5, 8M 우레아 및 5mM 디티오트레이톨(DTT)에 재현탁시키고 발현된 단백질의 변성을 일으키도록 실온에서 약 45분동안 교반한다.
추출용액을 70mL의 5mM Tris-HCl, pH 9.5 및 2.3M 우레아를 함유하는 비이커에 옮기고 18 내지 48시간동안 4℃에서 공기에 노출시키면서 완만하게 교반하고 단백질을 재접힘시킨다. 재접힘을 Vydac(Hesperia, Ca.) C18 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)칼럼(0.46×25㎝)상에서 분석함으로써 모니터한다. 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)를 함유하는 40% 내지 65% 아세토니트릴의 선형구배를 사용하여 재접힘을 관찰한다. 이 구배는 30분에 걸쳐서 분당 1.5 mL의 유속으로 전개시킨다. 변성된 단백질은 일반적으로 재접힘된 단백질 보다 구배에서 나중에 용출한다.
정제:
재접힘 다음에, 오염E.coli단백질을 산침전으로 제거한다. 재접힘용액의 pH를 15%(v/v) 아세트산(HOAc)을 사용하여 pH5.0 내지 pH5.2까지 적정한다. 이 용액을 4℃에서 2시간동안 교반한 다음 20분동안 12,000×g에서 원심분리하여 모든 불용성 단백질을 펠릿으로 만든다.
산침전단계로부터의 상청액을 3,500달톤의 분자량을 차단하는(MWCO) Spectra/Por 3 막을 사용하여 투석한다. 총 18시간동안 4리터(50배 과량)의 10mM Tris-HCl, pH 8.0으로 2회 바꿔 투석한다. 투석은 샘플의 전도율을 낮추고 DEAE 크로마토그래피전에 우레아를 제거하게 한다. 그런다음 샘플을 원심분리(12,000×g에서 20분)하여 투석다음의 모든 불용성 단백질을 펠릿으로 만든다.
Bio-Rad Bio-Scale DEAE2 칼럼(7×52㎜)을 이온 교환 크로마토그래피에 사용한다. 칼럼을 10mM Tris-HCl, pH 8.0을 함유하는 완충액에서 평형화하고 45 칼럼 부피위에서 평형완충액중의 0 내지 500mM 염화나트륨(NaCl)구배를 사용하여 단백질을 용출한다. 분당 1.0mL의 유속이 실행 내내 사용된다. 칼럼단편(단편당 2.0 mL)을 구배에 걸쳐 수집하고 Vydac(Hesperia, Ca.) C18 칼럼 (0.46×25㎝)상의 RP HPLC에의해 분석한다. 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)을 함유하는 40% 내지 65% 아세토니트릴의 선형구배가 사용된다. 이 구배는 30분에 걸쳐서 분당 1.5 mL의 유량으로 전개된다. 모은 분획들을 그런다음 총 18시간동안 4리터(50 내지 500배 과량)의10mM 아세트산 암모늄(NH4Ac), pH 4.0을 2회 바꿔 투석한다. 투석을 3,500달톤의 MWCO의 Spectra/Por 3 막을 사용하여 수행한다. 마지막으로 샘플을 0.22㎛ 시린지 필터(μStar LB 시린지 필터, Costar, Cambrige, Ma.)를 사용하여 무균여과하고 4℃에 보관한다.
몇몇 경우에서 접힘된 단백질은 적당한 매트릭스에 부착된 mAbs 또는 수용체 서브유니트같은 친화성시약을 사용함으로써 친화성 정제될 수 있다. 대안으로(또는 첨가하여) 정제를 이온 교환, 겔 여과 또는 소수성 크로마토그래피 또는 역상 HPLC같은 여러 가지 크로마토그래피 방법 중 어떤것을 사용함으로써 달성될 수 있다.
이런 또는 다른 단백질 정제방법은 Methods in Enzymology, Volume 182 'Guide to Protein Purification' edited by Murray Deutscher, Academic Press,San Diego, CA(1990)에 자세하게 기술되어있다.
단백질 특성화
정제된 단백질을 RP-HPLC, 일랙트로스프래이 질량 분석, 및 SDS-PAGE에의해 분석한다. 아미노산 조성, RP-HPLC, 및 Bradford 단백질 결정에의해 단백질 정량화를 한다. 몇몇 경우에서 트립신 펩티드 매핑을 일랙트로스프래이 질량 분석과 연관하여 수행하여 단백질의 동일성을 확인한다.
생체 활성 사람 인터로이킨-3에 대한 AML증식 분석
인자 의존 세포주 AML 193을 American Type Culture Collection(ACCC, Rockville, MD)로부터 얻었다. 급성 골수성 백혈병을 앓는 환자로부터 확립된 이 세포주는 GM-CSF 보충배지에서 강화된 성장을 나타낸 성장인자 의존세포주이다(Lange, B., et al.,Blood70: 192, 1987; Valtieri, M., et al.,J.Immunol.138: 4042, 1987). 사람 IL-3의 존재하의 증식하는 AML 193세포의 능력은 또한 문서로 입증되어 있다(Santoli, D., et al.,J.Immunol.139: 348, 1987). 세포주 변이체인 AML 193 1.3이 사용되었는데 이것은 성장인자를 세척해 내고 성장인자에 대한 사이토킨 의존 AML193 세포를 24시간동안 기아처리 시킴으로써 IL-3에서 장기간의 성장에 적합시킨 것이다. 그런다음 세포를 100 U/mL IL-3을 함유하는 배지중의 24웰 플레이트에서 1×105세포/웰로 재도말한다. 세포를 IL-3에서 빠르게 성장시키는데 약2달이 걸렸다. 그후 이 세포를 사람 IL-3로 조직배양배지(하기 참조)를 보충함으로써 AML 193 1.3으로서 유지한다.
AML 193 1.3 세포를 10분동안 250×g에서 세포 현탁물을 원심분리한 후 상청액을 따름으로써 냉 Hanks 균형 염용액(HBSS, Gibco, Grand Island, NY)에서 6회 세척한다. 펠릿화된 세포를 HBSS에서 재현탁시키고 이 방법을 6회 세척 사이클이 완료될 때까지 반복한다. 이 방법에의해 6회 세척된 세포를 2×105내지 5×105개의 생존할 수 있는 세포/mL의 범위의 밀도로 조직배양배지에 재현탁시킨다. 이 배지를 알부민, 트랜스페린, 지질 및 2-메르캅토에탄올로 Iscove's 변성 Dulbecco's Medium(IMDM, Hazelton, Lenexa, KS)를 보충함으로써 제조한다. 소 알부민(Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN)을 500㎍/mL로 첨가하고; 사람 트랜스페린(Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN)을 100㎍/mL로 첨가하고; 콩 지질(Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN)을 50㎍/mL로 첨가하고; 그리고 2-메르캅토에탄올(Sigma, St. Louis, MO)을 50×10-5M 으로 첨가한다.
사람 인터로이킨-3 또는 다기능 조혈 수용체 아고니스트 단백질의 일련의 희석액을 96웰 Costar 3596 조직배양 플레이트중의 상기한 바와같은 보충된 조직배양배지에서 3열로 만든다. 인터로이킨-3 또는 다기능 조혈 수용체 아고니스트 단백질을 함유하는 50㎕의 배지가 함유된 각 웰의 일회의 일련의 희석을 완료한다. 대조표준 웰은 조직 배양 배지만을 함유했다(부조절). 상기한 바와같이 하여 제조된 AML 193 1.3 세포 현탁액 50㎕ (2.5×104세포)를 피펫으로 각 웰에 첨가한다. 조직배양 플레이트를 3일동안 습윤 공기중 5% CO2와 함께 37℃로 가온처리한다. 3일째되는 날 0.5μCi3H-티미딘(2 Ci/mM, New England Nuclear, Boston, MA)을 50㎕의 조직배양배지에 첨가한다. 배양물을 18-24시간동안 습윤 공기중 5% CO2와 함께 37℃로 가온처리한다. 세포 DNA를 물 세척 사이클 후 70% 에탄올 세척 사이클을 이용한 TOMTEC 세포 수확기(TOMTEC, Orange, CT)를 사용하여 글라스 필터 매트(Pharmacia LKB, Gaithersburg, MD)상에 수확한다. 필터 매트를 공기건조 시킨 다음 신틸레이션 유체(Scintiverse Ⅱ , Fisher Scientific, St. Louis, MO or BetaPlate Scintillation Fluid, Pharmacia LKB, Gaithersburg, MD)가 첨가된 샘플 백에 넣는다. 각 조직배양 웰로부터의 샘플의 베타 방출을 LKB BetaPlate 모델 1205 신틸레이션 계수기(Pharmacia LKB, Gaithersburg, MD)에서 계수하고 데이터는 각 조직 배양 웰로 부터의 셀에 혼입된3H-티미딘의 분당 계수로서 표현된다. 각 사람 인터로이킨-3 제조물 또는 다기능 조혈 수용체 아고니스트 단백질 제조물의 활성을 등급화된 농도의 인터로이킨-3 또는 다기능 조혈 수용체 아고니스트에 의해 유발된 셀 증식(3H-티미딘 혼입물)을 측정함으로써 정량화한다. 전형적으로 0.05pM - 105pM의 농도범위는 이 분석에서 정량화된다. 활성을, 최대증식의 50%(EC50= 0.5×(시험된 모든 농도의 인터로이킨-3의 3벌 배양물중 웰당 혼입된3H-티미딘의 분당 최대 평균계수 - 인터로이킨-3이 없는 3벌 배양물에서 관찰된3H-티미딘 혼입물에의해 측정된 바탕 증식치))를 제공하는 인터로이킨-3 또는 다기능 조혈 수용체 아고니스트 단백질의 투여량을 측정함으로써 결정한다. 이 EC50값은 또한 대생물 활성의 1유니트와 등가이다. 모든 분석을 참고 표준으로서 음의 인터로이킨-3으로 수행하여 비활성 수준이 부여될 수 있다.
전형적으로 다기능 조혈 수용체 아고니스트 단백질을 일련의 2배 희석액에서 적정된 2000pM 내지 0.06pM의 범위에서 시험하였다.
각 샘플에대한 활성을 데이터에 대한 4개-파라미터 로우지스트 모델을 피팅함으로써 최대 반응의 50%를 제공하는 농도에의해 결정하였다. 샘플과 비교 표준에대한 상단 평탄부(최대 응답)가 다르지 않은 것이 관찰되었다. 따라서 각 샘플에 대한 비역가계산을 상기 나타낸 바와 같은 샘플과 표준에 대한 EC50평가로부터 결정한다. AML 193 1.3 세포는 hIL-3, hGM-CSF 및 hG-CSF에 대한 반응으로 증식한다. 따라서 다음의 추가 분석을 몇몇 샘플에 대하여 수행하여 다기능 조혈 수용체 아고니스트 단백질의 G-CSF 수용체 아고니스트 부분이 활성이 있다는 것을 증명하였다. 증식 분석을 무효화 단클론성 항체가 있는 그리고 없는 다기능 조혈 수용체 아고니스트로 hIL-3 수용체 아고니스트 부분에 대하여 수행하였다. 또한 인자 Xa 절단부위와의 융합분자를 절단한 다음 정제하고 분자의 반을 증식활성에 대하여 분석하였다. 이 실험은 다기능 조혈 수용체 아고니스트 단백질의 두 성분이 활성이 있다는 것을 보여준다.
TF1 c-mpl 리간드 의존 증식 분석
c-mpl 리간드 증식활성을 다분화능성 사람 세포주 TF1(Kitamura et al.,J.Cell Physiol 140: 323-334[1989])을 사용하여 분석할 수 있다. TF1 세포를 h-IL3(100 U/mL)에 유지한다. c-mpl리간드에 반응성이 있는 서브-클론을 확립하기 위하여 c-mpl 리간드의 1-153형을 발현시키는 유전자(pMON26448)로 트랜스펙션된 BHK 세포로 부터의 10% 상청액을 함유하는 계대배양배지에 유지한다. 대부분의 세포는 죽지만 세포의 서브세트는 생존한다. 희석 클로닝 후 c-mpl 리간드 반응성 클론을 선택하고 이 세포를 분석을 시작하기 전날 0.3×106세포/mL의 밀도로 계대배양배지에 분리시킨다. 이 세포에 대한 계대배양배지는 다음과 같다: RPMI 1640(Gibco), 트랜스펙션된 BHK 세포로 부터의 10% c-mpl 리간드 상청액, 1mM 피루브산나트륨(Gibco), 2mM 글루타민(Gibco), 및 100㎍/mL 페니실린-스트렙토마이신(Gibco). 다음날 세포를 수확하고 PRMI 또는 IMDM 배지에서 2회 세척하는데 마지막 세척은 ALT, 또는 분석배지에서 세척한다. ALT배지는 다음과 같은 것으로 구성된다: 1000mL의 ALT당 IMDM(Gibco), 500㎍/mL의 우혈청알부민, 100㎍/mL의 사람 트랜스페린, 50㎍/mL의 콩지질, 4×10-8M 베타-메르캅토에탄올 및 2mL의 A9909(Sigma, 항체용액). 세포를 최종부피 50㎕까지 96-웰 저 증발 플레이트(Coster)중의 최종밀도 0.25×106 세포/mL까지의 분석배지에서 희석시킨다. 트랜스펙션된 콜로니로 부터의 과도 상청액(컨디셔닝된 배지)을 부피 50㎕로 최종농도 50%의 2벌 샘플로서 첨가하고 1.8 %의 최종 희석액까지 3배 희석한다. 1㎍/mL에서 시작하고 0.0014㎍/mL까지 3배 희석액을 사용하여 희석된 IL-3 변이체 pMON13288의 선량 곡선의 3벌 샘플은 양성 대조표준으로 포함된다. 플레이트를 5% CO2에서 그리고 37℃에서 가온처리한다. 배양 6일째 되는 날 플레이트에 20㎕/웰 부피의 0.5 Ci의 3H/웰 (NEN)을 펄스로 주입하고 4시간 동안 5% CO2그리고 37℃에서 가온처리한다. 플레이트를 수확하고 Betaplate 계수기상에서 계수한다.
다른 시험관내 세포 기재 증식분석
본 분야에 숙련된 사람에게 알려진 다른 시험관내 세포 분석은 또한 AML 193.1.3 세포에서 기술된 바와 같은 비슷한 방법으로 분자로 이루어진 인자에 의존하는 다기능 조혈 수용체 아고니스트의 활성을 결정하는 데 유용하다. 다른 유용한 분석의 예는 다음과 같다.
TF1 증식분석: TF1은 hIL-3에 반응하는 다분화능성 사람 세포주(Kitamura et al., J. Cell Physiol 140: 323-334. [1989])이다.
32D 증식분석: 32D는 사람 IL-3에는 반응하지는 않지만 제한된 종이 아닌 사람 G-CSF에는 반응하는 쥐과 IL-3 의존 세포주이다.
Baf/3 증식분석: Baf/3은 사람 IL-3 또는 사람 c-mpl 리간드에는 반응하지는 않지만 제한된 종이 아닌 사람 G-CSF에는 반응하는 쥐과 IL-3 의존 세포주이다.
T1165 증식분석: T1165 세포는 IL-6과 IL-11에 반응하는 IL-6 의존 쥐과 세포주(Nordan et al., 1986)이다.
사람 플라스마 응고 meg-CSF 분석: 거핵구 콜로니 형성 활성(Mazur et al., 1981)을 분석하는데 쓰인다.
트랜스펙션된 세포주:
쥐과 Baf/3 세포주 같은 세포주를, 세포주가 가지고 있지 않은 사람 G-CSF 수용체 또는 사람 c-mpl 수용체 같은 콜로니 자극 인자 수용체로 트랜스펙션시킬 수 있다. 이 트랜스펙션된 세포주는 수용체가 세포주로 트랜스펙션된 리간드의 활성을 결정하는 데 사용될 수 있다.
트랜스펙션된 Baf/3 세포주 같은 것을 c-mpl 반응 세포주로부터 만들어진 라이브러리로부터의 c-mpl을 코딩하는 cDNA를 클로닝함으로써 만들고 플라스미드 pcDNA3(Invitrogen, San Diego Ca.)의 다 클로닝 부위로 클로닝하였다. Baf/3 세포를 일렉트로포레이션을 통하여 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 세포를 Wehi 컨디셔닝된 배지에서 마우스 IL-3의 존재하에서 G418 선택하에 성장시켰다. 클론을 한정된 희석을 통하여 확립하였다.
비슷한 방법에서 사람 G-CSF 수용체를 Baf/3 세포주로 트랜스펙션시킬 수 있고 다기능 조혈 수용체 아고니스트의 생체 활성을 결정하는데 사용할 수 있다.
c-mpl 리간드 증식활성의 분석
방법
1.골수 증식분석
a.CD34+ 세포 정제:
골수 흡입물(15-20mL)을 정상적인 동종 골수 공급자로부터 승낙을 받은 후 얻었다. 세포를 인산 완충 염수(PBS, Gibco-BRL)에서 1:3 희석하고 15 mL의 Histopaque-1077(Sigma)상에 30mL가 층분리되도록 하고 이것을 30분동안 300 RCF에서 원심분리했다. 단핵 경계층을 수집하고 PBS에서 세척하였다. CD34+세포가 제조가의 지시에 의한 어피너티 칼럼을 사용하여 단분자 세포제조물로부터 풍부하게 되었다(CellPro, Inc, Bothell WA). 풍부하게 한 후 CD34+세포의 순도는 플루오레세인에 접합된 항-CD34 단클론성 항체와 피코에리트린에 접합된 항-CD38을 사용하여 유동세포측정 분석을 사용함으로써 결정된 것으로서 평균 70%이다(Becton Dickinson, San Jose CA).
세포를 40,000 세포/mL로 X-Vivo 10 배지(Bio-Whittaker, Walkersville, MD)에 재현탁시키고 1mL를 12-웰 조직 배양 플레이트(Coastar)에서 도말하였다. 이 성장인자 rhIL-3을 몇몇 웰에 100㎍/mL(pMON5873)으로 첨가했다. hIL3 이형을 10㎍/mL 내지 100㎍/mL으로 사용했다. 코딩화 c-mpl 리간드 또는 다기능 조혈 수용체 아고니스트를 코딩하는 플라스미드로 트랜스펙션된 BHK 세포로 부터의 컨디셔닝된 배지를 1 mL의 배양물(약 10% 희석액)에 첨가된 상청액 100㎕를 첨가함으로써 시험하였다. 세포를 37℃ 습윤 인큐베이터내 5% CO2에서 8-14일 동안 37℃에서 가온처리 하였다.
b.세포 수확과 분석:
배양기간 마지막에 총 세포 계수를 각 조건에 대하여 얻었다. 형광 분석과 배수성 측정을 위하여 세포를 거핵구 완충액(MK 완충액, PBS내 13.6mM 시트르산나트륨, 1mM 테오필린, 2.2㎛ PGE1, 11mM 글루코스, 3% w/v BSA, pH 7.4)(Tomer et al.,blood70: 1735-1742, 1987)에서 세척하고 항-CD41a FITC 항체(1:200,AMAC,Westbrook,ME)를 함유하는 500㎕의 MK 완충액에서 재현탁시키고 MK 완충액에서 세척하였다. DNA 분석을 위하여 세포를 20분 동안 얼음위에서 0.5% Tween-20 (Fisher, Fair Lawn NJ)를 함유하는 MK 완충액에 투과한 후 0.5 % Tween 20와 1% 파라포름알데히드(Fisher Chemical)에서 30분 동안 고정한 후 55% v/v MK완충액(200mOsm)중의 RNA-ase(400 U/mL)와 함께 프로피듐 요오다이드(Calbiochem, La Jolla Ca)(50㎍/mL)에서 1-2시간 동안 배양하였다. 세포를 FACScan 또는 Vantage 유동세포측정기(Becton Dickinson, San Jose, CA)상에서 분석하였다. 초록 형광(CD41a-FITC)을 붉은 형광(PI)에 대하여 선형 로그 시그날과 함께 수집하여 DNA 배수성을 결정하였다. 모든 세포를 수집하여 CD41+인 세포의 존재를 결정하였다. 데이터 분석을 LYSIS(Becton Dickinson, San Jose, CA)에 의한 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.CD41 항원을 발현시키는 세포의 퍼센트를 유동세포측정 분석으로부터 얻었다(퍼센트). CD41+ 세포/mL의 절대수 (ABS)를 다음과 같이 계산했다: (Abs)=(세포계수)*(퍼센트)/100.
2. 거핵구 피부린 응고 분석
개체군이 풍부한 CD34+를 상기한 바와 같이 단리시켰다. 세포를 0.3% BSA, 0.4 mg/mL 아포-트랜스페린, 6.67-μM FeCl2, 25㎍/mL CaCl2, 25㎍/mL L-아파라긴, 500㎍/mL ε-아미노-n-카프로산 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 기본 Iscoves MIDM 배지로 구성된 배지에서 사이토킨이 있거나 없이 25,000 세포/mL로 현탁시켰다. 35㎜ 플레이트에 도말하기 전에 트롬빈을 초기 응고형성물에 (0.25 유니트/mL) 첨가하였다.세포를 37℃ 습윤 인큐베이터내 5% CO2에서 13일 동안 37℃에서 배양하였다.
배양기간 마지막에 플레이트를 메탄올:아세톤(1:3)으로 고정하고 공기건조시키고 염색할 때까지 -200℃에 보관하였다. 항-CD41a, CD42 및 CD61로 구성된 제1 단클론성항체의 칵테일을 사용하여 퍼옥시다제 면역세포화학 염색방법(Zymed, Histostain-SP. San Francisco, CA)을 사용하였다.콜로니를 염색한 후 계수하고 음성 CFU-MK(작은 콜로니, 약 25 세포보다 적은 1-2 초점), BFU-NK(크고 25 세포보다 많은 다-초점 콜로니) 또는 혼합 콜로니 (양성과 음성 콜로니 모두의 혼합물)로서 분류하였다.
메틸셀룰로스 분석
이 분석은 생체내에서 조혈 콜로니의 다른 형태를 유발하는 정상 골수세포를 자극하는 콜로니형성 자극인자의 능력을 반영한다[(Bradleyl et al.,Aust. Exp Biol. Sci.44: 287-300,1966), (Pluznik et al.,J. Cell Comp. Physio66: 319-324, 1965)].
방법
약 30 mL의 신선하고 정상적이고 건강한 골수 흡입물을 승낙을 얻은 후 사람으로부터 얻는다. 무균조건하에 샘플을 50mL 원뿔형 튜브(#25339-50 Corning, Corning MD)에서 1X PBS (#14040.059 Life Technologies, Gaithersburg, MD.)용액으로 1:5 희석한다. Ficoll (Histopaque 1077 Sigma H-8889)가 희석된 샘플 아래에 층분리되도록 하고 30분 동안 300×g로 원심분리한다. 단클론성 세포 무리를 1X PBS에서 2회 세척하고 1회는 1% BSA PBS(CellPro Co., Bothel, WA)로 세척한다. 단클론성 세포를 계수하고 CD34+ 세포를 Ceprate LC (CD34) Kit (CellPro Co., Bothel, WA) 칼럼을 사용하여 선택한다. 이 분핵화를 골수내의 모든 간세포와 전구세포가 CD34 표면 항원을 나타내기 때문에 수행한다.
배양을 35×10 ㎜ 페트리 디쉬(Nunc#174926)에서 최종부피 1.0 mL로 3벌 시작한다. 배양배지를 Terry Fox Labs.(HCC-4230 배지(Yerr Fox Labs, Vancouver, B.C., Canada))로부터 구입하고 에리트로포이에틴(Amgen, Thousand Oaks, CA.)을 배양배지에 첨가한다. 3,000-10,000 CD34+ 세포를 디쉬마다 첨가한다. 트랜스펙션된 포유동물 세포로부터 컨디셔닝된 배지에서 포유동물 세포 또는E. coli, 및 다기능 조혈 수용체 아고니스트 단백질로부터 정제되거나 트랜스펙션된 포유동물 세포 또는E. coli로부터 컨디셔닝된 배지로부터 정제된 재조합 IL-3을 첨가하여 최종농도범위 .001nM 내지 10nM을 제공한다. 재조합 hIL-3, GM-CSF, c-mpl 리간드와 다기능 조혈 수용체 아고니스트를 하우스에 제공한다. G-CSF(Neupogen)은 Amgen(Thousand Oaks Calf.)으로부터의 것이다. 배양물을 3cc 시링을 사용하여 재현탁시키고 1.0 mL를 디쉬마다 분배한다. 대조표준(기선응답) 배양물은 콜로니형성 자극인자를 수용하지 않았다. 양성 대조표준 배양물은 컨디셔닝된 배지(PHA 자극 사람 세포: Terry Fox Lab. H2400)를 수용한다. 배양물을 37℃, 습윤 공기중 5% CO2에서 배양한다. 50 세포보다 더 큰 것으로 정의된 조혈 콜로니를 40× 대물렌즈를 조합한 Nikon 도립상 현미경을 사용하여 피크 응답 일(10-11 일)을 센다. 50보다 적은 세포를 함유하는 세포군을 클러스터라 한다. 대안으로 콜로니를 슬라이드상에 펼침으로써 동정하고 염색할 수 있고 또는 그것을 취하고 재현탁시키고 시토스핀 슬라이드상에 염색을 위하여 회전시킬 수 있다.
사람 코드 블러드(cord blood) 조혈 성장인자 분석
골수세포는 종래에 조혈 콜로니형성 자극인자(CSF) 활성의 생체내 분석에 사용된다. 그러나 사람 골수는 항상 구입할 수 있는 것이 아니고 그리고 도너들 사이에 상당한 다양성이 있다. 탯줄 혈액은 조혈 간세포와 선구체의 공급원으로서 골수와 유사하다(Broxmeyer et al.,PNAS USA89: 4109-113, 1992; Mayani et al.,Blood81: 3252-3258, 1993). 골수와는 반대로 코드 블러드는 정규적인 공급원으로 좀더 쉽게 유용할 수 있다. 또한 몇몇 도너로부터 신선하게 얻은 세포를 푸울링함으로써 분석의 다양성을 감소시킬 수 있고 또는 이 목적을 위하여 냉동보존된 세포의 뱅크를 만들 수 있다. 배양조건의 변화, 및/또는 가계에 대한 특정 마커(marker)의 분석에의해 특히 과립구/매크로파지 콜로니(CFU-GM)에 대하여, 거핵구 CSF 활성에 대하여, 또는 높은 증식 잠재성 콜로니 형성 세포(HPP-CFC) 활성에 대하여 분석할 수 있다.
방법
단핵성 분자(MNC)를 수집 24시간내에 코드 블러드로부터 표준 밀도구배(1.077 g/mL Histopaque)를 사용하여 단리한다. 또한 코드 블러드 MNC를 CD14-,CD34+세포에 대한 면역자기적 선택; Applied Immune Science (Santa Clara, CA)로부터의 코팅된 플라스크를 사용한 SBA-,CD34+부분에 대한 팬닝; 및 CellPro(Bothell,WA) 어비딘 칼럼을 사용한 CD34+ 선택을 포함한 몇몇 방법에 의하여 간세포와 전구세포에대하여 풍부하게 한다. 신선하게 단리되거나 냉동보존된 CD34+ 세포 풍부 부분을 분석에 사용한다. 샘플의 각 연속 희석액(1pM 내지 1204pM의 농도범위)에 대한 2벌 배양물을 첨가의 증식DLSWK 없는 배지를 함유하는 0.9% AP티셀룰로스 1 ml에서 1x104 세포로 제조한다(Stem Cell Technologies, Vancouver, BC로 부터의 Methocult H4230). 몇몇 실험에서 에리트로포이에틴(EPO)을 함유하는 Methocult H4330을 Methocult H4230, 또는 Stem Cell Factor(SCF)대신 사용하였고 50㎍/mL(Biosource International, Camarillo, CA)를 첨가했다. 7-9일 배양한 후 >30 세포를 함유하는 콜로니를 계수한다. 기록에서 주관적인 편향을 제외하기 위하여 분석을 블라인드로 기록한다.
변이체를 생산시키고 박테리아, 포유동물 세포 또는 곤충 세포에서 그것들 발현시키는데 사용할 수 있는 재조합 DNA 방법, 원하는 단백질의 정제와 재접힘 및 단백질의 생체 활성을 결정하기 위한 분석 방법에 대한 추가의 상세한 내용은 여기에 전체가 참고로 포함된 공동출원된 출원 WO 95/00646, WO 94/12639, WO 94/12638, WO 95/20976, WO 95/21197, WO 95/20977, WO 95/21254 및 US 08/383,035에서 발견할 수 있다.
또한 본 분야에 숙련된 사람에게 공지된 상세한 기술은 여기에 참고로 포함된 T. Maniatis, et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982와 거기에 인용된 참고문헌 및 여기에 참고로 포함된 J. Sambrook, et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989와 거기에 인용된 참고문헌에서 발견할 수 있다.
표 1
올리고뉴클레오티드
[서열 13]
c-mplNcoI ACGTCCATGGCNTCNCCNGCNCCNCCTGCTTGTGCACTCCGAGTC
N=A,C,G 또는 T
[서열 14]
Ecompl ATGCACGAATTCCCTGACGCAGAGGGTGGA
[서열 15]
c-mplHindIII TGACAAGCTTACCTGACGCAGAGGGTGGACCCT
[서열 16]
4L-5' AATTCGGCAA
[서열 17]
AL-3' CATGTTGCCG
[서열 18]
5L-5' AATTCGGCGGCAA
[서열 19]
5L-3' CATGTTGCCGCCG
[서열 20]
8L-5' AATTCGGCGGCAACGGCGGCAA
[서열 21]
8L-3' CATGTTGCCGCCGTTGCCGCCG
[서열 22]
31-5' CGATCCATGGAGGTTCACCCTTTGCCT
[서열 23]
31-3' GATCAAGCTTATGGGCACTGGCTCAGTCT
[서열 24]
35-5' CGATACATGTTGCCTACACCTGTCCTG
[서열 25]
35-3' GATCAAGCTTAAGGGTGAACCTCTGGGCA
[서열 26]
39-5' CGATCCATGGTCCTGCTGCCTGCTGTG
[서열 27]
39-3' GATCAAGCTTAAGGTGTAGGCAAAGGGTG
[서열 28]
43-5' CGATCCATGGCTGTGGACTTTAGCTTGGGA
[서열 29]
43-3' GATCAAGCTTAAGGCAGCAGGACAGGTGT
[서열 30]
45-5' CGATCCATGGACTTTAGCTTGGGAGAA
[서열 31]
45-3' GATCAAGCTTACACAGCAGGCAGCAGGAC
[서열 32]
49-5' CGATCCATGGGAGAATGGAAAACCCAG
[서열 33]
49-3' GATCAAGCTTACAAGCTAAAGTCCACAGC
[서열 34]
82-5' CGATCCATGGGACCCACTTGCCTCTCA
[서열 35]
82-3' GATCAAGCTTACAGTTGTCCCCGTGCTGC
[서열 36]
109-5' CAGTCCATGGGAACCCAGCTTCCTCCA
[서열 37]
109-3' GATCAAGCTTAAAGGAGGCTCTGCAGGGC
[서열 38]
116-5' CGATCCATGGGCAGGACCACAGCTCAC
[서열 39]
116-3' GATCAAGCTTACTGTGGAGGAAGCTGGGTT
[서열 40]
120-5' CGATCCATGGCTCACAAGGATCCCAATGCC
[서열 41]
120-3' GATCAAGCTTATGTGGTCCTGCCCTGTGG
[서열 42]
123-5' CGATCCATGGATCCCAATGCCATCTTCCTG
[서열 43]
123-3' GATCAAGCTTACTTGTGAGCTGTGGTCCT
[서열 44]
126-5' CGATCCATGGCCATCTTCCTGAGCTTCCAA
[서열 45]
126-3' GATCAAGCTTAATTGGGATCCTTGTGAGCTGT
[서열 46]
[서열 47]
[서열 48]
Llsyn.for GTTACCCTTG AGCAAGCGCA GGAACAACAG GGTGGTGGCT CTAACTGCTC TATAATGAT
[서열 49]
Llsyn.rev CGATCATTAT AGAGCAGTTA GAGCCACCAC CCTGTTGTTC CTGCGCTTGC TCAAGG
[서열 50]
[서열 51]
[서열 52]
35start.seq GATCGACCAT GGCTCTGGAC CCGAACAACC TC
[서열 53]
34rev.seq CTCGATTACG TACAAAGGTG CAGGTGGT
[서열 54]
70start.seq GATCGACCAT GGCTAATGCA TCAGGTATTG AG
[서열 55]
69rev.seq CTCGATTACG TATTCTAAGT TCTTGACA
[서열 56]
91start.seq GATCGACCAT GGCTGCACCC TCTCGACATC CA
[서열 57]
90rev.seq CTCGATTACG TAGGCCGTGG CAGAGGGC
[서열 58]
101start.seq GATCGACCAT GGCTGCAGGT GACTGGCAAG AA
[서열 59]
100rev.seq CTCGATTACG TACTTGATGA TGATTGGA
[서열 60]
L-llstart.seq GCTCTGAGAG CCGCCAGAGC CGCCAGAGGG CTGCGCAAGG TGGCGTAGAA CGCG
[서열 61]
L-llstop.seq CAGCCCTCTG GCGGCTCTGG CGGCTCTCAG AGCTTCCTGC TCAAGTCTTT AGAG
[서열 62]
P-blstart.seq GGGCTGCGCA AGGTGGCG
[서열 63]
P-blstop.seq ACACCATTGG GCCCTGCCAG C
[서열 64]
39start.seq GATCGACCAT GGCTTACAAG CTGTGCCACC CC
[서열 65]
38stop.Seq CGATCGAAGC TTATTAGGTG GCACACAGCT TCTCCT
[서열 66]
97start.seq GATCGACCAT GGCTCCCGAG TTGGGTCCCA CC
[서열 67]
96stop.Seq CGATCGAAGC TTATTAGGAT ATCCCTTCCA GGGCCT
[서열 68]
126start.seq GATCGACCAT GGCTATGGCC CCTGCCCTGC AG
[서열 69]
125stop.Seq CGATCGAAGC TTATTATCCC AGTTCTTCCA TCTGCT
[서열 70]
133start.seq GATCGACCAT GGCTACCCAG GGTGCCATGC CG
[서열 71]
132stop.seq CGATCGAAGC TTATTAGGGC TGCAGGGCAG GGGCCA
[서열 72]
142start.seq GATCGACCAT GGCTTCTGCT TTCCAGCGCC GG
[서열 73]
141stop.Seq CGATCGAAGC TTATTAGGCG AAGGCCGGCA TGGCAC
[서열 74]
GLYXA1 GTAGAGGGCG GTGGAGGCTC C
[서열 75]
GLYXA2 CCGGGGAGCC TCCACCGCCC TCTAC
[서열 76]
lGGGSfor TTCTACGCCA CCTTGCGCAG CCCGGCGGCG GCTCTGACAT GTCTACACCA TTG
[서열 77]
lGGGSrev CAATGGTGTA GACATGTCAG AGCCGCCGCC GGGCTGCGCA AGGTGGCGTA GAA
[서열 240]
[서열 241]
표 2
유전자서열
pMON30304
[서열 78]
pMON26458
[서열 79]
pMON28548
[서열 80]
pMON28500
[서열 81]
pMON28501
[서열 82]
pMON28502
[서열 83]
Syntanl
[서열 84]
Syntan3
[서열 85]
pMON31104
[서열 86]
pMON31105
[서열 87]
pMON31106
[서열 88]
pMON31107
[서열 89]
pMON31108
[서열 90]
pMON31109
[서열 91]
pMON31110
[서열 92]
pMON31111
[서열 93]
pMON13182
[서열 94]
pMON13183
[서열 95]
pMON13184
[서열 96]
pMON13185
[서열 97]
pMON13186
[서열 98]
pMON13187
[서열 99]
pMON13188
[서열 100]
pMON13189
[서열 101]
pMON13190
[서열 102]
pMON13191
[서열 103]
pMON13192
[서열 104]
pMON13193
[서열 105]
pMON25190
[서열 106]
pMON25191
[서열 107]
pMON13194
[서열 108]
pMON13195
[서열 109]
pMON13196
[서열 110]
pMON13197
[서열 111]
pMON13198
[서열 112]
pMON13199
[서열 113]
pMON31112
[서열 114]
pMON31113
[서열 115]
pMON31114
[서열 116]
pMON31115
[서열 117]
pMON28505
[서열 118]
pMON28506
[서열 119]
pMON28507
[서열 120]
pMON28508
[서열 121]
pMON28509
[서열 122]
pMON28510
[서열 123]
pMON28511
[서열 124]
pMON28512
[서열 125]
pMON28513
[서열 126]
pMON28514
[서열 127]
pMON28515
[서열 128]
pMON28516
[서열 129]
pMON28519
[서열 130]
pMON28520
[서열 131]
pMON28521
[서열 132]
pMON28522
[서열 133]
pMON28523
[서열 134]
pMON28524
[서열 135]
pMON28525
[서열 136]
pMON28526
[서열 137]
pMON28527
[서열 138]
pMON28528
[서열 139]
pMON28529
[서열 140]
pMON28530
[서열 141]
pMON28533
[서열 142]
pMON28534
[서열 143]
pMON28535
[서열 144]
pMON28536
[서열 145]
pMON28537
[서열 146]
pMON28538
[서열 147]
pMON28539
[서열 148]
pMON28540
[서열 149]
pMON28541
[서열 150]
pMON28542
[서열 151]
pMON28543
[서열 152]
pMON28544
[서열 153]
pMON28545
[서열 154]
pMON15981
[서열 155]
pMON15982
[서열 156]
pMON15965
[서열 157]
pMON15966
[서열 158]
pMON15967
[서열 159]
pMON15960
[서열 160]
PMON32132
[서열 249]
PMON32133
[서열 250]
pMON32134
[서열 251]
Pmon13181
[서열 257]
Pmon13180.Seg
[서열 258]
표 3
단백질서열
pMON26458pep
[서열 161]
pMON28548pep
[서열 162]
pMON28500
[서열 163]
pMON28501
[서열 164]
pMON28502
[서열 165]
13182.Pept
[서열 166]
13183.Pept
[서열 167]
13184.Pept
[서열 168]
13185.Pept
[서열 169]
13186.Pept
[서열 170]
13187.Pept
[서열 171]
13188.Pept
[서열 172]
13189.Pept
[서열 173]
13190.Pept
[서열 174]
13191.Pept
[서열 175]
13192.Pept
[서열 176]
13193.Pept
[서열 177]
25190.Pept
[서열 178]
pMON25191.Pep
[서열 179]
13194.Pept
[서열 180]
13195.Pept
[서열 181]
13196.Pept
[서열 182]
13197.Pept
[서열 183]
13198.Pept
[서열 184]
13199.Pept
[서열 185]
31104.Pep
[서열 186]
31105.Pept
[서열 187]
31106.Pep
[서열 188]
31107.Pep
[서열 189]
31108.Pep
[서열 190]
31109.Pep
[서열 191]
31110.Pep
[서열 192]
31111.Pep
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pMON32132
[서열 252]
PMON32133
[서열 253]
PMON32134
[서열 254]
다음 실시예는 본 발명을 더 자세하게 설명하지만 그것은 이 상세한 실시예에 제한되지는 않는다는 것을 이해하게 될 것이다.
실시예1
친BHK발현벡터의 조립
A. 포유동물 발현플라스미드로부터의 AflⅢ부위의 제거
새로운 포유동물 발현벡터를 프레임내 NcoI-HindⅢ 또는 AflⅢ-HindⅢ 유전자 단편과 hIL-3 수용체 아고니스트 pMON13146(WO 94/12638)유전자에 대한 3' 및 마우스 IgG2b 링커 단편을 수용하도록 조립하였다. 우선 단일 AflⅢ부위를 pMON3359의 유도체인 pMON3934로부터 제거하였다. pMON3359는 포유동물 발현 카세트를 함유하는 pUC18-기재 벡터이다. 카세트는 단순성 포진바이러스 프로모터 IE110(-800 내지 +120) 다음에 변성된 사람 IL-3 시그날 펩티드 서열과 pUC18 폴리링커로 서브클로닝된 SV40 후기 폴리-아데닐화 (폴리-A) 시그날을 포함한다(Hippenmeyer et al., Bio/Technology, 1993, pp.1037-1041 참고). 세포의 외곽에 유전자 생산물의 분비작용을 촉진하는 변성된 사람 IL-3 시그날 서열은 5´단부상 BamHI부위와 3´단부상 유일한 NocI의 측면에 위치하게 된다. 유일한 HindⅢ부위는 NcoI부위에 대하여 3´이고 폴리-A 서열에 대하여 5´이다. 시그날 펩티드를 코딩하는 DNA서열을 하기에 나타냈다(제한효소 부위는 상기 나타냈다). NcoI 부위내 ATG(메티오닌)코돈은 프레임내 시그날 펩티드의 이니시에이터 ATG(밑줄)에 있다.
[서열 255]
시그날 AflⅢ부위를 AflⅢ로의 소화에의해 pMON3934로부터 제거한 후 DNA 중합효소와 누클레오티드의 첨가에의해 돌출부에 채웠다.소화된 DNA 단편을 Magic PCR Clean up 키트(Promaga)를 통하여 정제하고 T4 DNA 리가아제로 라이게이션시켰다. 라이게이션 반응물을 DH5αTM으로 형질전환시키고 세포를 LB-아갈과 암피실린상에 도말하였다. 각각의 콜로니를 만약 AflⅢ 부위를 제거했으면 단일 단편을 유발하는 AflⅢ과 HindⅢ으로의 제한분석에의해 AflⅢ 부위의 손실을 위하여 스크리닝하였다. 결과의 플라스미드를 pMON30275라 칭했다.
B. hIL-3 수용체 아고니스트 pMON13416/IgG2b 카세트의 pMON30275로의 전이
pMON30245로 부터의 NcoI-HindⅢ 단편(ca. 425 bp)을 pMON30275의 NcoI-HindⅢ 단편(ca. 3800 bp)에 라이게이션시켰다. pMON30245 (WO 94/12638)은 마우스 IgG2b 힌지단편에 연결된 hIL-3 수용체 아고니스트 pMON13416에 대한 유전자 코딩을 함유한다. AflⅢ 부위는 밀착하여 IgG2b 힌지에 대하여 3´이고 HindⅢ 부위에대하여 5´이다. 유전자는 hIL-3 변이체 pMON13416/IgG2b 힌지를 가지고 프레임내 NcoI-HindⅢ 또는 AflⅢ-HindⅢ 단편으로서 AflⅢ-HindⅢ 부위로 클로닝 될 수 있어 새로운 키메라를 생산한다. NcoI 부위과 AflⅢ 부위는 적합성 돌출부를 갖고 있으며 라이게이션할 것이지만 두 인식부위를 잃게 된다. 마우스 IgG2b 힌지 부분과 연결된 hIL-3 변이체 pMON13416에 대하여 코딩하는 서열 78의 DNA 서열을 함유하는 플라스미드인 pMON30304는 이 클로닝의 결과물이었다.
실시예 2
이량체 주형의 c-mpl 리간드 (1-153)유전자의 하나의 카피를 함유하는 중간 플라스미드의 조립
c-mpl(1-153) 리간드 다음의 유일 EcoRI 제한부위의 코딩서열로 플라스미드 DNA를 발생시키기 위하여 유전자를 역전사효소/중합효소 연쇄반응 (RT/PCR)을 통하여 단리시켰다. 사람 태아 (lot #38130)와 성인 간 (lot #46018) A+ RNA를 c-mpl 리간드 메신저 RNA (mRNA)의 공급원에 대하여 Clontech (Palo Alto, CA)로부터 얻었다. 제 1 가닥 cDNA 반응을 Invitrogen (San Diego, CA)로부터 얻은 cDNA CycleTMKit를 사용하여 수행했다. RT 반응에서 임의의 프라이머들과 올리고 dT 프라이머를 사람과 태아 간 mRNA의 조합물로부터 cDNA를 발생시키는데 사용했다. 아미노산 1-153을 코딩하는 c-mpl 리간드 유전자 단편의 증폭을 위하여 RT생산물을 프라이머 조합물 즉 정방향 프라이머: 서열 13의 c-mplNcoI과 역방향 프라이머: Ecompl을 가지고 PCR에 대한 주형으로 썼다. c-mplNcoI 프라이머를 c-mpl 리간드 유전자(Genebank 공탁 #L33410 또는 de Sauvage et al.,Nature369: 533-538(1994))로부터의 c-mpl 리간드 서열에 기초한 염기 #279-311)에 어닐링시켰는데 이것은 c-mpl 리간드의 제 1 코돈 (Ser+1)에 대한 5´에 밀착하여 NcoI 제한효소 부위를 코딩한다. NcoI 제한효소 부위는 Ser+1전의 메티오닌과 알라닌코돈에 대하여 코딩하고 c-mpl 리간드의 Ala 코돈과 제 1 4개의 코돈 (Ser, Pro, Ala, 그리고 Pro)에 대한 코돈축퇴를 포함한다. Ecompl 프라이머를 c-mpl 리간드의 염기 #720-737에 어닐링시켰는데 이것은 프레임내 Arg-153에 밀착한, 다음 c-mpl 리간드 유전자로 EcoRI 부위(GAATTC)를 코딩한다. EcoRI 부위는 Arg-153 다음에 Glu와 Phe 코돈을 발생시킨다. ca. 480 bp PCR 생산물을 정제하고 NcoI와 EcoRI로 소화시키고 pMON3993(ca. 4550 bp)의 NcoI-EcoRI 벡터 단편에 라이게이션시켰다. pMON3993은 pMON3359(실시예1에서 기술)의 유도체였다. BamHI단편으로서 IE110프로모터와 폴리-A 시그날 사이의 유일 BamHI 부위에 서브클로닝된 사람 IL-3시그날 펩티드 서열은 그것의 3´단부에 NcoI 부위를 함유하고 다음에 유일 EcoRI 부위가 있다. 서열 161의 c-mpl 리간드 아미노산 1-153에 대하여 코딩하는 서열 79의 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 pMON26458은 이 클로닝의 결과물이었다.
실시예 3
이량체 주형의 제 2 유전자를 함유하는 친 플라스미드의 조립
아미노산 153 (ARG)다음의 종결 코돈으로 아미노산 1 (Ser)에서 시작하는 c-mpl 리간드 유전자 단편의 증폭을 위하여 실시예 2로부터의 RT 반응물을 다음 프라이머의 조합물: 서열 13의 c-mplNcoI(정방향 프라이머)과 서열 15의 c-mplHindⅢ(역방향 프라이머)을 가지고 PCR에 대한 주형으로 썼다. 서열 13의 c-mplNcoI 프라이머는 실시예 2에 기술했다. c-mpl 리간드의 염기 #716-737에 어닐링시킨 서열 15의 c-mplHindⅢ 프라이머는 말단 코돈과 마지막 코돈인 Arg153에 밀착한, 다음 HindⅢ 제한 효소 부위 모두를 첨가한다.
PCR 생산물의 두가지 형태를 아미노산 112-115에 대한 코돈이 결여된 것과 이 코돈이 결여되지 않은 것인 RT cDNA 샘플들로부터 발생시켰다. c-mpl 리간드 PCR 생산물(ca. 480 bp)을 포유동물 발현 벡터인 pMON3934로 전이하기 위하여 NcoI와 HindⅢ 제한효소로 소화시켰다. pMON3934를 NcoI와 HindⅢ (ca. 3800 bp)로 소화시켰는데 이것은 PCR생산물을 수용할 것이다.
서열 252의 c-mpl 리간드 아미노산 1-153에 대하여 코딩하는 플라스미드인 서열 249의 pMON32132는 이 클로닝의 결과물이었다. 서열 253의 c-mpl 리간드 아미노산 1-153에 대하여 코딩하는 플라스미드인 서열 250의 pMON32134는 이 클로닝의 결과물이었다. 서열 254의 코돈 112-115 (△112-115)를 결여한 c-mpl 리간드 아미노산 1-153에 대하여 코딩하는 플라스미드인 서열 251의 pMON32133도 또한 이 클로닝의 결과물이었다.
실시예 4
제 2 c-mpl 리간드 유전자에서 △112-115를 결여한 PCR 이량체 주형 5L의 발생
c-mpl 리간드의 새로운 형태를 발생시키기 위한 PCR 주형을 EcoRI/AflⅢ 5L합성 올리고누클레오티드 링커의 서열 18의 5L-5´와 서열 19의 5L-3´과 함께 pMON32133(아미노산 112-115 결여)로 부터의 1 Kbp NcoI/BstⅩI 단편에 pMON26458의 3.7 Kbp BstⅩI/EcoRI 단편을 라이게이션시킴으로써 조립하였다.
링커의 EcoRI 단부는 pMON26458의 EcoRI 단부에 라이게이션할 것이다. 링커의 AflⅢ 단부는 pMON32133의 NcoI부위에 라이게이션할 것이고 제한 부위는 라이게이션이 유지되지 않을 것이다. pMON32133과 pMON26458의 BstⅩI 부위도 또한 라이게이션할 것이다. 플라스미드인 pMON28548은 클로닝의 결과물이고 서열 162의 아미노산 112-115가 없는 아미노산 1-153 c-mpl 리간드에 서열 222의 GluPheGlyGlyAsnMetAla 링커를 통하여 융합된 아미노산 1-153 c-mpl 리간드를 코딩하는 서열 80의 DNA 서열을 함유한다.
실시예 5
PCR 이량체 주형 4L의 발생
c-mpl 리간드의 새로운 형태를 발생시키기 위한 PCR 주형을 EcoRI/AflⅢ 4L 합성 올리고누클레오티드 링커의 서열 16의 4L-5´와 서열 17의 4L-3´과 함께 pMON32132로 부터의 1 Kbp NcoI/BstⅩI 단편에 pMON26458의 3.7 Kbp BstⅩI/EcoRI 단편을 라이게이션시킴으로써 조립하였다.
링커의 EcoRI 단부는 pMON26458의 EcoRI 단부에 라이게이션할 것이다. 링커의 AflⅢ 단부는 pMON32132의 NcoI부위에 라이게이션할 것이고 제한 부위는 라이게이션이 유지되지 않을 것이다. pMON26458과 pMON32132의 BstⅩI 부위도 또한 라이게이션할 것이다. 플라스미드인 pMON28500은 클로닝의 결과물이고 서열 163의 아미노산 1-153 c-mpl 리간드에 서열 223의 GluPheGlyAsnMetAla 링커(4L)를 통하여 융합된 아미노산 1-153 c-mpl 리간드를 코딩하는 서열 82의 DNA 서열을 함유한다.
실시예 6
PCR 이량체 주형 5L의 발생
c-mpl 리간드의 새로운 형태를 발생시키기 위한 PCR 주형을 EcoRI/AflⅢ 5L 합성 올리고누클레오티드 링커의 서열 18의 5L-5´와 서열 19의 5L-3´과 함께 pMON32132로 부터의 1 Kbp NcoI/BstⅩI 단편에 pMON26458의 3.7 Kbp BstⅩI/EcoRI 단편을 라이게이션시킴으로써 조립하였다.
링커의 EcoRI 단부는 pMON26458의 EcoRI 단부에 라이게이션할 것이다. 링커의 AflⅢ 단부는 pMON32132의 NcoI부위에 라이게이션할 것이고 제한 부위는 라이게이션이 유지되지 않을 것이다. pMON26458과 pMON32132의 BstⅩI 부위도 또한 라이게이션할 것이다. 플라스미드인 pMON28501은 클로닝의 결과물이고 서열 164의 아미노산 1-153 c-mpl 리간드에 서열 222의 GluPheGlyGlyAsnMetAla 링커(5L)를 통하여 융합된 아미노산 1-153 c-mpl 리간드를 코딩하는 서열 82의 DNA 서열을 함유한다.
실시예 7
PCR 이량체 주형 8L의 발생
c-mpl 리간드의 새로운 형태를 발생시키기 위한 PCR 주형을 EcoRI/AflⅢ 8L 합성 올리고누클레오티드 링커의 서열 20의 8L-5´와 서열 21의 8L-3´과 함께 pMON32134로 부터의 1 Kbp NcoI/BstⅩI 단편에 pMON26458의 3.7 Kbp BstⅩI/EcoRI 단편을 라이게이션시킴으로써 조립하였다.
링커의 EcoRI 단부는 pMON26458의 EcoRI 단부에 라이게이션할 것이다. 링커의 AflⅢ 단부는 pMON32134의 NcoI부위에 라이게이션할 것이고 제한 부위는 라이게이션이 유지되지 않을 것이다. pMON26458과 pMON32134의 BstⅩI 부위도 또한 라이게이션할 것이다. 플라스미드인 pMON28502는 서열 83의 DNA 서열을 함유하는 클로닝의 결과물이고 이것은 서열 165의 아미노산 1-153 c-mpl 리간드에 서열 224의 GluPheGlyGlyAsnGlyGlyAsnMetAla 링커(8L)를 통하여 융합된 아미노산 1-153 c-mpl 리간드를 코딩한다.
실시예 8-44
새로운 N-말단과 C-말단을 가진 새로운 c-mpl 리간드 유전자의 발생
A. 새로운 c-mpl 리간드 수용체 아고니스트를 코딩하는 유전자의 PCR 발생
새로운 c-mpl 리간드 수용체 아고니스트를 코딩하는 유전자를 Metchod Ⅲ(Horlick et al.,Prot. Eng.5: 427-433, 1992)를 사용하여 발생시켰다. PCR 반응을 이량체 주형, pMONs 28500, 28501 28502 또는 28548 및 하기 합성 프라이머 세트중 하나의 세트 (제 1 번호는 원래의 서열에서 제 1 아미노산의 위치를 말하는 것이다. 예를들어 31-5´와 31-3´은 원래의 서열의 잔기 31에 대응하는 코돈에서 시작하는 서열을 위한 5´과 3´올리고 프라이머를 수용성 있게 말하는 것이다.
(서열 22) 31-5' 및 (서열 23) 31-3' (서열 24) 35-5' 및 (서열 25) 35-3' (서열 26) 39-5' 및 (서열 27) 39-3' (서열 28) 43-5' 및 (서열 29) 43-3' (서열 30) 45-5' 및 (서열 31) 45-3' (서열 32) 49-5' 및 (서열 33) 49-3' (서열 34) 82-5' 및 (서열 35) 82-3' (서열 36) 109-5' 및 (서열 37) 109-3' (서열 38)116-5' 및 (서열 39) 116-3' (서열 40) 120-5' 및 (서열 41) 120-3' (서열 42) 123-5' 및 (서열 43) 123-3' (서열 44) 126-5' 및 (서열 45) 126-3'
B. 키메라의 발생을 위한 포유동물 발현벡터로의 새로운 c-mpl 수용체 아고니스트 유전자 생산물의 서브클로닝
c-mpl 수용체 아고니스트 유전자 PCR 생산물을 포유동물 발현벡터로 전이시키기 위하여 NcoI와 HindⅢ 또는 AflⅢ와 HindⅢ 제한효소(ca. 470 bp)로 소화시켰다. 발현벡터인 pMON30304를 NcoI와 HindⅢ (ca. 4200 bp)로 소화시켰는데 이것은 NcoI-HindⅢ 또는 AflⅢ-HindⅢ 단편으로서 PCR 생산물을 수용한다. PCR 생산물의 제한소화와 결과의 플라스미드를 표 4에 나타냈다.
실시예 # PCR 주형 PCR생성물프라이머세트 PCR생성물제한 소화 링커 결과의플라스미드pMON c-mpl 리간드에서의 브레이크포인트
실시예 8 pMON28501 31 NcoI/HindIII 5L 28505 30-31
실시예 9 pMON28501 35 AflIII/HindIII 5L 28506 34-35
실시예 10 pMON28501 39 NcoI/HindIII 5L 28507 38-39
실시예 11 pMON28501 43 NcoI/HindIII 5L 28508 42-43
실시예 12 pMON28501 45 NcoI/HindIII 5L 28509 44-45
실시예 13 pMON28501 49 NcoI/HindIII 5L 28510 48-49
실시예 14 pMON28501 82 NcoI/HindIII 5L 28511 81-82
실시예 15 pMON28501 109 NcoI/HindIII 5L 28512 108-109
실시예 16 pMON28501 116 NcoI/HindIII 5L 28513 115-116
실시예 17 pMON28501 120 NcoI/HindIII 5L 28514 119-120
실시예 18 pMON28501 123 NcoI/HindIII 5L 28515 122-123
실시예 19 pMON28501 126 NcoI/HindIII 5L 28516 125-126
실시예 20 pMON28500 31 NcoI/HindIII 4L 28519 30-31
실시예 21 pMON28500 35 AflIII/HindIII 4L 28520 34-35
실시예 22 pMON28500 39 NcoI/HindIII 4L 28521 38-39
실시예 23 pMON28500 43 NcoI/HindIII 4L 28522 42-43
실시예 24 pMON28500 45 NcoI/HindIII 4L 28523 44-45
실시예 25 pMON28500 49 NcoI/HindIII 4L 28524 48-49
실시예 26 pMON28500 82 NcoI/HindIII 4L 28525 81-82
실시예 27 pMON28500 109 NcoI/HindIII 4L 28526 108-109
실시예 28 pMON28500 116 NcoI/HindIII 4L 28527 115-116
실시예 29 pMON28500 120 NcoI/HindIII 4L 28528 119-120
실시예 30 pMON28500 123 NcoI/HindIII 4L 28529 122-123
실시예 31 pMON28500 126 NcoI/HindIII 4L 28530 125-126
실시예 32 pMON28502 31 NcoI/HindIII 8L 28533 30-31
실시예 33 pMON28502 35 AflIII/HindIII 8L 28534 34-35
실시예 34 pMON28502 39 NcoI/HindIII 8L 28535 38-39
실시예 35 pMON28502 43 NcoI/HindIII 8L 28536 42-43
실시예 # PCR 주형 PCR생성물프라이머세트 PCR생성물제한 소화 링커 결과의플라스미드pMON c-mpl 리간드에서의 브레이크포인트
실시예 36 pMON28502 45 NcoI/HindIII 8L 28537 44-45
실시예 37 pMON28502 49 NcoI/HindIII 8L 28538 48-49
실시예 38 pMON28502 82 NcoI/HindIII 8L 28539 81-82
실시예 39 pMON28502 109 NcoI/HindIII 8L 28540 108-109
실시예 40 pMON28502 116 NcoI/HindIII 8L 28541 115-116
실시예 41 pMON28502 120 NcoI/HindIII 8L 28542 119-120
실시예 42 pMON28502 123 NcoI/HindIII 8L 28543 122-123
실시예 43 pMON28502 126 NcoI/HindIII 8L 28544 125-126
실시예 44 pMON28548 123 NcoI/HindIII 5L 28545 122-123
실시예 45
pMON15960의 조립
새로운 N-말단과 C-말단을 갖는 G-CSF SeR17을 클로닝하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드를 조립하는데 사용된 중간 플라스미드인 pMON15960의 조립. 플라스미드 pACYC177 (Chang, A.C.Y. and Cohen, S.N.J.Bacteriol. 134: 1141-1156, 1978) DNA를 3092 염기쌍 HindⅢ, BamHⅠ 단편을 유발하는 제한효소 HindⅢ와 BamHⅠ로 소화시켰다. 플라스미드인 pMON13037 (WO 95/21254), DNA를 616 염기쌍 BglⅡ, FspⅠ 단편을 유발하는 BglⅡ와 FspⅠ로 소화시켰다. 플라스미드인 pMON13037, DNA의 제 2 샘플을 556 염기쌍 NcoI,HindⅢ 단편을 유발하는 NcoI와 HindⅢ로 소화시켰다. 합성 DNA 올리고누클레오티드의 서열 76의 1GGGSfor와 서열 77의 1GGGSrev를 각각 어닐링시킨다음 21 염기쌍 AflⅢ, FspⅠ 단편을 유발하는 AflⅢ와 FspⅠ로 소화시켰다.제한 단편을 라이게이션시키고 라이게이션 반응 혼합물을E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시키는데 사용하였다. 형질전환 박테리아를 암피실린-함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 단리시키고 제한분석으로 분석하여 적당한 삽입물을 확인했다.
실시예 46
pMON15981의 조립
다기능 조혈 수용체 아고니스트를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드인 pMON15981의 조립. 플라스미드인 pMON15960, DNA를 제한효소 SmaⅠ로 소화시키고 576 염기쌍의 DNA 단편의 증폭을 유발하는 프라이머로서 합성 DNA 올리고누클레오티드의 서열 65의 38 Stop과 서열 64의 39 Start를 사용한 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. 증폭단편을 558 염기쌍의 HindⅢ, NcoI 단편을 유발하는 제한효소 HindⅢ와 NcoI로 소화시켰다. 플라스미드인 pMON13181, DNA를 4068 염기쌍의 HindⅢ, AflⅢ 단편을 유발하는 HindⅢ와 AflⅢ로 소화시켰다. 제한단편을 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시키는데 사용하였다. 형질전환 박테리아를 암피실린-함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 단리시키고 제한분석으로 분석하고 서열결정하여 적합한 삽입물을 확인하였다. 플라스미드인 pMON15981은 다음 아미노산 서열을 코딩하는 서열 155의 DNA 서열을 함유한다:
(서열 195)
실시예 47
pMON15982의 조립
다기능 조혈 수용체 아고니스트를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드인 pMON15982의 조립. 플라스미드인 pMON15960, DNA를 제한효소 SmaⅠ로 소화시키고 576 염기쌍의 DNA 단편의 증폭을 유발하는 프라이머로서 합성 DNA 올리고누클레오티드의 서열 67의 96 Stop과 서열 66의 97Start를 사용한 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. 증폭단편을 558 염기쌍의 HindⅢ, NcoI 단편을 유발하는 제한효소 HindⅢ와 NcoI로 소화시켰다. 플라스미드인 pMON13181, DNA를 4068 염기쌍의 HindⅢ, AflⅢ 단편을 유발하는 HindⅢ와 AflⅢ로 소화시켰다. 제한단편을 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시키는데 사용하였다. 형질전환 박테리아를 암피실린-함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 단리시키고 제한분석으로 분석하고 서열결정하여 적합한 삽입물을 확인하였다. 플라스미드인 pMON15982는 다음 아미노산 서열을 코딩하는 서열 157의 DNA서열을 함유한다:
(서열 196)
실시예 48
pMON15965의 조립
다기능 조혈 수용체 아고니스트를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드인 pMON15965의 조립. 플라스미드인 pMON15960, DNA를 제한효소 SmaⅠ로 소화시키고 576 염기쌍의 DNA 단편의 증폭을 유발하는 프라이머로서 합성 DNA 올리고누클레오티드의 서열 73의 142 Stop과 서열 72의 141 Start를 사용한 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. 증폭단편을 558 염기쌍의 HindⅢ, NcoI 단편을 유발하는 제한효소 HindⅢ와 NcoI로 소화시켰다. 플라스미드인 pMON13181, DNA를 4068 염기쌍의 HindⅢ, AflⅢ 단편을 유발하는 HindⅢ와 AflⅢ로 소화시켰다. 제한단편을 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시키는데 사용하였다. 형질전환 박테리아를 암피실린-함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 단리시키고 제한분석으로 분석하고 서열결정하여 적합한 삽입물을 확인하였다. 플라스미드인 pMON15965는 다음 아미노산 서열을 코딩하는 서열 157의 DNA 서열을 함유한다:
(서열 196)
실시예 49
pMON15966의 조립
다기능 조혈 수용체 아고니스트를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드인 pMON15966의 조립. 플라스미드인 pMON15960, DNA를 제한효소 SmaⅠ로 소화시키고 576 염기쌍의 DNA 단편의 증폭을 유발하는 프라이머로서 합성 DNA 올리고누클레오티드의 서열 68의 126 Stop과 서열 69의 125 Start를 사용한 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. 증폭단편을 558 염기쌍의 HindⅢ, NcoI 단편을 유발하는 제한효소 HindⅢ와 NcoI로 소화시켰다. 플라스미드인 pMON13181, DNA를 4068 염기쌍의 HindⅢ, AflⅢ 단편을 유발하는 HindⅢ와 AflⅢ로 소화시켰다. 제한단편을 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을E. coli K-12 균주 JM101을 형질전환시키는데 사용하였다. 형질전환 박테리아를 암피실린-함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 단리시키고 제한분석으로 분석하고 서열결정하여 적합한 삽입물을 확인하였다. 플라스미드인 pMON15966은 다음 아미노산 서열을 코딩하는 서열 158의 DNA 서열을 함유한다:
(서열 198)
실시예 50
pMON15967의 조립
다기능 조혈 수용체 아고니스트를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드인 pMON15967의 조립. 플라스미드인 pMON15960, DNA를 제한효소 SmaⅠ로 소화시키고 576 염기쌍의 DNA 단편의 증폭을 유발하는 프라이머로서 합성 DNA 올리고누클레오티드의 서열 71의 132 Stop과 서열 70의 133 Start를 사용한 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. 증폭단편을 558 염기쌍의 HindⅢ, NcoI 단편을 유발하는 제한효소 HindⅢ와 NcoI로 소화시켰다. 플라스미드인 pMON13181, DNA를 4068 염기쌍의 HindⅢ, AflⅢ 단편을 유발하는 HindⅢ와 AflⅢ로 소화시켰다. 제한단편을 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을E. coli K-12 균주 JM101을 형질전환시키는데사용하였다. 형질전환 박테리아를 암피실린-함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 단리시키고 제한분석으로 분석하고 서열결정하여 적합한 삽입물을 확인하였다. 플라스미드인 pMON15967은 다음 아미노산 서열을 코딩하는 서열 159의 DNA 서열을 함유한다:
실시예 51
다기능성 조혈 수용체 아고니스트를 코딩하는 DNA서열을 함유하는 플라스미드를 조립하기 위해 사용된 중간플라스미드인 pMON13180의 조립
플라스미드인 pMON13046(WO 95/21254), DNA를 제한 엔도누클라아제 XmaI 및 SnaBI로 소화시킨 결과, 4018 염기쌍 벡터단편을 얻었다. 상기 4018 염기쌍 XmaI-SnaBI 단편을 25 염기쌍 XmaI-SnaBI 삽입단편이 유지되지 않는 Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 합성 올리고누클레오티드의 상보쌍인 서열 74의 glyxa1 및 서열 75의 glyxa2를 인자 Xa 절단부위를 코딩하는 서열을 제거하도록 설계하였다. 적절히 조립하면 이들 올리고누클레오티드 또한 XmaI 및 SnaBI 단부로 된다. 프라이머인, glyxa1 및 glyxa2를 10분간 70℃에서 가열하여 어닐링완충액(20mM Tris-HCl pH 7.5, 10mM MgCl2, 50mM NaCl)중에서 어닐링하고 서서히 냉각시켰다. pMON13046으로부터의 4018 염기쌍 XmaI-SnaBI단편을 T4 DNA리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조립된 올리고누클레오티드와 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환주로부터 분리하고 PCR계 분석으로 분석하였다. 선별된 형질전환주로부터의 플라스미드 DNA를 올리고누클레오티드의 정확한 삽입체를 확인하기위해 서열결정하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13180로 칭하였고 서열 **의 DNA서열을 함유한다.
실시예 52
다기능성 조혈 수용체 아고니스트를 코딩하는 DNA서열을 함유하는 플라스미드를 조립하기 위해 사용된 중간플라스미드인 pMON13181의 조립
플라스미드인 pMON13047(WO 95/21254), DNA를 제한 엔도누클라아제 XmaI 및 SnaBI로 소화시킨 결과, 4063 염기쌍 벡터단편을 얻었다. 상기 4063 염기쌍 XmaI-SnaBI 단편을 25 염기쌍 XmaI-SnaBI 삽입단편이 유지되지 않는 Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 합성 올리고누클레오티드의 상보쌍인, 서열 74의 glyxa1 및 서열 75의 glyxa2를 인자 Xa 절단부위를 코딩하는 서열을 제거하도록 설계하였다. 적절히 조립하면 이들 올리고누클레오티드 또한 XmaI 및 SnaBI 단부로 된다. glyxa1 및 glyxa2를 10분간 70℃에서 가열하여 어닐링완충액중에서 어닐링하고 서서히 냉각시켰다. pMON13047로부터의 4063 염기쌍 XmaI-SnaBI단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조립된 올리고누클레오티드와 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환주로부터 분리하고 PCR계 분석을 사용하여 분석하였다. 선별된 형질전환주로부터의 플라스미드 DNA를 올리고누클레오티드의 정확한 삽입체를 확인하기위해 서열결정하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13181로 칭하였고 서열 **의 DNA서열을 함유한다.
실시예 53
pMON13182의 조립
Materials and Methods에 기재된 Method I를 사용하여 pMON13182중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 64의 39 start 및 서열 60의 L-11 start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 65의 38 stop 및 서열 61의 L-11 stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 프라이머 39 start 및 38 stop을 사용하여 어닐링된 단편 start 및 stop으로부터 전장(full-length)의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 생산하고 증폭하였다.
새로운 유전자를 함유하는, 결과된 DNA단편을 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시키고 Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison,WI)를 사용하여 정제하였다. 중간플라스미드인 pMON13180을 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4023염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison,WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13182로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON13182로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON13182는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 94의 DNA서열를 함유한다:
(서열 166)
실시예 54
pMON13183의 조립
pMON13183중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method I을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 64의 39 start 및 서열 60의 L-11 start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 "단편 start"를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 65의 38 stop 및 서열 61의 L-11 stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 39 start 및 38 stop을 사용하여 어닐링된 단편 start 및 stop으로부터 생산하고 증폭하였다.
새로운 유전자를 함유하는, 결과된 DNA단편을 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시키고 Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison,WI)를 사용하여 정제하였다. 중간 플라스미드인 pMON13181를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4068 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13183로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON13183로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON13183는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 95의 DNA서열을 함유한다:
(서열 167)
실시예 55
pMON13184의 조립
pMON13184중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method I을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 66의 97 start 및 서열 60의 L-11 start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 67의 96 stop 및 서열 61의 L-11 stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 97 start 및 96 stop을 사용하여 어닐링된 단편 start 및 stop으로부터 생산하고 증폭하였다.
새로운 유전자를 함유하는, 결과된 DNA단편을 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시키고 Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison,WI)를 사용하여 정제하였다. 중간 플라스미드인 pMON13180를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4023 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13184로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON13184로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON13184는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 96의 DNA서열을 함유한다:
(서열 168)
실시예 56
pMON13185의 조립
pMON13185중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method I을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 66의 97 start 및 서열 60의 L-11 start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 67의 96 stop 및 서열 61의 L-11 stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 97 start 및 96 stop을 사용하여 어닐링된 단편 start 및 stop으로부터 생산하고 증폭하였다.
새로운 유전자를 함유하는, 결과된 DNA단편을 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시키고 Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison,WI)를 사용하여 정제하였다. 중간 플라스미드인 pMON13181를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4068 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13185로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON13185로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON13185는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 67의 DNA서열을 함유한다:
(서열 169)
실시예 57
pMON13186의 조립
pMON13186중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method I을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 68의 126 start 및 서열 60의 L-11 start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 69의 125 stop 및 서열 61의 L-11 stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 126 start 및 125 stop을 사용하여 어닐링된 단편 start 및 stop으로부터 생산하고 증폭하였다.
새로운 유전자를 함유하는, 결과된 DNA단편을 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시키고 Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison,WI)를 사용하여 정제하였다. 중간 플라스미드인 pMON13180를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4023 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13186로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON13186로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON13186는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 98의 DNA서열을 함유한다:
(서열 170)
실시예 58
pMON13187의 조립
pMON13187중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method I을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 68의 126 start 및 서열 60의 L-11 start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 69의 125 stop 및 서열 61의 L-11 stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 126 start 및 125 stop을 사용하여 어닐링된 단편 start 및 stop으로부터 생산하고 증폭하였다.
새로운 유전자를 함유하는, 결과된 DNA단편을 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시키고 Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison,WI)를 사용하여 정제하였다. 중간 플라스미드인 pMON13181를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4068 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13187로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON13187로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON13187는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 99의 DNA서열을 함유한다:
(서열 171)
실시예 59
pMON13188의 조립
pMON13188중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method I을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 70의 133 start 및 서열 60의 L-11 start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 71의 132 stop 및 서열 61의 L-11 stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 133 start 및 132 stop을 사용하여 어닐링된 단편 start 및 stop으로부터 생산하고 증폭하였다.
새로운 유전자를 함유하는, 결과된 DNA단편을 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시키고 Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison,WI)를 사용하여 정제하였다. 중간 플라스미드인 pMON13180를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4023 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13188로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON13188로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON13188는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 100의 DNA서열을 함유한다:
(서열 172)
실시예 60
pMON13189의 조립
pMON13189중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method I을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 70의 133 start 및 서열 60의 L-11 start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 71의 132 stop 및 서열 61의 L-11 stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 133 start 및 132 stop을 사용하여 어닐링된 단편 start 및 stop으로부터 생산하고 증폭하였다.
새로운 유전자를 함유하는, 결과된 DNA단편을 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시키고 Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison,WI)를 사용하여 정제하였다. 중간 플라스미드인 pMON13181를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4068 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13189로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON13189로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON13189는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 101의 DNA서열을 함유한다:
(서열 173)
실시예 61
pMON13190의 조립
pMON13190중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method I을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 72의 142 start 및 서열 60의 L-11 start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 73의 141 stop 및 서열 61의 L-11 stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 142 start 및 141 stop을 사용하여 어닐링된 단편 start 및 stop으로부터 생산하고 증폭하였다.
새로운 유전자를 함유하는, 결과된 DNA단편을 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시키고 Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison,WI)를 사용하여 정제하였다. 중간 플라스미드인 pMON13180를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4023 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13190로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON13190로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON13190는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 102의 DNA서열을 함유한다:
(서열 174)
실시예 62
pMON13191의 조립
pMON13191중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method I을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 72의 142 start 및 서열 60의 L-11 start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 73의 141 stop 및 서열 61의 L-11 stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 142 start 및 141 stop을 사용하여 어닐링된 단편 start 및 stop으로부터 생산하고 증폭하였다.
새로운 유전자를 함유하는, 결과된 DNA단편을 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시키고 Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison,WI)를 사용하여 정제하였다. 중간 플라스미드인 pMON13181를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4068 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13191로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON13191로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON13191는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 103의 DNA서열을 함유한다:
(서열 175)
실시예 63
pMON13192의 조립
pMON13192중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method II을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 64의 39 start 및 서열 62의 P-bl start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 65의 38 stop 및 서열 63의 P-bl stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 단편 start를 제한 엔도누클레아제 NcoI로 소화시키고, 단편 stop을 제한 엔도누클레아제 HindIII로 소화시켰다. 정제후, 상기 소화된 단편 start 및 stop을 pMON3934의 대략 3800 염기쌍 NcoI-HindIII 벡터 단편과 조합하고 라이게이션하였다.
상기한 중간플라스미드는 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 함유했고 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시켰다. 소화된 DNA를 1% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고 Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 분리하였다. 중간 플라스미드인 pMON13180를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4023 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 새로운 유전자의 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13192로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON13192로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON13192는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 104의 DNA서열을 함유한다:
13192.Pept
(서열 176)
실시예 64
pMON13193의 조립
pMON13193중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method II을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 64의 39 start 및 서열 62의 P-bl start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 65의 38 stop 및 서열 63의 P-bl stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 단편 start를 제한 엔도누클레아제 NcoI로 소화시키고, 단편 stop을 제한 엔도누클레아제 HindIII로 소화시켰다. 정제후, 상기 소화된 단편 start 및 stop을 pMON3934의 대략 3800 염기쌍 NcoI-HindIII 벡터 단편과 조합하고 라이게이션하였다.
상기한 중간플라스미드는 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 함유했고 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시켰다. 소화된 DNA를 1% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고 Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 분리하였다. 중간 플라스미드인 pMON13181를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4068 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 새로운 유전자의 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13193로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON13193로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON13193는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 105의 DNA서열을 함유한다:
(서열 177)
실시예 65
pMON25190의 조립
pMON25190중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method II을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 66의 97 start 및 서열 62의 P-bl start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 67의 96 stop 및 서열 63의 P-bl stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 단편 start를 제한 엔도누클레아제 NcoI로 소화시키고, 단편 stop을 제한 엔도누클레아제 HindIII로 소화시켰다. 정제후, 상기 소화된 단편 start 및 stop을 pMON3934의 대략 3800 염기쌍 NcoI-HindIII 벡터 단편과 조합하고 라이게이션하였다.
상기한 중간플라스미드는 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 함유했고 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시켰다. 소화된 DNA를 1% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고 Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 분리하였다. 중간 플라스미드인 pMON13180를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4023 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 새로운 유전자의 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON25190로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON25190로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON25190는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 106의 DNA서열을 함유한다:
(서열 178)
실시예 66
pMON25191의 조립
pMON25191중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method II을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 66의 97 start 및 서열 62의 P-bl start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 98의 96 stop 및 서열 63의 P-bl stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 단편 start를 제한 엔도누클레아제 NcoI로 소화시키고, 단편 stop을 제한 엔도누클레아제 HindIII로 소화시켰다. 정제후, 상기 소화된 단편 start 및 stop을 pMON3934의 대략 3800 염기쌍 NcoI-HindIII 벡터 단편과 조합하고 라이게이션하였다.
상기한 중간플라스미드는 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 함유했고 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시켰다. 소화된 DNA를 1% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고 Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 분리하였다. 중간 플라스미드인 pMON13181를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4068 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 새로운 유전자의 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON25191로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON25191로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON25191는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 107의 DNA서열을 함유한다:
(서열 179)
실시예 67
pMON13194의 조립
pMON13194중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method II을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 68의 126 start 및 서열 62의 P-bl start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 67의 125 stop 및 서열 63의 P-bl stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 단편 start를 제한 엔도누클레아제 NcoI로 소화시키고, 단편 stop을 제한 엔도누클레아제 HindIII로 소화시켰다. 정제후, 상기 소화된 단편 start 및 stop을 pMON3934의 대략 3800 염기쌍 NcoI-HindIII 벡터 단편과 조합하고 라이게이션하였다.
상기한 중간플라스미드는 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 함유했고 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시켰다. 소화된 DNA를 1% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고 Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 분리하였다. 중간 플라스미드인 pMON13180를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4023 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 새로운 유전자의 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13194로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON13194로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON13194는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 108의 DNA서열을 함유한다:
(서열 180)
실시예 68
pMON13195의 조립
pMON13195중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method II을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 68의 126 start 및 서열 62의 P-bl start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 69의 125 stop 및 서열 63의 P-bl stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 단편 start를 제한 엔도누클레아제 NcoI로 소화시키고, 단편 stop을 제한 엔도누클레아제 HindIII로 소화시켰다. 정제후, 상기 소화된 단편 start 및 stop을 pMON3934의 대략 3800 염기쌍 NcoI-HindIII 벡터 단편과 조합하고 라이게이션하였다.
상기한 중간플라스미드는 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 함유했고 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시켰다. 소화된 DNA를 1% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고 Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 분리하였다. 중간 플라스미드인 pMON13181를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4068 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 새로운 유전자의 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13195로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON13195로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON13195는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 109의 DNA서열을 함유한다:
(서열 181)
실시예 69
pMON13196의 조립
pMON13196중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method II을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 70의 133 start 및 서열 62의 P-bl start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF 서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 71의 132 stop 및 서열 63의 P-bl stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 단편 start를 제한 엔도누클레아제 NcoI로 소화시키고, 단편 stop을 제한 엔도누클레아제 HindIII로 소화시켰다. 정제후, 상기 소화된 단편 start 및 stop을 pMON3934의 대략 3800 염기쌍 NcoI-HindIII 벡터 단편과 조합하고 라이게이션하였다.
상기한 중간플라스미드는 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 함유했고 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시켰다. 소화된 DNA를 1% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고 Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 분리하였다. 중간 플라스미드인 pMON13180를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4023 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 새로운 유전자의 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13196로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON13196로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON13196는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 110의 DNA서열을 함유한다:
(서열 182)
실시예 70
pMON13197의 조립
pMON13197중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method II을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 70의 133 start 및 서열 62의 P-bl start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 71의 132 stop 및 서열 63의 P-bl stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 단편 start를 제한 엔도누클레아제 NcoI로 소화시키고, 단편 stop을 제한 엔도누클레아제 HindIII로 소화시켰다. 정제후, 상기 소화된 단편 start 및 stop을 pMON3934의 대략 3800 염기쌍 NcoI-HindIII 벡터 단편과 조합하고 라이게이션하였다.
상기한 중간플라스미드는 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 함유했고 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시켰다. 소화된 DNA를 1% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고 Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 분리하였다. 중간 플라스미드인 pMON13181를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4068 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 새로운 유전자의 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13197로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON13197로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON13197는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 111의 DNA서열을 함유한다:
(서열 183)
실시예 71
pMON13198의 조립
pMON13198중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method II을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 72의 142 start 및 서열 62의 P-bl start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 73의 141 stop 및 서열 63의 P-bl stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 단편 start를 제한 엔도누클레아제 NcoI로 소화시키고, 단편 stop을 제한 엔도누클레아제 HindIII로 소화시켰다. 정제후, 상기 소화된 단편 start 및 stop을 pMON3934의 대략 3800 염기쌍 NcoI-HindIII 벡터 단편과 조합하고 라이게이션하였다.
상기한 중간플라스미드는 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 함유했고 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시켰다. 소화된 DNA를 1% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고 Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 분리하였다. 중간 플라스미드인 pMON13180를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4023 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 새로운 유전자의 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13198로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON13198로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON13198는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 112의 DNA서열을 함유한다:
(서열 184)
실시예 72
pMON13199의 조립
pMON13199중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 Materials and Methods에 기재된 Method II을 사용하여 생산하였다. 프라이머 세트인 서열 72의 142 start 및 서열 62의 P-bl start를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 start를 생산하고 증폭하였다. 프라이머 세트인 서열 73의 141 stop 및 서열 63의 P-bl stop를 사용하여 pMON13037중의 G-CSF Ser17서열로부터 단편 stop을 생산하고 증폭하였다. 단편 start를 제한 엔도누클레아제 NcoI로 소화시키고, 단편 stop을 제한 엔도누클레아제 HindIII로 소화시켰다. 정제후, 상기 소화된 단편 start 및 stop을 pMON3934의 대략 3800 염기쌍 NcoI-HindIII 벡터 단편과 조합하고 라이게이션하였다.
상기한 중간플라스미드는 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 함유했고 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 HindIII로 소화시켰다. 소화된 DNA를 1% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고 Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 전장의 새로운 N-말단/C-말단 G-CSF Ser17유전자를 분리하였다. 중간 플라스미드인 pMON13181를 제한 엔도누클레아제 HindIII 및 AflIII로 소화시킨 결과, 4068 염기쌍 벡터단편을 얻었고, Magic DNA Clean-up System kit(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 제한 단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 조합하고 라이게이션하였다. 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 새로운 유전자의 정확한 삽입체를 확인하였다. 그 결과된 플라스미드를 pMON13199로 칭하였다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON13199로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON13199는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 113의 DNA서열을 함유한다:
(서열 185)
실시예 73
직렬로 중복된(tandemly-duplicated) 플라스미드 주형인 Syntan1의 조립
직렬로 중복된 hIL-3 수용체 아고니스트 pMON13416 주형인 syntan1을 생산하기 위해, 세 개의 DNA를 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim)를 사용하여 라이게이션에 의해 연결하였다. 세 개의 DNA는: 1)hIL-3 수용체 아고니스트 pMON13416을 함유하고, BstEII 및 SnaBI로 소화시킨 pMON13046; 2)원래의 단백질의 C-말단 및 N-말단 단부를 연결하는 링커를 코딩하는 서열과 소량의 주위 pMON13416 서열을 함유하고, 적절히 조립하면 BstEII 및 C1aI 단부로 되는, 합성 올리고누클레오티드의 어닐링된 상보쌍인 서열 48의 L1syn.for 및 서열 49의 L1syn.rev; 3)pMON13046을 C1aI(DNA를 dam- 세포인 DM1(Life Technologies)중에서 생장시킴) 및 SnaBI로 소화시킨 hIL-3 수용체 아고니스트 pMON13416의 부분이다. 상기 소화시킨 DNA를 0.9% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고 Geneclean(Bio101)를 사용하여 분리했다.
상기 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. Miniprep DNA를 형질전환주로부터 분리하고, 이 형질전환주를 PCR계 분석을 사용하여 선별하였다. 선별된 형질전환주로부터의 플라스미드 DNA를 서열결정하여 정확한 주형을 얻었다. 결과된 플라스미드를 syntan1로 칭하였고 서열 84의 DNA서열을 함유한다.
실시예 74
직렬로 중복된 주형인 syntan3의 조립
직렬로 중복된 hIL-3 수용체 아고니스트 pMON13416 주형인 syntan3을 생산하기 위해, 세 개의 DNA를 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim)를 사용하여 라이게이션에 의해 연결하였다. 세 개의 DNA는: 1)hIL-3 수용체 아고니스트 pMON13416을 함유하고, BstEII 및 SnaBI로 소화시킨 pMON13046; 2)원래의 단백질의 C-말단 및 N-말단 단부를 연결하는 링커를 코딩하는 서열과 소량의 주위 pMON13416 서열을 함유하고, 적절히 조립하면 BstEII 및 SnaBI 단부로 되는, 합성 올리고누클레오티드의 어닐링된 상보쌍인 서열 50의 L3syn.for 및 서열 51의 L3syn. rev; 3)pMON13046을 C1aI(DNA를 dam- 세포인 DM1(Life Technologies)중에서 생장시킴) 및 SnaBI로 소화시킨 hIL-3 수용체 아고니스트 pMON13416의 부분이다. 상기 소화시킨 DNA를 0.9% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고 Geneclean(Bio101)를 사용하여 분리했다.
상기 라이게이션반응물의 일부를E. coli균주 DH5α세포(LifeTechnologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. Miniprep DNA를 형질전환주로부터 분리하고, 이 형질전환주를 PCR계 분석을 사용하여 선별하였다. 선별된 형질전환주로부터의 플라스미드 DNA를 서열결정하여 정확한 주형을 얻었다. 결과된 플라스미드를 syntan3로 칭하였고 서열 85의 DNA서열을 함유한다.
실시예 75
pMON31104의 조립
Materials and Methods에 기재된 Method III를 사용하여 pMON31104중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 생산하였다. hIL-3 수용체 아고니스트 pMON13416의, 전장의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 프라이머 세트 서열 52의 35 start 및 서열 53의 34 rev를 사용하여 중간플라스미드인 Syntan1으로부터 생산하고 증폭하였다.
새로운 유전자를 함유하는, 결과된 DNA단편을 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 SnaBI로 소화시켰다. 소화시킨 DNA단편을 1% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고, Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 분리하였다. 정제하고 소화시킨 DNA단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)을 사용하여, 발현벡터인 pMON13189로 라이게이션하였다. pMON13189 DNA를 NcoI 및 SnaBI로 미리 소화시켜서 hIL3 수용체 아고니스트 pMON13416 코딩서열을 제거하였고 0.8% TAE 겔 상에 용해 후에 Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 4254 염기쌍 벡터 단편을 분리하고 에티듐 브로마이드으로 염색하였다. 라이게이션반응물의 일부를E.coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별했다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인했다. 결과된 플라스미드를 pMON31104로 칭했다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON31104로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON31104는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 86의 DNA서열을 함유한다:
(서열 186)
실시예 76
pMON31105의 조립
Materials and Methods에 기재된 Method III를 사용하여 pMON31105중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 생산하였다. hIL-3 수용체 아고니스트 pMON13416의, 전장의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 프라이머 세트 서열 54의 70 start 및 서열 55의 69 rev를 사용하여 중간플라스미드인 Syntan1으로부터 생산하고 증폭하였다.
새로운 유전자를 함유하는, 결과된 DNA단편을 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 SnaBI로 소화시켰다. 소화시킨 DNA단편을 1% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고, Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 분리하였다. 정제하고 소화시킨 DNA단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)을 사용하여, 발현벡터인 pMON13189로 라이게이션하였다. pMON13189 DNA를 NcoI 및 SnaBI로 미리 소화시켜서 hIL3 수용체 아고니스트 pMON13416 코딩서열을 제거하였고 0.8% TAE 겔 상에 용해 후에 Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 4254 염기쌍 벡터 단편을 분리하고 에티듐 브로마이드으로 염색하였다. 라이게이션반응물의 일부를E.coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별했다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인했다. 결과된 플라스미드를 pMON31105로 칭했다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON31105로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON31105는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 87의 DNA서열을 함유한다:
(서열 187)
실시예 77
pMON31106의 조립
Materials and Methods에 기재된 Method III를 사용하여 pMON31106중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 생산하였다. hIL-3 수용체 아고니스트 pMON13416의, 전장의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 프라이머 세트 서열 56의 91 start 및 서열 57의 90 rev를 사용하여 중간플라스미드인 Syntan1으로부터 생산하고 증폭하였다.
새로운 유전자를 함유하는, 결과된 DNA단편을 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 SnaBI로 소화시켰다. 소화시킨 DNA단편을 1% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고, Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 분리하였다. 정제하고 소화시킨 DNA단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)을 사용하여, 발현벡터인 pMON13189로 라이게이션하였다. pMON13189 DNA를 NcoI 및 SnaBI로 미리 소화시켜서 hIL3 수용체 아고니스트 pMON13416 코딩서열을제거하였고 0.8% TAE 겔 상에 용해 후에 Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 4254 염기쌍 벡터 단편을 분리하고 에티듐 브로마이드으로 염색하였다. 라이게이션반응물의 일부를E.coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별했다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인했다. 결과된 플라스미드를 pMON31106로 칭했다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON31106로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON31106는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 80의 DNA서열을 함유한다:
(서열 188)
실시예 78
pMON31107의 조립
Materials and Methods에 기재된 Method III를 사용하여 pMON31107중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 생산하였다. hIL-3 수용체 아고니스트 pMON13416의, 전장의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 프라이머 세트 서열 58의 101 start 및 서열 59의 100 rev를 사용하여 중간플라스미드인 Syntan1으로부터 생산하고 증폭하였다.
새로운 유전자를 함유하는, 결과된 DNA단편을 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 SnaBI로 소화시켰다. 소화시킨 DNA단편을 1% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고, Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 분리하였다. 정제하고 소화시킨 DNA단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)을 사용하여, 발현벡터인 pMON13189로 라이게이션하였다. pMON13189 DNA를 NcoI 및 SnaBI로 미리 소화시켜서 hIL3 수용체 아고니스트 pMON13416 코딩서열을 제거하였고 0.8% TAE 겔 상에 용해후에 Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 4254 염기쌍 벡터 단편을 분리하고 에티듐 브로마이드으로 염색하였다. 라이게이션반응물의 일부를E.coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별했다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인했다. 결과된 플라스미드를 pMON31107로 칭했다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON31107로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON31107는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 89의 DNA서열을 함유한다:
(서열 189)
실시예 79
pMON31108의 조립
Materials and Methods에 기재된 Method III를 사용하여 pMON31108중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 생산하였다. hIL-3 수용체 아고니스트 pMON13416의, 전장의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 프라이머 세트 서열 52의 35 start 및 서열 53의 34 rev를 사용하여 중간플라스미드인 Syntan3으로부터 생산하고 증폭하였다.
새로운 유전자를 함유하는, 결과된 DNA단편을 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 SnaBI로 소화시켰다. 소화시킨 DNA단편을 1% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고, Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 분리하였다. 정제하고 소화시킨 DNA단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)을 사용하여, 발현벡터인 pMON13189로 라이게이션하였다. pMON13189 DNA를NcoI 및 SnaBI로 미리 소화시켜서 hIL3 수용체 아고니스트 pMON13416 코딩서열을 제거하였고 0.8% TAE 겔 상에 용해후에 Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 4254 염기쌍 벡터 단편을 분리하고 에티듐 브로마이드으로 염색하였다. 라이게이션반응물의 일부를E.coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별했다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인했다. 결과된 플라스미드를 pMON31108로 칭했다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON31108로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON31108는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 90의 DNA서열을 함유한다:
(서열 190)
실시예 80
pMON31109의 조립
Materials and Methods에 기재된 Method III를 사용하여 pMON31109중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 생산하였다. hIL-3 수용체 아고니스트 pMON13416의, 전장의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 프라이머 세트 서열 54의 70 start 및 서열 55의 69 rev를 사용하여 중간플라스미드인 Syntan3으로부터 생산하고 증폭하였다.
새로운 유전자를 함유하는, 결과된 DNA단편을 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 SnaBI로 소화시켰다. 소화시킨 DNA단편을 1% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고, Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 분리하였다. 정제하고 소화시킨 DNA단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)을 사용하여, 발현벡터인 pMON13189로 라이게이션하였다. pMON13189 DNA를 NcoI 및 SnaBI로 미리 소화시켜서 hIL3 수용체 아고니스트 pMON13416 코딩서열을제거하였고 0.8% TAE 겔 상에 용해후에 Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 4254 염기쌍 벡터 단편을 분리하고 에티듐 브로마이드으로 염색하였다. 라이게이션반응물의 일부를E.coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별했다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인했다. 결과된 플라스미드를 pMON31109로 칭했다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON31109로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON31109는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 91의 DNA서열을 함유한다:
(서열 191)
실시예 81
pMON31110의 조립
Materials and Methods에 기재된 Method III를 사용하여 pMON31110중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 생산하였다. hIL-3 수용체 아고니스트 pMON13416의, 전장의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 프라이머 세트 서열 56의 91 start 및 서열 57의 90 rev를 사용하여 중간플라스미드인 Syntan3으로부터 생산하고 증폭하였다.
새로운 유전자를 함유하는, 결과된 DNA단편을 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 SnaBI로 소화시켰다. 소화시킨 DNA단편을 1% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고, Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 분리하였다. 정제하고 소화시킨 DNA단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)을 사용하여, 발현벡터인 pMON13189로 라이게이션하였다. pMON13189 DNA를 NcoI 및 SnaBI로 미리 소화시켜서 hIL3 수용체 아고니스트 pMON13416 코딩서열을 제거하였고 0.8% TAE 겔 상에 용해후에 Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 4254 염기쌍 벡터 단편을 분리하고 에티듐 브로마이드으로 염색하였다. 라이게이션반응물의 일부를E.coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별했다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인했다. 결과된 플라스미드를 pMON31110로 칭했다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON31110로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON31110는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 92의 DNA서열을 함유한다:
(서열 192)
실시예 82
pMON31111의 조립
Materials and Methods에 기재된 Method III를 사용하여 pMON31111중의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 생산하였다. hIL-3 수용체 아고니스트 pMON13416의, 전장의 새로운 N-말단/C-말단 유전자를 프라이머 세트 서열 58의 101 start 및 서열 59의 100 rev를 사용하여 중간플라스미드인 Syntan3으로부터 생산하고 증폭하였다.
새로운 유전자를 함유하는, 결과된 DNA단편을 제한 엔도누클레아제 NcoI 및 SnaBI로 소화시켰다. 소화시킨 DNA단편을 1% TAE겔 상에 용해시키고, 에티듐 브로마이드으로 염색하고, Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 분리하였다. 정제하고 소화시킨 DNA단편을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)을 사용하여, 발현벡터인 pMON13189로 라이게이션하였다. pMON13189 DNA를NcoI 및 SnaBI로 미리 소화시켜서 hIL3 수용체 아고니스트 pMON13416 코딩서열을 제거하였고 0.8% TAE 겔 상에 용해후에 Geneclean(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 4254 염기쌍 벡터 단편을 분리하고 에티듐 브로마이드으로 염색하였다. 라이게이션반응물의 일부를E.coli균주 DH5α세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 형질전환하는데 사용하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별했다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인했다. 결과된 플라스미드를 pMON31111로 칭했다.
E. coli균주 JM101을 봉입체로부터 단백질발현 및 단백질 분리를 위해 pMON31111로 형질전환하였다.
플라스미드인 pMON31111는 이후의 아미노산서열을 코딩하는 서열 93의 DNA서열을 함유한다:
(서열 193)
실시예 83
pMON31112의 조립
hIL-3 수용체 및 G-CSF 수용체를 활성화시키는, 다기능성 조혈수용체 아고니스트를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드인 pMON31112의 조립. 플라스미드, pMON13189 DNA를 제한효소 NcoI 및 XmaI로 소화시켜서 NcoI, XmaI벡터 단편을 얻었고, 이 단편을 0.8% 아가로즈겔로부터 분리하고 정제하였다. 제 2 플라스미드인 pMON13222(WO 94/12639, US serial # 08/411,796)로부터의 DNA를 NcoI 및 EcoRI로 소화시킨 결과 281 염기쌍 NcoI, EcoRI 단편을 얻었다. 이 단편을 1.0% 아가로즈겔로부터 분리하고 정제하였다. 두 개의 올리고누클레오티드 서열 240의 SYNNOXA1.REQ 및 서열 241의 SYNNOXA2.REQ를 어닐링하고 pMON13222로부터의 281염기쌍 DNA 단편으로 pMON13189로부터의 DNA 벡터단편에 라이게이션하였다. 라이게이션혼합물의 일부를E.coliK-12 균주 JM101로 형질전환하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 제한분석으로 분리하고 분석하여 EcoRV 단편의 존재를 증명하였고, 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인하였다.
플라스미드, pMON31112는 이후의 아미노산 서열을 코딩하는 서열 114의 DNA서열을 함유한다:
(서열 199)
pMON31113의 조립
hIL-3 수용체 및 G-CSF 수용체를 활성화시키는, 다기능성 조혈수용체 아고니스트를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드인 pMON31113의 조립. 플라스미드인 pMON13197 DNA를 제한효소 NcoI 및 XmaI로 소화시켜서 NcoI, XmaI벡터 단편을 얻었고, 이 단편을 0.8% 아가로즈겔로부터 분리하고 정제하였다. 제 2 플라스미드인 pMON13239(WO 94/12639, US serial # 08/411,796)로부터의 DNA를 NcoI 및 EcoRI로 소화시킨 결과 281 염기쌍 NcoI, EcoRI 단편을 얻었다. 이 단편을 1.0% 아가로즈겔로부터 분리하고 정제하였다. 두 개의 올리고누클레오티드 서열 240의 SYNNOXA1.REQ 및 서열 241의 SYNNOXA2.REQ를 어닐링하고 pMON13239로부터의 281염기쌍 DNA 단편으로 pMON13197로부터의 DNA 벡터단편에 라이게이션하였다. 라이게이션혼합물의 일부를E.coliK-12 균주 JM101로 형질전환하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 제한분석으로 분리하고 분석하여 EcoRV 단편의 존재를 증명하였고, 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인하였다.
플라스미드, pMON31113는 이후의 아미노산 서열을 코딩하는 서열 115의 DNA서열을 함유한다:
(서열 200)
실시예 85
pMON31114의 조립
hIL-3 수용체 및 G-CSF 수용체를 활성화시키는, 다기능성 조혈수용체 아고니스트를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드인 pMON31114의 조립. 플라스미드, pMON13189 DNA를 제한효소 NcoI 및 XmaI로 소화시켜서 NcoI, XmaI벡터 단편을 얻었고, 이 단편을 0.8% 아가로즈겔로부터 분리하고 정제하였다. 제 2 플라스미드인 pMON13239(WO 94/12639, US serial # 08/411,796)로부터의 DNA를 NcoI 및 EcoRI로 소화시킨 결과 281 염기쌍 NcoI, EcoRI 단편을 얻었다. 이 단편을 1.0% 아가로즈겔로부터 분리하고 정제하였다. 두 개의 올리고누클레오티드 서열 240의 SYNNOXA1.REQ 및 서열 241의 SYNNOXA2.REQ를 어닐링하고 pMON13239로부터의 281염기쌍 DNA 단편으로 pMON13189로부터의 DNA 벡터단편에 라이게이션하였다. 라이게이션혼합물의 일부를E.coliK-12 균주 JM101로 형질전환하였다. 형질전환주 발테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 제한분석으로 분리하고 분석하여 EcoRV 단편의 존재를 증명하였고, 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인하였다.
플라스미드, pMON31114는 이후의 아미노산 서열을 코딩하는 서열 116의 DNA서열을 함유한다:
(서열 201)
실시예 86
pMON31115의 조립
hIL-3 수용체 및 G-CSF 수용체를 활성화시키는, 다기능성 조혈수용체 아고니스트를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드인 pMON31115의 조립. 플라스미드, pMON13197 DNA를 제한효소 NcoI 및 XmaI로 소화시켜서 NcoI, XmaI벡터 단편을 얻었고, 이 단편을 0.8% 아가로즈겔로부터 분리하고 정제하였다. 제 2 플라스미드인 pMON13222로부터의 DNA를 NcoI 및 EcoRI로 소화시킨 결과 281 염기쌍 NcoI, EcoRI 단편을 얻었다. 이 단편을 1.0% 아가로즈겔로부터 분리하고 정제하였다. 두 개의 올리고누클레오티드 서열 240의 SYNNOXA1.REQ 및 서열 241의 SYNNOXA2.REQ를 어닐링하고 pMON13222로부터의 281염기쌍 DNA 단편으로 pMON13197로부터의 DNA 벡터단편에 라이게이션하였다. 라이게이션혼합물의 일부를E.coliK-12 균주 JM101로 형질전환하였다. 형질전환주 박테리아를 암피실린함유 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 제한분석으로 분리하고 분석하여 EcoRV 단편의 존재를 증명하였고, 서열결정하여 정확한 삽입체를 확인하였다.
플라스미드, pMON31115는 이후의 아미노산 서열을 코딩하는 서열 117의 DNA서열을 함유한다:
(서열 202)
실시예 87
다기능성 조혈수용체 아고니스트 단백질의 시험관내 활성의 측정
다기능성 조혈수용체 아고니스트 단백질의 단백질농도를 친화성 정제된 폴리클론 항체에 기준하여 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정할 수 있다. 대안으로서 단백질농도를 아미노산 조성물분석으로 측정할 수 있다. 다기능성 조혈수용체 아고니스트의 대생물 활성을 다수의 시험관내 분석으로 측정할 수 있다. 예를들면hIL-3수용체 및 G-CSF수용체를 결합하는 다기능성 조혈수용체 아고니스트를, hIL-3 및/또는 G-CSF수용체를 발현하는 세포주를 사용하여 세포증식분석으로 분석할 수 있다. 그러한 한가지 분석은 AML-193 세포증식분석이다. AML-193세포는 측정할 IL-3/G-CSF 다기능성 조혈수용체 아고니스트의 조합된 대생물 활성을 허용하는 IL-3 및 G-CSF에 반응한다. 다른 그러한 분석은 TF1세포증식분석이다.
게다가 쥐과 IL-3 의존세포주인 M-NFS-60(ATCC. CRL1838) 또는 32D와 같은, 다른 인자의존세포주를 사용할 수 있다. IL-3의 활성은 종 특이적인 반면에 G-CSF는 그렇지 않고, 그러므로 IL-3/G-CSF 다기능성 조혈수용체 아고니스트의 G-CSF성분의 대생물 활성을 독립적으로 측정할 수 있다. 주어진 리간드에 대해 수용체를 발현시키지 않는 BHK 또는 쥐과 Baf/3와 같은 세포주를, 원하는 수용체를 코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드로 트랜스펙션할 수 있다. 그러한 세포주의 예는 hG-CSF 수용체(BaF3/hG-CSF)로 트랜스펙션한 Baf3이다. 이들 세포주중의 다기능성 조혈수용체 아고니스트의 활성을 hIL-3 또는 G-CSF와 각각 또는 함께 비교할 수 있다. BaF3/hG-CSF 세포증식 및 TF1 세포증식분석으로 분석한 본 발명의 다기능성 조혈수용체 아고니스트의 예의 대생물 활성을 표 5 및 표 6에 제시한다. 다기능성 조혈수용체 아고니스트의 대생물 활성을 표준 단백질 pMON13056(WO 95/21254)와 비교한 상대활성으로 표시한다. BaF3/c-mpl 세포증식 및 TF1 세포증식분석으로 분석한 본 발명의 다기능성 조혈수용체 아고니스트의 예의 대생물 활성을 표 7 및 표 8에 제시한다.
이중 IL-3/G-CSF 수용체 아고니스트의 세포증식활성
pMON BaF3/hG-CSF 수용체 세포증식분석상대활성* TF1세포증식분석상대활성*
13182 0.015 1.1
13183 0.02 nd
13184 0.01 0.3
13185 0.023 0.36
13186 0.36 0.45
13187 0.07 0.26
13188 0.64 1.3
13189 0.58 1.37
13190 0.045 1.2
13191 0.14 2.7
13192 0.09 2.2
13193 0.06 3.0
25190 nd nd
25191 0.43 1.2
13194 nd nd
13195 1.3 4.3
13196 0.66 0.5
13197 0.6 0.77
13198 0.6 0.5
13199 nd nd
15982 0.7 1.9
15981 0.068 1.2
15965 0.7 0.82
15966 0.36 1.48
15967 0.62 1.37
nd = 구해지지 않음*다기능성 조혈 수용체 아고니스트의 대생물 활성을 표준단백질 pMON 13056과 비교한 상대활성으로 표시함. n = 3이상
이중 IL-3/G-CSF 수용체 아고니스트의 세포증식활성
pMON BaF3/hG-CSF 수용체 세포증식분석상대활성 TF1세포증식분석상대활성
31104 + +
31105 + +
31106 + +
31107 nd nd
31108 + +
31109 + +
31110 nd nd
31111 nd nd
31112 + +
31113 + +
31114 + +
31115 + +
31116 nd nd
31117 nd nd
nd = 구해지지 않음† 다기능성 조혈 수용체 아고니스트의 대생물 활성(n=1 또는 2)을 표준단백질 pMON 13056과 비교한 상대활성으로 표시함."+"는 분자가 pMON 13056과 유사함을 표시함.
세포증식활성
pMON Baf3/c-mpl 수용체 세포증식분석활성* TF1세포증식분석활성
28505 - +
28506 - +
28507 - +
28508 - +
28509 - +
28510 - +
28511 + +
28512 + +
28513 + +
28514 + +
28519 - +
28520 - +
28521 - +
28522 - +
28523 - +
28524 - +
28525 + +
28526 + +
28533 - +
28534 - +
28535 - +
28536 - +
28537 - +
28538 - +
28539 + +
28540 + +
28541 + +
28542 + +
28543 + +
28544 + +
28545 + +
*c-mpl 리간드(1-153)에 관하여, c-mpl 수용체로 트랜스펙션된 Baf3 세포주에서 측정한 활성.† pMON13056에 관하여 측정한 활성
유사한 방법으로 해당 기술분야의 당업자에게 공지되어 있는 다른 인자 의존세포주를 원하는 다기능성 조혈 수용체 아고니스트의 대생물 활성을 측정하는데 사용할 수 있다. 메틸셀룰로오스 분석을, 조혈 전구세포의 팽창에 대한 다기능성 조혈 수용체 아고니스트의 효과와 시험관내 조혈 콜로니의 상이한 유형의 양상을 측정하는데 사용할 수 있다. 100,000 투입세포당 전구체의 빈도를 측정하기 때문에 메틸셀룰로오스 분석으로 전구체빈도의 평가를 얻을 수 있다. 장기의 간질의존성 배양을 초기 조혈 전구체 및 간세포를 나타내는데 사용하였다. 이 분석을 다기능성 조혈 수용체 아고니스트가 매우 초기의 전구체 및/또는 간세포의 팽창을 자극하는지를 측정하는데 사용할 수 있다. 게다가 다기능성 조혈 수용체 아고니스트로 자극된 초기의 전구체의 빈도를 표시하는 제한희석배양을 수행할 수 있다.
pMON# IL-3 아고니스트 활성(AML 세포 증식 분석) c-mol 수용체 아고니스트 활성(Baf/3-c-mpl 세포 증식 분석)
28505 + -
28506 + -
28507 + -
28508 + -
28509 + -
28510 + -
28511 + +
28512 + +
28513 + +
28514 + +
28515 + +
28519 + -
28520 + -
28521 + -
28522 + -
28523 + -
28524 + -
28525 + +
28526 + +
28527 + +
28528 + +
28529 + +
28535 + -
28539 + +
28540 + +
28541 + +
28542 + +
28545 + +
28551 + +
28571 + +
실시예 88
단일의 또는 다중의 아미노산 치환을 함유하는 G-CSF 변이체를 WO 94/12639 및 WO 94/12638에 기재된 PCR 돌연변이유발기술을 사용하여 제조했다. 이들 및 다른 변이체(즉, 아미노산 치환, 삽입, 결실 그리고 N-말단 또는 C-말단 연장)또한, 합성유전자조립 또는 부위 특이적 돌연변이유발(Taylor et al.,Nucl. Acids Res.,13: 7864-8785[1985]; Kunkel et al.,proc. Natl. Acad. Sci. USA,82: 488-492[1985]; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,[1989], (WO 94/12639) 및 (WO 94/12638) 참조)을 포함하는 다양한 다른 방법을 사용하여, 해당분야의 당업자에 의해 제조할 수 있다. 이들 치환을 따로따로 또는 다른 아미노산치환, 및/또는 결실, 및/또는 삽입 및/또는 연장과 조합하여 수행할 수 있다. 변화의 서열확인 후에, 제조를 위해 플라스미드 DNA를 적합한 동물세포, 곤충세포 또는E.coli와 같은 박테리아균주로 트랜스펙션할 수 있다. 활성인 G-CSF의 공지되어 있는 변이체는, 위치 1(Thr에서 Ser, Arg 또는 Gly까지), 2(Pro에서 Leu까지), 3(Leu에서 Arg 또는 Ser까지) 및 17(Cys에서 Ser까지)에서의 치환과 아미노산 1-11을 포함한다(Kuga et al.Biochemical and Biophysical Research Comm.159:103-111(1989)). 이들 G-CSF 아미노산치환 변이체는, 새로운 N-말단 및 새로운 C-말단이 생산되는 G-CSF수용체 아고니스트를 생산하기 위한 주형으로서 사용할 수 있다. G-CSF 아미노산 치환 변이체의 예를 표 9에 제시한다.
실시예 89
G-CSF 아미노산 치환 변이체의 대생물 활성측정
G-CSF 아미노산 치환 변이체를, 사람 G-CSF 수용체로 트랜스펙션된 Baf/3 세포주를 사용하여 세포증식활성에 대해 분석할 수 있다. G-CSF 아미노산 치환 변이체의 예의 대생물 활성을 본래의 사람 G-CSF에 관하여 표 9에 제시한다. "+"는 본래의 아미노산에 대해 유사한 활성을 표시하고 "-"는 상당히 감소하거나 측정 가능한 활성이 없음을 표시한다.
사람 G-CSF 수용체로 트랜스펙션한 BAF3 세포주중의 G-CSF 변이체의 세포증식활성
aa위치 본래의 aa 돌연변이체 aa 활성*
13 Phe Ser +
13 Phe His +
13 Phe Thr +
13 Phe Pro +
16 Lys Pro +
16 Lys Ser +
16 Lys Thr +
16 Lys His +
18 Leu Pro +
18 Leu Thr +
18 Leu His +
18 Leu Cys +
18 Leu Ile +
19 Glu Ala -
19 Glu Thr -
19 Glu Arg -
19 Glu Pro -
19 Glu Leu -
19 Glu Ser -
22 Arg Tyr +
22 Arg Ser +
22 Arg Ala +
22 Arg Thr +
24 Ile Pro +
24 Ile Leu +
24 Ile Tyr +
aa위치 본래의 aa 돌연변이체 aa 활성
27 Asp Gly +
30 Ala Ile +
30 Ala Leu +
34 Lys Ser +
43 His Gly +
43 His Thr +
43 His Val +
43 His Lys +
43 His Trp +
43 His Ala +
43 His Arg +
43 His Cys +
43 His Leu +
44 Pro Arg +
44 Pro Asp +
44 Pro Val +
44 Pro Ala +
44 Pro His +
44 Pro Gln +
44 Pro Trp +
44 Pro Gly +
44 Pro Thr +
46 Glu Ala +
46 Glu Arg +
47 Leu Thr +
49 Leu Phe +
49 Leu Arg +
49 Leu Ser +
50 Leu His +
54 Leu His +
aa위치 본래의 aa 돌연변이체 aa 활성
67 Gln Lys +
67 Gln Leu +
67 Gln Cys +
70 Gln Pro +
70 Gln Leu +
70 Gln Arg +
70 Gln Ser +
104 Asp Gly +
104 Asp Val +
108 Leu Ala +
108 Leu Val +
108 Leu Arg +
108 Leu Gly +
108 Leu Trp +
108 Leu Gln +
115 Thr His +
115 Thr Leu +
115 Thr Ala +
144 Phe His +
144 Phe Arg +
144 Phe Pro +
144 Phe Leu +
144 Phe Glu +
146 Arg Gln +
147 Arg Gln +
156 His Asp -
156 His Ser +
156 His Gly +
aa위치 본래의 aa 돌연변이체 aa 활성
159 Ser Arg +
159 Ser Thr +
159 Ser Tyr +
159 Ser Val +
159 Ser Gly +
162 Glu Gly -
162 Glu Trp +
162 Glu Leu +
163 Val Arg +
163 Val Ala +
163 Val Gly +
165 Tyr Cys nd
169 Ser Leu +
169 Ser Cys +
169 Ser Arg +
170 His Arg +
170 His Ser +
*본래의 hG-CSF에 관한 활성.nd = 구해지지 않음
더 이상의 연구가 필요 없이, 해당분야의 당업자는, 상기한 기재내용을 사용하여, 본 발명을 충분히 이용할 수 있다. 그러므로 이후의 바람직한 상세한 구체예는 개시의 나머지를, 단지 설명하는 것으로서 해석되어야하고, 제한하기 위한 것으로 해석되지 않아야 한다.
WO 94/12639, WO 94/12638, WO 95/20976, WO 95/21197, WO 95/20977, WO 95/21254에서 발견할 수 있는 분자생물학기술, 단백질정제 및 생물학적 분석에 관한 보다 상세한 내용을 전체로서 참고로 포함한다.
여기에 인용된 모든 참고, 특허 또는 출원은 여기에 기재된 것처럼 전체로서 참고로 포함된다.
본 개시를 읽은 후에, 해당분야의 당업자에게 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고, 다양한 다른 예가 명백할 것이다. 모든 그러한 다른 예를 첨부한청구범위의 범주 내에 포함한다.
서열목록
(1) 일반정보
(i) 출원인
(A) 명칭: 지.디. 썰 앤드 컴파니
(B) 거리: 피.오. 박스 5110
(C) 시: 시카고
(D) 주: 일리노이
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호(ZIP): 60680
(G) 전화: (708)470-6501
(H) 팩스: (708)470-6881
(A) 명칭: 몬산토 컴파니
(B) 거리: 노오스 린드버그 블루바르드 800
(C) 시: 세이트 루이스
(D) 주: 미주리
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호(ZIP): 63167
(G) 전화: (314)647-3131
(H) 팩스: (314)694-5435
(ii) 발명의 명칭: 다기능성 조혈수용체 아고니스트
(iii) 서열의 수: 258
(iv) 컴퓨터 판독형 :
(A) 매체유형: 플로피디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 작동시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.30(EPO)
(v) 현 출원 데이터:
출원번호: US 2910
(vi) 선 출원 데이터:
(A) 출원번호: US 60/004,834
(B) 출원일: 1995.10. 5.
(2) 서열 1에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 174아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 미지
(D) 형태: 미지
(ii) 분자유형: 단백질
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 1
(D) 기타정보:/주="위치 1에서 Xaa는 Thr, Ser, Arg, Tyr 또는 Gly이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 2
(D) 기타정보:/주="위치 2에서 Xaa는 Pro 또는 Leu이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 3
(D) 기타정보:/주="위치 3에서 Xaa는 Leu, Arg, Tyr 또는 Ser이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 13
(D) 기타정보:/주="위치 13에서 Xaa는 Phe, Ser, His, Thr 또는 Pro이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 16
(D) 기타정보:/주="위치 16에서 Xaa는 Lys, Pro, Ser, thr 또는 His이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 17
(D) 기타정보:/주="위치 17에서 Xaa는 Cys, Ser, Gly, Ala, Ile, Tyr 또는 Arg이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 18
(D) 기타정보:/주="위치 18에서 Xaa는 Leu, Thr, Pro, His, Ile 또는 Cys이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 22
(D) 기타정보:/주="위치 22에서 Xaa는 Arg, Tyr, Ser, Thr 또는 Ala이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 24
(D) 기타정보:/주="위치 24에서 Xaa는 Ile, Pro, Tyr 또는 Leu이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 27
(D) 기타정보:/주="위치 27에서 Xaa는 Asp 또는 Gly이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 30
(D) 기타정보:/주="위치 30에서 Xaa는 Ala, Ile, Leu 또는 Gly이다;" (ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 34
(D) 기타정보:/주="위치 34에서 Xaa는 Lys 또는 Ser이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 36
(D) 기타정보:/주="위치 36에서 Xaa는 Cys 또는 Ser이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 42
(D) 기타정보:/주="위치 42에서 Xaa는 Cys 또는 Ser이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 43
(D) 기타정보:/주="위치 43에서 Xaa는 His, Thr, Gly, Val, Lys, Trp, Ala, Arg, Cys 또는 Leu이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 44
(D) 기타정보:/주="위치 44에서 Xaa는 Pro, Gly, Arg, Asp, Val, Ala, His, Trp, Gln 또는 Thr이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 46
(D) 기타정보:/주="위치 46에서 Xaa는 Glu, Arg, Phe, Arg, Ile 또는 Ala이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 47
(D) 기타정보:/주="위치 47에서 Xaa는 Leu 또는 Thr이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 49
(D) 기타정보:/주="위치 49에서 Xaa는 Leu, Phe, Arg 또는 Ser이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 50
(D) 기타정보:/주="위치 50에서 Xaa는 Leu, Ile, His, Pro 또는 Tyr이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 54
(D) 기타정보:/주="위치 54에서 Xaa는 Leu 또는 His이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 64
(D) 기타정보:/주="위치 64에서 Xaa는 Cys 또는 Ser이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 67
(D) 기타정보:/주="위치 67에서 Xaa는 Gln, Lys, Leu 또는 Cys이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 70
(D) 기타정보:/주="위치 70에서 Xaa는 Gln, Pro, Leu, Arg 또는 Ser이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 74
(D) 기타정보:/주="위치 74에서 Xaa는 Cys 또는 Ser이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 104
(D) 기타정보:/주="위치 104에서 Xaa는 Asp, Gly 또는 Val이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 108
(D) 기타정보:/주="위치 108에서 Xaa는 Leu, Ala, Val, Arg, Trp, Gln 또는 Gly이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 115
(D) 기타정보:/주="위치 115에서 Xaa는 Thr, His, Leu 또는 Ala이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 120
(D) 기타정보:/주="위치 120에서 Xaa는 Gln, GLy, Arg 또는 His이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 123
(D) 기타정보:/주="위치 123에서 Xaa는 Glu, Arg, Phe 또는 Thr이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 144
(D) 기타정보:/주="위치 144에서 Xaa는 Phe, His, Arg, Pro, Leu, Gln 또는 Glu이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 146
(D) 기타정보:/주="위치 146에서 Xaa는 Arg, 또는 Ala이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 147
(D) 기타정보:/주="위치 147에서 Xaa는 Arg 또는 Gln이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 156
(D) 기타정보:/주="위치 156에서 Xaa는 His, Gly 또는 Ser이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 159
(D) 기타정보:/주="위치 159에서 Xaa는 Ser, Arg, Thr, Tyr, Val 또는 Gly이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 162
(D) 기타정보:/주="위치 162에서 Xaa는 Glu, Leu, Gly 또는 Trp이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 163
(D) 기타정보:/주="위치 163에서 Xaa는 Val, GLy, Arg 또는 Ala이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 169
(D) 기타정보:/주="위치 169에서 Xaa는 Arg, Ser, Leu, Arg 또는 Cys이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 170
(D) 기타정보:/주="위치 170에서 Xaa는 His, Arg 또는 Ser이다;"
(xi) 서열설명: 서열 1
(2) 서열 2에 대한 정보
(i) 서열특징
(A) 길이: 133 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 17
(D) 기타정보:/주="위치 17에서 Xaa는 Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln 또는 Arg이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 18
(D) 기타정보:/주="위치 18에서 Xaa는 Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg 또는 Gln이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 19
(D) 기타정보:/주="위치 19에서 Xaa는 Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala 또는 Cys이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 20
(D) 기타정보:/주="위치 20에서 Xaa는 Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro 또는 Ala이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 21
(D) 기타정보:/주="위치 21에서 Xaa는 Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, Glu, Gln, Asn, Thr, Ser 또는 Val이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 22
(D) 기타정보:/주="위치 22에서 Xaa는 Glu, Trp, Pro, Ser Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu, Val 또는 Gly이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 23
(D) 기타정보:/주="위치 23에서 Xaa는 Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, Phe, Leu, Ser 또는 Arg이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 24
(D) 기타정보:/주="위치 24에서 Xaa는 Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe, Leu이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 25
(D) 기타정보:/주="위치 25에서 Xaa는 Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro 또는 Ala이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 26
(D) 기타정보:/주="위치 26에서 Xaa는 His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala, Trp이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 27
(D) 기타정보:/주="위치 27에서 Xaa는 Leu, Gly, Arg, Thr, Ser 또는 Ala이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 28
(D) 기타정보:/주="위치 28에서 Xaa는 Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, Val 또는 Trp이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 29
(D) 기타정보:/주="위치 29에서 Xaa는 Gln, Asn, Leu, Pro, Arg 또는 Val이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 30
(D) 기타정보:/주="위치 30에서 Xaa는 Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, Ser, Leu 또는 L...이다"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 31
(D) 기타정보:/주="위치 31에서 Xaa는 Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu 또는 Gln이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 32
(D) 기타정보:/주="위치 32에서 Xaa는 Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, Ala 또는 Glu이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 33
(D) 기타정보:/주="위치 33에서 Xaa는 Pro, Leu, Gln, Ala, Thr 또는 Glu이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 34
(D) 기타정보:/주="위치 34에서 Xaa는 Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, Gln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile 또는 Met이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 35
(D) 기타정보:/주="위치 35에서 Xaa는 Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln 또는 Val이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 36
(D) 기타정보:/주="위치 36에서 Xaa는 Asp, Leu 또는 Val이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 37
(D) 기타정보:/주="위치 37에서 Xaa는 Phe, Ser, Pro, Trp 또는 Ile이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 38
(D) 기타정보:/주="위치 38에서 Xaa는 Asn 또는 Ala이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 40
(D) 기타정보:/주="위치 40에서 Xaa는 Leu, Trp 또는 Arg이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 41
(D) 기타정보:/주="위치 41에서 Xaa는 Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met 또는 Pro이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 42
(D) 기타정보:/주="위치 42에서 Xaa는 Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, Thr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met 또는 Ala이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 43
(D) 기타정보:/주="위치 43에서 Xaa는 Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, Ala, Cys, Gln, Arg, Thr, Gly 또는 Ser이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 44
(D) 기타정보:/주="위치 44에서 Xaa는 Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, Met, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala 또는 Pro이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 45
(D) 기타정보:/주="위치 45에서 Xaa는 Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, Thr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, Glu 또는 His이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 46
(D) 기타정보:/주="위치 46에서 Xaa는 Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val 또는 Gly이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 47
(D) 기타정보:/주="위치 47에서 Xaa는 Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro 또는 His이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 48
(D) 기타정보:/주="위치 48에서 Xaa는 Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, Phe, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val 또는 Asn이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 49
(D) 기타정보:/주="위치 49에서 Xaa는 Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, His 또는 Asp이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 50
(D) 기타정보:/주="위치 50에서 Xaa는 Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, Asn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met 또는 Gln이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 51
(D) 기타정보:/주="위치 51에서 Xaa는 Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr 또는 his이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 52
(D) 기타정보:/주="위치 52에서 Xaa는 Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser 또는 Thr이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 53
(D) 기타정보:/주="위치 53에서 Xaa는 Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, Lys, Ser 또는 M...이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 54
(D) 기타정보:/주="위치 54에서 Xaa는 Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, His, Ala 또는 Leu이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 55
(D) 기타정보:/주="위치 55에서 Xaa는 Arg, Thr, Val, Ser, Leu 또는 Gly이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 56
(D) 기타정보:/주="위치 56에서 Xaa는 Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, Arg, His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, Val 또는 Lys이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 57
(D) 기타정보:/주="위치 57에서 Xaa는 Asn 또는 Gly이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 58
(D) 기타정보:/주="위치 58에서 Xaa는 Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val 또는 Cys이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 59
(D) 기타정보:/주="위치 59에서 Xaa는 Glu, Tyr, His, Leu, Pro 또는 Arg이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 60
(D) 기타정보:/주="위치 60에서 Xaa는 Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn 또는 Thr이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 61
(D) 기타정보:/주="위치 61에서 Xaa는 Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg 또는 Ser이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 62
(D) 기타정보:/주="위치 62에서 Xaa는 Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, Asp 또는 Ile이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 63
(D) 기타정보:/주="위치 63에서 Xaa는 Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, Pro 또는 Val이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 64
(D) 기타정보:/주="위치 64에서 Xaa는 Ala, Asn, Pro, Ser 또는 Lys이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 65
(D) 기타정보:/주="위치 65에서 Xaa는 Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe 또는 Ser이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 66
(D) 기타정보:/주="위치 66에서 Xaa는 Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu 또는 Ser이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 67
(D) 기타정보:/주="위치 67에서 Xaa는 Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, Ile, Pro 또는 His이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 68
(D) 기타정보:/주="위치 68에서 Xaa는 Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, Thr 또는 His이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 69
(D) 기타정보:/주="위치 69에서 Xaa는 Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly 또는 L...이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 70
(D) 기타정보:/주="위치 70에서 Xaa는 Asn, Leu, Val, Trp, Pro 또는 Ala이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 71
(D) 기타정보:/주="위치 71에서 Xaa는 Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, Thr, Gln, Trp 또는 Asn이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 72
(D) 기타정보:/주="위치 72에서 Xaa는 Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, Arg 또는 Asp이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 73
(D) 기타정보:/주="위치 73에서 Xaa는 Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, Thr 또는 Arg이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 74
(D) 기타정보:/주="위치 74에서 Xaa는 Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, Ala이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 75
(D) 기타정보:/주="위치 75에서 Xaa는 Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln 또는 Leu이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 76
(D) 기타정보:/주="위치 76에서 Xaa는 Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly 또는 A...이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 77
(D) 기타정보:/주="위치 77에서 Xaa는 Ile, Ser, Arg, Thr 또는 Leu이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 78
(D) 기타정보:/주="위치 78에서 Xaa는 Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, GLy 또는 Arg이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 79
(D) 기타정보:/주="위치 79에서 Xaa는 Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, Gly 또는 Asp이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 80
(D) 기타정보:/주="위치 80에서 Xaa는 Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, Glu 또는 Arg이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 81
(D) 기타정보:/주="위치 81에서 Xaa는 Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, Val 또는 Lys이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 82
(D) 기타정보:/주="위치 82에서 Xaa는 Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, Met 또는 Val이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 83
(D) 기타정보:/주="위치 83에서 Xaa는 Pro, Ala, Thr, Trp, Arg 또는 Met이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 84
(D) 기타정보:/주="위치 84에서 Xaa는 Cys, Glu, Gly, Arg, Met 또는 Val이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 85
(D) 기타정보:/주="위치 85에서 Xaa는 Leu, Asn, Val 또는 Gln이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 86
(D) 기타정보:/주="위치 86에서 Xaa는 Pro, Cys, Arg, Ala 또는 Lys이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 87
(D) 기타정보:/주="위치 87에서 Xaa는 Leu, Ser, Trp 또는 Gly이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 88
(D) 기타정보:/주="위치 88에서 Xaa는 Ala, Lys, Arg, Val 또는 Trp이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 89
(D) 기타정보:/주="위치 89에서 Xaa는 Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, His, Asn 또는 S...이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 90
(D) 기타정보:/주="위치 90에서 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, Ile 또는 Met이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 91
(D) 기타정보:/주="위치 91에서 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Asp 또는 His이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 92
(D) 기타정보:/주="위치 92에서 Xaa는 Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile 또는 Leu이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 93
(D) 기타정보:/주="위치 93에서 Xaa는 Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, Leu 또는 Arg이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 94
(D) 기타정보:/주="위치 94에서 Xaa는 Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala 또는 Pro이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 95
(D) 기타정보:/주="위치 95에서 Xaa는 His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile 또는 Tyr이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 96
(D) 기타정보:/주="위치 96에서 Xaa는 Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile 또는 Thr이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 97
(D) 기타정보:/주="위치 97에서 Xaa는 Ile, Val, Lys, Ala 또는 Asn이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 98
(D) 기타정보:/주="위치 98에서 Xaa는 His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, Thr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, Tyr 또는 Pro이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 99
(D) 기타정보:/주="위치 99에서 Xaa는 Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, Gln, Gly, Ser, Phe 또는 His이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 100
(D) 기타정보:/주="위치 100에서 Xaa는 Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln 또는 ...이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 101
(D) 기타정보:/주="위치 101에서 Xaa는 Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu 또는 Gln이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 102
(D) 기타정보:/주="위치 102에서 Xaa는 Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr 또는 Pro이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 103
(D) 기타정보:/주="위치 103에서 Xaa는 Asp, 또는 Ser이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 104
(D) 기타정보:/주="위치 104에서 Xaa는 Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe 또는 Gly이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 105
(D) 기타정보:/주="위치 105에서 Xaa는 Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp 또는 His이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 106
(D) 기타정보:/주="위치 106에서 Xaa는 Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly 또는 Pro이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 108
(D) 기타정보:/주="위치 108에서 Xaa는 Arg, Lys, Asp, Leu, Thr,Ile, Gln, His, Ser, Ala 또는 Pro이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 109
(D) 기타정보:/주="위치 109에서 Xaa는 Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser 또는 Gly이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 110
(D) 기타정보:/주="위치 110에서 Xaa는 Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser 또는 Trp이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 111
(D) 기타정보:/주="위치 111에서 Xaa는 Leu, Ile, Arg, Asp 또는 Met이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 112
(D) 기타정보:/주="위치 112에서 Xaa는 Thr, Val, Gln, Tyr, Glu,His, Ser 또는 Phe이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 113
(D) 기타정보:/주="위치 113에서 Xaa는 Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val 또는 Asn이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 114
(D) 기타정보:/주="위치 114에서 Xaa는 Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg 또는 Leu이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 115
(D) 기타정보:/주="위치 115에서 Xaa는 Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp 또는 Met이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 116
(D) 기타정보:/주="위치 116에서 Xaa는 Lys, Leu, Pro, Thr, Met,Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln 또는 Ile이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 117
(D) 기타정보:/주="위치 117에서 Xaa는 Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys 또는 Pro이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 118
(D) 기타정보:/주="위치 118에서 Xaa는 Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp 또는 Tyr이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 119
(D) 기타정보:/주="위치 119에서 Xaa는 Glu, Ser, Lys, Pro, leu, Thr, Tyr 또는 Arg이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 120
(D) 기타정보:/주="위치 120에서 Xaa는 Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val또는 Gln이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 121
(D) 기타정보:/주="위치 121에서 Xaa는 Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp 또는 Gly이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 122
(D) 기타정보:/주="위치 122에서 Xaa는 Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr 또는 Cys이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 123
(D) 기타정보:/주="위치 123에서 Xaa는 Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr 또는 Leu이다;"
(xi) 서열설명: 서열 2
(2) 서열 3에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 332 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 미지
(D) 형태: 미지
(ii) 분자유형: 단백질
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 112
(D) 기타정보:/주="위치 112는 삭제되거나 또는 Leu, Ala, Val, Ile,Pro, Phe, Trp 또는 M...이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 113
(D) 기타정보:/주="위치 113는 삭제되거나 또는 Pro, Phe, Ala, Leu, Ile, Trp 또는 Met이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 114
(D) 기타정보:/주="위치 114는 삭제되거나 또는 Pro, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp 또는 Met이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 115
(D) 기타정보:/주="위치 115는 삭제되거나 또는 Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr 또는 Asn이다;"
(xi) 서열설명: 서열 3
(2) 서열 4에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 1 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 단백질
(B) 위치: 1
(D) 기타정보:/주="여기서 x=(glyglyglyser)n이고 여기서 n은 정수이다.
(xi) 서열설명: 서열 4
(2) 서열 5에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 1 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 단백질
(B) 위치: 1
(D) 기타정보:/주="여기서 x=(glyglyglyglyser)n이고 여기서 n은 정수이다.
(xi) 서열설명: 서열 5
(2) 서열 6에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 1 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 단백질
(B) 위치: 1
(D) 기타정보:/주="여기서 x=(glyglyglyglyglyser)n이고 여기서 n은 정수이다.
(xi) 서열설명: 서열 6
(2) 서열 7에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 1 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 단백질
(B) 위치: 1
(D) 기타정보:/주="여기서 x=(gly n ser)n이고 여기서 n은 정수이다.
(xi) 서열설명: 서열 7
(2) 서열 8에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 1 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 단백질
(B) 위치: 1
(D) 기타정보:/주="여기서 x=(alaglyser)n이고 여기서 n은 정수이다.
(xi) 서열설명: 서열 8
(2) 서열 9에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 35 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 9
(2) 서열 10에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 24 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 10
(2) 서열 11에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 28 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 11
(2) 서열 12에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 4 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 12
(2) 서열 13에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 45 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 13
(2) 서열 14에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 14
(2) 서열 15에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 33 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 15
(2) 서열 16에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 10 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 16
(2) 서열 17에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 10 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 17
(2) 서열 18에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 13 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 18
(2) 서열 19에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 13 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 19
(2) 서열 20에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 20
(2) 서열 21에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 21
(2) 서열 22에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 22
(2) 서열 23에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 23
(2) 서열 24에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 24
(2) 서열 25에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 25
(2) 서열 26에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 26
(2) 서열 27에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 27
(2) 서열 28에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 28
(2) 서열 29에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 29
(2) 서열 30에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 30
(2) 서열 31에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 31
(2) 서열 32에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 32
(2) 서열 33에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 33
(2) 서열 34에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 34
(2) 서열 35에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 35
(2) 서열 36에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 36
(2) 서열 37에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 37
(2) 서열 38에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 38
(2) 서열 39에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 39
(2) 서열 40에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 40
(2) 서열 41에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 41
(2) 서열 42에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 42
(2) 서열 43에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 43
(2) 서열 44에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 44
(2) 서열 45에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 32 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 45
(2) 서열 46에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 83 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 46
(2) 서열 47에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 83 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 47
(2) 서열 48에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 59 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 48
(2) 서열 49에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 56 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 49
(2) 서열 50에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 80 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 50
(2) 서열 51에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 80 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 51
(2) 서열 52에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 52
(2) 서열 53에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 53
(2) 서열 54에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 32 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 54
(2) 서열 55에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 55
(2) 서열 56에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 32 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 56
(2) 서열 57에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 57
(2) 서열 58에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 32 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 58
(2) 서열 59에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 59
(2) 서열 60에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 54 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 60
(2) 서열 61에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 54 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 61
(2) 서열 62에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 18 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 62
(2) 서열 63에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 63
(2) 서열 64에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 32 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 64
(2) 서열 65에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 65
(2) 서열 66에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 32 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 66
(2) 서열 67에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 67
(2) 서열 68에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 32 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 68
(2) 서열 69에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 69
(2) 서열 70에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 32 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 70
(2) 서열 71에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 71
(2) 서열 72에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 72
(2) 서열 73에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 73
(2) 서열 74에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
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(xi) 서열설명: 서열 74
(2) 서열 75에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 25 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
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(2) 서열 76에 대한 정보
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(A) 길이: 53 염기쌍
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(2) 서열 77에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 53 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(ii) 분자유형: 기타 핵산
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(2) 서열 78에 대한 정보
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(A) 길이: 439 염기쌍
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(2) 서열 79에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 465 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(ii) 분자유형: 기타 핵산
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(2) 서열 80에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 927 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
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(xi) 서열설명: 서열 80
(2) 서열 81에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 936 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
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(xi) 서열설명: 서열 81
(2) 서열 82에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 939 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
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(xi) 서열설명: 서열 82
(2) 서열 83에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 948 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
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(xi) 서열설명: 서열 83
(2) 서열 84에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 688 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
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(xi) 서열설명: 서열 84
(2) 서열 85에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 712 염기쌍
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(2) 서열 86에 대한 정보
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(A) 길이: 975 염기쌍
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(ii) 분자유형: 기타 핵산
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(2) 서열 87에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 975 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
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(xi) 서열설명: 서열 87
(2) 서열 88에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 975 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
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(xi) 서열설명: 서열 88
(2) 서열 89에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 975 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
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(xi) 서열설명: 서열 89
(2) 서열 90에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 999 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
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(xi) 서열설명: 서열 90
(2) 서열 91에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 999 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 91
(2) 서열 92에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 999 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 92
(2) 서열 93에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 999 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 93
(2) 서열 94에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 918 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 94
(2) 서열 95에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 963 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 95
(2) 서열 96에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 918 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 96
(2) 서열 97에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 963 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 97
(2) 서열 98에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 918 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 98
(2) 서열 99에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 963 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 99
(2) 서열 100에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 918 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 100
(2) 서열 101에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 963 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 101
(2) 서열 102에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 918 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 102
(2) 서열 103에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 963 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 103
(2) 서열 104에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 927 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 104
(2) 서열 105에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 927 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 105
(2) 서열 106에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 927 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 106
(2) 서열 107에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 972 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 107
(2) 서열 108에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 927 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 108
(2) 서열 109에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 972 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 109
(2) 서열 110에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 927 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 110
(2) 서열 111에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 927 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 111
(2) 서열 112에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 927 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 112
(2) 서열 113에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 972 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 113
(2) 서열 114에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 963 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 114
(2) 서열 115에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 972 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 115
(2) 서열 116에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 963 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 116
(2) 서열 117에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 972 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 117
(2) 서열 118에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 918 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 118
(2) 서열 119에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 918 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 119
(2) 서열 120에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 918 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 120
(2) 서열 121에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 918 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 121
(2) 서열 122에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 918 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 122
(2) 서열 123에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 907 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 123
(2) 서열 124에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 918 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 124
(2) 서열 125에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 848 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 125
(2) 서열 126에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 918 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 126
(2) 서열 127에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 918 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 127
(2) 서열 128에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 918 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 128
(2) 서열 129에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 918 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 129
(2) 서열 130에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 915 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 130
(2) 서열 131에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 915 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 131
(2) 서열 132에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 915 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 132
(2) 서열 133에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 915 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 133
(2) 서열 134에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 915 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 134
(2) 서열 135에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 915 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 135
(2) 서열 136에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 915 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 136
(2) 서열 137에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 915 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 137
(2) 서열 138에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 915 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 138
(2) 서열 139에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 915 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 139
(2) 서열 140에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 915 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 140
(2) 서열 141에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 915 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 141
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(2) 서열 143에 대한 정보
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(A) 길이: 927 염기쌍
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(2) 서열 150에 대한 정보
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(A) 길이: 927 염기쌍
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(xi) 서열설명: 서열 150
(2) 서열 151에 대한 정보
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(A) 길이: 927 염기쌍
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(xi) 서열설명: 서열 151
(2) 서열 152에 대한 정보
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(A) 길이: 927 염기쌍
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(2) 서열 153에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 927 염기쌍
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(2) 서열 154에 대한 정보
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(2) 서열 155에 대한 정보
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(A) 길이: 993 염기쌍
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(2) 서열 156에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 993 염기쌍
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(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
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(xi) 서열설명: 서열 156
(2) 서열 157에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 993 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 157
(2) 서열 158에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 993 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 158
(2) 서열 159에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 993 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 159
(2) 서열 160에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 1027 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 160
(2) 서열 161에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 155 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 161
(2) 서열 162에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 309 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 162
(2) 서열 163에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 312 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 163
(2) 서열 164에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 313 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 164
(2) 서열 165에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 316 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 165
(2) 서열 166에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 302 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 166
(2) 서열 167에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 317 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
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(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 167
(2) 서열 168에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 302 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 168
(2) 서열 169에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 317 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 169
(2) 서열 170에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 302 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 170
(2) 서열 171에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 317 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 171
(2) 서열 172에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 302 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 172
(2) 서열 173에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 317 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 173
(2) 서열 174에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 302 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 174
(2) 서열 175에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 317 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 175
(2) 서열 176에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 305 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 176
(2) 서열 177에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 320 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
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(2) 서열 178에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 305 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
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(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 178
(2) 서열 179에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 320 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 179
(2) 서열 180에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 305 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 180
(2) 서열 181에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 320 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 181
(2) 서열 182에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 305 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 182
(2) 서열 183에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 320 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 183
(2) 서열 184에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 305 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 184
(2) 서열 185에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 320 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 185
(2) 서열 186에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 321 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 186
(2) 서열 187에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 321 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 187
(2) 서열 188에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 321 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 188
(2) 서열 189에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 321 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 189
(2) 서열 190에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 329 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 190
(2) 서열 191에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 329 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 191
(2) 서열 192에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 329 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 192
(2) 서열 193에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 299 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
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(xi) 서열설명: 서열 193
(2) 서열 194에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 329 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 194
(2) 서열 195에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 329 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 195
(2) 서열 196에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 329 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 196
(2) 서열 197에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 329 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 197
(2) 서열 198에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 329 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 198
(2) 서열 199에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 319 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 199
(2) 서열 200에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 322 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 200
(2) 서열 201에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 319 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 201
(2) 서열 202에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 322 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 202
(2) 서열 203에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 306 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 203
(2) 서열 204에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 306 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 204
(2) 서열 205에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 306 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 205
(2) 서열 206에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 306 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 206
(2) 서열 207에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 306 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 207
(2) 서열 208에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 306 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 208
(2) 서열 209에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 306 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 209
(2) 서열 210에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 306 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 210
(2) 서열 211에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 306 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 211
(2) 서열 212에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 306 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
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(xi) 서열설명: 서열 212
(2) 서열 213에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 306 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 213
(2) 서열 214에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 306 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 214
(2) 서열 215에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 305 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
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(xi) 서열설명: 서열 215
(2) 서열 216에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 305 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
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(xi) 서열설명: 서열 216
(2) 서열 217에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 305 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
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(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 217
(2) 서열 218에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 305 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 218
(2) 서열 219에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 305 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 219
(2) 서열 220에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 305 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 220
(2) 서열 221에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 305 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 221
(2) 서열 222에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 305 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 222
(2) 서열 223에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 305 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 223
(2) 서열 224에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 305 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 224
(2) 서열 225에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 305 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 225
(2) 서열 226에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 305 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 226
(2) 서열 227에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 309 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 227
(2) 서열 228에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 309 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 228
(2) 서열 229에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 309 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 229
(2) 서열 230에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 309 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 230
(2) 서열 231에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 309 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 231
(2) 서열 232에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 309 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 232
(2) 서열 233에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 309 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 233
(2) 서열 234에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 309 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 234
(2) 서열 235에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 309 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 235
(2) 서열 236에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 309 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 236
(2) 서열 237에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 309 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 237
(2) 서열 238에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 309 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 238
(2) 서열 239에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 302 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 239
(2) 서열 240에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 83 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 240
(2) 서열 241에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 82 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 241
(2) 서열 242에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 8 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 242
(2) 서열 243에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 12 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 243
(2) 서열 244에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 7 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 244
(2) 서열 245에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 6 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 245
(2) 서열 246에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 7 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 246
(2) 서열 247에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 10 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 247
(2) 서열 248에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 309 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 248
(2) 서열 249에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 459 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명 /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 249
(2) 서열 250에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 447 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 250
(2) 서열 251에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 459 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 251
(2) 서열 252에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 153 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 252
(2) 서열 253에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 149 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 253
(2) 서열 254에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 153 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(xi) 서열설명: 서열 254
(2) 서열 255에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 64 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 255
(2) 서열 256에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 153 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 미지
(D) 형태: 미지
(ii) 분자유형: 단백질
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 112
(D) 기타정보:/주="위치 112는 삭제되거나 또는 Leu, Ala, Val, Ile, Pro, Phe, Trp 또는 Met이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 113
(D) 기타정보:/주="위치 113는 삭제되거나 또는 Pro, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp 또는 Met이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 114
(D) 기타정보:/주="위치 114는 삭제되거나 또는 Pro, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp 또는 Met이다;"
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 변형된 부위
(B) 위치: 115
(D) 기타정보:/주="위치 115는 삭제되거나 또는 Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr 또는 Asn이다;"
(xi) 서열설명: 서열 256
(2) 서열 257에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 464 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 257
(2) 서열 258에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 419 기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 기타 핵산
(A) 설명: /설명="DNA(합성)"
(xi) 서열설명: 서열 258

Claims (36)

  1. 다음식의 아미노산서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 조혈 단백질.
    R1-L1-R2, R2-L1-R1, R1-R2, 또는 R2-R1
    상기식에서 R1및 R2는 독립적으로 하기 (I), (II), (III), (IV) 또는 (V)로 구성되는 군으로부터 선택되고,
    여기서 L1은 R1을 R2에 연결할 수 있는 링커이고;
    단 적어도 R1또는 R2는 식 (I), (II), 또는 (III)의 폴리펩티드로부터 선택되고; 그리고
    상기 조혈 단백질 바로 앞에 (-1 위치의 메티오닌), (-1 위치의 알라닌) 또는 (-2위치의 메티오닌 및 -1위치의 알라닌)이 올 수 있다.
    (I) 다음 식의 변형된 사람 G-CSF 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    (서열 1)
    상기 서열에서
    위치 1의 Xaa는 Thr, Ser, Arg, Tyr 또는 Gly이고;
    위치 2의 Xaa는 Pro 또는 Leu이고;
    위치 3의 Xaa는 Leu, Arg, Tyr 또는 Ser이고;
    위치 13의 Xaa는 Phe, Ser, His, Thr 또는 Pro이고;
    위치 16의 Xaa는 Lys, Pro, Ser, Thr 또는 His이고;
    위치 17의 Xaa는 Cys, Ser, Gly, Ala, Ile, Tyr 또는 Arg이고;
    위치 18의 Xaa는 Leu, Thr, Pro, His, Ile 또는 Cys이고;
    위치 22의 Xaa는 Arg, Tyr, Ser, Thr 또는 Ala이고;
    위치 24의 Xaa는 Ile, Pro, Tyr 또는 Leu이고;
    위치 27의 Xaa는 Asp 또는 Gly이고;
    위치 30의 Xaa는 Ala, Ile, Leu 또는 Gly이고;
    위치 34의 Xaa는 Lys 또는 Ser이고;
    위치 36의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 42의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 43의 Xaa는 His, Thr, Gly, Val, Lys, Trp, Ala, Arg, Cys 또는 Leu이고;
    위치 44의 Xaa는 Pro, Gly, Arg, Asp, Val, Ala, His, Trp, Gln 또는 Thr이고;
    위치 46의 Xaa는 Glu, Arg, Phe, Arg, Ile 또는 Ala이고;
    위치 47의 Xaa는 Leu 또는 Thr이고;
    위치 49의 Xaa는 Leu, Phe, Arg 또는 Ser이고;
    위치 50의 Xaa는 Leu, Ile, His, Pro 또는 Tyr이고;
    위치 54의 Xaa는 Leu 또는 His이고;
    위치 64의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 67의 Xaa는 Gln, Lys, Leu 또는 Cys이고;
    위치 70의 Xaa는 Gln, Pro, Leu, Arg 또는 Ser이고;
    위치 74의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 104의 Xaa는 Asp, Gly 또는 Val이고;
    위치 108의 Xaa는 Leu, Ala, Val, Arg, Trp, Gln 또는 Gly이고;
    위치 115의 Xaa는 Thr, His, Leu 또는 Ala이고;
    위치 120의 Xaa는 Gln, Gly, Arg, Lys 또는 His이고;
    위치 123의 Xaa는 Glu, Arg, Phe 또는 Thr이고;
    위치 144의 Xaa는 Phe, His, Arg, Pro, Leu, Gln 또는 Glu이고;
    위치 146의 Xaa는 Arg 또는 Gln이고;
    위치 147의 Xaa는 Arg 또는 Gln이고;
    위치 156의 Xaa는 His, Gly 또는 Ser이고;
    위치 159의 Xaa는 Ser, Arg, Thr, Tyr, Val 또는 Gly이고;
    위치 162의 Xaa는 Glu, Leu, Gly 또는 Trp이고;
    위치 163의 Xaa는 Val, Gly, Arg 또는 Ala이고;
    위치 169의 Xaa는 Arg, Ser, Leu, Arg 또는 Cys이고;
    위치 170의 Xaa는 His, Arg 또는 Ser이고;
    여기서 N-말단으로부터 1-11아미노산이, 그리고 C-말단으로부터 1-5 아미노산이 상기의 변형된 사람 G-CSF 아미노산서열로부터 삭제될 수 있고;
    여기서 N-말단은 C-말단에 직접 연결되거나, 또는 N-말단을 C-말단에 연결할 수 있고 다음 아미노산들에서 새로운 C-및 N-말단을 가질 수 있는 링커를 통해 연결된다;
    (II) 다음식의 변형된 사람 IL-3 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    (서열 2a)
    (서열 2b)
    상기 서열에서 위치 17의 Xaa는 Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln 또는 Arg이고;
    위치 18의 Xaa는 Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg 또는 Gln이고;
    위치 19의 Xaa는 Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala 또는 Cys이고;
    위치 20의 Xaa는 Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro 또는 Ala이고;
    위치 21의 Xaa는 Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, Glu, Gln, Asn, Thr, Ser 또는 Val이고;
    위치 22의 Xaa는 Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu, Val 또는 Gly이고;
    위치 23의 Xaa는 Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, Phe, Leu, Ser 또는 Arg이고;
    위치 24의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe 또는 Leu이고;
    위치 25의 Xaa는 Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro 또는 Ala이고;
    위치 26의 Xaa는 His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala 또는 Trp이고;
    위치 27의 Xaa는 Leu, Gly, Arg, Thr, Ser 또는 Ala이고;
    위치 28의 Xaa는 Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, Val 또는 Trp이고;
    위치 29의 Xaa는 Gln, Asn, Leu, Pro, Arg 또는 Val이고;
    위치 30의 Xaa는 Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, Ser, Leu 또는 Lys이고;
    위치 31의 Xaa는 Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu 또는 Gln이고;
    위치 32의 Xaa는 Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, Ala 또는 Glu이고;
    위치 33의 Xaa는 Pro, Leu, Gln, Ala, Thr 또는 Glu이고;
    위치 34의 Xaa는 Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, Gln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile 또는 Met이고;
    위치 35의 Xaa는 Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln 또는 Val이고;
    위치 36의 Xaa는 Asp, Leu 또는 Val이고;
    위치 37의 Xaa는 Phe, Ser, Pro, Trp 또는 Ile이고;
    위치 38의 Xaa는 Asn 또는 Ala이고;
    위치 40의 Xaa는 Leu, Trp 또는 Arg이고;
    위치 41의 Xaa는 Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met 또는 Pro이고;
    위치 42의 Xaa는 Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, Thr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met 또는 Ala이고;
    위치 43의 Xaa는 Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, Ala, Cys, Gln, Arg, Thr,Gly 또는 Ser이고;
    위치 44의 Xaa는 Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, Met, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala 또는 Pro이고;
    위치 45의 Xaa는 Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, Thr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, Glu 또는 His이고;
    위치 46의 Xaa는 Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val 또는 Gly이고;
    위치 47의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro 또는 His이고;
    위치 48의 Xaa는 Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, Phe, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val 또는 Asn이고;
    위치 49의 Xaa는 Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, His 또는 Asp이고;
    위치 50의 Xaa는 Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, Asn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met 또는 Gln이고;
    위치 51의 Xaa는 Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr 또는 His이고;
    위치 52의 Xaa는 Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser 또는 Thr이고;
    위치 53의 Xaa는 Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, Lys, Ser 또는 Met이고;
    위치 54의 Xaa는 Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, His, Ala 또는 Leu이고;
    위치 55의 Xaa는 Arg, Thr, Val, Ser, Leu 또는 Gly이고;
    위치 56의 Xaa는 Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, Arg, His, Thr, Ala, Tyr,Phe, Leu, Val 또는 Lys이고;
    위치 57의 Xaa는 Asn 또는 Gly이고;
    위치 58의 Xaa는 Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val 또는 Cys이고;
    위치 59의 Xaa는 Glu, Tyr, His, Leu, Pro 또는 Arg 이고;
    위치 60의 Xaa는 Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn 또는 Thr이고;
    위치 61의 Xaa는 Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg 또는 Ser이고;
    위치 62의 Xaa는 Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, Asp 또는 Ile이고;
    위치 63의 Xaa는 Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, Pro 또는 Val이고;
    위치 64의 Xaa는 Ala, Asn, Pro, Ser 또는 Lys이고;
    위치 65의 Xaa는 Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe 또는 Ser이고;
    위치 66의 Xaa는 Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu 또는 Ser이고;
    위치 67의 Xaa는 Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, Ile, Pro 또는 His이고;
    위치 68의 Xaa는 Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, Thr 또는 His이고;
    위치 69의 Xaa는 Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly 또는 Leu이고;
    위치 70의 Xaa는 Asn, Leu, Val, Trp, Pro 또는 Ala이고;
    위치 71의 Xaa는 Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, Thr, Gln, Trp 또는 Asn;
    위치 72의 Xaa는 Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, Arg 또는 Asp이고;
    위치 73의 Xaa는 Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, Thr 또는 Arg이고;
    위치 74의 Xaa는 Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, Ala이고;
    위치 75의 Xaa는 Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln 또는 Leu이고;
    위치 76의 Xaa는 Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly 또는 Asp이고;
    위치 77의 Xaa는 Ile, Ser, Arg, Thr 또는 Leu이고;
    위치 78의 Xaa는 Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly 또는 Arg이고;
    위치 79의 Xaa는 Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, Gly 또는 Asp이고;
    위치 80의 Xaa는 Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, Glu 또는 Arg이고;
    위치 81의 Xaa는 Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, Val 또는 Lys이고;
    위치 82의 Xaa는 Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, Met 또는 Val이고;
    위치 83의 Xaa는 Pro, Ala, Thr, Trp, Arg 또는 Met이고;
    위치 84의 Xaa는 Cys, Glu, Gly, Arg, Met 또는 Val이고;
    위치 85의 Xaa는 Leu, Asn, Val 또는 Gln이고;
    위치 86의 Xaa는 Pro, Cys, Arg, Ala 또는 Lys이고;
    위치 87의 Xaa는 Leu, Ser, Trp 또는 Gly이고;
    위치 88의 Xaa는 Ala, Lys, Arg, Val 또는 Trp이고;
    위치 89의 Xaa는 Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, His, Asn 또는 Ser이고;
    위치 90의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, Ile 또는 Met이고;
    위치 91의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Asp 또는 His이고;
    위치 92의 Xaa는 Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile 또는 Leu이고;
    위치 93의 Xaa는 Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, Leu 또는 Arg이고;
    위치 94의 Xaa는 Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala 또는 Pro이고;
    위치 95의 Xaa는 His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile 또는 Tyr이고;
    위치 96의 Xaa는 Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile 또는 Thr이고;
    위치 97의 Xaa는 Ile, Val, Lys, Ala 또는 Asn이고;
    위치 98의 Xaa는 His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, Thr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, Tyr 또는 Pro이고;
    위치 99의 Xaa는 Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, Gln, Gly, Ser, Phe 또는 His이고;
    위치 100의 Xaa는 Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln 또는 Pro이고;
    위치 101의 Xaa는 Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu 또는 Gln이고;
    위치 102의 Xaa는 Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr 또는 Pro이고;
    위치 103의 Xaa는 Asp 또는 Ser이고;
    위치 104의 Xaa는 Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe 또는 Gly이고;
    위치 105의 Xaa는 Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp 또는 His이고;
    위치 106의 Xaa는 Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly 또는 Pro이고;
    위치 108의 Xaa는 Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala 또는 Pro이고;
    위치 109의 Xaa는 Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser 또는 Gly이고;
    위치 110의 Xaa는 Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser 또는 Trp이고;
    위치 111의 Xaa는 Leu, Ile, Arg, Asp 또는 Met이고;
    위치 112의 Xaa는 Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser 또는 Phe 이고;
    위치 113의 Xaa는 Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val 또는 Asp이고;
    위치 114의 Xaa는 Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg 또는 Leu이고;
    위치 115의 Xaa는 Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp 또는 Met이고;
    위치 116의 Xaa는 Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln 또는 Ile이고;
    위치 117의 Xaa는 Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys 또는 Pro이고;
    위치 118의 Xaa는 Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp 또는 Tyr이고;
    위치 119의 Xaa는 Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr 또는 Arg이고;
    위치 120의 Xaa는 Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val 또는 Gln이고;
    위치 121의 Xaa는 Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp 또는 Gly이고;
    위치 122의 Xaa는 Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr 또는 Cys이고;
    위치 123의 Xaa는 Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr 또는 Leu이고;
    여기서 상기의 변형된 사람 IL-3 아미노산서열의 N-말단으로부터 1 내지 14 아미노산, C-말단으로부터 1 내지 15 아미노산, 또는 N-말단으로부터 1 내지 14 아미노산 및 C-말단으로부터 1 내지 15 아미노산 모두가 삭제될 수 있으며; Xaa로 표시된 아미노산의 0 내지 44는 본래의(1 - 133) 사람 인터루킨-3의 대응하는 아미노산과 다르며;
    여기서 N-말단은 C-말단에 직접 연결되거나, 또는 N-말단을 C-말단에 연결할 수 있고 다음 아미노산들에서 새로운 C-말단 및 N-말단을 가질 수 있는 링커(L2)를 통해 연결된다;
    (III) 다음식의 변형된 사람 c-mpl 리간드 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    (서열 256)
    상기 서열에서, 위치 112의 Xaa는 삭제되거나 Leu, Ala, Val, Ile, Pro, Phe, Trp 또는 Met이고;
    위치 113의 Xaa는 삭제되거나 Pho, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp 또는 Met이고;
    위치 114의 Xaa는 삭제되거나 Pro, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp 또는 Met이고;
    위치 115의 Xaa는 삭제되거나 Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr 또는 Asn이고;
    여기서 N-말단은 C-말단에 직접 연결되거나, 또는 N-말단을 C-말단에 연결할수 있고 다음 아미노산들에서 새로운 C- 및 N-말단을 가질 수 있는 링커(L2)를 통해 연결된다;
    (IV) 다음식의 변형된 사람 IL-3 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    (서열 2a)
    (서열 2b)
    상기 서열에서 위치 17의 Xaa는 Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln 또는 Arg이고;
    위치 18의 Xaa는 Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg 또는 Gln이고;
    위치 19의 Xaa는 Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala 또는 Cys이고;
    위치 20의 Xaa는 Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro 또는 Ala이고;
    위치 21의 Xaa는 Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, Glu, Gln, Asn, Thr, Ser 또는 Val이고;
    위치 22의 Xaa는 Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu, Val 또는 Gly이고;
    위치 23의 Xaa는 Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, Phe, Leu, Ser 또는 Arg이고;
    위치 24의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe 또는 Leu이고;
    위치 25의 Xaa는 Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro 또는 Ala이고;
    위치 26의 Xaa는 His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala 또는 Trp이고;
    위치 27의 Xaa는 Leu, Gly, Arg, Thr, Ser 또는 Ala이고;
    위치 28의 Xaa는 Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, Val 또는 Trp이고;
    위치 29의 Xaa는 Gln, Asn, Leu, Pro, Arg 또는 Val이고;
    위치 30의 Xaa는 Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, Ser, Leu 또는 Lys이고;
    위치 31의 Xaa는 Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu 또는 Gln이고;
    위치 32의 Xaa는 Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, Ala 또는 Glu이고;
    위치 33의 Xaa는 Pro, Leu, Gln, Ala, Thr 또는 Glu이고;
    위치 34의 Xaa는 Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, Gln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile 또는 Met이고;
    위치 35의 Xaa는 Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln 또는 Val이고;
    위치 36의 Xaa는 Asp, Leu 또는 Val이고;
    위치 37의 Xaa는 Phe, Ser, Pro, Trp 또는 Ile이고;
    위치 38의 Xaa는 Asn 또는 Ala이고;
    위치 40의 Xaa는 Leu, Trp 또는 Arg이고;
    위치 41의 Xaa는 Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met 또는 Pro이고;
    위치 42의 Xaa는 Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, Thr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met 또는 Ala이고;
    위치 43의 Xaa는 Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, Ala, Cys, Gln, Arg, Thr, Gly 또는 Ser이고;
    위치 44의 Xaa는 Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, Met, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala 또는 Pro이고;
    위치 45의 Xaa는 Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, Thr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, Glu 또는 His이고;
    위치 46의 Xaa는 Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val 또는 Gly이고;
    위치 47의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro 또는 His이고;
    위치 48의 Xaa는 Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, Phe, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val 또는 Asn이고;
    위치 49의 Xaa는 Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, His 또는 Asp이고;
    위치 50의 Xaa는 Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lsy, Asn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met 또는 Gln이고;
    위치 51의 Xaa는 Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr 또는 His이고;
    위치 52의 Xaa는 Asn, His, Arg, Leu, GLy, Ser 또는 Thr이고;
    위치 53의 Xaa는 Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, Lys, Ser 또는 Met이고;
    위치 54의 Xaa는 Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, His, Ala또는 Leu이고;
    위치 55의 Xaa는 Arg, Thr, Val, Ser, Leu 또는 Gly이고;
    위치 56의 Xaa는 Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, Arg, His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, Val 또는 Lys이고;
    위치 57의 Xaa는 Asn 또는 Gly이고;
    위치 58의 Xaa는 Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val 또는 Cys이고;
    위치 59의 Xaa는 Glu, Tyr, His, Leu, Pro 또는 Arg이고;
    위치 60의 Xaa는 Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn 또는 Thr이고;
    위치 61의 Xaa는 Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg 또는 Ser이고;
    위치 62의 Xaa는 Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, Asp 또는 Ile이고;
    위치 63의 Xaa는 Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, Pro 또는 Val이고;
    위치 64의 Xaa는 Ala, Asn, Pro, Ser 또는 Lys이고;
    위치 65의 Xaa는 Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe 또는 Ser이고;
    위치 66의 Xaa는 Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu 또는 Ser이고;
    위치 67의 Xaa는 Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, Ile, Pro 또는 His이고;
    위치 68의 Xaa는 Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, Thr 또는 His이고;
    위치 69의 Xaa는 Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly 또는 Leu이고;
    위치 70의 Xaa는 Asn, Leu, Val, Trp, Pro 또는 Ala이고;
    위치 71의 Xaa는 Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, Thr, Gln, Trp 또는 Asn이고;
    위치 72의 Xaa는 Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, Arg 또는 Asp이고;
    위치 73의 Xaa는 Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, Thr 또는 Arg이고;
    위치 74의 Xaa는 Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, Ala이고;
    위치 75의 Xaa는 Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln 또는 Leu이고;
    위치 76의 Xaa는 Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly 또는 Asp이고;
    위치 77의 Xaa는 Ile, Ser, Arg, Thr 또는 Leu이고;
    위치 78의 Xaa는 Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly 또는 Arg이고;
    위치 79의 Xaa는 Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, Gly 또는 Asp이고;
    위치 80의 Xaa는 Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, Glu 또는 Arg이고;
    위치 81의 Xaa는 Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, Val 또는 Lys이고;
    위치 82의 Xaa는 Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, Met 또는 Val이고;
    위치 83의 Xaa는 Pro, Ala, Thr, Trp, Arg 또는 Met이고;
    위치 84의 Xaa는 Cys, Glu, Gly, Arg, Met 또는 Val이고;
    위치 85의 Xaa는 Leu, Asn, Val 또는 Gln이고;
    위치 86의 Xaa는 Pro, Cys, Arg, Ala 또는 Lys이고;
    위치 87의 Xaa는 Leu, Ser, Trp 또는 Gly이고;
    위치 88의 Xaa는 Ala, Lys, Arg, Val 또는 Trp이고;
    위치 89의 Xaa는 Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, His, Asn 또는 Ser이고;
    위치 90의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, Ile 또는 Met이고;
    위치 91의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Asp 또는 His이고;
    위치 92의 Xaa는 Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile 또는 Leu이고;
    위치 93의 Xaa는 Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, Leu 또는 Arg이고;
    위치 94의 Xaa는 Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala 또는 Pro이고;
    위치 95의 Xaa는 His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile 또는 Tyr이고;
    위치 96의 Xaa는 Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile 또는 Thr이고;
    위치 97의 Xaa는 Ile, Val, Lys, Ala 또는 Asn이고;
    위치 98의 Xaa는 His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, Thr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, Tyr 또는 Pro이고;
    위치 99의 Xaa는 Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, Gln, Gly, Ser, Phe 또는 His이고;
    위치 100의 Xaa는 Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln 또는 Pro이고;
    위치 101의 Xaa는 Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu 또는 Gln이고;
    위치 102의 Xaa는 Gly, Leu, Glu, Lys, Set, Tyr 또는 Pro이고;
    위치 103의 Xaa는 Asp 또는 Ser이고;
    위치 104의 Xaa는 Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe 또는 Gly이고;
    위치 105의 Xaa는 Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp 또는 His이고;
    위치 106의 Xaa는 Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly 또는 Pro이고;
    위치 108의 Xaa는 Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala 또는 Pro이고;
    위치 109의 Xaa는 Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser 또는 Gly이고;
    위치 110의 Xaa는 Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser 또는 Trp이고;
    위치 111의 Xaa는 Leu, Ile, Arg, Asp 또는 Met이고;
    위치 112의 Xaa는 Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser 또는 Phe이고;
    위치 113의 Xaa는 Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val 또는 Asn이고;
    위치 114의 Xaa는 Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg 또는 Leu이고;
    위치 115의 Xaa는 Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp 또는 Met이고;
    위치 116의 Xaa는 Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln 또는 Ile이고;
    위치 117의 Xaa는 Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys 또는 Pro이고;
    위치 118의 Xaa는 Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp 또는 Tyr이고;
    위치 119의 Xaa는 Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr 또는 Arg이고;
    위치 120의 Xaa는 Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val 또는 Gln이고;
    위치 121의 Xaa는 Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp 또는 Gly이고;
    위치 122의 Xaa는 Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr 또는 Cys이고;
    위치 123의 Xaa는 Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr 또는 Leu이고;
    여기서 상기의 변형된 사람 IL-3 아미노산서열의 N-말단으로부터 1 내지 14 아미노산, C-말단으로부터 1 내지 15 아미노산 또는 N-말단으로부터 1 내지 14 아미노산 및 C-말단으로부터 1 내지 15 아미노산 모두가 삭제될 수 있으며; Xaa로 표시된 아미노산의 1 내지 44는 본래의(1 - 133) 사람 인터루킨-3의 대응하는 아미노산과 다르다;
    (V) 콜로니형성자극인자.
  2. 다음식의 아미노산서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 조혈 단백질.
    R1-L1-R2, R2-L1-R1, R1-R2, 또는 R2-R1
    상기식에서 R1및 R2는 독립적으로 하기 (I), (II), (III), (IV) 또는 (V)로 구성되는 군으로부터 선택되고,
    여기서 L1은 R1을 R2에 연결할 수 있는 링커이고;
    단 적어도 R1또는 R2는 식 (I), (II), 또는 (III)의 폴리펩티드로부터 선택되고; 그리고
    상기 조혈 단백질 바로 앞에 (-1 위치의 메티오닌), (-1 위치의 알라닌) 또는 (-2위치의 메티오닌 및 -1위치의 알라닌)이 올 수 있다.
    (I) 다음 식의 변형된 사람 G-CSF 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    (서열 1)
    상기 서열에서
    위치 1의 Xaa는 Thr, Ser, Arg, Tyr 또는 Gly이고;
    위치 2의 Xaa는 Pro 또는 Leu이고;
    위치 3의 Xaa는 Leu, Arg, Tyr 또는 Ser이고;
    위치 13의 Xaa는 Phe, Ser, His, Thr 또는 Pro이고;
    위치 16의 Xaa는 Lys, Pro, Ser, Thr 또는 His이고;
    위치 17의 Xaa는 Cys, Ser, Gly, Ala, Ile, Tyr 또는 Arg이고;
    위치 18의 Xaa는 Leu, Thr, Pro, His, Ile 또는 Cys이고;
    위치 22의 Xaa는 Arg, Tyr, Ser, Thr 또는 Ala이고;
    위치 24의 Xaa는 Ile, Pro, Tyr 또는 Leu이고;
    위치 27의 Xaa는 Asp 또는 Gly이고;
    위치 30의 Xaa는 Ala, Ile, Leu 또는 Gly이고;
    위치 34의 Xaa는 Lys 또는 Ser이고;
    위치 36의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 42의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 43의 Xaa는 His, Thr, Gly, Val, Lys, Trp, Ala, Arg, Cys 또는 Leu이고;
    위치 44의 Xaa는 Pro, Gly, Arg, Asp, Val, Ala, His, Trp, Gln 또는 Thr이고;
    위치 46의 Xaa는 Glu, Arg, Phe, Arg, Ile 또는 Ala이고;
    위치 47의 Xaa는 Leu 또는 Thr이고;
    위치 49의 Xaa는 Leu, Phe, Arg 또는 Ser이고;
    위치 50의 Xaa는 Leu, Ile, His, Pro 또는 Tyr이고;
    위치 54의 Xaa는 Leu 또는 His이고;
    위치 64의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 67의 Xaa는 Gln, Lys, Leu 또는 Cys이고;
    위치 70의 Xaa는 Gln, Pro, Leu, Arg 또는 Ser이고;
    위치 74의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 104의 Xaa는 Asp, Gly 또는 Val이고;
    위치 108의 Xaa는 Leu, Ala, Val, Arg, Trp, Gln 또는 Gly이고;
    위치 115의 Xaa는 Thr, His, Leu 또는 Ala이고;
    위치 120의 Xaa는 Gln, Gly, Arg, Lys 또는 His이고;
    위치 123의 Xaa는 Glu, Arg, Phe 또는 Thr이고;
    위치 144의 Xaa는 Phe, His, Arg, Pro, Leu, Gln 또는 Glu이고;
    위치 146의 Xaa는 Arg 또는 Gln이고;
    위치 147의 Xaa는 Arg 또는 Gln이고;
    위치 156의 Xaa는 His, Gly 또는 Ser이고;
    위치 159의 Xaa는 Ser, Arg, Thr, Tyr, Val 또는 Gly이고;
    위치 162의 Xaa는 Glu, Leu, Gly 또는 Trp이고;
    위치 163의 Xaa는 Val, Gly, Arg 또는 Ala이고;
    위치 169의 Xaa는 Arg, Ser, Leu, Arg 또는 Cys이고;
    위치 170의 Xaa는 His, Arg 또는 Ser이고;
    여기서 N-말단으로부터 1-11아미노산이, 그리고 C-말단으로부터 1-5 아미노산이 상기의 변형된 사람 G-CSF 아미노산서열로부터 삭제될 수 있고;
    여기서 N-말단은 C-말단에 직접 연결되거나, 또는 N-말단을 C-말단에 연결할 수 있고 다음 아미노산들에서 새로운 C-및 N-말단을 가질 수 있는 링커를 통해 연결된다;
    (II) 다음식의 변형된 사람 IL-3 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    상기 서열에서 위치 17의 Xaa는 Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln 또는 Arg이고;
    위치 18의 Xaa는 Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg 또는 Gln이고;
    위치 19의 Xaa는 Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala 또는 Cys이고;
    위치 20의 Xaa는 Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro 또는 Ala이고;
    위치 21의 Xaa는 Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, Glu, Gln, Asn, Thr, Ser 또는 Val이고;
    위치 22의 Xaa는 Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu, Val 또는 Gly이고;
    위치 23의 Xaa는 Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, Phe, Leu, Ser 또는 Arg이고;
    위치 24의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe 또는 Leu이고;
    위치 25의 Xaa는 Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro 또는 Ala이고;
    위치 26의 Xaa는 His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala 또는 Trp이고;
    위치 27의 Xaa는 Leu, Gly, Arg, Thr, Ser 또는 Ala이고;
    위치 28의 Xaa는 Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, Val 또는 Trp이고;
    위치 29의 Xaa는 Gln, Asn, Leu, Pro, Arg 또는 Val이고;
    위치 30의 Xaa는 Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, Ser, Leu 또는 Lys이고;
    위치 31의 Xaa는 Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu 또는 Gln이고;
    위치 32의 Xaa는 Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, Ala 또는 Glu이고;
    위치 33의 Xaa는 Pro, Leu, Gln, Ala, Thr 또는 Glu이고;
    위치 34의 Xaa는 Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, Gln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile 또는 Met이고;
    위치 35의 Xaa는 Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln 또는 Val이고;
    위치 36의 Xaa는 Asp, Leu 또는 Val이고;
    위치 37의 Xaa는 Phe, Ser, Pro, Trp 또는 Ile이고;
    위치 38의 Xaa는 Asn 또는 Ala이고;
    위치 40의 Xaa는 Leu, Trp 또는 Arg이고;
    위치 41의 Xaa는 Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met 또는 Pro이고;
    위치 42의 Xaa는 Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, Thr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met 또는 Ala이고;
    위치 43의 Xaa는 Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, Ala, Cys, Gln, Arg, Thr, Gly 또는 Ser이고;
    위치 44의 Xaa는 Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, Met, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala 또는 Pro이고;
    위치 45의 Xaa는 Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, Thr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, Glu 또는 His이고;
    위치 46의 Xaa는 Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val 또는 Gly이고;
    위치 47의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro 또는 His이고;
    위치 48의 Xaa는 Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, Phe, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val 또는 Asn이고;
    위치 49의 Xaa는 Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, His 또는 Asp이고;
    위치 50의 Xaa는 Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, Asn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met 또는 Gln이고;
    위치 51의 Xaa는 Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr 또는 His이고;
    위치 52의 Xaa는 Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser 또는 Thr이고;
    위치 53의 Xaa는 Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, Lys, Ser 또는 Met이고;
    위치 54의 Xaa는 Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, His, Ala 또는 Leu이고;
    위치 55의 Xaa는 Arg, Thr, Val, Ser, Leu 또는 Gly이고;
    위치 56의 Xaa는 Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, Arg, His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, Val 또는 Lys이고;
    위치 57의 Xaa는 Asn 또는 Gly이고;
    위치 58의 Xaa는 Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val 또는 Cys이고;
    위치 59의 Xaa는 Glu, Tyr, His, Leu, Pro 또는 Arg 이고;
    위치 60의 Xaa는 Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn 또는 Thr이고;
    위치 61의 Xaa는 Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg 또는 Ser이고;
    위치 62의 Xaa는 Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, Asp 또는 Ile이고;
    위치 63의 Xaa는 Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, Pro 또는 Val이고;
    위치 64의 Xaa는 Ala, Asn, Pro, Ser 또는 Lys이고;
    위치 65의 Xaa는 Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe 또는 Ser이고;
    위치 66의 Xaa는 Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu 또는 Ser이고;
    위치 67의 Xaa는 Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, Ile, Pro 또는 His이고;
    위치 68의 Xaa는 Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, Thr 또는 His이고;
    위치 69의 Xaa는 Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly 또는 Leu이고;
    위치 70의 Xaa는 Asn, Leu, Val, Trp, Pro 또는 Ala이고;
    위치 71의 Xaa는 Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, Thr, Gln, Trp 또는 Asn;
    위치 72의 Xaa는 Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, Arg 또는 Asp이고;
    위치 73의 Xaa는 Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, Thr 또는 Arg이고;
    위치 74의 Xaa는 Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, Ala이고;
    위치 75의 Xaa는 Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln 또는 Leu이고;
    위치 76의 Xaa는 Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly 또는 Asp이고;
    위치 77의 Xaa는 Ile, Ser, Arg, Thr 또는 Leu이고;
    위치 78의 Xaa는 Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly 또는 Arg이고;
    위치 79의 Xaa는 Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, Gly 또는 Asp이고;
    위치 80의 Xaa는 Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, Glu 또는 Arg이고;
    위치 81의 Xaa는 Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, Val 또는 Lys이고;
    위치 82의 Xaa는 Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, Met 또는 Val이고;
    위치 83의 Xaa는 Pro, Ala, Thr, Trp, Arg 또는 Met이고;
    위치 84의 Xaa는 Cys, Glu, Gly, Arg, Met 또는 Val이고;
    위치 85의 Xaa는 Leu, Asn, Val 또는 Gln이고;
    위치 86의 Xaa는 Pro, Cys, Arg, Ala 또는 Lys이고;
    위치 87의 Xaa는 Leu, Ser, Trp 또는 Gly이고;
    위치 88의 Xaa는 Ala, Lys, Arg, Val 또는 Trp이고;
    위치 89의 Xaa는 Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, His, Asn 또는 Ser이고;
    위치 90의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, Ile 또는 Met이고;
    위치 91의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Asp 또는 His이고;
    위치 92의 Xaa는 Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile 또는 Leu이고;
    위치 93의 Xaa는 Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, Leu 또는 Arg이고;
    위치 94의 Xaa는 Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala 또는 Pro이고;
    위치 95의 Xaa는 His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile 또는 Tyr이고;
    위치 96의 Xaa는 Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile 또는 Thr이고;
    위치 97의 Xaa는 Ile, Val, Lys, Ala 또는 Asn이고;
    위치 98의 Xaa는 His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, Thr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, Tyr 또는 Pro이고;
    위치 99의 Xaa는 Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, Gln, Gly, Ser, Phe 또는 His이고;
    위치 100의 Xaa는 Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln 또는 Pro이고;
    위치 101의 Xaa는 Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu 또는 Gln이고;
    위치 102의 Xaa는 Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr 또는 Pro이고;
    위치 103의 Xaa는 Asp 또는 Ser이고;
    위치 104의 Xaa는 Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe 또는 Gly이고;
    위치 105의 Xaa는 Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp 또는 His이고;
    위치 106의 Xaa는 Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly 또는 Pro이고;
    위치 108의 Xaa는 Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala 또는 Pro이고;
    위치 109의 Xaa는 Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser 또는 Gly이고;
    위치 110의 Xaa는 Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser 또는 Trp이고;
    위치 111의 Xaa는 Leu, Ile, Arg, Asp 또는 Met이고;
    위치 112의 Xaa는 Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser 또는 Phe 이고;
    위치 113의 Xaa는 Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val 또는 Asp이고;
    위치 114의 Xaa는 Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg 또는 Leu이고;
    위치 115의 Xaa는 Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp 또는 Met이고;
    위치 116의 Xaa는 Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln 또는 Ile이고;
    위치 117의 Xaa는 Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys 또는 Pro이고;
    위치 118의 Xaa는 Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp 또는 Tyr이고;
    위치 119의 Xaa는 Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr 또는 Arg이고;
    위치 120의 Xaa는 Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val 또는 Gln이고;
    위치 121의 Xaa는 Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp 또는 Gly이고;
    위치 122의 Xaa는 Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr 또는Cys이고;
    위치 123의 Xaa는 Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr 또는 Leu이고;
    여기서 상기의 변형된 사람 IL-3 아미노산서열의 N-말단으로부터 1 내지 14 아미노산, C-말단으로부터 1 내지 15 아미노산, 또는 N-말단으로부터 1 내지 14 아미노산 및 C-말단으로부터 1 내지 15 아미노산 모두가 삭제될 수 있으며; Xaa로 표시된 아미노산의 0 내지 44는 본래의(1 - 133) 사람 인터루킨-3의 대응하는 아미노산과 다르며;
    여기서 N-말단은 C-말단에 직접 연결되거나, 또는 N-말단을 C-말단에 연결할 수 있고 다음 아미노산들에서 새로운 C-말단 및 N-말단을 가질 수 있는 링커(L2)를 통해 연결된다;
    (III) 다음식의 변형된 사람 c-mpl 리간드 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    (서열 256)
    상기 서열에서, 위치 112의 Xaa는 삭제되거나 Leu, Ala, Val, Ile, Pro, Phe, Trp 또는 Met이고;
    위치 113의 Xaa는 삭제되거나 Pho, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp 또는 Met이고;
    위치 114의 Xaa는 삭제되거나 Pro, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp 또는 Met이고;
    위치 115의 Xaa는 삭제되거나 Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr 또는 Asn이고;
    여기서 N-말단은 C-말단에 직접 연결되거나, 또는 N-말단을 C-말단에 연결할 수 있고 다음 아미노산들에서 새로운 C- 및 N-말단을 가질 수 있는 링커(L2)를 통해연결된다;
    (IV) 다음식의 변형된 사람 IL-3 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    상기 서열에서 위치 17의 Xaa는 Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln 또는 Arg이고;
    위치 18의 Xaa는 Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg 또는 Gln이고;
    위치 19의 Xaa는 Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala 또는 Cys이고;
    위치 20의 Xaa는 Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro 또는 Ala이고;
    위치 21의 Xaa는 Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, Glu, Gln, Asn, Thr, Ser 또는 Val이고;
    위치 22의 Xaa는 Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu, Val 또는 Gly이고;
    위치 23의 Xaa는 Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, Phe, Leu, Ser 또는 Arg이고;
    위치 24의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe 또는 Leu이고;
    위치 25의 Xaa는 Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro 또는 Ala이고;
    위치 26의 Xaa는 His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala 또는 Trp이고;
    위치 27의 Xaa는 Leu, Gly, Arg, Thr, Ser 또는 Ala이고;
    위치 28의 Xaa는 Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, Val 또는 Trp이고;
    위치 29의 Xaa는 Gln, Asn, Leu, Pro, Arg 또는 Val이고;
    위치 30의 Xaa는 Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, Ser, Leu 또는 Lys이고;
    위치 31의 Xaa는 Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu 또는 Gln이고;
    위치 32의 Xaa는 Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, Ala 또는 Glu이고;
    위치 33의 Xaa는 Pro, Leu, Gln, Ala, Thr 또는 Glu이고;
    위치 34의 Xaa는 Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, Gln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile 또는 Met이고;
    위치 35의 Xaa는 Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln 또는 Val이고;
    위치 36의 Xaa는 Asp, Leu 또는 Val이고;
    위치 37의 Xaa는 Phe, Ser, Pro, Trp 또는 Ile이고;
    위치 38의 Xaa는 Asn 또는 Ala이고;
    위치 40의 Xaa는 Leu, Trp 또는 Arg이고;
    위치 41의 Xaa는 Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met 또는 Pro이고;
    위치 42의 Xaa는 Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, Thr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met 또는 Ala이고;
    위치 43의 Xaa는 Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, Ala, Cys, Gln, Arg, Thr, Gly 또는 Ser이고;
    위치 44의 Xaa는 Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, Met, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala 또는 Pro이고;
    위치 45의 Xaa는 Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, Thr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, Glu 또는 His이고;
    위치 46의 Xaa는 Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val 또는 Gly이고;
    위치 47의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro 또는 His이고;
    위치 48의 Xaa는 Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, Phe, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val 또는 Asn이고;
    위치 49의 Xaa는 Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, His 또는 Asp이고;
    위치 50의 Xaa는 Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lsy, Asn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met 또는 Gln이고;
    위치 51의 Xaa는 Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr 또는 His이고;
    위치 52의 Xaa는 Asn, His, Arg, Leu, GLy, Ser 또는 Thr이고;
    위치 53의 Xaa는 Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, Lys, Ser 또는 Met이고;
    위치 54의 Xaa는 Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, His, Ala 또는 Leu이고;
    위치 55의 Xaa는 Arg, Thr, Val, Ser, Leu 또는 Gly이고;
    위치 56의 Xaa는 Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, Arg, His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, Val 또는 Lys이고;
    위치 57의 Xaa는 Asn 또는 Gly이고;
    위치 58의 Xaa는 Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val 또는 Cys이고;
    위치 59의 Xaa는 Glu, Tyr, His, Leu, Pro 또는 Arg이고;
    위치 60의 Xaa는 Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn 또는 Thr이고;
    위치 61의 Xaa는 Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg 또는 Ser이고;
    위치 62의 Xaa는 Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, Asp 또는 Ile이고;
    위치 63의 Xaa는 Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, Pro 또는 Val이고;
    위치 64의 Xaa는 Ala, Asn, Pro, Ser 또는 Lys이고;
    위치 65의 Xaa는 Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe 또는 Ser이고;
    위치 66의 Xaa는 Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu 또는 Ser이고;
    위치 67의 Xaa는 Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, Ile, Pro 또는 His이고;
    위치 68의 Xaa는 Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, Thr 또는 His이고;
    위치 69의 Xaa는 Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly 또는 Leu이고;
    위치 70의 Xaa는 Asn, Leu, Val, Trp, Pro 또는 Ala이고;
    위치 71의 Xaa는 Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, Thr, Gln, Trp 또는 Asn이고;
    위치 72의 Xaa는 Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, Arg 또는 Asp이고;
    위치 73의 Xaa는 Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, Thr 또는 Arg이고;
    위치 74의 Xaa는 Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, Ala이고;
    위치 75의 Xaa는 Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln 또는 Leu이고;
    위치 76의 Xaa는 Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly 또는 Asp이고;
    위치 77의 Xaa는 Ile, Ser, Arg, Thr 또는 Leu이고;
    위치 78의 Xaa는 Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly 또는 Arg이고;
    위치 79의 Xaa는 Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, Gly 또는 Asp이고;
    위치 80의 Xaa는 Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, Glu 또는 Arg이고;
    위치 81의 Xaa는 Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, Val 또는 Lys이고;
    위치 82의 Xaa는 Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, Met 또는 Val이고;
    위치 83의 Xaa는 Pro, Ala, Thr, Trp, Arg 또는 Met이고;
    위치 84의 Xaa는 Cys, Glu, Gly, Arg, Met 또는 Val이고;
    위치 85의 Xaa는 Leu, Asn, Val 또는 Gln이고;
    위치 86의 Xaa는 Pro, Cys, Arg, Ala 또는 Lys이고;
    위치 87의 Xaa는 Leu, Ser, Trp 또는 Gly이고;
    위치 88의 Xaa는 Ala, Lys, Arg, Val 또는 Trp이고;
    위치 89의 Xaa는 Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, His, Asn 또는 Ser이고;
    위치 90의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, Ile 또는 Met이고;
    위치 91의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Asp 또는 His이고;
    위치 92의 Xaa는 Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile 또는 Leu이고;
    위치 93의 Xaa는 Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, Leu 또는 Arg이고;
    위치 94의 Xaa는 Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala 또는 Pro이고;
    위치 95의 Xaa는 His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile 또는 Tyr이고;
    위치 96의 Xaa는 Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile 또는 Thr이고;
    위치 97의 Xaa는 Ile, Val, Lys, Ala 또는 Asn이고;
    위치 98의 Xaa는 His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, Thr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, Tyr 또는 Pro이고;
    위치 99의 Xaa는 Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, Gln, Gly, Ser, Phe 또는 His이고;
    위치 100의 Xaa는 Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln 또는 Pro이고;
    위치 101의 Xaa는 Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu 또는 Gln이고;
    위치 102의 Xaa는 Gly, Leu, Glu, Lys, Set, Tyr 또는 Pro이고;
    위치 103의 Xaa는 Asp 또는 Ser이고;
    위치 104의 Xaa는 Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe 또는 Gly이고;
    위치 105의 Xaa는 Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp 또는 His이고;
    위치 106의 Xaa는 Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly 또는 Pro이고;
    위치 108의 Xaa는 Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala 또는 Pro이고;
    위치 109의 Xaa는 Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser 또는 Gly이고;
    위치 110의 Xaa는 Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser 또는 Trp이고;
    위치 111의 Xaa는 Leu, Ile, Arg, Asp 또는 Met이고;
    위치 112의 Xaa는 Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser 또는 Phe이고;
    위치 113의 Xaa는 Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val 또는 Asn이고;
    위치 114의 Xaa는 Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg 또는 Leu이고;
    위치 115의 Xaa는 Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp 또는 Met이고;
    위치 116의 Xaa는 Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln 또는 Ile이고;
    위치 117의 Xaa는 Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys 또는 Pro이고;
    위치 118의 Xaa는 Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp 또는 Tyr이고;
    위치 119의 Xaa는 Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr 또는 Arg이고;
    위치 120의 Xaa는 Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val 또는 Gln이고;
    위치 121의 Xaa는 Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp 또는 Gly이고;
    위치 122의 Xaa는 Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr 또는 Cys이고;
    위치 123의 Xaa는 Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr 또는 Leu이고;
    여기서 상기의 변형된 사람 IL-3 아미노산서열의 N-말단으로부터 1 내지 14 아미노산, C-말단으로부터 1 내지 15 아미노산, 또는 N-말단으로부터 1 내지 14 아미노산 및 C-말단으로부터 1 내지 15 아미노산 모두가 삭제될 수 있으며; Xaa로 표시된 아미노산의 1 내지 44는 본래의(1 - 133) 사람 인터루킨-3의 대응하는 아미노산과 다르다;
    (V) 콜로니형성자극인자.
  3. 제 1 항에 있어서, (IV)의 폴리펩티드는 다음으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조혈 단백질.
    (서열 225)
    (서열 226)
    (서열 227)
    및
    (서열 228)
  4. 제 2 항에 있어서, (IV)의 폴리펩티드는 다음으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조혈 단백질.
    (서열 225)
    (서열 226)
    (서열 227)
    및
    (서열 228)
  5. 다음식의 아미노산서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 조혈 단백질.
    R1-L1-R2, R2-L1-R1, R1-R2, 또는 R2-R1
    상기식에서 R1은 다음식의 변형된 사람 G-CSF 아미노산서열로 구성되는 폴리펩티드이고;
    (서열 1)
    상기 서열에서
    위치 1의 Xaa는 Thr, Ser, Arg, Tyr 또는 Gly이고;
    위치 2의 Xaa는 Pro 또는 Leu이고;
    위치 3의 Xaa는 Leu, Arg, Tyr 또는 Ser이고;
    위치 13의 Xaa는 Phe, Ser, His, Thr 또는 Pro이고;
    위치 16의 Xaa는 Lys, Pro, Ser, Thr 또는 His이고;
    위치 17의 Xaa는 Cys, Ser, Gly, Ala, Ile, Tyr 또는 Arg이고;
    위치 18의 Xaa는 Leu, Thr, Pro, His, Ile 또는 Cys이고;
    위치 22의 Xaa는 Arg, Tyr, Ser, Thr 또는 Ala이고;
    위치 24의 Xaa는 Ile, Pro, Tyr 또는 Leu이고;
    위치 27의 Xaa는 Asp 또는 Gly이고;
    위치 30의 Xaa는 Ala, Ile, Leu 또는 Gly이고;
    위치 34의 Xaa는 Lys 또는 Ser이고;
    위치 36의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 42의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 43의 Xaa는 His, Thr, Gly, Val, Lys, Trp, Ala, Arg, Cys 또는 Leu이고;
    위치 44의 Xaa는 Pro, Gly, Arg, Asp, Val, Ala, His, Trp, Gln 또는 Thr이고;
    위치 46의 Xaa는 Glu, Arg, Phe, Arg, Ile 또는 Ala이고;
    위치 47의 Xaa는 Leu 또는 Thr이고;
    위치 49의 Xaa는 Leu, Phe, Arg 또는 Ser이고;
    위치 50의 Xaa는 Leu, Ile, His, Pro 또는 Tyr이고;
    위치 54의 Xaa는 Leu 또는 His이고;
    위치 64의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 67의 Xaa는 Gln, Lys, Leu 또는 Cys이고;
    위치 70의 Xaa는 Gln, Pro, Leu, Arg 또는 Ser이고;
    위치 74의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 104의 Xaa는 Asp, Gly 또는 Val이고;
    위치 108의 Xaa는 Leu, Ala, Val, Arg, Trp, Gln 또는 Gly이고;
    위치 115의 Xaa는 Thr, His, Leu 또는 Ala이고;
    위치 120의 Xaa는 Gln, Gly, Arg, Lys 또는 His이고;
    위치 123의 Xaa는 Glu, Arg, Phe 또는 Thr이고;
    위치 144의 Xaa는 Phe, His, Arg, Pro, Leu, Gln 또는 Glu이고;
    위치 146의 Xaa는 Arg 또는 Gln이고;
    위치 147의 Xaa는 Arg 또는 Gln이고;
    위치 156의 Xaa는 His, Gly 또는 Ser이고;
    위치 159의 Xaa는 Ser, Arg, Thr, Tyr, Val 또는 Gly이고;
    위치 162의 Xaa는 Glu, Leu, Gly 또는 Trp이고;
    위치 163의 Xaa는 Val, Gly, Arg 또는 Ala이고;
    위치 169의 Xaa는 Arg, Ser, Leu, Arg 또는 Cys이고;
    위치 170의 Xaa는 His, Arg 또는 Ser이고;
    여기서 N-말단으로부터 1-11아미노산이, 그리고 C-말단으로부터 1-5 아미노산이 상기의 변형된 사람 G-CSF 아미노산서열로부터 삭제될 수 있고;
    여기서 N-말단은 C-말단에 직접 연결되거나, 또는 N-말단을 C-말단에 연결할 수 있고 다음 아미노산들에서 새로운 C-및 N-말단을 가질 수 있는 링커를 통해 연결된다;
    상기식에서 R2는 다음식의 변형된 사람 IL-3 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드이고;
    (서열 2a)
    (서열 2b)
    상기 서열에서 위치 17의 Xaa는 Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln 또는 Arg이고;
    위치 18의 Xaa는 Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg 또는 Gln이고;
    위치 19의 Xaa는 Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala 또는 Cys이고;
    위치 20의 Xaa는 Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro 또는 Ala이고;
    위치 21의 Xaa는 Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, Glu, Gln, Asn, Thr, Ser 또는 Val이고;
    위치 22의 Xaa는 Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu, Val 또는 Gly이고;
    위치 23의 Xaa는 Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, Phe, Leu, Ser 또는 Arg이고;
    위치 24의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe 또는 Leu이고;
    위치 25의 Xaa는 Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro 또는 Ala이고;
    위치 26의 Xaa는 His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala 또는 Trp이고;
    위치 27의 Xaa는 Leu, Gly, Arg, Thr, Ser 또는 Ala이고;
    위치 28의 Xaa는 Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, Val 또는 Trp이고;
    위치 29의 Xaa는 Gln, Asn, Leu, Pro, Arg 또는 Val이고;
    위치 30의 Xaa는 Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, Ser, Leu 또는 Lys이고;
    위치 31의 Xaa는 Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu 또는 Gln이고;
    위치 32의 Xaa는 Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, Ala 또는 Glu이고;
    위치 33의 Xaa는 Pro, Leu, Gln, Ala, Thr 또는 Glu이고;
    위치 34의 Xaa는 Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, Gln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile 또는 Met이고;
    위치 35의 Xaa는 Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln 또는 Val이고;
    위치 36의 Xaa는 Asp, Leu 또는 Val이고;
    위치 37의 Xaa는 Phe, Ser, Pro, Trp 또는 Ile이고;
    위치 38의 Xaa는 Asn 또는 Ala이고;
    위치 40의 Xaa는 Leu, Trp 또는 Arg이고;
    위치 41의 Xaa는 Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met 또는 Pro이고;
    위치 42의 Xaa는 Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, Thr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met 또는 Ala이고;
    위치 43의 Xaa는 Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, Ala, Cys, Gln, Arg, Thr,Gly 또는 Ser이고;
    위치 44의 Xaa는 Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, Met, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala 또는 Pro이고;
    위치 45의 Xaa는 Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, Thr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, Glu 또는 His이고;
    위치 46의 Xaa는 Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val 또는 Gly이고;
    위치 47의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro 또는 His이고;
    위치 48의 Xaa는 Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, Phe, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val 또는 Asn이고;
    위치 49의 Xaa는 Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, His 또는 Asp이고;
    위치 50의 Xaa는 Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, Asn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met 또는 Gln이고;
    위치 51의 Xaa는 Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr 또는 His이고;
    위치 52의 Xaa는 Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser 또는 Thr이고;
    위치 53의 Xaa는 Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, Lys, Ser 또는 Met이고;
    위치 54의 Xaa는 Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, His, Ala 또는 Leu이고;
    위치 55의 Xaa는 Arg, Thr, Val, Ser, Leu 또는 Gly이고;
    위치 56의 Xaa는 Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, Arg, His, Thr, Ala, Tyr,Phe, Leu, Val 또는 Lys이고;
    위치 57의 Xaa는 Asn 또는 Gly이고;
    위치 58의 Xaa는 Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val 또는 Cys이고;
    위치 59의 Xaa는 Glu, Tyr, His, Leu, Pro 또는 Arg 이고;
    위치 60의 Xaa는 Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn 또는 Thr이고;
    위치 61의 Xaa는 Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg 또는 Ser이고;
    위치 62의 Xaa는 Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, Asp 또는 Ile이고;
    위치 63의 Xaa는 Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, Pro 또는 Val이고;
    위치 64의 Xaa는 Ala, Asn, Pro, Ser 또는 Lys이고;
    위치 65의 Xaa는 Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe 또는 Ser이고;
    위치 66의 Xaa는 Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu 또는 Ser이고;
    위치 67의 Xaa는 Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, Ile, Pro 또는 His이고;
    위치 68의 Xaa는 Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, Thr 또는 His이고;
    위치 69의 Xaa는 Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly 또는 Leu이고;
    위치 70의 Xaa는 Asn, Leu, Val, Trp, Pro 또는 Ala이고;
    위치 71의 Xaa는 Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, Thr, Gln, Trp 또는 Asn;
    위치 72의 Xaa는 Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, Arg 또는 Asp이고;
    위치 73의 Xaa는 Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, Thr 또는 Arg이고;
    위치 74의 Xaa는 Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, Ala이고;
    위치 75의 Xaa는 Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln 또는 Leu이고;
    위치 76의 Xaa는 Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly 또는 Asp이고;
    위치 77의 Xaa는 Ile, Ser, Arg, Thr 또는 Leu이고;
    위치 78의 Xaa는 Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly 또는 Arg이고;
    위치 79의 Xaa는 Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, Gly 또는 Asp이고;
    위치 80의 Xaa는 Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, Glu 또는 Arg이고;
    위치 81의 Xaa는 Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, Val 또는 Lys이고;
    위치 82의 Xaa는 Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, Met 또는 Val이고;
    위치 83의 Xaa는 Pro, Ala, Thr, Trp, Arg 또는 Met이고;
    위치 84의 Xaa는 Cys, Glu, Gly, Arg, Met 또는 Val이고;
    위치 85의 Xaa는 Leu, Asn, Val 또는 Gln이고;
    위치 86의 Xaa는 Pro, Cys, Arg, Ala 또는 Lys이고;
    위치 87의 Xaa는 Leu, Ser, Trp 또는 Gly이고;
    위치 88의 Xaa는 Ala, Lys, Arg, Val 또는 Trp이고;
    위치 89의 Xaa는 Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, His, Asn 또는 Ser이고;
    위치 90의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, Ile 또는 Met이고;
    위치 91의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Asp 또는 His이고;
    위치 92의 Xaa는 Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile 또는 Leu이고;
    위치 93의 Xaa는 Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, Leu 또는 Arg이고;
    위치 94의 Xaa는 Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala 또는 Pro이고;
    위치 95의 Xaa는 His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile 또는 Tyr이고;
    위치 96의 Xaa는 Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile 또는 Thr이고;
    위치 97의 Xaa는 Ile, Val, Lys, Ala 또는 Asn이고;
    위치 98의 Xaa는 His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, Thr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, Tyr 또는 Pro이고;
    위치 99의 Xaa는 Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, Gln, Gly, Ser, Phe 또는 His이고;
    위치 100의 Xaa는 Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln 또는 Pro이고;
    위치 101의 Xaa는 Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu 또는 Gln이고;
    위치 102의 Xaa는 Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr 또는 Pro이고;
    위치 103의 Xaa는 Asp 또는 Ser이고;
    위치 104의 Xaa는 Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe 또는 Gly이고;
    위치 105의 Xaa는 Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp 또는 His이고;
    위치 106의 Xaa는 Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly 또는 Pro이고;
    위치 108의 Xaa는 Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala 또는 Pro이고;
    위치 109의 Xaa는 Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser 또는 Gly이고;
    위치 110의 Xaa는 Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser 또는 Trp이고;
    위치 111의 Xaa는 Leu, Ile, Arg, Asp 또는 Met이고;
    위치 112의 Xaa는 Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser 또는 Phe 이고;
    위치 113의 Xaa는 Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val 또는 Asp이고;
    위치 114의 Xaa는 Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg 또는 Leu이고;
    위치 115의 Xaa는 Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp 또는 Met이고;
    위치 116의 Xaa는 Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln 또는 Ile이고;
    위치 117의 Xaa는 Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys 또는 Pro이고;
    위치 118의 Xaa는 Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp 또는 Tyr이고;
    위치 119의 Xaa는 Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr 또는 Arg이고;
    위치 120의 Xaa는 Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val 또는 Gln이고;
    위치 121의 Xaa는 Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp 또는 Gly이고;
    위치 122의 Xaa는 Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr 또는 Cys이고;
    위치 123의 Xaa는 Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr 또는 Leu이고;
    여기서 상기의 변형된 사람 인터루킨-3 아미노산서열의 N-말단으로부터 1 내지 14 아미노산, C-말단으로부터 1 내지 15 아미노산, 또는 N-말단으로부터 1 내지 14 아미노산 및 C-말단으로부터 1 내지 15 아미노산 모두가 삭제될 수 있으며; Xaa로 표시된 아미노산의 0 내지 44는 본래의(1 - 133) 사람 인터루킨-3의 대응하는 아미노산과 다르며;
    여기서 N-말단은 C-말단에 직접 연결되거나, 또는 N-말단을 C-말단에 연결할 수 있고 다음 아미노산들에서 새로운 C-말단 및 N-말단을 가질 수 있는 링커(L2)를 통해 연결된다;
    여기서 L1은 R1을 R2에 연결할 수 있는 링커이고; 그리고
    상기 조혈 단백질은 바로 앞에 (-1위치의 메티오닌), (-1위치의 알라닌) 또는 (-2위치의 메티오닌 및 -1위치의 알라닌)이 올 수 있다.
  6. 다음식의 아미노산서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 조혈 단백질.
    R1-L1-R2, R2-L1-R1, R1-R2, 또는 R2-R1
    상기식에서 R1은 다음식의 변형된 사람 G-CSF 아미노산서열로 구성되는 폴리펩티드이고;
    (서열 1)
    상기 서열에서, 위치 1의 Xaa는 Thr, Ser, Arg, Tyr 또는 Gly이고;
    위치 2의 Xaa는 Pro 또는 Leu이고;
    위치 3의 Xaa는 Leu, Arg, Tyr 또는 Ser이고;
    위치 13의 Xaa는 Phe, Ser, His, Thr 또는 Pro이고;
    위치 16의 Xaa는 Lys, Pro, Ser, Thr 또는 His이고;
    위치 17의 Xaa는 Cys, Ser, Gly, Ala, Ile, Tyr 또는 Arg이고;
    위치 18의 Xaa는 Leu, Thr, Pro, His, Ile 또는 Cys이고;
    위치 22의 Xaa는 Arg, Tyr, Ser, Thr 또는 Ala이고;
    위치 24의 Xaa는 Ile, Pro, Tyr 또는 Leu이고;
    위치 27의 Xaa는 Asp 또는 Gly이고;
    위치 30의 Xaa는 Ala, Ile, Leu 또는 Gly이고;
    위치 34의 Xaa는 Lys 또는 Ser이고;
    위치 36의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 42의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 43의 Xaa는 His, Thr, Gly, Val, Lys, Trp, Ala, Arg, Cys 또는 Leu이고;
    위치 44의 Xaa는 Pro, Gly, Arg, Asp, Val, Ala, His, Trp, Gln 또는 Thr이고;
    위치 46의 Xaa는 Glu, Arg, Phe, Arg, Ile 또는 Ala이고;
    위치 47의 Xaa는 Leu 또는 Thr이고;
    위치 49의 Xaa는 Leu, Phe, Arg 또는 Ser이고;
    위치 50의 Xaa는 Leu, Ile, His, Pro 또는 Tyr이고;
    위치 54의 Xaa는 Leu 또는 His이고;
    위치 64의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 67의 Xaa는 Gln, Lys, Leu 또는 Cys이고;
    위치 70의 Xaa는 Gln, Pro, Leu, Arg 또는 Ser이고;
    위치 74의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 104의 Xaa는 Asp, Gly 또는 Val이고;
    위치 108의 Xaa는 Leu, Ala, Val, Arg, Trp, Gln 또는 Gly이고;
    위치 115의 Xaa는 Thr, His, Leu 또는 Ala이고;
    위치 120의 Xaa는 Gln, Gly, Arg, Lys 또는 His이고;
    위치 123의 Xaa는 Glu, Arg, Phe 또는 Thr이고;
    위치 144의 Xaa는 Phe, His, Arg, Pro, Leu, Gln 또는 Glu이고;
    위치 146의 Xaa는 Arg 또는 Gln이고;
    위치 147의 Xaa는 Arg 또는 Gln이고;
    위치 156의 Xaa는 His, Gly 또는 Ser이고;
    위치 159의 Xaa는 Ser, Arg, Thr, Tyr, Val 또는 Gly이고;
    위치 162의 Xaa는 Glu, Leu, Gly 또는 Trp이고;
    위치 163의 Xaa는 Val, Gly, Arg 또는 Ala이고;
    위치 169의 Xaa는 Arg, Ser, Leu, Arg 또는 Cys이고;
    위치 170의 Xaa는 His, Arg 또는 Ser이고;
    여기서 N-말단으로부터 1-11아미노산이, 그리고 C-말단으로부터 1-5 아미노산이 상기의 변형된 사람 G-CSF 아미노산서열로부터 삭제될 수 있고;
    여기서 N-말단은 C-말단에 직접 연결되거나, 또는 N-말단을 C-말단에 연결할 수 있고 다음 아미노산들에서 새로운 C-및 N-말단을 가질 수 있는 링커를 통해 연결된다;
    R2는 다음식의 변형된 사람 IL-3 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드이고;
    상기 서열에서 위치 17의 Xaa는 Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln 또는 Arg이고;
    위치 18의 Xaa는 Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg 또는 Gln이고;
    위치 19의 Xaa는 Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala 또는 Cys이고;
    위치 20의 Xaa는 Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro 또는 Ala이고;
    위치 21의 Xaa는 Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, Glu, Gln, Asn, Thr, Ser 또는 Val이고;
    위치 22의 Xaa는 Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu, Val 또는 Gly이고;
    위치 23의 Xaa는 Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, Phe, Leu, Ser 또는 Arg이고;
    위치 24의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe 또는 Leu이고;
    위치 25의 Xaa는 Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro 또는 Ala이고;
    위치 26의 Xaa는 His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala 또는 Trp이고;
    위치 27의 Xaa는 Leu, Gly, Arg, Thr, Ser 또는 Ala이고;
    위치 28의 Xaa는 Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, Val 또는 Trp이고;
    위치 29의 Xaa는 Gln, Asn, Leu, Pro, Arg 또는 Val이고;
    위치 30의 Xaa는 Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, Ser, Leu 또는 Lys이고;
    위치 31의 Xaa는 Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu 또는 Gln이고;
    위치 32의 Xaa는 Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, Ala 또는 Glu이고;
    위치 33의 Xaa는 Pro, Leu, Gln, Ala, Thr 또는 Glu이고;
    위치 34의 Xaa는 Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, Gln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile 또는 Met이고;
    위치 35의 Xaa는 Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln 또는 Val이고;
    위치 36의 Xaa는 Asp, Leu 또는 Val이고;
    위치 37의 Xaa는 Phe, Ser, Pro, Trp 또는 Ile이고;
    위치 38의 Xaa는 Asn 또는 Ala이고;
    위치 40의 Xaa는 Leu, Trp 또는 Arg이고;
    위치 41의 Xaa는 Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met 또는 Pro이고;
    위치 42의 Xaa는 Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, Thr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met 또는 Ala이고;
    위치 43의 Xaa는 Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, Ala, Cys, Gln, Arg, Thr, Gly 또는 Ser이고;
    위치 44의 Xaa는 Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, Met, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala 또는 Pro이고;
    위치 45의 Xaa는 Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, Thr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, Glu 또는 His이고;
    위치 46의 Xaa는 Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val 또는 Gly이고;
    위치 47의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro 또는 His이고;
    위치 48의 Xaa는 Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, Phe, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val 또는 Asn이고;
    위치 49의 Xaa는 Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, His 또는 Asp이고;
    위치 50의 Xaa는 Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, Asn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met 또는 Gln이고;
    위치 51의 Xaa는 Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr 또는 His이고;
    위치 52의 Xaa는 Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser 또는 Thr이고;
    위치 53의 Xaa는 Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, Lys, Ser 또는 Met이고;
    위치 54의 Xaa는 Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, His, Ala 또는 Leu이고;
    위치 55의 Xaa는 Arg, Thr, Val, Ser, Leu 또는 Gly이고;
    위치 56의 Xaa는 Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, Arg, His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, Val 또는 Lys이고;
    위치 57의 Xaa는 Asn 또는 Gly이고;
    위치 58의 Xaa는 Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val 또는 Cys이고;
    위치 59의 Xaa는 Glu, Tyr, His, Leu, Pro 또는 Arg 이고;
    위치 60의 Xaa는 Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn 또는 Thr이고;
    위치 61의 Xaa는 Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg 또는 Ser이고;
    위치 62의 Xaa는 Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, Asp 또는 Ile이고;
    위치 63의 Xaa는 Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, Pro 또는 Val이고;
    위치 64의 Xaa는 Ala, Asn, Pro, Ser 또는 Lys이고;
    위치 65의 Xaa는 Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe 또는 Ser이고;
    위치 66의 Xaa는 Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu 또는 Ser이고;
    위치 67의 Xaa는 Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, Ile, Pro 또는 His이고;
    위치 68의 Xaa는 Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, Thr 또는 His이고;
    위치 69의 Xaa는 Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly 또는 Leu이고;
    위치 70의 Xaa는 Asn, Leu, Val, Trp, Pro 또는 Ala이고;
    위치 71의 Xaa는 Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, Thr, Gln, Trp 또는 Asn;
    위치 72의 Xaa는 Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, Arg 또는 Asp이고;
    위치 73의 Xaa는 Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, Thr 또는 Arg이고;
    위치 74의 Xaa는 Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, Ala이고;
    위치 75의 Xaa는 Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln 또는 Leu이고;
    위치 76의 Xaa는 Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly 또는 Asp이고;
    위치 77의 Xaa는 Ile, Ser, Arg, Thr 또는 Leu이고;
    위치 78의 Xaa는 Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly 또는 Arg이고;
    위치 79의 Xaa는 Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, Gly 또는 Asp이고;
    위치 80의 Xaa는 Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, Glu 또는 Arg이고;
    위치 81의 Xaa는 Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, Val 또는 Lys이고;
    위치 82의 Xaa는 Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, Met 또는 Val이고;
    위치 83의 Xaa는 Pro, Ala, Thr, Trp, Arg 또는 Met이고;
    위치 84의 Xaa는 Cys, Glu, Gly, Arg, Met 또는 Val이고;
    위치 85의 Xaa는 Leu, Asn, Val 또는 Gln이고;
    위치 86의 Xaa는 Pro, Cys, Arg, Ala 또는 Lys이고;
    위치 87의 Xaa는 Leu, Ser, Trp 또는 Gly이고;
    위치 88의 Xaa는 Ala, Lys, Arg, Val 또는 Trp이고;
    위치 89의 Xaa는 Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, His, Asn 또는 Ser이고;
    위치 90의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, Ile 또는 Met이고;
    위치 91의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Asp 또는 His이고;
    위치 92의 Xaa는 Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile 또는 Leu이고;
    위치 93의 Xaa는 Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, Leu 또는 Arg이고;
    위치 94의 Xaa는 Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala 또는 Pro이고;
    위치 95의 Xaa는 His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile 또는 Tyr이고;
    위치 96의 Xaa는 Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile 또는 Thr이고;
    위치 97의 Xaa는 Ile, Val, Lys, Ala 또는 Asn이고;
    위치 98의 Xaa는 His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, Thr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, Tyr 또는 Pro이고;
    위치 99의 Xaa는 Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, Gln, Gly, Ser, Phe 또는 His이고;
    위치 100의 Xaa는 Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln 또는 Pro이고;
    위치 101의 Xaa는 Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu 또는 Gln이고;
    위치 102의 Xaa는 Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr 또는 Pro이고;
    위치 103의 Xaa는 Asp 또는 Ser이고;
    위치 104의 Xaa는 Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe 또는 Gly이고;
    위치 105의 Xaa는 Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp 또는 His이고;
    위치 106의 Xaa는 Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly 또는 Pro이고;
    위치 108의 Xaa는 Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala 또는 Pro이고;
    위치 109의 Xaa는 Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser 또는 Gly이고;
    위치 110의 Xaa는 Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser 또는 Trp이고;
    위치 111의 Xaa는 Leu, Ile, Arg, Asp 또는 Met이고;
    위치 112의 Xaa는 Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser 또는 Phe 이고;
    위치 113의 Xaa는 Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val 또는 Asp이고;
    위치 114의 Xaa는 Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg 또는 Leu이고;
    위치 115의 Xaa는 Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp 또는 Met이고;
    위치 116의 Xaa는 Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln 또는 Ile이고;
    위치 117의 Xaa는 Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys 또는 Pro이고;
    위치 118의 Xaa는 Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp 또는 Tyr이고;
    위치 119의 Xaa는 Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr 또는 Arg이고;
    위치 120의 Xaa는 Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val 또는 Gln이고;
    위치 121의 Xaa는 Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp 또는 Gly이고;
    위치 122의 Xaa는 Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr 또는Cys이고;
    위치 123의 Xaa는 Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr 또는 Leu이고;
    여기서 N-말단으로부터 1 내지 14 아미노산, C-말단으로부터 1 내지 15 아미노산, 또는 N-말단으로부터 1 내지 14 아미노산 및 C-말단으로부터 1 내지 15 아미노산 모두가 삭제될 수 있으며; Xaa로 표시된 아미노산의 1 내지 44는 본래의(1 - 133) 사람 인터루킨-3의 대응하는 아미노산과 다르며;
    여기서 L1은 R1을 R2에 연결할 수 있는 링커이고; 그리고
    추가적으로 상기 조혈 단백질은 바로 앞에 (-1위치의 메티오닌), (-1위치의 알라닌) 또는 (-2위치의 메티오닌 및 -1위치의 알라닌)이 올 수 있다.
  7. 다음식의 아미노산서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 조혈 단백질.
    R1-L1-R2, R2-L1-R1, R1-R2, 또는 R2-R1
    상기식에서 R1은 다음식의 변형된 사람 G-CSF 아미노산서열로 구성되는 폴리펩티드이고;
    (서열 1)
    상기 서열에서
    위치 1의 Xaa는 Thr, Ser, Arg, Tyr 또는 Gly이고;
    위치 2의 Xaa는 Pro 또는 Leu이고;
    위치 3의 Xaa는 Leu, Arg, Tyr 또는 Ser이고;
    위치 13의 Xaa는 Phe, Ser, His, Thr 또는 Pro이고;
    위치 16의 Xaa는 Lys, Pro, Ser, Thr 또는 His이고;
    위치 17의 Xaa는 Cys, Ser, Gly, Ala, Ile, Tyr 또는 Arg이고;
    위치 18의 Xaa는 Leu, Thr, Pro, His, Ile 또는 Cys이고;
    위치 22의 Xaa는 Arg, Tyr, Ser, Thr 또는 Ala이고;
    위치 24의 Xaa는 Ile, Pro, Tyr 또는 Leu이고;
    위치 27의 Xaa는 Asp 또는 Gly이고;
    위치 30의 Xaa는 Ala, Ile, Leu 또는 Gly이고;
    위치 34의 Xaa는 Lys 또는 Ser이고;
    위치 36의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 42의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 43의 Xaa는 His, Thr, Gly, Val, Lys, Trp, Ala, Arg, Cys 또는 Leu이고;
    위치 44의 Xaa는 Pro, Gly, Arg, Asp, Val, Ala, His, Trp, Gln 또는 Thr이고;
    위치 46의 Xaa는 Glu, Arg, Phe, Arg, Ile 또는 Ala이고;
    위치 47의 Xaa는 Leu 또는 Thr이고;
    위치 49의 Xaa는 Leu, Phe, Arg 또는 Ser이고;
    위치 50의 Xaa는 Leu, Ile, His, Pro 또는 Tyr이고;
    위치 54의 Xaa는 Leu 또는 His이고;
    위치 64의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 67의 Xaa는 Gln, Lys, Leu 또는 Cys이고;
    위치 70의 Xaa는 Gln, Pro, Leu, Arg 또는 Ser이고;
    위치 74의 Xaa는 Cys 또는 Ser이고;
    위치 104의 Xaa는 Asp, Gly 또는 Val이고;
    위치 108의 Xaa는 Leu, Ala, Val, Arg, Trp, Gln 또는 Gly이고;
    위치 115의 Xaa는 Thr, His, Leu 또는 Ala이고;
    위치 120의 Xaa는 Gln, Gly, Arg, Lys 또는 His이고;
    위치 123의 Xaa는 Glu, Arg, Phe 또는 Thr이고;
    위치 144의 Xaa는 Phe, His, Arg, Pro, Leu, Gln 또는 Glu이고;
    위치 146의 Xaa는 Arg 또는 Gln이고;
    위치 147의 Xaa는 Arg 또는 Gln이고;
    위치 156의 Xaa는 His, Gly 또는 Ser이고;
    위치 159의 Xaa는 Ser, Arg, Thr, Tyr, Val 또는 Gly이고;
    위치 162의 Xaa는 Glu, Leu, Gly 또는 Trp이고;
    위치 163의 Xaa는 Val, Gly, Arg 또는 Ala이고;
    위치 169의 Xaa는 Arg, Ser, Leu, Arg 또는 Cys이고;
    위치 170의 Xaa는 His, Arg 또는 Ser이고;
    여기서 N-말단으로부터 1-11아미노산이, 그리고 C-말단으로부터 1-5 아미노산이 상기의 변형된 사람 G-CSF 아미노산서열로부터 삭제될 수 있고;
    여기서 N-말단은 C-말단에 직접 연결되거나, 또는 N-말단을 C-말단에 연결할 수 있고 다음 아미노산들에서 새로운 C-및 N-말단을 가질 수 있는 링커를 통해 연결된다;
    R2는 다음식의 변형된 사람 c-mpl 리간드 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드이고;
    (서열 256)
    상기 서열에서
    위치 112의 Xaa는 삭제되거나 Leu, Ala, Val, Ile, Pro, Phe, Trp 또는 Met이고;
    위치 113의 Xaa는 삭제되거나 Pho, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp 또는 Met이고;
    위치 114의 Xaa는 삭제되거나 Pro, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp 또는 Met이고;
    위치 115의 Xaa는 삭제되거나 Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr 또는 Asn이고;
    여기서 N-말단은 C-말단에 직접 연결되거나, 또는 N-말단을 C-말단에 연결할 수 있고 다음 아미노산들에서 새로운 C- 및 N-말단을 가질 수 있는 링커(L2)를 통해 연결된다;
    여기서 L1은 R1을 R2에 연결할 수 있는 링커이고; 그리고
    추가적으로 상기 조혈 단백질 바로 앞에 (-1위치의 메티오닌), (-1위치의 알라닌) 또는 (-2위치의 메티오닌 및 -1위치의 알라닌)이 올 수 있다.
  8. 다음식의 아미노산서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 조혈 단백질.
    R1-L1-R2, R2-L1-R1, R1-R2, 또는 R2-R1
    상기식에서 R1은 다음식의 변형된 사람 c-mpl 리간드 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드이고;
    (서열 256)
    상기 서열에서
    위치 112의 Xaa는 삭제되거나 Leu, Ala, Val, Ile, Pro, Phe, Trp 또는 Met이고;
    위치 113의 Xaa는 삭제되거나 Pho, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp 또는 Met이고;
    위치 114의 Xaa는 삭제되거나 Pro, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp 또는 Met이고;
    위치 115의 Xaa는 삭제되거나 Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr 또는 Asn이고;
    여기서 N-말단은 C-말단에 직접 연결되거나, 또는 N-말단을 C-말단에 연결할 수 있고 다음 아미노산들에서 새로운 C- 및 N-말단을 가질 수 있는 링커(L2)를 통해 연결된다;
    R2는 다음식의 변형된 사람 IL-3 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드이고;
    상기 서열에서 위치 17의 Xaa는 Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln 또는 Arg이고;
    위치 18의 Xaa는 Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg 또는 Gln이고;
    위치 19의 Xaa는 Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala 또는 Cys이고;
    위치 20의 Xaa는 Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro 또는 Ala이고;
    위치 21의 Xaa는 Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, Glu, Gln, Asn, Thr, Ser 또는 Val이고;
    위치 22의 Xaa는 Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu, Val 또는 Gly이고;
    위치 23의 Xaa는 Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, Phe, Leu, Ser 또는 Arg이고;
    위치 24의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe 또는 Leu이고;
    위치 25의 Xaa는 Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro 또는 Ala이고;
    위치 26의 Xaa는 His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala 또는 Trp이고;
    위치 27의 Xaa는 Leu, Gly, Arg, Thr, Ser 또는 Ala이고;
    위치 28의 Xaa는 Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, Val 또는 Trp이고;
    위치 29의 Xaa는 Gln, Asn, Leu, Pro, Arg 또는 Val이고;
    위치 30의 Xaa는 Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, Ser, Leu 또는 Lys이고;
    위치 31의 Xaa는 Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu 또는 Gln이고;
    위치 32의 Xaa는 Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, Ala 또는 Glu이고;
    위치 33의 Xaa는 Pro, Leu, Gln, Ala, Thr 또는 Glu이고;
    위치 34의 Xaa는 Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, Gln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile 또는 Met이고;
    위치 35의 Xaa는 Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln 또는 Val이고;
    위치 36의 Xaa는 Asp, Leu 또는 Val이고;
    위치 37의 Xaa는 Phe, Ser, Pro, Trp 또는 Ile이고;
    위치 38의 Xaa는 Asn 또는 Ala이고;
    위치 40의 Xaa는 Leu, Trp 또는 Arg이고;
    위치 41의 Xaa는 Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met 또는 Pro이고;
    위치 42의 Xaa는 Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, Thr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met 또는 Ala이고;
    위치 43의 Xaa는 Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, Ala, Cys, Gln, Arg, Thr, Gly 또는 Ser이고;
    위치 44의 Xaa는 Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, Met, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala 또는 Pro이고;
    위치 45의 Xaa는 Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, Thr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, Glu 또는 His이고;
    위치 46의 Xaa는 Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val 또는 Gly이고;
    위치 47의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro 또는 His이고;
    위치 48의 Xaa는 Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, Phe, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val 또는 Asn이고;
    위치 49의 Xaa는 Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, His 또는 Asp이고;
    위치 50의 Xaa는 Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, Asn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met 또는 Gln이고;
    위치 51의 Xaa는 Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr 또는 His이고;
    위치 52의 Xaa는 Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser 또는 Thr이고;
    위치 53의 Xaa는 Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, Lys, Ser 또는 Met이고;
    위치 54의 Xaa는 Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, His, Ala 또는 Leu이고;
    위치 55의 Xaa는 Arg, Thr, Val, Ser, Leu 또는 Gly이고;
    위치 56의 Xaa는 Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, Arg, His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, Val 또는 Lys이고;
    위치 57의 Xaa는 Asn 또는 Gly이고;
    위치 58의 Xaa는 Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val 또는 Cys이고;
    위치 59의 Xaa는 Glu, Tyr, His, Leu, Pro 또는 Arg 이고;
    위치 60의 Xaa는 Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn 또는 Thr이고;
    위치 61의 Xaa는 Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg 또는 Ser이고;
    위치 62의 Xaa는 Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, Asp 또는 Ile이고;
    위치 63의 Xaa는 Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, Pro 또는 Val이고;
    위치 64의 Xaa는 Ala, Asn, Pro, Ser 또는 Lys이고;
    위치 65의 Xaa는 Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe 또는 Ser이고;
    위치 66의 Xaa는 Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu 또는 Ser이고;
    위치 67의 Xaa는 Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, Ile, Pro 또는 His이고;
    위치 68의 Xaa는 Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, Thr 또는 His이고;
    위치 69의 Xaa는 Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly 또는 Leu이고;
    위치 70의 Xaa는 Asn, Leu, Val, Trp, Pro 또는 Ala이고;
    위치 71의 Xaa는 Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, Thr, Gln, Trp 또는 Asn;
    위치 72의 Xaa는 Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, Arg 또는 Asp이고;
    위치 73의 Xaa는 Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, Thr 또는 Arg이고;
    위치 74의 Xaa는 Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, Ala이고;
    위치 75의 Xaa는 Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln 또는 Leu이고;
    위치 76의 Xaa는 Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly 또는 Asp이고;
    위치 77의 Xaa는 Ile, Ser, Arg, Thr 또는 Leu이고;
    위치 78의 Xaa는 Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly 또는 Arg이고;
    위치 79의 Xaa는 Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, Gly 또는 Asp이고;
    위치 80의 Xaa는 Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, Glu 또는 Arg이고;
    위치 81의 Xaa는 Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, Val 또는 Lys이고;
    위치 82의 Xaa는 Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, Met 또는 Val이고;
    위치 83의 Xaa는 Pro, Ala, Thr, Trp, Arg 또는 Met이고;
    위치 84의 Xaa는 Cys, Glu, Gly, Arg, Met 또는 Val이고;
    위치 85의 Xaa는 Leu, Asn, Val 또는 Gln이고;
    위치 86의 Xaa는 Pro, Cys, Arg, Ala 또는 Lys이고;
    위치 87의 Xaa는 Leu, Ser, Trp 또는 Gly이고;
    위치 88의 Xaa는 Ala, Lys, Arg, Val 또는 Trp이고;
    위치 89의 Xaa는 Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, His, Asn 또는 Ser이고;
    위치 90의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, Ile 또는 Met이고;
    위치 91의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Asp 또는 His이고;
    위치 92의 Xaa는 Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile 또는 Leu이고;
    위치 93의 Xaa는 Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, Leu 또는 Arg이고;
    위치 94의 Xaa는 Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala 또는 Pro이고;
    위치 95의 Xaa는 His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile 또는 Tyr이고;
    위치 96의 Xaa는 Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile 또는 Thr이고;
    위치 97의 Xaa는 Ile, Val, Lys, Ala 또는 Asn이고;
    위치 98의 Xaa는 His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, Thr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, Tyr 또는 Pro이고;
    위치 99의 Xaa는 Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, Gln, Gly, Ser, Phe 또는 His이고;
    위치 100의 Xaa는 Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln 또는 Pro이고;
    위치 101의 Xaa는 Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu 또는 Gln이고;
    위치 102의 Xaa는 Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr 또는 Pro이고;
    위치 103의 Xaa는 Asp 또는 Ser이고;
    위치 104의 Xaa는 Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe 또는 Gly이고;
    위치 105의 Xaa는 Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp 또는 His이고;
    위치 106의 Xaa는 Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly 또는 Pro이고;
    위치 108의 Xaa는 Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala 또는 Pro이고;
    위치 109의 Xaa는 Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser 또는 Gly이고;
    위치 110의 Xaa는 Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser 또는 Trp이고;
    위치 111의 Xaa는 Leu, Ile, Arg, Asp 또는 Met이고;
    위치 112의 Xaa는 Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser 또는 Phe 이고;
    위치 113의 Xaa는 Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val 또는 Asp이고;
    위치 114의 Xaa는 Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg 또는 Leu이고;
    위치 115의 Xaa는 Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp 또는 Met이고;
    위치 116의 Xaa는 Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln 또는 Ile이고;
    위치 117의 Xaa는 Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys 또는 Pro이고;
    위치 118의 Xaa는 Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp 또는 Tyr이고;
    위치 119의 Xaa는 Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr 또는 Arg이고;
    위치 120의 Xaa는 Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val 또는 Gln이고;
    위치 121의 Xaa는 Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp 또는 Gly이고;
    위치 122의 Xaa는 Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr 또는Cys이고;
    위치 123의 Xaa는 Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr 또는 Leu이고;
    여기서 상기의 변형된 사람 인터루킨-3 아미노산 서열의 N-말단으로부터 1 내지 14 아미노산, C-말단으로부터 1 내지 15 아미노산, 또는 N-말단으로부터 1 내지 14 아미노산 및 C-말단으로부터 1 내지 15 아미노산 모두가 삭제될 수 있으며; Xaa로 표시된 아미노산의 1 내지 44는 본래의(1 - 133) 사람 인터루킨-3의 대응하는 아미노산과 다르며;
    여기서 L1은 R1을 R2에 연결할 수 있는 링커이고; 그리고
    상기 조혈 단백질 바로 앞에 (-1위치의 메티오닌), (-1위치의 알라닌) 또는 (-2위치의 메티오닌 및 -1위치의 알라닌)이 올 수 있다.
  9. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서, R2는 다음으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조혈 단백질.
    (서열 225)
    (서열 226)
    (서열 227)
    및
    (서열 228)
  10. 다음식의 아미노산서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 조혈 단백질.
    R1-L1-R2, R2-L1-R1, R1-R2, 또는 R2-R1
    상기식에서 R1은 다음식의 변형된 사람 c-mpl 리간드 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드이고;
    (서열 256)
    상기 서열에서
    위치 112의 Xaa는 삭제되거나 Leu, Ala, Val, Ile, Pro, Phe, Trp 또는 Met이고;
    위치 113의 Xaa는 삭제되거나 Pho, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp 또는 Met이고;
    위치 114의 Xaa는 삭제되거나 Pro, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp 또는 Met이고;
    위치 115의 Xaa는 삭제되거나 Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr 또는 Asn이고;
    여기서 N-말단은 C-말단에 직접 연결되거나, 또는 N-말단을 C-말단에 연결할수 있고 다음 아미노산들에서 새로운 C- 및 N-말단을 가질 수 있는 링커(L2)를 통해 연결된다;
    R2는 G-CSF 또는 G-CSF Ser17이고;
    여기서 L1은 R1을 R2에 연결할 수 있는 링커이고; 그리고
    상기 조혈 단백질 바로 앞에 (-1위치의 메티오닌), (-1위치의 알라닌) 또는 (-2위치의 메티오닌 및 -1위치의 알라닌)이 올 수 있다.
  11. 제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 4 항, 제 5 항, 제 6 항, 제 7 항, 제 8 항, 또는 제 10 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커(L2)는 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조혈 단백질.
    (서열 12)
    GlyGlyGlySer;
    (서열 242)
    GlyGlyGlySerGlyGlyGlySer;
    (서열 243)
    GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySer;
    (서열 244)
    SerGlyGlySerGlyGlySer;
    (서열 245)
    GluPheGlyAsnMetAla;
    (서열 246)
    GluPheGlyGlyAsnMetAla;
    (서열 247)
    GluPheGlyGlyAsnGlyGlyAsnMetAla; 및
    (서열 248)
    GlyGlySerAspMetAlaGly.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 링커(L2)는 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조혈 단백질.
    (서열 12)
    GlyGlyGlySer;
    (서열 242)
    GlyGlyGlySerGlyGlyGlySer;
    (서열 243)
    GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySer;
    (서열 244)
    SerGlyGlySerGlyGlySer;
    (서열 245)
    GluPheGlyAsnMetAla;
    (서열 246)
    GluPheGlyGlyAsnMetAla;
    (서열 247)
    GluPheGlyGlyAsnGlyGlyAsnMetAla; 및
    (서열 248)
    GlyGlySerAspMetAlaGly.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질은 다음으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조혈 단백질.
    (서열 166)
    (서열 167)
    (서열 168)
    (서열 169)
    (서열 170)
    (서열 171)
    (서열 172)
    (서열 173)
    (서열 177)
    (서열 175)
    (서열 176)
    (서열 177)
    (서열 179)
    (서열 181)
    (서열 182)
    (서열 183)
    (서열 184)
    (서열 194)
    (서열 195)
    (서열 196)
    (서열 197)
    (서열 198)
    (서열 209)
    (서열 210)
    (서열 211)
    (서열 212)
    (서열 186)
    (서열 187)
    (서열 189)
    (서열 190)
    (서열 191)
    (서열 199)
    (서열 200)
    (서열 201)
    (서열 202)
    (서열 221)
    (서열 222)
    (서열 223)
    (서열 234)
    (서열 235)
    (서열 236)
    (서열 237)
    (서열 238)
    및
    (서열 239)
  14. 제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 4 항, 제 5 항, 제 6 항, 제 7 항, 제 8 항, 제 10 항 또는 제 11 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜로니형성자극인자는 GM-CSF, G-CSF, G-CSF Ser17, c-mpl 리간드(TPO), M-CSF, 에리스로포이에틴(EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, LIF, flt3/flk2 리간드, 사람성장호르몬, B-세포성장인자, B-세포분화인자, 호산성분화인자 및 간세포인자(SCF)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조혈 단백질.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 콜로니형성자극인자는 G-CSF, G-CSF Ser17및 c-mpl 리간드(TPO)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조혈 단백질.
  16. 제 1 항의 상기 조혈 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  17. 제 2 항의 상기 조혈 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  18. 제 3 항의 상기 조혈 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  19. 제 4 항의 상기 조혈 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  20. 제 5 항의 상기 조혈 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  21. 제 6 항의 상기 조혈 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  22. 제 7 항의 상기 조혈 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  23. 제 8 항의 상기 조혈 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  24. 제 9 항의 상기 조혈 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  25. 제 10 항의 상기 조혈 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  26. 제 11 항의 상기 조혈 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  27. 제 12 항의 상기 조혈 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  28. 제 13 항의 상기 조혈 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  29. 제 14 항의 상기 조혈 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  30. 제 15 항의 상기 조혈 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  31. 제 27 항에 있어서, 다음으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
    (서열 94)
    (서열 95)
    (서열 96)
    (서열 97)
    (서열 98)
    (서열 99)
    (서열 100)
    (서열 101)
    (서열 102)
    pMON25191
    (서열 107)
    (서열 103)
    (서열 104)
    (서열 105)
    (서열 109)
    (서열 110)
    (서열 111)
    (서열 112)
    (서열 155)
    (서열 156)
    (서열 157)
    (서열 158)
    (서열 159)
    (서열 124)
    (서열 125)
    (서열 126)
    (서열 127)
    (서열 128)
    (서열 114)
    (서열 115)
    (서열 116)
    (서열 117)
    (서열 86)
    (서열 87)
    (서열 88)
    (서열 90)
    (서열 91)
    (서열 136)
    (서열 137)
    (서열 148)
    (서열 149)
    (서열 150)
    (서열 151)
    (서열 152)
    (서열 153)
    및
    (서열 154)
  32. 상기 조혈 단백질의 발현을 허용하는 방식으로 제 16 항, 제 17 항, 제 18 항, 제 19 항, 제 20 항, 제 21 항, 제 22 항, 제 23 항, 제 24 항, 제 25 항, 제 26 항, 제 27 항, 제 28 항, 제 29 항, 제 30 항, 제 31 항의 핵산분자를 포함하는 복제가능 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션시킨 숙주세포를 적합한 영양조건 하에서 성장시키는 것과 상기 조혈 단백질을 회수하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 조혈 단백질의 생성방법.
  33. 제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 4 항, 제 5 항, 제 6 항, 제 7 항, 제 8 항, 제 10 항, 제 11 항, 제 12 항, 제 13 항 또는 제 14 항에 따른 조혈 단백질 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는, 백혈구감소증, 호중구감소증, 주기호중구감소증, 특발성호중구감소증, 체디아크 - 히가시 (Chediak - Higashi) 증후군, 전신성홍반성낭창 (SLE), 백혈병, 척수이형성 증후군, 골수섬유증 및 혈소판감소증으로부터 선택되는 질병이나 상태를 치료하기 위한 약학적 조성물.
  34. 제 9 항에 따른 조혈 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 백혈구감소증, 호중구감소증, 주기호중구감소증, 특발성호중구감소증, 체디아크 - 히가시 증후군, 전신성홍반성낭창 (SLE), 백혈병, 척수이형성 증후군, 골수섬유증 및 혈소판감소증으로부터 선택되는 질병이나 상태를 치료하기 위한 약학적 조성물.
  35. (a) 간세포를 기타 세포들로부터 분리하는 단계;
    (b) 제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 4 항, 제 5 항, 제 6 항, 제 7 항, 제 8 항, 제 10 항, 제 11 항, 제 12 항, 제 13 항 또는 제 14 항의 조혈 단백질을 함유하는 선택된 배지로 상기의 분리한 간세포를 배양하는 단계; 그리고
    (c) 상기의 배양한 세포를 수확하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 간세포의 선택적 생체외 확장방법.
  36. (a) 간세포를 기타 세포들로부터 분리하는 단계;
    (b) 제 9 항의 조혈 단백질을 함유하는 선택된 배지로 상기의 분리한 간세포를 배양하는 단계; 그리고
    (c) 상기의 배양한 세포를 수확하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 간세포의 선택적 생체외 확장방법.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
US6660257B1 (en) 1996-10-25 2003-12-09 Pharmacia Corporation Circular permuteins of flt3 ligand
US5969105A (en) * 1996-10-25 1999-10-19 Feng; Yiqing Stem cell factor receptor agonists
US6967092B1 (en) 1996-10-25 2005-11-22 Mc Kearn John P Multi-functional chimeric hematopoietic receptor agonists
US6165476A (en) * 1997-07-10 2000-12-26 Beth Israel Deaconess Medical Center Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker
US6242570B1 (en) 1997-07-10 2001-06-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Production and use of recombinant protein multimers with increased biological activity
US6187564B1 (en) 1997-07-10 2001-02-13 Beth Israel Deaconess Medical Center DNA encoding erythropoietin multimers having modified 5′ and 3′ sequences and its use to prepare EPO therapeutics
WO2001027621A2 (en) * 1999-10-07 2001-04-19 Pharmacia Corporation Competitive inhibition elisa for antibody detection
NZ530545A (en) 2001-07-11 2006-10-27 Maxygen Holdings Ltd Specific conjugates comprising a polypeptide exhibiting G-CSF activity and a non-polypeptide moiety
MX2007015156A (es) 2005-06-01 2008-02-15 Maxygen Holdings Ltd Polipeptidos g-csf pegilados y metodos para la produccion de los mismos.
WO2007075899A2 (en) * 2005-12-21 2007-07-05 Maxygen, Inc. Dual agonist compounds and uses thereof
CN102675472B (zh) * 2012-05-07 2014-07-30 北京诺派生物科技有限公司 用于检测猪繁殖与呼吸综合症患猪的试剂盒
CA2896053A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Ocata Therapeutics, Inc. Methods for production of platelets from pluripotent stem cells and compositions thereof
LT6161B (lt) 2013-09-27 2015-06-25 Uab Profarma Granuliocitų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus sulieti baltymai su kitais augimo faktoriais, optimaliai su kamieninių ląstelių faktoriumi, ir jų gavimo būdas

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995021254A1 (en) * 1994-02-04 1995-08-10 G. D. Searle & Co. Multivariant il-3 hematopoiesis fusion protein

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5355790A (en) * 1989-04-19 1990-11-16 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
US5738849A (en) * 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
US5635599A (en) * 1994-04-08 1997-06-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Fusion proteins comprising circularly permuted ligands

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995021254A1 (en) * 1994-02-04 1995-08-10 G. D. Searle & Co. Multivariant il-3 hematopoiesis fusion protein

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