KR100370264B1 - 다중변이체il-3조혈융합단백질 - Google Patents

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마이클 이스튼 앨런
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Abstract

본 발명은 다른 콜로니 자극인자(CSF), 시토카인, 림포카인, 인터루킨, 조혈성장인자 또는 IL-3변이체와 융합된 인간 인터루킨-3(hIL-3)변이체 또는 돌연변이체 단백질(뮤테인)에 관한 것이다.

Description

다중변이체 IL-3 조혈 융합 단백질
제 1도는 천연(야생형)인간 IL-3의 폴리펩티드 서열[SEQ ID NO:49]을 암호화하는E.coli발현(pMON5873)을 위한 인간 IL-3유전자, 및E.coli에서 발현되는 개시 메티오닌을 도시하며, 아미노산은 천연 hIL-3의 N-말단부터 번호가 매겨져 있다.
제 2도는 플라스미드 pMON13018 및 pMON13021의 구성을 도시한다. 플라스미드 pMON13018은 폴리펩티드 융합 pMON13021을 암호화하는 플라스미드 pMON13021을 구성하기 위해 사용되는 중간 플라스미드이다.
제 3도는 메틸셀룰로스 측정법에서 측정된 폴리펩티드 융합 pMON3988의 생활성을 도시한다.
제 4도는 메틸셀룰로스 측정법에서 측정된 폴리펩티드 융합 pMON3987 및 pMON26430, pMON3995 및 pMON26415의 생활성을 도시한다.
제 5도는 메틸셀룰로스 측정법에서 측정된 폴리펩티드 융합 pMON26425의 생활성을 도시한다.
제 6도는 메틸셀룰로스 측정법에서 측정된 폴리펩티드 융합 pMON26406 및 pMON26433의 생활성을 도시한다.
제 7도는 메틸셀룰로스 측정법에서 측정된 폴리펩티드 융합 pMON26431 및 pMON26427의 생활성을 도시한다.
발명의 개요
본 발명은 링커 있거나 없이 시토카인, 림포카인, 인터루킨, 조혈성장인자 또는 IL-3 변이체를 포함하는 제 2콜로니자극인자(CSF)에 융합된 인간 인터루킨-3(hIL-3)의 돌연변이체 또는 변이체로 이루어진 융합분자에 관한 것이다.
발명의 배경
골수세포의 분화 및/또는 증식을 자극하는 콜로니자극인자(CSF)는 조혈 간세포(stemcell)-유래 세포의 저하된 레벨을 회복시키는 그것들의 치료적 잠재능 때문에 많은 흥미를 유발시켰다. 인간 및 쥐 시스템 둘다에서의 CSF가 동정되었고, 그들의 활성에 따라 구별되었다. 예를들어 과립구-CSF(G-CSF) 및 대식세포-CSF(M-CSF)는 각각 호중성 과립구 및 대식세포 콜로니의 시험관내 형성을 자극하는 반면, GM-CSF 및 인터루킨-3 (IL-3)은 더 넓은 활성을 가지고 대식세포,호중성 및 호산성 과립구 콜로니 둘다의 형성을 자극한다. IL-3은 또한 유선(mast), 거핵구와 순수 및 혼합 적혈구양 콜로니의 형성을 자극한다.
여러 다른 세포유형의 증식을 자극하고 선조세포의 성장 및 증식을 지지하는 그것의 능력 때문에, IL-3은 질병 또는 방사선 및/또는 화학요법과 같은 치료조치로 인해 세포수가 감소된 경우에 조혈세포를 정상적 양으로 회복시키는 치료적 용도를 위한 잠재능력을 가진다.
인터루킨-3(IL-3)은 조혈세포의 생존,성장 및 분화를 촉진시킬 수 있는 성질을 갖는 조혈성장인자이다. IL-3의 생물학적 성질중에는 (a) 모든 또는 실질적으로 모든 혈액세포계통에 개입되는 선조세포의 성장 및 분화를 지지하고; (b) 초기 다잠재성 간세포와 상호작용하고; (c) 다능성 전구세포의 성장을 지속시키고; (d) 만성 골수성 백혈병(CML)세포의 증식을 자극하고; (e) 유선세포, 호산구 및 호염기구의 증식을 자극하고; (f)인간급성 골수성 백혈병(AML)세포에 의한 DNA합성을 자극하고; (g) 루코트리엔 및 히스타민의 생성을 위해 세포를 기폭시키고; (h) 백혈구 화학주성을 유도하고; (i) 백혈구 부착에 필요한 세포 표면분자를 유도하는 능력들이 있다.
성숙 인간 인터루킨-3 (hIL-3)은 133아미노산으로 구성된다 그것은 한 개의 이황화다리와 두 개의 잠재적 글리코실화 부위를 가진다(Yang et al., CELL47:3(1986)).
쥐 IL-3(mIL-3)은 T세포 연합효소인 20-히드로옥시스테로이드 탈수소효소의 발현을 유도하는 인자로서 Ihle et al., J. IMMUNOL.126: 2184(1981)에 의해 처음 동정되었다. 이 인자는 균질하게 정제되었고 초기 조혈 및 임파양 선조세포의 수많은 서브클래스의 성장 및 분화를 조절한다고 밝혀졌다.
1984년에 쥐 IL-3를 암호화하는 cDNA클론이 분리되었다(Fung et al., NATURE307:233(1984) 및 Yokota et al., PROC. NATL. ACAD.SCI. USA81: 1070(1984)). 쥐 DNA서열은 추정상 신호펩티드를 포함한 166 아미노산의 폴리펩티드를 암호화했다.
기번(gibbon:긴팔원숭이) IL-3서열은 기번 cDNA 발현도서관을 이용하여 얻었다. 그 다음 기번 IL-3서열을 인간 게놈도서관에 대한 프로브로 사용하여 인간 IL-3서열을 얻었다.
쥐 IL-3서열의 기번 및 인간게놈 DNA 상동체는 Yang et al., CELL47:3(1986)에 개시되었다. Yang et al.에 의해 보고된 인간서열은 성숙 단백질 서열의 위치 8에 세린잔기를 포함했다. 이 발견후에, 다른 이들이 단백질 서열의 위치 8에 프롤린을 갖는 Pro8hIL-3 cDNA의 분리를 보고했다. 따라서 hIL-3의 두가지 대립형태가 있을 것으로 생각된다.
Dorssers et al., GENE55:115(1987)는 인간 cDNA도서관으로부터 mIL-3와 혼성화하는 클론을 발견했다. 이 혼성화는 mIL-3과 hIL-3의 3'비암호 영역사이의 고도의 상동성의 결과였다. 이 cDNA는 hIL-3(Pro8)서열을 암호화했다.
미국 제 4,877,729호 및 미국 제 4,959,454호는 인간 IL-3 및 기번 IL-3 cDNA와 그것들이 암호화하는 단백질 서열을 개시한다. 개시된 hIL-3은 단백질 서열의 위치 8에 프롤린 대신 세린을 가진다.
Clark-Lewis et al., SCIENCE231:134(1986)는 자동 펩티드 합성기로 합성된 쥐 IL-3 유사체의 기능분석을 수행했다. 저자는 전부의 활성을 위해서는 완전한 분자의 안정한 3차구조가 요구된다고 결론내렸다. 이황화다리의 역할에 대한 연구는 알라닌에 의한 모든 4개의 시스테인의 치환이 천연 분자에 비해 1/500활성을 갖는 분자를 제공한다는 것을 보여주었다. Ala에 의한 4개의 Cys잔기중 두 개의 치환(Cys79, Cys140→ Ala79, Ala140)은 증가된 활성을 초래했다. 저자는 쥐 IL-3에서 생리학적 레벨에 접근하는 생물학적 활성을 얻기 위해서는 시스테인 17 및 80사이에 단일의 이황화다리가 필요하며, 이 구조는 아마도 단백질의 3차구조를 안정화시켜 기능에 최적인 구성을 가져온다고 결론내렸다(Clark-Lewis et al., PROC.NATL. ACAD. SCI. USA85:7897(1988)).
국제 특허출원(PCT) WO 88/00598은 기번- 및 인간-유사 IL-3을 개시한다. hIL-3은 Ser8→Pro8치환을 함유한다. Cys를 Ser로 치환하여 이황화다리를 끊는 것과 글리코실화 부위에서 한 개이상의 아미노산을 치환하는 것이 제안되었다.
EP-A-0275598(WO 88/04691)은 생물학적 활성을 유지하면서 Ala1이 결실될 수 있다는 것을 설명한다. 약간의 돌연변이 hIL-3서열들, 예컨대 두 개의 이중 돌연변이 Ala1→Asp1, Trp13→Arg13(pGB/IL-302) 및 Ala1→Asp1, Met3→Thr3(pGB/IL-304)과 한개의 삼중 돌연변이 Ala1→Asp1, Leu9→Pro9, Trp13→Arg13(pGB/IL-303)이 제공된다.
WO 88/05469는 어떻게 탈글리코실화 돌연변이체가 얻어질 수 있는지를 기술하며, Arg54Arg55및 Arg108Arg109Lys110의 돌연변이체는Saccharomyces cerevisiae에서 발현시에 KEX2 프로테아제에 의한 단백질 분해를 피할 수 있다는 것을 제시한다. 돌연변이된 단백질은 개시되어 있지 않다. 본 명세서에서 글리코실화 및 KEX2 프로테아제 활성은 효모에서의 발현시에만 중요하다.
WO 88/06161은 이론적으로는 구성적 및 항원적으로 중성일 수 있는 여러 돌연변이 체를 언급한다. 실제로 수행된 돌연변이는 Met2→Ile2및 Ile131→Leu131뿐이었다. 이들 두 개의 돌연변이에 대해 예상된 중성이 얻어지었는지는 개시되지 않았다.
WO 91/00350 은 비글리코실화된 hIL-3 유사체 단백질, 예컨대 hIL-3(Pro8Asp15Asp70), Met3rhuIL-3 (Pro8Asp15Asp70); Thr4rhuIL-3 (Pro8Asp15Asp70) 및 Thr6rhuIL-3 (Pro8Asp15Asp70)을 개시한다. 이들 단백질 조성물은 피부내로의 유선세포 및 림프구의 침투로 인한 담마진(urticaria)과 같은 천연hIL-3과 관련된 일정한 역부작용을 나타내지 않는다고 보고된다. 개시된 유사체 hIL-3단백질은 Met3, Thr4또는 Thr6에 N-말단을 가질 수도 있다.
WO 91/12874는 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기대신에 치환된 적어도 한 개의 Cys잔기를 가지는 IL-3의 시스테인 첨가 변이체(CAV)를 개시한다.
미국 제 4,810,643호는 인간 G-CSF를 암호화하는 DNA서열을 개시한다.
WO 91/02754는 GM-CSF 또는 IL-3단독에 비해 증가된 생물학적 활성을 갖는 GM-CSF 및 IL-3으로 이루어진 응합 단백질을 개시한다. 또한 융합체의 구성성분으로서 비글리코실화된 IL-3 및 GM-CSF 유사체 단백질도 개시한다.
WO 92/04455는 IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, EPO 및 G-CSF로 구성된 군으로부터 선택된 림포카인에 융합된 IL-3로 이루어진 융합단백질을 개시한다.
발명의 개요
본 발명은 링커 있거나 없이 시토카인, 림포카인, 인터루킨, 조혈 성장인자(여기서는 총괄하여 "콜로니 자극인자"라고 칭함) 또는 IL-3 변이체를 포함하는 제2콜로니 자극인자(CSF)에 융합된 재조합 인간 인터루킨-3(hIL-3)변이체 또는 돌연변이체 단백질(뮤테인)을 포함한다 이들 hIL-3뮤테인은 아미노산 치환을 함유하고, 또한 N-및/또는 C-말단에 아미노산 결실을 가질 수 있다. 본 발명은 공유결합된 폴리펩티드로부터 형성된 혼합기능 콜로니 자극인자를 포함하며, 각각의 폴리펩티드는 서로 다른 특이적 세포 리셉터를 통해 작용하여 상보적 생물학적 활성을 개시할 수 있다.
본 발명의 신규 화합물은 식 R1-L-R2, R2-L-R1, R1-R2, R2-R1, R1-L-R1및 R1-R1에 의해 나타낼 수 있다(상기 식에서, R1은 다중 아미노산 치환을 함유하고 결실된 hIL-3분자의 부분을 가질 수 있는 hIL-3변이체이며, R2는 Il-3, Il-3변이체 또는 다르나 상보적인 활성을 갖는 CSF이다). R1폴리펩티드는 직접 또는 링커절편을 통해 R2폴리펩티드에 융합된다. 따라서 L은 R1및 R2둘다가 융합된 화학결합 또는 폴리펩티드 절편을 나타낸다. 바람직하게는 본 발명의 이들 돌연변이체 IL-3폴리펩티드는 천연 hIL-3폴리펩티드의 대응 위치에서 발견되는 아미노산과 다른 4개이상의 아미노산을 함유한다. 또한 본 발명은 융합분자를 함유하는 약학적 조성물, 융합분자를 암호화하는 DNA와 융합분자의 사용방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 hIL-3융합분자를 암호화하는 뉴클레오티드서열로 이루어진 재조합 발현벡터, 관련된 미생물 발현시스템과 미생물발현시스템을 사용하여 융합분자를 만드는 방법에 관한 것이다.
이들 융합분자는 융합분자를 형성하는 펩티드 둘다의 일반적 활성을 가지는 것에 의해 특성화될 수 있으며, 또한 IL-3 또는 제 2콜로니 자극인자 단독의 존재로 인한 단순한 부가적 기능보다 더 큰 생물학적 또는 생리학적 활성을 가지는 것에 의해 특성화될 수 있다. 융합분자는 또한 예기치 않게 활성에 대한 향상된 효과를 제공하거나, IL-3 또는 제 2콜로니 자극인자 또는 IL-3변이체의 존재에 의해 기대되는 것과 다른 활성을 제공할 수 있다. 융합분자는 또한 천연 hIL-3과 관련된 바람직하지 않은 생물학적 활성의 감소를 포함하는 개선된 활성 프로파일을 가질 수 있다.
또한 본 발명은 1내지 14 아미노산이 N-말단으로부터 결실되고/되거나 1내지 15 아미노산이 C-말단으로부터 결실되고 다중 아미노산 치환을 함유하는 hIL-3의 돌연변이체를 포함하며, 거기에 제 2콜로니 자극인자 또는 IL-3변이체가 융합된다.
본 발명의 바람직한 융합분자는 제 2콜로니 자극인자 또는 IL-3변이체에 융합된, 아미노산 1내지 14가 N-말단으로부터 결실되고 아미노산 126내지 133이 C-말단으로부터 결실되며 폴리펩티드 서열중 약 4내지 약26개의 아미노산 치환을 함유하는 hIL-3변이체로 이루어진다.
또한 본 발명은 IL-3길항제(antagonist)로서 또는 면역측정 및 면역요법 프로토콜에 유용한 항체의 생산을 위한 분리된 항원성 단편으로서 기능할 수 있는 융합분자를 제공한다.
hIL-3의 길항제는 AML,CML 및 어떤 유형의 B림프양 암과 같은 일정한 암세포의 성장을 방해하는데 특히 유용할 것이다. 길항제가 유용할 수 있는 다른 상태는어떤 혈액세포가 비정상적인 높은 개수로 생성되거나 내생적 리간드에 의해 활성화되는 상태들을 포함한다. 길항제는 리간드의 고유 활성화성질은 감소되는 반면 IL-3리셉터 복합체에 결합할 수 있는 그들의 능력덕택에 암세포의 성장을 유발 또는 증가시킬 수 있는 리간드(아마도 IL-3, GM-CSF 및 IL-5를 포함하나 이에 한정되지 않는 자연발생 헤모포이에틴)와 효과적으로 경쟁할 것이다. IL-3, GM-CSF 및/또는 IL-5는 또한 일정한 천식성(asthmatic)응답에서 역할을 한다.
IL-3리셉터의 길항제는 염증성세포의 리셉터-매개 활성화 및 보충을 봉쇄함으로써 이 질병에 유용성을 가질 수 있다.
생체내에서 본 발명의 융합분자의 사용에 더하여, 시험관내 사용이 환자내로 주입전에 골수 및 혈액세포 활성화 및 성장을 자극하는 능력을 포함할 것이라는 것이 예상된다.
본 발명은 링커 있거나 없이 그 자체, Il-3 또는 시토카인, 림포카인, 인터루킨, 조혈성장인자 또는 IL-3변이체를 포함하나 이에 한정되지 않는 제 2콜로니 자극인자(CSF)에 융합된 재조합 인간 인터루킨-3(hIL-3)변이체 또는 돌연변이체 단백질(뮤테인)을 포함한다. 본 발명은 공유결합된 폴리펩티드로부터 형성된 혼합기능 콜로니 자극인자를 포함하며, 각각의 폴리펩티드는 서로 다른 특이적 세포 리셉터를 통해 작용하여 상보적 생물학적 활성을 개시할 수 있다. 조혈은 간세포가 모든 주요계통에서 큰 집단의 성숙세포로 연속발생하는 복잡한 일련의 세포사건을 필요로 한다.
현재 적어도 20개의 공지된 조혈증식활성을 갖는 조절인자가 있다. 대부분의 이들 증식 조절인자는 시험관내에서 여러 유형의 콜로니 형성을 자극할 수 있으며, 각 조절인자에 의해 자극되는 콜로니 형성의 정확한 패턴은 매우 특이하다.
콜로니 개수에 의해, 더 중요하게는 발생중인 콜로니를 만드는 세포의 계통 및 성숙패턴에 의해 평가될 때, 두 개의 조절인자는 정확하게 동일한 패턴의 콜로니 형성을 자극하지 않는다. 증식응답은 단순화된 시험관내 배양시스템에서 가장 용이하게 분석될 수 있다.
3가지 꽤다른 매개인자가 구별될 수 있다: 콜로니 크기의 변화, 콜로니 개수의 변화 및 세포계통. 두 개이상의 인자가 선조세포에 작용하여 다수의 자손형성을 유도함으로써 콜로니 크기를 증가시킬 수 있다. 두 개 이상의 인자는 한가지 인자에 배타적으로 응답하는 독특한 선조세포의 서브세트가 존재하기 때문에 또는 약간의 선조가 응답할 수 있기전에 두 개이상의 인자에 의한 자극을 필요로 하기 때문에 증가된 개수의 선조세포가 증식되도록 허용할 수 있다. 두 개이상의 인자의 사용에 의한 세포상 부가적 리셉터의 활성화는 초기 서로 다른 신호경로에서 핵에 도달하는 공통 최종경로로의 합체로 인해 유사분열신호를 향상시키기 쉽다(Metcalf, 1989).
다른 메카니즘은 상승작용(synergy)을 설명할 수 있다. 예를 들어 만약 한가지 신호 경로가 제 2인자에 의한 부가적 신호경로의 중간체 활성화에 의해 제한된다면 초부가적(superadditive)응답을 초래할 수 있다. 약간의 경우에, 한 리셉터 유형의 활성화는 다른 리셉터의 향상된 발현을 유도할 수 있다(Metcalf, 1993). 두개이상의 인자는 단일인자와 다른 패턴의 세포 계통을 초래할 수 있다. 융합분자의 사용은 어떤 단일 인자에 의해서도 불가능한 증식응답으로 인한 잠재적 임상적 이점을 가질 수 있다.
조혈 및 다른 성장인자는 관련된 리셉터의 두가지 별개의 족으로 구분될 수 있다: (1)표피성장인자, M-CSF(Sherr, 1990) 및 SCF(Yarden et al., 1987)에 대한 것들을 포함하는 티로신 키나제 리셉터; 와 (2) 티로신 키파제 도메인을 함유하지 않으나 그들의 세포외 도메인에 분명한 상동성을 나타내는 조혈 리셉터(Bazan, 1990). 상기 후자의 군에는 에리트로포이에틴(EPO)(D'Andrea et al., 1989), GM-CSF(Gearing et al., 1989), IL-3(Kitamura et al., 1991), G-CSF(Fukunaga et al., 1990), IL-4(Harada et al., 1990), IL-5(Takaki et al., 1990), IL-6(Yamasaki et al., 1988), IL-7(Goodwin et al., 1990), LIF(Gearing et al., 1991) 및 IL-2(Cosman et al., 1987)이 포함된다. 대부분의 후자군의 리셉터는 이종이합체로서 고친화성 형태로 존재한다. 리간드 결합후에, 특이적 α-사슬은 적어도 한 개의 다른 리셉터 사슬(β-사슬, γ-사슬)과 연합된다.
많은 이들 인자는 공통의 리셉터 서브유니트를 공유한다. GM-CSF, IL-3 및 IL-5에 대한 α-사슬은 동일한 β-사슬을 공유하며 (Kitamura et al., 1991; Takaki et al., 1991), IL-6, LIF 및 IL-11에 대한 리셉터 복합체는 공통의 β-사슬(gp130)을 공유한다(Taga et al., 1989; Gearing et al., 1992). IL-2, IL-4 및 IL-7의 리셉터 복합체는 공통의 γ-사슬을 공유한다(Kondo et al., 1993; Russell et al., 1993; Noguchi et al., 1993).
다중인자의 사용은 또한 인자-생산 세포 및 그들의 유도시스템에 놓여진 수요를 낮춤으로써 잠재적 이점을 가질 수 있다. 만약 세포가 인자를 생산하는 능력에 제한이 있다면, 그것들을 조합하여 사용하여 각각의 인자의 필요농도를 저하시킴으로써 유용하게 인자-생산 세포에 대한 수요를 감소시킬 것이다. 다중인자의 사용은 필요로 하는 인자의 양을 저하시키고, 아마도 역응답같은 것을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 신규화합물은 R1-L-R2, R2-L-R1, R1-R2, R2-R1, R1-L-R1 및 R1-R1으로 구성된 군으로부터 선택된 식에 의해 나타낸다(상기 식에서, R1은 다중 아미노산 치환을 함유하고 함께 계류중인 미국 특허출원번호 PCT/US93/11197에 개시된 바와같이 결실된 hIL-3분자의 부분을 가질 수 있는 hIL-3 변이체이며, R2는 Il-3, Il-3 변이체 또는 다르나 상보적인 활성을 갖는 콜로니 자극인자이다). 상보적 활성이란 또다른 세포조정인자에 대한 응답을 향상 또는 변화시키는 활성을 의미한다.
R1폴리펩티드는 직접 또는 링커절편을 통해 R2폴리펩티드에 융합된다.
"직접"이란 용어는 폴리펩티드가 펩티드 링커없이 연결된 융합을 의미한다.
따라서 L은 R1및 R2둘다가 프레임상에 융합된 화학결합 또는 폴리펩티드 절편을 나타내며, 가장 일반적으로 L은 R1의 카르복시말단을 L의 아미노말단에, L의 카르복시말단을 R2의 아미노말단에 연결시키는 아미드결합에 의해 R1및 R2가 결합된 선형펩티드이다. "프레임상에 융합된"이란 R1과 R2의 해독 프레임사이에 번역종결또는 중단이 없다는 것을 의미한다.
본 발명의 hIL-3 변이체에 융합될 수 있는 R2의 정의내의 다른 성장인자, 콜로니 자극인자(CSF), 시토카인, 림포카인, 인터루킨, 조혈성장인자의 비배타적 리스트는 GM-CSF, CSF-1, G-CSF, Meg-CSF(더 최근에는 c-mpl리간드라고 칭함), M-CSF, 에리트로포이에틴(EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, LIF, flt3/flk2, 인간성장호르몬, B-세포성장인자, B-세포분화인자, 호산구 분화인자 및 스틸인자 또는 c-키트 리간드라고도 알려진 간세포인자(SCF)를 포함한다. 더욱이, 본 발명은 변형된 R2분자의 사용 또는 이들 R2분자를 암호화하는 돌연변이 되거나 또는 변형된 DNA서열을 포함한다. 또한 본 발명은 R2가, 아미노산 치환을 가지고 PCT/US93/11197 및 PCT/US93/11198에 개시된 바와 같이 결실된 hIL-3분자의 부분을 가질 수 있는 IL-3을 의미하는 hIL-3변이체 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변이체인 융합분자를 포함한다.
연결 기(L)은 일반적으로 길이가 1내지 500아미노산 사이인 폴리펩티드이다.
두 개의 분자를 연결하는 링커는 바람직하게는 (1) 두 개의 분자가 서로 독립적으로 접히고 작용하도록 허용하고, (2) 두 개의 단백질의 기능적 도메인을 방해할 수 있는 순차적 2차구조를 발생시키는 경향을 가지지 않고, (3) 기능적 단백질 도메인과 상호작용할 수 있는 최소의 소수성 또는 전하를 띤 특성을 가지고, (4) R1및 R2가 단일세포상의 그들의 해당 리셉터와 동시에 상호작용할 수 있도록R1및 R2의 입체구분을 제공하도록 디자인된다. 전형적으로 유연성(flexible)단백질 영역에서의 표면아미노산은 Gly, Asn 및 Ser을 포함한다. 실제적으로 Gly, Asn 및 Ser을 함유하는 아미노산 서열의 어떤 순열도 링커 서열을 위한 상기 기준을 만족한다고 기대될 것이다. Thr 및 Ala와 같은 다른 중성 아미노산도 또한 링커서열에 사용될 수 있다. 부가적 아미노산이 또한 링커서열내의 단일 제한부위의 첨가로 인해 링커에 포함되어 융합체의 구성을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 링커는 식(Gly3Ser)n, (Gly4Ser)n, (Gly5Ser)n, (GlynSer)n 또는 (AlaGlySer)n의 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
고유연성 링커의 한가지 예는 사상 박테리오파지, 예컨대 박테리오파지 M13 또는 fd의 pIII 단백질내에 존재하는 (GlySer)-풍부한 스페이서 영역이다(Schaller et al., 1975). 이 영역은 pIII 표면 단백질의 두 개의 도메인 사이에 긴 유연성 스페이서 영역을 제공한다. 스페이서 영역은 다음 아미노산서열로 구성된다:
또한, 본 발명은 엔도펩티다제 인식서열이 포함된 링커를 포함한다.
그러한 절단부위는 융합체의 각 구성성분이 시험관내에서 적당히 접히고 활성적인지를 결정하기 위해 그것들을 구분하는데 가치있을 수 있다. 여러 엔도펜티다제의 예들은 플라스민, 엔테로키나제, 칼리크레인, 유로키나제, 조직 플라스미노겐 활성인자, 클로스트리파인, 키모신, 콜라겐아제, Russell의 독사독액 프로테아제, 포스트프롤린 절단효소, V8프로테아제, 트롬빈 및 인자 Xa를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
중사슬 면역글로불린 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE의 경첩(hinge)영역으로부터의 펩티드 링커절편은 부착된 폴리펩티드사이의 각도 관계를 제공한다. 시스테인이세린으로 치환된 경첩 영역이 특히 유용하다. 본 발명의 바람직한 링커는 시스테인이 세린으로 바뀐 쥐 IgG 감마 2b경첩 영역으로부터 유래된 서열을 포함한다.
이들 링커는 또한 엔도펩티다제 절단부위를 포함할 수 있다. 그러한 링커의 예들은 서열의 군으로부터 선택된 다음 서열을 포함한다:
그러나, 본 발명은 사용된 링커서열의 형태, 크기 또는 개수에 한정되지 않으며, 링커의 단하나의 요구조건은 그것이 기능적으로 융합체의 각 분자의 접힘 및 기능을 불리하게 방해하지 않는다는 것이다.
두 개의 조혈성장인자를 연결하기 위한 또다른 방법은 비공유결합적 상호작용에 의한것이다. 그러한 복합단백질은 다음식: R1-C1+R2-C2; 또는 C1-R1+C2-R2; C1-R1+R2-C2; 또는 C1-R1+R2-C2중 하나에 의해 기술될 수 있다(상기 식에서, R1은 다중 아미노산 치환을 함유하고 결실된 hIL-3분자의 부분을 가질 수 있는 hIL-3변이체이며, R2는 다르나 상보적인 활성을 갖는 콜로니 자극인자이다). 본 발명의 hIL-3변이체에 융합될 수 있는 R2의 정의내의 다른 성장호르몬, 콜로니자극인자(CSF), 시토카인, 림포카인, 인터루킨, 조혈성장인자의 비배타적 리스트는 GM-CSF, CSF-1, G-CSF, Meg-CSF (더 최근에는 c-mpl리간드라고 칭함), M-CSF, 에리트로포이에틴(EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, LIF, flt3/flk2, 인간성장호르몬, B-세포성장인자, B-세포분화인자, 호산구 분화인자 및 스틸인자 또는 c-키트 리간드로도 알려진 간세포인자(SCF)를 포함한다.
도메인 C1 및 C2는 비공유결합적 특이적 연합을 형성할 수 있는 동일한 또는 동일하지 않은 화학적 구조, 전형적으로는 단백질성이다. C1과 C2사이의 복합체는 각 복합체에 대한 R1과 R2사이의 1대 1 화학량론적 관계를 초래한다.
연합하는 도메인들의 예는 전사인자의 "루신 지퍼" 도메인, 박테리아전사억제인자의 이합체형성 도메인과 면역글로불린 불변도메인이다. 공유결합은 각각 R1 및 C1과 R2 및 C2를 연결한다. 식에서 가리켜진 바와같이, 도메인 C1 및 C2는 그들의 대응 조혈성장인자(R)의 N-말단 또는 C-말단에 존재할 수 있다.
이들 다량체형성 도메인(C1 및 C2)은 bZIP족의 단백질로부터 유래된 것(Abel et al., 1989; Landshulz et al., 1988; Pu et al., 1993; Kozarides et al., 1988) 뿐만 아니라, 나선-고리-나선족의 단백질의 다량체 형성 도메인(Abel et al., 1989; Murre et al., 1989; Tapscott et al., 1988; Fisher et al., 1991)을 포함한다. 본 발명의 바람직한 융합체는 bZIP족 단백질 Fos 및 Jun의 번역 융합 루신지퍼 이합체형성 도메인과 같은 그들의 통합에 의해 이합체형성된 콜로니 자극인자를 포함한다.
Jun의 루신지퍼 도메인은 동일한 도메인과 상호작용할 수 있다.
한편, Fos의 루신지퍼도메인와는 상호작용하지 않는다.
Fos 및 Jun의 혼합물은 우세하게 Fos-Jun이형이합체의 형성을 초래한다.
결과적으로 콜로니 자극인자에 융합될 때, Jun 도메인은 동형 또는 이형이합체의 형성을 지시하기 위해 사용될 수 있다. 만약 콜로니 자극인자 파트너중 하나가 Jun루신지퍼 도메인을 가지도록 설계된 반면 다른 하나가 Fos지퍼를 가지도록 설계된다면, 우선적인 이형이합체의 형성을 성취할 수 있다.
펩티드는 또한 융합단백질(예컨대 폴리-His)의 정제 또는 동정을 용이하게 하기 위해 첨가될 수 있다. 또한, 고 항원성 펩티드를 첨가하여 특이적 모노클론성 항체에 의한 융합단백질의 신속한 측정 및 용이한 정제를 가능하게 할 수 있다.
본 발명은 제 2콜로니 자극인자 또는 IL-3변이체에 융합된, 폴리펩티드의 아미노산 서열의 4개이상의 위치에 아미노산 치환이 생긴 신규의 인간 인터루킨-3(hIL-3)의 변이체로 이루어진 신규의 융합분자에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 융합분자는 제 2콜로니 자극인자 또는 IL-3변이체에 응합된, N-말단에 1내지 14, C-말단에 126내지 133의 아미노산 결실을 갖고 또한 폴리펩티드에서 4개이상의 아미노산 치환을 갖는(15-125)hIL-3결실돌연변이체이다. 본 발명은 또다른 콜로니 자극인자 또는 IL-3 변이체에 융합된, N-말단 및/또는 C-말단에 부가적 아미노산 연장이 있거나 없이 최소한 hIL-3의 아미노산 잔기 15내지 118로 이루어지고 폴리펩티드의 아미노산 서열에 4개 이상의 아미노산치환을 더 포함하는 돌연변이체 폴리펩티드를 포함한다.
여기에 사용된 인간 인터루킨-3은 제 1도에 도시된 아미노산 서열(1-133)에 해당하고, (15-125)hIL-3은 hIL-3폴리펩티드의 15 내지 125아미노산 서열에 해당한다.
hIL-3폴리펩티드 아미노산의 자연발생 변이체도 또한 본 발명에 포함되며 (예컨대 hIL-3폴리펩티드 서열의 위치 8에 세린보다 프롤린이 있는 대립변이체), 번역후에 변형된 (예컨대 글리코실화) 변이체 hIL-3분자도 마찬가지이다.
"돌연변이체 아미노산 서열", "돌연변이체 단백질" 또는 "돌연변이체 폴리펩티드"는 천연서열과 다르거나 천연서열로부터 의도적으로 변이체로 만들어진 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드를 의미한다.
"돌연변이체 단백질", "변이체 단백질" 또는 "뮤테인"은 돌연변이체 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 의미하고, 아미노산 결실, 치환 또는 둘다에 의해 천연 hIL-3의 아미노산 서열과 다른 폴리펩티드를 포함한다. "천연서열"은 유전자 또는 단백질의 야생형 또는 천연형태와 동일한 아미노산 또는 핵산서열을 의미한다.
인간 IL-3은 인간 조혈 선조세포에 의한 콜로니 형성을 자극하는 그것의 능력에 의해 특성화될 수 있다. 형성된 콜로니는 적혈구양, 과립구, 거핵구, 과립구성 대식세포 및 그것들의 혼합물을 포함한다. 인간 IL-3은 초기에 영장류에 이어서 인간에서 수행된 연구에서 (Gillio, A. P., et al. (1990); Ganser, A, et al., (1990); Falk, S., et al. (1991)) 골수기능을 회복하고 말초혈 세포집단을 치료적으로 유리한 레벨로 회복하는 능력을 입증했다. hIL-3의 부가적 활성은 백혈구 이동 및 화학주성을 자극하는 능력; 인간 백혈구가 루코트리엔 및 히스타민과 같은 고레벨의 염증성 매개인자를 생산하도록 기폭하는 능력; 백혈구 부착에 필요한 분자의 세포표면 발현을 유도하는 능력; 과 피부염증성 응답 및 열병을 유발하는 능력을 포함한다. hIL-3의 많은 또는 모든 이들 생물학적 활성은 신호전달(signal transduction) 및 고 친화성 리셉터 결합을 내포한다. 본 발명의 융합분자는 천연 hIL-3에 비해 유사하거나 더 큰 생물학적 활성을 갖거나, 향상된 반감기 또는 감소된 역부작용을 갖는 것과 같은 유용한 성질 또는 이들 성질의 조합을 나타낼 수 있다. 그것들은 또한 길항제로서도 유용할 수 있다.
천연 hIL-3와 비교하여 작거나 무활성을 갖는 융합분자는 길항제로서, 면역학 또는 면역요법에서의 사용을 위한 항체의 생산을 위한 항원으로서, 유전적 프로브로서 또는 다른 유용한 hIL-3 뮤테인을 구성하기 위해 사용되는 중간체로서 여전히 유용할 수 있다.
본 발명의 신규의 융합분자는 바람직하게는 인간 IL-3과 그것이 융합된 다른 콜로니 자극인자 또는 IL-3변이체의 적어도 한 개의 생물학적 성질을 가질 것이며, 한 개 이상의 IL-3유사 생물학적 성질 또는 향상된 성질 또는 인간 IL-3의 바람직하지 않은 생물학적 성질의 감소를 가질 수 있다. 또한 본 발명의 약간의 돌연변이체 폴리펩티드는 향상된 부작용 프로파일을 나타낼 수 있다. 예를들어, 그것들은 천연 hIL-3 또는 (15-125) hIL-3와 비교할 때 루코트리엔 방출 또는 히스타민 방출의 감소를 나타낼 수 있다. 그러한 hIL-3 또한 hIL-3-유사 생물학적 성질은 한 개 이상의 다음 생물학적 특성과 생체내 및 시험관내 활성을 포함할 수 있다.
한가지 그러한 성질은 적혈구양, 림프양 및 골수양 계통으로 개입되는 선조세포의 성장 및 분화의 지지이다. 예를들어 표준 인간골수측정법에서, IL-3-유사 생물학적 성질은 과립구형 콜로니, 거핵구형 콜로니, 단구/대식세포형 콜로니 및 적혈구양 돌발의 자극이다. 다른 IL-3-유사 성질은 초기 다잠재성 간세포와의 상호작용, 다능성 전구체 세포의 성장의 지속, 만성 골수성 백혈병(CML)세포증식을 자극하는 능력, 유선세포의 증식의 자극, 여러 인자-의존성 세포주의 성장을 지지하는 능력과 미성숙 골수세포 선조체를 유발하는 능력이다. IL-3의 다른 생물학적 성질은 당업계에 공지되어 있다. 인간 IL-3은 또한 몇몇 경우에 바람직하지 않을 수 있는 약간의 생물학적 활성, 예컨대 비장 및 골수배양과 생체내에서 루코트리엔 방출을 자극하는 능력과 증가된 히스타민 합성을 자극하는 능력을 가진다.
본 발명의 hIL-3 및 hIL-3융합단백질의 생물학적 활성은 인간 급성 골수성백혈병 세포(AML)에 의한 DNA합성에 의해 결정한다. 인자-의존성 세포주 AML 193을 생물학적 활성을 시험하는데 사용하기 위해 적응시켰다.
또한 본 발명의 hIL-3 및 hIL-3융합단백질의 생물학적 활성은 골수 측정법에서 콜로니 형성 단위체를 계수함으로써 결정한다.
다른 시험관내 세포기제 측정법도 또한 융합을 구성하는 콜로니 자극인자에 의존하는 융합분자의 활성을 결정하는데 유용할 수 있다. 다음은 다른 유용한 측정법의 예들이다.
TF-1증식 측정법: TF-1세포주는 적백혈병을 갖는 환자의 골수로부터 유래되었다(Kitamura et al., 1989). TF-1세포는 IL-3, GM-CSF, EPO 및 IL-5에 응답한다.
32D 증식측정법: 32D는 인간 IL-3에는 응답하지 않으나 종 한정되지 않는 인간 G-CSF에 응답하는 쥐 IL-3의존성 세포주이다.
T1165증식측정법: T1165세포는 IL-6 및 IL-11에 응답하는 IL-6의존성 쥐 세포주(Nordan et al., 1986)이다.
인간혈장응괴 meg-CSF측정법: 거핵구 콜로니형성활성을 측정하기 위해 사용됨(Mazur et al., 1981).
본 발명의 한가지 목적은 제 2콜로니 자극인자 또는 IL-3변이체에 융합된 폴리펩티드 서열에 4개이상의 아미노산 치환을 가지고 천연 hIL-3 또는 제 2콜로니 자극인자 또는 IL-3변이체에 비해 유사하거나 향상된 생물학적 활성을 갖는 hIL-3변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 hIL-3변이체 융합분자는 hIL-3또는 hIL-3유사활성을 가질 수 있다.
예를들어 그것들은 천연 hIL-3의 한 개이상의 생물학적 활성을 가질 수 있으며, 인간 또는 영장류 선조세포에 의한 조혈세포의 생성을 자극하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 융합분자 및 그것들을 함유하는 약학적 조성물은 질병이나 방사선 또는 화학요법과 같은 처리로 인해 조혈 세포집단이 감소 또는 파괴되는 상태의 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 융합분자를 함유하는 약학적 조성물은 장외적으로, 정맥내로 또는 피하적으로 투여될 수 있다.
천연 hIL-3은 상당한 염증성 활성을 가지며, 아라키돈산 대사물질 LTC4, LTD4및 LTE4의 합성; 히스타민 합성과 히스타민 방출을 자극한다고 밝혀졌다.
천연 hIL-3에 의한 인간 임상시험은 염증성 응답을 증명했다(Biesma et al., BLOOD,80: 1141-1148(1992) 및 Postmus et al., J. CLIN. ONCOL.,10: 1131-1140(1992)).
최근의 연구는 루코트리엔이 생체내 IL-3작용에 관련되며, IL-3처리의 생물학적 효과에 상당히 기여할 수 있다는 것을 가리킨다 (Denzlinger, C., et al., BLOOD,81: 2466-2470(1993)).
본 발명의 약간의 융합분자는 천연 hIL-3에 비해 향상된 치료적 프로파일을 가질 수 있다. 예를들어 본 발명의 약간의 융합분자는 루코트리엔 또는 히스타민의 자극의 유사하거나 일치하는 증가를 가지지 않고 천연 hIL-3에 비해 유사하거나 더 강한 성장인자 활성을 가질 수 있다. 이들 융합분자는 원하는 성자인자 활성(예컨대 세포증식)을 달성하기 위해 필요한 폴리펩티드의 양이 더 작은 루코트리엔 또는 히스타민 자극효과를 가지기 때문에 더 바람직한 치료적 프로파일을 가진다고 기대될 것이다. 천연 hIL-3에 의한 연구에서, 염증성 인자의 자극은 치료의 바람직하지 않은 부작용이었다. 염증 매개인자의 자극의 감소 또는 제거는 천연 hIL-3의 사용을 능가하는 이점을 제공할 것이다.
또한 본 발명의 신규 융합분자는 그것에 특이적으로 결합하여 작용제(agonist)의 결합을 방지함으로써 hIL-3리셉터를 봉쇄하는 길항제로서 유용할 수 있다.
본 발명의 신규융합분자, 특히 천연 hIL-3와 유사하거나 더나은 활성을 보유한 것의 한가지 잠재적 이점은 더 작은 양의 생물학적 활성 뮤테인을 사용하여 원하는 치료적 효과를 얻는 것이 가능할 수 있다는 것이다.
이것은 원하는 치료적 효과를 나타내는데 필요한 처리의 수를 감소시키는 것을 가능하게 할 수 있다.
더 작은 양의 사용은 또한 어떤 잠재적 항원 효과 또는 다른 가능한 바람직하지 않은 부작용의 가능성을 감소시킬 수 있다. 예를들어 만약 원하는 치료적 효과가 더 작은 양의 폴리펩티드로 성취될 수 있다면, 루코트리엔 및/또는 히스타민 방출의 자극과 같이 천연 IL-3의 투여와 연합된 부작용을 감소 또는 제거하는 것이 가능할 수 있다.
본 발명의 신규 융합분자는 또한 낮은 리셉터 개수를 갖는 간세포 또는 선조체의 활성화에 유용할 수 있다.
또한 본 발명은 융합단백질을 암호화하는 DNA서열, 실질적으로 유사하고 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 DNA서열과 오직 유전암호의 축퇴(degeneracy)로 인해 본 발명의 융합분자를 암호화하는 DNA와 다른 DNA서열을 포함한다. 또한 본 발명에는 돌연변이 DNA를 구성하는데 필요한 올리고뉴클레오티드 중간체와 이들 올리고뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드가 포함된다. 이들 폴리펩티드는 길항제로서 또는 면역측정법 및 면역요법 프로토콜에 유용한 항체의 생산을 위한 항원성 단편으로서 유용할 수 있다.
본 발명의 화합물은 바람직하게는 이제 당업계에 표준이된 유전공학적 기술[미국 특허 제 4,935,233호 및 Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory (1989)]에 의해 제조한다.
바람직한 hIL-3(15-125)돌연변이체 유전자를 생성하는 한가지 방법은 카세트 돌연변이유발[Wells et al. (1985)] 이며, 여기서 플라스미드내 hIL-3암호서열의 부분이 두개의 제한부위사이의 유전자 부분에서 원하는 아미노산 치환을 암호화하는 합성올리고뉴클레오티드로 치환된다.
유사한 방법으로 전체 길이 hIL-3유전자 또는 1내지 14아미노산이 N-말단으로부터 결실되고/되거나 1내지 15아미노산이 C-말단으로부터 결실된 hIL-3의 변이체를 암호화하는 유전자에서 아미노산 치환을 만들 수 있다. 올바로 조립될 때, 이들 올리고뉴클레오티드는 원하는 아미노산 치환 및/또는 N-말단 및/또는 C-말단으로부터의 결실을 갖는 hIL-3변이체를 암호화할 것이다. 이들과 다른 돌연변이들은 올리고뉴클레오티드-지정돌연변이유발[Zoller 및 Smith(1982, 1983, 1984), Smith(1985), Kunkel(1985), Taylor et al.(1985), Deng 및 Nickoloff(1992)] 또는 폴리머라제 연쇄반응(PCR)기술[Saiki, (1985)]을 포함하는 다른 돌연변이유발방법에 의해 당업계의 기술자에 의해 생성할 수 있다.
원하는 유전자를 암호화하는 상보적 합성 올리고뉴클레오티드의 쌍을 만들어서 서로 어닐링시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 DNA서열은 서열로부터 치환 및/또는 결실된 것을 제외하고 원하는 유전자의 아미노산에 대한 서열을 암호화할 것이다.
플라스미드 DNA를 선택된 제한효소로 처리한 다음, 어닐링된 올리고뉴클레오티드에 라이게이션시킬 수 있다. 라이게이션된 혼합물을 사용하여 콤피턴트 JM101세포를 적당한 항생제에 내성으로 형질전환시킬 수 있다. 단일 콜로니를 골라내고, 플라스미드 DNA를 제한분석 및/또는 DNA서열결정에 의해 시험하여 원하는 유전자를 갖는 플라스미드를 동정할 수 있다.
hIL-3변이체의 DNA서열과 다른 콜로니 자극인자 또는 IL-3변이체의 DNA서열의 융합은 중간체/벡터를 사용하여 성취할 수 있다. 이와 선택적으로 한 개의 유전자를 다른 유전자를 함유하는 벡터내로 직접 클로닝할 수 있다.
제한부위가 관심의 영역내부에 있는 경우, 링커 및 아댑터를 사용하여 DNA서열을 연결할 뿐만아니라 결실된 서열을 대체할 수 있다. 따라서 한가지 폴리펩티드, 펩티드링커 및 다른 폴리펩티드를 암호화하는 유전물질(DNA)을 박테리아, 효모, 곤충세포 또는 포유동물세포를 형질전환하기 위해 사용되는 적합한 발현벡터내로 삽입시킬 수 있다. 형질전환된 생물을 성장시키고, 표준기술에 의해 단백질을 분리한다.
그러므로 결과의 단백질은 링커영역에 의해 제 2 콜로니 자극인자 또는 IL-3변이체에 연결된 hIL-3변이체를 갖는 신규의 단백질이다.
본 발명의 또다른 태양은 이들 신규의 융합분자의 발현에 사용하기 위한 플라스미드 DNA벡터를 제공한다. 이들 벡터는 본 발명의 신규 폴리팹티드를 암호화하는 상기 신규 DNA서열을 함유한다. 융합분자를 발현할 수 있도록 미생물을 형질전환시킬 수 있는 적당한 벡터는 사용된 숙주 세포에 따라 선택된 전사 및 번역 조절서열에 연결된 융합분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 발현벡터를 포함한다.
상기와 같이 변형된 서열을 갖는 벡터는 본 발명에 포함되며, 융합 폴리펩티드의 생성에 유용하다. 그 방법에 사용된 벡터는 또한 본 발명의 DNA암호서열과 작동가능하게 연합된 선택된 조절서열을 함유하며, 선택된 숙주세포에서 그것의 복제 및 발현을 지시할 수 있다.
본 발명의 또다른 태양으로서, 신규의 융합분자를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 신규의 hIL-3변이체 융합분자의 발현을 암호화하는 DNA서열을 함유하는 벡터로 형질전환된 적합한 세포 또는 세포주를 배양하는 것을 포함한다.
적합한 세포 또는 세포주는 박테리아 세포일 수 있다.
예를들어, 다양한E. coli균주가 생물공학분야에서 숙주세포로 잘 알려져 있다.
그러한 균주의 예들은E. coli균주 JM101[Yanish-Perron et al. (1985)] 및 MON105[Obukowics et al., (1992)]를 포함한다. 또한 본 발명에는 박테리오파지 Mu에 기초한E. coli용 염색체 발현벡터를 사용한 융합단백질의 발현이 포함된다(Weinberg et al., 1993). 또한, 다양한B. subtilis균주가 이 방법에 사용될 수 있다.
당업계의 기술자에게 공지된 많은 효모세포의 균주도 또한 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주세포로서 사용될 수 있다.
E. coli세포질에서 발현될 때, 본 발명의 상기 돌연변이 hIL-3 변이체 융합분자는 또한 N-말단에 Met-Ala-로 구성되게 하여 발현시 Met이 절단되어 N-말단에 Ala를 남기도록 할 수 있다. 본 발명의 융합분자는 N-말단에 부착된 Met-, Ala- 또는 Met-Ala-를 갖는 융합 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 융합분자가E. coli의 세포질에서 발현될 때, N-말단에 부착된 Met 있는 그리고 없는 폴리펠티드가 얻어진다.
E. coli의 세포질에서 만들어진 단백질의 N-말단은 메티오닌 아미노펩티다제(Ben-Bassat et al., 1987)에 의한 그리고 가능하면 다른 펩티다제에 의한 번역후 프로세싱에 의해 영향을 받는다. 이들 돌연변이 융합분자는 또한 신호펩티드를 N- 말단에 융합시킴으로써E. coli에서 발현될 수 있다. 이 신호펩티드는 분비공정의 일부로서 폴리펩티드로부터 절단된다.E. coli에서의 분비는 신호 펩티다제의 정확한 성질로 인해 N-말단에 올바른 아미노산 (예컨대 (15-125)hIL-3 폴리펜티드에서의 Asn15)을 얻기 위해 사용될 수 있다. 이것은E. coli의 세포질에서 발현된 단백질의 N-말단에서 종종 관찰되는 이종성과 대조적이다.
또한 중국산 햄스터 난소세포(CHO)와 같은 포유동물 세포도 본 발명에서의 사용에 적합하다. 포유동물세포에서의 외부 유전자의 발현을 위한 일반적인 방법은 Kaufman, R. J.(1987) High level production of proteins in mammalian cells, inGenetic Engineering, Principles and Methods, Vol. 9, J. K. Setlow, editor,Plenum Press, New York에 검토된다. 포유동물세포에서 기능할 수 있는 강한 프로모터가 융합분자의 암호영역에 번역적으로 융합되는 진핵 분비신호펩티드 암호영역의 전사를 시동하는 발현벡터를 구성한다. 예를들어 pcDNA I/ Neo, pRc/RSV 및 pRc/CMV와 같은 플라스미드(Invitrogen Corp., San Diego, California로부터 구함)를 사용할 수 있다. 진핵 분비 신호펩티드암호영역은 hIL-3유전자 자체로부터 올 수 있거나, 또다른 분비 포유동물 단백질로부터 올 수 있다(Bayne, M. L. et al., (1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2638-2642). hIL-3변이체 유전자를 함유하는 벡터의 구성후에, 벡터 DNA를 포유동물세포내로 형질감염시킨다. 그러한 세포는 예컨대 COS7, HeLa, BHK, CHO 또는 마우스 L라인이 될 수 있다. 세포는 예를들어 DMEM배지(JRH Scientific)에서 배양할 수 있다. 배지로 분비된 hIL-3변이체는 세포의 형질감염한지 24-72시간후의 일시적 발현후 또는 네오마이신 내성에 대한 선택후의 안정한 세포주의 수립후에 표준 생화학적 접근법에 의해 회수할 수 있다. 적합한 포유동물 숙주세포의 선택과 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 생성물 생산 및 정제를 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예컨대 Gething 및 Sambrook,Nature, 293: 620-625(1981), 또는 선택적으로 Kaufman et al.,Mol. Cell. Biol., 5(7): 1750-1759(1985) 또는 Howley et al., 미국특허 제 4, 419, 446호 참조. 또다른 적합한 포유동물 세포주는 원숭이 COS-1세포주이다. 유사하게 유용한 포유동물 세포주는 CV-1세포주이다.
원한다면, 곤충세포를 본 발명의 방법에서 숙주세포로서 사용할 수 있다.
예컨대 Miller et al.,Genetic Engineering, 8: 277-298(Plenum Press1986) 및 거기에 인용된 참고문헌 참조, 더욱이 바큘로비루스 벡터를 사용한 곤충세포에서의 외부유전자외 발현을 위한 일반적인 방법은 Summers, M. D. 및 Smith, G. E.(1987) - A manual of methods for Baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555에 기술된다.
강한 바큘로비루스 프로모터(폴리헤드론 프로모터와 같은)가 진핵 분비 신호펩티드 암호영역의 전사를 시동하고, 그것은 융합 폴리펩티드를 위한 암호영역에 번역적으로 융합된 바큘로비루스 전달 벡터로 이루어진 발현벡터를 구성한다.
예를들어, 플라스미드 pVL 1392(Invitrogen Corp., San Diego, California로부터 구함)를 사용할 수 있다. 융합폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 수반하는 벡터의 구성후에, 그 마이크로그램의 이 DNA를 1마이크로그램의 바큘로비루스 DNA와 함께 곤충세포, 균주 SF9내로 공동형질 감염시킨다(Summers & Smith, 1987참조).
융합분자를 수반하는 순수 재조합 바큘로비루스를 사용하여 예컨대 Excell 401 무혈청배지(JRH Biosciences, Lenexa, Kansas)에서 배양된 세포를 감염시킨다.
배지내로 분비된 융합분자는 표준 생화학적 접근법에 의해 회수할 수 있다.
융합 단백질을 발현하는 포유동물 또는 곤충세포로부터의 상청액은 다수의 상업적 농축 유니트중 어느 것을 사용하여 우선 농축시킬 수 있다.
본 발명의 응합분자는 조혈시스템의 골수양, 적혈구양, 림프양 또는 거핵구 세포 또는 그것들의 조합의 저하된 레벨에 의해 특성화된 질병의 치료에 유용할 수 있다.
더욱이 그것들은 성숙 골수양 및/또는 림프양 세포를 활성화하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 의한 치료를 받기 쉬운 상태들중에는 말초혈액에 순환하는 백혈구(백색세포)의 개수의 감소인 백혈구 감소증이 있다. 백혈구 감소증은 일정한 비루스에 또는 방사선에 노출함으로써 유발될 수 있다. 그것은 종종 다양한 형태의 암 치료법, 예컨대 화학요법약품, 방사선에의 노출과 감염 또는 출혈의 부작용이다. 본 발명의 이들 융합분자에 의한 백혈구 감소증의 치료적 처리는 현재 구할 수 있는 약품에 의한 치료에 의해 유발되는 바람직하지 않은 부작용을 피할 수 있다.
본 발명의 융합분자는 호중구감소증의 치료에 그리고 예컨대 무형성 빈혈, 주기성 호중구감소증, 자발성 호중구감소증, Chediak -Higashi증, 전신성 홍반 낭창(SLE), 백혈병, 골수이형성증 및 골수섬유증과 같은 상태의 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 융합분자는 혈소판감소증의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다.
현재 혈소판감소중에 대한 유일한 치료법은 값비싸고 감염(HIV, HBV) 및 동종면역화의 중대한 위험을 수반하는 혈소판 수혈이다. 융합분자는 혈소판 수혈의 필요성을 완화 또는 감소시킬 수 있다. 심각한 혈소판감소증은 Fanconi 빈혈, Wiscott-Aldrich 또는 May-Hegglin등과 같은 유전적 결함으로부터 초래될 수 있다.
후천성 혈소판감소증은 면역 혈소판감소증 자반병, 전신성 홍반낭창, 용혈성 빈혈 또는 태아 모체 부적합성에서와 같은 자기-또는 동종-항체로부터 초래될 수 있다.
더욱이, 거비증, 파종성 맥관내 응혈, 혈전성 혈소판감소성 자반병, 감염 또는 인공심장판막은 혈소판감소증을 초래할 수 있다. 심각한 혈소판감소증은 또한 암의 화학요법 및/또는 방사선 치료법으로부터 초래될 수 있다. 혈소판감소증은 또한 암, 림프종, 백혈병 또는 섬유증에의한 골수 침입으로부터 초래될 수 있다.
본 발명의 융합분자는 조혈선조체 및 간세포의 말초혈액으로의 이동에 유용할 수 있다. 말초혈 유래선조체는 자기 골수이식의 세팅에서 환자를 재생시키는데 효과적이라고 밝혀졌다. C-CSF 및 GM-CSF를 포함하는 조혈성장인자는 말초혈액중 순환하는 선조체 및 간세포의 개수를 증강시킨다고 밝혀졌다. 이것은 말초 간세포 수집을 위한 절차를 단순화하고, 필요한 페레시스(pheresis)의 개수를 감소시킴으로써 절차의 비용을 급격히 감소시켰다. 융합분자는 간세포의 이동에 유용하고, 또한 말초간세포이식의 효율을 향상시킬 수 있다.
성장인자의 또다른 예측되는 임상용도는 유전자 치료를 위한 조혈선조 및 간세포의 시험관내 활성화에 있다. 조혈선조 또는 간세포의 게놈내로 관심의 유전자를 통합시키기 위해 세포분열 및 DNA복제를 자극할 필요가 있다. 조혈 간세포는 매우 낮은 빈도의 주기를 가지며, 이는 성장인자가 유전자 형질도입을 촉진하는데 유용하여 유전자 치료의 임상적 전망을 향상시킬 수 있다는 것을 의미한다.
많은 약품들이 골수억제 또는 조혈 결함을 초래할 수 있다.
그러한 약품의 예들은 화학요법에 사용되는 AZT, DDI, 알킬화제 및 항대사물질, 클로람페니콜,페니실린, 간시클로비르, 다운오마이신 및 술파약품과 같은 항생제, 페노티아존, 메프로바메이트와 같은 정신안정제, 아미노피린 및 디피론과 같은진통제, 페니토인 또는 카르바마제핀과 같은 진경제, 프로필티오우라실 및 메티마졸과 같은 항갑상선제와 이뇨제이다.
본 발명의 융합분자는 이들 약품으로 처리된 환자에서 종종 발생하는 골수억제 또는 조혈 결함을 예방 또는 치료하는데 유용할 수 있다.
조혈 결함은 또한 비루스, 미생물 또는 기생물 감염의 결과로서 그리고 신장질환 또는 신부전의 치료, 예컨대 투석의 결과로서 발생할 수 있다. 본 발명의 융합분자는 그러한 조혈결함을 치료하는데 유용할 수 있다.
조혈 결함의 치료는 환자에게 융합분자를 함유하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 융합분자는 본 발명의 융합단백질로 이들 세포를 시험관내 처리한 후 세포를 환자에게 주사함으로써 조혈 전구 세포를 활성화 및 증폭시키는데 유용할 수 있다.
또한 예컨대 T 및/또는 B림프구에서의 다양한 면역결폅, 또는 면역장애, 예컨대 류마티스양 관절염도 본 발명의 융합분자에 의한 치료에 의해 유리하게 영향받을 수 있다. 면역결핍은 예를들어 HTLVI, HTLVII, HTLVIII와 같은 비루스감염, 방사선, 암치료법에의 심각한 노출 또는 다른 의학적 치료의 결과일 수 있다.
또한 본 발명의 융합분자는 혈소판감소증(혈소판결핍)을 포함한 다른 혈액세포결핍 또는 빈혈의 치료에서 단독으로 또는 다른 헤마토포이에틴과 조합하여 사용될 수 있다.
이들 신규의 폴리펩티드에 대한 다른 용도는 생체내 및 생체외 골수이식으로부터 회복하는 환자의 치료에 그리고 진단 또는 치료적 용도를 위한 표준방법에 의해 생성된 모노클론성 및 폴리클론성 항체의 발생에 있다.
본 발명의 또다른 태양은 상기 상태들을 치료하기 위한 방법과 치료적 조성물이다. 그러한 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와의 혼합물로 치료적 유효량의 본 발명의 한 개이상의 융합분자로 이루어진다. 이 조성물은 장외적으로, 정맥내로 또는 피하적으로 투여될 수 있다. 투여될 때, 본 발명에서의 사용을 위한 치료적 조성물은바람직하게는 발열물질-없는, 장외적으로 허용가능한 수용액의 형태이다.
pH ,등장성, 안정성 등에 대한 정당한 고려를 갖는 장외적으로 허용가능한 단백질 용액의 제제는 당업계의 통상의 기술범위내에 있다.
상기 상태들을 치료하는 방법에 관련된 투여량 섭생은 약품의 작용을 변형시키는 다양한 요인들, 예컨대 환자의 상태, 체중, 성별 및 다이어트, 어떤 감염의 중한 정도, 투여시간 및 다른 임상적 요인을 고려하여 참가 내과의사에 의해 결정될 것이다.
일반적으로 일일 섭생은 체중의 킬로그램담 0.2-150㎍/kg의 융합단백질의 범위내일 수 있다. 이 투여량섭생은 천연 IL-3가 일반적으로 여기 기술된 AML증식 측정법에서 약 10피코몰 내지 100피코몰에서 EC50을 가지는 것을 인식하는 생물학적 활성의 표준레벨을 참조한다. 그러므로 투여량은 주어진 융합단백질의 활성 대 천연(기준) IL-3의 활성에 관련하여 조정될 것이며, 투여량 섭생이 일당 체중의 킬로그램탕 0.1미크로그램만큼 낮고 1밀리그램만큼 높은 투여량을 포함할 수 있다고 인식하는 것은 비합리적이지 않을 것이다. 더욱이 융합분자의 투여량이 체중의 킬로그램당 10-200미크로그램의 범위 보다 더 높거나 낮게 조정될 수 있는 특이적 환경이 존재할 수도 있다.
이들은 다른 콜로니 자극인자 또는 IL-3 변이체 또는 성장인자와의 공동투여; 화학요법적 약품 및/또는 방사선과의 공동투여; 글리코실화된 융합단백질의 사용; 과 이 절에서 미리 언급된 다양한 환자-관련이슈를 포함한다. 상기와 같이, 치료방법 및 조성물은 또한 다른 인간인자와의 공동투여를 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드와의 동시적 또는 순차적 공동투여를 위한 다른 적당한 헤마토포이에틴, CSF, 시토카인, 림포카인, 조혈성장인자 및 인터루킨의 비배타적 리스트는 GM-CSF, CSF-1, G-CSF, Meg-CSF(더 최근에는 c-mpl리간드로 칭함), M-CSF, 에리트로포이에틴(EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, It-10, IL-11, IL-12, IL-13, LIF, flt3/flk2, B-세포성장인자, B-세포분화인자 및 호산구 분화인자,스틸인자 또는 c-키트리간드로도 알려진 간세포인자(SCF), 또는 그것들의 조합을 포함한다.
상기 투여량은 치료적 조성물에서 그러한 부가성분들을 상보하기 위해 조정될 것이다. 처리된 환자의 진전은 혈액학적 프로파일, 예컨대 분화세포수 등의 정기적 평가에 의해 모니터할 수 있다.
본 발명은 또한 다음에 관한 것이다.
[상기 식에서 R1은 식:
의 인간 인터루킨-3 돌연변이체 폴리펩티드이고, 위치 1의 아미노산에 선행하는 Met-를 더 가질 수 있고, N-말단으로부터 1내지 14아미노산이 결실될 수 있고/있거나 C-말단으로부터 1내지 15아미노산이 결실될 수 있고, Xaa로 표시된 아미노산중 4내지 44개는 천연 (1-133)인간 인터루킨-3의 대응 아미노산과 다르다.]
2. 1의 융합단백질에 있어서, 상기 인간 인터루킨-3 돌연변이체 폴리펩티드가 식:
의 것이고, 위치 1의 아미노산에 선행하는 Met-를 더 가질 수 있고, N-말단으로부터 1내지 14아미노산이 결실될 수 있고/있거나 C-말단으로부터 1내지 15아미노산이 결실될 수 있고, Xaa로 표시된 아미노산중 4내지 35개는 천연 (1-133)인간 인터루킨-3의 대응 아미노산과 다른 융합 단백질.
3. 2의 융합단백질에 있어서, 상기 인간 인터루킨-3 돌연변이체 폴리펩티드가 식:
의 것이고, 위치 1의 아미노산에 선행하는 Met-를 더 가질 수 있고, N-말단으로부터 1내지 14아미노산이 결실될 수 있고/있거나 C-말단으로부터 1내지 15아미노산이 결실될 수 있고, Xaa로 표시된 아미노산중 4내지 44개는 천연 (1-133)인간 인터루킨-3의 대응 아미노산과 다른 융합 단백질.
4. 3의 융합단백질에 있어서, 상기 인간 인터루킨-3 돌연변이체 폴리펩티드가
5. 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 식을 갖는 융합단백질.
의 인간 인터루킨-3 돌연변이체 폴리펩티드이고, 위치 1의 아미노산에 선행하는 Met- 또는 Met-Ala-를 더 가질 수 있고, Xaa로 표시된 아미노산중 4내지 44개는 (1-133)인간 인터루킨-3의 대응 천연아미노산과 다르고;
R2는 콜로니 자극인자이고;
L은 R1을 R2에 연결할 수 있는 링커이다.]
6. 5의 융합단백질에 있어서, 상기 인간 인터루킨-3 돌연변이체 폴리펩티드가 식:
의 것이고, 위치 1의 아미노산에 선행하는 Met-또는 Met-Ala-를 더 가질 수 있고, Xaa로 표시된 아미노산중 4내지 35개는 천연 인간 인터루킨-3의 대응 아미노산과 다른 융합단백질.
7. 6의 융합단백질에 있어서, 상기 인간 인터루킨-3 돌연변이체 폴리펩티드가 식:
의 것이고, 위치 1의 아미노산에 선행하는 Met-또는 Met-Ala-를 더 가질 수 있고, Xaa로 표시된 아미노산중 4내지 26개는 천연 (1-133)인간 인터루킨-3의 대응아미노산과 다른 융합 단백질.
8. 7의 융합단백질에 있어서, 상기 인간 인터루킨-3 돌연변이체 폴리펩티드가
9. 8의 융합단백질에 있어서, 상기- 인간 인터루킨-3 돌연변이체 폴리펩티드가 다음 식의 것인 융합단백질.
(여기서, m은 0 또는 1; 위치 18에서의 Xaa는 Asn 또는 Ile; 위치 19에서의 Xaa는 Met, Ala 또는 Ile; 위치 20에서의 Xaa는 Ile, Pro 또는 Ile; 위치 23에서의Xaa는 Ile, Ala 또는 Leu; 위치 25에서의 Xaa는 Thr 또는 His, 위치 29에서의 Xaa는 Gln, Arg, Val 또는 Ile; 위치 322에서의 Xaa는 Leu, Ala, Asn 또는 Arg; 위치 34에서의 Xaa는 Leu 또는 Ser; 위치 37에서의 Xaa는 Phe, Pro 또는 Ser; 위치 38에서의 Xaa는 Asn 또는 Ala; 위치 42에서의 Xaa는 Gly, Ala, Ser, Asp 또는 Asn; 위치 45에서의 Xaa는 Gln, Val 또는 Met; 위치 46에서의 Xaa는 Asp 또는 Ser; 위치 49에서의 Xaa는 Met, Ile, Leu 또는 Asp; 위치 50에서의 Xaa는 Glu 또는 Asp; 위치 51에서의 Xaa는 Asn, Arg 또는 Ser; 위치 55에서의 Xaa는 Arg, Leu 또는 Thr; 위치 56에서의 Xaa는 Pro 또는 Ser; 위치 59에서의 Xaa는 Glu 또는 Leu; 위치 60에서의 Xaa는 Ala 또는 Ser; 위치 62에서의 Xaa는 Asn, Val 또는 Pro; 위치 63에서의 Xaa는 Arg 또는 His; 위치 65에서의 Xaa는 Val 또는 Ser; 위치 67에서의 Xaa는 Ser, Asn, His 또는 Gln; 위치 69에서의 Xaa는 Gln 또는 Glu; 위치 73에서의 Xaa는 Ala 또는 Gly; 위치 76에서의 Xaa는 Ser, Ala 또는 Pro; 위치 79에서의 Xaa는 Lys, Arg 또는 Ser; 위치 82에서의 Xaa는 Leu, Glu, Val 또는 Trp; 위치 85에서의 Xaa는 Leu 또는 Val; 위치 87에서의 Xaa는 Leu, Ser, Tyr; 위치 88에서의 Xaa는 Ala 또는 Trp; 위치 91에서의 Xaa는 Ala 또는 Pro; 위치 93에서의 Xaa는 Pro 또는 Ser; 위치 95에서의 Xaa는 His 또는 Thr; 위치 98에서의 Xaa는 His, Ile 또는 Thr; 위치 100에서의 Xaa는 Lys 또는 Arg; 위치 101에서의 Xaa는 Asp, Ala 또는 Met; 위치 105에서의 Xaa는 Asn 또는 Glu; 위치 109에서의 Xaa는 Arg, Glu 또는 Leu; 위치 112에서의 Xaa는 Thr 또는 Gln; 위치 116에서의 Xaa는 Lys, Val, Trp 또는 Ser; 위치 117에서의 Xaa는 Thr 또는 Ser; 위치 120에서의 Xaa는 Asn, Gln 또는 His; 위치 123에서의 Xaa는 Ala 또는 Glu인데; 단 Xaa로 표시된 아미노산중 4내지 44개는 천연 인간 인터루킨-3의 대응 아미노산과 다르다)
10. 9의 융합단백질에 있어서, 상기 인간 인터루킨-3 돌연변이체 폴리펩티드가 다음 식의 것인 융합단백질.
(여기서, m은 0 또는 1; n은 0 또는 1; p는 0 또는 1; 위치 4에서의 Xaa는 Asn 또는 Ile; 위치 5에서의 Xaa는 Met, Ala 또는 Ile; 위치 6에서의 Xaa는 Ile, Pro 또는 Leu; 위치 9에서의 Xaa는 Ile, Ala 또는 Leu; 위치 11에서의 Xaa는 Thr 또는 His; 위치 15에서의 Xaa는 Gln, Arg, Val 또는 Ile; 위치 18에서의 Xaa는 Leu, Ala, Asn 또는 Arg; 위치 20에서의 Xaa는 Leu 또는 Ser; 위치 23에서의 Xaa는 Phe, Pro, 또는 Ser; 위치 24에서의 Xaa는 Asn 또는 Ala; 위치 28에서의 Xaa는Gly, Ala, Ser, Asp 또는 Asn; 위치 31에서의 Xaa는 Gln, Val, 또는 Met; 위치 32에서의 Xaa는 Asp 또는 Ser; 위치 35에서의 Xaa는 Met, Ile 또는 Asp; 위치 36에서의 Xaa는 Glu 또는 Asp; 위치 37에서의 Xaa는 Asn, Arg 또는 Ser; 위치 41에서의 Xaa는 Arg, Leu, 또는 Thr; 위치 42에서의 Xaa는 Pro 또는 Ser; 위치 45에서의 Xaa는 Glu 또는 Leu; 위치 46에서의 Xaa는 Ala 또는 Ser; 위치 48에서의 Xaa는 Asn, Val 또는 Pro; 위치 49에서의 Xaa는 Arg 또는 His; 위치 51에서의 Xaa는 Val 또는 Ser; 위치 53에서의 Xaa는 Ser, Asn, His 또는 Gln; 위치 55에서의 Xaa는 Gln 또는 Glu; 위치 59에서의 Xaa는 Ala 또는 Gly; 위치 62에서의 Xaa는 Ser, Ala 또는 Pro; 위치 65에서의 Xaa는 Lys, Arg 또는 Ser; 위치 67에서의 Xaa는 Leu, Glu, 또는 Val; 위치 68에서의 Xaa는 Leu, Glu, Val, 또는 Trp; 위치 71에서의 Xaa는 Leu 또는 Val; 위치 73에서의 Xaa는 Leu, Ser 또는 Tyr; 위치 74에서의 Xaa는 Ala 또는 Trp; 위치 77에서의 Xaa는 Ala 또는 Pro; 위치 79에서의 Xaa는 Pro 또는 Ser; 위치 81에서의 Xaa는 His 또는 Thr; 위치 84에서의 Xaa는 His, Ile, 또는 Thr; 위치 86에서의 Xaa는 Lys 또는 Arg; 위치 87에서의 Xaa는 Asp, Ala 또는 Met; 위치 91에서의 Xaa는 Asn 또는 Glu: 위치 95에서의 Xaa는 Arg, Glu, Leu; 위치 98에서의 Xaa는 Thr또는 Gln; 위치 102에서의 Xaa는 Lys, Val, Trp 또는 Ser; 위치 103에서의 Xaa는 Thr 또는 Ser; 위치 106에서의 Xaa는 Asn, Gln, 또는 His; 위치 109에서의 Xaa는 Ala 또는 Glu인데; 단 Xaa로 표시된 아미노산중 4내지 44개는 천연(15-125) 인간 인터루킨-3의 대응 아미노산과 다르다)
11. 10의 융합단백질에 있어서, 상기 인간 인터루킨-3 돌연변이체 폴리펩티드가 다음 식의 것인 융합단백질.
다음은 본 발명의 융함단백질의 예이다.
E. coli에서의 융합분자의 발현재료 및 방법
달리 언급하지 않는 한 모든 특제 화학약품은 Sigma Co. (미주리주 세인트 루이스)에서 입수한다. 제한 엔도뉴클레아제, T4 폴리뉴클레오티드키나제,E. coliDNA 폴리머라제 I의 큰 단편(Klenow) 및 T4 DNA 리가제는 New England Biolabs(매사추세츠주 베벌리)에서 입수한다.
Escherichia coli 균주
균주 JM101: 델타(pro lac), supE, thi, F'(traD36, rpoAB, lacI-Q, lacZdeltaM15(Messing, 1979). 이 균주는 아메리칸 타입 걸쳐 컬렉션(ATCC) (메릴랜드 20852 록빌 파크론 드라이브 12301, 수탁번호 33876)에서 입수할 수 있다.
MON105(W3110 rpoH358)는 W3110(Bachmann, 1972)의 유도체이며 ATCC 수탁번호 55204로 지정되었다. 균주 GM48: dam-3, dcm-6, gal, ara, lac, thr, leu, lonA, tsx (Marinus, 1973)는 서열 GATC에서 메틸화되지 않은 플라스미드 DNA를 제조하는데 사용된다.
유전자 및 플라스미드
E. coli에서의 hIL-3 생산에 사용되는 유전자는 British Biotechnology Incorporated(영국 캠브리지, 카탈로그번호 BBG14)에서 입수한다. 이 유전자는 pP0518이라고 명명된 pUC기제 플라스미드상에 포함되어 있다. IL-1 알파, IL 1 베타, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, G-CSF, GM-CSF 및 LIF를 포함한 다른 인간 CSF유전자는 R & D systems, Inc. (미네소타주 미니애폴리스)에서 입수할 수 있다.
E. coli에서의 hIL-3 생산에 사용되는 플라스미드는 유전요소를 함유하고 있는데 이것의 사용은 기술되었다(Olins et al., 1988; Olins and Rangwala, 1990). 사용되는 레플리콘은 pBR327(Covarrubias, et al., 1981)의 레플리콘인데 이것은 세포내에 약 100개의 복사수(copy number)로 유지된다(Soberon et al. 1980). β-락타마제 단백질을 암호화하는 유전자는 플라스미드상에 존재한다. 이단백질은 세포에 암피실린 내성을 부여한다. 이 내성물질은 플라스미드의 세포내 존재에 대한 선택가능 표현형으로서 작용한다.
세포질 박현벡터에 대해서 전사 프로모터는E. coli의 recA 유전자로부터 유래된다 (Sancar et al., 1980). precA라 명명된 이 프로모터는 RNA 폴리머라제 결합부위 및 lexA 억제인자 결합부위(오퍼레이터)를 포함하고 있다. 이 DNA 절편은 recA 프로모터가 pBR327 복제기원을 갖는 플라스미드상에 있더라도 조절이 되는 높은 레벨의 전사를 제공한다(여기에 참고로 포함된 Olins et al., 1988).
사용되는 리보솜 결합부위는 파지 T7의 유전자 10으로부터의 것이다(Olins et al., 1988). 이것은 precA에 인접하여 위치한 100염기쌍(bp) 단편에서 암호화된다. 여기서 사용되는 플라스미드에서는 효소 NcoI에 대한 인식서열(CCATGG)이 g10-L에 후속한다. 그것은 hIL-3 유전자 플라스미드에 접합되는 이 NcoI 부위에 있다. 이 접합점에서의 뉴클레오티드 서열은 mRNA에서 기능적 번역개시부위로 인식된 것으로 예상된다(Olins et al., 1988). 사용되는 hIL-3 유전자는 이 유전자의 코딩 서열 하류에 HindIII 인식부위(AAGCTT)를 갖도록 설계하였다. 여기서 HindIII 부위는 단일가닥 파지 f1의 복제기원을 함유하는 514염기쌍 RsaI 단편이다(Dente et al., 1983; Olins, et al., 1990. 둘다 여기에 참고로 포함됨). 이들 요소를 함유하는 플라스미드는 pMON2341이다.
이들 요소를 함유하는 또 하나의 플라스미드는 pMON5847로서, 이것은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(메릴랜드 20852 록빌 파크론 드라이브 12301)에 수탁번호 ATCC 68912로 기탁되었다.
분비발현 플라스미드에 있어서 전사 프로모터는E. coli의ara B, A및D유전자로부터 유래된다 (Greenfield et al., 1978). 이 프로모터는 pAraBAD라 명명되어 있고 323 염기쌍SacII,BglII 제한 단편에 함유되어 있다.
LamB 분비리더 (Wong et al., 1988, Clement et al., 1981)는 효소NcoI에 대한 인식서열(5'CCATGG3')에서 hIL-3 유전자의 N말단에 융합된다. 사용되는 hIL-3 유전자는 이 유전자의 코딩서열에 후속하는 HindIII 인식부위 (5'AACCTT3')를 갖도록 설계하였다.
재조합 DNA법
합성 유전자 어셈블리
hIL-3 변이체유전자 및 기타 CSF 유전자는 합성 올리고뉴클레오티드에 의해 구성할 수 있다. 합성 올리고뉴클레오티드는 돌출하는 단일가닥 말단에 의해 상보적 쌍으로 어닐링하여 그 쌍을 적당히 어셈블(조립)할때 원하는 유전자의 일부를 암호화하는 DNA서열을 초래하도록 설계한다. hIL-3 유전자의 아미노산 치환은 올리고뉴클레오티드를 원하는 치환체를 암호화하도록 설계함으로써 행한다.
상보적 올리고뉴클레오티드를 50mM NaCl을 가한 라이게이션 완충액중에서 미크로리터당 1 피코몰의 농도로 어닐링한다. 샘플을 끓는 물중의 100ml 비이커에서 가열하여 실온으로 서서히 냉각시킨다. 각각의 어닐링된 올리고뉴클레오티드쌍 1 피코몰을 New England Biolabs(메사추세츠주 베벌리)에서 입수한 T4 DNA 리가제에 의해 라이게이션 완충액(25mM Tris pH 8.0, 10mM MgCl2, 10mM 디티오트레이톨, 1mMATP, 2mM 스페르미딘)중에서 적당한 제한효소로 분해된 플라스미드 DNA 약 0.2 피코몰과 총부피 20μl로 실온에서 하룻밤 라이게이션시킨다.
폴리머라제 연쇄반응
폴리머라제 연쇄반응(이하 PCR이라 함)법 (Saiki, 1985)에서는 Perkin-Elmer Cetus (코네티컷주 노르월크)제 시약 키트 및 서멀 사이클러를 사용하였다. PCR은Thermus aguaticus로부터의 열안정성 DNA 폴리머라제에 기초한다. PCR법은 생체내 복제와 유사한 방식으로 각 사이클 후에 DNA 분자수가 두배로 되는 천연 DNA 복제 프로세스를 모사하는 DNA 증폭법이다. DNA 폴리머라제 매개 연장은 5'에서 3'방향으로이다. 여기서 사용되는 "프라이머"라는 용어는 DNA 폴리머라제가 뉴클레오티트 서열에 상보적인 뉴클레오티드를 첨가할 수 있는 말단을 제공하는 올리고뉴클레오티드 서열을 말한다. 전자의 뉴클레오티드 서열을 "주형"이라 하는데 여기에 프라이머가 어닐링된다. 증폭된 PCR산물은 연장 프라이머들의 5'말단 사이에 포함된 영역으로서 정의된다. 프라이머가 서열을 정의하므로 산물은 프라이머서열에 대응하는 별개의 말단을 갖게 된다.
프라이머 연장반응은 35 사이클(1사이클은 94℃에서 1분, 50℃에서 2분, 72℃에서 3분으로 정의함) 동안 20피코몰(pmole)의 각 올리고뉴클레오티드와 1피코그램의 주형 플라스미드 DNA를 사용하여 수행한다. 반응혼합물을 같은 부피의 페놀/클로로포름(50% 페놀 및 50% 클로로포름, 부피/부피)으로 추출하여 단백질을 제거한다.
증폭된 DNA를 함유하는 수상과 용매상을 미크로원심분리기(Model 5414Eppendorf Inc. (캘리포니아주 프리몬트))로 5분간 원심분리에 의해 분리한다. 증폭된 DNA를 침전시키기 위해 수상을 제거하여 새 관에 옮기고 여기에 1/10부피의 3M NaOAc (pH 5.2) 및 2.5부피의 에탄을 (-20℃에서 저장한 100%)을 가한다.
용액을 혼합하여 20분 동안 드라이 아이스위에 놓는다. DNA를 미크로원심분리기로 10분 원심분리하여 펠렛화하고 용액을 펠렛에서 제거한다. DNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고 에탄올을 제거하여 speedvac 농축기(Savant (뉴욕주 파밍데일))로 건조시킨다. 펠렛을 25 미크로리터의 TE(20mM Tris-HCl pH 7.9, 1mM EDTA)에 재현탁시킨다. 별법으로 DNA를 같은 부피의 4M NH4OAc 및 1부피의 이소프로판올을 가하여 침전시키기도 한다[Treco et al., (1988)]. 용액을 혼합하고 실온에서 10분간 배양하여 원심분리한다. 이들 조건은 ∼20 염기보다 큰 DNA 단편을 선택적으로 침전시키며 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제거하는데 이용된다. 반응물의 4분의 1을 제한효소 [Higuchi, (1989)]로 분해하고 종료시 70℃로 가열하여 효소를 불활성화시킨다.
라이게이션 혼합물로부터의 재조합 플라스미드 회수
DNA를 흡수하는데 적당한E. coliJM101 세포를 제조한다. 전형적으로는 20 내지 100ml의 세포를 밀도가 약 150Klett 유니트가 되게 LB 배지애서 성장시킨 다음 원심분리로 수집한다. 세포를 배양 부피의 절반의 50mM CaCl2에 재현탁시키고 4℃에서 1시간 유지시킨다. 세포를 다시 원심분리로 수집하여 배양부피의 10분의 1의 50mM CaCl2에 재현탁시킨다. DNA를 150 미크로리터 부피의 이들 세포에 가하고샘플을 4℃에서 30분 동안 유지시킨다. 샘플을 1분 동안 42℃로 바꾸고 LB 1밀리리터를 가하고 샘플을 37℃에서 1시간 진탕한다. 이들 샘플로부터의 세포를 암피실린을 함유하는 플레이트에 펼쳐서 형질전환체를 선택한다. 플레이트를 37℃에서 하룻밤 배양한다. 단일 콜로니를 골라서 진탕하면서 37℃에서 하룻밤 암피실린이 첨가된 LB에서 성장시킨다.
제한분석을 위해 이들 배양물로부터 DNA를 분리한다.
배양배지
DNA 분리용의 세포 성장을 위해서는 LB 배지 (Maniatis et al., 1982)를 사용한다. 재조합 융합분자를 생산하는 배양을 위해서는 1.0% 카사미노산, 산 가수분해 카제인, Difco (미시건주 디트로이트)가 첨가된 M9 최소 배지를 사용한다. M9배지의 성분은 다음과 같다: 3g/ℓ KH2PO4, 6g/ℓ Na2HPO4, 0.5g/ℓ NaCl, Ig/ℓ NH4Cl, 1.2mM MgSO4, 0.025mM CaCl2, 0.2% 글루코스 (AraBAD 프로모터를 함유하는 0.2% 글리세롤), 1% 카사미노산, 0.1ml/ℓ pl량 무기물 (리터당 FeCl3·6H2O 108g, ZnSO4· 7H2O 4.0g, CoCl2· 2H2O 7.0g, Na2MoO4· 2H2O 7.0g, CuSO4· 5H2O 8.0g, H3BO32.0g, MnSO4· H2O 5.0g, 농 HCl 100ml). 고체 배지에는 박토 한천을 사용하고 액체 LB배지와 고체 LB배지 둘다에 암피실린을 200㎍/㎖로 가한다.
recA 프로모터를 사용하는 벡터에 의한 E. coli에서의 융합분자 생산
관심 대상의 플라스미드를 포함하는E. coli균주를 New Scientific (뉴저지주 에디슨)제 Gyrotory water bath Model G76에서 진탕하면서 카사미노산이 첨가된 M9 배지에서 37℃에서 성장시킨다. Klett Mfg. Co. (뉴욕주 뉴욕)제 Klett Summerson meter (그린 54 필터)로 성장을 모니터한다. Klett 값이 약 150일때 배양물의 분액 (약 1밀리리터)을 단백질 분석을 위해 제거한다. 남은 배양물에 0.1N NaOH중의 날리딕스산(10㎍/ml)을 최종농도가 50㎍/ml가 되게 가한다.
날리딕스산을 가한후 배양물을 3 내지 4시간 동안 37℃에서 진탕한다. 원하는 유전자산물의 최대 생산을 이루기 위해서는 세균성장동안 높은 폭기도를 유지시킨다. 세포를 광현미경으로 봉입체의 존재에 대해 조사한다. 단백질 함량의 분석을 위해 배양물 분액 1ml를 제거한다.
세포질에서 융합단백질을 생산하는 E. coli세포의 분획화
융합분자 정제에 있어서의 제1단계는 세로를 음파처리하는 것이다. 배양물 분액을 음파처리 완충액 즉 10mM Tris, pH 8.0, 1mM EDTA, 50mM NaCl 및 0.1mM PMSF 중에서 세포 펠렛으로부터 재현탁한다. 이들 재현탁 세보를 Heat Systems-Ultrasonics Inc. (뉴욕주 파밍데일)에서 입수한 소니케이터 세포 파열기 모델 W-375의 마이크로팁을 사용하여 수회 반복된 음파처리로 파괴한다. 광현미경으로 호모게네이트를 검사함으로써 음파처리정도를 모니터한다. 세포가 거의 전부 파괴된 때 호모게네이트를 원심분리로 분획화한다. 펠렛은 봉입체의 대부분을 함유하는 것으로서 융합단백질이 아주 풍부하다.
방법: E. coli에서 봉입체로서 발현된 융합단백질의 추출, 재접기 및 정제
이들 융합단백질은 여러가지 표준방법으로 정제할 수 있다. 이들 방법 중 몇몇은 Methods in Enzymology, Volume 182 'Guide to Protein Purification' edited by Murray Deutscher, Academic Press, San Diego, CA (1990)에 상세히 기술되어 있다.
E. coli에서 불용성 봉입체를 생산하는 융합단백질은 환원제로서 디티오트레이톨 또는 베타 메르캅토에탄올을 포함하는 구아니딘 HCl 또는 우레아 같은 고농도의 변성제중에서 가용화시킬 수 있다. 활성 구조로의 단백질 접기는 환원제 없는 저농도의 변성제로의 순차적 투석을 통해 달성할 수 있다.
몇몇의 경우에 접힌 단백질은 적당한 매트릭스에 부착된 리셉터 서브유니트 또는 mAbs와 같은 친화성 시약을 사용하여 친화성 정제할 수 있다. 선택적으로 (또는 이에 더하여) 정제는 이온교환, 겔여과 또는 소수성 크로마토그래피 또는 역상 HPLC와 같은 각종 크로마토그래피법 중의 어느 한가지를 사용하여 달성할 수 있다.
hIL-3 샌드위치 ELISA
융합단백질의 농도는 친화성 정제한 적당한 항체에 의거하는 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정할 수 있다. 마이크로역가 플레이트(Dynatech Immulon II)를 100mM NaHCO3, pH 8.2 중에서 약 1㎍/ml의 농도로 150μl의 염소항 rhIL-3로 피복한다. 플레이트를 습도 100%를 유지하는 방에서 실온에서 하룻밤 배양한다. 웰을 비우고 플레이트상에 남은 반응성 부위를 10mM PBS, 3% BSA 및 0.05% Tween 20, pH 7.4를 함유하는 용액 200μl로 1시간 동안 37℃ 및 습도 100%에서 블로킹한다.
웰을 비우고 0.05% Tween 20 (세척 완충액)을 함유하는 150mM NaCl로 4회 세척한다. 다음에 각 웰에 rhIL-3 표준, 콘트롤, 샘플 또는 회석완충액만을 함유하는 150μl의 희석 완충액(0.1% BSA, 0.01% Tween 20, pH 7.4를 함유하는 10mM PBS)을 담는다.
rhIL-3의 원료용액을 사용하여 0.125ng/ml 내지 5ng/ml 범위의 농도(아미노산 조성분석으로 측정한 농도)로 표준 곡선을 만든다. 플레이트를 37℃ 및 습도 100%에서 2.5시간 배양한다. 웰을 비우고 각 플레이트를 세척 완충액으로 4회 세척한다. 다음에 각 웰에 호스래디시 과산화효소에 컨쥬게이트된 염소 항 rhIL-3의 최적 희석액(체커보드 측정 포맷으로 측정할때 최적) 150μl를 담았다.
플레이트를 37℃ 및 습도 100%에서 1.5시간 배양한다. 웰을 비우고 각 플레이트를 세척 완충액으로 4회 세척한다. 다음에 각 웰에 ABTS 기질용액 150μl를 담는다(Kirkegaard and Perry). 5ng/ml rhIL-3를 함유하는 표준웰의 색이 Dynatech 마이크로역가 플레이트 리더로 시험파장 410nm 및 기준 파장 570nm에서 읽을때 0.5-1.0의 흡수도를 산출하기에 충분할만큼 전개될때까지 플레이트를 실온에서 배양한다. 미지의 샘플중의 먼역반응성 rhIL-3 농도를 플레이트 리더가 공급된 소프트웨어를 사용하여 표준 곡선으로부터 산출한다.
다음 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 예시하나 본 발명은 이들 특정 실시예에 한정되지 않음을 알 것이다.
실시예 1
융합분자에 대한 발현 플라스미드의 구성
플라스미드 pMON13288 (미국특허출원 번호 PCT/US93/11197)에서 발견된 IL-3변이체 단백질, 이것에 후속하는 인자 Xa 단백질분해성 절단부위, 이것에 후속하는 쥐과 IgG 2b 힌지부 (여기서 시스테인은 융합체의 두 단백질 사이의 폴리펩티드 링커서열로서의 세린으로 치환됨), 및 이에 후속하는 G-CSF로 구성된 융합단백질을 암호화하는 플라스미드의 구성. 플라스미드 pMON13288은 EcoRI (이것은 IL-3 변이체 유전자에 내재함)로 분해하고 HindIII(이것은 IL-3 변이체에 대한 중지코돈 뒤에 있음) 및 3900 염기쌍 EcoRI, HindIII 제한단편은 정제한다. pMON13288로부터 유래하는 유전요소는 β-락타마제 유전자(AMP), pBR 327 복제기원, recA 프로모터, g10L 리보솜 결합부위, (15-125) IL-3 변이체 유전자의 아미노산 15-105를 암호화하는 염기, 및 파지 f1 복제기원이다. 상보적 합성 올리고뉴클레오티드쌍은 EcoRI 부위(아미노산 106-125를 암호화하는 염기)뒤의 IL-3 변이체 유전자의 부분, 인자 Xa 절단부위를 암호화하는 DNA 서열, 폴리펩티드 링커를 암호화하는 DNA서열 및 AflIII 제한부위를 치환하여 융합체에서 제 2유전자의 클로닝을 허용하도록 설계한다. 적당히 조립할 때 올리고뉴클레오티드는 EcoRI 및 HindIII 제한 말단을 갖는, 상기한 프레임내(in-frame)성분을 암호화하는 DNA 서열을 초래한다. 이 DNA서열내에는 단일 제한부위가 또한 생성되어 유사한 기능을 갖는 서열(예를들면 또 하나의 폴리펩티드 링커 영역)로 특정 영역을 계속해서 치환할 수 있게 한다. 단일 SnaBI 제한부위는 13288유전자의 말단에서 생성되는데 이것은 융합체의 C말단 위치에서 다른 유전자의 클로닝을 가능하게 한다. 단일 XmaI 부위는 인자 Xa 절단부위를 암호화하는 서열과 폴리펩티드 링커를 암호화하는 영역 사이에 생성된다. 단일 AflIII 부위는 링커영역뒤에 생성되는데 이것은 응합체의 N-말단 단백질의 클로닝을 가능하게 한다. pMON13288로부터의 3900 염기쌍 단편을 조립된 올리고뉴클레오티드로 라이게이션시키고 적당한 E. coli 균주로 형질전환시킨다. 얻어진 클론을 제한분석으로 스크린하고 DNA 서열화하여 원하는 DNA서열이 생성되는지 확인한다. 얻어지는 플라스미드를, 다른 유전자를 AflIII 및 HindIII에 NcoI, HindIII 단편으로서 클로닝할 수 있는 중간체로서 사용한다.
NcoI 및 AflIII에 의해 생성된 오버행은 적합하나 제한인식부위의 측면 서열은 다르다. 클로닝 결과 NcoI 및 AflIII 부위는 손실된다. 상기한 제한부위를 예로서 사용하나 기재된 것에 한정되지는 않는다. 영역이 치환될 수 있게 하는 기능을 하는 다른 단일 제한부위도 설계할 수 있다. 얻어지는 융합체를 암호화하는 플라스미드를 DNA 서열화하여 원하는 DNA서열이 얻어지는지 확인한다.
다른 IL-3 변이체 유전자 또는 다른 콜로니 자극인자 유전자도 유전적 설계법에 의해 유사한 방법으로 변경시켜 상기한 융합 구조체의 C말단 또는 N말단 위치에의 클로닝을 가능하게 할 적당한 제한부위를 생성할 수 있다. 또한 다른 펩티다제 절단부위 또는 폴리펩티드링커도 융합 플라스미드로 설계할 수 있다.
실시예 2
E. coli에서 봉입체로서 발현되는 pMON13061과 같은 융합단백질의 발현, 추출, 재접기 및 정제
관심대상의 플라스미트를 포함하는E. coli균주를 37℃에서 하룻밤 성장시키고 다음날 아침에 카사미산이 첨가된 새로운 M9 배지에 약 1/50로 희석시킨다. 배양물을 격렬하게 진탕하면서 중간 로그(OD600=∼1)까지 3내지 4시간 동안 37℃에서 성장시킨다. 0.1N NaOH중의 날리딕스산(10mg/ml)을 최종농도가 50㎍/ml가 되게 가한다. 날리딕스산을 가한후 배양물을 3 내지 4시간 동안 37℃에서 성장시킨다. 원하는 융합단백질의 최대 생산을 이루기 위해서는 세균성장동안 높은 폭기도를 유지시킨다. 융합단백질이E. coli에서 불용성 봉입체로서 생산되는 경우에는 세포를 광현미경으로 봉입체의 존재에 대해 조사한다.
봉입체에 융합분자를 함유하는E. coli세포를 음파처리로 분해시켰다. 10mM Tris HCl pH 8.0 및 1mM EDTA중의 세포의 10%(w/v) 현탁액을 Heat Systems-Ultrasonics Inc.(뉴욕주 파밍테일)에서 입수한 소니케이터 세포 파열기 모델 W-375를 사용하여 1분 동안 3 또는 4회 파괴시켰다. 세포를 광현미경으로 조사함으로써 세포파괴정도를 모니터하였다. 세포가 본질적으로 모두 분해되었을 때 2800 x g에서 20분 동안 원심분리하여 봉입체를 수거하였다.
봉입체 펠렛을 음파처리 완충액에 10%로 현탁시키고 상기와 같이 원심분리하이 2회 세척하였다.
융합분자를 Bio Homogenizer로 10-30초 동안 배합한 다음 4℃에서 1-2시간 동안 완만하게 교반함으로써 50mM Tris-HCl pH 9.5 및 5mM DTT와 함께 8M 요소 10ml에 봉입체 1g으로서 용해하였다. 용해된 융합단백질을 47,000 x g에서 15분동안 원심분리로 정화하였다.
활성 구조로의 단백질 접기는 30분에 걸쳐 10mM Tris-HCl pH 9.5중의 2.3M 요소로 8배 희석하여 요소농도를 3M로 낮춤으로써 행하였다. 융합분자의 집기는 보통 2M과 3M의 요소 사이에서 행하였으나 보다 고농도의 요소에 의해서도 접기가 가능할 것이다. 단백질 접기 및 이황화 결합의 형성이 종료될 때까시 공기에 노출된 조건하에 융합체를 완만하게 교반하였다. 접기 진행상태는 1ml/분으로 25분에 걸쳐 35% 내지 65% 아세토니트릴(CH3CN)/0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 선형 구배에 의해 0.46×15cm Vydac C 4컬럼 (캘리포니아주 헤스페리아)을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토피레피(RP-HPLC)로 모니터하였다.
접기가 종료된 후 융합단백질 용액의 pH를 빙초산으로 5.0으로 낮추고 4℃에서 배양하였다. 1시간후 용액을 47,000 x g에서 15분 동안 원심분리로 정화하였다.
상청액의 pH를 아세트산으로 4.0으로 낮추고 0.45μ 필터를 사용하여 여과에 의해 정화하였다. 여액을 10mM 아세트산암모늄 pH 4.0의 두가지의 100배 변화에 대하여 투석하였다. 투석된 용액의 pH를 NaOH로 6.5로 증가시켰다.
다음에 중화된 용액을 10mM Tris-Cl pH 6.5로 평형화된 DEAE 패스트 플로우 컬럼(Pharmacia, 뉴저지주 피스커터웨이)상에 수지 1ml당 융합단백질 2mg으로 부하하였다. 융합단백질을 12시간 동안 0.28cmt/분의 선형 유동으로 평형화 완충액중에서 50 내지 150mM NaCl의 선형구배를 사용하여 용출하였다. RP-HPLC분석을 이용하여 순도 93%이상의 분획을 모았다. 모든 분획을 10mM Tris-Cl pH 7.5의 두가지의 100배 변화에 대하여 투석하였다. 투석된 단백질 용액을 0.45μ 필터를 사용하여 멸균여과하고 4℃에서 저장하였다. CM 패스트 플로우와 같은 양이온교환 크로마토그래피 및 RP-HPLC도 별도로 또는 DEAE 크로마토그래피와 조합하여 융합단백질을 정제하는데 사용할 수 있다.
정제된 융합단백질을 RP-HPLC, 전기스프레이 질량분광법, IEF, 및 SDS-PAGE로 분석하였다. 단백질 정량화는 아미노산 조성 및 Bradford 단백질 측정으로 행하였다.
몇몇의 경우에는 접힌 단백질을 적당한 매트릭스에 부착된 리셉터 서브유니트 또는 mAbs와 같은 친화성 시약을 사용하여 친화성 정제할 수 있다. 선택적으로 (또는 이에 더하여) 정제는 이온교환, 겔여과 또는 소수성 크로마토그래피 또는 역상 HPLC와 같은 다양한 크로마토그래피법 중의 어느 한가지를 사용하여 달성할 수 있다.
이들 및 다른 정제방법은 Methods in Enzymology, Volume 182 'Guide to Protein Purification' edited by Murray Deutscher, Academic Press, San Diego, (AC1990)에 상세히 기재되어 있다.
실시예 3
융합단백질의 시험관내 활성 측정
융합단백질의 단백질 농도는 친화성 정제한 폴리클론성 항체에 의거하는 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정할 수 있다. 이 대신 단백질 농도는 아미노산 조성에 의해 측정할 수도 있다. 융합분자의 생활성은 천연 IL-3, IL-3 변이체 또는 G-CSF 단독 또는 전부와 비교하여 다수의 시험관내 측정법으로 측정할 수 있다.
한가지 그러한 측정법이 AML-193 세포증식측정법이다. AML-193세포는 IL-3 및 G-CSF에 응답하는데 이것에 의해 IL-3 변이체/ G-CSF 융합체의 조합된 생활성을 측정할 수 있게 된다. 게다가 쥐과 IL-3 의존성 세포주인 M-NFS-60(ATCC. CRL1838) 또는 32D와 같은 다른 인자 의존성 세포주도 사용할 수 있다.
IL-3의 활성은 종특이적인데 반해 G-CSF는 그렇지 않으므로 IL-3 변이체/G-CSF 융합체의 G-CSF성분의 생활성은 독립적으로 측정할 수 있다. 시험관내에서 IL- 3 변이체/G-CSF 융합단백질이 조혈 전구세포의 팽창 및 여러 유형의 조혈 콜로니의 패턴에 미치는 영향을 결정하는데는 메틸셀룰로스 측정법을 사용할 수 있다.
메틸셀룰로스 측정법은 투입세포 10,000개당 전구체의 빈도를 측정하므로 전구체 빈도를 추정할 수 있게 한다. 원시 조혈 전구체 및 간세포를 묘사하는데는 장기 스트로마 의존 배양이 사용되어 왔다. 이 측정법을 융합분자가 매우 원시적인 전구체 및/또는 간세포의 팽창을 자극하는지 안하는지 결정하는데 사용할 수 있다. 또한 한계 희석 배양도 수행할 수 있는데 이것은 융합분자에 의해 자극받는 원시 전구체의 빈도를 알 수 있게 한다.
인자 Xa 절단부위는 융합단백질을 정제하여 재접기한 후 절단하여 융합체의 IL-3 및 G-CSF성분을 분리하는데 유용하다. 인자 Xa로 절단후 융합체의 IL-3 및 G-CSF 성분은 균일하게 정제하고 개별적으로 분석하여 융합체로서 발현, 재접기 및 정제후 두성분 모두 활성형태임을 입증한 수 있다.
실시예 4
pMON13018의 구성
융합단백질을 암호화하는 DNA서열을 함유하는 플라스미드를 구성하는데 사용되는 중간 플라스미드인 pMON13018의 구성. pMON13288로부터의 3900염기쌍 EcoRI,HindIII 제한단편을 이하의 어닐링된 상보적 뉴클레오티드쌍과 라이게이션시켰다.
조립된 올리고뉴클레오티드는 인자 Xa 절단부위 및 아미노산 서열(Gly3Ser)2로 구성된 폴리펩티드 링커 1 (표 1) 및 (15 125) hIL-3 변이체 13288의 아미노산 106 125를 암호화하는 DNA서열과 EcoRI 및 HindIII 제한말단을 생성한다.
라이게이션 반응을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다.
형질전환 세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 LB육즙에서 성장시킨 콜로니에서 분리하였다. DNA를 서열화하여 서열이 올리고뉴클레오티드의 것인지 결정하였다. 플라스미드 pMON13018구성의 개략도를 제2도에 도시한다.
실시예 5
pMON13019의 구성
융합단백질을 암호화하는 DNA서열을 함유하는 플라스미드를 구성하는데 사용되는 중간 플라스미드인 pMON13019의 구성. pMON13018로부터의 4014염기쌍 XmaI/AflIII 제한단편을 이하의 어닐링된 상보적 올리고뉴클레오티드쌍과 라이게이션시켰다.
조립된 올리고뉴클레오티드는 인자 Xa 절단부위 및 쥐 IgG 2b힌지부로 구성된 폴리펩티드 링커 4(표 1)의 아미노산 9-33을 암호화하는 DNA서열과 XmaI 및 AflIII 제한말단을 생성한다. 라이게이션 반응을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다. 형질전환 세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다.
플라스미드 DNA를 LB육즙에서 성장시킨 콜로니로부터 분리하였다.
DNA를 서열화하여 서열이 올리고뉴클레오티드의 것인지 결정하였다.
실시예 6
pMON13024의 구성
융합단백질을 암호화하는 DNA서열을 함유하는 플라스미드를 구성하는데 사용되는 중간 플라스미드인 pMON13024의 구성. pMON13010으로부터의 4091 염기쌍 NheI, HindIII 제한단편을 이하의 어닐링된 상보적 올리고뉴클레오티드쌍과 라이게이션시켰다.
조립된 올리고뉴클레오티드는 NheI 및 HindIII 제한말단을 생성하고 G-CSF 유전자의 3'말단에서 SnaBI 제한부위를 생성하며 G-CSF의 아미노산 155-175를 암호화하는 DNA서열을 생성한다. G-CSF유전자 뒤의 중지코돈은 배제되고 SnaBI 인식부위의 DNA서열은 G-CSF의 C말단에서 프레임내 아미노산 Tyr Val을 암호화한다.
라이게이션 반응을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다.
형질전환세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 LB육즙에서 성장시킨 콜로니로부터 분리하였다. DNA를 서열화하여 서열이 올리고뉴클레오티드 것인지 결정하였다.
실시예 7
pMON13027의 구성
융합단백질을 암호화하는 DNA서열을 함유하는 플라스미드를 구성하는데 사용되는 중간 플라스미드인 pMON13027의 구성. 플라스미드 pMON13018 DNA를 제한효소 NcoI 및 SnaBI로 분해하여 3704 염기쌍 NcoI, SnaBI 단편을 얻었다.
플라스미드 pMON13024 DNA를 NcoI 및 SnaBI로 분해하여 528 염기쌍 NcoI, SnaBI 단편을 얻었다. 이 제한단편들을 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다. 형질전환세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하여 제한분석으로 분석하고 서열화하여 정확한 삽입체를 화인하였다.
실시예 8
pMON13032의 구성
융합단백질을 암호화하는 DNA서열을 함유하는 플라스미드를 구성하는데 사용되는 중간 플라스미드인 pMON13032의 구성. 플라스미드 pMON1593O DNA를 제한효소 NcoI 및 SnaBI로 분해하여 3829 염기쌍 NcoI, SnaBI 단편을 얻었다.
플라스미드 pMON13024 DNA를 NcoI 및 SnaBI로 분해하여 528 염기쌍 NcoI, SnaBI 단편을 얻었다. 이 제한단편들을 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다. 형질전환세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하여 제한분석으로 분석하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다.
실시예 9
pMON13041의 구성
융합단백질을 암호화하는 DNA서열을 함유하는 플라스미드를 구성하는데 사용되는 중간 플라스미드인 pMON13041의 구성. pMON13018로부터의 4018염기쌍 SnaBI/XmaI 제한단편을 이하의 어닐링된 상보적 올리고뉴클레오티드쌍과 라이게이션시켰다.
조립된 올리고뉴클레오티드는 Arg가 Lys로 교체된 인자 Xa 절단부위 및 아미노산서열(Gly3Ser)2로 구성된 폴리펩티드 링커 2(표 1)의 아미노산 1-8을 암호화하는 DNA서열과 SnaBI 및 XmaI 제한말단을 생성한다. 라이게이션 반응을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다. 형질전환 세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 LB육즙에서 성장시킨 콜로니로부터 분리하였다.
DNA를 서열화하여 서열이 올리고뉴클레오티드의 것인지 결정하였다.
실시예 10
pMON13042의 구성
융합단백질을 암호화하는 DNA서열을 함유하는 플라스미드를 구성하는데 사용되는 중간 플라스미드인 pMON13042의 구성. pMON13018로부터의 4018염기쌍 SnaBI/XmaI 제한단편을 이하의 어닐링된 상보적 올리고뉴클레오티드쌍과 라이게이션시켰다.
조립된 올리고뉴클레오티드는 인자 Xa 절단부위 및 쥐 IgG 2b 힌지부로 구성된 폴리펩티드 링커 3(표 1)을 암호화하는 DNA서열과 SnaBI 및 XmaI 제한말단을 생성한다. 폴리펩티드 링커 3은 아미노산서열 Tyr Val Glu Gly Gly Gly Cly Ser Pro (Gly3Ser)2Asn[SEQ ID NO: 190]으로 구성되어 있다. 라이게이션 반응을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다. 형질전환 세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 LB육즙에서 성장시킨 콜로니로부터 분리하였다. DNA를 서열화하여 서열이 올리고뉴클레오티드의 것인지 결정하였다.
실시예 11
pMON13046의 구성
융합단백질을 암호화하는 DNA서열을 함유하는 플라스미드를 구성하는데 사용되는 중간 플라스미드인 pMON13046의 구성. 플라스미드 pMON13018 DNA를 제한효소 NcoI 및 NsiI로 분해하여 3873 염기쌍 NcoI, NsiI 단편을 얻었다.
hIL-3 변이체를 암호화하는 플라스미드 pMON13416(미국특허출원번호PCT/US93/11197) DNA를 NcoI 및 NsiI로 분해하여 170 염기쌍 NcoI, NsiI 단편을 얻었다.
이 제한단편들을 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다. 형질전환세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하여 제한분석으로 분석하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다.
실시예 12
pMON13047의 구성
융합단백짙을 암호화하는 DNA서열을 함유하는 플라스미드를 구성하는데 사용되는 중간 플라스미드인 pMON13047의 구성. 플라스미드 pMON13019 DNA를 제한효소 NcoI 및 NsiI로 분해하여 3918 염기쌍 NcoI, NsiI 단편을 얻었다.
플라스미드 pMON13416 DNA를 NcoI 및 NsiI로 분해하여 170 염기쌍 NcoI, NsiI 단편을 얻었다. 이 제한단편들을 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다. 형질전환세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하여 제한분석으로 분석하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다.
실시예 13
pMON13478의 구성
인간 과립구 콜로니 자극인자(hG-CSF)를 암호화하는 설계 유전자를 함유하는pUC18기제 플라스미드는 R & D Systems(카탈로그 # BBG13, 미네소타주 미니애폴리스)에서 입수하였다. 이 플라스미드를 pMON13457이라 명명하였다.
pMON13457로부터의 3157 염기쌍 ApaI, HindIII 단편을 이하의 어닐링된 상보적 올리고뉴클레오티트쌍과 라이게이션시켰다.
조립된 올리고뉴클레오티드는 HindIII 및 ApaI 제한말단, 내부 NcoI 제한부위, 알라닌이 후속하고 개시 메티오닌이 선행하는 hG-CSF의 최초 네개의 아미노산(Thr Pro Leu Gly)을 암호화하는 DNA서열을 생성한다.E. coli에서의 발현을 위해 메티오닌 및 알라닌을 첨가하였다. 라이게이션 반응혼합물을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다. 형질전환세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 얻어진 플라스미드를 pMON13478이라 명명하였다.
실시예 14
pMON13498의 구성
pMON13478로부터의 3163 염기쌍 NcoI, ApaI 단편을 이하의 어닐링된 상보적 올리고뉴클레오티쌍과 라이게이션시켰다.
조립된 올리고뉴클레오티드는 NcoI 및 ApaI 제한말단을 생성하며, 성숙한hG-CSF의 최초 네개의 아미노산 (Thr Pro Leu Cly)을 암호화하는 DNA서열의 A/T함량을 최대화한다. DNA서열의 A/T함량을 변경하여E. coli에서의 단백질 발현을 증가시켰다. 라이게이션 반응혼합물을 사용하여E. colik-12 균주 JM101을 형질전환시켰다. 형질전환 세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다.
플라스미드 DNA를 분리하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다.
을리고뉴클레오티드의 ApaI 제한말단은 ApaI 부위에 적합하나 ApaI 인식 서열은 변경된다. 얻어진 플라스미드를 pMON13498이라 명명하였다.
hG-CSF 유전자에 대한 상기 변형은 DNA서열[SEQ ID NO: 178]에서 발견된다.
실시예 15
pMON13010의 구성
플라스미드 pMON5743(Olins and Rangwala [1990]) DNA를 제한효소 NcoI 및 EcoRI로 분해하여 3633 염기쌍 NcoI, EcoRI 단편을 얻었다. 플라스미드 pMON13498 DNA를 NcoI 및 EcoRI로 분해하여 542염기쌍 NcoI, EcoRI 단편을 얻었다.
이 제한단편들을 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다. 형질전환 세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하여 제한분석으로 분석하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 플라스미드 pMON13010은 다음의 아미노산서열을 암호화한다.
DNA 서열 # [SEQ ID NO: 178]은 상기 pMON13010 폴리펩티드를 암호화한다.
실시예 16
pMON13499의 구성
pMON13478로부터의 3163 염기쌍 NcoI, ApaI 단편을 이하의 어닐링된 상보적 올리고뉴클레오티쌍과 라이게이션시켰다.
조립된 올리고뉴클레오티드는 NcoI 및 ApaI 제한말단을 생성하며, hG-CSF의 최초 세개의 아미노산 (Thr Pro Leu)을 암호화하는 DNA서열의 A/T함량을 최대화한다. DNA서열의 A/T함량을 변경하여E. coli에서의 발현레벨을 증가시켰다. 라이게이션 반응혼합물을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다.
형질전환 세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다.
플라스미드 DNA를 분리하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다.
얻어진 플라스미드를 pMON13499라 명명하였다. hG-CSF 유전자에 대한 상기 변형은 DNA서열[SEQ ID NO: 177]에서 발견된다.
실시예 17
pMON13033의 구성
pMON13499로부터의 3117 염기쌍 ApaI, BstXI 단편을 이하의 어닐링된 상보적 올리고뉴클레오티쌍과 라이게이션시켰다.
조립된 올리고뉴클레오티드는 ApaI 및 BstXI 제한말단을 생성하며, 시스테인이 세린으로 치환된 경우 아미노산 17을 제외하고 hG-CSF의 아미노산 5 내지 26을 암호화한다. 시스테인을 세린으로 치환하여E. coli로부터 단리된 단백질의 시험관내 재접기 효율을 증가시컸다. 라이게이션 반응혼합물을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다. 형질전환 세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다.
얻어진 플라스미드를 pMON13033이라 명명하였다. hG-CSF 유전자에 대한 상기 변형은 DNA서열[SEQ ID NO: 179]에서 발견된다.
실시예 18
pMON13037의 구성
플라스미드 pMON5743 DNA를 제한효소 NcoI 및 EcoRI로 분해하여 3633 염기쌍 NcoI, EcoRI 단편을 얻었다. 플라스미드 pMON13033 DNA를 NcoI 및 EcoRI로 분해하여 542염기쌍 NcoI, EcoRI 단편을 얻었다. 이 제한단편들을 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다. 형질전환 세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하여 제한분석으로 분석하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 플라스미드 pMON13037은 다음의 아미노산서열을 암호화한다.
DNA 서열 # [SEQ ID NO: 179]은 상기 pMON13037 폴리펩티드를 암호화한다.
실시예 19
pMON13011의 구성
인간 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(hGM-CSF)를 암호화하는 설계 유전자를 함유하는 pUC18기제 플라스미드는 R & D Systems(카탈로그 # BBG12, 미네소타주 미니애폴리스)에서 입수하였다. 이 플라스미드를 pMON13458이라 명명하였다.
pMON13458로부터의 2986 염기쌍 NcoI, BsmI 단편을 이하의 어닐링된 상보적 올리고뉴클레오티드쌍과 라이게이션시켰다.
조립된 올리고뉴클레오티드는 NcoI 및 BsmI 제한말단, 및 hG-CSF의 최초 19개의 아미노산을 암호화하는 DNA서열을 생성한다. 아미노산 3, 4, 5, 7, 9, 11, 12, 13 및 15를 암호화하는 DNA서열을 E. coli 선호 코돈으로 변경하여E. coli에서의 발현레벨을 증가시켰다. 라이게이션 반응혼합물을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다. 형질전환세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 얻어진 플라스미드를 pMON13011이라 명명하였다. hGM-CSF 유전자에 대한 상기 변형은 DNA서열 [SEQ ID NO: 176]에서 발견된다.
실시예 20
pMON13012의 구성
플라스미드 pMON5743 DNA를 제한효소 NcoI 및 EcoRI로 분해하여 3633 염기쌍 NcoI, EcoRI 단편을 얻었다. 플라스미드 pMON13011 DNA를 NcoI 및 EcoRI로 분해하여 398염기쌍 NcoI, EcoRI 단편을 얼었다. 이 제한단편들을 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질진환시켰다. 형질전환 세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하여 제한분석으로 분석하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 플라스미드 pMON13012는 다음의 아미노산서열을 암호화한다.
DNA 서열 # [SEQ ID NO: 176]은 상기 pMON13012 폴리펩티드를 암호화한다.
실시예 21
pMON5865의 구성
인간 인터루킨-6(hIL-6)를 암호화하는 설계 유전자를 함유하는 pUC18기제 플라스미드는 British Biotech(카탈로그 # BBG17)애서 입수하였다. 이 플라스미드로부터의 3170 염기쌍 HindIII/BstXI 단편을 이하의 어닐링된 상보적 올리고뉴클레오티드쌍과 라이게이션시켰다.
조립된 올리고뉴클레오티드 HindIII 및 BstXI 제한말단, 및E. coli단백질 발현을 위한 N말단에서의 Met Ala에 더하여 hIL-6의 최초 10개의 아미노산을 암호화하는 DNA서열을 생성한다. 이 올리고뉴클레오티드는 또한 유전자의 5'말단에서 NcoI부위를 생성하기도 한다. 최초 10개의 아미노산을 암호화하는 코돈은 E. coli 선호 코돈으로 변경하여E. coli에서의 발현레벨을 증가시켰다. 라이게이션 반응혼합물을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다. 형질전환세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 얻어진 플라스미드를 pMON5865라 명명하였다. hG-CSF의 상기 변형은 DNA서열[SEQ ID NO: 175]에서 발견된다.
실시예 22
pMON13040의 구성
플라스미드 pMON5743 DNA를 제한효소 NcoI 및 EcoRI로 분해하여 3633 염기쌍 NcoI, EcoRI 단편을 얻었다. 플라스미드 pMON5865 DNA를 Ncol 및 EcoRI로 분해하여 572염기쌍 NcoI, EcoRI 단편을 얻었다.
이 제한단편들을 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시컸다. 형질전환 세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하여 제한분석으로 분석하고 서열화하여정확한 삽입체를 확인하였다. 플라스미드 pMON13040은 다음의 아미노산서열을 암호화한다.
DNA 서열 # [SEQ ID NO: 175]은 상기 pMON13040 폴리펩티드를 암호화한다.
실시예 23
pMON15931의 구성
융합단백질을 암호화하는 DNA서열을 함유하는 플라스미드를 구성하는데 사용되는 중간 플라스미드인 pMON15931의 구성. 선상 박테리오파지 fd(Schaller et al., 1975)의 pIII 단백질의 (Gly-Ser)풍부 스페이서 영역을 암호화하는 DNA서열을 PCR법을 사용하여 증폭시켰다. 선상 박테리오파지 fd의 pIII 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드는 프라이머로서 이하의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 PCR반응을 위한 주형으로서의 역할을 한다.
PCR프라이머 연장반응은 이하의 DNA서열을 생성하였다.
상기 DNA서열은 인자 Xa절단부위 및 fd 박테리오파지의 pIII 단백질의 (Gly-Ser) 풍부 영역으로 구성된 폴리펩티드 링커 7(표 1)의 아미노산 9-49를 암호화한다.
PCR로 생성된 단편을 XmaI 및 AflIII로 분해하고 pMON13018로부터의 4014염기쌍 XmaI, AflIII 단편과 라이게이션시켰다. 라이게이션 반응 혼합물을 사용하여E. coliK-12 균주JM101을 형질전환시켰다. 형질전환 세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하여 제한분석으로 분석하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다.
실시예 24
pMON15930의 구성
융합단백질을 암호화하는 DNA서열을 함유하는 플라스미드를 구성하는데 사용되는 중간 플라스미드인 pMON15930의 구성. 선상 박테리오파지 fd(Schaller et al., 1975)의 pIII 단백질의 몇개의 측면 아미노산을 갖는 (Gly-Ser)풍부 스페이서영역을 암호화하는 DNA서열을 PCR법을 사용하여 증폭시켰다. 선상 박테리오파지 fd의 pIII단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드는 프라이머로서 이하의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 PCR반응을 위한 주형으로서의 역할을 한다.
PCR프라이머 연장반응은 이하의 DNA서열을 생성하였다.
상기 DNA서열은 인자 Xa절단부위 및 fd 박테리오파지의 pIII 단백질의 (Gly-Ser) 풍부영역으로 구성된 폴리펩티드 링커 8(표 1)의 아미노산 9-70를 암호화한다.
PCR로 생성된 단편을 XmaI 및 AflIII로 분해하고 pMON13018로부터의 4014염기쌍 XmaI, AflIII 단편과 라이게이션시켰다. 라이게이션 반응 혼합물을 사용하여E. coliK-12 균주JM101을 형짙전환시켰다. 형질전환 세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하여 제한분석으로 분석하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다.
실시예 25
pMON13038의 구성
융합단백질을 암호화하는 DNA서열을 함유하는 플라스미드를 구성하는데 사용되는 중간 플라스미드인 pMON13038의 구성. 플라스미드 pMON13019 DNA를 제한효소 NcoI 및 SnaBI로 분해하여 3749 염기쌍 NcoI, SnaBI 단편을 얻었다.
플라스미드 pMON13024 DNA를 NcoI 및 SnaBI로 분해하여 528 염기쌍 NcoI, SnaBI 단편을 얻었다. 이 제한단편들을 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다. 형질전환세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하여 재한분석으로 분석하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 얻어진 플라스미드를 pMON13038이라 명명하였다.
실시예 26
pMON13021의 구성
플라스미드 pMON13018 DNA를 제한효소 AflIII 및 HindIII로 분해하여 4023 염기쌍 AflIII, HindIII 단편을 얻었다. 플라스미드 pMON13288 DNA를 NcoI 및 HindIII로 분해하여 345염기쌍 NcoI, HindIII 단편을 얻었다. 이 제한단편들을 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다. 형질전환 세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다.
플라스미드 DNA를 분리하여 제한분석으로 분석하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 플라스미드 pMON13021의 구성 개략도를 제2도에 도시한다. 플라스미드 pMON13021은 다음의 아미노산서열을 암호화한다.
펩티드 # [SEQ ID NO: 125]
DNA 서열 #[SEQ ID NO: 54]은 상기 pMON13021 폴리펩티드를 암호화한다.
실시예 27
pMON13022의 구성
플라스미드 pMON13018 DNA를 제한효소 AflIII 및 HindIII로 분해하여 4023 염기쌍 AflIII, HindIII 단편을 얻었다. 플라스미드 pMON13012, DNA를 NcoI 및 HindIII로 분해하여 586염기쌍 NcoI, HindIII 단편을 얻었다. 이 제한단편들을 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을 사용하여E. coliK-12 균주 JM101을 형질전환시켰다. 형질전환 세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하여 제한분석으로 분석하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다. 플라스미드 pMON13022는 다음의 아미노산서열을 암호화한다.
펩티드 # [SEQ ID NO: 141]
DNA 서열 #[SEQ ID NO: 55]은 상기 pMON13032 폴리펩티드를 암호화한다.
실시예 28-62
hIL-3 변이체(들)로 일부 구성된 융합단백질의 추가 실시예를 표 2에 나타낸타. 표 2의 융합단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드는 여기에 포함된 재료 및 방법과 실시예, 특히 실시예 1, 9, 10, 26 및 27에 기재된 방법으로 구성하였다.
표 2에 나타낸 DNA 제한단편들을 라이게이션시켰는데 얻어진E. coli발현 플라스미드(표 2)는 나타낸 폴리펩티드 융합체를 암호화하는 DNA서열을 함유하고 있다(표 2).
폴리펩티드 융합체는 폴리펩티드 링커(L)(표 1)를 통해 융합된 두개의 콜로니 자극인자(R1및 R2)로 구성되어 있으며, 식 R1-L-R2로 표시된다. 표 2의 폴리펩티트융합체를 암호화하는 유전자중의 일부는E. coli발현벡터로부터 NcoI, HindIII 제한단편으로서 포유류 세포(BHK) 발현벡터 pMON3934로 전이시켰다.E. coli및 BHK 발현 플라스미드를 표 2에 나타낸다. 표 2의 폴리펩티드 융합체중 일부에 대한 AML193.1.3세포에서의 생물학적 활성, 성장촉진 활성을 표 3에 나타빈다. 표 2의 융합체중 일부에 대한 메틸셀룰로스 측정법으로 평가한 생물학적 활성을 제3도 내지 제7도에 나타낸다.
실시예 63
1-332 및 1-153 아미노산형의 c_mpl리간드(Meg_CSF)의 분리
A. 역전사효소반응 (Genbank accession #L33410에 의거한 c-mpl 리간드 서열).
인간 태아 간 A+ RNA는 Clontech(캘리포니아주 팔로 알토)에서 입수하였다. 제 1 가닥 cDNA 반응은 Invitrogen(캘리포니아주 샌 디에고)에서 입수한 cDNA CycleTM키트를 사용하여 실행하였다.
B. 폴리머라제 연쇄 반응
역전사효소(RT) 반응에 따라, 유전자의 5' 말단에 바로 선행하는 NcoI 부위를 생성하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 c-mplNcoI [SEQ ID NO:169] 및 중지코돈에 대해 3'에 바로 접하여 EcoRI 부위를 생성하는 c-mplEcoRI [SEQ ID NO:170]을 사용하여 PCR에 의해 1-332 c-mpl 리간드를 증폭시켰다. RT 반응에 따라서, c-mplNcoI[SEQ ID NO:169] 프라이머 및 아미노산 153에 대한 코돈에 대해 3'에 접하여 중지코돈 및 HindIII 부위를 생성하는 3' 프라이머 c-mplHindIII [SEQ ID NO:171]을 사용하여 1-153 c-mpl 리간드를 증폭시켰다.
실시예 64
pMON26448의 구성
1-153 c-mpl 리간드 PCR 산물을 pMON3934에 서브클로닝시키기 위해 NcoI 및 HindIII 제한효소로 분해하였다. 포유류 발현벡터인 pMON3934는 pMON3359[Hippenmeyer et al., (1993)]으로부터 유래하나, IE110 프로모터 및폴리-A 신호에 더하여 변형된 인간 IL 3 신호 펩티드 서열을 함유하고 있다. 신호 펩티드 서열 측면에는 BamHI 및 NcoI 제한효소부위가 있는데, 이것은 NcoI, HindIII 단편으로서의 유전자의 클로닝 및 발현을 용이하게 한다. HindIII 부위는 NcoI 부위에 대해 3'이다. 신호 펩티드의 DNA 서열은 이하에 나타낸다(제한효소부위는 위에 나타냄).
NcoI 부위내의 ATG(메티오닌) 코튼은 신호 펩티드의 개시 ATG(밑줄침)를 갖는 프레임 내에 있다.
얻어진 플라스미드를 pMON26448이라 명명하였다. 플라스미드 pMON26448은 이하의 아미노산서열을 갖는 융합체를 암호화한다.
DNA 서열 # [SEQ ID NO:180]은 상기 pMON26448 폴리펩티드를 암호화한다.
실시예 65
C말단이 변형된 cDNA 서열 아미노산 1-153형의 c-mpl 리간드 (Meg-CSF)의 분리
A. 역전사효소반응 (Genbank accession #L33410에 의거한 c-mpl 리간드 서열).
인간 태아 간 A+ RNA는 Clontech(캘리포니아주 팔로 알토)에서 입수하였다.
제 1 가닥 cDNA 반응은 Invitrogen(캘리포니아주 센 디에고)에서 입수한 cDNA Cycle™ 키트를 사용하여 실행하였다.
B. 폴리머라제 연쇄 반응
역전사효소(RT) 반응에 따라, 유전자의 5' 말단에 바로 선행하는 NcoI 부위를 생성하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 c-mplNcoI [SEQ ID NO:169] 및 중지코돈에 대해 3'에 바로 접하여 EcoRI 부위를 생성하는 c-mplEcoRI [SEQ ID NO:170]을 사용하여 PCR에 의해 1-332 c-mpl 리간드를 증폭시켰다. 상기 PCR 반응물을 주형으로서 사용하여, c-mplNcoI[SEQ ID NO:169] 프라이머 및 아미노산 153에 대한 코돈에 대해 3'에 접하여 중지코돈 및 HindIII 부위를 생성하고 유전자의 C말단에서 프레임내 아미노산 Glu Phe를 암호화하는 3' 프라이머 Eco-mpl [SEQ ID NO:172]을 사용하여 1-153 c-mpl 리간드를 증폭시켰다. 1-153 c-mpl 리간드 PCR 산물을 NcoI 및 EcoRI로 분해하였다. 얻어진 467 염기쌍 NcoI, EcoRI 제한 단편을 계속해서 본 명세서중의 실시예에 기재된 중간 플라스미드에 클로닝시켜 융합 폴리펩티드를 생성하였다.
실시예 66
pMON26460의 구성
플라스미드 pMON13018 DNA를 제한효소 AFlIII 및 HindIII로 분해하여 4023 염기쌍 AflIII, HindIII 단편을 얻었다. 플라스미드 pMON26448 DNA를 NcoI 및 HindIII로 분해하여 468 염기쌍 NcoI, HIndIII 단편을 얻었다. 이 제한단편들을 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을 사용하여 E. coli를 형질전환시켰다. 형질전환 세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하여 제한분석으로 분석하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다.E. coli발현 플라스미드 pMON26460은 다음의 아미노산서열을 암호화한다.
펩티드 # [SEQ ID NO:165]
DNA 서열 # [SEQ ID NO:183]은 상기 pMON26460 폴리펩티드를 암호화한다. 융합체를 암호화하는 유전자를 NcoI, HindIII 단편으로서 포유류 발현벡터 pMON3934에 전이시켰고 얻어진 플라스미드를 pMON26463이라 명명하였다.
실시예 67
pMON26461의 구성
pMON13057로부터의 4029 염기쌍 NcoI, SnaBI 단편을 실시예 65로부터 PCR로 생성된 467 염기쌍 NcoI, EcoRI 단편 및 두 개의 올리고뉴클레오티드 (Ecosnal [SEQ ID NO:173], Ecosna2 [SEQ ID NO:174])와 라이게이션시켰다. 라이게이션 반응혼합물을 사용하여 E. coli를 형질전환시켰다. 형질전환 세균을 암피실린함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 제한분석으로 분석하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다.E. coli발현 플라스미드 pMON26461은 이하의 아미노산 서열을 갖는 융합체를 암호화한다.
뀁티드 # [SEQ ID NO:168]
DNA 서열 # [SEQ ID NO:186]은 상기 pMON26461 폴리펩티드를 암호화한다. 융합체를 암호화하는 유전자를 NcoI, HindIII 단편으로서 포유류 발현벡터 pMON3934에 전이시켰으며 얻어진 플라스미드를 pMON26464라 명명하였다.
실시예 68
pMON26471의 구성
pMON3935로부터의 3285 염기쌍 NcoI, HindIII 단편을 pMON26426으로부터의 362 염기쌍 NcoI, SmaI 제한 단편 및 pMON26460으로부터의 494 염기쌍 SmaI, HindIII 제한단편과 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을 사용하여 E. coli를 형질전환시켰다. 형질전환 세균을 스펙티노마이신 함유 플레이트상에서 선택하였다.
플라스미드 DNA를 분리하고 제한분석으로 분석하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다.E. coli발현 플라스미드 pMON26471은 이하의 아미노산 서열을 갖는 융합체를 암호화한다.
펩티드 # [SEQ ID NO:166]
DNA 서열 # [SEQ ID NO:184]은 상기 pMON26471 폴리펩티드를 암호화한다. 융합체를 암호화하는 유전자를 NcoI, HindIII 단편으로서 포유류 발현벡터 PMON3934에 전이시켰으며 얻어진 플라스미드를 pMON26473라 명명하였다.
실시예 69
pMON26472의 구성
pMON3935로부터의 3285 염기쌍 NcoI, HindIII 단편을 pMON26461로부터의 481 염기쌍 NcoI, SnaBI 제한단편 및 pMON3988로부터의 399 염기쌍 SnaBI, HindIII 제한단편과 라이게이션시키고 라이게이션 반응혼합물을 사용하여 E. coli를 형질전환시켰다.
형질전환 세균을 스펙티노마이신 함유 플레이트상에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 제한분석으로 분석하고 서열화하여 정확한 삽입체를 확인하였다.E. coli발현 플라스미드 pMON26472은 이하의 아미노산 서열을 갖는 융합체를 암호화한다.
펩티드 # [SEQ ID NO:167]
BNA서열 # [SEQ ID NO:185]은 상기 pMON26472 폴리펩티드를 암호화한다.
융합체를 암호화하는 유전자를 NcoI, HindIII 단편으로서 포유류 발현벡터 pMON3934에 전이시켰으며 얻어진 플라스미드를 pMON26474라 명명하였다.
여러가지 다른 실시예는 본 발명의 사상 및 범위에서 벗어나지 않고 본 개시내용을 읽은 후 당업자에게 명백해질 것이다. 모든 그러한 다른 실시예는 첨부된 특허청구의 범위내에 포함되는 것으로 한다.
생활성 인간 인터루킨-3에 대한 AML 증식 측정법
인자-의존성 세포주 AML 193은 아메리칸 타입 걸쳐 컬렉션 (ATCC, 메릴랜드주 록빌)에서 입수하였다. 급성 골수성 백혈병에 걸린 환자로부터 수립된 이 세포주는 GM-CSF 보충 배지에서 향상된 성장을 나타내는 성장인자의존성 세포주이다(Lange, B., et al., (1987); Valtieri, M., et al., (1987)), 인간 IL-3의 존재하에 증식할 수 있는 AML 193 세포의 능력도 또한 기록되었다(Santoli, D., et al., (1987)). 세포주 변이체 AML 193 1.3을 사용하였는데, 이것은 성장인자를 씻어내고 시토카인의존성 AML 193 세포가 24시간 동안 성장인자에 굶주리게 함으로서 IL-3에서의 장기 성장에 적합하도록 하였다. 다음에 세포는 100U/ml IL-3을 함유하는 배지중의 24웰 플레이트에 1×105세포/웰로 재플레이팅한다. 세포가 IL-3에서 급속히 성장하는데는 약 2개월이 걸린다. 그 후 인간 IL-3를 갖는 조직배지(이하 참조)를 보충함으로써 세포를 AML 193 1.3으로서 유지한다.
세포 현탁액을 250×g으로 10분 동안 원심분리한 다음 상청액을 기울여 따름으로써 AML 193 1.3 세포를 차가운 행크스의 평형염류용액(HBSS, Gibco (뉴욕주 그랜드 아일랜드))으로 6회 세척한다. 펠렛화된 세포를 HBSS에 재현탁하고 6회의 세척 사이클이 종료될 때까지 이 과정을 반복한다. 이 과정으로 6회 세척한 세포를 2×105내지 5×105생세포/ml 범위의 밀도로 조직배양배지에 재현탁한라. 이 배지는 Iscove의 변형된 Dulbecco의 배지(IMDM, Hazelton, Lenexa, KS)를 알부민, 트랜스페린, 지질 및 2-메르캅토에탄올로 보충함으로써 제조한다. 소 알부민(Boehringer-Mannheim (인디애나주 인디애나폴리스))은 500 μ/ml로 가하고 인간 트랜스페린(Boehringer-Mannheim (인디애나주 인디애나폴리스))은 100㎍/ml로 가하고 콩 지질(Boehringer-Mannheim(인디애나주 인디애나폴리스))은 50㎍/ml로 가하고 2-메르캅토에탄올(Sigma (미주리주 세인트루이스))은 5×10-5M로 가한다.
인간 인터루킨-3 또는 융합단백질(hIL-3 뮤테인)의 일련의 희석은 96웰 Costar 3596 조직배양 플레이트에서 상기와 같이 보충된 조직배양배지로 3회 연속하여 행한다. 일단 일련의 희석이 완료되면 각 웰은 인터루킨-3 또는 융합단백질을 함유하는 배지 50μl (2.5×104세포) 씩 각 웰에 피펫으로 옮겨서 각 웰에 가한다. 조직배양 플레이트를 3일동안 가습 공기중에서 5% CO2와 함께 37℃에서 배양한다. 3일째에 0.5μCi3H-티미딘 (2Ci/mM, New England Nuclear (매사추세츠주 보스톤))은 조직배양배지 50μl에 가한다. 배양물을 18-24시간 동안 가습공기중에서 5% CO2와 함께 37℃에서 배양한다. 수세척 사이클에 이어 70% 에탄올 세척 사이클을 사용하는 TOMTEC 세포 수거기(TOMTEC (코네티컷주 오렌지))를 사용하여 글라스 필터 매트(Pharmacia LKB (메릴랜드주 게이터스버그))상에 DNA를 수거한다. 필터매트를 공기건조시킨 다음 샘플 주머니에 넣고 여기에 신틸레이션액 (Scintiverse II, Fisher Scientific (미주리주 세인트 루이스) 또는 BetaPlate Scintillation Fluid, Pharmacia LKB (메릴랜드주 게이터스버그))을 가한다. 개개의 조직배양 웰로부터의 샘플의 베타 방출은 LKB 베타 플레이트 모델 1205 신틸레이션 카운터(Pharmacia LkB (메릴랜드주 게이터스버그))로 계수하고 데이타는 각 조직배양 웰로부터 세포에 통합된3H-티미딘의 분당 계수로 표현한다. 각 인간 인터루킨-3제제 또는 융합단백질 제제의 활성은 인터루킨-3 또는 융합단백질의 증가된 농도로 유발된 세포 증식(3H-티미딘 통합)을 측정함으로써 정량화한다. 일반적으로 이들 분석으로 0.05pM-105pM의 농도범위가 정량화된다.
활성은 최대 증식의 50%를 제공하는 인터루킨-3 또는 융합분자의 투여량을 측정함으로써 결정 한다 [EC50= 0.5×(시험한 모든 농도의 인터루킨-3의 3벌 배양물 가운데 웰당 통합된3H-티미딘의 분당 최대평균계수- 인터루킨-3이 결여된 3벌 배양물에서 관찰된3H-티미딘 통합으로 측정한 백그라운드 증식)]. 이 EC50값은 또한 생활성 1 단위와 동등하다. 상대활성레벨이 결정될 수 있도록 모든 측정은 천연 인터루킨-3을 대조표준으로 사용 하여 실시한다.
일반적으로 단백질 융합체는 일련의 2배 희석으로 적정된 2000pM 내지 0.06pM의 농도범위에서 시험하였다. 융합분자의 생활성은 하기와 같이 다음의 대조표준과 비교하였다.
G-CSF, pMON3987, pMON3995, pMON3997, pMON26406, pMON26433, pMON26415, pMON26416, 및 pMON26430으로 일부 구성된 단백질 융합체는 동일 몰 농도의 hG-CSF 및 pMON13288 또는 pMON13416의 투여량 응답곡선과 비교하였다. GM-CSF, pMON3989 및 pMON3998로 일부 구성된 단백질 융합체는 동일 몰농도의 hGM-CSF 및 pMON13288의 투여량 응답곡선과 비교하였다.
HL-3 변이체의 이합체, PMON3988, pMON26425, pMON26427, pMON26420,pMON26429 및 pMON25431로 구성된 단백질 융합체는 pMON13288 또는 pMON13416의 투여량응답곡선과 비교하였다.
각 샘플의 활성은 매개변수 네 개의 로지스틱 모델을 데이타에 맞춤으로써 최대 응답의 50%를 제공하는 농도로 측정하였다. 샘플의 상측 플라토(최대 응답)와 이것과 비교한 대조표준은 상이하지 않았음이 관찰되었다. 따라서 각 샘플에 대한 상대효능의 이론치는 상기한 샘플과 대조표준에 대한 EC50 추정치로 결정하였다.
표 3에 기록된 상대효능(대조표준의 EC50을 샘플의 EC50으로 나눈 것)은 달리 지적하지 않는 한 적어도 두 개의 독립된 분석의 평균이다. AML 193.1.3 세포는 hIL-3, hGM-CSF 및 hG- CSF에 응답하여 증식한다. 따라서 융합단백질의 G-CSF 또는 GM-CSF 부분이 활성이었는지 증명하기 위해 일부 샘플에 대해 이하의 추가 분석을 실시하였다. 증식분석은 pMON13288에 대한 중화 폴리클론성 항체를 사용하여 행하였다. 또한 인자Xa 절단부위를 갖는 융합분자를 절단한 다음 정제하고 분자의 절반을 증식활성에 대해 분석하였다. 이들 실험으로 융합 단백질의 두가지 성분 모두 활성이었음을 알았다.
메틸셀룰로스 측정법
이 분석은 시험관내에서 다른 유형의 조혈 콜로니를 생산하도록 정상 골수 세포를 자극하는 콜로니자극인자 성장활성의 합리적인 근사값을 제공한다(Bradley et al., 1966, Pluznik et al., 1965).
방법
약 30ml의 신선하고 건강한 정상 골수 흡인물을 인간에서 얻는다 멸균 조건하에 샘플을 50ml 원뿔형 튜브(#25339-50 Corning (메릴랜드주 코닝))중에서 1×PBS(#14040.059 Life Technologies (메릴랜드주 게이터스버그))로 1:5 희석한다. 희석된 샘플 아래에 피콜(Histopaue 1077 Sigma H-8889)의 층을 만들고 300×g으로 30분 동안원심분리한다. 단핵세포 밴드를 제거하여 1×PBS로 2회, 1% BSA PBS (CelIPro Co.(워싱톤주 보텔))로 1회 세척한다. 단핵세포를 계수하고 CeprateLC(CD34) Kit (CellPro Co. (워싱톤주 보텔))를 사용하여 CD34+ 세포를 선택한다. 골수내의 모든 간세포 및 전구세포는 CD34 표면항원을 나타내기 때문에 이러한 분획화를 수행한다.
배양물은 35×10mm 페트리 접시(Nunc #174926)에서 최종농도 1.0ml로 세벌 만든다. 배양 배지는 Terry Fox Labs에서 구입한다. HCC-4230 배지(Terry Fox Labs (캐나다 B.C. 밴쿠버)) 및 에리트로포이에틴(Amgen (캘리포니아주 사우즌드 오크스))을 이 배양배지에 가한다. 접시당 3,000-10,000 CD34+ 세포를 가한다. 음성 IL-3 및 융합 분자는 최종농도가 0.001nM 내지 10nM의 범위가 되게 가한다. 천연 IL-3 및 융합분자는 하우스에서, G-CSF(Neupogen)는 Amgen에서 공급받는다.
배양물은 3cc 시린지를 사용하여 재현탁하며 접시당 1.0ml를 사용한다. 콘트롤(베이스라인 응답) 배양물은 콜로니자극인자를 수용하지 않았다. 양성 콘트롤 배양물은 조절된 배지(PHA자극 인간세포: Terry Fox Lab. H2400)를 수용하였다. 배양물은 가습공기중에서 5% CO2와 함께 37℃에서 배양한다. 40배 대물렌즈를 갖는 Nikon 역상 현미경을 사용하여 피크응답일(10-11일)에 세포 50개보다 많은 것으로서 정의되는 조혈콜로니를 계수한다. 세포 50개 미만을 함유하는 세포군을 클러스터라 한다. 대안으로 콜로니는 콜로니를 슬라이드 위에 펼쳐서 염색함으로써 확인할 수도 있고 그것을 골라서 재현탁한 다음 염색용 사이토스핀 슬라이드에 방사할 수도 있다.
인간 제대혈(cord blood) 조혈성장인자의 분석
인간 골수 세포는 조혈콜로니 자극인자(CSF) 활성의 시험관내 측정에 전통적으로 사용되고 있다. 그러나 인간 골수는 항상 입수할 수 없으며 제공자 사이에 상당한 변수가 있다. 제대혈은 조혈간세포 및 전구체의 공급원으로서 골수에 필적한다(Broxmeyer et al., 1992; Mayani et al., 1993). 골수와 달리 제대혈은 규칙적인 원리로 보다 쉽게 입수할 수 있다. 또한 여러명의 제공자에게서 갓 얻은 세포를 모으므로 분석 변수를 줄이거나 또는 이 목적으로 냉동보존된 세포은행을 만들 가능성도 있다. 배양 조건을 수정하거나 및/또는 혈통특이적 마커를 분석함으로써 과립구/대식세포 콜로니(CFU-GM), 거핵구 CSF 활성, 또는 고증식능 콜로니형성세포(HPP-CFC) 활성을 측정하는 것이 가능해야 한다.
방법
표준밀도구배(1.077g/ml Histopaque)를 사용하여 채취 24시간내에 제대혈로부터 단핵세포(MNC)를 분리한다. 제대혈 MNC는 CD14-, CD34+ 세포에 대한 면역자기적 선택; Applied Immune Science (캘리포니아주 산타 클라라)제 피복 플라스크를 사용하는 SBA-, CD34+ 분획에 대한 제정; 및 CellPro (워싱턴주 보텔)제 아비딘 컬럼을 사용하는 CD34+ 선택을 포함하여 몇가지 방법으로 간세포 및 전구체가 더 풍부하게 하였다. 갓 분리하거나 냉동보존된 CD34+ 세포를 풍부하게 한 분획을 측정에 사용한다. 일련의 각 샘플 희석을 위한 2벌의 배양물(농도 범위 1pM 내지 1204pM)은 추가의 성장인자없는 1ml의 0.9% 메틸셀룰로스함유 배지중의 1×104세포(Stem Cell Technologies (브리티시 컬럼비아주 밴쿠버)제 Methocult H4230)로제조한다. 일부실험에서는 Methocult H4230 대신에 에리트로포이에틴(EPO)을 함유하는 Methocult H4330을 사용하거나, 또는 간세포인자(SCF) 50ng/ml (Biosource International (캘리포니아주 캐머릴로))를 가하였다. 7-9일 배양후 30개를 초과하는 세포를 함유하는 콜로니를 계수한다. 기록할 때 주관적인 선입관을 없애기 위해 측정은 익명으로 기록한다.
c-mpl 리간드 증식활성의 분석
방법
1. 골수 증식 측정법
a. CD34+ 세포정제:
15-20ml의 골수 흡인물을 정상의 동종 골수 제공자에게서 승낙을 받은 후 얻었다. 세포를 인산완충용액(PBS, Gibco-BRL)으로 1:3 희석하고 30ml를 Histspasue-1077(Sigma) 15ml 위에 쌓고 300RCF에서 30분 동안 원심분리하였다. 단핵 계면층을 수집하여 PBS로 세척하였다. 제조업자의 지시대로 친화성 컬럼을 사용하여 단핵세포제제에 CD34+ 세포가 풍부하게 하였다(CellPro, Inc. (워싱턴주 보텔)). 풍부하게 한후 CD34+ 세포의 순도는 플루오레세인에 콘쥬게이트된 항 CD34 모노클론성 항체 및 피코에리트린에 콘쥬게이트된 항 CD38을 사용하는 유동세포계측 분석법을 사용하여 측정할 때 평균 70%였다(Becton Dickinson (캘리포니아주 산호세)).
세포를 X-Vivo 10 배지 (Bio-Whittaker (메릴랜드주 월커스빌))에 40,000 세포/ml로 재현탁하고 1ml를 12웰 조직배양 플레이트(Costar)에 플레이팅하였다. 성장인자 rhIL-3을 일부 배지에 100ng/ml (pMON5873)로 가하였다. hIL3 변이체pMON13288은 10ng/ml 또는 100ng/ml로 사용하였다. 배양물(약 10% 회석물) 1ml에 상청액 100μl를 가하여 c-mpl 리간드를 암호화하는 플라스미드로 형질감염된 BHK로부터의 조절배지를 시험하였다. 세포는 37℃의 가습 배양기에서 5% CO2에서 8-14일 동안 37℃에서 배양하였다.
b. 세포 수거 및 분석:
배양기간 말기에 각 조건에 대한 총 세포계수를 얻었다. 형광분석 및 배수성 측정을 위해 세포를 거핵구 완충액(MK 완충액, 13.6mM 시트르산나트륨, 1mM 테오필린, 2.2μm PGE1, 11mM 글루코스, 3% w/v BSA, PBS중, pH 7.4) [Tomer et al., (1987)]으로 세척하고 항-CD4la FITC 항체(1:200, AMAC (메인주 웨스트브록))를 함유하는 MK 완충액 500μl에 재현탁하고 MK 완충액으로 세척하였다. DNA 분석을 위해 세포를 얼음상에서 20분 동안 0.5% Tween 20(Fisher (뉴저지주 페어 론))을 함유하는 MK 완충액에 침투시킨 다음 30분동안 0.5% Tween-20 및 1% 파라포름알데히드(Fisher Chemical)에서 고정시키고 이어서 얼음상에서 1-2시간 동안 55% v/v MK 완충액(200mOsm)중에서 RNA아제(400U/ml)와 함께 프로피듐 요오다이드(Calbiochem (캘리포니아주 라 졸라))(50㎍/㎖)에서 배양하였다. 세포를 FACScan 또는 Vantage 유동세포 계측기 (Becton Dickinson (캘리포니아주 산호세))로 분석하였다. 녹색 형광물(CD41a-FITC)을 적색 형광물(PI)에 대한 선형 및 로그 신호과 함께 수집하여 DNA 배수성을 측정하였다. 모든 세포를 수집하여 CD41+인 세포의 백분율을 결정하였다. 데이타 분석은 LYSIS (Becton Dickinson (캘리포니아주 산호세))에 의해 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. CD41 항원을 발현하는 세포의 백분율은 유동세포계측 분석법으로 얻었다 (퍼센트). CD41+ 세포/ml의 절대(Abs)수는 (Abs)= (세포 계수)*(퍼센트)/100으로 계산하였다.
2. 거핵구 피브린 응괴 측정법.
CD34+를 풍부하게 한 집단을 상기와 같이 분리하였다. 세포를 0.3% BSA, 0.4mg/ml 아포-프랜스페린, 6.67μM FeCl2, 25㎍/ml CaCl2, 25㎍/ml L-아스파라긴, 500㎍/ml E-아미노-n-카프로산 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 베이스 Iscoves IMDM 배지로 구성된 배지에 시토카인(들)과 함께 또는 그것없이 25,000 세포/ml로 현탁하였다. 35mm 플레이트에 플레이팅하기 전에 트롬빈을 가하여(0.25단위/ml) 응괴 형성을 개시하였다. 세포는 37℃ 가습 배양기에서 5% CO2에서 13일 동안 37℃에서 배양하였다.
배양기간 말기에 플레이트를 메탄올:아세톤(1:3)으로 고정시키고 공기건조시키고 염색할 때까지 -200℃에서 저장하였다. 항 CD41a, CD42 및 CD61로 구성된 1차 모노클론성 항체 칵테일을 사용하는 과산화효소 면역세포화학 염색방법을 사용하였다(Zymed, Histostain-SP. (캘리포니아주 샌프란시스코)). 염색후 콜로니를 계수하고 음성, CFU-MK (작은 콜로니, 초점 1-2개, 세포 약 25개 미만), BFU-MK (큰 다초점 콜로니, 세포25개 초과) 또는 혼합 콜로니(양성 세포와 음성 세포의 혼합물)로 분류하였다.
실시예 70
어느 시토카인 단독에 의한 것보다도 거핵구 팽창에 더 부가적인 영향을 미치는 hIL-3 변이체 pMON13288 및 c-mpl 리간드 융합단백질의 투여
거핵구 피브린 응괴 배양물은 방법난에 기재한 바와 같이 만들었다. pMON26448은 1-153 아미노산형의 c-mpl 리간드(Meg-CSF)이다. pMON26463은 hIL3 변이체 pMON13288 및 1-153 아미노산형의 c-mpl 리간드로 구성된 융합분자이다. hIL3 변이체 pMON13288 존재하의 배양은 다수의 작은 CFU-MK 콜로니(23/114)를 제외하고는 거핵구 마커에 대해 주로 음성인 콜로니(86/114 (표 4))를 생성하였다. pMON26448만으로는 주로 CFU-MK 콜로니(172/175)가 생성되고 음성 콜로니(3/175)는 소수뿐이었다. hIL3 변이체 pMON13288 및 pMON26448의 조합물은 주로 BFU-MK 형태인 다수의 양성 콜로니(295/414)를 생성하였다. 음성 콜로니도 물론 있었다(119/414). 공동 투여한 양성 콜로니의 총수는 어느 시토카인 단독에 의한 것보다 더 많았다. 음성 세포의 수는 hIL3 변이체 pMON13288에 의한 것보다 적었는데 이것은 아마 제제중의 pMON13288의 농도가 낮기 때문인 것같다(융합분자의 일부로서 약 10ng/ml 대 hIL3 변이체 pMON13288 100ng/ml).
인간 단핵세포로부터의 IL-3 매개 술피도루코트리엔 방출
인간 단핵세포로부터의 IL-3 매개 술피도루코트리엔 방출을 측정하는데 다음 측정법을 사용하였다.
혜파린함유 인간혈액을 채취하여 쉽게 배지(밀도 1.077g/ml)로 사용할 수 있는 같은 부피의 Ficoll-Paque (Pharmacia #17-0840-02) 위에 층을 이룬다. Ficoll은 사용하기 전에 실온으로 가온하고 깨끗한 50ml 폴리스티렌 튜브를 사용한다. 'Ficoll 구배는 Sorvall RT6000B 냉각된 원심분리기에서 H1000B 로터를 사용하여 실온에서 30분 동안 300×g으로 회전시킨다. 단핵 세포를 함유하는 밴드를 주의하여 제거하고 부피를 Dulbecco의 인산완충용액(Gibco Laboratories cat. #310-4040Pk)으로 50ml가 되게 조절하고 4℃에서 10분 동안 400×g으로 회전시키고 상청액을 주의하여 제거한다. 세포 펠렛을 HA 완충액 [20mM 혜페스 (Sigma # H-3375), 125mM NaCl (Fisher #S271-500), 5mM KCl (Sigma # P-9541), 0.5mM 글루코스 (Sigma # G-5000), 0.025% 인간혈청알부민 (Calbiochem # 126654)]으로 2회 세척하고 4℃에서 10분 300×g으로 회전시킨다. 세포를 HACM 완충액(1mM CaCl2(Fisher # C79-500) 및 1mM MgCl2(Fisher # M-33)를 첨가한 HA 완충액)에 1×106세포/ml의 농도로 재현탁하고 180μl를 96웰 조직배양 플레이트의 각 웰에 옮긴다. 세포를 15분 동안 37℃에서 순화시킨다. 각 웰에 여러 농도의 시토카인의 20배 원료(일반적으로 100000, 20000, 4000, 800, 160, 32, 6.4, 1.28, 0 fM IL3) 10μ1를 가하여 세포를 기폭시킨다. 세포를 37℃에서 15분 동안 배양한다. 20배(1000nM) fmet-leu-phe (Calbiochem # 344252) 10μl를 최종농도가 50nM FMLP가 되게 첨가하여 술피도루코트리엔 방출을 활성화하고 37℃에서 10분 배양한다. 플레이트를 20분동안 4℃에서 350×g으로 회전시킨다. 상청액을 제거하고 제조업자의 지시에 따라 Cayman's Leukotriene C4 EIA 키트 (Cat. #420211)를 사용 하여 술피도루코트리엔에 대해 측정한다. 각 측정에서 천연 hIL-3는 표준 콘트롤로서 작용한다.
당업자에게 공지된 더 이상의 상세내용은 여기에 참고로 포함된 T Maniatis, et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)와 거기에 인용된 참조문헌 및 여기에 참고로 포함된 J. Sambrook, et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring HarborLaboratory (1989)와 거기에 인용된 참조문헌에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 IL-3 변이체에 관한 추가의 상세내용은 마치 여기에 기재된 것처럼 전부 여기에 참고로 포함된 함께 계류중의 미국 특허출원 번호 PCT/US93/11197에서 찾아볼 수 있다.
융합 단백질의 제조방법에 관한 추가의 상세내용은 WO 92/04455 및 WO 91/02754에서 찾아볼 수 있다.
림포카인 및 그 변이체에 관한 추가의 상세내용은 미국특허 4,810,643 및 5,218,092와 유럽출원 02174004에서 찾아볼 수 있다.
여기에 인용된 모든 참조문헌, 특허 또는 출원은 마치 여기에 기재된 것처럼 전부 참고로 포함되어 있다.
아미노산은 다음과 같은 한글자 또는 세글자의 표준 약명으로 나타낸다.
서열목록
(1) 일반정보
(i) 출원인
(A) 명칭 : 지. 디. 썰 앤드 컴파니
(B) 거리 : 피. 오. 박스 5110
(C) 시 : 시카고
(D) 주 : 일리노이
(I) 국명 : 미합중국
(F) 우편번호 : 60680
(G) 전화번호 : (708) 470-6501
(H) 텔레팩스 : (708) 470-6881
(A) 명칭 : 몬산토 컴파니
(B) 거리 : 노스 린드버그 블러버드 800
(C) 시 : 세인트 루이스
(D) 주 : 미주리
(I) 국명 : 미합중국
(F) 우편번호 : 63167
(G) 전화번호 : (314) 694-3131
(H) 텔레팩스 : (314) 694-5435
(ii) 발명의 명칭 : 다중변이체 IL-3 조혈 융합 단백질
(iii) 서열의 수 : 196
(iv) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종
(C) 운영 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
(vi) 선출원 데이타 :
(A) 출원번호 : US OS/192325
(B) 출원일 : 1994. 2. 14
(2) SEQ ID NO : 1에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 133 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(ix) 특징
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 1
(D) 기타정보 : /주="Met-가 위치 1의 아미노산에 선행할 수도 안할 수도 있다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 17
(D) 기타정보 : /주="위치 17에서의 Xaa는 Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 18
(D) 기타정보 : /주="위치 18에서의 Xaa는 Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 19
(D) 기타정보 : /주="위치 19에서의 Xaa는 Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala, 또는 Cys 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 20
(D) 기타정보 : /주="위치 20에서의 Xaa는 Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro, 또는 Ala 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 21
(D) 기타정보 : /주="위치 21에서의 Xaa는 Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, Glu, Gln, Asn, Thr, Ser또는 Val 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 22
(D) 기타정보 : /주="위치 22에서의 Xaa는 Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu, Val, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 23
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(ix) 특징 :
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(B) 위치 : 24
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(ix) 특징 :
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(ix) 특징 :
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(ix) 특징 :
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(B) 위치 : 30
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(ix) 특징 :
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(ix) 특징 :
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(B) 위치 : 35
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(ix) 특징 :
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(ix) 특징 :
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(ix) 특징 :
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(ix) 특징 :
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(ix) 특징 :
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(ix) 특징 :
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(ix) 특징 :
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(ix) 특징 :
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(ix) 특징 :
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(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 54
(D) 기타정보 : /주="위치 54에서의 Xaa는 Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, HiS, Ala, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 55
(D) 기타정보 : /주="위치 55에서의 Xaa는 Arg, Thr, Val, Ser, Leu, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 56
(D) 기타정보 : /주="위치 56에서의 Xaa는 Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, Arg, His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, Val, 또는 Lys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 57
(D) 기타정보 : /주="위치 57에서의 Xaa는 Asn, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 58
(D) 기타정보 : /주="위치 58에서의 Xaa는 Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val, 또는 Cys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 59
(D) 기타정보 : /주="위치 59에서와 Xaa는 Glu, Tyr, His, Leu, Pro, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 60
(D) 기타정보 : /주="위치 60에서의 Xaa는 Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 61
(D) 기타정보 : /주="위치 61에서의 Xaa는 Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 62
(D) 기타정보 : /주="위치 62에서의 Xaa는 Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, Asp, 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 63
(D) 기타정보 : /주="위치 63에서의 Xaa는 Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, Pro, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 64
(D) 기타정보 : /주="위치 64에서의 Xaa는 Ala, Asn, Pro, Ser, 또는 Lys, 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 65
(D) 기타정보 : /주="위치 65에서의 Xaa는 Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 66
(D) 기타정보 : /주="위치 66에서의 Xaa는 Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 67
(D) 기타정보 : /주="위치 67에서의 Xaa는 Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, Ile, Pro, 또는 His이다.
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 68
(D) 기타정보 : /주="위치 68에서의 Xaa는 Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, Thr, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 69
(D) 기타정보 : /주="위치 69에서의 Xaa는 Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 70
(D) 기타정보 : /주="위치 70에서의 Xaa는 Asn, Leu, Val, Trp, Pro, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 71
(D) 기타정보 : /주="위치 71에서의 Xaa는 Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, Thr, Gln, Trp, 또는 Asn이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 72
(D) 기타정보 : /주="위치 72에서의 Xaa는 Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, Arg, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 73
(D) 기타정보 : /주="위치 73에서의 Xaa는 Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, Thr, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 74
(D) 기타정보 : /주="위치 74에서의 Xaa는 Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 75
(D) 기타정보 : /주="위치 75에서의 Xaa는 Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 76
(D) 기타정보 : /주="위치 76에서의 Xaa는 Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 77
(B) 기타정보 : /주="위치 77에서의 Xaa는 Ile, Ser, Arg, Thr, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 78
(D) 기타정보 : /주="위치 78에서의 Xaa는 Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 79
(D) 기타정보 : /주="위치 79에서의 Xaa는 Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, Gly, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 80
(D) 기타정보 : /주="위치 80에서의 Xaa는 Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, Glu, 또는 Arg이다.
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 81
(D) 기타정보 : /주="위치 81에서의 Xaa는 Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, Val, 또는 Lys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 82
(D) 기타정보 : /주="위치 82에서의 Xaa는 Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, Met, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 83
(D) 기타정보 : /주="위치 83에서의 Xaa는 Pro, Ala, Thr, Trp, Arg, 또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 84
(D) 기타정보 : /주="위치 84에서의 Xaa는 Cys, Glu, Gly, Arg, Met, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 85
(D) 기타정보 : /주="위치 85에서의 Xaa는 Leu, Asn, Val, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 86
(D) 기타정보 : /주="위치 86에서의 Xaa는 Pro, Cys, Arg, Ala, 또는 Lys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 87
(D) 기타정보 : /주="위치 87에서의 Xaa는 Leu, Ser, Trp, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 88
(D) 기타정보 : /주="위치 88에서의 Xaa는 Ala, Lys, Arg, Val, 또는 Trp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 89
(D) 기타정보 : /주="위치 89에서의 Xaa는 Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, His, Asn, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 90
(D) 기타정보 : /주="위치 91에서의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp Ile, 또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 91
(D) 기타정보 : /주="위치 91에서의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Asp, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 92
(D) 기타정보 : /주="위치 92에서의 Xaa는 Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 93
(D) 기타정보 : /주="위치 93에서의 Xaa는 Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, Leu, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 94
(D) 기타정보 : /주="위치 94에서의 Xaa는 Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 95
(D) 기타정보 : /주="위치 95에서의 Xaa는 His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile, 또는 Tyr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 96
(B) 기타정보 : /주="위치 96에서의 Xaa는 Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 97
(D) 기타정보 : /주="위치 97에서의 Xaa는 Ile, Val, Lys, Ala, 또는 Asn이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 98
(D) 기타정보 : /주="위치 98에서의 Xaa는 His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, Thr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, Tyr, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 99
(D) 기타정보 : /주="위치 99에서의 Xaa는 Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, Gln, Gly, Ser, Phe, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 100
(D) 기타정보 : /주="위치 100에서의 Xaa는 Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 101
(D) 기타정보 : /주="위치 101에서의 Xaa는 Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 102
(D) 기타정보 : /주="위치 102에서의 Xaa는 Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 103
(D) 기타정보 : /주="위치 103에서의 Xaa는 Asp, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 104
(D) 기타정보 : /주="위치 104에서의 Xaa는 Trp, Val, Cys, Tyr, Met, Pro,Leu, Gln, Lys, Ala, Phe, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 105
(D) 기타정보 : /주="위치 105에서의 Xaa는 Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 106
(D) 기타정보 : /주="위치 106에서의 Xaa는 Glu, Ser, Ala, Lys, Ile, Gly, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 108
(D) 기타정보 : /주="위치 108에서의 Xaa는 Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modilied-site
(B) 위치 : 109
(D) 기타정보 : /주="위치 109에서의 Xaa는 Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu,Ser, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 110
(D) 기타정보 : /주="위치 110에서의 Xaa는 Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser, Ala, 또는 Trp 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 111
(D) 기타정보 : /주="위치 111에서의 Xaa는 Leu, Ile, Arg, Asp 또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 112
(D) 기타정보 : /주="위치 112에서의 Xaa는 Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser, 또는 Phe이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 113
(D) 기타정보 : /주="위치 113에서의 Xaa는 Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp,Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val, 또는 Asn이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 114
(D) 기타정보 : /주="위치 114에서의 Xaa는 Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 115
(D) 기타정보 : /주="위치 115에서의 Xaa는 Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp, 또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 116
(D) 기타정보 : /주="위치 116에서의 Xaa는 Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln, 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modilled-site
(B) 위치 : 117
(D) 기타정보 : /주="위치 117에서의 Xaa는 Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys,또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 118
(D) 기타정보 : /주="위치 118에서의 Xaa는 Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp, 또는 Tyr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 119
(D) 기타정보 : /주="위치 119에서의 Xaa는 Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 120
(D) 기타정보 : /주="위치 120에서의 Xaa는 Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 121
(D) 기타정보 : /주="위치 121에서의 Xaa는 Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys,Asp, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 122
(D) 기타정보 : /주="위치 122에서의 Xaa는 Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr, 또는 Cys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 123
(D) 기타정보 : /주="위치 123에서의 Xaa는 Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr, 또는 Leu이다"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 1 :
(2) SEQ ID NO : 2에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 133 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modilfied-site
(B) 위치 : 1
(D) 기타정보 : /주="Met-가 위치 1의 아미노산에 선행할 수도 안할 수도 있다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 17
(D) 기타정보 : /주="위치 17에서의 Xaa는 Ser, Gly, Asp, Met, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 18
(D) 기타정보 : /주="위치 18에서의 Xaa는 Asn, His, 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 19
(D) 기타정보 : /주="위치 19에서의 Xaa는 Met, 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 21
(D) 기타정보 : /주="위치 21에서의 Xaa는 Asp, 또는 Glu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 23
(D) 기타정보 : /주="위치 23에서의 Xaa는 Ile, Ala, Leu, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 24
(D) 기타정보 : /주="위치 24에서의 Xaa는 Ile, Val, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 25
(D) 기타정보 : /주="위치 25에서의 Xaa는 Thr, His, Gln, 또는 Ala이다"
(ix) 특징
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 26
(D) 기타정보 : /주="위치 26에서의 Xaa는 His, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 29
(D) 기타정보 : /주="위치 29에서의 Xaa는 Gln, Asn, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 30
(D) 기타정보 : /주="위치 30에서의 Xaa는 Pro, Gly, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 31
(D) 기타정보 : /주="위치 31에서의 Xaa는 Pro, Asp, Gly, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 32
(D) 기타정보 : /주="위치 32에서의 Xaa는 Leu, Arg, Gln, Asn, Gly, Ala, 또는 Glu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 33
(D) 기타정보 : /주="위치 33에서의 Xaa는 Pro, 또는 Glu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 34
(D) 기타정보 : /주="위치 34에서의 Xaa는 Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Ala, Arg, Gln, Glu, Ile, Phe, Thr, 또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 35
(D) 기타정보 : /주="위치 35에서의 Xaa는 Leu, Ala, Asn, Pro, Gln, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 37
(D) 기타정보 : /주="위치 37에서의 Xaa는 Phe, Ser, Pro, 또는 Trp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 38
(D) 기타정보 : /주="위치 38에서의 Xaa는 Asn, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 42
(D) 기타정보 : /주="위치 42에서의 Xaa는 Gly, Asp, Ser, Cys, Ala, Asn, Ile, Leu, Met, Tyr, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 44
(D) 기타정보 : /주="위치 44에서의 Xaa는 Asp, 또는 Glu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 45
(D) 기타정보 : /주="위치 45에서의 Xaa는 Gln, Val, Met, Leu, Thr, Ala, Asn, Glu, Ser, 또는 Lys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 46
(D) 기타정보 : /주="위치 46에서의 Xaa는 Asp, Phe, Ser, Thr, Ala, Asn, Gln, Glu, His, Ile, Lys, Tyr, Val, 또는 Cys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 50
(D) 기타정보 : /주="위치 50에서의 Xaa는 Glu, Ala, Asn, Ser, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 51
(D) 기타정보 . /주="위치 51에서의 Xaa는 Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 54
(D) 기타정보 : /주="위치 54에서의 Xaa는 Arg, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modifled-site
(B) 위치 : 55
(D) 기타정보 : /주="위치 55에서의 Xaa는 Arg, Thr, Val, Leu, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 56
(D) 기타정보 /주="위치 56에서의 Xaa는 Pro, Gly, Ser, Gln, Ala, Arg, Asn, Glu, Leu, Thr, Val, 또는 Lys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 60
(D) 기타정보 · /주="위치 60에서의 Xaa는 Ala, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 62
(D) 기타정보 : /주="위치 62에서의 Xaa는 Asn, Pro, Thr 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 63
(D) 기타정보 : /주="위치 63에서의 Xaa는 Arg, 또는 Lys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 64
(D) 기타정보 : /주="위치 64에서의 Xaa는 Ala, 또는 Asn이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 65
(D) 기타정보 : /주="위치 65에서의 Xaa는 Val, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 66
(D) 기타정보 /주="위치 66에서의 Xaa는 Lys, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 67
(D) 기타정보 : /주="위치 67에서의 Xaa는 Ser, Phe 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 68
(D) 기타정보 : /주="위치 68에서의 Xaa는 Leu, Ile, Phe, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 69
(D) 기타정보 : /주="위치 69에서의 Xaa는 Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 71
(D) 기타정보 : /주="위치 71에서의 Xaa는 Ala, Pro, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 72
(D) 기타정보 : /주="위치 72에서의 Xaa는 Ser, Glu, Arg, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 73
(D) 기타정보 : /주="위치 73에서의 Xaa는 Ala, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 76
(D) 기타정보 : /주="위치 76에서의 Xaa는 Ser, Val, Ala, Asn, Glu, Pro, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 77
(D) 기타정보 : /주="위치 77에서의 Xaa는 Ile, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 79
(D) 기타정보 : /주="위치 79에서의 Xaa는 Lys, Thr, Gly, Asn, Met, Arg, Ile, Gly, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 80
(D) 기타정보 : /주="위치 80에서의 Xaa는 Asn, Gly, Glu, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 82
(D) 기타정보 : /주="위치 82에서의 Xaa는 Leu, Gln, Trp, Arg, Asp, Ala, Asn, Gly, His, Ile, Met, Phe, Ser, Thr, Tyr, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 83
(D) 기타정보 : /주="위치 83에서의 Xaa는 Pro, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 85
(D) 기타정보 : /주="위치 85에서의 Xaa는 Leu, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 87
(D) 기타정보 : /주="위치 87에서의 Xaa는 Leu, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 88
(D) 기타정보 : /주="위치 88에서의 Xaa는 Ala, 또는 Trp, 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 91
(D) 기타정보 : /주="위치 91에서의 Xaa는 Ala, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 93
(D) 기타정보 : /주="위치 93에서의 Xaa는 Thr, Asp, Ser, Pro, Ala, Leu, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 95
(D) 기타정보 : /주="위치 95에서의 Xaa는 His, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Asn, Phe, Ser, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 96
(D) 기타정보 /주="위치 96에서의 Xaa는 Pro, 또는 Tyr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 97
(D) 기타정보 : /주="위치 97에서의 Xaa는 Ile, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 98
(D) 기타정보 : /주="위치 98에서의 Xaa는 His, Ile, Asn, Leu, Ala, Thr, Arg, Gln, Lys, Met, Ser, Tyr, Val, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 99
(D) 기타정보 : /주="위치 99에서의 Xaa는 Ile, Leu, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 100
(D) 기타정보 : /주="위치 100에서의 Xaa는 Lys, Arg, Ile, Gln, Pro, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 101
(D) 기타정보 : /주="위치 101에서의 Xaa는 Asp, Pro, Met, Lys, Thr, His, Asn, Ile, Leu, 또는 Tyr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 104
(D) 기타정보 : /주="위치 104에서의 Xaa는 Trp, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 105
(D) 기타정보 : /주="위치 105에서의 Xaa는 Asn, Pro, Ala, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 106
(D) 기타정보 : /주="위치 106에서의 Xaa는 Glu, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 108
(D) 기타정보 : /주="위치 108에서의 Xaa는 Arg, Ala, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 109
(D) 기타정보 : /주="위치 109에서의 Xaa는 Arg, Thr, Glu, Leu, 또는 Ser, 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 112
(D) 기타정보 : /주="위치 112에서의 Xaa는 Thr, Val, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 114
(D) 기타정보 : /주="위치 114에서의 Xaa는 Tyr, 또는 Trp 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 115
(D) 기타정보 : /주="위치 115에서의 Xaa는 Leu, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 116
(D) 기타정보 : /주="위치 116에서의 Xaa는 Lys, Thr, Val, Trp, Ser, Ala, His, Met, Phe, Tyr, 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 117
(D) 기타정보 : /주="위치 117에서의 Xaa는 Thr, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 120
(D) 기타정보 : /주="위치 120에서의 Xaa는 Asn, Pro, Leu, His, Val, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 121
(D) 기타정보 : /주="위치 121에서의 Xaa는 Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Asp, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 122
(D) 기타정보 : /주="위치 122에서의 Xaa는 Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr, 또는 Cys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 123
(D) 기타정보 : /주="위치 123에서의 Xaa는 Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr, 또는 Leu이다"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 2 :
(2) SEQ ID NO : 3에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 133 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 1
(D) 기타정보 : /주="Met-가 위치 1의 아미노산에 선행할 수도 안할 수도 있다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 17
(D) 기타정보 : /주="위치 17에서의 Xaa는 Ser, Gly, Asp, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 18
(D) 기타정보 : /주="위치 18에서의 Xaa는 Asn, His 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 23
(D) 기타정보 : /주="위치 23에서의 Xaa는 Ile, Ala, Leu, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 25
(D) 기타정보 : /주="위치 25에서의 Xaa는 Thr, His, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 26
(D) 기타정보 : /주="위치 26에서의 Xaa는 His, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 29
(D) 기타정보 : /주="위치 29에서의 Xaa는 Gln 또는 Asn이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 30
(D) 기타정보 : /주="위치 30에서의 Xaa는 Pro, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 32
(D) 기타정보 : /주="위치 32에서의 Xaa는 Leu, Arg, Asn, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 34
(D) 기타정보 : /주="위치 34에서의 Xaa는 Leu, Val, Ser, Ala, Arg, Gln, Glu, Ile, Phe, Thr, 또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 35
(D) 기타정보 : /주="위치 35에서의 Xaa는 Leu, Ala, Asn, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 38
(B) 기타정보 : /주="위치 38에서의 Xaa는 Asn, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 42
(D) 기타정보 : /주="위치 42에서의 Xaa는 Gly, Asp, Ser, Ala, Asn, Ile, Leu, Met, Tyr, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 45
(D) 기타정보 : /주="위치 45에서의 Xaa는 Gln, Val, Met, Leu, Ala, Asn,
Glu, 또는 Lys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 46
(D) 기타정보 : /주="위치 46에서의 Xaa는 Asp, Phe, Ser, Gln, Glu, His, Val, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 50
(D) 기타정보 : /주="위치 50에서의 Xaa는 Glu, Asn, Ser, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 51
(D) 기타정보 : /주="위치 51에서의 Xaa는 Asn, Arg, Pro, Thr, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 55
(D) 기타정보 : /주="위치 55에서의 Xaa는 Arg, Leu, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 56
(D) 기타정보 : /주="위치 56에서의 Xaa는 Pro, Gly, Ser, Ala, Asn, Val, Leu, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 62
(D) 기타정보 : /주="위치 62에서의 Xaa는 Asn, Pro, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 64
(D) 기타정보 : /주="위치 64에서의 Xaa는 Ala, 또는 Asn이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 65
(D) 기타정보 : /주="위치 65에서의 Xaa는 Val, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 67
(D) 기타정보 : /주="위치 67에서의 Xaa는 Ser, 또는 Phe이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 68
(D) 기타정보 : /주="위치 68에서의 Xaa는 Leu, 또는 Phe이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 69
(D) 기타정보 : /주="위치 69에서의 Xaa는 Gln, Ala, Glu, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 76
(D) 기타정보 : /주="위치 76에서의 Xaa는 Ser, Val, Asn, Pro, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 77
(D) 기타정보 : /주="위치 77에서의 Xaa는 Ile, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 79
(D) 기타정보 : /주="위치 79에서의 Xaa는 Lys, Asn, Met, Arg, Ile, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 80
(D) 기타정보 : /주="위치 80에서의 Xaa는 Asn, Gly, Glu, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 82
(D) 기타정보 : /주="위치 82에서의 Xaa는 Leu, Gln, Trp, Arg, Asp, Asn, Glu, His, Met, Phe, Ser, Thr, Tyr, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 87
(D) 기타정보 : /주="위치 87에서의 Xaa는 Leu, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 88
(D) 기타정보 : /주="위치 88에서의 Xaa는 Ala, 또는 Trp, 이다.
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 91
(D) 기타정보 : /주="위치 91에서의 Xaa는 Ala, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 93
(D) 기타정보 : /주="위치 93에서의 Xaa는 Thr, Asp, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 95
(D) 기타정보 : /주="위치 95에서의 Xaa는 His, Pro, Arg, Val, Gly, Asn, Ser, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 98
(D) 기타정보 : /주="위치 98에서의 Xaa는 His, Ile, Asn, Ala, Thr, Gln, Glu, Lys, Met, Ser, Tyr, Val, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 99
(D) 기타정보 : /주="위치 99에서의 Xaa는 Ile, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 100
(D) 기타정보 : /주="위치 100에서의 Xaa는 Lys, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 101
(D) 기타정보 : /주="위치 101에서의 Xaa는 Asp, Pro, Met, Lys, Thr, His, Asn, Ile, Leu, 또는 Tyr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 105
(D) 기타정보 : /주="위치 105에서의 Xaa는 Asn, Pro, Ser, Ile, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 108
(D) 기타정보 : /주="위치 108에서의 Xaa는 Arg, Ala, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 109
(D) 기타정보 : /주="위치 109에서의 Xaa는 Arg, Thr, Glu, Leu, 또는 Ser, 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 112
(D) 기타정보 : /주="위치 112에서의 Xaa는 Thr, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 116
(D) 기타정보 : /주="위치 116에서의 Xaa는 Lys, Val, Trp, Ala, His, Phe, Tyr, 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 117
(D) 기타정보 : /주="위치 117에서의 Xaa는 Thr, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 120
(D) 기타정보 : /주="위치 120에서의 Xaa는 Asn, Pro, Leu, His, Val, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 121
(D) 기타정보 : /주="위치 121에서의 Xaa는 Ala, Ser, Ile, Pro, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 122
(D) 기타정보 : /주="위치 122에서의 Xaa는 Gln, Met, Trp, Pro, Phe, His, Ile, 또는 Tyr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 123
(D) 기타정보 : /주="위치 123에서의 Xaa는 Ala, Met, Glu, Ser, 또는 Leu이다"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 3 :
(2) SEQ ID NO : 4에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 1
(D) 기타정보 : /주="Met-또는 Met-Ala-가 위치 1의 아미노산에 선행할수도안할 수도 있다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 3
(D) 기타정보 : /주="위치 3에서의 Xaa는 Ser, Lys, Gly, Met, Gln, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 4
(D) 기타정보 : /주="위치 4에서의 Xaa는 Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 5
(D) 기타정보 : /주="위치 5에서의 Xaa는 Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala, 또는 Cys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 6
(D) 기타정보 : /주="위치 6에서의 Xaa는 Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 7
(D) 기타정보 : /주="위치 7에서의 Xaa는 Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, Glu, Asn, Thr, Ser, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 8
(D) 기타정보 : /주="위치 8에서의 Xaa는 Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu, Val, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 9
(D) 기타정보 : /주="위치 9에서의 Xaa는 Ile, Val, Ala, Leu, Gly, Trp, Lys, Phe, Leu, Ser, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 10
(D) 기타정보 : /주="위치 10에서의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe,또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 11
(D) 기타정보 : /주="위치 11에서의 Xaa는 Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 12
(D) 기타정보 : /주="위치 12에서의 Xaa는 His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala, 또는 Trp 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 13
(D) 기타정보 : /주="위치 13에서의 Xaa는 Leu, Gly, Arg, Thr, Ser, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 14
(D) 기타정보 : /주="위치 14에서의 Xaa는 Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro,Val, 또는 Trp 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 15
(D) 기타정보 : /주="위치 15에서의 Xaa는 Gln, Asn, Leu, Pro, Arg, 또는, Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 16
(D) 기타정보 : /주="위치 16에서의 Xaa는 Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, Ser, Leu, 또는 Lys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 17
(D) 기타정보 : /주="위치 17에서의 Xaa는 Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 18
(D) 기타정보 : /주="위치 18에서의 Xaa는 Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly,Ala, 또는 Glu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 19
(D) 기타정보 : /주="위치 19에서의 Xaa는 Pro, Leu, Gln, Ala, Thr, 또는 Glu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 20
(D) 기타정보 : /주="위치 20에서의 Xaa는 Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, Gln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile, 또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 21
(D) 기타정보 : /주="위치 21에서의 Xaa는 Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 22
(D) 기타정보 : /주="위치 22에서의 Xaa는 Asp, Leu, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 23
(D) 기타정보 : /주="위치 23에서의 Xaa는 Phe, Ser, Pro, Trp, 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 24
(D) 기타정보 : /주="위치 24에서의 Xaa는 Asn, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 26
(D) 기타정보 : /주="위치 26에서의 Xaa는 Leu, Trp, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 27
(D) 기타정보 : /주="위치 27에서의 Xaa는 Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 28
(D) 기타정보 : /주="위치 28에서의 Xaa는 Gly, Asp, Ser, Cys, Ala, Lys, Asn, Thr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, 또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 29
(D) 기타정보 : /주="위치 29에서의 Xaa는 Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, Ala, Cys, Gln, Arg, Thr, Gly, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 30
(D) 기타정보 : /주="위치 30에서의 Xaa는 Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, Met, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 31
(D) 기타정보 : /주="위치 31에서의 Xaa는 Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, Thr, Lys, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, Glu, His, 또는 Trp, 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 32
(D) 기타정보 : /주="위치 32에서의 Xaa는 Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 33
(D) 기타정보 : /주="위치 33에서의 Xaa는 Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 34
(D) 기타정보 : /주="위치 34에서의 Xaa는 Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, Phe, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val, 또는 Asn이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 35
(D) 기타정보 : /주="위치 35에서의 Xaa는 Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, His, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 36
(D) 기타정보 : /주="위치 36에서의 Xaa는 Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, Asn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 37
(D) 기타정보 : /주="위치 37에서의 Xaa는 Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 38
(D) 기타정보 : /주="위치 38에서의 Xaa는 Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 39
(D) 기타정보 : /주="위치 39에서의 Xaa는 Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, Lys, Ser, 또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 40
(D) 기타정보 : /주="위치 40에서의 Xaa는 Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, His, Ala, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 41
(D) 기타정보 : /주="위치 41에서의 Xaa는 Arg, Thr, Val, Ser, Leu 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 42
(D) 기타정보 : /주="위치 42에서의 Xaa는 Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, Arg, His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, 또는 Lys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 43
(D) 기타정보 : /주="위치 43에서의 Xaa는 Asn, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 44
(D) 기타정보 : /주="위치 44에서의 Xaa는 Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val, 또는 Cys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 45
(D) 기타정보 : /주="위치 45에서의 Xaa는 Glu, Tyr, His, Leu, Pro, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 46
(D) 기타정보 : /주="위치 46에서의 Xaa는 Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 47
(D) 기타정보 : /주="위치 47에서의 Xaa는 Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 48
(D) 기타정보 : /주="위치 48에서의 Xaa는 Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, Asp, 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 49
(D) 기타정보 : /주="위치 49에서의 Xaa는 Arg, Tyr, TS, Lys, Ser, His, Pro, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modifled-site
(B) 위치 : 50
(D) 기타정보 : /주="위치 50에서의 Xaa는 Ala, Asn, Pro, Ser, 또는 Lys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 51
(D) 기타정보 : /주="위치 51에서의 Xaa는 Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 52
(D) 기타정보 : /주="위치 52에서의 Xaa는 Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 53
(D) 기타정보 : /주="위치 53에서의 Xaa는 Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, Ile, Pro, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 54
(D) 기타정보 : /주="위치 54에서의 Xaa는 Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, Thr 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 55
(D) 기타정보 : /주="위치 55에서의 Xaa는 Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 56
(D) 기타정보 : /주="위치 56에서의 Xaa는 Asn, Leu, Val, Trp, Pro, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 57
(D) 기타정보 : /주="위치 57에서의 Xaa는 Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, Thr, Gln, Trp, 또는 Asn이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 58
(D) 기타정보 : /주="위치 58에서의 Xaa는 Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, Arg, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 59
(D) 기타정보 : /주="위치 59에서의 Xaa는 Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, Thr, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 60
(D) 기타정보 : /주="위치 60에서의 Xaa는 Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly, Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 61
(D) 기타정보 : /주="위치 61에서의 Xaa는 Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : ModifIed-site
(B) 위치 : 62
(D) 기타정보 : /주="위치 62에서의 Xaa는 Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 63
(D) 기타정보 : /주="위치 63에서의 Xaa는 Ile, Ser, Arg, Thr 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 64
(D) 기타정보 /주="위치 64에서의 Xaa는 Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 65
(D) 기타정보 : /주="위치 65에서의 Xaa는 Lys, Thr, Gly, Asn, Met, Arg, Ile, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 66
(D) 기타정보 : /주="위치 66에서의 Xaa는 Asn, Trp, Val, Gly, Thr, leu, Glu, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 67
(D) 기타정보 : /주="위치 67에서의 Xaa는 Leu, Gln, Gly, Ala, Trp, Arg, Val, 또는 Lys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 68
(D) 기타정보 : /주="위치 68에서의 Xaa는 Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, Met, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 69
(D) 기타정보 : /주="위치 69에서의 Xaa는 Pro, Ala, Thr, Trp, Arg, 또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 70
(D) 기타정보 : /주="위치 70에서의 Xaa는 Cys, Glu, Gly, Arg, Met, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 71
(D) 기타정보 : /주="위치 71에서의 Xaa는 Leu, Asn, Val, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 72
(D) 기타정보 : /주="위치 72에서의 Xaa는 Pro, Cys, Arg, Ala, 또는 Lys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 73
(D) 기타정보 : /주="위치 73에서의 Xaa는 Leu, Ser, Trp, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 74
(D) 기타정보 : /주="위치 74에서의 Xaa는 Ala, Lys, Arg, Val, 또는 Trp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 75
(D) 기타정보 : /주="위치 75에서의 Xaa는 Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, His, Asn, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 76
(D) 기타정보 : /주="위치 76에서의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, Ile, 또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 77
(D) 기타정보 : /주="위치 77에서의 Xaa는 Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Asp, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 78
(D) 기타정보 : /주="위치 78에서의 Xaa는 Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 79
(D) 기타정보 : /주="위치 79에서의 Xaa는 Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, Leu, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 80
(D) 기타정보 : /주="위치 80에서의 Xaa는 Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 81
(D) 기타정보 : /주="위치 81에서의 Xaa는 His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile, 또는 Tyr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 82
(D) 기타정보 : /주="위치 82에서의 Xaa는 Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 83
(D) 기타정보 : /주="위치 83에서의 Xaa는 Ile, Val, Lys, Ala, 또는 Asn이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 84
(D) 기타정보 : /주="위치 84에서의 Xaa는 His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, Thr, Glu, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, Tyr, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 85
(D) 기타정보 : /주="위치 85에서의 Xaa는 Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, Gln, Gly, Ser, Phe, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 86
(D) 기타정보 : /주="위치 86에서의 Xaa는 Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 87
(D) 기타정보 : /주="위치 87에서의 Xaa는 Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 88
(D) 기타정보 : /주="위치 88에서의 Xaa는 Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 89
(D) 기타정보 : /주="위치 89에서의 Xaa는 Asp, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 90
(D) 기타정보 : /주="위치 90에서의 Xaa는 Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 91
(D) 기타정보 : /주="위치 91에서의 Xaa는 Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, teu, Lys, Ile, Asp, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 92
(D) 기타정보 : /주="위치 92에서의 Xaa는 Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 94
(D) 기타정보 : /주="위치 94에서의 Xaa는 Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 95
(D) 기타정보 : /주="위치 95에서의 Xaa는 Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 96
(D) 기타정보 : /주="위치 96에서의 Xaa는 Lys, Asn, Thr, Leu, Gln, Arg, His, Glu, Ser, Ala또는 Trp 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 97
(D) 기타정보 : /주="위치 97에서의 Xaa는 Leu, Ile, Arg, Asp또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 98
(D) 기타정보 : /주="위치 98에서의 Xaa는 Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser, 또는 Phe이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 99
(D) 기타정보 : /주="위치 99에서의 Xaa는 Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val, 또는 Asn이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 100
(D) 기타정보 : /주="위치 100에서의 Xaa는 Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 101
(D) 기타정보 : /주="위치 101에서의 Xaa는 Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp, 또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 102
(D) 기타정보 : /주="위치 102에서의 Xaa는 Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln, 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 103
(D) 기타정보 : /주="위치 103에서의 Xaa는 Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 104
(D) 기타정보 : /주="위치 104에서의 Xaa는 Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp, 또는 Tyr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 105
(D) 기타정보 : /주="위치 105에서의 Xaa는 Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 106
(D) 기타정보 : /주="위치 106에서의 Xaa는 Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 107
(D) 기타정보 : /주="위치 107에서의 Xaa는 Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 108
(D) 기타정보 : /주="위치 108에서의 Xaa는 Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr, 또는 Cys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 109
(D) 기타정보 : /주="위치 109에서의 Xaa는 Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr 또는 Leu이다"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 4 :
(2) SEQ ID NO : 5에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 1
(D) 기타정보 : /주="Met-또는 Met-Ala-가 위치1의 아미노산에 선행할 수도 안할 수도 있다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 3
(D) 기타정보 : /주="위치 3에서의 Xaa는 Ser, Gly, Asp, Met, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 4
(D) 기타정보 : /주="위치 4에서의 Xaa는 Asn, His, 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 5
(D) 기타정보 : /주="위치 5에서의 Xaa는 Met 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 7
(D) 기타정보 : /주="위치 7에서의 Xaa는 Asp, 또는 Glu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 9
(D) 기타정보 : /주="위치 9에서의 Xaa는 Ile, Ala, Leu, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 10
(D) 기타정보 : /주="위치 10에서의 Xaa는 Ile, Val, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 11
(D) 기타정보 : /주="위치 11에서의 Xaa는 Thr, His, Gln 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 12
(D) 기타정보 : /주="위치 12에서의 Xaa는 His, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 15
(D) 기타정보 : /주="위치 15에서의 Xaa는 Gln, Asn, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 16
(D) 기타정보 : /주="위치 16에서의 Xaa는 Pro, Gly 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 17
(D) 기타정보 : /주="위치 17에서의 Xaa는 Pro, Asp, Gly, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 18
(D) 기타정보 : /주="위치 18에서의 Xaa는 Leu, Arg, Gln, Asn, Gly, Ala, 또는 Glu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 19
(D) 기타정보 : /주="위치 19에서의 Xaa는 Pro, 또는 Glu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 20
(D) 기타정보 : /주="위치 20에서의 Xaa는 Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Ala, Arg, Gln, Glu, Ile, Phe, Thr 또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 21
(D) 기타정보 : /주="위치 21에서의 Xaa는 Leu, Ala, Asn, Pro, Gln, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 23
(D) 기타정보 : /주="위치 23에서의 Xaa는 Phe, Ser, Pro 또는 Trp 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 24
(D) 기타정보 : /주="위치 24에서의 Xaa는 Asn, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 28
(D) 기타정보 : /주="위치 28에서의 Xaa는 Gly, Asp, Ser, Cys, Ala, Asn, Ile, Leu, Met, Tyr, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 30
(D) 기타정보 : /주="위치 30에서의 Xaa는 Asp, 또는 Glu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 31
(D) 기타정보 : /주="위치 31에서의 Xaa는 Gln, Val, Met, Leu, Thr, Ala, Asn, Glu, Ser, 또는 Lys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 32
(D) 기타정보 : /주="위치 32에서의 Xaa는 Asp, Phe, Ser, Thr, Ala, Asn, Gln, Glu, His, Ile, Lys, Tyr, Val, 또는 Cys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 36
(D) 기타정보 : /주="위치 36에서의 Xaa는 Glu, Ala, Asn, Ser, 또는 Asp 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 37
(D) 기타정보 : /주="위치 37에서의 Xaa는 Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 40
(D) 기타정보 : /주="위치 40에서의 Xaa는 Arg, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 41
(D) 기타정보 : /주="위치 41에서의 Xaa는 Arg, Thr, Val, Leu 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 42
(D) 기타정보 : /주="위치 42에서의 Xaa는 Pro, Gly, Ser, Gln, Ala, Arg, Asn, Glu, Leu, Thr, Val, 또는 Lys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 46
(D) 기타정보 : /주="위치 46에서의 Xaa는 Ala, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 48
(D) 기타정보 : /주="위치 48에서의 Xaa는 Asn, Pro, Thr 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 49
(D) 기타정보 : /주="위치 49에서의 Xaa는 Arg, 또는 Lys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 50
(D) 기타정보 : /주="위치 50에서의 Xaa는 Ala, 또는 Asn이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 51
(D) 기타정보 : /주="위치 51에서의 Xaa는 Val, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 52
(D) 기타정보 : /주="위치 52에서의 Xaa는 Lys, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 53
(D) 기타정보 : /주="위치 53에서의 Xaa는 Ser, Phe, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 54
(D) 기타정보 : /주="위치 54에서의 Xaa는 Leu, Ile, Phe, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 55
(D) 기타정보 : /주="위치 55에서의 Xaa는 Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 57
(D) 기타정보 : /주="위치 57에서의 Xaa는 Ala, Pro, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 58
(D) 기타정보 : /주="위치 58에서의 Xaa는 Ser, Glu, Arg, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 59
(D) 기타정보 : /주="위치 59에서의 Xaa는 Ala, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 62
(D) 기타정보 : /주="위치 62에서의 Xaa는 Ser, Val, Ala, Asn, Glu, Pro, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 63
(D) 기타정보 : /주="위치 63에서의 Xaa는 Ile, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 65
(D) 기타정보 : /주="위치 65에서의 Xaa는 Lys, Thr, Gly, Asn, Met, Arg, Ile, Gly, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 66
(D) 기타정보 : /주="위치 66에서의 Xaa는 Asn, Gly, Glu, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 68
(D) 기타정보 : /주="위치 68에서의 Xaa는 Leu, Gln, Trp, Arg, Asp, Ala, Asn, Glu, His, Ile, Met, Phe, Ser, Thr, Tyr, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 69
(D) 기타정보 : /주="위치 69에서의 Xaa는 Pro, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 71
(B) 기타정보 : /주="위치 71에서의 Xaa는 Leu, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 73
(D) 기타정보 : /주="위치 73에서의 Xaa는 Leu, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 74
(D) 기타정보 : /주="위치 74에서의 Xaa는 Ala, 또는 Trp 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 77
(D) 기타정보 : /주="위치 77에서의 Xaa는 Ala, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 79
(D) 기타정보 : /주="위치 79에서의 Xaa는 Thr, Asp, Ser, Pro, Ala, Leu, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 81
(D) 기타정보 : /주="위치 81에서의 Xaa는 His, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Asn, Phe, Ser, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 82
(D) 기타정보 : /주="위치 82에서의 Xaa는 Pro, 또는 Tyr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 83
(D) 기타정보 : /주="위치 83에서의 Xaa는 Ile, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 84
(D) 기타정보 : /주="위치 84에서의 Xaa는 His, Ile, Asn, Leu, Ala, Thr, Arg, Gln, Lys, Met, Ser, Tyr, Val, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 85
(D) 기타정보 : /주="위치 85에서의 Xaa는 Ile, Leu 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 86
(D) 기타정보 : /주="위치 86에서의 Xaa는 Lys, Arg, Ile, Gln, Pro, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 87
(B) 기타정보 : /주="위치 87에서의 Xaa는 Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Asn, Ile, Leu, 또는 Tyr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 90
(D) 기타정보 : /주="위치 90에서의 Xaa는 Trp, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 91
(D) 기타정보 : /주="위치 91에서의 Xaa는 Asn, Pro, Ala, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 92
(D) 기타정보 : /주="위치 92에서의 Xaa는 Glu, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 94
(D) 기타정보 : /주="위치 94에서의 Xaa는 Arg, Ala, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 95
(D) 기타정보 : /주="위치 95에서의 Xaa는 Arg, Thr, Glu, Leu, 또는 Ser, 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 98
(D) 기타정보 : /주="위치 98에서의 Xaa는 Thr, Val, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 100
(D) 기타정보 : /주="위치 100에서의 Xaa는 Tyr, 또는 Trp 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 101
(D) 기타정보 : /주="위치 101에서의 Xaa는 Leu, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 102
(D) 기타정보 : /주="위치 102에서의 Xaa는 Lys, Thr, Val, Trp, Ser, Ala, His, Met, Phe, Tyr, 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 103
(D) 기타정보 : /주="위치 103에서의 Xaa는 Thr, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 106
(D) 기타정보 : /주="위치 106에서의 Xaa는 Asn, Pro, Leu, His, Val, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 107
(D) 기타정보 : /주="위치 107에서의 Xaa는 Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Asp, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 108
(D) 기타정보 : /주="위치 108에서의 Xaa는 Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe,Pro, His, Ile, Tyr, 또는 Cys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 109
(D) 기타정보 : /주="위치 109에서의 Xaa는 Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr, 또는 Leu이다"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 5 :
(2) SEQ ID NO : 6에 대한 정보 :
(i) 서열특성
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 1
(D) 기타정보 : /주="Met-또는 Met-Ala-가 위치 1의 아미노산에 선행할 수도 안할 수도 있다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 3
(D) 기타정보 /주="위치 3에서의 Xaa는 Ser, Gly, Asp, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 4
(D) 기타정보 : /주="위치 4에서의 Xaa는 Asn, His, 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 9
(D) 기타정보 : /주="위치 9에서의 Xaa는 Ile, Ala, Leu, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 11
(D) 기타정보 : /주="위치 11에서의 Xaa는 Thr, His, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 12
(D) 기타정보 : /주="위치 12에서의 Xaa는 His, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 15
(D) 기타정보 : /주="위치 15에서의 Xaa는 Gln, 또는 Asn이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 16
(D) 기타정보 : /주="위치 16에서의 Xaa는 Pro, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 18
(D) 기타정보 : /주="위치 18에서의 Xaa는 Leu, Arg, Asn, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 20
(D) 기타정보 : /주="위치 20에서의 Xaa는 Leu, Val, Ser, Ala, Arg, Gln, Glu, Ile, Phe, Thr, 또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 21
(D) 기타정보 : /주="위치 21에서의 Xaa는 Leu, Ala, Asn, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 24
(D) 기타정보 : /주="위치 24에서의 Xaa는 Asn, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 28
(D) 기타정보 : /주="위치 28에서의 Xaa는 Gly, Asp, Ser, Ala, Asn, Ile, Leu, Met, Tyr, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 31
(D) 기타정보 : /주="위치 31에서의 Xaa는 Gln, Val, Met, Leu, Ala, Asn, Glu, 또는 Lys이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 32
(D) 기타정보 : /주="위치 32에서의 Xaa는 Asp, Phe, Ser, Ala, Gln, Glu, His, Val, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 36
(D) 기타정보 : /주="위치 36에서의 Xaa는 Glu, Asn, Ser, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 37
(D) 기타정보 : /주="위치 37에서의 Xaa는 Asn, Arg, Pro, Thr, 또는 His 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 41
(D) 기타정보 : /주="위치 41에서의 Xaa는 Arg, Leu, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 42
(D) 기타정보 : /주="위치 42에서의 Xaa는 Pro, Gly, Ser, Ala, Asn, Val, Leu, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 48
(D) 기타정보 : /주="위치 48에서의 Xaa는 Asn, Pro, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 50
(D) 기타정보 : /주="위치 50에서의 Xaa는 Ala, 또는 Asn이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 51
(D) 기타정보 : /주="위치 51에서의 Xaa는 Val, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 53
(D) 기타정보 : /주="위치 53에서의 Xaa는 Ser, 또는 Phe이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 54
(D) 기타정보 : /주="위치 54에서의 Xaa는 Leu, 또는 Phe이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 55
(D) 기타정보 : /주="위치 55에서의 Xaa는 Gln, Ala, Glu 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 62
(D) 기타정보 : /주="위치 62에서의 Xaa는 Ser, Val, Asn, Pro, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 63
(D) 기타정보 : /주="위치 63에서의 Xaa는 Ile, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 65
(D) 기타정보 : /주="위치 65에서의 Xaa는 Lys, Asn, Met, Arg, Ile, 또는Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 66
(D) 기타정보 : /주="위치 66에서의 Xaa는 Asn, Gly, Glu 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 68
(D) 기타정보 : /주="위치 68에서의 Xaa는 Leu, Gln, Trp, Arp, Asn, Glu, His, Met, Phe, Ser, Thr, Tyr, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 73
(D) 기타정보 : /주="위치 73에서의 Xaa는 Leu, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 74
(D) 기타정보 : /주="위치 74에서의 Xaa는 Ala, 또는 Trp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 77
(D) 기타정보 : /주="위치 77에서의 Xaa는 Ala, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 79
(D) 기타정보 : /주="위치 79에서의 Xaa는 Thr, Asp, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 81
(D) 기타정보 : /주="위치 81에서의 Xaa는 His, Pro, Arg, Val, Gly, Asn, Ser, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 84
(D) 기타정보 : /주="위치 84에서의 Xaa는 His, Ile, Asn, Leu, Ala, Thr, Arg, Gln, Glu, Lys, Met, Ser, Tyr, Val, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 85
(D) 기타정보 : /주="위치 85에서의 Xaa는 Ile, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 86
(D) 기타정보 : /주="위치 86에서의 Xaa는 Lys, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 87
(D) 기타정보 : /주="위치 87에서의 Xaa는 Asp, Pro, Met, Lys, His, Pro, Asn, Ile, Leu 또는 Tyr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 91
(D) 기타정보 : /주="위치 91에서의 Xaa는 Asn, Pro, Ser, Ile, 또는 Asp 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 94
(D) 기타정보 : /주="위치 94에서의 Xaa는 Arg, Ala, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 95
(D) 기타정보 : /주="위치 95에서의 Xaa는 Arg, Thr, Glu, Leu 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 98
(D) 기타정보 : /주="위치 98에서의 Xaa는 Thr, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 102
(D) 기타정보 : /주="위치 102에서의 Xaa는 Lys, Val, Trp, 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 103
(D) 기타정보 : /주="위치 103에서의 Xaa는 Thr, Ala, His, Phe, Tyr, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 106
(D) 기타정보 : /주="위치 106에서의 Xaa는 Asn, Pro, Leu, His, Val, 또는Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 107
(D) 기타정보 : /주="위치 107에서의 Xaa는 Ala, Ser, Ile, Pro, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 108
(D) 기타정보 : /주="위치 108에서의 Xaa는 Gln, Met, Trp, Phe, Pro, His, Ile, 또는 Tyr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 109
(D) 기타정보 : /주="위치 109에서의 Xaa는 Ala, Met, Glu, Ser, 또는 Leu이다"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 6 :
(2) SEQ ID NO : 7에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 133 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 1
(D) 기타정보 : /주="Met-가 위치1의 아미노산에 선행할 수도 안할 수도 있다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 18
(D) 기타정보 : /주="위치 18에서의 Xaa는 Asn, 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 19
(D) 기타정보 : /주="위치 l9에서의 Xaa는 Met, Ala, 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 20
(D) 기타정보 : /주="위치 20에서의 Xaa는 Ile, Pro, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 23
(D) 기타정보 : /주="위치 23에서의 Xaa는 Ile, Ala, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 25
(D) 기타정보 : /주="위치 25에서의 Xaa는 Thr, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 29
(D) 기타정보 : /주="위치 29에서의 Xaa는 Gln, Arg, Val 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 32
(D) 기타정보 : /주="위치 32에서의 Xaa는 Leu, Ala, Asn, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 34
(D) 기타정보 : /주="위치 34에서의 Xaa는 Leu, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 37
(D) 기타정보 : /주="위치 37에서의 Xaa는 Phe, Pro, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 38
(D) 기타정보 : /주="위치 38에서의 Xaa는 Asn, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 42
(D) 기타정보 : /주="위치 42에서의 Xaa는 Gly, Ala, Ser, Asp, 또는 Asn이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 45
(D) 기타정보 : /주="위치 45에서의 Xaa는 Gln, Val, 또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 46
(D) 기타정보 : /주="위치 46에서의 Xaa는 Asp, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 49
(D) 기타정보 : /주="위치 49에서의 Xaa는 Met, Ile, Leu, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 50
(D) 기타정보 : /주="위치 50에서의 Xaa는 Glu, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 51
(D) 기타정보 : /주="위치 51에서의 Xaa는 Asn, Arg, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 55
(D) 기타정보 : /주="위치 55에서의 Xaa는 Arg, Leu, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 56
(D) 기타정보 : /주="위치 56에서의 Xaa는 Pro, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 59
(D) 기타정보 : /주="위치 59에서의 Xaa는 Glu, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 60
(D) 기타정보 : /주="'위치 60에서의 Xaa는 Ala, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 62
(D) 기타정보 : /주="위치 62에서의 Xaa는 Asn, Val, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 63
(D) 기타정보 : /주="위치 63에서의 Xaa는 Arg, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 65
(D) 기타정보 : /주="위치 65에서의 Xaa는 Val, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 67
(D) 기타정보 : /주="위치 67에서의 Xaa는 Ser, Asn, His 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 69
(D) 기타정보 : /주="위치 69에서의 Xaa는 Gln, 또는 Glu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 73
(D) 기타정보 : /주="위치 73에서의 Xaa는 Ala, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 76
(D) 기타정보 : /주="위치 76에서의 Xaa는 Ser, Ala, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 79
(D) 기타정보 : /주="위치 79에서의 Xaa는 Lys, Arg, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 82
(B) 기타정보 : /주="위치 82에서의 Xaa는 Leu, Glu, Val, 또는 Trp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 85
(D) 기타정보 : /주="위치 85에서의 Xaa는 Leu, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 87
(D) 기타정보 : /주="위치 87에서의 Xaa는 Leu, Ser, 또는 Tyr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 88
(D) 기타정보 : /주="위치 88에서의 Xaa는 Ala, 또는 Trp 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 91
(D) 기타정보 : /주="위치 91에서의 Xaa는 Ala, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 93
(D) 기타정보 : /주="위치 93에서의 Xaa는 Pro, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 95
(D) 기타정보 : /주="위치 95에서의 Xaa는 His, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 98
(D) 기타정보 : /주="위치 98에서의 Xaa는 His, Ile, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 100
(D) 기타정보 : /주="위치 100에서의 Xaa는 Lys, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 101
(D) 기타정보 : /주="위치 101에서의 Xaa는 Asp, Ala 또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 105
(D) 기타정보 : /주="위치 105에서의 Xaa는 Asn, 또는 Glu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 109
(D) 기타정보 : /주="위치 109에서의 Xaa는 Arg, Glu 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 112
(D) 기타정보 : /주="위치 112에서의 Xaa는 Thr, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 116
(D) 기타정보 : /주="위치 116에서의 Xaa는 Lys, Val, Trp, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 117
(D) 기타정보 · /주="위치 117에서의 Xaa는 Thr, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 120
(D) 기타정보 · /주="위치 120에서의 Xaa는 Asn, Gln, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 123
(D) 기타정보 : /주="위치 123에서의 Xaa는 Ala, 또는 Glu이다"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 7 :
(2) SEQ ID NO : 7에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 1
(D) 기타정보 : /주="Met-또는 Met-Ala-가 위치1의 아미노산에 선행할 수도안할 수도 있다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 4
(D) 기타정보 : /주="위치 43에서의 Xaa는 Asn 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 5
(D) 기타정보 : /주="위치 5에서의 Xaa는 Met, Ala, 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 6
(D) 기타정보 : /주="위치 6에서의 Xaa는 Ile, Pro, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 9
(D) 기타정보 : /주="위치 9에서의 Xaa는 Ile, Ala, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 11
(D) 기타정보 : /주="위치 11에서의 Xaa는 Thr, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 15
(D) 기타정보 : /주="위치 15에서의 Xaa는 Gln, Arg, Val, 또는 Ile이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 18
(D) 기타정보 : /주="위치 18에서의 Xaa는 Leu, Ala, Asn, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 20
(D) 기타정보 : /주="위치 20에서의 Xaa는 Leu, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 23
(D) 기타정보 /주="위치 23에서의 Xaa는 Phe, Pro, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 24
(D) 기타정보 : /주="위치 24에서의 Xaa는 Asn, 또는 Ala이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 28
(D) 기타정보 : /주="위치 28에서의 Xaa는 Gly, Ala, Ser, Asp또는 Asn이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 31
(D) 기타정보 : /주="위치 31에서의 Xaa는 Gln, Val, 또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 32
(D) 기타정보 : /주="위치 32에서의 Xaa는 Asp, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 35
(D) 기타정보 : /주="위치 35에서의 Xaa는 Met, Ile, 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 36
(D) 기타정보 : /주="위치 36에서와 Xaa는 Glu 또는 Asp이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 37
(D) 기타정보 : /주="위치 37에서의 Xaa는 Asn, Arg, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 41
(D) 기타정보 : /주="위치 41에서의 Xaa는 Arg, Leu, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 42
(D) 기타정보 : /주="위치 42에서의 Xaa는 Pro, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 45
(D) 기타정보 : /주="위치 45에서의 Xaa는 Glu, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 46
(D) 기타정보 : /주="'위치 46에서의 Xaa는 Ala, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 48
(D) 기타정보 : /주="위치 48에서의 Xaa는 Asn, Val, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 49
(D) 기타정보 : /주="위치 49에서의 Xaa는 Arg, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 51
(D) 기타정보 : /주="위치 51에서의 Xaa는 Val, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 53
(D) 기타정보 : /주="위치 53에서의 Xaa는 Ser, Asn, His, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 55
(D) 기타정보 : /주="위치 55에서의 Xaa는 Gln, 또는 Glu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 59
(D) 기타정보 : /주="위치 59에서의 Xaa는 Ala, 또는 Gly이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 62
(D) 기타정보 : /주="위치 62에서의 Xaa는 Ser, Ala, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 65
(D) 기타정보 : /주="위치 65에서의 Xaa는 Lys, Arg, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 67
(D) 기타정보 : /주="위치 67에서의 Xaa는 Leu, Glu, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 68
(D) 기타정보 : /주="위치 68에서의 Xaa는 Leu, Glu, Val, 또는 Trp 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 71
(D) 기타정보 : /주="위치 71에서의 Xaa는 Leu, 또는 Val이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 73
(D) 기타정보 : /주="위치 73에서의 Xaa는 Leu, Ser, 또는 Tyr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 74
(D) 기타정보 : /주="위치 74에서의 Xaa는 Ala, 또는 Trp 이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 77
(D) 기타정보 : /주="위치 77에서의 Xaa는 Ala, 또는 Pro이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 79
(D) 기타정보 : /주="위치 79에서의 Xaa는 Pro, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 81
(D) 기타정보 : /주="위치 81에서의 Xaa는 His, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 84
(D) 기타정보 : /주="위치 84에서의 Xaa는 His, Ile, 또는 Thr이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 86
(D) 기타정보 : /주="위치 86에서의 Xaa는 Lys, 또는 Arg이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 87
(D) 기타정보 : /주="위치 87에서의 Xaa는 Asp, Ala, 또는 Met이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B)위치 : 91
(D) 기타정보 : /주="위치 91에서의 Xaa는 Asn, 또는 Glu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 95
(D) 기타정보 : /주="위치 95에서의 Xaa는 Arg, Glu, 또는 Leu이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 98
(D) 기타정보 : /주="위치 98에서의 Xaa는 Thr, 또는 Gln이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 102
(D) 기타정보 : /주="위치 102에서의 Xaa는 Lys, Val, Trp, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 103
(D) 기타정보 : /주="위치 103에서의 Xaa는 Thr, 또는 Ser이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 106
(D) 기타정보 : /주="위치 106에서의 Xaa는 Asn, Gln, 또는 His이다"
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : Modified-site
(B) 위치 : 109
(D) 기타정보 : /주="위치 109에서의 Xaa는 Ala, 또는 Glu이다"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 8 :
(2) SEQ ID NO : 9에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 9 :
(2) SEQ ID NO : 10에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 10 :
(2) SEQ ID NO : 11에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 11 :
(2) SEQ ID NO : 12에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 12 :
(2) SEQ ID NO : 13에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 13 :
(2) SEQ ID NO : 14에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 14 :
(2) SEQ ID NO : 15에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 15 :
(2) SEQ ID NO : 16에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 16 :
(2) SEQ ID NO : 17에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 17 :
(2) SEQ ID NO : 18에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 18 :
(2) SEQ ID NO : 19에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 19 :
(2) SEQ ID NO : 20에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 20 :
(2) SEQ ID NO : 21에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 21
(2) SEQ ID NO : 22에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 22 :
(2) SEQ ID NO : 23에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 23 :
(2) SEQ ID NO : 24에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 111 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 24 :
(2) SEQ ID NO : 25에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 25 :
(2) SEQ ID NO : 26에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 26 :
(2) SEQ ID NO : 27에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 27 :
(2) SEQ ID NO : 28에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 28 :
(2) SEQ ID NO : 29에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 :선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 29 :
(2) SEQ ID NO : 30에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO 30 :
(2) SEQ ID NO : 31에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii)분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 31 :
(2) SEQ ID NO : 32에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 32 :
(2) SEQ ID NO : 33에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 33 :
(2) SEQ ID NO : 34에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 34 :
(2) SEQ ID NO : 35에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 35 :
(2) SEQ ID NO : 36에 대한 정보 :
(i ) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 36 :
(2) SEQ ID NO 37에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 37 :
(2) SEQ ID NO : 38에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 38 :
(2) SEQ ID NO : 39에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 39 :
(2) SEQ ID NO : 40에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 40 :
(2) SEQ ID NO : 41에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 41 :
(2) SEQ ID NO : 42에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 42 :
(2) SEQ ID NO : 43에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 43 :
(2) SEQ ID NO : 44에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 44 :
(2) SEQ ID NO : 45에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 45 :
(2) SEQ ID NO : 46에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 125 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 46 :
(2) SEQ ID NO 47에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 125 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 47 :
(2) SEQ ID NO : 48에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 113 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 48 :
(2) SEQ ID NO : 49에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 134 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 49 :
(2) SEQ ID NO : 50에 대한 정보
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 36아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 50 :
(2) SEQ ID NO : 51에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 24 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 51 :
(2) SEQ ID NO : 52에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 24 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 펩티드
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 52 :
(2) SEQ ID NO : 53에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 906 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 53 :
(2) SEQ ID NO : 54에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 732 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(B) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 54 :
(2) SEQ ID NO : 55에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 777 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 55 :
(2) SEQ ID NO : 56에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 921 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 56 :
(2) SEQ ID NO : 57에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 951 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 57 :
(2) SEQ ID NO : 58에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 732 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (개놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 58 :
(2) SEQ ID NO : 59애 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 921 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 59 :
(2) SEQ ID NO : 60에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 921 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서옅기술 : SEQ ID NO : 60 :
(2) SEQ ID NO : 61에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 732 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 61 :
(2) SEQ ID NO : 62에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 777 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 62 :
(2) SEQ ID NO : 63에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 777 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 63 :
(2) SEQ ID NO : 64에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 777 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 64 :
(2) SEQ ID NO : 65에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 1047 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 65 :
(2) SEQ ID NO : 66에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 903 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 66 :
(2) SEQ ID NO : 67에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 1017 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C)가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 67:
(2) SEQ ID NO : 68에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 966 염기쌍
(B)유형 : 헥산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi)서열기술 : SEQ ID NO : 68 :
(2) SEQ ID NO : 69에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 822 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 69 :
(2) SEQ ID NO : 70에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 966 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 70 :
(2) SEQ ID NO : 71에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 966 염기쌍
(B) 유형 :핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형테 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 71 :
(2) SEQ ID NO : 72에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 921 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 72 :
(2) SEQ ID NO : 73에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 966 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 73 :
(2) SEQ ID NO : 74에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 1047 염기쌍
(B) 유형 : 헥산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 74 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 921 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 75 :
(2) SEQ ID NO : 76에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 1047 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(B) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 76 :
(2) SEQ ID NO : 77에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 966 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 77 :
(2) SEQ ID NO : 78에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 921 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(B) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 78 :
(2) SEQ ID NO : 79에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 966 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 79 :
(2) SEQ ID NO : 80에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 921 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 80 :
(2) SEQ ID NO : 81에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 966 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(B) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 81 :
(2) SEQ ID NO : 82에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 777 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 82 :
(2) SEQ ID NO : 83에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 984 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(B) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 83 :
(2) SEQ ID NO : 84에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 921 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 84 :
(2) SEQ ID NO : 85에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 921 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유혈 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 85 :
(2) SEQ ID NO : 86에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 732 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 86 :
(2) SEQ ID NO : 87에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 921 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C)가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 87 :
(2) SEQ ID NO : 88에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 732 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 88 :
(2) SEQ ID NO : 89에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 966 염기쌍
(B)유형 : 핵산
(C)가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 89 :
(2) SEQ ID NO : 90에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 777 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 90 :
(2) SEQ ID NO : 91에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 41 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO · 91 :
(2) SEQ ID NO : 92에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 46 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 92 :
(2) SEQ ID NO : 93애 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 39 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 93 :
(2) SEQ ID NO : 94에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 39 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 94 :
(2) SEQ ID NO : 95에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 63 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 95 :
(2) SEQ ID NO : 96에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 58 염기쌍
(B) 유형 : 헥산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 96 :
(2) SEQ ID NO : 97에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 74 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 97 :
(2) SEQ ID NO : 98에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 74 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 98 :
(2) SEQ ID NO : 99애 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 68 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEO ID NO : 99 :
(2) SEQ ID NO : 100에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 68 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 100 :
(2) SEQ ID NO : 101에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 21 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 101 :
(2) SEQ ID NO : 102에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 25 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 102 :
(2) SEQ ID NO : 103에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 21 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 103 :
(2) SEQ ID NO : 104에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 25 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 104 :
(2) SEQ ID NO : 105에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 58 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C)가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 105 :
(2) SEQ ID NO : 106에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 52 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 106 :
(2) SEQ ID NO : 107에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 66 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 107 :
(2) SEQ ID NO : 108에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 66 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 108 :
(2) SEQ ID NO : 109에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 48 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 109 :
(2) SEQ ID NO : 110에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 40 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 110 :
(2) SEQ ID NO : 111에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 26 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 111 :
(2) SEQ ID NO : 112에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 18 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 112 :
(2) SEQ ID NO : 113에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 113 :
(2) SEQ ID NO : 114에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 12 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 114 :
(2) SEQ ID NO : 115에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEO ID NO : 115 :
(2) SEQ ID NO : 116에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 12 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 116 :
(2) SEQ ID NO : 117에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 117 :
(2) SEQ ID NO : Il8에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 31 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C)가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 118 :
(2) SEQ ID NO : 119에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 34 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 헥산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 119 :
(2) SEQ ID NO : 120에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 핵산
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 120 :
(2) SEQ ID NO : 121 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 307아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 가닥 :
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 단백질
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 121:
(2) SEQ ID NO : 140에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 64 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C)가닥 : 단일
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 다른 유형
(A) 기술 : /desc = "합성 DNA"
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 140 :
(2) SEQ ID NO : 141에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 259아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 가닥 :
(D) 형태 : 선형
(ii) 분자유형 : 단백질
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 141 :

Claims (11)

  1. 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 식을 갖는 융합단백질.
    [상기 식에서 R1은 식:
    의 인간 인터루킨-3 돌연변이체 폴리펩티드이고;
    R2는 Il-3, Il-3 변이체 또는 콜로니 자극인자이고;
    L은 R1을 R2에 연결할 수 있는 링커이다.]
  2. 제1항에 있어서, R1이 다음식의 것임을 특징으로 하는 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 콜로니 자극인자 G-CSF 또는 GM-CSF인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  4. 제1항에 있어서, SEQ. ID. NO : 121-159 및 165-168에 대응하는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  5. 제1항에 있어서, SEQ. ID. NO : 133, 124, 154 및 155에 대응하는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  6. 치료학적 유효량의 제1항, 제2항, 제4항 및 제5항중의 어느 한 항의 융합단백질 및 약학적으로 허용되는 담체로 이루어지는, 조혈세포생산의 증가를 필요로하는 포유동물에서 조혈세포의 생산을 증가시키기 위한 약학적 조성물.
  7. 치료학적 유효량의 제3항의 융합단백질 및 약학적으로 허용되는 담체로 이루어지는 조혈세포생산의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 조혈세포의 생산을 증가시키기 위한 약학적 조성물.
  8. 약학적 유효량의 제1항, 제2항, 제4항 및 제5항중의 어느 한 항의 융합단백질을 사용하는 것으로 이루어지는, 조혈세포생산의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 조혈세포의 생산을 증가시키기 위한 약학적 조성물의 제조 방법.
  9. 약학적 유효량의 제3항의 융합단백질을 사용하는 것으로 이루어지는, 조혈세포생산의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 조혈세포의 생산을 증가시키기 위한 약학적 조성물의 제조 방법.
  10. ID. NO: 53-90 및 183-186에 대응하는 뉴클레오티드서열로 구성되는 군에서 선택된 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 및 벡터 DNA로 이루어지는 재조합 DNA.
  11. 제10항에 있어서, SEQ. ID. NO: 60, 64, 89, 및 98에 대응하는 뉴클레오티드서열로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA.
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