DE69534381T2

DE69534381T2 - Hämatopoetisches fusionsprotein multivariantes il-3 enthaltend

Info

Publication number: DE69534381T2
Application number: DE69534381T
Authority: DE
Inventors: Christopher S. Bauer; Mark Allen Abrams; Sarah Ruth Braford-Goldberg; Marie Helena Caparon; Alan Michael Easton; Barbara Kure Klein; John Patrick Mc Kearn; Peter O. Olins; Kumnan Paik; John Warren Thomas
Original assignee: GD Searle LLC
Current assignee: GD Searle LLC
Priority date: 1994-02-04
Filing date: 1995-02-02
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2015-02-03
Also published as: FI963072A; ATE302275T1; BR9506733A; MX9603205A; RO118016B1; EP0742826B1; US6022535A; PL315791A1; KR100370264B1; WO1995021254A1; NZ281421A; CN1227604A; AU1835695A; KR970700766A; EP1482044A3; JPH10502801A; US6030812A; FI963072A0; NO963225D0; EP0742826A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Fusionsmoleküle, die aus Mutanten oder Varianten von humanem Interleukin-3 bestehen.
Hintergrund der Erfindung
Kolonie-stimulierende Faktoren (CSFs), die die Differenzierung und/oder Proliferation von Knochenmarkzellen stimulieren, haben aufgrund ihres therapeutischen Potentials zur Wiederherstellung gesenkter Level an von hämatopoetischen Stammzellen abgeleiteten Zellen großes Interesse hervorgerufen. CSFs wurden sowohl in humanen als auch murinen Systemen identifiziert und entsprechend ihrer Aktivitäten unterschieden. Beispielsweise stimulieren Granulozyten-CSF (G-CSF) und Makrophagen-CSF (M-CSF) die in vitro-Bildung von neutrophilen Granulozyten- bzw. Makrophagen-Kolonien, während GM-CSF und Interleukin-3 (IL-3) breitere Aktivitäten besitzen und die Bildung sowohl von Makrophagen- als auch von neutrophilen und eosinophilen Granulozyten-Kolonien stimulieren. IL-3 stimuliert auch die Bildung von Mast-, Megakaryozyten- und reinen und gemischten erythrozytären Kolonien.
Infolge seiner Fähigkeit, die Proliferation einer Reihe unterschiedlicher Zelltypen zu stimulieren und das Wachstum und die Proliferation von Progenitorzellen zu unterstützen, hat IL-3 Potential zur therapeutischen Verwendung bei der Wiederherstellung von hämatopoietischen Zellen auf normale Mengen in den Fällen, in denen die Anzahl der Zellen durch Krankheiten oder durch therapeutische Behandlungen, wie z.B. Bestrahlung und/oder Chemotherapie, reduziert worden ist.
Interleukin-3 (IL-3) ist ein hämatopoetischer Wachstumsfaktor, der die Eigenschaft hat, das Überleben, das Wachstum und die Differenzierung von hämatopoetischen Zellen fördern zu können. Unter den biologischen Eigenschaften von IL-3 sind die Fähigkeit, (a) das Wachstum und die Differenzierung von Progenitorzellen zu unterstützen, die mit allen oder fast allen Blutzelllinien verbunden sind; (b) mit frühen multipotentiellen Stammzellen zu wechselwirken; (c) das Wachstum von pluripotenten Vorläuferzellen aufrecht zu erhalten; (d) die Proliferation von chronischen Myelozyten-Leukämiezellen zu stimulieren; (e) die Proliferation von Mastzellen, Eosinophilen und Basophilen zu stimulieren; (f) die DNA-Synthese durch humane akute Myelozyten-Leukämie (ANL)-Zellen zu stimulieren; (g) Zellen zur Produktion von Leukotrienen und Histaminen zu stimulieren; (h) die Leukozytenchemotaxis zu induzieren; und (i) Zelloberflächenmoleküle zu induzieren, die zur Leukozytenadhäsion benötigt werden.
Reifes humanes Interleukin-3 (hIL-3) besteht aus 133 Aminosäuren. Es hat eine Disulfidbrücke und zwei potentielle Glykosylierungsstellen (Yang et al., CELL 47:3 (1986)). Murines IL-3 (mIL-3) wurde zuerst von Ihle et al., J. IMMUNOL. 126:2184 (1981) als ein Faktor identifiziert, der die Expression eines T-Zell-assoziierten Enzyms, 20-Hydroxysteroiddehydrogenase, induziert. Der Faktor wurde zur Homogenität gereinigt, und es wurde gezeigt, dass er das Wachstum und die Differenzierung zahlreicher Unterklassen von frühen hämatopoetischen und lmyphoiden Progenitorzellen reguliert.
1984 wurden cDNA-Klone, die für murines IL-3 codieren, isoliert (Fung et al., NATURE 307:233 (1984), und Yokota et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 81:1070 (1984)). Die murine DNA-Sequenz codierte für ein Polypeptid aus 166 Aminosäuren, einschließlich eines vermeintlichen Signalpeptids.
Die Gibbon-IL-3-Sequenz wurde unter Verwendung einer Gibbon-cDNA-Expressionsbibliothek erhalten. Die Gibbon-IL-3-Sequenz wurde dann als Sonde gegen eine humane genomische Bibliothek verwendet, um eine humane IL-3-Sequenz zu erhalten.
Gibbon- und humane genomische DNA-Homologe der murinen IL-3-Sequenz wurden von Yang et al., CELL, 47:3 (1986), offenbart. Von Yang et al. wurde beschrieben, dass die humane Sequenz einen Serinrest in Position 8 der reifen Proteinsequenz enthält. Nach dieser Feststellung beschrieben andere die Isolierung von Pro⁸-hIL-3-cDNAs mit Prolin in Position 8 der Proteinsequenz. Somit hat es den Anschein, dass es zwei allele Formen von hIL-3 geben kann.
Dorssers et al., GENE 55:115 (1987), fanden einen Klon aus einer humanen cDNA-Bibliothek, der mit mIL-3 hybridisierte. Diese Hybridisierung war das Resultat des hohen Grads an Homologie zwischen den nicht-codierenden 3'-Regionen von mIL-3 und hIL-3. Diese cDNA codierte für eine hIL-3 (Pro⁸)-Sequenz.
US 4 877 729 und US 4 959 454 offenbaren humane IL-3- und Gibbon-IL-3-cDNAs und die Proteinsequenzen, für die sie codieren. Das offenbarte hIL-3 hat Serin statt Prolin in Position 8 in der Proteinsequenz.
Clark-Lewis et al., SCIENCE 231:134 (1986), führten eine funktionelle Analyse von murinen IL-3-Analoga, die mit automatischem Peptid-Synthesizier synthetisiert worden waren, durch. Die Autoren zogen den Schluss, dass die stabile Tertiärstruktur des vollständigen Moleküls für eine volle Aktivität erforderlich war. Eine Studie über die Rolle der Disulfidbrücken zeigte, dass ein Ersatz aller vier Cysteine durch Alanin ein Molekül mit 1/500 der Aktivität des nativen Moleküls ergab. Ein Ersatz von zwei der vier Cys-Reste durch Ala(Cys⁷⁹, Cys¹⁴⁰ → Ala⁷⁹, Ala¹⁴⁰) führte zu einer erhöhten Aktivität. Die Autoren schlossen daraus, dass in murinem IL-3 eine einzelne Disulfidbrücke zwischen den Cysteinen 17 und 80 erforderlich ist, um eine biologische Aktivität zu erhalten, die physiologischen Leveln nahe kommt, und dass diese Struktur wahrscheinlich die Tertiärstruktur des Proteins stabilisiert, was eine Konformation gibt, die für die Funktion optimal ist (Clark-Lewis et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 85:7897 (1988)).
Die internationale Patentanmeldung (PCT) WO 88/00598 offenbart Gibbon- und Menschen-artiges IL-3. Das hIL-3 enthält einen Ser⁸ → Pro⁸-Austausch. Es werden Vorschläge gemacht, um Cys durch Ser zu ersetzen, wodurch die Disulfidbrücke gebrochen wird, und um eine oder mehrere Aminosäuren an den Glykosylierungsstellen zu ersetzen.
EP-A-0275598 (WO 88/04691) erläutert, dass Ala¹ deletiert werden kann, während die biologische Aktivität beibehalten wird. Es werden einige mutante hIL-3-Sequenzen bereitgestellt, z.B. zwei Doppelmutanten, Ala¹ → Asp¹, Trp¹³ → Arg¹³ (pGB/IL-302) und Ala¹ → Asp¹, Met³ → Thr³ (pGB/IL-304), und eine Dreifachmutante Ala¹ → Asp¹, Leu⁹ → Pro⁹, Trp¹³ → Arg¹³ (pGB/IL-303).
WO 88/05469 beschreibt, wie Deglykosylierungsmutanten erhalten werden können und legt nahe, dass Mutanten von Arg⁵⁴Arg⁵⁵ und Arg¹⁰⁸Arg¹⁰⁹Lys¹¹⁰ eine Proteolyse bei Expression in Saccharomyces cerevisiae durch KEX2-Protease vermeiden könnten. Es werden keine mutierten Proteine offenbart. Eine Glykosylierung und die KEX2-Protease-Aktivität sind in diesem Kontext nur bei Expression in Hefe von Bedeutung.
WO 88/06161 erwähnt verschiedene Mutanten, die theoretisch bezüglich Konformation und Antigenität neutral sein können. Die tatsächlich durchgeführten Mutationen sind nur Met² → Ile² und Ile¹³¹ → Leu¹³¹. Es wird nicht offenbart, ob die ins Auge gefassten Neutralitäten für diese zwei Mutationen erhalten wurden.
WO 91/00350 offenbart nicht-glykosylierte hIL-3-Analogon-Proteine, z.B. hIL-3 (Pro⁸Asp¹⁵Asp⁷⁰), Met³ rhuIl-3 (Pro⁸Asp¹⁵Asp⁷⁰); Thr⁴ rhuIL-3 (Pro⁸Asp¹⁵Asp⁷⁰) und Thr⁶ rhu-IL-3 (Pro⁸Asp¹⁵Asp⁷⁰). Es wird gesagt, dass diese Proteinzusammensetzungen keine nachteiligen Nebenwirkungen, die mit nativem hIL-3 assoziiert sind, wie z.B. Urticaria, die aus einer Infiltration von Mastzellen und Lymphozyten in die Dermis resultiert, aufweisen. Die offenbarten analogen hIL-3-Proteine können N-Termini an Met³, Thr⁴ oder Thr⁶ haben.
WO 91/12874 offenbart Varianten von IL-3 mit addiertem Cystein (CAVs), die wenigstens einen Cys-Rest für einen natürlich auftretenden Aminosäurerest eingesetzt haben.
US 4 810 643 offenbart die DNA-Sequenz, die für humanen G-CSF codiert.
WO 91/02754 offenbart ein Fusionsprotein, das aus GM-CSF und IL-3 besteht, das im Vergleich zu GM-CSF oder IL-3 allein verstärkte biologische Aktivität hat. Offenbart werden auch nicht-glykosylierte IL-3- und GM-CSF-Analogon-Proteine als Komponenten der Fusion.
WO 92/04455 offenbart Fusionsproteine, die aus IL-3, fusioniert an ein Lymphokin, bestehen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, EPO und G-CSF.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf das Folgende gerichtet:

1. Ein Fusionsprotein, das Bindungsaffinität für wenigstens den hIL-3-Rezeptor hat, und das die Formel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ. ID. Nos. 126, 127, 132 und 136 des beigefügten Sequenzprotokolls, hat.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge des Fusionsproteins nach 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
3. Pharmazeutisch wirksame Menge des Fusionsproteins nach 1 zur Verwendung in einem Verfahren zur Erhöhung der hämatopoetischen Zellproduktion in einem Säuger.
4. Pharmazeutisch wirksame Menge des Fusionsproteins nach 1 zur Verwendung in einem Verfahren zur Erhöhung der hämatopoetischen Zellproduktion in einem Säuger.
5. Rekombinante DNA-Sequenz, die für ein Fusionsprotein nach 1 codiert.
6. Rekombinante DNA-Sequenz nach 5, die aus der Gruppe, bestehend aus Nucleotid-Sequenzen, die SEQ ID NOs: 58, 61, 63 und 86 des beigefügten Sequenzprotokolls entsprechen, ausgewählt ist.
7. Wirtszelle, die eine rekombinante DNA-Sequenz nach 5 oder 6 umfasst und zur Expression des Fusionsproteins fähig ist.
8. Verfahren zum Produzieren eines Fusionsproteins nach 1, umfassend die Schritte: (a) Kultivieren einer Wirtszelle nach 7, unter Bedingungen, die eine Expression der rekombinanten DNA erlauben; und (b) Ernten des Fusionsproteins aus der Kultur.

Zu Vergleichszwecken werden außerdem rekombinante humane Interleukin-3 (hIL-3)-Varianten- oder Mutantenproteine (Muteine), an eine zweite IL-3-Variante mit oder ohne Linker fusioniert, beschrieben. Diese hIL-3-Muteine enthalten Aminosäuresubstitutionen und können auch Aminosäure-Deletionen, entweder am N- oder C-Terminus oder an beiden, haben. Zu Vergleichszwecken werden außerdem Kolonie-stimulierende Faktoren mit Mischfunktion beschrieben, die aus kovalent verknüpften Polypeptiden gebildet werden, von welchen jedes durch einen unterschiedlichen und spezifischen Zellrezeptor unter Initiierung komplementärer biologischer Aktivitäten wirken kann.
Diese werden durch die Formeln R₁-L-R₂, R₂-L-R₁, R₁-R₂, R₂-R₁, R₁-L-R₁ und R₁-R₁ dargestellt, worin R₁ eine hIL-3-Variante ist, die mehrere Aminosäuresubstitutionen enthält, und die Teile des hIL-3-Moleküls deletiert haben kann, R₂ IL-3 oder eine IL-3-Variante ist. Das R₁-Polypeptid ist entweder direkt oder über eine Linkersequenz an das R₂-Polypeptid fusioniert. Somit stellt L eine chemische Bindung oder ein Polypeptidsegment dar, an das sowohl R₁ als auch R₂ fusioniert ist. Diese mutanten IL-3-Vergleichs-Polypeptide können vier oder mehr Aminosäuren enthalten, die sich von den Aminosäuren unterscheiden, die in den entsprechenden Positionen im nativen hIL-3-Polypeptid gefunden werden.
Die Fusionsmoleküle können dadurch gekennzeichnet sein, dass sie die übliche Aktivität von den beiden Peptiden, die das Fusionsmolekül bilden, haben, oder sie können dadurch gekennzeichnet sein, dass sie eine biologische oder physiologische Aktivität haben, die größer ist als nur die additive Funktion des Vorliegens von IL-3 oder dem zweiten Koloniestimulierenden Faktor alleine. Das Fusionsmolekül kann auch unerwarteterweise eine verstärkte Wirkung auf die Aktivität oder eine andere Aktivität als die durch das Vorliegen von IL-3 oder der IL-3-Variante bereitstellen. Das Fusionsmolekül kann auch ein verbessertes Aktivitätsprofil haben, das eine Verringerung unerwünschter biologischer Aktivitäten, die mit nativem hIL-3 assoziiert sind, umfasst.
Zu Vergleichszwecken werden außerdem Mutanten von hIL-3 beschrieben, in denen 1 bis 14 Aminosäuren vom N-Terminus deletiert wurden, und/oder 1 bis 15 Aminosäuren vom C-Terminus deletiert wurden, die mehrere Aminosäuresubstitutionen enthalten, an die ein zweiter Kolonie-stimulierender Faktor oder eine IL-3-Variante fusioniert wurde. Andere Fusionsmoleküle bestehen aus hIL-3-Varianten, in denen die Aminosäuren 1 bis 14 vom N-Terminus deletiert wurden, die Aminosäuren 126 bis 133 vom C-Terminus deletiert wurden und die etwa 4 bis etwa 26 Aminosäuresubstitutionen in der Polypeptidsequenz enthalten, die an einen zweiten Kolonie-stimulierenden Faktor oder eine IL-3-Variante fusioniert sind.
Die Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung können als IL-3-Antagonisten oder als getrennte antigene Fragmente für die Herstellung von Antikörpern fungieren, welche in Immunoassay- und Immuntherapie-Protokollen einsetzbar sind.
Antagonisten von hIL-3 wären bei der Blockierung des Wachstums von bestimmten Krebszellen, wie AML, CML und bestimmten Typen von B-Lymphoidkrebs, besonders nützlich. Andere Zustände bzw. Krankheitsbilder, wo Antagonisten nützlich wären, umfassen solche, in denen bestimmte Blutzellen in abnormal hohen Zahlen produziert werden oder durch endogene Liganden aktiviert werden. Antagonisten würden wirksam um Liganden konkurrieren, vermutlich natürlich vorkommende Hämatopoietine, einschließlich und nicht beschränkt auf IL-3, GM-CSF und IL-5, die das Wachstum von Krebszellen durch ihre Fähigkeit, an den IL-3-Rezeptorkomplex zu binden, während intrinsische Aktivierungseigenschaften des Liganden vermindert werden, auslösen oder verstärken können. IL-3, GM-CSF und/oder IL-5 spielen auch bei bestimmten asthmatischen Reaktionen eine Rolle. Ein Antagonist des IL-3-Rezeptors kann bei dieser Krankheit Anwendung finden, indem eine Rezeptor-vermittelte Aktivierung und Rekrutierung von inflammatorischen Zellen blockiert wird.
Zusätzlich zur Verwendung der Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung in vivo, wird in Betracht gezogen, dass in vitro-Verwendungen die Fähigkeit einschließen würden, Knochenmarks- und Blutzellaktivierung und Wachstum vor Infusion in Patienten zu stimulieren.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist das humane IL-3-Gen für eine E. coli-Expression (pMON5873), das für die Polypeptidsequenz von natürlichem (Wildtyp) humanen IL-3 [SEQ ID NO:49] codiert, plus ein Initiator-Methionin, wie es in E. coli exprimiert wird, wobei die Aminosäuren vom N-Terminus des natürlichen hIL-3 aus nummeriert sind.
2 ist die Konstruktion der Plasmide pMON13018 und pMON13021. Das Plasmid pMON13018 ist ein Zwischenplasmid, das verwendet wird, um das Plasmid pMON13021 zu konstruieren, welches für die Polypeptidfusion pMON13021 codiert.
3 ist die Bioaktivität der Polypeptidfusion pMON3988, wie sie im Methylcellulose-Assay gemessen wird.
4 ist die Bioaktivität der Polypeptidfusionen pMON3987 und pMON26430, pMON3995 und pMON26415, wie sie im Methylcellulose-Assay gemessen wird.
5 ist die Bioaktivität der Polypeptidfusion pMON26425, wie sie im Methylcellulose-Assay gemessen wird.
6 ist die Bioaktivität der Polypeptidfusionen pMON26406 und pMON26433, wie sie im Methylcellulose-Assay gemessen wird.
7 ist die Bioaktivität der Polypeptidfusionen pMON26431 und pMON26427, wie sie im Methylcellulose-Assay gemessen wird.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die hierin zu Vergleichszwecken beschriebenen Verbindungen umfassen rekombinante humane Interleukin-3 (hIL-3)-Varianten oder mutante Proteine (Muteine), fusioniert mit sich selbst, IL-3 oder einem zweiten Kolonie-stimulierenden Faktor (CSF), einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Cytokin, Lymphokin, Interleukin, hämatopoetischen Wachstumsfaktor oder IL-3-Variante, mit oder ohne Linker. Sie umfassen Kolonie-stimulierende Faktoren mit Mischfunktion, die aus kovalent verknüpften Polypeptiden gebildet werden, von denen jedes durch einen unterschiedlichen und spezifischen Zellrezeptor wirken kann, um komplementäre biologische Aktivitäten zu initiieren. Hämatopoese erfordert eine komplexe Reihe von zellulären Ereignissen, in denen sich Stammzellen kontinuierlich zu großen Populationen reifender Zellen in allen Hauptzelllinien entwickeln. Es gibt derzeit wenigstens 20 bekannte Regulatoren mit hämatopoetischer proliferativer Aktivität. Die meisten dieser proliferativen Regulatoren können den einen oder anderen Typ der Koloniebildung in vitro stimulieren, wobei das genaue Muster der Koloniebildung, die durch jeden Regulator stimuliert wird, ziemlich verschieden ist. Keine zwei Regulatoren stimulieren exakt dasselbe Muster der Koloniebildung, wie es durch die Kolonienzahl, oder wichtiger, durch das Abstammungs- und Reifungsmuster der Zellen, die die sich entwickelnden Kolonien bilden, beurteilt wird. Proliferative Reaktionen können am einfachsten in vereinfachten in vitro-Kultursystemen analysiert werden. Es können drei ziemlich unterschiedliche Parameter unterschieden werden: Veränderung der Koloniengröße, Veränderung der Kolonienzahl und der Zell-Reihe. Zwei oder mehr Faktoren können auf die Progenitorzelle wirken, was die Bildung einer größeren Anzahl von Nachkommenschaft induziert, wodurch die Koloniengröße zunimmt. Zwei oder mehr Faktoren können ermöglichen, dass eine erhöhte Zahl von Progenitorzellen sich vermehrt, und zwar entweder weil unterschiedliche Untersätze von Progenitorzellen existieren, die ausschließlich auf einen Faktor reagieren, oder weil einige Progenitoren eine Stimulation durch zwei oder mehr Faktoren benötigen, bevor sie reagieren können. Eine Aktivierung von zusätzlichen Rezeptoren an einer Zelle durch die Verwendung von zwei oder mehr Faktoren wird wahrscheinlich das mitotische Signal verstärken, und zwar infolge des Verschmelzens von anfänglich unterschiedlichen Signalwegen zu einem gemeinsamen Endweg, der den Kern erreicht (Metcalf 1989). Andere Mechanismen könnten Synergie erklären. Wenn beispielsweise ein Signalgebungsweg limitiert ist, kann durch eine Zwischenaktivierung eines zusätzlichen Signalgebungswegs durch einen zweiten Faktor zu einer superadditiven Reaktion führen. In einigen Fällen kann die Aktivierung eines Rezeptortyps eine verstärkte Expression von anderen Rezeptoren induzieren (Metcalf, 1993). Zwei oder mehr Faktoren können dann zu einem unterschiedlichen Muster der Zell-Reihen aus einem einzelnen Faktor resultieren. Die Verwendung von Fusionsmolekülen kann den potentiellen klinischen Vorteil haben, der aus einer proliferativen Antwort resultiert, die mit einem einzelnen Faktor nicht möglich ist.
Hämatopoetische und andere Wachstumsfaktoren können in zwei unterschiedliche Familien verwandter Rezeptoren eingeteilt werden:

(1) Tyrosinkinaserezeptoren, einschließlich der für epidermalen Wachstumsfaktor, M-CSF (Sherr, 1990), und SCF (Yarden et al., 1987); und (2) hämatopoetische Rezeptoren, die keine Tyrosinkinase-Domäne enthalten, aber offensichtliche Homologie in ihrer extrazellulären Domäne aufweisen (Bazan, 1990). In dieser zuletzt genannten Gruppe enthalten sind Erythropoietin (EPO) (D'Andrea et al., 1989), GM-CSF (Gearing et al., 1989), IL-3 (Kitamura et al., 1991), G-CSF (Fukunaga et al., 1990), IL-4 (Harada et al., 1990), IL-5 (Takaki et al., 1990), IL-6 (Yamasaki et al., 1988), IL-7 (Goodwin et al., 1990), LIF (Gearing et al., 1991) und IL-2 (Cosman et al, 1987). Die meisten der letztgenannten Gruppe an Rezeptoren existieren in Hochaffinitätsform als Heterodimere. Nach Ligandenbindung werden die spezifischen α-Ketten mit wenigstens einer anderen Rezeptorkette (β-Kette, γ-Kette) assoziiert. Viele dieser Faktoren haben eine gemeinsame Rezeptor-Untereinheit. Die α-Ketten für GM-CSF, IL-3 und IL-5 haben dieselbe β-Kette (Kitamura et al., 1991; Takaki et al., 1991), und Rezeptorkomplexe für IL-6, LIF und IL-11 haben eine gemeinsame β-Kette (gp130) (Taga et al., 1989; Gearing et al., 1992). Die Rezeptorkomplexe von IL-2, IL-4 und IL-7 haben eine gemeinsame γ-Kette (Kondo et al., 1993; Russell et al., 1993; Noguchi et al., 1993).

Die Verwendung von mehreren Faktoren kann auch den potentiellen Vorteil haben, dass die Anforderungen, die an Faktor-produzierende Zellen und ihre Induktionssysteme gestellt werden, gesenkt werden. Wenn es Beschränkungen bei der Fähigkeit einer Zelle, einen Faktor zu produzieren, gibt, dann kann eine Senkung der erforderlichen Konzentrationen jedes der Faktoren durch Verwendung derselben in Kombination die Anforderungen an die Faktorproduzierenden Zellen nützlicherweise senken. Die Verwendung von mehreren Faktoren kann die Menge der Faktoren senken, die benötigt werden, vermutlich indem die Wahrscheinlichkeit nachteiliger Reaktionen reduziert wird.
Alle hierin beschriebenen Verbindungen, einschließlich derjenigen für Vergleichszwecke, werden durch eine Formel dargestellt, die aus der Gruppe, bestehend aus R₁-L-R₂, R₂-L-R₁, R₁-R₂, R₂-R₁, R₁-L-R₁ und R₁-R₁ ausgewählt ist, worin R₁ eine hIL-3-Variante ist, die mehrere Aminosäuresubstitutionen enthält, und die Teile des hIL-3-Moleküls deletiert haben kann, wie es in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung, Serial No. PCT/US93/11197 offenbart ist, R₂ ist IL-3, eine IL-3-Variante oder ein Kolonie-stimulierender Faktor mit unterschiedlicher, aber komplementärer Aktivität. Mit komplementärer Aktivität ist Aktivität gemeint, die die Reaktion auf einen anderen Zellmodulator verstärkt oder verändert. Das R₁-Polypeptid wird entweder direkt oder über ein Linkersegment an das R₂-Polypeptid fusioniert. Der Ausdruck "direkt" definiert Fusionen, bei denen die Polypeptide ohne einen Peptidlinker verbunden werden. So stellt L eine chemische Bindung oder ein Polypeptidsegment dar, an das sowohl R₁ als auch R₂ im Rahmen fusioniert sind, am häufigsten ist L ein lineares Peptid, an das R₁ und R₂ durch Amidbindungen gebunden sind, welche den Carboxyterminus von R₁ an den Aminoterminus von L binden und den Carboxyterminus von L an den Aminoterminus von R₂ binden. Mit "im Rahmen bzw. Raster fusioniert" ist gemeint, dass es keine Translationstermination oder -unterbrechung zwischen den Leserastern von R₁ und R₂ gibt. Eine nicht-ausschließliche Liste von anderen Wachstumsfaktoren, Kolonie-stimulierenden Faktoren (CSFs), Cyotkin, Lymphokin, Interleukin, hämatopoetischem Wachstumsfaktor, die an eine hIL-3-Variante für Vergleichszwecke fusioniert werden können, umfasst GM-CSF, CSF-1, G-CSF, Meg-CSF (neuerdings als c-mpl-Ligand bezeichnet), M-CSF, Erythropoietin (EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, LIF, flt3/flk2, humanes Wachstumshormon, B-Zellwachstumsfaktor, B-Zelldifferenzierungsfaktor, Eosinophilen-Differenzierungsfaktor und Stammzellfaktor (SCF), auch bekannt als Steel-Faktor oder c-kit-Ligand. Zusätzlich umfasst diese auch die Verwendung von modifizierten R₂-Molekülen oder mutierten oder modifizierten DNA-Sequenzen, die für diese R₂-Moleküle codieren. Die vorliegende Erfindung umfasst Fusionsmoleküle, in denen R₂ eine hIL-3-Variante ist, was ein IL-3 bedeutet, in dem Aminosäuresubstitutionen vorliegen und in dem Teile des hIL-3-Moleküls deletiert sind, wie es z.B. in PCT/US93/11197 und PCT/US93/11198 offenbart ist, oder andere fachbekannte Varianten ist.
Eine Verknüpfungsgruppe (L) ist im Allgemeinen ein Polypeptid mit einer Länge von zwischen 1 und 500 Aminosäuren. Die Linker, die die zwei Moleküle verbinden, sind vorzugsweise so konzipiert, dass sie (1) zulassen, dass sich die zwei Moleküle falten und unabhängig voneinander wirken, (2) nicht die Neigung zur Entwicklung einer geordneten Sekundärstruktur haben, welche mit den funktionellen Domänen der zwei Proteine wechselwirken könnte, (3) minimale hydrophobe oder geladene Charakteristika haben, die mit den funktionellen Protein-Domänen wechselwirken könnten bzw. diese stören könnten, und (4) eine sterische Trennung von R₁ und R₂ bereitstellen, so dass R₁ und R₂ gleichzeitig mit ihren entsprechenden Rezeptoren an einer einzelnen Zelle wechselwirken können. Typischerweise umfassen Oberflächen-Aminosäuren in flexiblen Proteinregionen Gly, Asn und Ser. Tatsächlich würde erwartet, dass eine beliebige Permutation von Aminosäuresequenzen, die Gly, Asn und Ser enthalten, den obigen Kriterien für eine Linkersequenz entspricht. Andere neutrale Aminosäuren, z.B. Thr und Ala, können ebenfalls in der Linkersequenz eingesetzt werden. Zusätzliche Aminosäuren können auch in den Linkem enthalten sein, und zwar infolge der Addition von einmal vorkommenden Restriktionsstellen in der Linkersequenz, um eine Konstruktion der Fusionen zu erleichtern.
Ein Beispiel für einen hochflexiblen Linker ist die (GlySer)-reiche Spacerregion, die innerhalb des pIII-Proteins der filamentösen Bakteriophagen vorliegt, z.B. Bakteriophagen M13 oder fd (Schaller et al., 1975). Diese Region stellt eine lange, flexible Spacerregion zwischen zwei Domänen des pIII-Oberflächenproteins bereit. Die Spacerregion besteht aus der Aminosäuresequenz:
GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGlu
GlyGlyGlySerGluGlyGlyGlySerGlaGlyGlyGlySerGlyGlyGlySer
[SEQ ID NO:50]
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Linker, in denen eine Endopeptidase-Erkennungssequenz enthalten ist. Eine derartige Spaltungsstelle kann zur Trennung der einzelnen Komponenten der Fusion wertvoll sein, um so zu bestimmen, ob sie in passender Weise gefaltet und in vitro aktiv sind. Beispiele für verschiedene Endopeptidasen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Plasmin, Enterokinase, Kallikrein, Urokinase, Gewebe-Plasminogen-Aktivator, Clostripain, Chymosin, Collagenase, Russell's Schlangengift-Protease, Postprolin-Spaltungsenzym, V8-Protease, Thrombin und Faktor Xa.
Peptid-Linkersegmente aus der Hinge-Region der schweren Kette der Immunglobuline IgG, IgA, IgM, IgD oder IgE stellen eine Winkelbeziehung zwischen den gebundenen Polypeptiden bereit. Speziell nützlich sind die Hinge-Regionen, in denen Cysteine durch Serine ersetzt sind. Linker umfassen Sequenzen, die aus der murinen IgG-γ-2b-Hinge-Region stammen, in der die Cysteine in Serine geändert waren. Diese Linker können auch eine Endopeptidase-Spaltungsstelle enthalten. Beispiele für solche Linker umfassen die folgenden Sequenzen, die ausgewählt sind aus der Gruppe von Sequenzen:
IleSerGluProSerGlyProIleSerThrIleAsnProSerProProSerLys
GluSerHisLysSerPro [SEQ ID NO:51]
IleGluGlyArgIleSerGluProSerGlyProIleSerThrIleAsnProSer
ProProSerLysGluSerHisLysSerPro [SEQ ID NO:52]
Ein alternatives Verfahren zur Verknüpfung von zwei hämatopoetischen Wachstumsfaktoren ist durch eine nicht-kovalente Wechselwirkung. Solche komplexierten Proteine können durch eine der folgenden Formeln beschrieben werden: R1-C1 + R2-C2; oder C1-R1 + C2-R2; C1-R1 + R2-C2; oder C1-R1 + R2-C2 worin R1 eine hIL-3-Variante ist, die mehrere Aminosäuresubstitutionen hat und die Teile des hIL-3-Moleküls deletiert haben kann, R2 ein Kolonie-stimulierender Faktor mit einer unterschiedlichen, aber komplementären Aktivitä ist. Eine nicht-ausschließliche Liste von anderen Wachstumsfaktoren, Kolonie-stimulierenden Faktoren (CSFs), Cytokin, Lymphokin, Interleukin, hämatopoetischem Wachstumsfaktor innerhalb der Definition für R2, die an eine hIL-3- Variante zu Vergleichszwecken fusioniert werden können, umfassen GM-CSF, CSF-1, G-CSF, Meg-CSF (neuerdings als c-mpl-Ligand bezeichnet), M-CSF, Erythropoietin (EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, LIF, flt3/flk2, humanes Wachstumshormon, B-Zellwachstumsfaktor, B-Zelldifferenzierungsfaktor, Eosinophilen-Differenzierungsfaktor und Stammzellfaktor (SCF), auch bekannt als Stahlfaktor oder c-kit-Ligand. Die Domänen C1 und C2 haben entweder identische oder nicht-identische chemische Strukturen, typischerweise Protein-artige, die eine nicht-kovalente, spezifische Assoziation bilden können. Komplexe zwischen C1 und C2 resultieren in einer stöchiometrischen Beziehung zwischen R1 und R2 für jeden Komplex von 1:1. Beispiele für Domänen, die assoziieren, sind "Leucin-Zipper"-Domänen von Transkriptionsfaktoren, Dimerisations-Domänen von bakteriellen Transkriptionsrepressoren und Immunglobulin-konstante Domänen. Kovalente Bindungen verknüpfen R1 und C1 bzw. R2 und C2. Wie in den Formeln angegeben ist, können die Domänen C1 und C2 entweder am N-Terminus oder C-Terminus ihres entsprechenden hämatopoetischen Wachstumsfaktors (R) vorliegen. Diese Multimerisations-Domänen (C1 und C2) umfassen die, die von der bZIP-Familie von Proteinen stammen (Abel et al., 1989; Landshulz et al., 1988, Pu et al., 1993; Kozarides et al., 1988), wie auch Multimerisations-Domänen der Helix-Loop-Helix-Proteinfamilie (Abel et al., 1989; Murre et al., 1989, Tapscott et al., 1988, Fisher et al., 1991). Fusionen, die darüber hinaus zum Vergleich beschrieben werden, umfassen Koloniestimulierende Faktoren, die durch ihren Einbau der Leucin-Zipper-Dimerisations-Domäne der bZIP-Familien-Proteine Fos und Jun als translationale Fusionen dimerisiert sind. Die Leucin-Zipper-Domäne von Jun ist fähig, mit identischen Domänen in Wechselwirkung zu treten. Andererseits wechselwirkt die Leucin-Zipper-Domäne von Fos mit der Jun-Leucin-Zipper-Domäne, wechselwirkt aber nicht mit anderen Fos-Leucin-Zipper-Domänen. Gemische aus Fos und Jun führen vornehmlich zur Bildung von Fos-Jun-Heterodimeren. Wenn folglich an Kolonie-stimulierende Faktoren fusioniert wird, kann die Jun-Domäne verwendet werden, um die Bildung entweder von Homo- oder Heterodimeren zu steuern. Eine bevorzugte Bildung von Heterodimeren kann erreicht werden, wenn einer der Kolonie-stimulierenden Faktor-Partner so verändert ist, dass er die Jun-Leucin-Zipper-Domäne besitzt, während der andere so bearbeitet ist, dass er den Fos-Zipper besitzt.
Peptide können auch addiert werden, um eine Reinigung oder Identifizierung von Fusionsproteinen (z.B. Poly-His) zu erleichtern. Es kann auch ein in hohem Maße antigenes Peptid addiert werden, das einen schnellen Assay und eine leichte Reinigung des Fusionsproteins durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper ermöglicht.
Moleküle, die darüber hinaus zum Vergleich beschrieben werden, bestehen aus Varianten von humanem Interleukin-3 (hIL-3), in denen Aminosäuresubstitutionen an vier oder mehr Positionen in der Aminosäuresequenz des Polypeptids durchgeführt wurden, welches an einen zweiten Kolonie-stimulierenden Faktor oder eine IL-3-Variante fusioniert ist. Andere Fusionsmoleküle, die zu Vergleichszwecken beschrieben werden, sind (15-125)hIL-3-Deletionsmutan ten, die Deletionen der Aminosäuren 1 bis 14 am N-Terminus und 126 bis 133 am C-Terminus haben, und die auch vier oder mehr Aminosäuresubstitutionen in dem Polypeptid, das an einen zweiten Kolonie-stimulierenden Faktor oder eine IL-3-Variante fusioniert ist, haben. Die Beschreibung umfasst vergleichende Mutanten-Polypeptide, die mindestens die Aminosäurereste 15 bis 118 von hIL mit oder ohne zusätzliche Aminosäureextensionen am N-Terminus und/oder C-Terminus umfassen, die außerdem vier oder mehr Aminosäuresubstitutionen in der Aminosäuresequenz des Polypeptids enthalten, das an einen anderen Kolonie-stimulierenden Faktor oder eine IL-3-Variante fusioniert ist.
Humanes Interleukin-3, wie der Ausdruck hier verwendet wird, entspricht der Aminosäuresequenz (1-133), wie sie in 1 gezeigt ist, und (15-125)hIL-3 entspricht der 15- bis 125-Aminosäuresequenz des hIL-3-Polypeptids. Natürlich auftretende Varianten von hIL-3-Polypeptid-Aminosäuren sind auch (z.B. das Allel, in dem Prolin anstatt Serin in Position 8 in der hIL-3-Polypeptidsequenz ist) Varianten-hIL-3-Moleküle, die posttranslational (z.B. durch Glykosylierung) modifiziert sind.
"Mutante Aminosäuresequenz", "mutantes bzw. mutiertes Protein" oder "mutantes bzw. mutiertes Polypeptid" beziehen sich auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von einer nativen Sequenz unterscheidet und durch eine Nucleotidsequenz codiert wird, die absichtlich von einer nativen Sequenz variant gemacht wurde. "Mutantes Protein", "variantes Protein" oder "Mutein" bezeichnet ein Protein, das eine mutante Aminosäuresequenz umfasst, und beinhaltet Polypeptide, die sich von der Aminosäuresequenz von nativem hIL-3 durch Aminosäure-Deletionen, -Substitutionen oder beides unterscheiden. "Native Sequenz" bezieht sich auf eine Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenz, die identisch mit einer Wildtyp- oder nativen Form eines Gens oder Proteins ist.
Humanes IL-3 kann durch seine Fähigkeit, die Kolonienbildung durch humane hämatopoetische Progenitorzellen zu stimulieren, charakterisiert werden. Die gebildeten Kolonien umfassen Erythroidzellen, Granulozyten, Megakaryozyten, granulozytische Makrophagen und Gemische davon. Humanes IL-3 hat Fähigkeit zur Wiederherstellung der Knochenmarksfunktion und der peripheren Blutzellpopulationen zu therapeutisch günstigen Leveln in Studien bewiesen, die zunächst an Primaten und anschließend an Menschen durchgeführt wurden (Gillio, A.P., et al. (1990); Ganser, A., et al. (1990); Falk, S., et al. (1991). Zusätzliche Aktivitäten von hIL-3 umfassen die Fähigkeit, die Leukozytenmigration und die Chemotaxis zu stimulieren; die Fähigkeit, humane Leukozyten zur Produktion hoher Konzentrationen an inflammatorischen Mediatoren, wie Leukotriene und Histamin, zu veranlassen; die Fähigkeit, eine Zelloberflächenexpression von Molekülen zu induzieren, die für eine Leukozytenadhäsion benötigt werden; und die Fähigkeit, dermale Entzündungsreaktionen und Fieber auszulösen. Viele dieser biologischen Aktivitäten oder alle diese biologischen Aktivitäten von hIL-3 involvieren eine Signaltransduktion und eine Hochaffinitätsrezeptorbindung. Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung können nützliche Eigenschaften aufweisen, beispielsweise haben sie im Vergleich zu nativem hIL-3 ähnliche oder höhere biologische Aktivität oder haben eine verbesserte Halbwertszeit oder verringerte nachteilige Nebenwirkungen oder eine Kombination dieser Eigenschaften. Sie können auch als Antagonisten einsetzbar sein. Fusionsmoleküle, die im Vergleich zu nativem hIL-3 geringe oder keine Aktivität haben, können noch als Antagonisten, als Antigene für die Produktion von Antikörpern zur Verwendung in der Immunologie oder Immuntherapie, als genetische Sonden oder als Zwischenprodukte, die zum Aufbau anderer nützlicher hIL-3-Muteine eingesetzt werden, verwendbar sein.
Die neuen Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise wenigstens eine biologische Eigenschaft von humanem IL-3 und der anderen IL-3-Variante, an das es fusioniert ist, haben, und können mehr als eine IL-3-artige biologische Eigenschaft oder eine verbesserte Eigenschaft oder eine Verringerung bei einer unerwünschten biologischen Eigenschaft von humanem IL-3 haben. Einige mutante Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch ein verbessertes Nebenwirkunsgprofil aufweisen. Beispielsweise können sie eine Verringerung bei der Leukotrienfreisetzung oder Histaminfreisetzung im Vergleich zu nativem hIL-3 oder (15-125)hIL-3 aufweisen. Solche hIL-3- oder hIL-3-artigen biologischen Eigenschaften können eines oder mehrere der folgenden biologischen Charakteristika und in vivo- und in vitro-Aktivitäten umfassen.
Eine solche Eigenschaft ist die Unterstützung des Wachstums und der Differenzierung von Progenitorzellen, die mit erythroiden, lymphoiden und myeloiden Zellreihen verbunden sind. In einem humanen Knochenmarks-Standardassay ist beispielsweise eine IL-3-artige biologische Eigenschaft die Stimulation von Granulozytenkolonien, Megakaryozytenkolonien, Monozyten/Makrophagen-Kolonien und Erythroidbursts. Andere IL-3-artige Eigenschaften sind die Wechselwirkung mit frühen multipotentiellen Stammzellen, die Aufrechterhaltung des Wachstums von pluripotenten Vorläuferzellen, die Fähigkeit, die Proliferation von Fällen chronischer myeloischer Leukämie (CML) zu stimulieren, die Stimulation der Proliferation von Mastzellen, die Fähigkeit, das Wachstum verschiedener Faktor-abhängiger Zelllinien zu unterstützen, und die Fähigkeit, unreife Knochenmarkszell-Progenitoren auszulösen. Andere biologische Eigenschaften von IL-3 wurden auf dem Fachgebiet offenbart. Humanes IL-3 hat auch einige biologische Aktivitäten, die in einigen Fällen unerwünscht sein können, z.B. die Fähigkeit, die Leukotrienfreisetzung zu stimulieren, und die Fähigkeit, eine verstärkte Histaminsynthese in Milz- und Knochenmarkskulturen und in vivo zu stimulieren.
Die biologische Aktivität von hIL-3 und hIL-3-Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung wird durch DNA-Synthese durch humane Zellen der akuten myeloischen Leukämie (AML) bestimmt. Die Faktor-abhängige Zelllinie AML 193 wurde zur Verwendung beim Testen biologischer Aktivität angepasst. Die biologische Aktivität von hIL-3 und hIL-3-Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung wird auch durch Zählen der Kolonie-bildenden Einheiten in einem Knochenmarks-Assay bestimmt.
Andere in vitro-Assays auf Zellbasis können nützlich sein, um die Aktivität der Fusionsmoleküle in Abhängigkeit von Kolonie-stimulierenden Faktoren, die die Fusion umfasst, zu bestimmen. Nachfolgend werden Beispiele von anderen einsetzbaren Assays gegeben.
TF-1-Proliferations-Assay: Die TF-1-Zelllinie stammte aus Knochenmark eines Patienten mit Erythroleukämie (Kitamura et al., 1989). TF-1-Zellen sprechen auf IL-3, GM-CSF, EPO und IL-5 an.
32D-Proliferations-Assay: 32D ist eine murine IL-3-abhängige Zelllinie, die nicht auf humanes IL-3 anspricht, aber auf humanen G-CSF anspricht, der nicht Spezies-beschränkt ist. T1165-Proliferations-Assay: T1165-Zellen sind eine IL-6-abhängige murine Zelllinie (Nordan et al., 1986), die auf IL-6 und IL-11 anspricht.
Human Plasma Clot-meg-CSF-Assay: Verwendet, um Megakaryozytenkolonie-Bildungsaktivität zu analysieren (Mazur et al., 1981).
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer hIL-3-Variante, wie sie in den Ansprüchen definiert ist, die im Vergleich zu nativem hIL-3 oder einer IL-3-Variante ähnliche oder verbesserte biologische Aktivität hat.
Die hIL-3-Varianten-Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung haben hIL-3- oder hIL-3-artige Aktivität. Sie können z.B. eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten von nativem hIL-3 besitzen und können bei der Stimulierung der Produktion von hämatopoetischen Zellen durch humane oder Primaten-Progenitorzellen einsetzbar sein. Die Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung und pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese enthalten, können bei der Behandlung von Krankheitsbildern, in denen hämatopoetische Zellpopulationen durch Krankheit oder durch Behandlungen, wie Strahlen- oder Chemotherapie, verringert oder zerstört worden sind, einsetzbar sein. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung enthalten, können parenteral, intravenös oder subkutan verabreicht werden.
Natives hIL-3 besitzt beachtliche inflammatorische Aktivität, und es hat sich gezeigt, dass es die Synthese der Arachidonsäure-Metaboliten LTC₄, LTD₄ und LTE₄, die Histaminsynthese und Histaminfreisetzung stimuliert. Klinische Versuche mit nativem hIL-3 an Menschen haben inflammatorische Antworten dokumentiert (Biesma et al., BLOOD, 80:1141-1148 (1992), und Postmus et al., J. CLIN. ONCOL., 10:1131-1140 (1992)). Eine neuere Studie gibt an, dass Leukotriene bei IL-3-Wirkungen in vivo involviert sind und signifikant zu den biologischen Effekten einer IL-3-Behandlung beitragen können (Denzlinger, C., et al., BLOOD, 81:2466-2470 (1993)).
Einige Fusionsmoleküle der Erfindung können im Vergleich zu nativem hIL-3 ein verbessertes therapeutisches Profil haben. Beispielsweise können einige Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung verglichen mit nativem hIL-3 eine ähnliche oder stärkere Wachstumsfaktoraktivität haben, ohne dass sie eine ähnliche oder entsprechende Zunahme bei der Stimulation von Leukotrien oder Histamin haben. Von diesen Fusionsmolekülen würde erwartet, dass sie ein günstigeres therapeutisches Profil haben, da die Menge an Polypeptid, die zur Erreichung der gewünschten Wachstumsfaktoraktivität (z.B. Zellproliferation) gegeben werden muss, einen geringeren Leukotrien- oder Histamin-stimulierenden Effekt haben würde. In Untersuchungen mit nativem hIL-3 war die Stimulation von inflammatorischen Faktoren eine unerwünschte Nebenwirkung der Behandlung. Verringerung oder Eliminierung der Stimulation von Entzündungsmediatoren würden gegenüber der Verwendung von nativem hIL-3 einen Vorteil liefern.
Neue Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung können als Antagonisten einsetzbar sein, die den hIL-3-Rezeptor blockieren, indem sie spezifisch daran binden und eine Bindung des Agonisten verhindern.
Ein potentieller Vorteil der neuen Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung, insbesondere solcher, die eine Aktivität ähnlich der von nativem hIL-3 oder besser als diese beibehalten, ist der, dass es möglich sein kann, eine geringere Menge des biologisch aktiven Muteins zu verwenden, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu erzeugen. Dies kann es möglich machen, die Anzahl von Behandlungen zu reduzieren, die notwendig sind, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu erzeugen. Die Verwendung von kleineren Mengen kann auch die Möglichkeit potentieller antigener Wirkungen oder anderer möglicher unerwünschter Nebenwirkungen verringern. Wenn z.B. eine gewünschte therapeutische Wirkung mit einer geringeren Menge an Polypeptid erreicht werden kann, kann es möglich sein, Nebenwirkungen, die mit der Verabreichung von nativem IL-3 assoziiert sind, z.B. die Stimulation von Leukotrien- und/oder Histaminfreisetzung, zu reduzieren oder zu eliminieren. Die neuen Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung können auch bei der Aktivierung von Stammzellen oder Progenitoren, die niedrige Rezeptorzahlen haben, einsetzbar sein.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die DNA-Sequenzen, die für die Fusionsproteine codieren, DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen ähnlich sind und im Wesentlichen dieselbe Funktion erfüllen, und DNA-Sequenzen, die sich von den DNAs, die für die Fusionsmoleküle der Erfindung codieren, nur durch die Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheiden. Auch enthalten in der vorliegenden Erfindung sind die Oligonucleotid-Zwischenprodukte, die verwendet werden, um die mutanten DNAs zu konstruieren, und die Polypeptide, die durch diese Oligonucleotide codiert werden. Diese Polypeptide können als Antagonisten oder als antigene Fragmente für die Herstellung von Antikörpern, die in Immunoassay- und Immuntherapie-Protokollen einsetzbar sind, nützlich sein.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise durch Gentechnologie des Standes der Technik hergestellt; US-Patent Nr. 4 935 233 und Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Ein Verfahren zur Erzeugung der bevorzugten hIL-3 (15-125)-Mutantengene ist die Kassettenmutagenese [Wells et al. (1985)], wobei ein Teil der codierenden Sequenz von hIL-3 in einem Plasmid durch synthetische Oligonucleotide ersetzt wird, die für die gewünschten Aminosäure-Substitutionen in einem Teil des Gens zwischen zwei Restriktionsstellen codieren. In ähnlicher Art könnten Aminosäure-Substitutionen in einem Volllängen-hIL-3-Gen oder Genen, die für Varianten von hIL-3 codieren, wobei 1 bis 14 Aminosäuren vom N-Terminus und/oder 1 bis 15 Aminosäuren vom C-Terminus deletiert wurden, hergestellt werden. Wenn diese Oligonucleotide passend zusammengebaut sind, würden sie für hIL-3-Varianten mit den gewünschten Aminosäure-Substitutionen und/oder -Deletionen vom N-Terminus und/oder C-Terminus codieren. Diese und andere Mutationen könnten vom Fachmann durch andere Mutageneseverfahren erzeugt werden; diese umfassen Oligonucleotid-spezifische Mutagenese [Zoller und Smith (1982, 1983, 1984), Smith (1985), Kunkel (1985), Taylor et al. (1985), Deng und Nickoloff (1992)] oder Polymerasekettenreaktions (PCR)-Techniken [Saiki (1985)].
Es können Paare komplementärer synthetischer Oligonucleotide, die für das gewünschte Gen codieren, hergestellt und aneinander angelagert werden. Die DNA-Sequenz des Oligonucleotids würde für eine Sequenz für Aminosäuren des gewünschten Gens, mit Ausnahme von denen, die in der Sequenz ersetzt und/oder deletiert sind, codieren.
Plasmid-DNA kann mit den gewählten Restriktionsendonucleasen behandelt werden, dann an die angelagerten Oligonucleotide ligiert werden. Das ligierte Gemisch kann verwendet werden, um kompetente JM101-Zellen zur Resistenz gegenüber einem geeigneten Antibiotikum zu transformieren. Einzelkolonien können herausgenommen werden, und die Plasmid-DNA kann durch Restriktionsanalyse und/oder DNA-Sequenzierung untersucht werden, um Plasmide mit den gewünschten Genen zu identifizieren.
Ein Fusionieren der DNA-Sequenzen der hIL-3-Variante mit der DNA-Sequenz der anderen IL-3-Variante kann durch die Verwendung von Zwischenvektoren erreicht werden. Alternativ kann ein Gen direkt in einen Vektor, der das andere Gen enthält, kloniert werden. Linker und Adapter können zum Verbinden der DNA-Sequenzen wie auch zum Ersetzen verlorener Sequenzen, wenn eine Restriktionsstelle in der interessierenden Region war, verwendet werden. So wird genetisches Material (DNA), das für ein Polypeptid, einen Peptidlinker und das andere Polypeptid codiert, in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert, der eingesetzt wird, um Bakterien, Hefen, Insektenzellen oder Säugerzellen zu transformieren. Der transformierte Organismus wird wachsen gelassen, und das Protein wird durch Standardtechniken isoliert. Das resultierende Produkt ist daher ein neues Protein, das eine hIL-3-Variante über eine Linkerregion an eine zweite IL-3-Variante gebunden hat.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt Plasmid-DNA-Vektoren zur Verwendung bei der Expression dieser neuen Fusionsmoleküle bereit. Diese Vektoren enthalten die neuen DNA-Sequenzen, die oben beschrieben wurden, und die für die neuen Polypeptide der Erfindung codieren. Geeignete Vektoren, die Mikroorganismen transformieren können, welche fähig sind, die Fusionsmoleküle zu exprimieren, umfassen Expressionsvektoren, die Nucleotidsequenzen umfassen, welche für die Fusionsmoleküle codieren, die an transkriptionale und translationale Regulatorsequenzen gebunden sind, welche entsprechend den verwendeten Wirtszellen ausgewählt werden.
Vektoren, die modifizierte Sequenzen, wie sie oben beschrieben wurden, einbauen, sind in der vorliegenden Erfindung enthalten und sind bei der Herstellung der Fusionspolypeptide nützlich. Der in dem Verfahren verwendete Vektor enthält auch ausgewählte regulatorische Sequenzen in funktioneller Verbindung mit den codierenden DNA-Sequenzen der Erfindung und ist fähig, die Replikation und Expression derselben in ausgewählten Wirtszellen zu steuern.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung der neuen Fusionsmoleküle bereit. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung involviert Kultivieren einer geeigneten Zelle oder Zelllinie, die mit einem Vektor, der eine DNA-Sequenz enthält, die für eine Expression eines neuen hIL-3-Varianten-Fusionsmoleküls codiert, transformiert wurde. Geeignete Zellen oder Zelllinien können bakterielle Zellen sein. Beispielsweise sind die verschiedenen Stämme von E. coli auf dem Gebiet der Biotechnologie als Wirtszellen gut bekannt. Beispiele für solche Stämme umfassen die E. coli-Stämme JM101 [Yanish-Perron et al. (1985)] und MON105 [Obukowicz et al. (1992)]. In der vorliegenden Erfindung ist auch die Expression des Fusionsproteins enthalten, die einen chromosomalen Expressionsvektor für E. coli auf der Basis des Bakteriophagen Mu verwendet (Weinberg et al., 1993). In diesem Verfahren können auch verschiedene Stämme von B. subtilis verwendet werden. Dem Fachmann ist auch bekannt, dass viele Stämme von Hefezellen als Wirtszellen zur Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide auf dem Fachgebiet verfügbar sind. Bei Expression in das E. coli-Zytoplasma können die oben genannten mutanten hIL-3-Varianten-Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung auch mit Met-Ala- am N-Terminus konstruiert sein, so dass das Met bei Expression abgespalten wird, wobei Ala am N-Terminus zurückbleibt. Die Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung können Fusionspolypeptide umfassen, die Met-, Ala- oder Met-Ala- am N-Terminus gebunden haben. Wenn die Fusionsmoleküle in das Zytoplasma von E. coli exprimiert werden, werden Polypeptide mit und ohne Met, das an den N-Terminus gebunden ist, erhalten. Die N-Termini von Proteinen, die im Zytoplasma von E. coli gebildet werden, werden durch posttranslationales Processing durch Methionin-Aminopeptidase (Ben-Bassat et al., 1987) und möglicherweise durch andere Peptidasen beeinträchtigt. Diese mutanten Fusionsmoleküle können auch in E. coli exprimiert werden, indem ein Signalpeptid an den N-Terminus fusioniert wird. Dieses Signalpeptid wird als Teil des Sekretionsprozesses vom Polypeptid abgespalten. Eine Sekretion in E. coli kann verwendet werden, um die korrekte Aminosäure am N-Terminus (z.B. Asn¹⁵ im (15-125)hIL-3-Polypeptid) durch die genaue Natur der Signalpeptidase zu erhalten. Dies steht im Gegensatz zur Heterogenität, die oft am N-Terminus von Proteinen beobachtet wird, die im Cytoplasma in E. coli exprimiert werden.
Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind auch Säugerzellen, z.B. Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO) geeignet. Allgemeine Verfahren zur Expression von Fremdgenen in Säugerzellen werden in: Kaufman, R.J. (1987), High level production of proteins in mammalian cells, in Genetic Engineeering, Principles and Methods, Bd. 9, J.K. Setlow, Herausg. Plenum Press, New York, zusammengefasst. Es wird ein Expressionsvektor kon struiert, indem ein starker Promotor, der in Säugerzellen arbeiten kann, eine Transkription einer für ein eukaryotisches Sekretionssignalpeptid-codierenden Region, die translational an die für das Fusionsmolekül codierende Region fusioniert ist, steuert. Beispielsweise können Plasmide, wie z.B. pcDNAI/Neo, pRc/RSV und pRc/CMV (erhalten von Invitrogen Corp., San Diego, Californien) eingesetzt werden. Die für das eukaryotische Sekretionssignalpeptid codierende Region kann aus dem hIL-3-Gen selbst sein oder kann aus einem anderen sezernierten Säugerprotein sein (Bayne, M.L. et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2638-2642). Nach Konstruktion des Vektors, der das hIL-3-Varianten-Gen enthält, wird die Vektor-DNA in Säugerzellen transfiziert. Solche Zellen können z.B. die COS7-, HeLa-, BHK-, CHO- oder Maus-L-Linien sein. Die Zellen können z.B. in DMEM-Medium (JRH Scientific) kultiviert werden. Die in das Medium sezernierte hIL-3-Variante kann durch biochemische Standardansätze nach transienter Expression 24 bis 72 Stunden nach Transfektion der Zellen oder nach Entwicklung stabiler Zelllinien nach Selektion auf Neomycin-Resistenz isoliert werden. Die Selektion geeigneter Säugerwirtszellen und Verfahren zur Transformation, Kultur, Amplifikation, zum Screening und Produktproduktion und -reinigung sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. Gething und Sambrook, Nature, 293:620-625 (1981), oder alternativ Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 5(7):1750-1759 (1985), oder Howley et al., US-Patent Nr. 4 419 446. Eine andere geeignete Säugerzelllinie ist die Affen-COS-1-Zelllinie. Eine ähnlich nützliche Säugerzelllinie ist die CV-1-Zelllinie.
Wenn gewünscht, können Insektenzellen als Wirtszellen im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Siehe z.B. Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298 (Plenum Press 1986) und darin angegebenen Literaturstellen. Außerdem werden allgemeine Verfahren zur Expression von Fremdgenen in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Vektoren bei Summers, M.D. und Smith, G.E. (1987) – A manual of methods for Baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nr. 1555, beschrieben. Es wird ein Expressionsvektor konstruiert, der einen Baculovirus-Transfervektor umfasst, indem ein starker Baculovirus-Promotor (z.B. der Polyhedron-Promotor) eine Transkription einer für eukaryotisches Sekretionssignalpeptid codierenden Region, die translational an die codierende Region für das Fusionspolypeptid fusioniert ist, steuert. Z.B. kann das Plasmid pVL1392 (erhalten von Invitrogen Corp., San Diego, Californien) verwendet werden. Nach Konstruktion des Vektors, der das Gen trägt, das für das Fusionspolypeptid codiert, werden zwei Mikrogramm dieser DNA mit einem Mikrogramm Baculovirus-DNA (siehe Summers & Smith, 1987) in Insektenzellen, Stamm SF9, cotransfiziert. Reines rekombinantes Baculovirus, das das Fusionsmolekül trägt, wird verwendet, um kultivierte Zellen, z.B. in Excell 401-Serum-freiem Medium (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), zu infizieren. Das in das Medium sezernierte Fusionsmolekül kann durch biochemische Standardansätze gewonnen werden. Überstände von Säuger- oder Insektenzellen, die das Fusionsprotein exprimieren, können zuerst konzentriert werden, wobei eine beliebige einer Reihe im Handel verfügbarer Konzentrierungseinheiten verwendet wird.
Die Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung können in der Behandlung von Krankheiten nützlich sein, welche durch verringern Level entweder myeloider, erythroider, lymphoider oder Megakaryozyten-Zellen des hämatopoetischen Systems oder Kombinationen davon gekennzeichnet sind. Außerdem können sie verwendet werden, um reife myeloide und/oder lymphoide Zellen zu aktivieren. Unter Zuständen, die für eine Behandlung mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden ansprechen, ist Leukopenie, eine Verringerung der Zahl an zirkulierenden Leukozyten (weiße Blutkörperchen) im peripheren Blut. Leukopenie kann durch Exposition bestimmter Viren oder Strahlung induziert werden. Sie ist oft eine Nebenwirkung verschiedener Formen der Krebstherapie, z.B. Behandlung mit chemotherapeutischen Arzneimitteln, Bestrahlung, und eine Nebenwirkung einer Infektion oder Hämorrhagie. Eine therapeutische Behandlung von Leukopenie mit diesen Fusionsmolekülen der vorliegenden Erfindung kann unerwünschte Nebenwirkungen, die durch Behandlung mit derzeit verfügbaren Arzneimitteln verursacht werden, vermeiden.
Die Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung können in der Behandlung von Neutropenie und z.B. in der Behandlung von Zuständen, wie aplastischer Anämie, cyclischer Neutropenie, idiopathischer Neutropenie, Chediak-Higashi-Syndrom, systemischem Lupus erythematodes (SLE), Leukämie, myelodysplastischem Syndrom und Myelofibrose, einsetzbar sein.
Das erfindungsgemäße Fusionsmolekül kann in der Behandlung oder Prävention von Thrombozytopenie einsetzbar sein. Derzeit ist die einzige Therapie für Thrombozytopenie Thrombozyteninfusionen, die teuer sind und signifikante Gefahren der Infektion (HIV, HBV) und Alloimmunisation tragen. Das Fusionsmolekül kann die Notwendigkeit für Thrombozytentransfusionen mildern oder verringern. Schwere Thrombozytopenie kann aus genetischen Defekten resultieren, wie z.B. Fanconi's Anämie, Wiscott-Aldrich- oder May-Hegglin-Syndrom. Erworbene Thrombozytopenie kann aus Auto- oder Allo-Antikörpern resultieren, wie z.B. immune thrombozytopenische Purpura, systemischer Lupus erythematodes, hämolytische Anämie oder fötale Mutterunverträglichkeit. Außerdem können Splenomegalie, disseminierte intravaskuläre Koagulation, thrombotische thrombozytopenische Purpura, Infektion oder künstliche Herzklappen zu Thrombozytopenie führen. Schwere Thrombozytopenie kann auch aus einer Chemotherapie und/oder einer Strahlentherapie von Krebs herrühren. Thrombozytopenie kann auch aus einer Knochenmarksinvasion durch Karzinom, Lymphom, Leukämie oder Fibrose resultieren.
Die Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung können bei der Mobilisierung von hämatopoetischen Progenitoren und Stammzellen in peripheres Blut einsetzbar sein. Progenitoren, die aus peripherem Blut stammen, haben sich als bei der Wiederherstellung von Patienten bei Einstellung einer autologen Knochenmarktransplantation als wirksam erwiesen. Von häma topoetischen Wachstumsfaktoren, einschließlich G-CSF und GM-CSF, wurde gezeigt, dass sie die Anzahl der zirkulierenden Progenitoren und Stammzellen im peripheren Blut erhöhen. Dies hat das Verfahren zur Sammlung peripherer Stammzellen vereinfacht und die Kosten des Verfahrens drastisch reduziert, indem die notwendige Pheresezahl gesenkt wurde. Das Fusionsmolekül kann bei der Mobilisierung von Stammzellen einsetzbar sein und kann außerdem die Wirksamkeit einer Transplantation von peripheren Stammzellen erhöhen.
Eine weitere geplante klinische Verwendung von Wachstumsfaktoren war die in vitro-Aktivierung von hämatopoetischen Progenitoren und Stammzellen für die Gentherapie. Um das interessierende Gen in das Genom der hämatopoetischen Progenitor- oder Stammzelle eingebaut zu haben, ist es notwendig, Zellteilung und DNA-Replikation zu stimulieren. Hämatopoetische Stammzellen durchlaufen den Zyklus mit sehr niedriger Frequenz, was bedeutet, dass Wachstumsfaktoren nützlich sein können, um eine Gentransduktion zu fördern und dadurch die klinischen Aussichten für eine Gentherapie zu erhöhen.
Viele Arzneimittel bzw. Wirkstoffe können Knochenmarksuppression oder hämatopoetische Mängel verursachen. Beispiele für solche Arzneimittel sind AZT, DDI, Alkylierungsmittel und Antimetaboliten, die in der Chemotherapie eingesetzt werden, Antibiotika, wie z.B. Chloramphenicol, Penicillin, Gancyclovir, Daunomycin, und Arzneimittel auf Sulfonamid-Basis, Phenothiazone, Tranquilizer, wie z.B. Meprobamat, Analgetika, wie z.B. Aminopyrin und Dipyron, Antikonvulsiva, z.B. Phenytoin oder Carbamazepin, Thyreostatika, wie z.B. Propylthiouracil und Methimazol, und Diuretika. Die Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung können bei der Prävention oder Behandlung der Knochenmarksuppression oder hämatopoetischer Defizientien, die oft bei Patienten auftreten, die mit diesen Arzneimitteln behandelt werden, einsetzbar sein.
Hämatopoetische Defizientien können auch als Resultat viraler, mikrobieller oder parasitärer Infektionen und als Resultat einer Behandlung auf Nierenerkrankung oder Nierenversagen, z.B. Dialyse, auftreten. Die Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung können bei der Behandlung einer derartigen hämatopoetischen Defiziens nützlich sein.
Die Behandlung von hämatopoetischer Defiziens kann eine Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die die Fusionsmoleküle enthält, an einen Patienten umfassen. Die Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung können auch zur Aktivierung und Amplifikation von hämatopoetischen Vorläuferzellen einsetzbar sein, indem diese Zellen in vitro mit den Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung behandelt werden, bevor die Zellen einem Patienten injiziert werden.
Verschiedene Immundefizientien, z.B. in T- und/oder B-Lymphozyten, oder Immunerkrankungen, z.B. rheumatoide Arthritis, können durch Behandlung mit den Fusionsmolekülen der vorliegenden Erfindung ebenfalls günstig beeinflusst werden. Immundefizientien können das Resultat viraler Infektionen, z.B. HTLVI, HTLVII, HTLVIII, starker Bestrahlung, Krebstherapie oder das Resultat anderer medizinischer Behandlung sein. Die Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung können auch allein oder in Kombination mit anderen Hämatopoietinen bei der Behandlung anderer Blutzelldefizientien, einschließlich Thrombozytopenie (Thrombozytendefiziens) oder Anämie, verwendet werden. Andere Verwendungen für diese neuen Polypeptide liegen in der Behandlung von Patienten, die sich von Knochenmarktransplantationen, in vivo und ex vivo, erholen, und in der Entwicklung von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, die durch Standardverfahren erzeugt werden, für eine diagnostische oder therapeutische Verwendung.
Andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind Verfahren und therapeutische Zusammensetzungen zur Behandlung der oben genannten Zustände bzw. Krankheitsbilder. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer der Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Diese Zusammensetzung kann entweder parenteral, intravenös oder subkutan verabreicht werden. Bei Verabreichung liegt die therapeutische Zusammensetzung zur Verwendung in dieser Erfindung vorzugsweise in Form einer Pyrogen-freien, parenteral akzeptablen, wässrigen Lösung vor. Die Herstellung einer solchen parenteral akzeptablen Proteinlösung liegt, was den pH, die Isotonität, Stabilität und dergleichen, angeht, im Rahmen des Fachwissens eines Fachmanns. Der in einem Verfahren zur Behandlung der oben beschriebenen Zustände involvierte Dosierungsplan wird vom behandelnden Arzt unter Berücksichtigung verschiedener Faktoren, die die Wirkung von Arzneimitteln modifizieren, wie z.B. Zustand, Körpergewicht, Geschlecht und Ernährung des Patienten, der Schwere einer Infektion, die Verabreichungszeit und andere klinische Faktoren, bestimmt werden. Im Allgemeinen wird ein Tagesplan den Bereich von 0,2 bis 150 μg/kg Fusionsprotein pro Kilogramm Körpergewicht umfassen. Dieser Dosierungsplan bezieht sich auf einen Standardlevel der biologischen Aktivität, der anerkennt, dass natives IL-3 im Allgemeinen einen EC₅₀-Wert von etwa 10 Picomolar bis 100 Picomolar im AML-Proliferationsassay, der hierin beschrieben wird, besitzt. Daher würden Dosierungen bezüglich der Aktivität eines gegebenen Fusionsproteins vs. die Aktivität von nativem (Referenz) IL-3 eingestellt, und es wäre nicht unvernünftig, anzugeben, dass Dosierungspläne niedrige Dosen, wie 0,1 Mikrogramm, und hohe Dosen, wie 1 Milligramm, pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag umfassen können. Außerdem können besondere Umstände vorliegen, bei denen Dosierungen des Fusionsmoleküls höher oder niedriger als der Bereich von 10 bis 200 Mikrogramm pro Kilogramm Körpergewicht eingestellt würden. Diese umfassen eine Co-Verabreichung mit einem anderen Kolonie-stimulierenden Faktor oder einer IL-3-Variante oder Wachstumsfaktoren; eine Co-Verabreichung mit chemotherapeutischen Arzneimitteln und/oder Bestrahlung; die Verwendung von glykosyliertem Fusionsprotein sowie verschiedenen, mit dem Patienten in Verbindung stehende Umstände, die früher in diesem Abschnitt genannt wurden. Wie oben angegeben wurde, können das therapeutische Verfahren und die therapeutischen Zusammensetzungen auch eine Co-Verabreichung mit anderen humanen Faktoren beinhalten. Eine nicht-ausschließliche Liste von anderen geeigneten Hämatopoietinen, CSFs, Cytokinen, Lymphokinen, hämatopoetischen Wachstumsfaktoren und Interleukinen für eine gleichzeitige oder eine aufeinanderfolgende Co-Verabreichung mit den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung umfasst GM-CSF, CSF-1, G-CSF, Meg-CSF (neuerdings als c-mpl-Ligand bezeichnet), M-CSF, Erythropoietin (EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, LIF, flt3/flk2, B-Zell-Wachstumsfaktor, B-Zell-Differenzierungsfaktor und Eosinophilen-Differenzierungsfakor, Stammzellfaktor (SCF), auch bekannt als Steel-Faktor oder c-kit-Ligand, oder Kombinationen davon. Die oben genannte Dosierung würde so eingestellt werden, dass zusätzliche Komponenten in der therapeutischen Zusammensetzung ausgeglichen werden. Fortschritte des behandelten Patienten können durch periodische Beurteilung des hämatologischen Profils, z.B. differentielle Zellzählung und dergleichen, überwacht werden.
Materialien und Verfahren zur Fusionsmolekül-Expression in E. coli
Wenn nichts anderes angegeben ist, werden alle Spezialchemikalien von Sigma Co. (St. Louis, MO) erhalten. Restriktionsendonucleasen, T4-Polynucleotidkinase, E. coli-DNA-Polymerase I-großes Fragment (Klenow) und T4-DNA-Ligase werden von New England Biolabs (Beverly, Massachusetts) erhalten.
Escherichia coli-Stämme
Stamm JM101: delta (pro lac), supE, tli, F'(traD36, rpoAB, lacI-Q, lacZdeltaM15) (Messing, 1979). Dieser Stamm kann von der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Eingangsnummer 33876, erhalten werden. MON105 (W3110 rpoH358) ist ein Derivat von W3110 (Bachmann, 1972); ihm wurde die ATCC-Eingangsnummer 55204 zugeordnet. Stamm GM48: dam-3, dcm-6, gal, ara, lac, thr, leu, tonA, tsx (Marinus, 1973) wird verwendet, um Plasmid-DNA herzustellen, die an der Sequenz GATC nicht methyliert ist.
Gene und Plasmide
Das zur hIL-3-Produktion in E. coli verwendete Gen wird von British Biotechnology Incorporated, Cambridge, England, Katalog-Nr. BBG14, erhalten. Dieses Gen wird auf einem auf pUC basierenden Plasmid, das pP0518 genannt wird, getragen. Von R&D Systems, Inc. (Minn, MN) können viele andere humane CSF-Gene erhalten werden, einschließlich IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, G-CSF, GM-CSF und LIF.
Die zur Produktion von hIL-3 in E. coli verwendeten Plasmide enthalten genetische Elemente, deren Verwendung beschrieben wurde (Olins et al., 1988; Olins und Rangwala, 1990). Das verwendete Replikon ist das von pBR327 (Covarrubias et al., 1981), das mit einer Kopienzahl von etwa 100 in der Zelle gehalten wird (Soberon et al., 1980). Auf den Plasmiden ist ein Gen vorhanden, das für das beta-Lactamaseprotein codiert. Dieses Protein verleiht der Zelle Ampicillin-Resistenz. Diese Resistenz dient als selektierbarer Phänotyp für das Vorliegen des Plasmids in der Zelle.
Für cytoplasmische Expressionsvektoren ist der Transkriptionspromotor vom recA-Gen von E. coli (Sancar et al., 1980) abgeleitet. Dieser Promotor, der precA genannt wird, umfasst die RNA-Polymerase-Bindungsstelle und die lexA-Repressor-Bindungsstelle (den Operator). Dieses DNA-Segment stellt eine Transkription auf hohem Level bereit, die sogar reguliert ist, wenn der recA-Promotor auf einem Plasmid mit dem pBR327-Replikationsursprung ist (Olins et al., 1988).
Die verwendete Ribosomen-Bindungsstelle ist die aus Gen 10 von Phage T7 (Olins et al., 1988). Dieser wird in einem 100 Basenpaar (bp)-Fragment codiert, das zu precA benachbart ist. In den hierin verwendeten Plasmiden folgt die Erkennungssequenz für das Enzym NcoI (CCATGG) auf g10-L. An dieser NcoI-Stelle werden die hIL-3-Gene mit dem Plasmid verknüpft. Es wird erwartet, dass die Nucleotidsequenz an dieser Verbindungsstelle in mRNA als funktionelle Startstelle zur Translation erkannt werden wird (Olins et al., 1988). Die verwendeten hIL-3-Gene wurden gentechnisch so verändert, dass sie eine HindIII-Erkennungsstelle (AAGCTT) stromabwärts von der codierenden Sequenz des Gens haben. An dieser HindIII-Stelle ist ein 514 Basenpaar RsaI-Fragment, das den Replikationsursprung des einzelsträngigen Phagen fl enthält (Dente et al., 1983; Olins et al., 1990). Ein Plasmid, das diese Elemente enthält, ist pMON2341. Ein anderes Plasmid, das diese Elemente enthält, ist pMON5847, das bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, unter der Eingangsnummer ATCC 68912 hinterlegt wurde.
Bei Sekretionsexpressionsplasmiden stammt der Transkriptionspromotor von den ara B-, A- und D-Genen von E. coli (Greenfield et al., 1978). Dieser Promotor wird pAraBAD genannt und ist in einem 323 Basenpaar-SacII, BglII-Restriktionsfragment enthalten. Der LamB-Sekretionsleader (Wong et al., 1988, Clement et al., 1981) ist an den N-Terminus des hIL-3-Gens an der Erkennungssequenz für das Enzym NcoI (5'CCATGG3') fusioniert. Die hIL-3-Gene, die verwendet wurden, wurden gentechnisch so verändert, dass sie eine HindIII-Erkennungsstelle (5'AAGCTT3') auf die codierende Sequenz des Gens folgend haben.
DNA-Rekombinationsverfahren
Synthetische Genanordnung
Die hIL-3-Varianten-Gene und andere CSF-Gene können durch die Anordnung synthetischer Oligonucleotide konstruiert werden.
Synthetische Oligonucleotide werden so konzipiert, dass sie in komplementären Paaren mit vorstehenden einzelsträngigen Enden aneinander lagern, und wenn die Paare korrekt angeordnet sind, werden sie zu einer DNA-Sequenz führen, die einen Teil des gewünschten Gens codiert. Aminosäuresubstitutionen im hIL-3-Gen werden durchgeführt, indem die Oligonucleotide entwickelt werden, die für die gewünschten Substitutionen codieren. Die komplementären Oligonucleotide werden mit einer Konzentration von 1 Picomol pro Mikroliter in Ligationspuffer plus 50 mM NaCl angelagert (annealed). Die Proben werden in einem 100 ml-Becher mit siedendem Wasser erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Ein Picomol jedes der aneinandergelagerten Paare von Oligonucleotiden wird mit etwa 0,2 Picomol Plasmid-DNA, verdaut mit den geeigneten Restriktionsenzymen, in Ligationspuffer (25 mM Tris, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP, 2 mM Spermidin) mit T4-DNA-Ligase, erhalten von New England Biolabs (Beverly, Massachusetts), in einem Gesamtvolumen von 20 μl bei Raumtemperatur über Nacht ligiert.
Polymerasekettenreaktion
Polymerasekettenreaktion (im Folgenden als PCR bezeichnet)-Techniken (Saiki, 1985) verwendeten den Reagens-Kit und den Thermocycler von Perkin-Elmer Cetus (Norwalk, CT). PCR basiert auf einer thermostabilen DNA-Polymerase von Thermus aquaticus. Die PCR-Technik ist ein DNA-Amplifikationsverfahren, das den natürlichen DNA-Replikationsprozess nachahmt, in dem sich die Anzahl der DNA-Moleküle nach jedem Zyklus verdoppelt, der ähnlich einer in vivo-Replikation ist. Die DNA-Polymerase-vermittelte Extension erfolgt in 5'-zu-3'-Richtung. Der Ausdruck "Primer", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Oligonucleotidsequenz, die ein Ende bereitstellt, an das die DNA-Polymerase Nucleotide addieren kann, die zu einer Nucleotidsequenz komplementär sind. Die letztgenannte Nucleotidsequenz wird als "Matrize" bezeichnet, an welche die Primer angelagert werden. Das amplifizierte PCR-Produkt wird als die Region definiert, die zwischen den 5'-Enden der Extensionsprimer enthalten ist. Da die Primer Sequenzen definiert haben, wird das Produkt diskrete Enden haben, die den Primersequenzen entsprechen. Die Primerextension wird unter Verwendung von 20 Picomol (pmol) von jedem der Oligonucleotide und 1 Picogramm Matrizen-Plasmid-DNA über 35 Zyklen durchgeführt (1 Zyklus ist definiert als 94 Grad Celsius für eine Minute, 50 Grad Celsius für zwei Minuten und 72 Grad für drei Minuten). Das Reaktionsgemisch wird mit einem gleichen Volumen an Phenol/Chloroform (50% Phenol und 50% Chloroform, Volumen zu Volumen) extrahiert, um Proteine zu entfernen. Die wässrige Phase, die die amplifizierte DNA enthält, und die Lösungsmittelphase werden durch Zentrifugation für 5 Minuten in einer Mikrozentrifuge (Modell 5414 Eppendorf Inc., Fremont CA.) getrennt. Um die amplifizierte DNA auszufällen, wird die wässrige Phase entfernt und in ein frisches Röhrchen übertragen, in das 1/10 Volumen 3M NaOAc (pH 5,2) und 2,5 Volumina Ethanol (100%, gelagert bei –20 Grad C) gegeben werden. Die Lösung wird gemischt und für 20 Minuten auf Trockeneis gestellt. Die DNA wird durch Zentrifugation für 10 Minuten in einer Mikrozentrifuge pelletisiert, und die Lösung wird vom Pellet entfernt. Das DNA-Pellet wird mit 70% Ethanol gewaschen, Ethanol wird entfernt, und es wird in einem Speedvac-Konzentrator (Savant, Farmingdale, New York) getrocknet. Das Pellet wird in 25 Mikroliter TE (20 mM Tris-HCl, pH 7,9, 1 mM EDTA) resuspendiert. Alternativ wird die DNA durch Zugabe eines gleichen Volumens an 4M NH₄OAc und eines Volumens Isopropanol [Treco et al., (1988)] präzipitiert. Die Lösung wird gemischt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und zentrifugiert. Diese Bedingungen präzipitieren DNA-Fragmente, die größer als ~ 20 Basen sind, selektiv und werden zur Entfernung von Oligonucleotid-Primern eingesetzt. Ein Viertel der Reaktion wird mit Restriktionsenzymen [Higuchi (1989)] vollständig verdaut, dann auf 70 Grad C zur Inaktivierung der Enzyme erhitzt.
Gewinnung von rekombinanten Plasmiden aus Ligationsgemischen
E. coli JM101-Zellen werden für eine DNA-Aufnahme kompetent gemacht. Typischerweise werden 20 bis 100 ml Zellen in LB-Medium zu einer Dichte von etwa 150 Klett-Einheiten wachsen gelassen und dann durch Zentrifugation gesammelt. Die Zellen werden in einem halben Kulturvolumen von 50 mM CaCl₂ resuspendiert und für eine Stunde bei 4°C gehalten. Die Zellen werden wieder durch Zentrifugation gesammelt und in einem Zehntel Kulturvolumen aus 50 mM CaCl₂ resuspendiert. DNA wird zu einem 150 Mikroliter-Volumen dieser Zellen gegeben, und die Proben werden für 30 Minuten bei 4°C gehalten. Die Proben werden für eine Minute auf 42°C gebracht, es wird ein Milliliter LB zugesetzt, und die Proben werden für eine Stunde bei 37°C geschüttelt. Zellen aus diesen Proben werden auf Platten, die Ampicillin enthalten, ausgebreitet, um auf Transformanten zu selektieren. Die Platten werden über Nacht bei 37°C inkubiert. Einzelne Kolonien werden herausgenommen, in LB, ergänzt mit Ampicillin, über Nacht bei 37°C unter Schütteln wachsen gelassen. Aus diesen Kulturen wird DNA zur Restriktionsanalyse isoliert.
Kulturmedium
LB-Medium (Maniatis et al., 1982) wird zum Wachstum von Zellen zur DNA-Isolierung verwendet. M9-Minimalmedium, ergänzt mit 1,0% Casaminosäuren, Säurehydrolysiertem Casein, Difco (Detroit, Michigan), wird für Kulturen verwendet, in denen rekombinantes Fusionsmolekül produziert wird. Die Ingredientien in dem M9-Medium sind wie folgt: 3 g/Liter KH₂PO₄, 6 g/l Na₂HPO₄, 0,5 g/l NaCl, 1 g/l NH₄Cl, 1,2 mM MgSO₄, 0,025 mM CaCl₂, 0,2% Glucose (0,2% Glycerin mit dem AraBAD-Promotor), 1% Casaminosäuren, 0,1 ml/l Spurenmineralien (pro Liter 108 g FeCl₃·6H₂O, 4,0 g ZnSO₄·7H₂O, 7,0 CoCl₂·2H₂O, 7,0 g Na₂MoO₄·2H₂O, 8,0 g CuSO₄·5H₂O, 2,0 g H₃BO₃, 5,0 g MnSO₄·H₂O, 100 ml konzentrierte HCl). Als festes Medium wird Bactoagar verwendet, und Ampicillin wird mit 200 Mikrogramm pro Milliliter sowohl zu flüssigem als auch zu festem LB-Medium gegeben.
Produktion von Fusionsmolekülen in E. coli mit Vektoren, die den recA-Promotor verwenden
E. coli-Stämme, die die Plasmide von Interesse beherbergen, werden bei 37°C in M9-plus-Casaminosäuren-Medium unter Schütteln in einem Gyrotory-Wasserbad, Modell G76, von New Brunswick Scientific (Edison, New Jersey), wachsen gelassen. Das Wachstum wird mit einem Klett-Summerson-Messgerät (grün 54-Filter), Klett Mfg. Co. (New York, New York) überwacht. Bei einem Klett-Wert von etwa 150 wird ein Aliquot der Kultur (üblicherweise ein Milliliter) zur Proteinanalyse entfernt. Zu der verbleibenden Kultur wird Nalidixinsäure (10 mg/ml) in 0,1 N NaOH zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml gegeben. Die Kulturen werden bei 37°C für drei bis vier Stunden nach Zugabe von Nalidixinsäure geschüttelt. Während des Bakterienwachstums wird ein hoher Belüftungsgrad aufrecht erhalten, um eine maximale Produktion des gewünschten Genprodukts zu erreichen. Die Zellen werden unter einem Lichtmik roskop auf Vorliegen von Einschlusskörpern untersucht. Ein Milliliter-Aliquots der Kultur werden zur Analyse des Proteingehalts entfernt.
Fraktionierung von E. coli-Zellen, die Fusionsproteine im Cytoplasma produzieren
Der erste Schritt bei der Reinigung der Fusionsmoleküle besteht darin, die Zellen zu beschallen. Aliquots der Kultur werden aus Zellpellets in Beschallungspuffer: 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl und 0,1 mM PMSF, resuspendiert. Diese resuspendierten Zellen werden mehreren wiederholten Beschallungs-Bursts unterworfen, wobei die Mikrospitze aus einem Beschallungs-Zellzerkleinerungsgerät, Modell W-375, erhalten von Heat Systems-Ultrasonics Inc. (Farmingdale, New York), verwendet wurde. Das Ausmaß der Beschallung wird überwacht, indem die Homogenate unter einem Lichtmikroskop untersucht werden. Wenn nahezu alle Zellen aufgebrochen sind, werden die Homogenate durch Zentrifugation fraktioniert. Die Pellets, die die meisten der Einschlusskörper enthalten, sind mit Fusionsproteinen hoch angereichert.
Verfahren: Extraktion, Rückfaltung und Reinigung von Fusionsmolekülen, die als Einschlusskörper in E. coli exprimiert werden
Diese Fusionsproteine können durch eine Vielzahl von Standardverfahren gereinigt werden. Einige dieser Verfahren werden detailliert in Methods in Enzymology, Band 182, "Guide to Protein Purification", herausgegeben von Murray Deutscher, Academic Press, San Diego, CA (1990), beschrieben.
Fusionsproteine, die als unlösliche Einschlusskörper in E. coli produziert werden, können in hohen Konzentrationen Denaturierungsmittel, z.B. Guanidin·HCl oder Harnstoff, enthaltend Dithiothreitol oder beta-Mercaptoethanol als Reduktionsmittel, solubilisiert werden. Eine Faltung des Proteins zu einer aktiven Konformation kann über sequenzielle Dialyse zu niedrigeren Konzentrationen an Denaturierungsmittel oder Reduktionsmittel erreicht werden.
In einigen Fällen können die gefalteten Proteine unter Verwendung von Affinitätsreagentien, z.B. mAbs oder Rezeptor-Untereinheiten, die an eine geeignete Matrix gebunden sind, Affinitäts-gereinigt werden. Alternativ (oder zusätzlich) kann eine Reinigung unter Verwendung eines beliebigen einer Vielzahl chromatographischer Verfahren erreicht werden, z.B. Ionenaustausch, Gelfiltration oder hydrophobe Chromatographie oder Umkehrphasen-HPLC.
hIL-3-SANDWICH-ELISA
Die Fusionsproteinkonzentrationen können unter Verwendung eines Sandwich-ELISA auf der Basis eines geeigneten Affinitäts-gereinigten Antikörpers bestimmt werden. Mikrotiterplatten (Dynatech Immulon II) werden mit 150 μl Ziege-anti-rhIL-3 mit einer Konzentration von etwa 1 μg/ml in 100 mM NaHCO₃, pH 8,2, beschichtet. Die Platten werden über Nacht bei Raumtemperatur in einer Kammer, die eine Feuchtigkeit von 100% aufrecht erhält, inkubiert. Die Vertiefungen werden geleert, und die verbleibenden reaktiven Stellen auf der Platte werden mit 200 μl einer Lösung, die 10 mM PBS, 3% BSA und 0,05% Tween 20, pH 7,4, enthält, für 1 Stunde bei 37°C und 100% Feuchtigkeit blockiert. Die Vertiefungen werden geleert und 4X mit 150 mM NaCl, das 0,05% Tween 20 enthält (Waschpuffer), gewaschen. Jede Vertiefung nimmt dann 150 μl Verdünnungspuffer (10 mM PBS, enthaltend 0,1% BSA, 0,01% Tween 20, pH 7,4), der rhIL-3-Standard, Kontrolle, Probe oder Verdünnungspuffer allein enthält, auf. Mit Konzentrationen, die von 0,125 ng/ml bis 5 ng/ml reichen, wird eine Standardkurve erstellt, wobei eine rhIL-3-Stammlösung verwendet wird (Konzentration bestimmt durch Aminosäurezusammensetzungs-Analyse. Die Platten werden für 2,5 Stunden bei 37°C und 100% Feuchtigkeit inkubiert. Die Vertiefungen werden geleert, und die Platte wird 4X mit Waschpuffer gewaschen. Jede Vertiefung erhielt dann 150 μl einer optimalen Verdünnung (wie in einem Schachbrettmuster-Assayformat bestimmt) von Ziege-anti-rhIL-3, konjugiert an Meerrettichperoxidase. Die Platten wurden für 1,5 Stunden bei 37°C und 100% Feuchtigkeit inkubiert. Die Vertiefungen werden geleert, und jede Platte wird 4X mit Waschpuffer gewaschen. Jede Vertiefung erhält dann 150 μl ABTS-Substratlösung (Kirkegaard und Perry). Die Platten werden bei Raumtemperatur inkubiert, bis die Farbe der Standardvertiefungen, die 5 ng/ml rhIL-2 enthielten, sich ausreichend entwickelt hatten, um eine Extinktion zwischen 0,5 und 1,0 zu ergeben, wenn bei einer Testwellenlänge von 410 nm und einer Referenzwellenlänge von 570 nm an einem Dynatech-Mikrotiterplatten-Lesegerät abgelesen wurde. Konzentrationen von immunreaktivem rhIL-3 in unbekannten Proben werden aus der Standardkurve unter Verwendung von Software, die mit dem Plattenlesegerät mitgeliefert wurde, errechnet.
Die folgenden Beispiele werden die Erfindung detaillierter erläutern.
BEISPIEL 1
Konstruktion von Expressionsplasmid für Fusionsmoleküle
Konstruktion eines Plasmids, das für ein Fusionsprotein codiert, das aus dem IL-3-Variantenprotein, das in Plasmid pMON13288 (US-Patentanmeldung, Serial-No. PCT/US93/11197) gefunden wird, gefolgt von einer proteolytischen Faktor Xa-Spaltungsstelle, gefolgt von muriner IgG 2b-Hinge-Region, in der die Cysteine durch Serine ersetzt wurden, als Polypeptid-Linkersequenz zwischen den zwei Proteinen der Fusion, und gefolgt von G-CSF, besteht. Das Plasmid pMON13288 wird mit EcoRI (was im IL-3-Varianten-Gen ist) und HindIII (das sich nach den Stopkodons für die IL-3-Variante befindet) verdaut, und das 3900 Basenpaar-EcoRI, HindIII-Restriktionsfragment wird gereinigt. Die genetischen Elemente, die von pMON13288 stammen, sind das beta-Lactamase-Gen (AMP), der pBR327-Replikationsursprung, der recA-Promotor, die g10L-Ribosomen-Bindungsstelle, die Basen des (15-125)IL-3-Variantengens, die für die Aminosäuren 15-105 codieren, und der Phagen fl-Replikationsursprung. Paare komplementärer synthetischer Oligonucleotide werden so konzipiert, dass sie den Teil des IL-3-Varianten-Gens nach der EcoRI-Stelle (Basen, die für die Aminosäuren 106-125 codieren), die DNA-Sequenz, die für die Faktor Xa-Spaltungsstelle codiert, die DNA-Sequenz, die für den Polypeptid-Linker und die AflIII-Restriktionsstelle codiert, zu ersetzen, um für eine Klonierung des zweiten Gens in der Fusion zu sorgen. Wenn die Oligonucleotide passend zusammengebaut werden, führt dies zu einer DNA-Sequenz, die für die oben genannten Komponenten im Raster mit EcoRI- und HindIII-Restriktionsenden codiert. Innerhalb dieser DNA-Sequenz werden auch einmal vorkommende Restriktionsstellen geschaffen, um für den anschließenden Ersatz spezifischer Regionen durch eine Sequenz, die ähnliche Funktion hat (z.B. alternative Polypeptid-Linkerregion), zu sorgen. Die einmal vorkommende SnaBI-Restriktionsstelle wird am Ende des 13288-Gens geschaffen, die für die Klonierung anderer Gene in der C-Terminus-Position der Fusion sorgt. Eine einmal vorkommende XmaI-Stelle wird zwischen der Sequenz, die für die Faktor Xa-Spaltungsstelle codiert, und der Region, die für den Polypeptid-Linker codiert, geschaffen. Eine einmal vorkommende AflIII-Stelle wird nach der Linkerregion geschaffen, die für die Klonierung des N-terminalen Proteins der Fusion sorgt. Das 3900 Basenpaar-Fragment aus pMON13288 wird mit den zusammengebauten Oligonucleotiden ligiert und in einen geeigneten E. coli-Stamm transformiert. Die resultierenden Klone werden durch Restriktionsanalyse durchgemustert und DNA-sequenziert, um zu bestätigen, dass die gewünschte DNA-Sequenz geschaffen wurde. Das resultierende Plasmid wird als ein Zwischenprodukt verwendet, in das andere Gene kloniert werden können, wie ein NcoI, HindIII-Fragment in die AflIII- und HindIII-Stellen, um die gewünschte Fusion herzustellen. Die durch NcoI und AflIII geschaffenen Überhänge sind kompatibel, allerdings ist die flankierende Sequenz der Restriktionserkennungsstellen unterschiedlich. Die NcoI- und AflIII-Stellen gehen als Resultat der Klonierung verloren. Die oben genannten Restriktionsstellen werden als Beispiele verwendet und sind nicht auf die Beschriebenen beschränkt. Es kann auch eine andere einmal vorkommende Restriktionsstelle konstruiert werden, welche dazu dient, dass die Regionen ersetzt werden können. Das Plasmid, das für die resultierende Fusion codiert, wird DNA sequenziert, um zu bestätigen, dass die gewünschte DNA-Sequenz erhalten wurde. Andere IL-3-Varianten-Gene oder andere Gene für Kolonie-stimulierende Faktoren können in entsprechender Weise durch Gentechnologie verändert werden, um die geeigneten Restriktionsstellen zu schaffen, wodurch eine Klonierung entweder in die C-terminale oder N-terminale Position des oben beschriebenen Fusionskonstrukts ermöglicht würde. Entsprechend können alternative Peptidase-Spaltungsstellen oder Polypeptid-Linker in die Fusionsplasmide konstruiert werden.
BEISPIEL 2
Expression, Extraktion, Rückfaltung und Reinigung von Fusionsproteinen, z.B. pMON13061, exprimiert als Einschlusskörper in E. coli
E. coli-Stämme, die die Plasmide von Interesse beherbergen, werden über Nacht bei 37°C wachsen gelassen und am folgenden Morgen verdünnt, und zwar etwa 1/50, in frischem M9-plus-Casaminosäuren-Medium. Die Kultur wird bei 37°C für drei bis vier Stunden zur midlog-Phase (OD600 = ~1) und bei kräftigem Schütteln wachsen gelassen. Nalidixinsäure (10 mg/ml) in 0,1 N NaOH wird zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml zugegeben. Nach der Zugabe von Nalidixinsäure werden die Kulturen für drei bis vier Stunden bei 37°C wachsen gelassen. Während des Bakterienwachstums wird ein hoher Belüftungsgrad aufrecht erhalten, um eine maximale Produktion des gewünschten Fusionsproteins zu erreichen. In Fällen, wo die Fusionsproteine als unlösliche Einschlusskörper in E. coli produziert werden, werden die Zellen unter einem Lichtmikroskop auf das Vorliegen von Einschlusskörpern untersucht.
E. coli-Zellen, die Fusionsmoleküle in Einschlusskörpern enthielten, wurden durch Beschallung lysiert. Eine 10% (G/V)-Suspension der Zellen in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, und 1 mM EDTA wurde drei oder vier einminütigen Bursts unter Verwendung eines Beschallungs-Zellzerkleinerungsgeräts, Modell W-375, erhalten von Heat Systems-Ultrasonics Inc. (Farmingdale, New York) unterworfen. Das Ausmaß des Zellaufbrechens wurde durch Untersuchung der Zellen unter einem Lichtmikroskop überwacht. Wenn im Wesentlichen alle Zellen lysiert waren, wurden die Einschlusskörper durch Zentrifugation bei 2800 × g für 20 min geerntet. Die Einschlusskörper wurden zweimal gewaschen, indem die Einschlusskörperpellets zu 10% in Beschallungspuffer suspendiert wurden und wie oben zentrifugiert wurden.
Die Fusionsmoleküle wurden mit einem Gramm Einschlusskörper in 10 ml 8 M Harnstoff mit 50 mM Tris-HCl, pH 9,5, und 5 mM DTT gelöst, indem in einem Bio Homogenizer für 10-30 Sekunden gemischt wurde und dann leicht bei 4°C für 1-2 Stunden gerührt wurde. Das aufgelöste Fusionsprotein wurde durch Zentrifugation bei 47.000 × g für 15 Minuten geklärt.
Die Faltung des Proteins zu einer aktiven Konformation erfolgte durch 8faches Verdünnen mit 2,3 M Harnstoff in 10 mM Tris-HCl, pH 9,5, über 30 Minuten unter Senkung der Konzentration auf 3 M Harnstoff. Ein Falten des Fusionsmoleküls erfolgte normalerweise zwischen 2 und 3 M Harnstoff, obgleich auch höhere Harnstoffkonzentrationen eine Faltung erlauben werden. Die Fusion wurde unter diesen Bedingungen leicht gerührt, Luft ausgesetzt, bis Proteinfaltung und Bildung von Disulfidbindungen vollständig war. Das Fortschreiten der Faltung wurde durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) unter Verwendung einer 0,46 × 15 cm Vydac C 4-Säule (Hesperia, Californien) mit einem linearen Gradienten von 35% bis 65% Acetonitril (CH₃CN)/0,1% Trifluoressigsäure (TFA) über 25 Minuten bei 1 ml/Minute überwacht.
Nachdem die Faltung vollständig war, wurde der pH der Fusionsproteinlösung mit Eisessig auf 5,0 gesenkt, und es wurde bei 4°C inkubiert. Nach einer Stunde wurde die Lösung durch Zentrifugation bei 47.000 × g für 15 Minuten geklärt. Der pH des Überstands wurde mit Essigsäure auf 4,0 gesenkt und durch Filtration unter Verwendung eines 0,45 μ-Filters geklärt. Das Filtrat wurde gegen zwei, 100fache, Wechsel an 10 mM-Ammoniumacetat pH 4,0, dialysiert. Der pH der dialysierten Lösung wurde mit NaOH auf 6,5 erhöht. Die neutralisierte Lösung wurde dann mit 2 mg Fusionsprotein pro 1 ml Harz auf eine DEAE-Säule mit schnellem Durchfluss (Pharmacia Piscataway, NJ), die mit 10 mM Tris-Cl, pH 6,5, equilibriert worden war, aufgebracht. Das Fusionsprotein wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 50 bis 150 mM NaCl in Equilibrierungspuffer mit einem linearen Durchfluss von 0,28 cm/min für 12 Stunden equilibriert. Unter Verwendung der RP-HPLC-Analyse wurden Fraktionen mit einer Reinheit von 93% oder mehr gesammelt. Die gesammelten Fraktionen wurden gegen zwei, 100fache, Wechsel an 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, dialysiert. Die dialysierte Proteinlösung wurde steril filtriert, wobei ein 0,45 μ-Filter verwendet wurde, und bei 4°C gelagert. RP-HPLC und Kationenaustauschchromatographie, z.B. CM Fast Flow, können getrennt oder in Kombination mit DEAE-Chromatographie verwendet werden, um die Fusionsproteine zu reinigen.
Das gereinigte Fusionsprotein wurde durch RP-HPLC, Elektrospray-Massenspektrometrie, IEF und SDS-PAGE analysiert. Die quantitative Proteinbestimmung erfolgte durch Aminosäurezusammensetzungs- und Bradford-Proteinbestimmung.
In einigen Fällen können die gefalteten Proteine unter Verwendung von Affinitätsreagentien, z.B. mAbs oder Rezeptor-Untereinheiten, die an eine geeignete Matrix gebunden sind, affinitätsgereinigt werden. Alternativ (oder zusätzlich) kann eine Reinigung unter Verwendung eines beliebigen einer Vielzahl chromatographischer Verfahren erreicht werden, z.B. durch Ionenaustausch, Gelfiltration oder hydrophobe Chromatographie oder reversed phase-HPLC.
Diese und andere Proteinreinigungsverfahren sind detailliert in Methods in Enzymology, Band 182, "Guide to Protein Purification", herausgegeben von Murray Deutscher, Academic Press, San Diego, CA (1990), beschrieben.
BEISPIEL 3
Bestimmung der in vitro-Aktivität von Fusionsproteinen
Die Proteinkonzentration des Fusionsproteins kann unter Verwendung eines Sandwich-ELISA auf der Basis eines Affinitäts-gereinigten polyklonalen Antikörpers bestimmt werden. Alternativ kann die Proteinkonzentration durch Aminosäurezusammensetzung bestimmt werden. Die Bioaktivität des Fusionsmoleküls kann in einer Reihe von in vitro-Assays im Vergleich zu nativem IL-3, der IL-3-Variante oder G-CSF allein oder zusammen bestimmt werden. Ein derartiger Assay ist der AML-193-Zell-Proliferations-Assay. AML-193-Zellen reagieren auf IL-3 und G-CSF, was es ermöglicht, die kombinierte Bioaktivität der IL-3-Variante/G-CSF-Fusion zu bestimmen. Außerdem können andere Faktor-abhängige Zelllinien, z.B. M-NFS-60 (ATCC CRL 1838) oder 32D, die murine IL-3-abhängige Zelllinien sind, verwendet werden. Die Aktivität von IL-3 ist Spezies-spezifisch, die von G-CSF nicht; daher kann die Bioaktivität der G-CSF-Komponente der IL-3-Variante/G-CSF-Fusion unabhängig bestimmt werden. Der Methylcellulose-Assay kann verwendet werden, um den Effekt des IL-3-Variante/G-CSF-Fusionsproteins auf die Expansion der hämatopoetischen Progenitorzellen und das Muster der verschiedenen Typen hämatopoetischer Kolonien in vitro zu bestimmen. Der Methylcellulose-Assay kann eine Schätzung der Vorläuferhäufigkeit liefern, da man die Häufigkeit von Progenitoren pro 100.000 Input-Zellen misst. Langzeit-, Stroma-abhängige Kulturen wurden eingesetzt, um primitive hämatopoetische Progenitoren und Stammzellen zu charakterisieren. Dieser Assay kann eingesetzt werden um zu bestimmen, ob das Fusionsmolekül die Expansion von sehr primitiven Progenitoren und/oder Stammzellen stimuliert. Außerdem können limitierende Verdünnungskulturen durchgeführt werden, die die Häufigkeit von primitiven Progenitoren, die durch das Fusionsmolekül stimuliert werden, anzeigen werden.
Die Faktor Xa-Spaltungsstelle ist nützlich, um das Fusionsprotein, nachdem es gereinigt und rückgefaltet wurde, zu spalten, um die IL-3- und G-CSF-Komponenten der Fusion zu trennen. Nach Spaltung mit Faktor Xa können die IL-3- und G-CSF-Komponenten der Fusion zur Homogenität gereinigt werden und getrennt analysiert werden um zu beweisen, dass beide Komponenten als Fusion in einer aktiven Konformation sind, nachdem sie exprimiert, rückgefaltet und gereinigt worden waren.
BEISPIEL 4
Konstruktion von pMON13018
Konstruktion von pMON13018, ein Zwischenplasmid, das zur Konstruktion von Plasmiden eingesetzt wird, die DNA-Sequenzen enthalten, welche für Fusionsproteine codieren. Das 3900 Basenpaar-EcoRI, HindIII-Restriktionsfragment aus pMON13288 wurde mit den folgenden Paaren angelagerter, komplementärer Oligonucleotide ligiert:
Oligo #88Cterm1 [SEQ ID NO:91]
Oligo #88Cterm4 [SEQ ID NO:92]
Oligo #88Xa2 [SEQ ID NO:93]
Oligo #88Xa5 [SEQ ID NO:94]
Oligo #Glyn3 [SEQ ID NO:95]
Oligo #Glyn6 [SEQ ID NO:96]
Die zusammengefügten Oligonucleotide schaffen EcoRI- und HindIII-Restriktionsenden und die DNA-Sequenz, die für die Aminosäuren 106-125 der (15-125)hIL-3-Variante 13288 und den Polypeptid-Linker 1 (Tabelle 1), welcher aus der Faktor Xa-Spaltungsstelle und der Aminosäuresequenz (Gly3Ser)₂ besteht, codiert. Die Ligationsreaktion wurde verwendet, um E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillinenthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde aus einer in LB-Brühe gewachsenen Kolonie isoliert. Die DNA wurde sequenziert, um zu bestimmen, dass die Sequenz die der Oligonucleotide war. Eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pMON13018 ist in 2 gezeigt.
BEISPIEL 5
Konstruktion von pMON13019
Konstruktion von pMON13019, ein Zwischenplasmid, das zur Konstruktion von Plasmiden verwendet wird, die DNA-Sequenzen enthalten, welche für Fusionsproteine codieren. Das 414 Basenpaar-XmaI/AflIII-Restriktionsfragment aus pMON13018 wurde mit dem folgenden Paar aneinandergelagerter, komplementärer Oligonucleotide ligiert:
Oligo #IgG2b1 [SEQ ID NO:97]
Oligo #IgG2b2 [SEQ ID NO:98]
Die zusammengefügten Oligonucleotide schaffen XmaI- und AflIII-Restriktionsenden und die DNA-Sequenz, die für die Aminosäuren 9-33 des Polypeptid-Linkers 4 (Tabelle 1), der aus der Faktor Xa-Spaltungsstelle und der murinen IgG2b-Hinge-Region besteht, codiert. Die Ligationsreaktion wurde verwendet, um E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde aus einer Kolonie, die in LB-Brühe gewachsen war, isoliert. Die DNA wurde sequenziert, um zu bestimmen, dass die Sequenz die der Oligonucleotide war.
BEISPIEL 6
Konstruktion von pMON13024
Konstruktion von pMON13024, einem Zwischenplasmid, das zur Konstruktion von Plasmiden verwendet wird, die DNA-Sequenzen enthalten, welche für Fusionsproteine codieren. Das 4081 Basenpaar-NheI, HindIII-Restriktionsfragment aus pMON13010 wurde mit dem folgenden Paar aneinandergelagerter, komplementärer Oligonucleotide ligiert:
Oligo #GCSFSna1 [SEQ ID NO:99]
Oligo #GCSFSna2 [SEQ ID NO:100]
Die aneinandergefügten Oligonucleotide schaffen NheI- und HindIII-Restriktionsenden, schaffen eine SnaBI-Restriktionsstelle am 3'-Ende des G-CSF-Gens und die DNA-Sequenz, die für die Aminosäuren 155-175 von G-CSF codiert. Das Stopkodon nach dem G-CSF-Gen wird eliminiert, und die DNA-Sequenz der SnaBI-Erkennungsstelle codiert für die Aminosäuren Tyr Val im Raster mit dem C-Terminus von G-CSF. Die Ligationsreaktion wurde verwendet, um den E. coli K-12-Stamm JM 101 zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde aus einer Kolonie, die in LB-Brühe gewachsen war, isoliert. Die DNA wurde sequenziert, um zu bestimmen, dass die Sequenz die der Oligonucleotide war.
BEISPIEL 7
Konstruktion von pMON13027
Konstruktion von pMON13027, einem Zwischenplasmid, das zur Konstruktion von Plasmiden verwendet wird, die DNA-Sequenzen enthalten, welche für Fusionsproteine codieren. Die DNA von Plasmid pMON13018 wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und SnaBI verdaut, was zu einem NcoI, SnaBI-Fragment mit 3704 Basenpaaren führt. Die DNA von Plasmid pMON13024 wurde mit NcoI und SnaBI verdaut, was zu einem NcoI, SnaBI-Fragment mit 528 Basenpaaren führt. Die Restriktionsfragmente wurden ligiert, und das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um den E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert, durch Restriktionsanalyse analysiert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen.
BEISPIEL 8
Konstruktion von pMON13032
Konstruktion von pMON13032, ein Zwischenplasmid, das zur Konstruktion von Plasmiden verwendet wird, die DNA-Sequenzen enthalten, welche für Fusionsproteine codieren. Die DNA des Plasmids pMON15930 wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und SnaBI ver daut, was zu einem NcoI, SnaBI-Fragment mit 3829 Basenpaaren führt. Die DNA von Plasmid pMON13024 wurde mit NcoI und SnaBI verdaut, was zu einem NcoI, SnaBI-Fragment mit 528 Basenpaaren führte. Die Restriktionsfragmente wurden ligiert, und das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um den E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert, durch Restriktionsanalyse analysiert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen.
BEISPIEL 9
Konstruktion von pMON13041
Konstruktion von pMON13041, ein Zwischenplasmid, das zur Konstruktion von Plasmiden verwendet wird, die DNA-Sequenzen enthalten, welche für Fusionsproteine codieren. Das SnaBI/XmaI-Restriktionsfragment mit 4018 Basenpaaren aus pMON13018 wurde mit dem folgenden Paar aneinandergelagerter, komplementärer Oligonucleotide ligiert:
Oligo #Lysxa1 [SEQ ID NO:101]
Oligo #Lysxa2 [SEQ ID NO:102]
Die aneinandergelagerten Oligonucleotide schaffen SnaBI- und XmaI-Restriktionsenden und die DNA-Sequenz, die für die Aminosäuren 1-8 des Polypeptid-Linkers 2 (Tabelle 1) codiert, der aus der Faktor Xa-Spaltungsstelle, in der Arg in Lys geändert ist, und der Aminosäuresequenz (G1y₃Ser)₂ besteht. Die Ligationsreaktion wurde verwendet, um E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde aus einer Kolonie, die in LB-Brühe gewachsen war, isoliert. Die DNA wurde sequenziert, um zu bestimmen, dass die Sequenz die der Oligonucleotide war.
BEISPIEL 10
Konstruktion von pMON13042
Konstruktion von pMON13042, ein Zwischenplasmid, das zur Konstruktion von Plasmiden eingesetzt wird, welche DNA-Sequenzen enthalten, die für Fusionsproteine codieren. Das SnaBI/XmaI-Restriktionsfragment mit 4018 Basenpaaren aus pMON13018 wurde mit dem folgenden Paar aneinandergelagerter, komplementärer Oligonucleotide ligiert:
Oligo #Glyxa1 [SEQ ID NO:103]
Oligo #Glyxa2 [SEQ ID NO:104]
Die aneinandergelagerten Oligonucleotide schaffen SnaBI- und XmaI-Restriktionsenden und die DNA-Sequenz, die für den Polypeptid-Linker 3 (Tabelle 1) codiert. Der Polypeptid-Linker 3 besteht aus der folgenden Aminosäuresequenz Tyr Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Pro (Gly₃Ser)₂ ASN [SEQ ID NO:190]. Die Ligationsreaktion wurde verwendet, um den E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillinenthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde aus einer in LB-Brühe gewachsenen Kolonie isoliert. Die DNA wurde sequenziert, um zu bestimmen, dass die Sequenz die der Oligonucleotide war.
BEISPIEL 11
Konstruktion von pMON13046
Konstruktion von pMON13046, ein Zwischenplasmid, das zur Konstruktion von Plasmiden eingesetzt wird, die DNA-Sequenzen enthalten, welche für Fusionsproteine codieren. Die DNA des Plasmids pMON13018 wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und NsiI verdaut, was in einem NcoI, NsiI-Fragment mit 3873 Basenpaaren resultierte. Plasmid pMON13416 (US-Patentanmeldung, Serial No. PCT/US93/11197)-DNA, die für eine hIL-3-Variante codiert, wurde mit NcoI und NsiI verdaut, was zu einem NcoI, NsiI-Fragment mit 170 Basenpaaren resultiert. Die Restriktionsfragmente wurden ligiert, und das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um den E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert, durch Restriktionsanalyse analysiert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen.
BEISPIEL 12
Konstruktion von pMON13047
Konstruktion von pMON13047, ein Zwischenplasmid, das zur Konstruktion von Plasmiden verwendet wird, die DNA-Sequenzen enthalten, welche für Fusionsproteine codieren. pMON13019-Plasmid-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und NsiI verdaut, was zu einem NcoI, NsiI-Fragment mit 3918 Basenpaaren führt. pMON13416-Plasmid-DNA wurde mit NcoI und NsiI verdaut, was zu einem NcoI, NsiI-Fragment mit 170 Basenpaaren führte. Die Restriktionsfragmente wurden ligiert, und das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um den E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert, durch Restriktionsanalyse analysiert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen.
BEISPIEL 13
Konstruktion von pMON 13478
Ein Plasmid auf pUC18-Basis, das das konstruierte Gen enthält, das für humanen Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (hG-CSF) codiert, wurde von R&D-Systems (Katalog # BBG13, Minneapolis MN) erhalten. Dieses Plasmid wurde pMON13457 genannt. Das ApaI, HindIII-Fragment mit 3157 Basenpaaren aus pMON13457 wurde mit dem folgenden Paar aneinandergelagerter, komplementärer Oligonucleotide ligiert:
Oligo #hgcsfma1 [SEQ ID NO:111]
Oligo #hgcsfma2 [SEQ ID NO:112]
Die aneinandergefügten Oligonucleotide schaffen HindIII- und ApaI-Restriktionsenden, eine interne NcoI-Restriktionsstelle, die DNA-Sequenz, die für die ersten vier Aminosäuren von hG-CSF (Thr Pro Leu Gly), denen ein Initiator-Methionin, gefolgt von einem Alanin, vorausgeht, codiert. Das Methionin und das Alanin wurden zur Expression in E. coli angefügt. Das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um den E. coli K-12-Stamm JM101 zu trans formieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen. Das resultierende Plasmid wurde pMON13478 genannt.
BEISPIEL 14
Konstruktion von pMON13498
Das NcoI, ApaI-Fragment mit 3163 Basenpaaren aus pMON 13478 wurde mit dem folgenden Paar aneinandergelagerter, komplementärer Oligonucleotide ligiert:
Oligo #hgcsfat3 [SEQ ID NO:115]
Oligo #hgcsfat4 [SEQ ID NO:116]
Die aneinandergefügten Oligonucleotide schaffen NcoI- und ApaI-Restriktionsenden und maximieren den A/T-Gehalt der DNA-Sequenz, die für die ersten vier Aminosäuren von reifem hG-CSF (Thr Pro Leu Gly) codiert. Der A/T-Gehalt der DNA-Sequenz wurde so verändert, dass die Proteinexpressionslevel in E. coli erhöht wurden. Das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen. Das ApaI-Restriktionsende der Oligonucleotide ist mit der ApaI-Stelle kompatibel, allerdings ist die ApaI-Erkennungssequenz verändert. Das resultierende Plasmid wurde pMON13498 genannt. Die vorgenannten Modifikationen für das hG-CSF-Gen werden in der DNA-Sequenz [SEQ ID NO:178] gefunden.
BEISPIEL 15
Konstruktion von pMON13010
Die DNA des Plasmids pMON5743 (Olins und Rangwala [1990]) wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und EcoRI verdaut, was zu einem NcoI, EcoRI-Fragment mit 3633 Basenpaaren führte. Die DNA von Plasmid pMON13498 wurde mit NcoI und EcoRI verdaut, was zu einem NcoI, EcoRI-Fragment mit 542 Basenpaaren führte. Die Restriktionsfragmente wurden ligiert, und das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert, durch Restriktionsanalyse analysiert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen. Das Plasmid pMON13010 codiert für die folgende Aminosäuresequenz: Peptid #

DNA-Sequenz # [SEQ ID NO:178] codiert für das vorstehende pMON13010-Polypeptid.

BEISPIEL 16
Konstruktion von pMON13499
Das NcoI, ApaI-Fragment mit 3163 Basenpaaren aus pMON13478 wurde mit dem folgenden Paar aneinandergelagerter, komplementärer Oligonucleotide ligiert:
Oligo #hgcsfat1 [SEQ ID NO:113]
Oligo #hgcsfat2 [SEQ ID NO:114]
Die aneinandergefügten Oligonucleotide schaffen NcoI- und ApaI-Restriktionsenden und maximieren den A/T-Gehalt der DNA-Sequenz, die für die ersten drei Aminosäuren von hG-CSF (Thr Pro Leu) codiert. Der A/T-Gehalt der DNA-Sequenz wurde so verändert, dass die Expressionslevel in E. coli erhöht wurden. Das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen. Das resultierende Plasmid wurde pMON13499 genannt. Die vorstehenden Modifikationen für das hG-CSF-Gen werden in der DNA-Sequenz [SEQ ID NO:177] gefunden.
BEISPIEL 17
Konstruktion von pMON13033
Das ApaI, BstXI-Fragment mit 3117 Basenpaaren aus pMON13499 wurde mit dem folgenden Paar aneinandergelagerter, komplementärer Oligonucleotide ligiert:
Oligo #gcys18 [SEQ ID NO:107]
Oligo #gcys181o [SEQ ID NO:108]
Die aneinandergefügten Oligonucleotide schaffen ApaI- und BstXI-Restriktionsenden und codieren für die Aminosäuren 5-26 von hG-CSF, außer für Aminosäure 17, wo Cystein durch Serin ersetzt war. Das Cystein war durch ein Serin ersetzt, um die invitro-Rückfaltungseffizienz des aus E. coli isolierten Proteins zu erhöhen. Das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen. Das resultierende Plasmid wurde pMON13033 genannt. Die vorstehend genannten Modifikationen für das hG-CSF-Gen werden in der DNA-Sequenz [SEQ ID NO:179] gefunden.
BEISPIEL 18
Konstruktion von pMON13037
Die DNA von Plasmid pMON5743 wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und EcoRI verdaut, was zu einem NcoI, EcoRI-Fragment mit 3633 Basenpaaren führte. Die DNA von Plasmid pMON13033 wurde mit NcoI und EcoRI verdaut, was zu einem NcoI, EcoRI-Fragment mit 542 Basenpaaren führte. Die Restriktionsfragmente wurden ligiert, und das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert, durch Restriktionsanalyse analysiert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen. Das Plasmid pMON13037 codiert für die folgende Aminosäuresequenz: Peptid #

DNA-Sequenz # [SEQ ID NO:179] codiert für das vorstehende pMON13037-Polypeptid.

BEISPIEL 19
Konstruktion von pMON13011
Ein Plasmid auf pUC18-Basis, das das konstruierte Gen enthält, das für humanen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (hGM-CSF) codiert, wurde von R&D-Systems (Katalog # BBG12, Minneapolis MN) erhalten. Dieses Plasmid wurde pMON13458 genannt. Das NcoI, BsmI-Fragment mit 2986 Basenpaaren aus pMON13458 wurde mit dem folgenden Paar aneinandergelagerter, komplementärer Oligonucleotide ligiert:
Oligo #gm-aup [SEQ ID NO:105]
Oligo #gm-alow [SEQ ID NO:106]
Die aneinandergelagerten Oligonucleotide schaffen NcoI- und BsmI-Restriktionsenden und die DNA-Sequenz, die für die ersten neunzehn Aminosäuren von hGM-CSF codiert. Die DNA-Sequenz, die für die Aminosäuren 3, 4, 5, 7, 9, 11, 12, 13 und 15 codiert, wurde in von E. coli bevorzugte Kodons geändert, um die Expressionslevel in E. coli zu erhöhen. Das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert, durch Restriktionsanalyse analysiert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen. Das resultierende Plasmid wurde pMON13011 genannt. Die vorstehend genannten Modifikationen für das hGM-CSF-Gen werden in der DNA-Sequenz [SEQ ID NO:176] gefunden.
BEISPIEL 20
Konstruktion von pMON13012
Die DNA von Plasmid pMON5743 wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und EcoRI verdaut, was zu einem NcoI, EcoRI-Fragment mit 3633 Basenpaaren führte. Die DNA von Plasmid pMON13011 wurde mit NcoI und EcoRI verdaut, was zu einem NcoI, EcoRI-Fragment mit 398 Basenpaaren führte. Die Restriktionsfragmente wurden ligiert, und das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um den E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert, durch Restriktionsanalyse analysiert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen. Das Plasmid pMON13012 codiert für die folgende Aminosäuresequenz: Peptid #

DNA-Sequenz # [SEQ ID NO:176] codiert für das vorstehende pMON13012-Polypeptid.

BEISPIEL 21
Konstruktion von pMON5865
Ein Plasmid auf pUC18-Basis, das das konstruierte Gen enthält, welches für humanes Interleukin-6 (hIL-6) codiert, wurde von British Biotech (Katalog # BBG17) erhalten. Das HindIII/BstXI-Fragment mit 3170 Basenpaaren aus diesem Plasmid wurde mit dem folgenden Paar aneinandergelagerter, komplementärer Oligonucleotide ligiert:
Oligo #HIL6231 [SEQ ID NO:109]
Oligo #HIL6232 [SEQ ID NO:110]
Die aneinandergefügten Oligonucleotide schaffen HindIII- und BstXI-Restriktionsenden und die DNA-Sequenz, die für die ersten zehn Aminosäuren von hIL-6 plus Met Ala am N-Terminus zur E. coli-Proteinexpression codiert. Die Oligonucleotide schaffen auch eine NcoI-Stelle am 5'-Ende des Gens. Die Kodons, die für die ersten zehn Aminosäuren codieren, wurden in von E. coli bevorzugte geändert, um die Expressionslevel in E. coli zu erhöhen. Das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Tansformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen. Das resultierende Plasmid wurde pMON5865 genannt. Die vorstehend genannten Modifikationen für das hG-CSF-Gen werden in der DNA-Sequenz [SEQ ID NO:175] gefunden.
BEISPIEL 22
Konstruktion von pMON13040
Die DNA von Plasmid pMON5743 wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und EcoRI verdaut, was zu einem NcoI, EcoRI-Fragment mit 3633 Basenpaaren führte. Die DNA von Plasmid pMON5865 wurde mit NcoI und EcoRI verdaut, was zu einem NcoI, EcoRI-Fragment mit 572 Basenpaaren führte. Die Restriktionsfragmente wurden ligiert, und das Liga tionsreaktionsgemisch wurde verwendet, um den E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Tansformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert, durch Restriktionsanalyse analysiert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen. Das Plasmid pMON13040 codiert für die folgende Aminosäuresequenz: Peptid #

DNA-Sequenz # [SEQ ID NO:175] codiert für das vorstehende pMON13040-Polypeptid.

BEISPIEL 23
Konstruktion von pMON15931
Konstruktion von pMON15931, einem Zwischenplasmid, das zur Konstruktion von Plasmiden eingesetzt wird, welche DNA-Sequenzen enthalten, die für Fusionsproteine codieren. Die DNA-Sequenz, die die (Gly-Ser)-reiche Spacerregion des pIII-Proteins des filamentösen Bakteriophagen fd (Schaller et al., 1975) codiert, wurde unter Anwendung von PCR-Techniken amplifiziert. Ein Plasmid, das das Gen enthält, welches für das pIII-Protein des filamentösen Bakteriophagen fd codiert, diente als Matrize für die PCR-Reaktion, wobei die folgenden Oligonucleotide als Primer verwendet wurden:
Oligo #prefor [SEQ ID NO:117]
Oligo #revpre [SEQ ID NO:118]
Die PCR-Primer-Extensionsreaktion erzeugte die folgende DNA-Sequenz:
Die vorstehende DNA-Sequenz codiert die Aminosäuren 9-49 des Polypeptid-Linkers 7 (Tabelle 1), der aus der Faktor Xa-Spaltungsstelle und der (Gly-Ser)-reichen Region des pIII-Proteins des fd-Bakteriophagen besteht. Das durch PCR erzeugte Fragment wurde mit XmaI und AflIII verdaut und mit dem XmaI, AflIII-Fragment mit 4014 Basenpaaren aus pMON13018 ligiert. Das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um den E. coli K-12-Stamm JM 101 zu transformieren. Tansformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert, durch Restriktionsanalyse analysiert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen.
BEISPIEL 24
Konstruktion von pMON 15930
Konstruktion von pMON15930, einem Zwischenplasmid, das zur Konstruktion von Plasmiden eingesetzt wird, welche DNA-Sequenzen enthalten, die für Fusionsproteine codieren. Die DNA-Sequenz, die für die (Gly-Ser)-reiche Spacerregion mit wenigen flankierenden Aminosäuren des pIII-Proteins des filamentösen Bakteriophagen fd (Schaller et al., 1975) codiert, wurde unter Anwendung von PCR-Techniken amplifiziert. Ein Plasmid, das das Gen enthält, welches für das pIII-Protein des filamentösen Bakteriophagen fd codiert, diente als Matrize für die PCR-Reaktion, wobei die folgenden Oligonucleotide als Primer verwendet wurden:
Oligo #forxtra [SEQ ID NO:119]
Oligo #xtrarev [SEQ ID NO:120]
Die PCR-Primer-Extensionsreaktion erzeugte die folgende DNA-Sequenz:
Die vorstehende DNA-Sequenz codiert für die Aminosäuren 9-70 des Polypeptid-Linkers 8 (Tabelle 1), der aus der Faktor Xa-Spaltungsstelle und der (Gly-Ser)-reichen Region des pIII-Proteins des fd-Bakteriophagen besteht. Das durch PCR erzeugte Fragment wurde mit XmaI und AflIII verdaut und mit dem XmaI, AflIII-Fragment mit 4014 Basenpaaren aus pMON13018 ligiert. Das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um den E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Tansformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert, durch Restriktionsanalyse analysiert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen.
BEISPIEL 25
Konstruktion von pMON13038
Konstruktion von pMON13038, einem Zwischenplasmid, das zur Konstruktion von Plasmiden verwendet wurde, die DNA-Sequenzen enthalten, welche für Fusionsproteine codieren. Die DNA des Plasmids pMON13019 wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und SnaBI verdaut, was zu einem NcoI, SnaBI-Fragment mit 3749 Basenpaaren führte. Die DNA von Plasmid pMON13024 wurde mit NcoI und SnaBI verdaut, was in einem NcoI, SnaBI-Fragment mit 528 Basenpaaren resultierte. Die Restriktionsfragmente wurden ligiert, und das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um den E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Tansformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert, durch Restriktionsanalyse analysiert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen. Das resultierende Plasmid wurde pMON13038 genannt.
BEISPIEL 26
Konstruktion von pMON13021
Die DNA von Plasmid pMON13018 wurde mit den Restriktionsenzymen AflIII und HindIII verdaut, was zu einem AflIII, HindIII-Fragment mit 4023 Basenpaaren führte. Die DNA von Plasmid pMON13288 wurde mit NcoI und HindIII verdaut, was zu einem NcoI, HindIII-Fragment mit 345 Basenpaaren führte. Die Restriktionsfragmente wurden ligiert, und das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um den E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Tansformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert, durch Restriktionsanalyse analysiert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen. Eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pMON13021 ist in 2 gezeigt. Das Plasmid pMON13021 codiert für die Fusion mit der folgenden Aminosäuresequenz:
Peptid # [SEQ ID NO:125]
DNA-Sequenz # [SEQ ID NO:54] codiert für das vorangehende pMON13021-Polypeptid.
BEISPIEL 27
Konstruktion von pMON13022
Die DNA von Plasmid pMON13018 wurde mit den Restriktionsenzymen AflIII und HindIII verdaut, was zu einem AflIII, HindIII-Fragment mit 4023 Basenpaaren führte. Die DNA von Plasmid pMON13012 wurde mit NcoI und HindIII verdaut, was zu einem NcoI, HindIII-Fragment mit 586 Basenpaaren führte. Die Restriktionsfragmente wurden ligiert, und das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um den E. coli K-12-Stamm JM101 zu transformieren. Tansformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert, durch Restriktionsanalyse analysiert und sequenziert, um das kor rekte Insert zu bestätigen. Das Plasmid pMON 13022 codiert für die Fusion mit der folgenden Aminosäuresequenz:
Peptid # [SEQ ID NO:141]
DNA-Sequenz # [SEQ ID NO:55] codiert für das vorangehende pMON13022-Polypeptid.
BEISPIEL 28-62
Weitere Beispiele für Fusionsproteine, die zum Teil (eine) hIL-3-Variante(n) umfassen, sind in Tabelle 2 angegeben. Die Plasmide, die die Gene enthalten, welche für die Fusionsproteine in Tabelle 2 codieren, wurden durch Verfahren konstruiert, die in Materialien und Verfahren und in hierin enthaltenen Beispielen, insbesondere Beispiele 1, 9, 10, 26 und 27, beschrieben sind. DNA-Restriktionsfragmente, die in Tabelle 2 angegeben sind, wurden ligiert, und die resultierenden E. coli-Expressionsplasmide (Tabelle 2) enthalten DNA-Sequenzen, die für die angegebenen Polypeptid-Fusionen codieren (Tabelle 2). Die Polypeptid-Fusionen bestehen aus zwei Kolonie-stimulierenden Faktoren (R₁ und R₂), die durch einen Polypeptid-Linker (L) (Tabelle 1) fusioniert sind, und werden durch die Formel R₁-L-R₂ dargestellt. Einige der Gene, die für die Polypeptid-Fusionen in Tabelle 2 codieren, wurden aus dem E. coli-Expressionsvektor als ein NcoI, HindIII-Restriktionsfragment in einen Säugerzell (BHK)-Expressionsvektor pMON3934 transferiert. Die E. coli- und BHK-Expressionsplasmide sind in Tabelle 2 gezeigt. Die biologische Aktivität, die Wachstum-fördernde Aktivität in AML193.1.3-Zellen für einige der Polypeptid-Fusionen in Tabelle 2 ist in Tabelle 3 gezeigt. Die biologische Aktivität, wie sie im Methylcellulose-Assay für einige der Fusionen in Tabelle 2 beurteilt wurde, ist in den 3-7 gezeigt. TABELLE 1. Polypeptid-Linker-Nomenklatur und Aminosäuresequenz

* nur zu Vergleichszwecken

BEISPIEL 63
Isolierung der (1-332)- und (1-153)-Aminosäure-Formen von c-mpl-Ligand (Meg-CSF)

A. Reverse Transkriptase-Reaktion (c-mpl-Ligandsequenz, basierend auf Genbank, Eingangsnummer L33410). Humane fötale Leber-A+ RNA wurde von Clontech (Palo Alto, CA) erhalten. Reaktionen der Erststrang-cDNA wurden unter Verwendung eines cDNA-Cycle^TM-Kits, erhalten von Invitrogen (San Diego, CA), durchgeführt.
B. Polymerasekettenreaktionen Nach der reversen Transkriptase (RT)-Reaktion wurde der 1-332-c-mpl-Ligand durch PCR unter Verwendung der Nucleotid-Primer c-mplNcoI [SEQ ID NO:169], der unmittelbar dem 5'-Ende des Gens vorausgehend eine NcoI-Stelle schuf, und c-mplEcoRI [SEQ ID NO:170], der unmittelbar 3' zum Stopkodon eine EcoRI-Stelle bildete. Nach der RT-Reaktion wurde der 1-153-c-mpl-Ligand amplifiziert, wobei der Primer c-mplNcoI [SEQ ID NO:169] und der 3'-Primer c-mplHindIII [SEQ ID NO:171], der ein Stopkodon und eine HindIII-Stelle unmittelbar 3' zum Kodon für die Aminosäure 153 schuf.

BEISPIEL 64
Konstruktion von pMON26448
Das PCR-Produkt des 1-153-c-mpl-Liganden wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und HindIII zur Subklonierung in pMON3934 verdaut. pMON3934, ein Säuger-Expressionsvektor, stammt von pMON3359 [Hippenmeyer et al., (1993)], enthält aber zusätzlich zu dem IE110-Promotor und dem Poly-A-Signal eine modifizierte humane IL-3-Signalpeptidsequenz. Die Signalpeptidsequenz wird durch BamHI- und NcoI-Restriktionsenzymstellen flankiert, welche eine Klonierung und Expression der Gene als NcoI, HindIII-Fragmente erleichtern. Die HindIII-Stelle ist 3' zu der NcoI-Stelle. Die DNA-Sequenz des Signalpeptids ist unten dargestellt (Restriktionsenzymstellen sind oben angegeben). Das ATG (Methionin)-Kodon innerhalb der NcoI-Stelle ist im Raster mit dem Initiator-ATG des Signalpeptids (unterstrichen):
Das resultierende Plasmid wurde pMON26448 genannt. Das Plasmid pMON26448 codiert für die Fusion mit der folgenden Aminosäuresequenz: Peptid #

DNA-Sequenz # [SEQ ID NO:180] codiert für das vorstehende pMON26448-Polypeptid.

BEISPIEL 65
Isolierung der cDNA-Sequenz-Aminosäure-(1-153)-Form des c-mpl-Liganden (Meg-CSF) mit modifiziertem C-Terminus

A. Reverse Transkriptase-Reaktion (c-mpl-Ligandsequenz, basierend auf Genbank-Eingangsnummer L33410). Humane fötale Leber-A+ RNA wurde von Clontech (Palo Alto, CA) erhalten. Die cDNA-Reaktionen des ersten Strangs wurden unter Verwendung eines cDNA-Cycle^TM-Kits, erhalten von Invitrogen (San Diego, CA), durchgeführt.
B. Polymerasekettenreaktionen Nach der reversen Transkriptase (RT)-Reaktion wurde der 1-332-c-mpl-Ligand durch PCR amplifiziert, wobei die Oligonucleotid-Primer c-mplNcoI [SEQ ID NO:169], der eine NcoI-Stelle unmittelbar dem 5'-Ende des Gens vorausgehend schuf, und c-mplEcoRI [SEQ ID NO:170], der eine EcoRI-Stelle unmittelbar 3' zum Stopkodon schuf. Unter Verwendung der obigen PCR-Reaktion als Matrize, wurde der 1-153-c-mpl-Ligand amplifiziert, wobei der Primer c-mplNcoI [SEQ ID NO:169] und der 3'-Primer Eco-mpl [SEQ ID NO:172], der eine EcoRI-Stelle unmittelbar 3' zum Kodon für Aminosäure 153 schuf und für die Aminosäuren Glu Phe im Raster mit dem c-Terminus des Gens codiert, verwendet wurden. Das 1-153-c-mpl-Ligand-PCR-Produkt wurde mit NcoI und EcoRI verdaut. Das resultierende NcoI, EcoRI-Restriktionsfragment mit 467 Basenpaaren wurde anschließend in Zwischenplasmide, die in den Beispielen hier beschrieben werden, kloniert, um Fusionspolypeptide zu schaffen.

BEISPIEL 66
Konstruktion von pMON26460
Die DNA von Plasmid pMON13018 wurde mit den Restriktionsenzymen AflIII und HindIII verdaut, was zu einem AflIII, HindIII-Fragment mit 4023 Basenpaaren führte. Die DNA von Plasmid pMON26448 wurde mit NcoI und HindIII verdaut, was zu einem NcoI, HindIII-Fragment mit 468 Basenpaaren führte. Die Restriktionsfragmente wurden ligiert, und das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert, durch Restriktionsanalyse analysiert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen. Das E. coli-Expressionsplasmid pMON26460 codiert für die Fusion mit der folgenden Aminosäuresequenz:
Peptid # [SEQ ID NO:165]
Die DNA-Sequenz # [SEQ ID NO:183] codiert für das vorstehend genannte pMON26460-Polypeptid. Das Gen, das für die Fusion codiert, wurde als NcoI, HindIII-Fragment in den Säugetier-Expressionsvektor pMON3934 übertragen, und das resultierende Plasmid wurde pMON26463 genannt.
BEISPIEL 67
Konstruktion von pMON26461
Das NcoI, SnaBI-Fragment mit 4029 Basenpaaren aus pMON1357 wurde mit dem durch PCR erzeugten NcoI, EcoRI-Fragment mit 467 Basenpaaren aus Beispiel 65 und zwei Oligonucleotiden (Ecosnal [SEQ ID NO:173], Ecosna2 [SEQ ID NO:174]) ligiert. Das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Ampicillin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert, durch Restriktionsanalyse analysiert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen. Das E. coli-Expressionsplasmid pMON26461 codiert die Fusion mit der folgenden Aminosäuresequenz:
Peptid # [SEQ ID NO:168]
Die DNA-Sequenz # [SEQ ID NO:186] codiert für das vorstehend genannte pMON26461-Polypeptid. Das Gen, das für die Fusion codiert, wurde als NcoI, HindIII-Fragment auf den Säugetier-Expressionsvektor pMON3934 übertragen, und das resultierende Plasmid wurde pMON26464 genannt.
BEISPIEL 68
Konstruktion von pMON26471
Das NcoI, HindIII-Fragment mit 3285 Basenpaaren aus pMON3935 wurde mit dem NcoI, SmaI-Restriktionsfragment mit 362 Basenpaaren aus pMON26426 und dem SmaI, HindIII-Restriktionsfragment mit 494 Basenpaaren aus pMON26460 ligiert, und das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Spectinomycin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert, durch Restriktionsanalyse analysiert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen. Das E. coli-Expressionsplasmid pMON26471 codiert für die Fusion mit der folgenden Aminosäuresequenz:
Peptid # [SEQ ID NO:166]
Die DNA-Sequenz # [SEQ ID NO:184] codiert für das oben genannte pMON26471-Polypeptid. Das Gen, das für die Fusion codiert, wurde als NcoI, HindIII-Fragment auf den Säuger-Expressionsvektor pMON3934 übertragen, und das resultierende Plasmid wurde pMON26473 genannt.
BEISPIEL 69
Konstruktion von pMON26472
Das NcoI, HindIII-Fragment mit 3285 Basenpaaren aus pMON3935 wurde mit dem NcoI, SmaBI-Restriktionsfragment mit 481 Basenpaaren aus pMON26461 und dem SnaBI, HindIII-Restriktionsfragment mit 399 Basenpaaren aus pMON3988 ligiert, und das Ligationsreaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf Spectinomycin-enthaltenden Platten selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert, durch Restriktionsanalyse analysiert und sequenziert, um das korrekte Insert zu bestätigen. Das E. coli-Expressionsplasmid pMON26472 codiert für die Fusion mit der folgenden Aminosäuresequenz:
Peptid # [SEQ ID NO:167]
Die DNA-Sequenz # [SEQ ID NO:185] codiert für das vorstehende pMON26472-Polypeptid. Das Gen, das für die Fusion codiert, wurde als NcoI, HindIII-Fragment auf den Säuger-Expressionsvektor pMON3934 übertragen, und das resultierende Plasmid wurde pMON26474 genannt.
AML-Proliferationsassay für bioaktives humanes Interleukin-3
Die Faktor-abhängige Zelllinie ANL 193 wurde von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) erhalten. Diese Zelllinie, die von einem Patienten mit akuter myelinogener Leukämie entwickelt wird, ist eine Wachstumsfaktor-abhängige Zelllinie, die verstärktes Wachstum in GM-CSF-supplementiertem Medium zeigt (Lange, B., et al., (1987); Valtieri, M., et al., (1987)). Die Fähigkeit der AML 193-Zellen zur Proliferation in Gegenwart von humanem IL-3 ist gut dokumentiert (Santoli, D., et al., (1987)). Es wurde eine Zelllinien-Variante, AML 193 1.3, verwendet, die für ein Langzeitwachstum in IL-3 angepasst war, indem die Wachstumsfaktoren ausgewaschen worden waren und die Cytokin-abhängigen AML 193-Zellen für 24 Stunden bezüglich Wachstumsfaktoren hungern gelassen wurden. Dann wurden die Zellen mit 1 × 10⁵ Zellen/Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen in Medium, das 100 U/ml IL-3 enthielt, replattiert. Es dauerte etwa 2 Monate, bis die Zellen in IL-3 schnell wuchsen. Diese Zellen werden danach als AML1 193 1.3 gehalten, wobei Gewebekulturmedium mit humanem IL-3 supplementiert wurde (siehe unten).
AML 193 1.3-Zellen werden 6 Mal in kalter, ausgewogener Hanks-Salzlösung (HBSS, Gibco, Grand Island, NY) gewaschen, indem Zellsuspensionen mit 250 × g für 10 Minuten zentrifugiert werden, worauf ein Dekantieren des Überstands folgt. Pelletisierte Zellen werden in HBSS resuspendiert, und das Verfahren wird wiederholt, bis sechs Waschzyklen vollendet sind. Zellen, die sechsmal mit diesem Verfahren gewaschen sind, werden in Gewebekulturmedium in einer Dichte im Bereich von 2 × 10⁵ bis 5 × 10⁵ lebensfähige Zellen/ml resuspendiert. Dieses Medium wird hergestellt, indem Iscove's modifiziertes Dulbecco's Medium (IMDM, Hazelton, Lenexa, KS) mit Albumin, Transferrin, Lipiden und 2-Mercaptoethanol supplementiert wird. Rinderalbumin (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) wird mit 500 μg/ml zugesetzt; humanes Transferrin (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) wird mit 100 μg/ml zugesetzt; Sojalipid (Boeheringer-Mannheim, Indianapolis, IN) wird mit 50 μg/ml zugesetzt, und 2-Mercaptoethanol (Sigma, St. Louis, MO) wird mit 5 × 10^–5 M zugesetzt.
Reihenverdünnungen von humanem Interleukin-3 oder Fusionsprotein (hIL-3-Mutein) werden in Dreifachserien in Gewebekulturmedium, das wie oben angegeben supplementiert ist, in Costar 3596-Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Jede Vertiefung enthält 50 μl Medium, das Interleukin-3 oder Fusionsprotein enthält, wenn die Reihenverdünnungen beendet sind. Kontrollvertiefungen enthalten nur Gewebekulturmedium (negative Kontrolle). AML 193 1.3-Zellsuspensionen, die wie oben hergestellt wurden, werden in jede Vertiefung gegeben, indem 50 μl (2,5 × 10⁴ Zellen) in jede Vertiefung pipettiert werden. Gewebekulturplatten werden bei 37°C mit 5% CO₂ in befeuchteter Luft für 3 Tage inkuziert. Am Tag 3 werden 0,5 μCi ³H-Thymidin (2 Ci/mM, New England Nuclear, Boston, MA) in 50 μl Gewebekulturmedium zugesetzt. Kulturen werden bei 37°C mit 5% CO₂ in befeuchteter Luft für 18-24 Stunden inkuziert. Zelluläre DNA wird auf Glasfiltermatten (Pharmacia LKB, Gaithersburg, MD) unter Verwendung eines TOMTEC-Zell-Erntegeräts (TOMTEC, Orange, CT) geerntet, wobei dieses einen Waschzyklus mit Wasser, gefolgt von einem Waschzyklus mit 70%igem Ethanol, verwendet. Die Filtermatten werden an der Luft trocknen gelassen und dann in einen Probenbeutel gegeben, dem Szintillationsflüssigkeit (Scintiverse II, Fisher Scientific, St. Louis, MO, oder BetaPlate Scintillation Fluid, Pharmacia LKB, Gaithersburg, MD) zugesetzt wird. Beta-Emissionen von Proben aus einzelnen Gewebekulturvertiefungen werden in einem LKB-Betaplate-Szintillationszählgerät, Modell 1205 (Pharmacia LKB, Gaithersburg, MD), gezählt, und die Daten werden als Impulse pro Minute von ³H-Thymidin, das in die Zellen eingebaut ist, aus jeder Gewebekulturvertiefung ausgedrückt. Die Aktivität jeder humanen Interleukin-3-Präparation oder Fusionsprotein-Präparation wird durch Messung der Zellproliferation (³H-Thymidin-Einbau), induziert durch graduierte Konzentrationen an Interleukin-3 oder Fusionsprotein, quantitativ bestimmt. Typischerweise werden in diesen Assays Konzentrationsbereiche von 0,05 pM bis 10⁵ pM quantifiziert. Die Aktivität wird bestimmt, indem die Dosis an Interleukin-3 oder Fusionsmolekül gemessen wird, welche 50% der maximalen Proliferation bereitstellt [EC₅₀ = 0,5 × (Maximum der durchschnittlichen Impulse pro Minute von eingebautem 3H-Thymidin Vertiefung unter Dreifachkulturen von allen getesteten Konzentrationen an Interleukin-3 – Hintergrundproliferation, gemessen durch ³H-Thymidin-Einbau, beobachtet in Dreifachkulturen, denen Interleukin-3 fehlt)]. Dieser EC₅₀-Wert entspricht auch 1 Bioaktivitätseinheit. Jeder Assay wird mit nativem Interleukin-3 als Referenzstandard durchgeführt, so dass relative Aktivitätslevel zugeordnet werden können.
Typischerweise wurden die Proteinfusionen in einem Konzentrationsbereich von 2000 pM bis 0,06 pM, titriert in 2-fach-Reihenverdünnungen, getestet. Die biologische Aktivität der Fusionsmoleküle wurde mit derjenigen der folgenden Standards, wie sie unten beschrieben werden, verglichen.
Proteinfusionen, die zum Teil aus G-CSF, pMON3987, pMON3995, pMON3997, pMON26406, pMON26433, pMON26415, pMON26416 und pMON26430 bestanden, wurden mit der Dosis-Antwort-Kurve von gleichen Molkonzentrationen an hG-CSF und pMON13288 oder pMON 13416 verglichen.
Proteinfusionen, die zum Teil aus GM-CSF, pMON3989 und pMON3998 bestanden, wurden mit der Dosis-Antwort-Kurve von gleichen Molkonzentrationen an hGM-CSF und pMON13288 verglichen.
Proteinfusionen, die aus Dimeren von hIL-3-Varianten, pMON3988, pMON26425, pMON26427, pMON26420, pMON26429 und pMON26431 bestanden, wurden mit der Dosis-Antwort-Kurve von pMON13288 oder pMON13416 verglichen.
Für jede Probe wurde die Aktivität durch die Konzentration bestimmt, die 50% der maximalen Antwort liefert, indem ein Vier-Parameter-Logistikmodell auf die Daten angewendet wurde. Es wurde beobachtet, dass die obere Ebene (maximale Antwort) für die Probe und den Standard, mit der sie verglichen wurde, sich nicht unterschieden. Daher wurde die Kalkulation der relativen Wirksamkeit für jede Probe aus EC₅₀-Bestimmungen für die Probe und den Standard, wie oben angegeben, bestimmt. Die relative Wirksamkeit (EC₅₀ des Standards dividiert durch EC₅₀ der Probe), die in Tabelle 3 angegeben ist, ist der Mittelwert von wenigstens zwei unabhängigen Assays, wenn nichts anderes angegeben ist. AML 193.1.3-Zellen vermehren sich als Antwort auf hIL-3, hGM-CSF und hG-CSF. Daher wurden die folgenden zusätzlichen Assays für einige Proben durchgeführt, um zu beweisen, dass der G-CSF- oder GM-CSF-Teil der Fusionsproteine aktiv war. Ein Proliferationsassay wurde unter Verwendung von neutralisierenden polyklonalen Antikörpern gegen pMON13288 durchgeführt. Außerdem wurde ein Fusionsmolekül mit der Faktor Xa-Spaltungsstelle gespalten, dann gereinigt, und die Hälften des Moleküls wurden auf proliferative Aktivität analysiert. Diese Experimente zeigten, dass beide Komponenten des Fusionsproteins aktiv waren. Tabelle 3 AML-Zell-Proliferationsassay

*) zu Vergleichszwecken

Methylcellulose-Assay
Dieser Assay stellt eine vernünftige Näherung der Wachstumsaktivität von Koloniestimulierenden Faktoren dar, um normale Knochenmarkzellen zu stimulieren, um unterschiedliche Typen hämatopoetischer Kolonien in vitro zu produzieren (Bradley et al. 1966, Pluznik et al., 1965).
Verfahren
Etwa 30 ml frisches, normales, gesundes Knochenmarkaspirat werden von Personen erhalten. Unter sterilen Bedingungen werden Proben 1:5 mit 1X PBS (#14040.059 Life Technologies, Gaithersburg, MD)-Lösung in konischen Röhrchen (#25339-50 Corning, Corning, MD) verdünnt. Ficoll (Histopaque 1077 Sigma H-8889) wird unter die verdünnte Probe geschichtet, und es wird mit 300 × g für 30 Minuten zentrifugiert. Die Bande einkerniger Zellen wird entfernt und zweimal in 1X PBS und einmal mit 1% BSA PBS (CellPro Co., Bothel, WA) gewaschen. Einkernige Zellen werden gezählt, und CD34+-Zellen werden unter Verwendung der Ceprate LC (CD34) Kit (CellPro Co., Bothel, WA)-Säule selektiert. Diese Fraktionierung wird durchgeführt, da alle Stamm- und Progenitorzellen innerhalb des Knochenmarks CD34-Oberflächenantigen zeigen.
Die Kulturen werden dreifach mit einem Endvolumen von 1,0 ml in einer 35 × 10 ml-Petrischale (Nunc# 174926) angesetzt. Das Kulturmedium wird von Terry Fox Labs. (HCC-4230-Medium; Terry Fox Labs., Vancouver, B.C., Canada) bezogen; zu dem Kulturmedium wird Erythropoietin (Amgen, Thousands Oaks, CA) gegeben. 3.000-10.000 CD34+-Zellen werden pro Schale zugesetzt. Natives IL-3 und Fusionsmoleküle werden unter Erhalt von Endkonzentrationen im Bereich von 0,001 nM bis 10 nM zugesetzt. Natives IL-3 und Fusionsmoleküle werden im Haus geliefert. G-CSF (Neupogen) ist von Amgen.
Kulturen werden unter Verwendung einer 3 cm³-Spritze mit 1,0 ml pro Schale verteilt. Kontrollkulturen (Basislinienantwort) erhielten keine Kolonie-stimulierenden Faktoren. Positive Kontrollkulturen erhielten konditioniertes Medium (PHA-stimulierte humane Zellen: Terry Fox Lab. H2400). Kulturen werden bei 37°C, 5% CO₂ in befeuchteter Luft inkubiert. Hämatopoetische Kolonien, die als größer als 50 Zellen definiert werden, werden am Tag der Spitzenantwort (Tage 10-11) unter Verwendung eines Nikon-Umkehrphasen-Mikroskops mit einer 40x Objektivkombination gezählt. Gruppen von Zellen, die weniger als 50 Zellen enthalten, werden als Cluster bezeichnet. Alternativ können Kolonien identifiziert werden, indem die Kolonien auf einem Objektträger ausgebreitet werden und gefärbt werden, oder sie können herausgenommen, resuspendiert und an Cytospin-Objektträgern zum Färben zentrifugiert werden.
Assays auf hämatopoetischen Wachstumsfaktor in humanem Nabelschnurblut
Traditionell werden Knochenmarkzellen für in vitro-Assays auf die Aktivität des hämatopoetischen Kolonie-stimulierenden Faktors (CSF) verwendet. Allerdings ist humanes Knochenmark nicht immer verfügbar, und es gibt eine beträchtliche Variabilität zwischen Donoren. Nabelschnurblut ist als Quelle für hämatopoetische Stammzellen und Progenitoren mit Knochenmark vergleichbar (Broxmeyer et al., 1992; Mayani et al., 1993). Im Gegensatz zu Knochenmark ist Nabelschnurblut leichter regelmäßig verfügbar. Es gibt auch die Möglichkeit, die Assayvariabilität zu reduzieren, indem Zellen vereinigt werden, die frisch von verschiedenen Donoren erhalten werden, oder eine Bank gefrierkonservierter Zellen für diesen Zweck zu schaffen. Durch Modifizierung der Kulturbedingungen und/oder Analysieren auf Abstammungsspezifische Marker sollte es möglich sein, spezifisch auf Granulozyten/Makrophagen-Kolonien (CFU-GM), auf Megakaryozyten-CSF-Aktivität, auf Aktivität Kolonie-bildender Zellen mit hohem proliferativen Potential (HPP-CFC) zu analysieren.
Verfahren
Einzellige Zellen (MNC) werden innerhalb von 24 Stunden nach Sammlung aus Nabelschnurblut isoliert, wobei ein Standard-Dichtegradient (1,077 g/ml Histopaque) verwendet wird. Nabelschnurblut-MNC wurden außerdem durch verschiedene Verfahren an Stammzellen und Progenitoren angereichert; diese Verfahren umfassen immunmagnetische Selektion auf CD14-, CD34+-Zellen; "Panning" auf SBA-, CD34+-Fraktion unter Verwendung beschichteter Flaschen von Applied Immune Science (Santa Clara, CA) und CD34+-Selektion unter Verwendung einer CellPro (Bothell, WA)-Avidin-Säule. Für den Assay wurden entweder frisch isolier te oder Kryo-konservierte CD34+-Zell-angereicherte Fraktionen verwendet. Für jede Reihenverdünnung einer Probe wurden zweifache Kulturen (Konzentrationsbereich von 1 pM bis 1204 pM) mit 1 × 10⁴ Zellen in 1 ml 0,9% Methylcellulose-enthaltendem Medium ohne zusätzliche Wachstumsfaktoren (Methocult H4230 von Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) hergestellt. In einigen Experimenten wurde Methocult H4330, das Erythropoietin (EPO) enthält, anstelle von Methocult H4230 verwendet oder es wurde Stammzellfaktor (SCF), 50 ng/ml (Biosource International, Camarillo, CA) zugesetzt. Nach Kultivieren für 7-9 Tage werden die Kolonien, die >30 Zellen enthalten, gezählt. Um bei der Punktbewertung subjektive Befangenheit zu eliminieren, werden die Assays blind bewertet.
Analyse der proliferativen Aktivität des c-mpl-Liganden Verfahren
1. Knochenmarkproliferationsassay
a. CD34+-Zellreinigung:
Zwischen 15 und 20 ml Knochenmarksaspirate wurden von normalen allogenen Knochenmarks-Donoren nach Einverständniserklärung erhalten. Zellen werden in Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, Gibco-BRL) 1:3 verdünnt, 30 ml wurden über 15 ml Histopaque-1077 (Sigma) geschichtet und für 30 Minuten bei 300 RCF zentrifugiert. Die einkernige Grenzflächenschicht wurde gesammelt und in PBS gewaschen. CD34+-Zellen wurden aus der einkernigen Zellpräparation unter Verwendung einer Affinitätssäule nach Anweisungen der Hersteller (CellPro, Inc., Bothell, WA) angereichert. Nach Anreicherung war die Reinheit der CD23+-Zellen durchschnittlich 70%, wie es unter Verwendung einer strömungscytometrischen Analyse bestimmt wurde, wobei monoklonale Antikörper gegen CD34, konjugiert an Fluorescein, und gegen CD38, konjugiert an Phycoerythrin (Becton Dickinson, San Jose, CA), verwendet wurden.
Zellen wurden mit 40.000 Zellen/ml in X-Vivo 10-Medium (Bio-Whittaker, Walkersville, MD) resuspendiert, und 1 ml wurde in Gewebekulturplatten mit 12 Vertiefungen (Costar) plattiert. Der Wachstumsfaktor rhIL-3 wurde mit 100 ng/ml (pMON5873) zu einigen Vertiefungen gegeben. hIL3-Variante pMON13288 wurde mit 10 ng/ml oder 100 ng/ml verwendet. Konditionierte Medien von BHK-Zellen, transfiziert mit Plasmid, das für c-mpl-Ligand codiert, wurden durch Zusatz von 100 μl Überstand, zugegeben zu 1 ml-Kulturen (etwa 10% Verdünnung), getestet. Die Zellen wurden für 8-10 Tage bei 37°C und 5% CO₂ in einem befeuchteten 37°C-Inkubator inkubiert.
b. Zellernte und -analyse
Am Ende des Kulturzeitraums wurde für jeden Zustand eine Gesamtzellzählung erhalten. Zur Fluoreszenzanalyse und Ploidy-Bestimmung wurden Zellen in Megakaryozyten-Puffer (MK-Puffer, 13,6 mM Natriumcitrat, 1 mM Theophyllin, 2,2 μm PGE1, 11 mM Glucose, 3% G/V BSA in PBS, pH 7,4) [Tomer et al., (1987)] gewaschen, in 500 μl MK-Puffer, der Anti-CD41a-FITC-Antikörper enthielt (1:200, AMAC, Westbrook, ME) resuspendiert und in MK- Puffer gewaschen. Zur DNA-Analyse wurden Zellen in MK-Puffer, der 0,5% Tween 20 (Fisher, Fair Lawn NJ) enthielt, für 20 Minuten auf Eis permeabilisiert, gefolgt von Fixierung in 0,5% Tween 20 und 1% Paraformaldehyd (Fischer Chemical) für 30 Minuten, gefolgt von einer Inkubation in Propidiumiodid (Calbiochem, La Jolla, CA) (50 μg/ml) mit RNA-ase (400 U/ml) in 55% V/V MK-Puffer (200 mOsm) für 1-2 Stunden auf Eis. Die Zellen wurden mit einem FACScan- oder Vantage-Strömungscytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) analysiert. Grüne Fluoreszenz (CD41a-FITC) wurde zusammen mit linearen und log-Signalen auf rote Fluoreszenz (PI) zur Bestimmung von DNA-Ploidy gesammelt. Alle Zellen wurden gesammelt, um den prozentualen Anteil an Zellen, die CD41+ waren, zu bestimmen. Eine Datenanalyse wurde unter Verwendung von LYSIS-Software (Becton Dickinson, San Jose, CA) durchgeführt. Der Prozentwert für Zellen, die das CD41-Antigen exprimieren, wurde durch Strömungscytometrie-Analyse (Prozent) erhalten. Die absolute (Abs) Zahl der CD41+-Zellen/ml wurde durch: (Abs) = (Zellzahl) * (Prozent)/100 errechnet.
2. Megakaryozten-Fibringerinnsel-Assay
Eine CD34+-angereicherte Population wurde, wie oben beschrieben, isoliert. Die Zellen wurden mit 25.000 Zellen/ml mit/ohne Cytokin(en) in einem Medium suspendiert, das aus einem Iscoves IMDM-Grundmedium, supplementiert mit 0,3% BSA, 0,4 mg/ml apo-Transferrin, 6,67 μM FeCl₂, 25 μg/ml CHCl₂, 25 μg/ml L-Asparagin, 500 μg/ml E-Amino-n-capronsäure und Penicillin/Streptomycin, bestand. Vor Plattieren in 35 mm-Platten wurde Thrombin zugesetzt (0,25 Einheiten/ml), um die Gerinnselbildung zu initiieren. Die Zellen wurden für 13 Tage bei 37°C und 5% CO₂ in einem befeuchteten Inkubator mit 37°C inkubiert.
Am Ende des Kulturzeitraums wurden die Platten mit Methanol:Aceton (1:3) fixiert, luftgetrocknet und bis zum Färben bei –200°C gelagert. Ein Peroxidase-Immuncytochemie-Färbeverfahren wurde angewendet (Zymed, Histostain-SP, San Francisco, CA), wobei ein Cocktail primärer monoklonaler Antikörper, bestehend aus anti-CD41a, -CD42 und -CD61, verwendet wurde. Nach dem Färben wurden die Kolonien gezählt und als negative, CFU-MK(kleine Kolonien, 1-2 Foci und weniger als etwa 25 Zellen), BFU-MK- (große Kolonien mit mehreren Foci mit >25 Zellen) oder gemischte Kolonien (Mischung aus positiven und negativen Zellen) klassifiziert.
Beispiel 70
Verabreichung des Fusionsmoleküls aus hIL-3-Variante, pMON13288 und c-mpl-Ligand hat im Vergleich zu jedem Cytokin allein eine mehr als additive Wirkung auf die Megakaryozyten-Expansion.
Megakaryozyten-Fibringerinnsel-Kulturen wurden wie im Abschnitt Verfahren be schrieben angelegt. pMON26448 ist die 1-153-Aminosäuren-Form des c-mpl-Liganden (Meg-CSF). pMON26463 ist ein Fusionsmolekül, das aus hIL-3-Variante, pMON13288 und der 1-153-Aminosäuren-Form des c-mpl-Liganden besteht. Inkubation in Gegenwart von hIL-3-Variante pMON13288 ergab Kolonien, die außer für eine geringe Zahl an CFU-MK-Kolonien (23/114) auf Megakaryozyten-Marker negativ waren (86/114 (Tabelle 4)). pMON26448 allein führte vornehmlich zu CFU-MK-Kolonien (172/175) mit nur einer geringen Zahl an negativen Kolonien (3/175). Die Kombination von hIL-3-Variante pMON13288 und pMON26448 führte zu einer großen Zahl positiver Kolonien (295/414), die vornehmlich BFU-MK-Morphologie hatten. Es gab auch negative Kolonien (119/414). Die Gesamtzahl positiver Kolonien bei der Co-Verabreichung war im Vergleich zu jedem Cytokin allein mehr als additiv. pMON26463, das Fusionsmolekül, lieferte Resultate, die ähnlich denen der Kombination von hIL-3-Variante pMON13288 und pMON26448 war. Die Anzahl der negativen Zellen ist weniger als mit der hIL-3-Variante pMON13288, was vermutlich auf die niedrigere Konzentration an pMON13288 in der Präparation zurückzuführen ist (annähernd 10 ng/ml als Teil des Fusionsmoleküls vs. 100 ng/ml hIL-3-Variante pMON13288).
Tabelle 4.
IL-3-vermittelte Sulfidoleukotrien-Freisetzung aus humanen einkernigen Zellen
Der folgende Assay wird verwendet, um eine IL-3-vermittelte Sulfidoleukotrien-Freisetzung aus humanen einkernigen Zellen zu messen.
Heparin-enthaltendes humanes Blut wird gesammelt und auf ein gleiches Volumen an Ficoll-Paque (Pharmacia #17-0840-02)-gebrauchsfertiges Medium (Dichte 1,077 g/ml) geschichtet. Das Ficoll wird vor Verwendung auf Raumtemperatur erwärmt, und es werden klare 50 ml Polystyrolröhrchen verwendet. Der Ficoll-Gradient wird mit 300 × g für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Verwendung eines H1000B-Rotors in einer gekühlten Sorvall RT6000B-Zentrifuge zentrifugiert. Die Bande, die die einkernigen Zellen enthält, wird sorgfältig entfernt, das Volumen wird mit Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung (Gibco Labora tories Kat. # 310-4040PK) auf 50 ml eingestellt, für 10 Minuten bei 4°C mit 400 × g zentrifugiert, und der Überstand wird sorgfältig entfernt. Das Zellpellet wird zweimal mit HA-Puffer [20 mM Hepes (Sigma # H-3375), 125 mM NaCl (Fisher # 5271-500), 5 mM KCl (Sigma # P-9541), 0,5 mM Glucose (Sigma # G-5000), 0,025% humanes Serumalbumin (Calbiochem # 126654)] gewaschen und bei 300 × g, 10 min, 4°C, zentrifugiert. Die Zellen werden in HACM-Puffer (HA-Puffer, supplementiert mit 1 mM CaCl₂ (Fisher # C79-500) und 1 mM MgCl₂ (Fisher # M-33), in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert, und 180 μl werden in jede Vertiefung von Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen transferiert. Die Zellen werden sich bei 37°C für 15 Minuten akklimatisieren gelassen. Die Zellen werden durch Zusetzen von 10 μl einer 20 X Stammlösung verschiedener Cytokin-Konzentrationen in jede Vertiefung (typischerweise 100.000, 20.000, 4.000, 800, 160, 32, 6,4, 1,28, 0 fM IL3) stimuliert ("primed"). Die Zellen werden für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Sulfidoleukotrien-Freisetzung wird durch Zusatz von 10 μl 20 X (1000 nM) fmet-leu-phe (Calbiochem # 344252) Endkonzentration 50 nM FMLP aktiviert und für 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platten werden bei 4°C für 20 Minuten bei 350 × g zentrifugiert. Die Überstände werden entfernt und auf Sulfidoleukotriene analysiert, wobei Caymans Leukotrien C4 EIA-Kit (Kat. #420211) nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde. Natives hIL-3 wird in jedem Assay als Standardkontrolle laufen gelassen.
Weitere Details, die dem Fachmann bekannt sind, können bei T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), und darin zitierten Referenzen; und in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), und darin zitierten Referenzen, gefunden werden.
Zusätzliche Details über die IL-3-Varianten der vorliegenden Erfindung können in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung, Serial No. PCT/US93/11197, gefunden werden. Weitere Details über die Herstellung des Fusionsproteins können in WO 92/04455 und WO 91/02754 gefunden werden.
Weitere Details über das Lymphokin und die Varianten davon können in den US-Patenten 4 810 643 und 5 218 092, in der EP-Anmeldung 02174004 gefunden werden. Aminosäuren werden hierin durch Ein-Buchstaben- oder Drei-Buchstaben-Standardabkürzungen wie folgt angegeben:

TABELLE 5 OLIGONUCLEOTIDE

TABELLE 6 DNA-SEQUENZEN
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Fusionsprotein, das Bindungsaffinität für wenigstens den hIL-3-Rezeptor hat und das die Formel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOs: 126, 127, 132 und 136 des beigefügten Sequenzprotokolls, hat.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge des Fusionsproteins nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Pharmazeutisch wirksame Menge des Fusionsproteins nach Anspruch 1 zur Verwendung in einem Verfahren zur Erhöhung der hämatopoetischen Zellproduktion in einem Säuger.
Pharmazeutisch wirksame Menge des Fusionsproteins nach Anspruch 1 zur Verwendung in einem Verfahren zur Erhöhung der hämatopoetischen Zellproduktion in einem Säuger.
Rekombinante DNA-Sequenz, die für ein Fusionsprotein nach Anspruch 1 codiert.
Rekombinante DNA-Sequenz nach Anspruch 5, die aus der Gruppe, bestehend aus Nucleotid-Sequenzen, die SEQ ID NOs: 58, 61, 63 und 86 des beigefügten Sequenzprotokolls entsprechen, ausgewählt ist.
Wirtszelle, die eine rekombinante DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 5 oder 6 umfasst und zur Expression des Fusionsproteins fähig ist.
Verfahren zum Produzieren eines Fusionsproteins nach Anspruch 1, umfassend die Schritte: (a) Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 7, unter Bedingungen, die eine Expression der rekombinanten DNA erlauben; und (b) Ernten des Fusionsproteins aus der Kultur.