JPH0463595A - ヒトインターロイキン３誘導体 - Google Patents
ヒトインターロイキン３誘導体Info
- Publication number
- JPH0463595A JPH0463595A JP2279108A JP27910890A JPH0463595A JP H0463595 A JPH0463595 A JP H0463595A JP 2279108 A JP2279108 A JP 2279108A JP 27910890 A JP27910890 A JP 27910890A JP H0463595 A JPH0463595 A JP H0463595A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- plasmid
- reaction
- fragment
- derivative
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101001033279 Homo sapiens Interleukin-3 Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 23
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 118
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 abstract description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 173
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 93
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 64
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 61
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 43
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 42
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 40
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 40
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 36
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 36
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 description 32
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 26
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 26
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 26
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 21
- 101100069853 Caenorhabditis elegans hil-3 gene Proteins 0.000 description 19
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 17
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 17
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 16
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 14
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 101000658545 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Type I restriction enyme HindI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 4
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 108091007973 Interleukin-36 Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 102000055276 human IL3 Human genes 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000003760 tallow Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- PLVPPLCLBIEYEA-WAYWQWQTSA-N (z)-3-(1h-indol-3-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(\C=C/C(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-WAYWQWQTSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100433727 Caenorhabditis elegans got-1.2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000031637 Erythroblastic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000036566 Erythroleukaemia Diseases 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 241000116629 Ferula sumbul Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101000998132 Homo sapiens Interleukin-34 Proteins 0.000 description 1
- 108010067003 Interleukin-33 Proteins 0.000 description 1
- 102000017761 Interleukin-33 Human genes 0.000 description 1
- 102100033499 Interleukin-34 Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 208000021841 acute erythroid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010359 gene isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N indoleacrylic acid Natural products C1=CC=C2C(C=CC(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940030270 sumbul Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野コ
本発明は、新規な変異型のヒトインターロイキン３誘導
体、この誘導体をコードするＤＮＡ、このＤＮＡを組み
込んだ組換え体プラスミドおよびこの組換えプラスミド
により形質転換された微生物、ならびにこの微生物を使
用するヒトインターロイキン３誘導体の製造方法に関す
る。
体、この誘導体をコードするＤＮＡ、このＤＮＡを組み
込んだ組換え体プラスミドおよびこの組換えプラスミド
により形質転換された微生物、ならびにこの微生物を使
用するヒトインターロイキン３誘導体の製造方法に関す
る。
［従来の技術］
ヒトインターロイキン３（以下ｈｌＬ３という）は、多
能性幹細胞に作用して好中球、マクロファージ、好酸球
、肥満細胞、巨核球への分化を刺激する生理活性物質で
ある（三浦恭定、蛋白質核酸酵素３２゜１２０ （１９
８７）；小安重夫、細胞工学６．４５８ （１９８７）
）。
能性幹細胞に作用して好中球、マクロファージ、好酸球
、肥満細胞、巨核球への分化を刺激する生理活性物質で
ある（三浦恭定、蛋白質核酸酵素３２゜１２０ （１９
８７）；小安重夫、細胞工学６．４５８ （１９８７）
）。
医薬品としての用途としては、次の２つが考えられる。
すなわち、造血細胞の共通幹細胞および各種白血球の前
駆細胞を増殖することから骨髄移植時の補助薬としての
用途と、臨床上要望の強い血小板数低下としての用途で
ある。
駆細胞を増殖することから骨髄移植時の補助薬としての
用途と、臨床上要望の強い血小板数低下としての用途で
ある。
骨髄移植は、白血病の治療のための放射線障害、悪性リ
ンパ腫、抗癌剤投与による各種障害の治療法として有用
な方法であるが、移植する骨髄細胞が大量に必要なため
ドナーの負担が大きい。そのため１度採取した骨ｆｉｔ
細胞を生体外で大量に増やしたりあるいは移植時にレシ
ピエンド体内で急速に増殖させて血球の回復を早めるこ
とができれば医薬上画期的な方法となる（医学のあゆみ
、１４６゜２５５−４５８ （１９８８））。
ンパ腫、抗癌剤投与による各種障害の治療法として有用
な方法であるが、移植する骨髄細胞が大量に必要なため
ドナーの負担が大きい。そのため１度採取した骨ｆｉｔ
細胞を生体外で大量に増やしたりあるいは移植時にレシ
ピエンド体内で急速に増殖させて血球の回復を早めるこ
とができれば医薬上画期的な方法となる（医学のあゆみ
、１４６゜２５５−４５８ （１９８８））。
一方、血小板は抗癌剤を大量に投与された担癌患者にお
いては極度に低下することがあり、このような患者にお
いては血小板数低下に起因する種々の障害、たとえば異
常出血（出血過多等）がおこり易くなる。ｈｒＬ３は血
小板の分化増殖を促進させることにより、これらの障害
を軽減させることが期待されている（Ｓ、Ｃ，Ｃ１ａｒ
ｋ ａｎｄ Ｒ，Ｋａｍｅｎ。
いては極度に低下することがあり、このような患者にお
いては血小板数低下に起因する種々の障害、たとえば異
常出血（出血過多等）がおこり易くなる。ｈｒＬ３は血
小板の分化増殖を促進させることにより、これらの障害
を軽減させることが期待されている（Ｓ、Ｃ，Ｃ１ａｒ
ｋ ａｎｄ Ｒ，Ｋａｍｅｎ。
５ｃｉｅｎｃｅ ２３６．１２２９ （１９８７））。
そして、このｈｌＬ３は、天然には１３３個のアミノ酸
残基から成るポリペプチドを含む糖タンパク質として存
在していると考えられている。ｈｌＬ３の遺伝子単離と
これを利用した製造技術については既に報告があり（Ｙ
、Ｃ，ＹａｎｇらＣｅ１ｌ ４７．３ （１９８６）；
Ｌ、 ＤｏｒｓｓｅｒらＧｅｎｅ ５５． １１５
（１９８７）） 、 ｈｌＬ３をコードする遺伝子の
塩基配列ならびにそれによって生産されるポリペプチド
のアミノ酸配列は共に公知である。上記のＹａｎｇらお
よびＤｏｒｓｓｅｒらの報告によれば、天然のｈｌＬ３
には、その成熟蛋白質のＮ末端と推定されるＡｌａから
数えて８番目のアミノ酸がＳｅｒであるものとＰｒｏで
あるものの両者が存在する。これらはともにヒトゲノム
上に遺伝子として存在しており、両者間で活性には差が
ないことが知られている（Ｗｏ ９０１０１０３９）。
残基から成るポリペプチドを含む糖タンパク質として存
在していると考えられている。ｈｌＬ３の遺伝子単離と
これを利用した製造技術については既に報告があり（Ｙ
、Ｃ，ＹａｎｇらＣｅ１ｌ ４７．３ （１９８６）；
Ｌ、 ＤｏｒｓｓｅｒらＧｅｎｅ ５５． １１５
（１９８７）） 、 ｈｌＬ３をコードする遺伝子の
塩基配列ならびにそれによって生産されるポリペプチド
のアミノ酸配列は共に公知である。上記のＹａｎｇらお
よびＤｏｒｓｓｅｒらの報告によれば、天然のｈｌＬ３
には、その成熟蛋白質のＮ末端と推定されるＡｌａから
数えて８番目のアミノ酸がＳｅｒであるものとＰｒｏで
あるものの両者が存在する。これらはともにヒトゲノム
上に遺伝子として存在しており、両者間で活性には差が
ないことが知られている（Ｗｏ ９０１０１０３９）。
［発明が解決しようとする課題］
そこで、本発明の課題は、ｈｌＬ３よりもさらに比活性
の高い変異型のｈｌＬ３誘導体を安価に大量に提供する
点にある。
の高い変異型のｈｌＬ３誘導体を安価に大量に提供する
点にある。
［課題を解決するための手段］
本発明者らはｈｌＬ３をコードするＤＮＡを改変し、そ
の改変したＤＮＡを適当な発現プラスミドに組み込み、
そのプラスミドを担う宿主細胞を培養することにより比
活性の高いｈＩＬ３誘導体が生産されることを見いだし
、この研究成果を基礎として本発明を完成するに至った
。
の改変したＤＮＡを適当な発現プラスミドに組み込み、
そのプラスミドを担う宿主細胞を培養することにより比
活性の高いｈＩＬ３誘導体が生産されることを見いだし
、この研究成果を基礎として本発明を完成するに至った
。
すなわち、本発明は、新規な変異型のｈｌＬ３誘導体、
この誘導体ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込ん
だ組換え体プラスミド、このプラスミドを含む微生物お
よびこの微生物を用いる新規なｈＩＬ３誘導体の製造法
に関するものである。
この誘導体ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込ん
だ組換え体プラスミド、このプラスミドを含む微生物お
よびこの微生物を用いる新規なｈＩＬ３誘導体の製造法
に関するものである。
以下本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の変異型のｈＩＬ３誘導体は、第１図に示すアミ
ノ酸配列を有するｈｌＬ３ポリペプチドの一部のアミノ
酸が他種アミノ酸で置換されたものである。
ノ酸配列を有するｈｌＬ３ポリペプチドの一部のアミノ
酸が他種アミノ酸で置換されたものである。
より好ましくは、第１図で示されるアミノ酸配列におい
て、Ｎ末端から（ＭＥＴを第１番目として）第６４番目
から第１３４番目までのアミノ酸のうち少なくとも１個
のアミノ酸が他種のアミノ酸に置換されたものである。
て、Ｎ末端から（ＭＥＴを第１番目として）第６４番目
から第１３４番目までのアミノ酸のうち少なくとも１個
のアミノ酸が他種のアミノ酸に置換されたものである。
具体的には、同６４番目、８３番目、８８番目、９９番
目、１１３１３番目２２２２番目１２７２７番目３２３
２番目３４３４番目ミノ酸のうち少なくても１つ、最大
８つが他のアミノ酸に変換されたアミノ酸配列を有する
ｈＩＬ３であり、さらに具体的には、第３図から第８図
に示すｈｌＬ３ポリペプチド誘導体を挙げることができ
る。そして、これらの変異部位はいずれもｈｌＬ３のＣ
末端側に位置する。
目、１１３１３番目２２２２番目１２７２７番目３２３
２番目３４３４番目ミノ酸のうち少なくても１つ、最大
８つが他のアミノ酸に変換されたアミノ酸配列を有する
ｈＩＬ３であり、さらに具体的には、第３図から第８図
に示すｈｌＬ３ポリペプチド誘導体を挙げることができ
る。そして、これらの変異部位はいずれもｈｌＬ３のＣ
末端側に位置する。
誘導体ポリペプチドをコードするＤＮＡを得る方法とし
ては、変異させたいアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を
ポイントミューティジョン法（Ａ。
ては、変異させたいアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を
ポイントミューティジョン法（Ａ。
Ｗａｎｇら、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２２４．１４３１ （
１９８４））により変異させる方法が知られている。し
かしなから上記の方法は現実的には煩雑な操作となるた
め、本発明者らは、変異させたい最大９残基のアミノ酸
の全てが変異したポリペプチドに対応する変異ｈｌＬ３
ＤＮＡを化学的に全合成し、このＤＮＡから変異させた
い部分を切り出してもとのＤＮＡと置換することにより
、誘導体ポリペプチドをコードするＤＮＡを得た。より
具体的には、もとのｈｌＬ３のうち変化させたいアミノ
酸、すなわちＮ末端から（ＭＥＴを第１番目として）６
４番目、８３番目、８８番目、９９番目、１１３１３番
目２２２２番目２７２７番目３２３２番目１３４３４番
目残基のアミノ酸が特定のアミノ酸に置換されたポリペ
プチド（第２図に示す）をコードする部分変異ｈｌＬ３
ＤＮＡを化学的に合成する。この部分変異ｈＩＬ３Ｄ
Ｎ Ａを制限酵素で切断して適切な断片を取り出し、も
とのｈｌＬ３をコードするＤＮＡの対応部分と入れ換え
ることによって、変異型の誘導体ｈｌＬ３ポリペプチド
をコードするＤＮＡ鎖を構築する。
１９８４））により変異させる方法が知られている。し
かしなから上記の方法は現実的には煩雑な操作となるた
め、本発明者らは、変異させたい最大９残基のアミノ酸
の全てが変異したポリペプチドに対応する変異ｈｌＬ３
ＤＮＡを化学的に全合成し、このＤＮＡから変異させた
い部分を切り出してもとのＤＮＡと置換することにより
、誘導体ポリペプチドをコードするＤＮＡを得た。より
具体的には、もとのｈｌＬ３のうち変化させたいアミノ
酸、すなわちＮ末端から（ＭＥＴを第１番目として）６
４番目、８３番目、８８番目、９９番目、１１３１３番
目２２２２番目２７２７番目３２３２番目１３４３４番
目残基のアミノ酸が特定のアミノ酸に置換されたポリペ
プチド（第２図に示す）をコードする部分変異ｈｌＬ３
ＤＮＡを化学的に合成する。この部分変異ｈＩＬ３Ｄ
Ｎ Ａを制限酵素で切断して適切な断片を取り出し、も
とのｈｌＬ３をコードするＤＮＡの対応部分と入れ換え
ることによって、変異型の誘導体ｈｌＬ３ポリペプチド
をコードするＤＮＡ鎖を構築する。
第１図に示されるｈＩＬ３をコードするＤＮＡとしては
、既知の合成法、たとえばホスホアミダイド法による固
相合成法（Ｂｅａｕｃａｇｅら、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎＬｅｔｔｅｒｓ ２２．１８５９〜１９６２ （１
９８１））によって合成したものや、ｈｌＬ３をコード
するｍＲＮＡから組換えＤＮＡ技術で逆転写して得られ
るｃＤＮＡなどを利用できる。
、既知の合成法、たとえばホスホアミダイド法による固
相合成法（Ｂｅａｕｃａｇｅら、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎＬｅｔｔｅｒｓ ２２．１８５９〜１９６２ （１
９８１））によって合成したものや、ｈｌＬ３をコード
するｍＲＮＡから組換えＤＮＡ技術で逆転写して得られ
るｃＤＮＡなどを利用できる。
本発明のｈｌＬ３ポリペプチド誘導体をコードするＤＮ
Ａ断片は、第１図に示すｈｌＬ３ポリペプチドをコード
するＤＮＡ断片の適切な領域と、第２図に示した部分変
異ｈＩＬ３ポリペプチドをコードするＤＮＡの対応する
領域とを、前記した変異手段にしたがって、具体的には
例えば実施例１から実施例６あるいは実施例９に詳細に
示した工程にしたがって、入れ換えることによって構築
することができる。このようにして作製されたＤＮＡを
当該技術分野で公知の技術により適当な形質発現ベクタ
ープラスミドに適切に発現するように挿入する。
Ａ断片は、第１図に示すｈｌＬ３ポリペプチドをコード
するＤＮＡ断片の適切な領域と、第２図に示した部分変
異ｈＩＬ３ポリペプチドをコードするＤＮＡの対応する
領域とを、前記した変異手段にしたがって、具体的には
例えば実施例１から実施例６あるいは実施例９に詳細に
示した工程にしたがって、入れ換えることによって構築
することができる。このようにして作製されたＤＮＡを
当該技術分野で公知の技術により適当な形質発現ベクタ
ープラスミドに適切に発現するように挿入する。
本発明による上記ＤＮＡ鎖を含むプラスミドの例として
は、第９図（第３図に示す塩基配列を含むＤＮＡ鎖を含
むもの）、第１０図（第４図に示す塩基配列を含むＤＮ
Ａ鎖を含むもの）、第１１図（第５図に示す塩基配列を
含むＤＮＡを含むもの）、第１２図（第６図に示す塩基
配列を含むＤＮＡ鎖を含むもの）、第１３図（第７図に
示す塩基配列を含むＤＮＡ鎖を含むもの）および第１４
図（第８図に示す塩基配列を含むＤＮＡ鎖を含むもの）
に示されているもの並びに第２２図に示す塩基配列を含
むＤＮＡ鎖を持つものをあげることができる。
は、第９図（第３図に示す塩基配列を含むＤＮＡ鎖を含
むもの）、第１０図（第４図に示す塩基配列を含むＤＮ
Ａ鎖を含むもの）、第１１図（第５図に示す塩基配列を
含むＤＮＡを含むもの）、第１２図（第６図に示す塩基
配列を含むＤＮＡ鎖を含むもの）、第１３図（第７図に
示す塩基配列を含むＤＮＡ鎖を含むもの）および第１４
図（第８図に示す塩基配列を含むＤＮＡ鎖を含むもの）
に示されているもの並びに第２２図に示す塩基配列を含
むＤＮＡ鎖を持つものをあげることができる。
第１図に示されるｈｌＬ３をコードするＤＮＡとして化
学合成したものを利用できることはすでに述べたが、合
成に際しては、コドンの縮重を利用して、アミノ酸配列
が変わらないようにして目的に合った任意の塩基配列を
用いることができる。具体的には、特定の宿主細胞中で
高い発現量を得るために、その宿主において用いられる
頻度が高いコドンを使用することが考えられる。ｈＩＬ
３をコードするそのようなりＮＡの例としては、たとえ
ば大腸菌で大量発現するように合成されたものが発明者
らによって公表されている（特開平２−４８２号）。
学合成したものを利用できることはすでに述べたが、合
成に際しては、コドンの縮重を利用して、アミノ酸配列
が変わらないようにして目的に合った任意の塩基配列を
用いることができる。具体的には、特定の宿主細胞中で
高い発現量を得るために、その宿主において用いられる
頻度が高いコドンを使用することが考えられる。ｈＩＬ
３をコードするそのようなりＮＡの例としては、たとえ
ば大腸菌で大量発現するように合成されたものが発明者
らによって公表されている（特開平２−４８２号）。
本発明のｈｌＬ３誘導体をコードするＤＮＡについても
、このようなコドンの縮重を利用した任意の塩基配列を
用いることが可能である。具体例としては、たとえば大
腸菌でｈｌＬ３誘導体ポリペプチドを大量に発現させる
ために、大腸菌でよく用いられるコドンを使用すること
ができ、これはさらに具体的に実施例９に示されている
。
、このようなコドンの縮重を利用した任意の塩基配列を
用いることが可能である。具体例としては、たとえば大
腸菌でｈｌＬ３誘導体ポリペプチドを大量に発現させる
ために、大腸菌でよく用いられるコドンを使用すること
ができ、これはさらに具体的に実施例９に示されている
。
本発明においてはこれらプラスミドを宿主に導入した形
質転換体を培養することにより、本発明のｈＩＬ３誘導
体を産生させることができる。さらに詳しくは、例えば
本発明のｈＩＬ３誘導体ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ断片を調製し、これを適描なプロモーターおよびＳＤ
配列の下流に組み込むことにより、本発明の誘導体ポリ
ペプチドを大腸菌で生産するための形質発現ベクターを
製造することができる。プロモーターとしては、例えば
ｌａｃ。
質転換体を培養することにより、本発明のｈＩＬ３誘導
体を産生させることができる。さらに詳しくは、例えば
本発明のｈＩＬ３誘導体ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ断片を調製し、これを適描なプロモーターおよびＳＤ
配列の下流に組み込むことにより、本発明の誘導体ポリ
ペプチドを大腸菌で生産するための形質発現ベクターを
製造することができる。プロモーターとしては、例えば
ｌａｃ。
ｔｒｐ、 ｔａｃ、 ＰＬプロモーター等が挙げられる
。本発明のｈｌＬ３誘導体ポリペプチド生産用の形質発
現ベクターを適当な大腸菌株にＣｏｈｅｎらの方法（Ｐ
ｒｏｃ。
。本発明のｈｌＬ３誘導体ポリペプチド生産用の形質発
現ベクターを適当な大腸菌株にＣｏｈｅｎらの方法（Ｐ
ｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ６９．
２１１０ （１９７２））により導入して形質転換体を
得ることができる。ついでこの形質転換体をそれに応じ
た適当な培養条件で培養することにより、目的とするｈ
ｒＬ３誘導体ポリペプチドを産生ずることができる。こ
の培養物すなわち菌体からの生産蛋白の回収も目的に合
った任意の方法に従って行うことができる。ｈｌＬ３誘
導体ポリペプチドは大腸菌中において凝集した形で生産
されるので、この蛋白を回収し変性剤（例えば、塩酸グ
アニジン、尿素）およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）
中で可溶化の後、還元剤存在下で酸化してから、さらに
蛋白質の一般的な精製法に従い精製することにより、ｈ
ｌＬ３誘導体ポリペプチドを製造することができる。
２１１０ （１９７２））により導入して形質転換体を
得ることができる。ついでこの形質転換体をそれに応じ
た適当な培養条件で培養することにより、目的とするｈ
ｒＬ３誘導体ポリペプチドを産生ずることができる。こ
の培養物すなわち菌体からの生産蛋白の回収も目的に合
った任意の方法に従って行うことができる。ｈｌＬ３誘
導体ポリペプチドは大腸菌中において凝集した形で生産
されるので、この蛋白を回収し変性剤（例えば、塩酸グ
アニジン、尿素）およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）
中で可溶化の後、還元剤存在下で酸化してから、さらに
蛋白質の一般的な精製法に従い精製することにより、ｈ
ｌＬ３誘導体ポリペプチドを製造することができる。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。
。
実施例１
（１）プラスミドｐＰＵＩＬ３の構築
ヒトＩＬ３ｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ、ＢＢＧ１
４ （Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｌｉｍ１ｔｅｄより購入）８μｇに５０μｌの１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ （ｐＨ７，５） 、５ｍＭＭｇＣ
ｌ！、１ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１００ｍ
Ｍ ＮａＣ１を含む溶液（以下Ｂ緩衝液という）中で制
限酵素ＨｉｎｄｌＩ［（ベーリンガーマンハイム社製、
以下制限酵素については特記しない限りすべてベーリン
ガーマンハイム社製）４０単位と制限酵素５ｐｅ１ ４
０単位とを加え、３７°Ｃで３時間反応を行った。エタ
ノール沈澱処理を行った後アガロースゲル電気泳動法に
より約３． ｌｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
４ （Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｌｉｍ１ｔｅｄより購入）８μｇに５０μｌの１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ （ｐＨ７，５） 、５ｍＭＭｇＣ
ｌ！、１ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１００ｍ
Ｍ ＮａＣ１を含む溶液（以下Ｂ緩衝液という）中で制
限酵素ＨｉｎｄｌＩ［（ベーリンガーマンハイム社製、
以下制限酵素については特記しない限りすべてベーリン
ガーマンハイム社製）４０単位と制限酵素５ｐｅ１ ４
０単位とを加え、３７°Ｃで３時間反応を行った。エタ
ノール沈澱処理を行った後アガロースゲル電気泳動法に
より約３． ｌｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
次に、Ｙａｎｇら（Ｃｅｌｌ ４７．３ （１９８６）
）によって報告されているヒトＩＬ３のシグナル配列を
コードするＤＮＡ配列を化学合成し、さらにアニーリン
グした後、上記ＢＢＧ１４由来のＤＮＡ断片（３，１ｋ
ｂ）に結合反応を行った。得られた組換え体プラスミド
の混合物を用いて大腸菌ＪＭ １０９株（宝酒造社製）
を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体よりプラスミドを回収し、得られ
たプラスミドのＤＮＡ塩基配列を決定して目的の配列を
含むことを確認した。このプラスミドをｐＰＵＩＬ３と
呼ぶ。
）によって報告されているヒトＩＬ３のシグナル配列を
コードするＤＮＡ配列を化学合成し、さらにアニーリン
グした後、上記ＢＢＧ１４由来のＤＮＡ断片（３，１ｋ
ｂ）に結合反応を行った。得られた組換え体プラスミド
の混合物を用いて大腸菌ＪＭ １０９株（宝酒造社製）
を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体よりプラスミドを回収し、得られ
たプラスミドのＤＮＡ塩基配列を決定して目的の配列を
含むことを確認した。このプラスミドをｐＰＵＩＬ３と
呼ぶ。
（２） ｈｌＬ３誘導体誘導体３ブ
（第９図、第１５図参照）：
前記工程で得られたｈｌＬ３をコードするＤＮＡを含む
ｐＰＵＩＬ３Ｄ Ｎ Ａ ５μｇを１００μｌのＢ緩衝
液中で制限酵素ＢａｍＨＩ ５０単位を加え、３７°Ｃ
で４時間反応を行った。エタノール沈澱により回収した
ＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、
１０ｍＭ ＭｇＣ１ｚおよび１０ｍＭメルカプトエタノ
ールを含む溶液（以下り緩衝液という）５０μｌに溶か
し、制限酵素Ｂａ１ｌ （宝酒造社製）５０単位を加え
３７°Ｃで５時間反応を行った。
ｐＰＵＩＬ３Ｄ Ｎ Ａ ５μｇを１００μｌのＢ緩衝
液中で制限酵素ＢａｍＨＩ ５０単位を加え、３７°Ｃ
で４時間反応を行った。エタノール沈澱により回収した
ＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、
１０ｍＭ ＭｇＣ１ｚおよび１０ｍＭメルカプトエタノ
ールを含む溶液（以下り緩衝液という）５０μｌに溶か
し、制限酵素Ｂａ１ｌ （宝酒造社製）５０単位を加え
３７°Ｃで５時間反応を行った。
その反応液に５０μｌのＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ
８．０）を加え混合し、１０単位のバクテリアアルカリ
フォスファダーゼ（宝酒造社製）を添加して６５°Ｃで
３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った後、ア
ガロースゲル電気泳動法により３． ｌｋｂのＤＮＡ断
片を回収しＤＮＡ精製用ミニカラム（ナツクス５２ブレ
パックＴＭコンバーティブル、ベセスダ・リサーチ・ラ
ボラトリーズ社）にて精製した。
８．０）を加え混合し、１０単位のバクテリアアルカリ
フォスファダーゼ（宝酒造社製）を添加して６５°Ｃで
３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った後、ア
ガロースゲル電気泳動法により３． ｌｋｂのＤＮＡ断
片を回収しＤＮＡ精製用ミニカラム（ナツクス５２ブレ
パックＴＭコンバーティブル、ベセスダ・リサーチ・ラ
ボラトリーズ社）にて精製した。
一方、第２図に示した部分変異ｈｌＬ３ポリペプチド（
ただしＸはＳＥＲ）のＸからＣ末端までをコードするＤ
ＮＡ配列（第１９図に示す）を化学合成し、これを制限
酵素ＨｉｎｄＩ［［とＥｃｏＲＩとで切断したプラスミ
ドｐｕｃｔｓにクローニングしてプラスミドｐｃｃｓｓ
を作成した（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ Ｌｉｍｌｔｅｄ社に委託）。このプラスミドＤＮ
Ａｌ０μｇを上記ｐＰＵＩＬ３と同様の条件にて制限酵
素ＢａｍＨＩ ５０単位とＢａ１Ｉ ５０単位にて切断
した。反応後、エタノール沈澱したＤＮＡをアガロース
ゲル電気泳動にて分画して１５０ｂｐのＤＮＡ断片０．
５μｇを精製・回収した。
ただしＸはＳＥＲ）のＸからＣ末端までをコードするＤ
ＮＡ配列（第１９図に示す）を化学合成し、これを制限
酵素ＨｉｎｄＩ［［とＥｃｏＲＩとで切断したプラスミ
ドｐｕｃｔｓにクローニングしてプラスミドｐｃｃｓｓ
を作成した（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ Ｌｉｍｌｔｅｄ社に委託）。このプラスミドＤＮ
Ａｌ０μｇを上記ｐＰＵＩＬ３と同様の条件にて制限酵
素ＢａｍＨＩ ５０単位とＢａ１Ｉ ５０単位にて切断
した。反応後、エタノール沈澱したＤＮＡをアガロース
ゲル電気泳動にて分画して１５０ｂｐのＤＮＡ断片０．
５μｇを精製・回収した。
こうして得られたｐｐＬＩ ＩＬ３由来のＢａｌ Ｉ−
Ｂａｍ旧断片（３，１ｋｂ）０．５μｇとｐＣＧＳ８由
来のＢａｌｌ−Ｂａｍ旧断片（１５０ｂｐ） ０．０５
μｇの結合反応を行った。得られた組換え体プラスミド
の混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株（（ベセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ社製）。
Ｂａｍ旧断片（３，１ｋｂ）０．５μｇとｐＣＧＳ８由
来のＢａｌｌ−Ｂａｍ旧断片（１５０ｂｐ） ０．０５
μｇの結合反応を行った。得られた組換え体プラスミド
の混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株（（ベセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ社製）。
（Ｄ、 Ｈａｎａｈａｎ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ
、 １６６、５５７ （１９８３））をＣｏｈｅｎらの
方法により形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを
得た。いくつかのコロニーの培養菌体から版部らの方法
（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １５２゜２３２ （
１９８６））にしたがってプラスミドを回収し、合成り
ＮＡをプライマーとして二本鎖ＤＮＡを鋳型とするダイ
デオキシ法（サンガー法）にて塩基配列を確認した。こ
のプラスミドをｐＰＵＩＬ３１と呼ぶ。
、 １６６、５５７ （１９８３））をＣｏｈｅｎらの
方法により形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを
得た。いくつかのコロニーの培養菌体から版部らの方法
（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １５２゜２３２ （
１９８６））にしたがってプラスミドを回収し、合成り
ＮＡをプライマーとして二本鎖ＤＮＡを鋳型とするダイ
デオキシ法（サンガー法）にて塩基配列を確認した。こ
のプラスミドをｐＰＵＩＬ３１と呼ぶ。
次に、このｐＰＵＩＬ３１ ＤＮＡ２μｇをＢ緩衝液５
０μｌに溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ １０単位と５ｐ
ｅｌ ２０単位を加えて、３７°Ｃ−晩切断反応を行っ
た。エタノール沈澱後、ＤＮＡをアガロースゲル電気泳
動して約３９０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し精製した。
０μｌに溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ １０単位と５ｐ
ｅｌ ２０単位を加えて、３７°Ｃ−晩切断反応を行っ
た。エタノール沈澱後、ＤＮＡをアガロースゲル電気泳
動して約３９０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し精製した。
一方これとは別に、プラスミドｐＵｃ１９ （宝酒造
社製）をＢ緩衝液に溶解し、制限酵素ＨｉｎｄＩ［［と
ＢａｍＨＩで切断し、エタノール沈澱後、ＤＮＡをアガ
ロースゲル電気泳動にかけて約２．７ｋｂのＤＮＡ断片
を回収した。次に第１８図に示す大腸菌での発現に必要
なＳｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列とｈＩＬ３ポリペ
プチドのＮ末の一部を含むＤＮＡ配列を合成してアニリ
ングし、このＤＮＡとｐＵｃ１９のＢａｍＨＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片の結合反応を行った。得られた組換え体プ
ラスミドの混合物を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転
換し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。このコロニ
ーの培養菌体よりプラスミドを回収し、得られたプラス
ミドについてダイデオキシ法にてＤＮＡ塩基配列を決定
し、第１８図に示す配列を有することを確認してｐｓＤ
Ｎｌと命名した。
社製）をＢ緩衝液に溶解し、制限酵素ＨｉｎｄＩ［［と
ＢａｍＨＩで切断し、エタノール沈澱後、ＤＮＡをアガ
ロースゲル電気泳動にかけて約２．７ｋｂのＤＮＡ断片
を回収した。次に第１８図に示す大腸菌での発現に必要
なＳｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列とｈＩＬ３ポリペ
プチドのＮ末の一部を含むＤＮＡ配列を合成してアニリ
ングし、このＤＮＡとｐＵｃ１９のＢａｍＨＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片の結合反応を行った。得られた組換え体プ
ラスミドの混合物を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転
換し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。このコロニ
ーの培養菌体よりプラスミドを回収し、得られたプラス
ミドについてダイデオキシ法にてＤＮＡ塩基配列を決定
し、第１８図に示す配列を有することを確認してｐｓＤ
Ｎｌと命名した。
このｐｓＤＮＩ ＤＮＡ ５μｇをＢ緩衝液５０μＩに
溶かし、同様にＢａｍＨＩと５ｐｅｌで切断反応を行っ
た。
溶かし、同様にＢａｍＨＩと５ｐｅｌで切断反応を行っ
た。
その反応液に５０μｌのＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ
８，０）を加え混合し、１０単位のバクテリアアルカリ
フォスファターゼ（宝酒造社製）を添加して６５°Ｃで
３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った後、ア
ガロースゲル電気泳動法により２．７ｋｂのＤＮＡ断片
を回収した。
８，０）を加え混合し、１０単位のバクテリアアルカリ
フォスファターゼ（宝酒造社製）を添加して６５°Ｃで
３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った後、ア
ガロースゲル電気泳動法により２．７ｋｂのＤＮＡ断片
を回収した。
こうして得られたｐＰＵＩＬ３１由来の５ｐｅｉ Ｂａ
ｍＨＩ断片（３９０ｂｐ）Ｏ，ｌμｇとｐｓＤＮ１由来
の５ｐｅｌ−ＢａｍＨＩ断片（２，７ｋｂ）０．５μｇ
の結合反応を行った。得られた組換え体プラスミドの混
合物を用いて大腸菌ＤＨ５株を形質転換し、アンピシリ
ン耐性のコロニを得た。いくつかのコロニーの培養菌体
からプラスミドを単離し、得られたプラスミドの塩基配
列の一部を決定して目的とするプラスミドｐｓＤＩＬ３
１を得た。
ｍＨＩ断片（３９０ｂｐ）Ｏ，ｌμｇとｐｓＤＮ１由来
の５ｐｅｌ−ＢａｍＨＩ断片（２，７ｋｂ）０．５μｇ
の結合反応を行った。得られた組換え体プラスミドの混
合物を用いて大腸菌ＤＨ５株を形質転換し、アンピシリ
ン耐性のコロニを得た。いくつかのコロニーの培養菌体
からプラスミドを単離し、得られたプラスミドの塩基配
列の一部を決定して目的とするプラスミドｐｓＤＩＬ３
１を得た。
そうして得られたｐｓＤＩＬ３１ ＤＮＡ５ μｇを３
３ｍＭＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７，９） 、６６ｍＭ
酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウムおよび０．５
ｍＭ ＤＴＴを含む溶液（以下ＴＡ緩衝液という）２０
μｌに溶かし、制限酵素Ａｆｔ Ｋ １５単位を加え、
３７°Ｃで３．５時間反応した。反応液をエタノール沈
澱して回収したＤＮＡをＢ緩衝液３０μｌに溶かし、制
限酵素ＢａｍＨＩ ２０単位を加え３７°Ｃで５時間反
応を行った。再度エタノール沈澱して回収したＤＮＡか
らアガロースゲル電気泳動法により約４２０ｂｐのＤＮ
Ａ断片を精製した。
３ｍＭＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７，９） 、６６ｍＭ
酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウムおよび０．５
ｍＭ ＤＴＴを含む溶液（以下ＴＡ緩衝液という）２０
μｌに溶かし、制限酵素Ａｆｔ Ｋ １５単位を加え、
３７°Ｃで３．５時間反応した。反応液をエタノール沈
澱して回収したＤＮＡをＢ緩衝液３０μｌに溶かし、制
限酵素ＢａｍＨＩ ２０単位を加え３７°Ｃで５時間反
応を行った。再度エタノール沈澱して回収したＤＮＡか
らアガロースゲル電気泳動法により約４２０ｂｐのＤＮ
Ａ断片を精製した。
一方、カルモジュリン発現プラスミドｐＴＣＡＬ７（特
開平２−９２２８６号参照）１０℃ｇを前記ｐｓＤＩＬ
３１の場合の３倍スケールの反応条件にて制限酵素Ａｆ
ｌ ＩＩとＢａｍＨＩにて切断反応を行った。反応後、
ｌＯＯμｌの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０
）に溶かし、１０単位のバクテリアアルカリフォスファ
ターゼを添加して６５°Ｃで３０分間反応した。エタノ
ール沈澱処理を行った後、アガロースゲル電気泳動法に
より大きい方（３，３ｋｂ）のＤＮＡ断片を回収した。
開平２−９２２８６号参照）１０℃ｇを前記ｐｓＤＩＬ
３１の場合の３倍スケールの反応条件にて制限酵素Ａｆ
ｌ ＩＩとＢａｍＨＩにて切断反応を行った。反応後、
ｌＯＯμｌの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０
）に溶かし、１０単位のバクテリアアルカリフォスファ
ターゼを添加して６５°Ｃで３０分間反応した。エタノ
ール沈澱処理を行った後、アガロースゲル電気泳動法に
より大きい方（３，３ｋｂ）のＤＮＡ断片を回収した。
こうして得られたｐｓＤｒｔ、３を由来のＡｆ ｌ Ｉ
Ｆ −ＢａｍＨＩ断片（４２０ｂｐ）０．１ｕｇとカル
モジュリン発現プラスミドｐＴＣＡＬ７由来のＡｆｌ
ＩＩ−Ｂａｍ旧断片（３，３ｋｂ）０．５μｇの結合反
応を行った。得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌ＤＨ５株を形質転換し、アンピシリン耐性の
コロニーを得た。このコロニーの培養菌体よりプラスミ
ドＤＮＡ５μｇを回収し、ＤＮＡ塩基配列を決定して第
３図に示す配列を含むことを確認した。このプラスミド
をｐＴＫＩＬ３１ と呼ぶ。
Ｆ −ＢａｍＨＩ断片（４２０ｂｐ）０．１ｕｇとカル
モジュリン発現プラスミドｐＴＣＡＬ７由来のＡｆｌ
ＩＩ−Ｂａｍ旧断片（３，３ｋｂ）０．５μｇの結合反
応を行った。得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌ＤＨ５株を形質転換し、アンピシリン耐性の
コロニーを得た。このコロニーの培養菌体よりプラスミ
ドＤＮＡ５μｇを回収し、ＤＮＡ塩基配列を決定して第
３図に示す配列を含むことを確認した。このプラスミド
をｐＴＫＩＬ３１ と呼ぶ。
ｐＴＫＩＬ３１上のＤＮＡによりコードされるＩＬ３誘
導体（本誘導体をｈｌＬ３１と呼ぶ）は、Ｎ末端から９
９番目のＨｉｓがＡｒｇ、１１３１３番目ｈｒがＬＹＳ
、 １２２２２番目ｌａがＧｌｕ、１２７２７番目ｈｒ
がＭｅｔ、 １３２３２番目ｌａがＧｌｕにそして１３
４３４番目ｈｅがＳｅｔに置換している。
導体（本誘導体をｈｌＬ３１と呼ぶ）は、Ｎ末端から９
９番目のＨｉｓがＡｒｇ、１１３１３番目ｈｒがＬＹＳ
、 １２２２２番目ｌａがＧｌｕ、１２７２７番目ｈｒ
がＭｅｔ、 １３２３２番目ｌａがＧｌｕにそして１３
４３４番目ｈｅがＳｅｔに置換している。
実施例２
ｈｌＬ３誘導体誘導体３プ
（第１θ図参照、なお以下の実施例２ないし６において
は、第１５図をしかるべ（読み替えて参照てきる）： 実施例１の工程（１）により得られたｐＰＵＩＬ３ＤＮ
Ａ ５μｇに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．
５）、１０ｍＭ ＭｇＣ１．、１ｍＭＤＴＴおよび１０
０ｍＭ ＮａＣ１を含む溶液（以下Ｈ緩衝液と略す）中
で制限酵素ＥｃｏＲＩ ５０単位を加え、３７°Ｃで４
時間反応を行った。エタノール沈澱により回収したＤＮ
ＡをＬ緩衝液５０μｍに溶かし、制限酵素Ｂａ１ｌ（宝
酒造社製）５０単位を加え３７°Ｃで５時間反応を行っ
た。その反応液に５０μｌのＩＭ Ｔｒｉｓ−Ｉ（Ｃ
Ｉ （ｐ）（８． ０）を加え混合し、１０単位のバク
テリアアルカリフォスファターゼを添加して６５℃で３
０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った後、アガ
ロースゲル電気泳動法により約３．１ｋｂのＤＮＡ断片
を回収して精製した。
は、第１５図をしかるべ（読み替えて参照てきる）： 実施例１の工程（１）により得られたｐＰＵＩＬ３ＤＮ
Ａ ５μｇに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．
５）、１０ｍＭ ＭｇＣ１．、１ｍＭＤＴＴおよび１０
０ｍＭ ＮａＣ１を含む溶液（以下Ｈ緩衝液と略す）中
で制限酵素ＥｃｏＲＩ ５０単位を加え、３７°Ｃで４
時間反応を行った。エタノール沈澱により回収したＤＮ
ＡをＬ緩衝液５０μｍに溶かし、制限酵素Ｂａ１ｌ（宝
酒造社製）５０単位を加え３７°Ｃで５時間反応を行っ
た。その反応液に５０μｌのＩＭ Ｔｒｉｓ−Ｉ（Ｃ
Ｉ （ｐ）（８． ０）を加え混合し、１０単位のバク
テリアアルカリフォスファターゼを添加して６５℃で３
０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った後、アガ
ロースゲル電気泳動法により約３．１ｋｂのＤＮＡ断片
を回収して精製した。
別に、実施例１の工程（２）において使用した部分変異
ｈｌＬ３ｃＤ Ｎ Ａを有するプラスミドｐＣＧ３８
１０℃ｇを上記ｐＰＵＩＬ３と同様の条件にて制限酵素
ＥｃｏＲ Ｉ、そしてＢａ１ｌにて切断した。反応後、
エタノール沈澱したＤＮＡをポリアクリルアミド電気泳
動にて分画して５０ｂｐのＤＮＡ断片を回収・精製した
。
ｈｌＬ３ｃＤ Ｎ Ａを有するプラスミドｐＣＧ３８
１０℃ｇを上記ｐＰＵＩＬ３と同様の条件にて制限酵素
ＥｃｏＲ Ｉ、そしてＢａ１ｌにて切断した。反応後、
エタノール沈澱したＤＮＡをポリアクリルアミド電気泳
動にて分画して５０ｂｐのＤＮＡ断片を回収・精製した
。
こうして得られたｐｐｕｒｔ，ｓ由来のＢａ１Ｉ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片（３． １ｋｂ） ０． ５μｇとｐＣＧＳ
８由米のＢａｌ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉ断片（５０ｂｐ）
０．０５℃ｇの結合反応を行った。得られた組換え体プ
ラスミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株をＣｏｈｅｎ
らの方法により形質転換し、アンピシリン耐性のコロニ
ーを得た。いくつかのコロニーの培養菌体からプラスミ
ドを回収し、合成りＮＡをブライマーとして二本鎖ＤＮ
Ａを鋳型とするダイデオキシ法（サンガー法）にて塩基
配列を確認した。
ｏＲＩ断片（３． １ｋｂ） ０． ５μｇとｐＣＧＳ
８由米のＢａｌ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉ断片（５０ｂｐ）
０．０５℃ｇの結合反応を行った。得られた組換え体プ
ラスミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株をＣｏｈｅｎ
らの方法により形質転換し、アンピシリン耐性のコロニ
ーを得た。いくつかのコロニーの培養菌体からプラスミ
ドを回収し、合成りＮＡをブライマーとして二本鎖ＤＮ
Ａを鋳型とするダイデオキシ法（サンガー法）にて塩基
配列を確認した。
このプラスミドをｐＰＵＩＬ３２と呼ぶ。
次に、このｐＰＵＩＬ３２Ｄ Ｎ Ａ ２μｇをＢ緩衝
液５０μｌに溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ １０単位と
５ｐｅｌ ２０単位を加えて、３７°Ｃ−晩切断反応を
行った。エタノール沈澱後、ＤＮＡをアガロースゲル電
気泳動して約３９ＱｂｐのＤＮＡ断片を回収し精製した
。別に実施例１の（２）の工程により得られたプラスミ
ドｐｓＤＮＩ ＤＮＡ ５μｇをＢ緩衝液５０μｌに溶
かし、同様にＢａｍＨ ［と５ｐｅｌで切断反応を行っ
た。その反応液に５０μｌのＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（
１）８８．０）を加え混合し、１０単位のバクテリアア
ルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を添加して６５
°Ｃで３０分間反応した。
液５０μｌに溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ １０単位と
５ｐｅｌ ２０単位を加えて、３７°Ｃ−晩切断反応を
行った。エタノール沈澱後、ＤＮＡをアガロースゲル電
気泳動して約３９ＱｂｐのＤＮＡ断片を回収し精製した
。別に実施例１の（２）の工程により得られたプラスミ
ドｐｓＤＮＩ ＤＮＡ ５μｇをＢ緩衝液５０μｌに溶
かし、同様にＢａｍＨ ［と５ｐｅｌで切断反応を行っ
た。その反応液に５０μｌのＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（
１）８８．０）を加え混合し、１０単位のバクテリアア
ルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を添加して６５
°Ｃで３０分間反応した。
エタノール沈澱処理を行った後、アガロースゲル電気泳
動法により２． ７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
動法により２． ７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
こうして得られたｐＰＵＩＬ３２由来のＳｐｅｌ−Ｂａ
ｍＨＩ断片（３９０ｂｌ））０． １ｕ ｇとｐｓＤＮ
１由来のＳｐｅＩ−Ｂａｍ旧断片（２， ７ｋｂ）０．
５μｇの結合反応を行った。得られた組換え体プラス
ミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株を形質転換し、ア
ンピシリン耐性のコロニーを得た。いくつかのコロニー
の培養菌体中のプラスミドについて塩基配列の一部を決
定して、目的とするプラスミドｐｓＤＩＬ３２を得た。
ｍＨＩ断片（３９０ｂｌ））０． １ｕ ｇとｐｓＤＮ
１由来のＳｐｅＩ−Ｂａｍ旧断片（２， ７ｋｂ）０．
５μｇの結合反応を行った。得られた組換え体プラス
ミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株を形質転換し、ア
ンピシリン耐性のコロニーを得た。いくつかのコロニー
の培養菌体中のプラスミドについて塩基配列の一部を決
定して、目的とするプラスミドｐｓＤＩＬ３２を得た。
そうして得られたｐＳＤＩＬ３２ ＤＮＡ ５μｇをＴ
Ａ緩衝液２０μｌに溶かし、制限酵素ＡｆｌＩ［１５単
位を加え、３７°Ｃで３．５時間反応した。反応液をエ
タノール沈澱して回収したＤＮＡをＢ緩衝液３０μｌに
溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ ２０単位を加え３７°Ｃ
て５時間反応を行った。再度エタノール沈澱して回収し
たＤＮＡから、アガロースゲル電気泳動法により約４２
０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
Ａ緩衝液２０μｌに溶かし、制限酵素ＡｆｌＩ［１５単
位を加え、３７°Ｃで３．５時間反応した。反応液をエ
タノール沈澱して回収したＤＮＡをＢ緩衝液３０μｌに
溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ ２０単位を加え３７°Ｃ
て５時間反応を行った。再度エタノール沈澱して回収し
たＤＮＡから、アガロースゲル電気泳動法により約４２
０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
一方、カルモジュリン発現プラスミドｐＴＣＡＬ７ＤＮ
Ａ １０μｇを前記ｐＳＤ ＩＬ３２の場合の３倍スケ
ールの反応条件にて制限酵素Ａｆｌ Ｉ［とＢａｍＨＩ
にて切断反応を行った。反応後、１００μｌの０，５Ｍ
ＴｒｉｓＨＣＩ （ＰＨ８，０）に溶かし、１０単位
のバクテリアアルカリフォスファターゼを添加して６５
°Ｃで３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った
後、アガロースゲル電気泳動法により大きい方（３，３
ｋｂ）のＤＮＡ断片を回収した。
Ａ １０μｇを前記ｐＳＤ ＩＬ３２の場合の３倍スケ
ールの反応条件にて制限酵素Ａｆｌ Ｉ［とＢａｍＨＩ
にて切断反応を行った。反応後、１００μｌの０，５Ｍ
ＴｒｉｓＨＣＩ （ＰＨ８，０）に溶かし、１０単位
のバクテリアアルカリフォスファターゼを添加して６５
°Ｃで３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った
後、アガロースゲル電気泳動法により大きい方（３，３
ｋｂ）のＤＮＡ断片を回収した。
こうして得られたｐｓＤＩＬ３２由来のＡｆｌ ＩＩ−
ＢａｍＨＩ断片（４２０ｂｌ）） ０．１μｇとカルモ
ジュリン発現プラスミドｐＴＣＡＬＴ由来のＡｆ ｌ
ＩＦ −Ｂａｍ旧断片（３，３ｋｂ）０．５ μｇの結
合反応を行った。得られた組換え体プラスミドの混合物
を用いて大腸菌ＤＨ５株を形質転換し、アンピシリン耐
性のコロニーを得た。このコロニーの培養菌体よりプラ
スミドＤＮＡを回収し、ＤＮＡ塩基配列を決定して第４
図に示す配列を含むことを確認した。このプラスミドを
ｐＴＫＩＬ３２と呼ぶ。
ＢａｍＨＩ断片（４２０ｂｌ）） ０．１μｇとカルモ
ジュリン発現プラスミドｐＴＣＡＬＴ由来のＡｆ ｌ
ＩＦ −Ｂａｍ旧断片（３，３ｋｂ）０．５ μｇの結
合反応を行った。得られた組換え体プラスミドの混合物
を用いて大腸菌ＤＨ５株を形質転換し、アンピシリン耐
性のコロニーを得た。このコロニーの培養菌体よりプラ
スミドＤＮＡを回収し、ＤＮＡ塩基配列を決定して第４
図に示す配列を含むことを確認した。このプラスミドを
ｐＴＫＩＬ３２と呼ぶ。
ｐＴＫＩＬ３２上のＤＮＡによりコードされるＩＬ３誘
導体（本誘導体をｈｌＬ３２と呼ぶ）は、Ｎ末端から９
９番目のＨｉｓがＡｒｇに置換している。
導体（本誘導体をｈｌＬ３２と呼ぶ）は、Ｎ末端から９
９番目のＨｉｓがＡｒｇに置換している。
実施例３
ｈＩＬ３誘導体誘導体３プ
（第１１図参照）：
実施例１の工程（１）により得られた１）ＰＵＩＬ３
ＤＮＡ５μｇにＨ緩衝液中で制限酵素ＥｃｏＲＩ ５０
単位を加え、３７°Ｃで４時間反応を行った。エタノー
ル沈澱により回収したＤＮＡをＢ緩衝液５０μｌに溶か
し、制限酵素ＢａｍＨＩ ５０単位を加え３７゛Ｃで５
時間反応を行った。その反応液に５０μｌのＩＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８． ０）を加え混合し、ＩＯ単位
のバクテリアアルカリフォスファターゼを添加して６５
℃で３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った後
、アガロースゲル電気泳動法により約３， ｌｋｂのＤ
ＮＡ断片を回収して精製した。
ＤＮＡ５μｇにＨ緩衝液中で制限酵素ＥｃｏＲＩ ５０
単位を加え、３７°Ｃで４時間反応を行った。エタノー
ル沈澱により回収したＤＮＡをＢ緩衝液５０μｌに溶か
し、制限酵素ＢａｍＨＩ ５０単位を加え３７゛Ｃで５
時間反応を行った。その反応液に５０μｌのＩＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８． ０）を加え混合し、ＩＯ単位
のバクテリアアルカリフォスファターゼを添加して６５
℃で３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った後
、アガロースゲル電気泳動法により約３， ｌｋｂのＤ
ＮＡ断片を回収して精製した。
別に、実施例１の工程（２）において使用した部分変異
ｈｌＬ３ｃＤＮＡを有するプラスミドｐｃｃｓｓ １０
μｇを上記ｐＰＵＩＬ３と同様の条件にて制限酵素Ｅｃ
ｏＲ Ｉ、そしてＢａｍＨにて切断した。反応後、エタ
ノール沈澱したＤＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳
動にて分画して９０ｂｐのＤＮＡ断片を回収・精製した
。
ｈｌＬ３ｃＤＮＡを有するプラスミドｐｃｃｓｓ １０
μｇを上記ｐＰＵＩＬ３と同様の条件にて制限酵素Ｅｃ
ｏＲ Ｉ、そしてＢａｍＨにて切断した。反応後、エタ
ノール沈澱したＤＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳
動にて分画して９０ｂｐのＤＮＡ断片を回収・精製した
。
こうして得られたｐＰＵ ＩＬ３由来のＥｃｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨ Ｉ断片（３， １ｋｂ）０． ５，ｃｚ ｇと
ｐＣＧＳ８由来のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ Ｉ断片（９０
ｂｌ））０． ０５μｇの結合反応を行った。得られた
組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株を
Ｃｏｈｅｎらの方法により形質転換し、アンピシリン耐
性のコロニーを得た。いくつかのコロニの培養菌体から
プラスミドを回収し、合成りＮＡをブライマーとして二
本鎖ＤＮＡを鋳型とするダイデオキシ法（サンガー法）
にて塩基配列を確認した。このプラスミドをｐＰＵＩＬ
３３と呼ぶ。
ａｍＨ Ｉ断片（３， １ｋｂ）０． ５，ｃｚ ｇと
ｐＣＧＳ８由来のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ Ｉ断片（９０
ｂｌ））０． ０５μｇの結合反応を行った。得られた
組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株を
Ｃｏｈｅｎらの方法により形質転換し、アンピシリン耐
性のコロニーを得た。いくつかのコロニの培養菌体から
プラスミドを回収し、合成りＮＡをブライマーとして二
本鎖ＤＮＡを鋳型とするダイデオキシ法（サンガー法）
にて塩基配列を確認した。このプラスミドをｐＰＵＩＬ
３３と呼ぶ。
次に、この１）ＰＵＩＬ３３ Ｄ Ｎ Ａ ２μｇをＢ
緩衝液５０μｌに溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ １０単
位と５ｐｅ１ ２０単位を加えて、３７°Ｃ−晩切断反
応を行った。エタノール沈澱後、ＤＮＡをアガロースゲ
ル電気泳動して約３９０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し精製
した。別に実施例１の（２）の工程により得られたプラ
スミドｐｓＤＮｌ ５μｇをＢ緩衝液５０μｌに溶かし
、同様にＢａｍＨ ＩとＳｐｅ Ｉで切断反応を行った
。その反応液に５０μｍのＩＭ Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ（
ｐＨ８．０）を加え混合し、１０単位のバクテリアアル
カリフォスファターゼ（宝酒造社製）を添加して６５゛
Ｃで３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った後
、アガロースゲル電気泳動法により２． ７ｋｂのＤＮ
Ａ断片を回収した。
緩衝液５０μｌに溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ １０単
位と５ｐｅ１ ２０単位を加えて、３７°Ｃ−晩切断反
応を行った。エタノール沈澱後、ＤＮＡをアガロースゲ
ル電気泳動して約３９０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し精製
した。別に実施例１の（２）の工程により得られたプラ
スミドｐｓＤＮｌ ５μｇをＢ緩衝液５０μｌに溶かし
、同様にＢａｍＨ ＩとＳｐｅ Ｉで切断反応を行った
。その反応液に５０μｍのＩＭ Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ（
ｐＨ８．０）を加え混合し、１０単位のバクテリアアル
カリフォスファターゼ（宝酒造社製）を添加して６５゛
Ｃで３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った後
、アガロースゲル電気泳動法により２． ７ｋｂのＤＮ
Ａ断片を回収した。
こうして得られたｐＰＵＩＬ３３由来のＳｐｅ ｌＢａ
ｍ旧断片（３９０ｂｐ） ０．１μｇとｐｓＤＮ１由来
のＳｐｅ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉ断片（２． ７ｋｂ）０．
５μｇの結合反応を行った。得られた組換え体プラス
ミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株を形質転換し、ア
ンピシリン耐性のコロニーを得た。いくつかのコロニー
の培養菌体中のプラスミドについて塩基配列の一部を決
定して、目的とするプラスミドｐＳＤ ｒＬ３３を得た
。
ｍ旧断片（３９０ｂｐ） ０．１μｇとｐｓＤＮ１由来
のＳｐｅ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉ断片（２． ７ｋｂ）０．
５μｇの結合反応を行った。得られた組換え体プラス
ミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株を形質転換し、ア
ンピシリン耐性のコロニーを得た。いくつかのコロニー
の培養菌体中のプラスミドについて塩基配列の一部を決
定して、目的とするプラスミドｐＳＤ ｒＬ３３を得た
。
そうして得られたｐｓＤＩＬ３３ ＤＮＡ ５μｇをＴ
Ａ緩衝液２０μｌに溶かし、制限酵素Ａｆｌ Ｋ １５
単位を加え、３７°Ｃで３．５時間反応した。反応液を
エタノール沈澱して回収したＤＮＡをＢ緩衝液３０μｌ
に溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ ２０単位を加え３７°
Ｃで５時間反応を行った。再度エタノール沈澱して回収
したＤＮＡから、アガロースゲル電気泳動法により約４
２０Ｍ１のＤＮＡ断片を精製した。
Ａ緩衝液２０μｌに溶かし、制限酵素Ａｆｌ Ｋ １５
単位を加え、３７°Ｃで３．５時間反応した。反応液を
エタノール沈澱して回収したＤＮＡをＢ緩衝液３０μｌ
に溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ ２０単位を加え３７°
Ｃで５時間反応を行った。再度エタノール沈澱して回収
したＤＮＡから、アガロースゲル電気泳動法により約４
２０Ｍ１のＤＮＡ断片を精製した。
一方、カルモジュリン発現プラスミドｐＴＣＡＬ７ＤＮ
Ａ １０℃ｇを前記ｐｓＤＩＬ３３の場合の３倍スケー
ルの反応条件にて制限酵素ＡｆｌＩＩとＢａｍＨＩにて
切断反応を行った。反応後、１００μＩの０．５Ｍ Ｔ
ｒｉｓＨＣＩ （１）８８．０）に溶かし、ｌＯ単位の
バクテリアアルカリフォスファターゼを添加して６５°
Ｃで３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った後
、アガロースゲル電気泳動法により大きい方（３，３ｋ
ｂ ’）のＤＮＡ断片を回収した。次に、上記で得られ
たｐＳＤＩＬ３３由来のＡｆＩＩ［−ＢａｍＨＩ断片（
４２０ｂｌ））０．１ ｔｔ ｇとカルモジュリン発現
プラスミドｐＴＣＡＬＴ由来のＡｆｌ■−ＢａｍＨｒ断
片（３，３ｋｂ） ０．５μｇの結合反応を行った。得
られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ
５株を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得た
。このコロニーの培養菌体よりプラスミドＤＮＡを回収
し、ＤＮＡ塩基配列を決定して第５図に示す配列を含む
ことを確認した。
Ａ １０℃ｇを前記ｐｓＤＩＬ３３の場合の３倍スケー
ルの反応条件にて制限酵素ＡｆｌＩＩとＢａｍＨＩにて
切断反応を行った。反応後、１００μＩの０．５Ｍ Ｔ
ｒｉｓＨＣＩ （１）８８．０）に溶かし、ｌＯ単位の
バクテリアアルカリフォスファターゼを添加して６５°
Ｃで３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った後
、アガロースゲル電気泳動法により大きい方（３，３ｋ
ｂ ’）のＤＮＡ断片を回収した。次に、上記で得られ
たｐＳＤＩＬ３３由来のＡｆＩＩ［−ＢａｍＨＩ断片（
４２０ｂｌ））０．１ ｔｔ ｇとカルモジュリン発現
プラスミドｐＴＣＡＬＴ由来のＡｆｌ■−ＢａｍＨｒ断
片（３，３ｋｂ） ０．５μｇの結合反応を行った。得
られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ
５株を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得た
。このコロニーの培養菌体よりプラスミドＤＮＡを回収
し、ＤＮＡ塩基配列を決定して第５図に示す配列を含む
ことを確認した。
このプラスミドをｐＴＫＩＬ３３と呼ぶ。
ｐＴＫＩＬ３３上のＤＮＡによりコードされるＩＬ３誘
導体（本誘導体をｈｌＬ３３と呼ぶ）は、Ｎ末端から１
１３番目のＴｈｒがＬｙｓ、１２２番目のＡｌａがＧｌ
ｕ、 １２７番目のＴｈｒがＭｅｔ、 １３２番目の
ＡｌａがＧｌｕにそして１３４番目のＰｈｅがＳｅｔに
置換している。
導体（本誘導体をｈｌＬ３３と呼ぶ）は、Ｎ末端から１
１３番目のＴｈｒがＬｙｓ、１２２番目のＡｌａがＧｌ
ｕ、 １２７番目のＴｈｒがＭｅｔ、 １３２番目の
ＡｌａがＧｌｕにそして１３４番目のＰｈｅがＳｅｔに
置換している。
実施例４
ｈＩＬ３誘導体誘導体３プ
（第１２図参照）：
実施例１の工程（１）により得られたＩ）ＰＵＩＬ３Ｄ
Ｎ Ａ５μｇにＢ緩衝液中で制限酵素５ｐｅＩ ５０
単位を加え、３７℃で４時間反応を行った。エタノール
沈澱により回収したＤＮＡをＢ緩衝液５０μｌに溶かし
、制限酵素Ｂａｌ Ｉ ５０単位を加え３７°Ｃで５時
間反応を行った。その反応液に５０μｌのＩＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．０）を加え混合し、ｌＯ単位のバ
クテリアアルカリフォスファターゼを添加して６５℃で
３０分間反応した。
Ｎ Ａ５μｇにＢ緩衝液中で制限酵素５ｐｅＩ ５０
単位を加え、３７℃で４時間反応を行った。エタノール
沈澱により回収したＤＮＡをＢ緩衝液５０μｌに溶かし
、制限酵素Ｂａｌ Ｉ ５０単位を加え３７°Ｃで５時
間反応を行った。その反応液に５０μｌのＩＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．０）を加え混合し、ｌＯ単位のバ
クテリアアルカリフォスファターゼを添加して６５℃で
３０分間反応した。
エタノール沈澱処理を行った後、アガロースゲル電気泳
動法により約３． ＯｋｂのＤＮＡ断片を回収して精製
した。
動法により約３． ＯｋｂのＤＮＡ断片を回収して精製
した。
別に、実施例１の工程（２）において使用した部分変異
ｈｌＬ３ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＣＧ３８ １０
℃ｇを上記ｐＰＵＩＬ３と同様の条件にて制限酵素５ｐ
ｅｌ、そしてＢａ１ｌにて切断した。反応後、エタノー
ル沈澱したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にて分画し
て２４０ｂｐのＤＮＡ断片を回収・精製した。
ｈｌＬ３ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＣＧ３８ １０
℃ｇを上記ｐＰＵＩＬ３と同様の条件にて制限酵素５ｐ
ｅｌ、そしてＢａ１ｌにて切断した。反応後、エタノー
ル沈澱したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にて分画し
て２４０ｂｐのＤＮＡ断片を回収・精製した。
こうして得られたｐＰＵＩＬ３由来の５ｐｅｌ−Ｂａｌ
Ｉ断片（３， ０ｋｂ）０．５ ｕ ｇとｐＣＧＳ８
由来の５ｐｅＩ−Ｂａｌ Ｉ断片（２４０ｂｌ））０．
０５℃ｇの結合反応を行った。得られた組換え体プラ
スミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株をＣｏｈｅｎら
の方法により形質転換し、アンピシリン耐性のコロニー
を得た。いくつかのコロニの培養菌体からプラスミドを
回収し、合成りＮＡをブライマーとして二本鎖ＤＮＡを
鋳型とするダイデオキシ法（サンガー法）にて塩基配列
を確認した。このプラスミドをｐＰＵＩＬ３４と呼ぶ。
Ｉ断片（３， ０ｋｂ）０．５ ｕ ｇとｐＣＧＳ８
由来の５ｐｅＩ−Ｂａｌ Ｉ断片（２４０ｂｌ））０．
０５℃ｇの結合反応を行った。得られた組換え体プラ
スミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株をＣｏｈｅｎら
の方法により形質転換し、アンピシリン耐性のコロニー
を得た。いくつかのコロニの培養菌体からプラスミドを
回収し、合成りＮＡをブライマーとして二本鎖ＤＮＡを
鋳型とするダイデオキシ法（サンガー法）にて塩基配列
を確認した。このプラスミドをｐＰＵＩＬ３４と呼ぶ。
次に、このｐＰＵＩＬ３４ ＤＮＡ ２μｇをＢ緩衝液
５０μｌに溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ １０単位と５
ｐｅＩ ２０単位を加えて、３７°Ｃ−晩切断反応を行
った。エタノール沈澱後、ＤＮＡをアガロースゲル電気
泳動して約３９０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し精製した。
５０μｌに溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ １０単位と５
ｐｅＩ ２０単位を加えて、３７°Ｃ−晩切断反応を行
った。エタノール沈澱後、ＤＮＡをアガロースゲル電気
泳動して約３９０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し精製した。
別に実施例１の（２）の工程により得られたプラスミド
ｐｓＤＮ１ ５μｇをＢ緩衝液５０μｌに溶かし、同様
にＢａｍＨ Ｉと５ｐｅＴで切断反応を行った。その反
応液に５０μｌのＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．０
）を加え混合し、１０単位のバクテリアアルカリフォス
ファターゼ（宝酒造社製）を添加して６５°Ｃで３０分
間反応した。エタノール沈澱処理を行った後、アガロー
スゲル電気泳動法により２． ７ｋｂのＤＮＡ断片を回
収した。
ｐｓＤＮ１ ５μｇをＢ緩衝液５０μｌに溶かし、同様
にＢａｍＨ Ｉと５ｐｅＴで切断反応を行った。その反
応液に５０μｌのＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．０
）を加え混合し、１０単位のバクテリアアルカリフォス
ファターゼ（宝酒造社製）を添加して６５°Ｃで３０分
間反応した。エタノール沈澱処理を行った後、アガロー
スゲル電気泳動法により２． ７ｋｂのＤＮＡ断片を回
収した。
こうして得られたｐＰＵＩＬ３４由来のＳｐｅｌ−Ｂａ
ｍＨＩ断片（３９０ｂｐ）０． １ μｇとｐｓＤＮ１
由来のＳｐｅｌ−ＢａｍＨＩ断片（２． ７ｋｂ）０．
５μｇの結合反応を行った。得られた組換え体プラス
ミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株を形質転換し、ア
ンピシリン耐性のコロニーを得た。いくつかのコロニー
の培養菌体中のプラスミドについて塩基配列の一部を決
定して、目的とするプラスミドｐｓｎ ｒＬ３４を得た
。
ｍＨＩ断片（３９０ｂｐ）０． １ μｇとｐｓＤＮ１
由来のＳｐｅｌ−ＢａｍＨＩ断片（２． ７ｋｂ）０．
５μｇの結合反応を行った。得られた組換え体プラス
ミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株を形質転換し、ア
ンピシリン耐性のコロニーを得た。いくつかのコロニー
の培養菌体中のプラスミドについて塩基配列の一部を決
定して、目的とするプラスミドｐｓｎ ｒＬ３４を得た
。
そうして得られたｐｓＤＩＬ３４ ＤＮＡ ５μｇをＴ
Ａ緩衝液２０μｌに溶かし、制限酵素ＡｆｌＩ［１５単
位を加え、３７℃で３．５時間反応した。反応液をエタ
ノール沈澱して回収したＤＮＡをＢ緩衝液３０μｌに溶
かし、制限酵素ＢａｍＨＩ ２０単位を加え３７°Ｃで
５時間反応を行った。再度エタノール沈澱して回収した
ＤＮＡから、アガロースゲル電気泳動法により約４２０
ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
Ａ緩衝液２０μｌに溶かし、制限酵素ＡｆｌＩ［１５単
位を加え、３７℃で３．５時間反応した。反応液をエタ
ノール沈澱して回収したＤＮＡをＢ緩衝液３０μｌに溶
かし、制限酵素ＢａｍＨＩ ２０単位を加え３７°Ｃで
５時間反応を行った。再度エタノール沈澱して回収した
ＤＮＡから、アガロースゲル電気泳動法により約４２０
ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
一方、カルモジュリン発現プラスミドｐＴＣＡＬ７ＤＮ
Ａ １０℃ｇを前記ｐＳＤ ＩＬ３４の場合の３倍スケ
ールの反応条件にて制限酵素Ａｆｔ Ｉ［とＢａｍＨＩ
にて切断反応を行った。反応後、１００μｌの０．５Ｍ
ＴｒｉｓＨＣＩ （ｐＨ８，０）に溶かし、１０単位
のバクテリアアルカリフォスファターゼを添加して６５
°Ｃで３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った
後、アガロースゲル電気泳動法により大きい方（３，３
ｋｂ ’）のＤＮＡ断片を回収した。次に、上記で得ら
れたｐＳＤ ＩＬ３４由来のＡｆｌ ＩＩ−ＢａｍＨＩ
断片（４２０ｂｌ））０．１μｇとカルモジュリン発現
プラスミドｐＴＣＡＬ７由来のＡｆｌ ＩＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片（３，３ｋｂ）０．５ μｇの結合反応を行った
。得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌
ＤＨ５株を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを
得た。このコロニーの培養菌体よりプラスミドＤＮＡを
回収し、ＤＮＡ塩基配列を決定して第６図に示す配列を
含むことを確認した。このプラスミドをｐＴＫ ＩＬ３
４と呼ぶ。
Ａ １０℃ｇを前記ｐＳＤ ＩＬ３４の場合の３倍スケ
ールの反応条件にて制限酵素Ａｆｔ Ｉ［とＢａｍＨＩ
にて切断反応を行った。反応後、１００μｌの０．５Ｍ
ＴｒｉｓＨＣＩ （ｐＨ８，０）に溶かし、１０単位
のバクテリアアルカリフォスファターゼを添加して６５
°Ｃで３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った
後、アガロースゲル電気泳動法により大きい方（３，３
ｋｂ ’）のＤＮＡ断片を回収した。次に、上記で得ら
れたｐＳＤ ＩＬ３４由来のＡｆｌ ＩＩ−ＢａｍＨＩ
断片（４２０ｂｌ））０．１μｇとカルモジュリン発現
プラスミドｐＴＣＡＬ７由来のＡｆｌ ＩＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片（３，３ｋｂ）０．５ μｇの結合反応を行った
。得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌
ＤＨ５株を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを
得た。このコロニーの培養菌体よりプラスミドＤＮＡを
回収し、ＤＮＡ塩基配列を決定して第６図に示す配列を
含むことを確認した。このプラスミドをｐＴＫ ＩＬ３
４と呼ぶ。
ｐＴＫＩＬ３４上のＤＮＡによりコードされるＩＬ３誘
導体（本誘導体をｈｌＬ３４と呼ぶ）は、Ｎ末端から６
４番目のＡｒｇがＬｙｓ、 ８３番目のＬｅｕがＰｒｏ
、８８番目のＬｅｕがＭｅｔに置換している。
導体（本誘導体をｈｌＬ３４と呼ぶ）は、Ｎ末端から６
４番目のＡｒｇがＬｙｓ、 ８３番目のＬｅｕがＰｒｏ
、８８番目のＬｅｕがＭｅｔに置換している。
実施例５
ｈｌＬ３誘導体誘導体３ブ
（第１３図参照）：
実施例１の工程（１）により得られた１）ＰＵＩＬ３
ＤＮＡ５μｇにＢ緩衝液中で制限酵素５ｐｅｌ ５０単
位を加え、３７°Ｃで４時間反応を行った。エタノール
沈澱により回収したＤＮＡをＨ緩衝液５０μｍに溶かし
、制限酵素ＥｃｏＲＩ ５０単位を加え３７℃で５時間
反応を行った。その反応液に５０μｌのＩＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ（ｐＨ８． ０）を加え混合し、ｌＯ単位のバ
クテリアアルカリフォスファターゼを添加して６５°Ｃ
で３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った後、
アガロースゲル電気泳動法により約２． ９ｋｂのＤＮ
Ａ断片を回収して精製した。
ＤＮＡ５μｇにＢ緩衝液中で制限酵素５ｐｅｌ ５０単
位を加え、３７°Ｃで４時間反応を行った。エタノール
沈澱により回収したＤＮＡをＨ緩衝液５０μｍに溶かし
、制限酵素ＥｃｏＲＩ ５０単位を加え３７℃で５時間
反応を行った。その反応液に５０μｌのＩＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ（ｐＨ８． ０）を加え混合し、ｌＯ単位のバ
クテリアアルカリフォスファターゼを添加して６５°Ｃ
で３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った後、
アガロースゲル電気泳動法により約２． ９ｋｂのＤＮ
Ａ断片を回収して精製した。
別に、実施例１の工程（２）において使用した部分変異
ｈｌＬ３ｃＤ Ｎ Ａを有するプラスミドｐＣＧＳ８
１０℃ｇを上記ｐＰＵＩＬ３と同様の条件にて制限酵素
５ｐｅｌ、そしてＥｃｏＲ Ｉにて切断した。反応後、
エタノール沈澱したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に
て分画して３００ｂｐのＤＮＡ断片を回収・精製した。
ｈｌＬ３ｃＤ Ｎ Ａを有するプラスミドｐＣＧＳ８
１０℃ｇを上記ｐＰＵＩＬ３と同様の条件にて制限酵素
５ｐｅｌ、そしてＥｃｏＲ Ｉにて切断した。反応後、
エタノール沈澱したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に
て分画して３００ｂｐのＤＮＡ断片を回収・精製した。
こうして得られたｐＰＵＩＬ３由来の５ｐｅＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ断片（２． ９ｋｂ）０． ５ μｇとｐＣＧＳ８
由来のＳｐｅ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉ断片（３００ｂｐ）０
． ０５℃ｇの結合反応を行った。得られた組換え体プ
ラスミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株をＣｏｈｅｎ
らの方法により形質転換し、アンピシリン耐性のコロニ
ーを得た。いくつかのコロニーの培養菌体からプラスミ
ドを回収し、合成りＮＡをプライマーとして二本鎖ＤＮ
Ａを鋳型とするダイデオキシ法（サンガー法）にて塩基
配列を確認した。このプラスミドをｐＰＵＩＬ３５と呼
ぶ。
ＲＩ断片（２． ９ｋｂ）０． ５ μｇとｐＣＧＳ８
由来のＳｐｅ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉ断片（３００ｂｐ）０
． ０５℃ｇの結合反応を行った。得られた組換え体プ
ラスミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株をＣｏｈｅｎ
らの方法により形質転換し、アンピシリン耐性のコロニ
ーを得た。いくつかのコロニーの培養菌体からプラスミ
ドを回収し、合成りＮＡをプライマーとして二本鎖ＤＮ
Ａを鋳型とするダイデオキシ法（サンガー法）にて塩基
配列を確認した。このプラスミドをｐＰＵＩＬ３５と呼
ぶ。
次に、このｐＰＵＩＬ３５ Ｄ Ｎ Ａ ２μｇをＢ緩
衝液５０μｌに溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ １０単位
と５ｐｅＩ ２０単位を加えて、３７°Ｃ−晩切断反応
を行った。エタノール沈澱後、ＤＮＡをアガロースゲル
電気泳動して約３９０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し精製し
た。別に実施例１の（２）の工程により得られたプラス
ミドＩ）ＳＤＮｌ ５μｇをＢ緩衝液５０μｌに溶かし
、同様にＢａｍＨ Ｉと５ｐｅｌで切断反応を行った。
衝液５０μｌに溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ １０単位
と５ｐｅＩ ２０単位を加えて、３７°Ｃ−晩切断反応
を行った。エタノール沈澱後、ＤＮＡをアガロースゲル
電気泳動して約３９０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し精製し
た。別に実施例１の（２）の工程により得られたプラス
ミドＩ）ＳＤＮｌ ５μｇをＢ緩衝液５０μｌに溶かし
、同様にＢａｍＨ Ｉと５ｐｅｌで切断反応を行った。
その反応液に５０，ｃｚｌのＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（
ｐＨ８．０）を加え混合し、１０単位のバクテリアアル
カリフォスファターゼ（宝酒造社製）を添加して６５°
Ｃで３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った後
、アガロースゲル電気泳動法により２． ７ｋｂのＤＮ
Ａ断片を回収した。
ｐＨ８．０）を加え混合し、１０単位のバクテリアアル
カリフォスファターゼ（宝酒造社製）を添加して６５°
Ｃで３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った後
、アガロースゲル電気泳動法により２． ７ｋｂのＤＮ
Ａ断片を回収した。
こうして得られたｐｐｕｒｔ，ａｓ由来のＳｐｅＩ−Ｂ
ａｍ旧断片（３９０ｂｐ）０． １ ｔｔ ｇとｐｓＤ
Ｎ１由来のＳｐｅＩ−Ｂａｍ旧断片（２． ７ｋｂ）０
． ５μｇの結合反応を行った。得られた組換え体プラ
スミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株を形質転換し、
アンピシリン耐性のコロニーを得た。いくつかのコロニ
ーの培養菌体中のプラスミドについて塩基配列の一部を
決定して、目的とするプラスミドｐＳＤ ＩＬ３５を得
た。
ａｍ旧断片（３９０ｂｐ）０． １ ｔｔ ｇとｐｓＤ
Ｎ１由来のＳｐｅＩ−Ｂａｍ旧断片（２． ７ｋｂ）０
． ５μｇの結合反応を行った。得られた組換え体プラ
スミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株を形質転換し、
アンピシリン耐性のコロニーを得た。いくつかのコロニ
ーの培養菌体中のプラスミドについて塩基配列の一部を
決定して、目的とするプラスミドｐＳＤ ＩＬ３５を得
た。
そうして得られたｐｓＤＩＬ３５ ＤＮＡ ５μｇをＴ
Ａ緩衝液２０μｌに溶かし、制限酵素Ａｆｔ ＩＩ １
５単位を加え、３７℃で３．５時間反応した。反応液を
エタノール沈澱して回収したＤＮＡをＢ緩衝液３０μｌ
に溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ ２０単位を加え３７°
Ｃで５時間反応を行った。再度エタノール沈澱して回収
したＤＮＡから、アガロースゲル電気泳動法により約４
２０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
Ａ緩衝液２０μｌに溶かし、制限酵素Ａｆｔ ＩＩ １
５単位を加え、３７℃で３．５時間反応した。反応液を
エタノール沈澱して回収したＤＮＡをＢ緩衝液３０μｌ
に溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ ２０単位を加え３７°
Ｃで５時間反応を行った。再度エタノール沈澱して回収
したＤＮＡから、アガロースゲル電気泳動法により約４
２０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
一方、カルモジュリン発現プラスミドｐＴＣＡＬＴＤＮ
Ａ １０μｇを前記ｐＳＤＩＬ３５の場合の３倍スケー
ルの反応条件にて制限酵素Ａｆｌ ＩＩとＢａｍＨＩに
て切断反応を行った。反応後、１００μｌの０．５Ｍ
ＴｒｉｓＨＣＩ （１）Ｈ８，Ｏ）に溶かし、ＩＯ単位
のバクテリアアルカリフォスファターゼを添加して６５
°Ｃて３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った
後、アガロースゲル電気泳動法により大きい方（３，３
ｋｂ）のＤＮＡ断片を回収した。次に、上記で得られた
ｐＳＤＩＬ３５由来のＡｆ ｌ ＩＩ −ＢａｍＨＩ断
片（４２０ｂｐ）０．１μｇとカルモジュリン発現プラ
スミドｐＴＣＡＬ７由来のＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片
（３，３ｋｂ）０．５μｇの結合反応を行った。
Ａ １０μｇを前記ｐＳＤＩＬ３５の場合の３倍スケー
ルの反応条件にて制限酵素Ａｆｌ ＩＩとＢａｍＨＩに
て切断反応を行った。反応後、１００μｌの０．５Ｍ
ＴｒｉｓＨＣＩ （１）Ｈ８，Ｏ）に溶かし、ＩＯ単位
のバクテリアアルカリフォスファターゼを添加して６５
°Ｃて３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った
後、アガロースゲル電気泳動法により大きい方（３，３
ｋｂ）のＤＮＡ断片を回収した。次に、上記で得られた
ｐＳＤＩＬ３５由来のＡｆ ｌ ＩＩ −ＢａｍＨＩ断
片（４２０ｂｐ）０．１μｇとカルモジュリン発現プラ
スミドｐＴＣＡＬ７由来のＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片
（３，３ｋｂ）０．５μｇの結合反応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｄ
Ｈ５株を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得
た。このコロニーの培養菌体よりプラスミドＤＮＡを回
収し、ＤＮＡ塩基配列を決定して第７図に示す配列を含
むことを確認した。このプラスミドをｐＴＫＩＬ３５と
呼ぶ。
Ｈ５株を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得
た。このコロニーの培養菌体よりプラスミドＤＮＡを回
収し、ＤＮＡ塩基配列を決定して第７図に示す配列を含
むことを確認した。このプラスミドをｐＴＫＩＬ３５と
呼ぶ。
ｐＴＫＩＬ３５上のＤＮＡによりコードされる［Ｌ３誘
導体（本誘導体を旧Ｌ３５と呼ぶ）は、Ｎ末端から６４
番目のＡｒｇがＬｙｓ、 ８３番目のＬｅｕ力（Ｐｒｏ
、 ８８番目のＬｅｕがＭｅｔ、９９番目のＨｉｓがＡ
ｒｇに置換している。
導体（本誘導体を旧Ｌ３５と呼ぶ）は、Ｎ末端から６４
番目のＡｒｇがＬｙｓ、 ８３番目のＬｅｕ力（Ｐｒｏ
、 ８８番目のＬｅｕがＭｅｔ、９９番目のＨｉｓがＡ
ｒｇに置換している。
実施例６
ｈｌＬ３誘導体誘導体３プ
（第１４図参照）：
実施例４の工程により得られたｐＰＵｒＬ３４ ＤＮＡ
５μｇにＨ緩衝液中で制限酵素ＥｃｏＲＩ ５０単位を
加え、３７°Ｃで４時間反応を行った。エタノール沈澱
により回収したＤＮＡをＢ緩衝液５０μｍに溶かし、制
限酵素ＢａｍＨＩ ５０単位を加え３７°Ｃで５時間反
応を行った。その反応液に５０μｌのＩＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ（ｐＨ８．０）を加え混合し、１０単位のバクテ
リアアルカリフォスファターゼを添加して６５°Ｃで３
０分間反応した。
５μｇにＨ緩衝液中で制限酵素ＥｃｏＲＩ ５０単位を
加え、３７°Ｃで４時間反応を行った。エタノール沈澱
により回収したＤＮＡをＢ緩衝液５０μｍに溶かし、制
限酵素ＢａｍＨＩ ５０単位を加え３７°Ｃで５時間反
応を行った。その反応液に５０μｌのＩＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ（ｐＨ８．０）を加え混合し、１０単位のバクテ
リアアルカリフォスファターゼを添加して６５°Ｃで３
０分間反応した。
エタノール沈澱処理を行った後、アガロースゲル電気泳
動法により約３．ｌｋｂのＤＮＡ断片を回収して精製し
た。
動法により約３．ｌｋｂのＤＮＡ断片を回収して精製し
た。
別に、実施例１の工程（２）において使用した部分変異
ｈｌＬ３ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＣＧ８８１０μ
ｇを上記１）ＰＵＩＬ３と同様の条件にて制限酵素Ｅｃ
ｏＲ Ｉ、そしてＢａｍＨ Ｉにて切断した。反応後、
エタノール沈澱したＤＮＡをポリアクリルアミドゲル電
気泳動にて分画して９０ｂｐのＤＮＡ断片を回収・精製
した。
ｈｌＬ３ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＣＧ８８１０μ
ｇを上記１）ＰＵＩＬ３と同様の条件にて制限酵素Ｅｃ
ｏＲ Ｉ、そしてＢａｍＨ Ｉにて切断した。反応後、
エタノール沈澱したＤＮＡをポリアクリルアミドゲル電
気泳動にて分画して９０ｂｐのＤＮＡ断片を回収・精製
した。
こうして得られたｐＰＵＩＬ３４由来のＥｃｏＲ Ｉ−
ＢａｍＨ １断片（３． １ｋｂ）０．５ｕ ｇとｐＣ
ＧＳ８由来のＥｃｏＲｉＢａｍＨＩ断片（９０ｂｐ）０
．０５μｇの結合反応を行った。得られた組換え体プラ
スミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株をＣｏｈｅｎら
の方法により形質転換し、アンピシリン耐性のコロニー
を得た。いくつかのコロニーの培養菌体からプラスミド
を回収し、合成りＮＡをブライマーとして二本鎖ＤＮＡ
を鋳型とするダイデオキシ法（サンガー法）にて塩基配
列を確認した。このプラスミドをｐＰＵＩＬ３６と呼ぶ
。
ＢａｍＨ １断片（３． １ｋｂ）０．５ｕ ｇとｐＣ
ＧＳ８由来のＥｃｏＲｉＢａｍＨＩ断片（９０ｂｐ）０
．０５μｇの結合反応を行った。得られた組換え体プラ
スミドの混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株をＣｏｈｅｎら
の方法により形質転換し、アンピシリン耐性のコロニー
を得た。いくつかのコロニーの培養菌体からプラスミド
を回収し、合成りＮＡをブライマーとして二本鎖ＤＮＡ
を鋳型とするダイデオキシ法（サンガー法）にて塩基配
列を確認した。このプラスミドをｐＰＵＩＬ３６と呼ぶ
。
次に、このｐＰＵＩＬ３６ ＤＮＡ ２μｇをＢ緩衝液
５０μｌに溶かし、制限酵素ＢａｍＨ１ １０単位と５
ｐｅ１ ２０単位を加えて、３７℃−晩切断反応を行っ
た。エタノール沈澱後、ＤＮＡをアガロースゲル電気泳
動して約３９０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し精製した。別
に実施例１の（２）の工程により得られたプラスミド１
）ＳＤＮＩ ５μｇをＢ緩衝液５０μｌに溶かし、同様
にＢａｍＨ Ｉと５ｐｅｌで切断反応を行った。その反
応液に５０、ｃｚｌのＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（１）Ｈ
８．Ｏ）を加え混合し、ｌＯ単位のバクテリアアルカリ
フォスファターゼ（宝酒造社製）を添加して６５°Ｃで
３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った後、ア
ガロースゲル電気泳動法により２．７ｋｂのＤＮＡ断片
を回収した。
５０μｌに溶かし、制限酵素ＢａｍＨ１ １０単位と５
ｐｅ１ ２０単位を加えて、３７℃−晩切断反応を行っ
た。エタノール沈澱後、ＤＮＡをアガロースゲル電気泳
動して約３９０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し精製した。別
に実施例１の（２）の工程により得られたプラスミド１
）ＳＤＮＩ ５μｇをＢ緩衝液５０μｌに溶かし、同様
にＢａｍＨ Ｉと５ｐｅｌで切断反応を行った。その反
応液に５０、ｃｚｌのＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（１）Ｈ
８．Ｏ）を加え混合し、ｌＯ単位のバクテリアアルカリ
フォスファターゼ（宝酒造社製）を添加して６５°Ｃで
３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った後、ア
ガロースゲル電気泳動法により２．７ｋｂのＤＮＡ断片
を回収した。
こうして得られたｐＰＵ ＩＬ３６由来のＳｐｅｌ−Ｂ
ａｍＨＩ断片（３９０ｂｐ）０． １ μｇとｐｓＤＮ
１由来のＳｐｅｌ−Ｂａｍ旧断片（２，７ｋｂ）０．５
μｇの結合反応を行った。得られた組換え体プラスミド
の混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株を形質転換し、アンピ
シリン耐性のコロニーヲ得た。いくつかのコロニーの培
養菌体中のプラスミドについて塩基配列の一部を決定し
て、目的とするプラスミドｐｓＤＩＬ３６を得た。
ａｍＨＩ断片（３９０ｂｐ）０． １ μｇとｐｓＤＮ
１由来のＳｐｅｌ−Ｂａｍ旧断片（２，７ｋｂ）０．５
μｇの結合反応を行った。得られた組換え体プラスミド
の混合物を用いて大腸菌ＤＨ５株を形質転換し、アンピ
シリン耐性のコロニーヲ得た。いくつかのコロニーの培
養菌体中のプラスミドについて塩基配列の一部を決定し
て、目的とするプラスミドｐｓＤＩＬ３６を得た。
そうして得られたｐｓＤＩＬ３６ ＤＮＡ ５μｇをＴ
Ａ緩衝液２０μｌに溶かし、制限酵素Ａｆｌ Ｉ［１５
単位を加え、３７℃で３．５時間反応した。反応液をエ
タノール沈澱して回収したＤＮＡをＢ緩衝液３０μｌに
溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ ２０単位を加え３７°Ｃ
で５時間反応を行った。再度エタノール沈澱して回収し
たＤＮＡから、アガロースゲル電気泳動法により約４２
０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
Ａ緩衝液２０μｌに溶かし、制限酵素Ａｆｌ Ｉ［１５
単位を加え、３７℃で３．５時間反応した。反応液をエ
タノール沈澱して回収したＤＮＡをＢ緩衝液３０μｌに
溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ ２０単位を加え３７°Ｃ
で５時間反応を行った。再度エタノール沈澱して回収し
たＤＮＡから、アガロースゲル電気泳動法により約４２
０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
一方、カルモジュリン発現プラスミドｐＴＣＡＬ７ＤＮ
Ａ １０℃ｇを前記ｐＳＤ ＩＬ３６の場合の３倍スケ
ールの反応条件にて制限酵素Ａｆｌ ＩＩとＢａｍＨＩ
にて切断反応を行った。反応後、１００μｌの０．５Ｍ
ＴｒｉｓＨＣＩ （ｐＨ８，０）に溶かし、１０単位
のバクテリアアルカリフォスファターゼを添加して６５
°Ｃで３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った
後、アガロースゲル電気泳動法により大きい方（３，３
ｋｂ）のＤＮＡ断片を回収した。次に、上記で得られた
ｐＳＤ ＩＬ３６由来のＡｆ Ｉ ＩＩ−Ｂａｍ旧断片
（４２０ｂｐ）Ｏ，１８ｇとカルモジュリン発現プラス
ミドｐＴＣＡＬ７由来のＡｆｌＩｆ−Ｂａｍ旧断片（３
，３ｋｂ）０．５ μｇの結合反応を行った。
Ａ １０℃ｇを前記ｐＳＤ ＩＬ３６の場合の３倍スケ
ールの反応条件にて制限酵素Ａｆｌ ＩＩとＢａｍＨＩ
にて切断反応を行った。反応後、１００μｌの０．５Ｍ
ＴｒｉｓＨＣＩ （ｐＨ８，０）に溶かし、１０単位
のバクテリアアルカリフォスファターゼを添加して６５
°Ｃで３０分間反応した。エタノール沈澱処理を行った
後、アガロースゲル電気泳動法により大きい方（３，３
ｋｂ）のＤＮＡ断片を回収した。次に、上記で得られた
ｐＳＤ ＩＬ３６由来のＡｆ Ｉ ＩＩ−Ｂａｍ旧断片
（４２０ｂｐ）Ｏ，１８ｇとカルモジュリン発現プラス
ミドｐＴＣＡＬ７由来のＡｆｌＩｆ−Ｂａｍ旧断片（３
，３ｋｂ）０．５ μｇの結合反応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｄ
Ｈ５株を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得
た。このコロニーの培養菌体よりプラスミドＤＮＡを回
収し、ＤＮＡ塩基配列を決定して第８図に示す配列を含
むことを確認した。このプラスミドをｐＴＫＩＬ３６と
呼ぶ。
Ｈ５株を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得
た。このコロニーの培養菌体よりプラスミドＤＮＡを回
収し、ＤＮＡ塩基配列を決定して第８図に示す配列を含
むことを確認した。このプラスミドをｐＴＫＩＬ３６と
呼ぶ。
ｐＴＫＩＬ３６上のＤＮＡによりコードされるＩＬ３誘
導体（本誘導体をｈｌＬ３６と呼ぶ）は、Ｎ末端から６
４番目のＡｒｇがＬｙｓ、８３番目のＬｅｕがＰｒｏ、
８８番目のＬｅｕがＭｅｔ、 １１３１３番目ｈｒがＬ
ｙｓ、 １２２２２番目ｌａがＧｌｕ、 １２７２７番
目ｈｒがＭｅｔ、 １３２３２番目ｌａがＧｌｕにそし
て１３４３４番目ｈｅがＳｅｒに置換している。
導体（本誘導体をｈｌＬ３６と呼ぶ）は、Ｎ末端から６
４番目のＡｒｇがＬｙｓ、８３番目のＬｅｕがＰｒｏ、
８８番目のＬｅｕがＭｅｔ、 １１３１３番目ｈｒがＬ
ｙｓ、 １２２２２番目ｌａがＧｌｕ、 １２７２７番
目ｈｒがＭｅｔ、 １３２３２番目ｌａがＧｌｕにそし
て１３４３４番目ｈｅがＳｅｒに置換している。
実施例７
ｈｌＬ３誘導体ポリペプチドの調製並びに精製単離実施
例１ないし６で得られたプラスミド（ｐＴＫＩＬ３１、
ｐＴＫＩＬ３２、ｐＴＫＩＬ３３、ｐＴＫｒＬ３４、ｐ
ＴＫＩＬ３５、ｐＴＫＩＬ３６）により形質転換された
それぞれの大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）
をアンピシリンを含むＬＢ培地（１１当りバクトドリブ
トンｌｏｇ 、イーストエキストラクト５ｇ、 ＮａＣ
１ｌＯｇ）にて３７°Ｃで一晩振どう培養した。
例１ないし６で得られたプラスミド（ｐＴＫＩＬ３１、
ｐＴＫＩＬ３２、ｐＴＫＩＬ３３、ｐＴＫｒＬ３４、ｐ
ＴＫＩＬ３５、ｐＴＫＩＬ３６）により形質転換された
それぞれの大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）
をアンピシリンを含むＬＢ培地（１１当りバクトドリブ
トンｌｏｇ 、イーストエキストラクト５ｇ、 ＮａＣ
１ｌＯｇ）にて３７°Ｃで一晩振どう培養した。
この培養液２０ｍ１を１０１００ＯのＭ９培地（０，８
％グルコース、０．４％カザミノ酸、１０℃ｇ／ｍｌチ
アミン、５０℃ｇ／ｍｌアンピシリンを含む）に加え、
３７°Ｃにて３時間振とうした後、インドールアクリル
酸を最終濃度２０μｇ／ｍ ｌになるように添加し、さ
らに５時間振とう培養した。得られた大腸菌の一部をサ
ンプリングし、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（
５ＤＳＰＡＧＥ）により、菌体中のｈｌＬ３様ポリペプ
チドの含有量を調べた。この条件においては、発現され
たｈｌＬ３誘導体６種は大腸菌細胞蛋白質の２０％以上
であった。この培養液を５０００Ｘｇ 、１０分間遠心
することにより、ｈｌＬ３様ポリペプチドを蓄積してい
る上記形質転換大腸菌の菌体約５ｇを得た。
％グルコース、０．４％カザミノ酸、１０℃ｇ／ｍｌチ
アミン、５０℃ｇ／ｍｌアンピシリンを含む）に加え、
３７°Ｃにて３時間振とうした後、インドールアクリル
酸を最終濃度２０μｇ／ｍ ｌになるように添加し、さ
らに５時間振とう培養した。得られた大腸菌の一部をサ
ンプリングし、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（
５ＤＳＰＡＧＥ）により、菌体中のｈｌＬ３様ポリペプ
チドの含有量を調べた。この条件においては、発現され
たｈｌＬ３誘導体６種は大腸菌細胞蛋白質の２０％以上
であった。この培養液を５０００Ｘｇ 、１０分間遠心
することにより、ｈｌＬ３様ポリペプチドを蓄積してい
る上記形質転換大腸菌の菌体約５ｇを得た。
この菌体を約４°Ｃで２０ｍ１の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、１ｍＭ ＤＴＴに均一に懸濁し
、懸濁液をフレンチプレスに３回かけて菌体を破砕した
。この破砕液を５０００ Ｘ ｇで１０分間遠心分離後
、上清をデカンテーションし大腸菌封入体を含む沈澱を
得た。得られた沈澱を２０ｍ ｌの冷水に再懸濁後上記
の条件で遠心を行い沈澱を得る操作を２回繰り返し、封
入体を水洗した。
ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、１ｍＭ ＤＴＴに均一に懸濁し
、懸濁液をフレンチプレスに３回かけて菌体を破砕した
。この破砕液を５０００ Ｘ ｇで１０分間遠心分離後
、上清をデカンテーションし大腸菌封入体を含む沈澱を
得た。得られた沈澱を２０ｍ ｌの冷水に再懸濁後上記
の条件で遠心を行い沈澱を得る操作を２回繰り返し、封
入体を水洗した。
得られた封入体を９．２ｍｌの冷水に懸濁し、０．８ｍ
ｌのＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ９，２）、３０ｍ１
の８Ｍ塩酸グアニジンを加え、室温にて１時間おだやか
に撹拌した。この溶液に１２０ｍ１の２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ（１）Ｈ９，２）を白濁しないようゆっくり
撹拌しなから加えた後、さらに３０分撹拌した。これに
１９．６ｍｇの酸化型グルタチオンと９８．３ｍｇの還
元型グルタチオンを加え撹拌溶解し、４°Ｃに約２０時
間静置しポリペプチドの再構成を行った。この溶液につ
いて約４℃で２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣＩ（ｐＨ８，０）
５１に対して５回透析を行った。透析の際に生じた不
溶物は、前記の条件での遠心分離により除去した。
ｌのＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ９，２）、３０ｍ１
の８Ｍ塩酸グアニジンを加え、室温にて１時間おだやか
に撹拌した。この溶液に１２０ｍ１の２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ（１）Ｈ９，２）を白濁しないようゆっくり
撹拌しなから加えた後、さらに３０分撹拌した。これに
１９．６ｍｇの酸化型グルタチオンと９８．３ｍｇの還
元型グルタチオンを加え撹拌溶解し、４°Ｃに約２０時
間静置しポリペプチドの再構成を行った。この溶液につ
いて約４℃で２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣＩ（ｐＨ８，０）
５１に対して５回透析を行った。透析の際に生じた不
溶物は、前記の条件での遠心分離により除去した。
次いで、得られた上清に１Ｍ酢酸ナトリウム（吐５．４
）を試料溶液の１７５０容量加え、ＩＮ酢酸にてｐＨを
５．４に調整した。このｐＨを調整した溶液を前記の条
件にて遠心分離し、得られた上清を、予め０．２ＮＮａ
ＯＨを通して脱パイロジエン化した後に２０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５，４）で平衡化しておいたＣＭセファロー
スＦＦカラム（ファルマシア社）にアプライした。
）を試料溶液の１７５０容量加え、ＩＮ酢酸にてｐＨを
５．４に調整した。このｐＨを調整した溶液を前記の条
件にて遠心分離し、得られた上清を、予め０．２ＮＮａ
ＯＨを通して脱パイロジエン化した後に２０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５，４）で平衡化しておいたＣＭセファロー
スＦＦカラム（ファルマシア社）にアプライした。
２０ｍＭ ＮａＣ１を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５
，４）を数カラム容量通して洗浄した後、５０ｍＭ Ｎ
ａＣ１を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，４）にてｈ
ｌＬ３誘導体を溶出した。
，４）を数カラム容量通して洗浄した後、５０ｍＭ Ｎ
ａＣ１を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，４）にてｈ
ｌＬ３誘導体を溶出した。
カラムからの溶出パターンを第１６図に示す。
ピーク画分を限外濾過（分子量５０００カツト、ミリポ
ア社）により約１０倍に濃縮した。この濃縮液を、予め
０．２Ｎ ＮａＯＨを通して脱パイロジエン化した後に
リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６，５）にて平衡化してお
いたセファクリル３２００カラム（ファルマシア社）に
アプライし、同波にてｈｌＬ３誘導体を溶出した。カラ
ムからの溶出パターンを第１７図に示す。
ア社）により約１０倍に濃縮した。この濃縮液を、予め
０．２Ｎ ＮａＯＨを通して脱パイロジエン化した後に
リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６，５）にて平衡化してお
いたセファクリル３２００カラム（ファルマシア社）に
アプライし、同波にてｈｌＬ３誘導体を溶出した。カラ
ムからの溶出パターンを第１７図に示す。
５ＤＳ−ＰＡＧＥにより目的物が単一に含まれている事
が確認された両分のみを集めて最終精製品とした。
が確認された両分のみを集めて最終精製品とした。
６種のｈｌＬ３誘導体すべてについて、それぞれ約１５
０ｍｇの最終精製品を得た。
０ｍｇの最終精製品を得た。
実施例８
ｈｌＬ３誘導体蛋白の活性測定
（ｈｌＬ３誘導体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖に対
する効果） 実施例７で調製したｈｌＬ３誘導体とｈｌＬ３のｉｎ
ｖｉｔｒ。
する効果） 実施例７で調製したｈｌＬ３誘導体とｈｌＬ３のｉｎ
ｖｉｔｒ。
活性の比較を、増殖因子依存性細胞株ＴＦ−１の増殖促
進能力を指標として行った（北村ら、 ＢＬＯＯＤ ７
３゜３７５ （１９８９））。ＴＦ−１は赤白血病患者
の骨髄由来で、エリスロボエチン（ＥＰＯ） 、顆粒球
マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）また
はＩＬ３に依存して増殖する細胞株である。ＧＭ−Ｃ３
Ｆ ２μｇ／ｍｌと１０％牛脂児血清を含むＲＰＭ１１
６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中で継代維持したＴＦ−１細
胞を用いた。９６ウエル平底マイクロタイタープレート
の各ウェル中に、ＧＭ−Ｃ３Ｆを洗浄除去したＴＦ−１
細胞ｌＸｌ０’個、各種濃度のｈｌＬ３、ｈＩＬ３誘導
体および１０％牛脂児血清を含む最終容量１００μｌの
ＲＰＭ １１６４０培地を加え、３７°Ｃ１湿度１００
％、５％ＣＯ２存在下に７２時間培養した。各ウェルに
３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２ｙ
ｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕ
ｍ ｂｒｏｍｉｄｅ （ＣＨＥＭＩＣＯＮ社） ５ｍｇ
／ｍｌを１０μｍずつ加えて、さらに４時間培養した。
進能力を指標として行った（北村ら、 ＢＬＯＯＤ ７
３゜３７５ （１９８９））。ＴＦ−１は赤白血病患者
の骨髄由来で、エリスロボエチン（ＥＰＯ） 、顆粒球
マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）また
はＩＬ３に依存して増殖する細胞株である。ＧＭ−Ｃ３
Ｆ ２μｇ／ｍｌと１０％牛脂児血清を含むＲＰＭ１１
６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中で継代維持したＴＦ−１細
胞を用いた。９６ウエル平底マイクロタイタープレート
の各ウェル中に、ＧＭ−Ｃ３Ｆを洗浄除去したＴＦ−１
細胞ｌＸｌ０’個、各種濃度のｈｌＬ３、ｈＩＬ３誘導
体および１０％牛脂児血清を含む最終容量１００μｌの
ＲＰＭ １１６４０培地を加え、３７°Ｃ１湿度１００
％、５％ＣＯ２存在下に７２時間培養した。各ウェルに
３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２ｙ
ｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕ
ｍ ｂｒｏｍｉｄｅ （ＣＨＥＭＩＣＯＮ社） ５ｍｇ
／ｍｌを１０μｍずつ加えて、さらに４時間培養した。
生じた沈澱物を０．０４Ｎ ＨＣＩを含むイソプロパツ
ールｌｏ。
ールｌｏ。
μｌを各ウェルにくわえてよく撹拌して溶解させ、１時
間以内にマイクロプレートリーダーで６２０ｎｍを対照
として５７０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を第１
表に示す。なお、第１表に示す数値は、ｈｌＬ３を１と
した時の相対値である。
間以内にマイクロプレートリーダーで６２０ｎｍを対照
として５７０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を第１
表に示す。なお、第１表に示す数値は、ｈｌＬ３を１と
した時の相対値である。
第１表 ヒトＩＬ３およびその誘導体の相対活性サンプ
ル 名 ｈｒＬ３ ｈｌＬ３１ ｈｌ
Ｌ３２ ｈｌＬ３３相対活性 １．００ ２．
２０ １．４７ １．９７すンブル 名 ｈＩＬ
３４ ｈｌＬ３５ ｈＩＬ３６相対活性 １
．０３ １．７７ ２．００実施例９ ｈｌＬ３誘導体３１大腸菌高発現プラスミドｐＫＴ［Ｌ
３１の構築 プラスミドｐＵｃ１９ ＤＮＡ （宝酒造社製）５μｇ
を９０μｌのＨ緩衝液に溶かし、制限酵素Ｘｂａｌ ５
０単位およびＥｃｏＲＩ ５０単位を加えて３７°Ｃで
２時間反応を行った。その反応液からアガロース電気泳
動法により約２．７ＫｂのＤＮＡ断片を回収して精製し
た。
ル 名 ｈｒＬ３ ｈｌＬ３１ ｈｌ
Ｌ３２ ｈｌＬ３３相対活性 １．００ ２．
２０ １．４７ １．９７すンブル 名 ｈＩＬ
３４ ｈｌＬ３５ ｈＩＬ３６相対活性 １
．０３ １．７７ ２．００実施例９ ｈｌＬ３誘導体３１大腸菌高発現プラスミドｐＫＴ［Ｌ
３１の構築 プラスミドｐＵｃ１９ ＤＮＡ （宝酒造社製）５μｇ
を９０μｌのＨ緩衝液に溶かし、制限酵素Ｘｂａｌ ５
０単位およびＥｃｏＲＩ ５０単位を加えて３７°Ｃで
２時間反応を行った。その反応液からアガロース電気泳
動法により約２．７ＫｂのＤＮＡ断片を回収して精製し
た。
一方、第１９図に示されているＤＮＡのＥｃｏＲＩから
ＢａｍＨＩの領域を、このＤＮＡにコードされている部
分変異ｈｌＬ３のアミノ酸配列が変わらないようにして
、コドンを大腸菌でよく用いられているものに改変した
ＤＮＡ配列（両端にリンカ−配列を含む；第２０図に示
す）を化学合成した。このＤＮＡと上記ｐＵｃ１９のＸ
ｂａ Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片（２，７ｋｂ）の結合反応を
行った。得られた組換え体プラスミド混合物を用いて大
腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、アンピシリン耐性のコ
ロニーを得た。このコロニーの培養菌体よりプラスミド
を回収し、得られたプラスミドについてダイデオキシ法
でＤＮＡ塩基配列を決定し、第２０図に示す配列を有す
ることを確認した。
ＢａｍＨＩの領域を、このＤＮＡにコードされている部
分変異ｈｌＬ３のアミノ酸配列が変わらないようにして
、コドンを大腸菌でよく用いられているものに改変した
ＤＮＡ配列（両端にリンカ−配列を含む；第２０図に示
す）を化学合成した。このＤＮＡと上記ｐＵｃ１９のＸ
ｂａ Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片（２，７ｋｂ）の結合反応を
行った。得られた組換え体プラスミド混合物を用いて大
腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、アンピシリン耐性のコ
ロニーを得た。このコロニーの培養菌体よりプラスミド
を回収し、得られたプラスミドについてダイデオキシ法
でＤＮＡ塩基配列を決定し、第２０図に示す配列を有す
ることを確認した。
このプラスミドをｐＫＥ３と呼ぶ。
次に、このｐＫＥ３ ＤＮＡ ５μｇを９０μｍのＢ緩
衝液に溶かし、制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉ ５０単位およ
びＥｃｏＲＩ５０単位を加え、３７°Ｃで２時間反応を
行った。その反応液から、アガロース電気泳動法により
約２．８ＫｂのＤＮＡ断片を回収して精製した。
衝液に溶かし、制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉ ５０単位およ
びＥｃｏＲＩ５０単位を加え、３７°Ｃで２時間反応を
行った。その反応液から、アガロース電気泳動法により
約２．８ＫｂのＤＮＡ断片を回収して精製した。
別に、大腸菌でよく用いられるコドンでｈＩＩ、３をコ
ードしているＤＮＡを含むプラスミドｐｓｎ （特開平
２−４８２号公報参照）５μｇを上記ｐＫＥ３と同様の
条件にて制限酵素１ｉｎｄＩ［およびＥｃｏＲＩにて切
断した。反応後、エタノール沈澱したＤＮＡをアガロー
ス電気泳動にて分画して約３４０ｂｐのＤＮＡ断片を回
収・精製した。
ードしているＤＮＡを含むプラスミドｐｓｎ （特開平
２−４８２号公報参照）５μｇを上記ｐＫＥ３と同様の
条件にて制限酵素１ｉｎｄＩ［およびＥｃｏＲＩにて切
断した。反応後、エタノール沈澱したＤＮＡをアガロー
ス電気泳動にて分画して約３４０ｂｐのＤＮＡ断片を回
収・精製した。
こうして得られたｐＫＥ３由来のＨｉｎｄＩ［−Ｅｃｏ
ＲＩ断片（２，８ｋｂ）とｐｓｒｔ由来の）ｆｉｎｄｌ
ｌｒ−ＥｃｏＲＩ断片（３４０ｂｐ）の結合反応を行っ
た。得られた組換え体プラスミド混合物を用いて大腸菌
ＪＭ１０９株を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニ
ーを得た。このコロニーの培養菌体よりプラスミドを回
収し、得られたプラスミドにｐｓｒｔ断片由来の制限酵
素Ａｆｔ Ｉ［切断部位が存在することを確認した。こ
のプラスミドをｐＫＥＩＬ３３と呼ぶ。ｐＫＥＩＬ３３
上のＤＮＡにはｈＩＬ３３がコードされている。
ＲＩ断片（２，８ｋｂ）とｐｓｒｔ由来の）ｆｉｎｄｌ
ｌｒ−ＥｃｏＲＩ断片（３４０ｂｐ）の結合反応を行っ
た。得られた組換え体プラスミド混合物を用いて大腸菌
ＪＭ１０９株を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニ
ーを得た。このコロニーの培養菌体よりプラスミドを回
収し、得られたプラスミドにｐｓｒｔ断片由来の制限酵
素Ａｆｔ Ｉ［切断部位が存在することを確認した。こ
のプラスミドをｐＫＥＩＬ３３と呼ぶ。ｐＫＥＩＬ３３
上のＤＮＡにはｈＩＬ３３がコードされている。
このｐＫＥＩＬ３３ ＤＮＡ ５μｇを９０μｌのＨ緩
衝液に溶かし、制限酵素Ｐｓｔｌ ５０単位およびＥｃ
ｏＲＩ ５０単位を加え、３７°Ｃで２時間反応を行
った。反応液をエタノール沈澱して回収したＤＮＡから
アガロース電気泳動により約３ｋｂのＤＮＡ断片を回収
して精製した。
衝液に溶かし、制限酵素Ｐｓｔｌ ５０単位およびＥｃ
ｏＲＩ ５０単位を加え、３７°Ｃで２時間反応を行
った。反応液をエタノール沈澱して回収したＤＮＡから
アガロース電気泳動により約３ｋｂのＤＮＡ断片を回収
して精製した。
一方、大腸菌でよく用いられているコドンを使用して、
第２図に示す部分変異ｈＩＬ３の７１番目のＡｓｎから
１０６番目のＡｓｎまでの部分をコードするＤＮＡ配列
（第２１図に示す）を化学合成した。このＤＮＡと上記
ｐＫＥ ＩＬ３３のＰｓ ｔ Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片（３
ｋｂ）の結合反応を行った。得られた組換え体プラスミ
ド混合物を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ア
ンピシリン耐性のコロニーを得た。このコロニの培養菌
体よりプラスミドを回収し、得られたプラスミドについ
てダイデオキシ法でＤＮＡ塩基配列を決定し、第２１図
に示す配列を有することを確認した。このプラスミドを
ｐＫＥ３３３と呼ぶ。
第２図に示す部分変異ｈＩＬ３の７１番目のＡｓｎから
１０６番目のＡｓｎまでの部分をコードするＤＮＡ配列
（第２１図に示す）を化学合成した。このＤＮＡと上記
ｐＫＥ ＩＬ３３のＰｓ ｔ Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片（３
ｋｂ）の結合反応を行った。得られた組換え体プラスミ
ド混合物を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ア
ンピシリン耐性のコロニーを得た。このコロニの培養菌
体よりプラスミドを回収し、得られたプラスミドについ
てダイデオキシ法でＤＮＡ塩基配列を決定し、第２１図
に示す配列を有することを確認した。このプラスミドを
ｐＫＥ３３３と呼ぶ。
そうして得られたｐＫＥ３３３ＤＮＡ ５μｇを９０μ
ｌのＴＡ緩衝液２０μｌに溶かし、制限酵素ＡｆｌＩＩ
５０単位およびＢａｍＨＩ ５０単位を加えて３７°Ｃ
で２時間反応した。エタノール沈澱して回収したＤＮＡ
からアガロースゲル電気泳動法により約４２０ｂｐのＤ
ＮＡ断片を精製した。一方、カルモジュリン発現プラス
ミドＩ）ＴＣＡＬＴＤ Ｎ Ａ ５μｇを同様にして制
限酵素ＡｆｌＩ［とＢａｍ旧で切断し、アガロースゲル
電気泳動法により大きい方（３，３ｋｂ）のＤＮＡ断片
を回収した。
ｌのＴＡ緩衝液２０μｌに溶かし、制限酵素ＡｆｌＩＩ
５０単位およびＢａｍＨＩ ５０単位を加えて３７°Ｃ
で２時間反応した。エタノール沈澱して回収したＤＮＡ
からアガロースゲル電気泳動法により約４２０ｂｐのＤ
ＮＡ断片を精製した。一方、カルモジュリン発現プラス
ミドＩ）ＴＣＡＬＴＤ Ｎ Ａ ５μｇを同様にして制
限酵素ＡｆｌＩ［とＢａｍ旧で切断し、アガロースゲル
電気泳動法により大きい方（３，３ｋｂ）のＤＮＡ断片
を回収した。
こうして得られたｐＫＥ３３３由来のＡｆｌＩ［−Ｂａ
ｍＨｒ断片（４２０ｂｐ）０．１μｇとカルモジュリン
発現プラスミドｐＴＣＡＬ７由来のＡｆ ｌ ＩＩ−Ｂ
ａｍ旧断片（３，３ｋｂ）０．５ μｇの結合反応を行
った。得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大
腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、アンピシリン耐性のコ
ロニーを得た。このコロニーの培養菌体よりプラスミド
ＤＮＡを単離し、ＤＮＡ塩基配列を決定して第２２図に
示す配列を含むことを確認した。このプラスミドをｐＫ
ＴＥＩＬ３１と呼ぶ。
ｍＨｒ断片（４２０ｂｐ）０．１μｇとカルモジュリン
発現プラスミドｐＴＣＡＬ７由来のＡｆ ｌ ＩＩ−Ｂ
ａｍ旧断片（３，３ｋｂ）０．５ μｇの結合反応を行
った。得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大
腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、アンピシリン耐性のコ
ロニーを得た。このコロニーの培養菌体よりプラスミド
ＤＮＡを単離し、ＤＮＡ塩基配列を決定して第２２図に
示す配列を含むことを確認した。このプラスミドをｐＫ
ＴＥＩＬ３１と呼ぶ。
ｐＫＴＥｒＬ３１上のＤＮＡによりコードされるｈｌＬ
３誘導体は実施例１の工程（２）で得られたｈｌＬ３１
であるが、第２２図に示すように、このプラスミドでは
大腸菌で高頻度で用いられるコドンが使用されている。
３誘導体は実施例１の工程（２）で得られたｈｌＬ３１
であるが、第２２図に示すように、このプラスミドでは
大腸菌で高頻度で用いられるコドンが使用されている。
このｐＫＴＥＩＬ３１を用いて、実施例７と同様に発現
および精製を行った結果、ｐＫＴＥＩＬ３１によって発
現されるポリペプチドは大腸菌内蛋白質の３０％以上で
あった。その精製サンプルについて実施例８にしたがっ
て活性測定を行った結果、実施例７で得られたｈｌＬ３
１と同等の活性を示した。
および精製を行った結果、ｐＫＴＥＩＬ３１によって発
現されるポリペプチドは大腸菌内蛋白質の３０％以上で
あった。その精製サンプルについて実施例８にしたがっ
て活性測定を行った結果、実施例７で得られたｈｌＬ３
１と同等の活性を示した。
［発明の効果］
本発明により、ｈＩＬ３よりもさらに活性の高い変異型
のｈｌＬ３誘導体ポリペプチドを提供することができた
。また、このｈｌＬ３誘導体は、遺伝子工学的手法によ
り形質転換された微生物を用いて安価にかつ大量に生産
することができる。したがって、このｈｌＬ３誘導体は
骨髄移植時の補助薬あるいは血小板増加薬等としてきわ
めて有望であり、医薬分野において大いに貢献すること
が期待できる。
のｈｌＬ３誘導体ポリペプチドを提供することができた
。また、このｈｌＬ３誘導体は、遺伝子工学的手法によ
り形質転換された微生物を用いて安価にかつ大量に生産
することができる。したがって、このｈｌＬ３誘導体は
骨髄移植時の補助薬あるいは血小板増加薬等としてきわ
めて有望であり、医薬分野において大いに貢献すること
が期待できる。
第１図は、ｈＩＬ３ポリペプチドのアミノ酸配列を示す
。 第２図は、部分変異ｈＩＬ３ポリペプチドのアミノ酸配
列を示す。 第３図は、ｈｌＬ３１ポリペプチドのアミノ酸配列およ
びこれをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 第４図は、ｈｌＬ３２ポリペプチドのアミノ酸配列およ
びこれをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 第５図は、ｈｌＬ３３ポリペプチドのアミノ酸配列およ
びこれをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 第６図は、ｈｌＬ３４ポリペプチドのアミノ酸配列およ
びこれをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 第７図は１．ｈｌＬ３５ポリペプチドのアミノ酸配列お
よびこれをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 第８図は、ｈｌＬ３６ボリペブチドのアミノ酸配列およ
びこれをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 第９図は、組換えプラスミドｐＴＫＩＬ３１の制限酵素
切断地図を示す。 第１０図は、組換えプラスミドｐＴＫＩＬ３２の制限酵
素切断地図を示す。 第１１図は、組換えプラスミドｐＴＫＩＬ３３の制限酵
素切断地図を示す。 第１２図は、組換えプラスミドｐＴＫＩＬ３４の制限酵
素切断地図を示す。 第１３図は、組換えプラスミドｐＴＫＩＬ３５の制限酵
素切断地図を示す。 第１４図は、組換えプラスミドｐＴＫｒＬ３６の制限酵
素切断地図を示す。 第１５図は、組換えプラスミドｐＴＫＩＬ３１の構築図
を示す。 第１６図は、ＣＭセファロースＦＦカラムによるｈｌＬ
３誘導体の溶出パターンを示す。 第１７図は、セファクリル８２００カラムによるｈｌＬ
３誘導体の溶出パターンを示す。 第１８図は、プラスミドｐｓＤＮ１を構築するために合
成したＤＮＡの塩基配列を示す。 第１９図は、プラスミドｐｃｃｓｓに含まれている、部
分変異ｈｌＬ３の一部をコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。 第２０図は、プラスミドｐＫＥ３を構築するために合成
したＤＮＡの塩基配列を示す。 第２１図は、プラスミドｐＫＥ３３３を構築するために
合成したＤＮＡの塩基配列を示す。 第２２図は、ｈＩＬ３１ポリペプチドのアミノ酸配列お
よびこれをコードするＤＮＡの塩基配列（大腸菌高発現
用）を示す。
。 第２図は、部分変異ｈＩＬ３ポリペプチドのアミノ酸配
列を示す。 第３図は、ｈｌＬ３１ポリペプチドのアミノ酸配列およ
びこれをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 第４図は、ｈｌＬ３２ポリペプチドのアミノ酸配列およ
びこれをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 第５図は、ｈｌＬ３３ポリペプチドのアミノ酸配列およ
びこれをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 第６図は、ｈｌＬ３４ポリペプチドのアミノ酸配列およ
びこれをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 第７図は１．ｈｌＬ３５ポリペプチドのアミノ酸配列お
よびこれをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 第８図は、ｈｌＬ３６ボリペブチドのアミノ酸配列およ
びこれをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 第９図は、組換えプラスミドｐＴＫＩＬ３１の制限酵素
切断地図を示す。 第１０図は、組換えプラスミドｐＴＫＩＬ３２の制限酵
素切断地図を示す。 第１１図は、組換えプラスミドｐＴＫＩＬ３３の制限酵
素切断地図を示す。 第１２図は、組換えプラスミドｐＴＫＩＬ３４の制限酵
素切断地図を示す。 第１３図は、組換えプラスミドｐＴＫＩＬ３５の制限酵
素切断地図を示す。 第１４図は、組換えプラスミドｐＴＫｒＬ３６の制限酵
素切断地図を示す。 第１５図は、組換えプラスミドｐＴＫＩＬ３１の構築図
を示す。 第１６図は、ＣＭセファロースＦＦカラムによるｈｌＬ
３誘導体の溶出パターンを示す。 第１７図は、セファクリル８２００カラムによるｈｌＬ
３誘導体の溶出パターンを示す。 第１８図は、プラスミドｐｓＤＮ１を構築するために合
成したＤＮＡの塩基配列を示す。 第１９図は、プラスミドｐｃｃｓｓに含まれている、部
分変異ｈｌＬ３の一部をコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。 第２０図は、プラスミドｐＫＥ３を構築するために合成
したＤＮＡの塩基配列を示す。 第２１図は、プラスミドｐＫＥ３３３を構築するために
合成したＤＮＡの塩基配列を示す。 第２２図は、ｈＩＬ３１ポリペプチドのアミノ酸配列お
よびこれをコードするＤＮＡの塩基配列（大腸菌高発現
用）を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、下記のアミノ酸配列を有するヒトインターロイキン
３ポリペプチドの一部のアミノ酸が、他のアミノ酸で置
換された変異型のヒトインターロイキン３誘導体。 【遺伝子配列があります】 （ただし式中、ＸはＳＥＲまたはＰＲＯ） ２、前記ヒトインターロイキン３ポリペプチドのＣ末端
側のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された請求項１記載
のヒトインターロイキン３誘導体。 ３、前記ヒトインターロイキン３ポリペプチドのＮ末端
側から第６４番目から第１３４番目のアミノ酸のうち少
なくとも１個のアミノ酸が他の種類のアミノ酸で置換さ
れた請求項１または２記載のヒトインターロイキン３誘
導体。 ４、前記ヒトインターロイキン３ポリペプチドのＮ末端
側から第６４番目、８３番目、８８番目、９９番目、１
１３番目、１２２番目、１２７番目、１３２番目、１３
４番目の９残基のアミノ酸のうち少なくとも１個以上が
他の種類のアミノ酸で置換された請求項１または２記載
のヒトインターロイキン３誘導体。 ５、前記ヒトインターロイキン３ポリペプチドのＮ末端
側から第６４番目、８３番目、８８番目、１１３番目、
１２２番目、１２７番目、１３２番目、および１３４番
目の８残基のアミノ酸がそれぞれＬＹＳ、ＰＲＯ、３Ｍ
ＥＴ、ＬＹＳ、ＧＬＵ、ＭＥＴ、ＧＬＵおよびＳＥＲの
アミノ酸で置換された請求項１または２記載のヒトイン
ターロイキン３誘導体。 ６、前記ヒトインターロイキン３ポリペプチドのＮ末端
側から９９番目、１１３番目、１２２番目、１２７番目
、１３２番目、および１３４番目の６残基のアミノ酸が
それぞれＡＲＧ、ＬＹＳ、ＧＬＵ、ＭＥＴ、ＧＬＵおよ
びＳＥＲのアミノ酸で置換された請求項１または２記載
のヒトインターロイキン３誘導体。 ７、請求項１〜６いずれか記載のヒトインターロイキン
３誘導体をコードするＤＮＡ。 ８、請求項７記載のＤＮＡを有する組換え体プラスミド
。 ９、請求項８記載のプラスミドにより形質転換された形
質転換微生物。 １０、請求項９記載の形質転換微生物を培養することに
より請求項１〜６いずれか記載のヒトインターロイキン
３誘導体を製造することを特徴とするヒトインターロイ
キン３誘導体の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8746890 | 1990-04-03 | ||
| JP2-87468 | 1990-04-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0463595A true JPH0463595A (ja) | 1992-02-28 |
Family
ID=13915737
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2279108A Pending JPH0463595A (ja) | 1990-04-03 | 1990-10-19 | ヒトインターロイキン３誘導体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0463595A (ja) |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995020977A1 (en) * | 1994-02-04 | 1995-08-10 | G.D. Searle & Co. | Co-administration of interleukin-3 mutant polypeptides with csf's for multi-lineage hematopoietic cell production |
| WO1995020976A1 (en) * | 1994-02-04 | 1995-08-10 | G.D. Searle & Co. | Co-administration of interleukin-3 mutants with colony stimulating factors |
| US5501962A (en) * | 1993-06-21 | 1996-03-26 | G. D. Searle & Co. | Interleuken-3 (IL-3) human/murine hybrid polypeptides and recombinant production of the same |
| US5604116A (en) * | 1992-11-24 | 1997-02-18 | G. D. Searle & Co. | Interleukin-3 (IL-3) multiple mutation polypeptides, recombinant production of the same, and corresponding therapeutic methods |
| US5738849A (en) * | 1992-11-24 | 1998-04-14 | G. D. Searle & Co. | Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them |
| US6017523A (en) * | 1995-06-06 | 2000-01-25 | G.D. Searle & Co. | Therapeutic methods employing mutant human interleukin-3 (IL-3) polypeptides |
| US6022535A (en) * | 1993-11-22 | 2000-02-08 | G. D. Searle & Company | Treatment of hematopoietic disorders with fusion proteins comprising multiply mutated interleukin-3 (IL-3) polypeptides and second growth factors |
| US6361977B1 (en) * | 1992-11-24 | 2002-03-26 | S. Christopher Bauer | Methods of using multivariant IL-3 hematopoiesis fusion protein |
| US6361976B1 (en) * | 1992-11-24 | 2002-03-26 | S. Christopher Bauer | Co-administration of interleukin-3 mutant polypeptides with CSF'S for multi-lineage hematopoietic cell production |
| US6403076B1 (en) * | 1992-11-24 | 2002-06-11 | S. Christopher Bauer | Compositions for increasing hematopoiesis with interleukin-3 mutants |
| US6413509B1 (en) * | 1992-11-24 | 2002-07-02 | S. Christopher Bauer | Methods of ex-vivo expansion of hematopoietic cells using interleukin-3 mutant polypeptides with other hematopoietic growth factors |
| US7091319B1 (en) * | 1992-11-24 | 2006-08-15 | Bauer S Christopher | IL-3 variant hematopoiesis fusion protein |
-
1990
- 1990-10-19 JP JP2279108A patent/JPH0463595A/ja active Pending
Cited By (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6030812A (en) * | 1992-11-24 | 2000-02-29 | G. D. Searle & Company | Fusion proteins comprising multiply mutated interleukin-3 (IL-3) polypeptides and second growth factors |
| US7091319B1 (en) * | 1992-11-24 | 2006-08-15 | Bauer S Christopher | IL-3 variant hematopoiesis fusion protein |
| US6051217A (en) * | 1992-11-24 | 2000-04-18 | G. D. Searle & Co. | Therapeutic uses of interleukin-3 (IL-3) multiple mutation polypeptides |
| EP1283264A3 (en) * | 1992-11-24 | 2004-03-10 | G.D. Searle & Co. | Interleukin-3 (IL-3) mutant polypeptides |
| US5604116A (en) * | 1992-11-24 | 1997-02-18 | G. D. Searle & Co. | Interleukin-3 (IL-3) multiple mutation polypeptides, recombinant production of the same, and corresponding therapeutic methods |
| US5677149A (en) * | 1992-11-24 | 1997-10-14 | G.D. Searle & Co., | Interleukin-3 (IL-3) mutant polypeptides and their recombinant production |
| US5738849A (en) * | 1992-11-24 | 1998-04-14 | G. D. Searle & Co. | Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them |
| US5772992A (en) * | 1992-11-24 | 1998-06-30 | G.D. Searle & Co. | Compositions for co-administration of interleukin-3 mutants and other cytokines and hematopoietic factors |
| US5817486A (en) * | 1992-11-24 | 1998-10-06 | G. D. Searle & Co. | Recombinant human interleukin-3 (IL-3) multiple mutation polypeptides |
| US5858347A (en) * | 1992-11-24 | 1999-01-12 | G. D. Searle & Co. | Therapeutic methods using fusion proteins between interleukin-3 (IL-3) variants and other hematopoietic factors |
| US5997860A (en) * | 1992-11-24 | 1999-12-07 | G. D. Searle & Co. | Ex-vivo expansion of stem cells using combinations of interleukin-3 (IL-3) variants and other cytokines |
| US5997857A (en) * | 1992-11-24 | 1999-12-07 | G. D. Searle & Co. | Co-administration of interleukin-3 mutants with colony stimulating factors |
| US6479261B1 (en) | 1992-11-24 | 2002-11-12 | Pharmacia Corporation | Methods of using interleukin-3 (IL-3) mutant polypeptides for ex-vivo expansion of hematopoietic stem cells |
| US6458931B1 (en) | 1992-11-24 | 2002-10-01 | S. Christopher Bauer | Interleukin-3 (IL-3) multiple mutation polypeptides |
| US6440407B1 (en) * | 1992-11-24 | 2002-08-27 | G. D. Searle | Methods of ex-vivo expansion of hematopoietic cells using interleukin-3 (IL-3) multiple mutation polypeptides |
| US6074639A (en) * | 1992-11-24 | 2000-06-13 | G. D. Searle & Co. | Ex vivo expansion of hematopoietic cells using interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins |
| US6413509B1 (en) * | 1992-11-24 | 2002-07-02 | S. Christopher Bauer | Methods of ex-vivo expansion of hematopoietic cells using interleukin-3 mutant polypeptides with other hematopoietic growth factors |
| US6093395A (en) * | 1992-11-24 | 2000-07-25 | G. D. Searle & Co. | Co-administration of interleukin-3 mutant polypeptides with CSF's for multi-lineage hematopoietic cell production |
| US6132991A (en) * | 1992-11-24 | 2000-10-17 | G. D. Searle & Co. | Human interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins |
| US6153183A (en) * | 1992-11-24 | 2000-11-28 | G. D. Searle & Company | Co-administration of interleukin-3 mutant polypeptides with CSF's or cytokines for multi-lineage hematopoietic cell production |
| US6361977B1 (en) * | 1992-11-24 | 2002-03-26 | S. Christopher Bauer | Methods of using multivariant IL-3 hematopoiesis fusion protein |
| US6361976B1 (en) * | 1992-11-24 | 2002-03-26 | S. Christopher Bauer | Co-administration of interleukin-3 mutant polypeptides with CSF'S for multi-lineage hematopoietic cell production |
| US6379662B1 (en) * | 1992-11-24 | 2002-04-30 | Mckearn John P. | Co-administration of interleukin-3 mutant polypeptides with CSF's for multi-lineage hematopoietic cell production |
| US6403076B1 (en) * | 1992-11-24 | 2002-06-11 | S. Christopher Bauer | Compositions for increasing hematopoiesis with interleukin-3 mutants |
| US5501962A (en) * | 1993-06-21 | 1996-03-26 | G. D. Searle & Co. | Interleuken-3 (IL-3) human/murine hybrid polypeptides and recombinant production of the same |
| US5543141A (en) * | 1993-06-21 | 1996-08-06 | G.D. Searle & Co. | Therapeutic methods using interleukin-3 (IL-3) human/murine hybrid polypeptides |
| US6022535A (en) * | 1993-11-22 | 2000-02-08 | G. D. Searle & Company | Treatment of hematopoietic disorders with fusion proteins comprising multiply mutated interleukin-3 (IL-3) polypeptides and second growth factors |
| WO1995020976A1 (en) * | 1994-02-04 | 1995-08-10 | G.D. Searle & Co. | Co-administration of interleukin-3 mutants with colony stimulating factors |
| EP1199080A3 (en) * | 1994-02-04 | 2003-11-26 | G.D. Searle & Co. | Co-administration of interleukin-3 mutants with colony stimulating factors |
| WO1995020977A1 (en) * | 1994-02-04 | 1995-08-10 | G.D. Searle & Co. | Co-administration of interleukin-3 mutant polypeptides with csf's for multi-lineage hematopoietic cell production |
| US6017523A (en) * | 1995-06-06 | 2000-01-25 | G.D. Searle & Co. | Therapeutic methods employing mutant human interleukin-3 (IL-3) polypeptides |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2125985C (en) | Stem cell inhibiting proteins | |
| JP2003501035A (ja) | 安定性に関して改変されたサイトカイン | |
| JPH10503371A (ja) | 新規化合物 | |
| JPS61224985A (ja) | 酸化耐性ミユ−テイン | |
| JPH0463595A (ja) | ヒトインターロイキン３誘導体 | |
| JPH05244977A (ja) | 組換え蛋白質を活性化する方法 | |
| KR0159107B1 (ko) | 우레이트 산화효소 활성 단백질, 이 단백질을 암호화하는 재조합 유전자, 발현 벡터, 미생물 및 형질전환세포 | |
| JPS63267296A (ja) | インタ−フエロン結合体およびその製造方法 | |
| JPH10262686A (ja) | ポリペプチド | |
| CN116375888A (zh) | 一种融合蛋白及其制备方法和用途 | |
| HUT56134A (en) | Process for producing and purifying recombinant human interleukin-3 and its muteins | |
| EP0427189A1 (en) | Modified forms of human erythropoietin and DNA sequences encoding genes which can express them | |
| KR0123892B1 (ko) | 인간의 콜로니 자극 인자 | |
| JPH07106159B2 (ja) | タンパク質抗ガン剤 | |
| JP2002534089A (ja) | 顆粒球形成活性を有するｇ−ｃｓｆ変異体相当核酸およびタンパク質 | |
| WO2004019856A9 (en) | Glycosylated human interferon alpha isoform | |
| JPS5841849A (ja) | ヒト白血球インタフエロン | |
| Kang et al. | High level expression and simple purification of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in E. coli | |
| JP2990162B2 (ja) | ヒト酸性線維芽細胞成長因子の組成物、その製法、ｄｎａ構築物および酵母宿主細胞 | |
| JPH04182498A (ja) | ポリペプチド | |
| JP3251592B2 (ja) | Ｉｌ―１６活性を有するプロセスされたポリペプチド、それらの製法、及びそれらの使用 | |
| EP0223230B1 (en) | Process for producing cell having high productivity of protein and process for preparing protein by using the cell | |
| WO2024046280A1 (zh) | 一种聚乙二醇修饰的il-21衍生物及其应用 | |
| JP2015513400A (ja) | １→２リーディングフレームシフトを減少させるための方法 | |
| JP2579747B2 (ja) | ヒトインタ−ロイキン１をコ−ドする新規ｄｎａ |