JPS63267296A - インタ−フエロン結合体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は医薬品あるいは試薬として用いることができる
、β型インターフェロンとγ型インターフェロンとを連
結してなるインターフェロン結合体およびその製造方法
に間する。

〔従来の技術〕

インターフェロンは抗腫瘍作用、抗ウィルス作用をはじ
めとする多面的生物活性を有するタンパク質であり、そ
の臨床応用が注目を集めている。

インターフェロンはその誘導物質、産生細胞あるいは抗
原性によりα、β、γ型の三種に公葬されるが、それぞ
れ遺伝子の構造、タンパク質としての物性、生物活性に
違いのあることが知られている〔小林茂保編“インター
フェロンの科学”講談社＜１９８５）　　：］　。

β型インターフェロン（ＩＦＮ−β）はおもに線維芽細
胞をウィルスや二重鎖ＲＮＡなどの核酸を用いて誘発し
、産生される糖タンパク質であり、ｐＨ２処理に安定、
５６℃処理に不安定な性質を有する。β型インターフェ
ロンを暗号化する遺伝子はすでに単離され（Ｔａｎｉｇ
ｕｃｈｉら（１９７９）　Ｐｒｏｃ、　Ｊｐｎ、　Ａｃ
ａｄ、　　５５．　Ｓｅｒ、　Ｂ、　４６４−４６８　
）　、塩基配列およびアミノ酸配列が明らかにされてお
り、さらに得られたｃＤＮＡを利用して、大腸菌を宿主
とする生産系が開発されている（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら
　　′（１９８０）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７７、５２３０−５２３３
　；　ＧＯｅｄｄｅｌら＜１９８０）　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　ＡＣｉｄＳ　Ｒｅｓ。

８、４０５７−４０７４　；　Ｄｅｒｙｎｃｋら（１９
８０）　Ｎａｔｕｒｅ　２８７、　１９３−１９７　）
。

γ型インターフェロン（ＩＦＮ−γ）はおちにＴリンパ
球をマイトジェン処理することにより誘発される糖タン
パク質であり、ｐＨ２処理に対し不安定な性質を有する
。γ型インターフェロンについても暗号化する遺伝子が
単離され塩基配列が明らかにされるとともに、大腸菌を
用いた生産系が構築されている（　Ｄｅｖｏｓら（１９
８２）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　１
０．２４８７−２５０１　　ＨＧｒａｙら＜１９８２）
　Ｎａｔｕｒｅ　２９５．５０３−５０８　）。また天
然型についてアミノ酸配列が報告されている（　Ｒｉ　
ｎｄｅｒｋｎｃｃｈｔら（１９８４）Ｊ、　　Ｂｉｏｌ
、　　Ｃｈｅｍ、　　２５９．　６７９０−６７９７　
：Ｊ。

α、β、γ型インターフェロンの中で、α、β型は従来
■型インターフェロンと呼ばれていたもので、アミノ酸
配列で２９％の一致を示し高い構造類似性が示唆されて
おり（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら（１９８０）Ｇｅｎｅ　　
１０．１１−１５　）　、さらにその認識するレセプタ
ーも同じであるといわれている。このためα、β型共存
下での作用は相加的である。これに対しγ型インターフ
ェロンは従来■型と呼ばれていたものであり、■型との
アミノ酸配列類似性は低く、その認識するレセプターも
異なるといわれている（　Ｂｒａｎｃａら（１９８１）
　Ｎａｔｕｒｅ　２９４．　７６８−７７０　）　。そ
のため■型、■型ではそれぞれの示す抗ウイルススペク
トル、抗細胞増殖効果のスペクトルは異なっており〔小
林茂保編“インターフェロンの科学′”講談社（１９８
５）　２２−６８　）また創作用において相乗効果を示
すことが認められている（ＣＺａｒｎｉｅＣｋｉら＜１
９８４）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、４９．４９０−４９６　
；　ＦｌｅｉｓｈｍａｎｎＪｒ、ら（１９８４）　Ｊ、
　ＩＦＮ、　ＲＣ３，４，２６５−２７４、特開昭５９
−９８０１９）。

インビトロにおいては既存のβ、γ型インターフェロン
を混合すればこの相乗作用が示されるが、インビボにお
いてはそれぞれのインターフェロンの体内動態の異なる
ことが予測され、二種のインターフェロンがその作用部
位に存在するかどうかは疑問があり、すなわちインビト
ロで示される相乗作用がインビボで示されるかについて
疑問視される。

上記の欠点を解消するためβ、γ型インターフェロンを
一つのポリペプチドに連結させ、β、γ型温合物による
相乗作用を単独のポリペプチドに発揮させることができ
れば、体内動態の問題も解消され有用なことと考えられ
る。またこのような連結されたインターフェロンは一つ
のポリペプチドに元のβ、γ型インターフェロン混合物
の相乗作用を示すため、分子あたりの作用が天然に存在
するインターフェロンより増強されることとなり、作用
の強いインターフェロンを得ることが可能と考えられる
。

また異なる作用スペクトルを持つβ、γ型インターフェ
ロンの活性を一つのポリペプチドに表現させれば、作用
スペクトルの広いポリペプチドを作製することができる
と考えられる。しかしまだこのようなβ、γ型インター
フェロンを一つのポリペプチドに連結させる試みは成さ
れていない。

元来二つの異なる作用をしていたポリペプチドを結合さ
せ、一つのポリペプチドに元に二つの機能を持たせる例
はすでに知られている（　Ｙｏｕ　ｒｎｏら（１９７０
）　Ｎａｔｕｒｅ　２２８．８２０−８２４　；　Ｎｅ
ｕｂｅｒｇｅｒら（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３１２
．６０４−６０８　；　Ｂｕｌｏｗら（１９８５）Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３　　、８２１−８２３）　
。また、インシュリンを連結しポリペプチドの安定化を
はかった例も報告されている（Ｓｈｅｎ、　Ｓｈｉ−Ｈ
ｓｉａｎｇ　（１９８４）　ＰｒＱＣ，Ｎａｔｌ、　　
八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　　８１．　４６
２７−４６３１　　〕　。

他の例としてγ型インターフェロンとインターロイキン
−２を連結、一つのポリペプチドに表現し、再活性を発
現させた例が開示されているく特開昭６０−２４１８９
０＞。しかしながらβ、γ型インターフェロンを一つの
ポリペプチドに発現させ、作用スペクトルが広く、かつ
作用の強いインターフェロンを製造した例はまだ知られ
ていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、従来β型インターフェロン、γ型インターフ
ェロンとして独立に産生されていたインターフェロンポ
リペプチドを一つのポリペプチドに連結し、β、γ型イ
ンターフェロンがそれぞれ保持していた抗ウィルス作用
、抗細胞増殖作用などの生物活性を単独のポリペプチド
で発揮する作用スペクトルの広いインターフェロン結合
体を製造するものであり、かつ、β、γ型インターフェ
ロン混合体の示す相乗作用を単独のポリペプチドで発揮
する作用の強力なインターフェロン結合体を提供するも
のである。

〔問題を解決するための手段〕

本発明はβ型インターフェロンとγ型インターフェロン
とを連結してなるインターフェロン結合体、および該結
合体を暗号化する塩基配列を有し、該結合体の発現のた
めの制御部位を酊加した組換え体ＤＮＡによる形質転換
体を用いた該結合体の製造方法に関する。

本発明におけるβ型インターフェロン、γ型インターフ
ェロンとは、それぞれのインターフェロン特有の活性を
有するものであれば全てを包含する。そのポリペプチド
部分は、たとえばγ型インターフェロンにおいては、Ｎ
末端にアミノ酸残基が三残基付加されたもノ〔Ｇｒａｙ
ら（１９８２）　Ｎａｔｕｒｅ２９５　、５０３−５０
８　〕や、Ｃ末端部の欠損しているもの（Ｒｏｓｅら（
１９８３）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２１５　、２７
３　）が知られているが、このようにアミノ酸残基が付
加あるいは欠損しているものも本発明に含まれる。

またアミノＭ残基の一部置換したγ型インターフェロン
も開示されているが（特開昭５９−９３０９３号公報、
特開昭５９−１６７５９６号公報）、それぞれのインタ
ーフェロン特有の活性を有しておればこれらも本発明に
包含される。好ましくは、β型インターフェロンについ
ては第１図に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドがよく、γ型インターフェロンについては第２図のも
のがよい。

これらβ、γ型インターフェロンの連結Ｋｔ序は特に限
定しない。すなわち、β型のポリペプチドが新しい結合
ポリペプチドのＮ末端側に、γ型がＣ末端側に配置され
てもよいし、またその逆でもよい。

β、γ型インターフェロンの連結部位について、β、γ
型のポリペプチドを直接連結してもよいし、両者の間に
スペーサーペプチドを介して連結してもよい。スペーサ
ーペプチドを介して酵素を連結した例として、β−ガラ
クトシダーゼのサブユニットを連結した例が報告されて
いるが〔Ｋｕｓｈｉｎｋｅら＜１９８５）　ＥＭＢＯＪ
、　４　、１０６７−１０７３　）　、この例に示され
るように親水性のアミノ酸残基を多く含むポリペプチド
により連結されることが好ましい。

さらにスペーサーとしては、自然界に存在するタンパク
質のドメイン間を繋ぐポリペプチドを利用することもで
きる。スペーサーペプチドは通常アミノ酸の数が５０以
下のものが用いられ、好ましくはイムノグロブリン分子
のスイッチペプチドと呼ばれるペプチドがよく、さらに
Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｙｓ−Ａｌａ−八１ａ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈ
ｒで示されるペプチドが好ましい。

本発明では、β型インターフェロンとγ型インターフェ
ロンとを連結してなる構造体をインターフェロン結合体
と呼ぶ。特にＮ末端側にβ型インフェロン、Ｃ末端側に
γ型インターフェロンのポリペプチドを連結したものを
インターフェロンβγ結合体（ＩＦＮ−βγ）とし、そ
の逆をインターフェロンγβ結合体（ＩＦＮ−γβ）と
呼ぶ。

また各インターフェロンの連結部にスペーサーペプチド
を含むものをそれぞれインターフェロンβＣγ結合体（
ＩＦＮ−βＣγ）あるいはインターフェロンγＣβ結合
体（ＩＦＮ−γＣβ）と呼ぶこととする。

インターフェロン結合体を得る手段としては、有機合成
によりアミノ酸を付加し合成する方法、遺伝子操作の手
法を用いて、ＤＮＡレベルで目的のポリペプチドを発現
するよう設計し、適当な形質転換体により発現させる方
法がある。本発明において、目的のポリペプチドを得る
ための方法は特に限定されるものではないが、遺伝子操
作の手法を用いた方がより容易に目的のポリペプチドを
得ることができるため好ましい。

遺伝子操作の手法を用いてインターフェロン結合体を得
るなめには、それぞれのβ、γ型インターフェロンを暗
号化する塩基配列を直接あるいはスペーサーペプチドを
暗号化する塩基配列を介して連結した構造を持つＤＮＡ
に、発現のための適当な制御部位を結合することにより
組換え体内での発現が達成される。

インターフェロン結合体を暗号化する塩基配列としては
、目的のポリペプチドを暗号化するものであれば特に限
定されない。すなわち、あるアミノ酸に対するコドンが
複数個存在する場合、いずれを用いてもかまわない。好
ましくはβ型あるいはγ型インターフェロンｃＤＮＡの
塩基配列（Ｔａｎ　ｉｇｕｃｈ　ｉ　ら（１９８０）　
Ｇｅｎｅ　　１０．１１−１５　　ＨＤｅｖ。

Ｓら（１９８２）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、　　１０．２４８７−２５０１〕に一致することが
好ましい。インターフェロン結合体を暗号化する塩基配
列を得る手段としてＤＮＡ合成による方法、あるいはβ
、γ型インターフェロンを暗号化する遺伝子を取り出し
連結する方法が行い得るし、両者を組み合わせた方法で
もよい。ＤＮＡ合成により目的の塩基配列を得る方法は
、すでに報告されている手法ＣＥｄｇｅら（１９８１）
　Ｎａｔｕｒｅ　２９２．７５６−７６２　　；　Ｔａ
ｎａｋａら（１９８３）　Ｎｕｃｉｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ、１１．１７０７−１７２３　〕に従えば達成
される。β型あるいはγ型インターフェロンを暗号化す
る遺伝子としては、いわゆる染色体上の遺伝子とｃＤＮ
Ａを用いることができるが、ｃＤＮ、Ａを用いる方が好
ましい。それぞれのｃＤＮＡは公知の方法に従って単離
することができる（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　ら（１９７９
）　Ｐｒｏｃ、　Ｊｐｎ、八ｃａｄ、　　互５．　Ｓｅ
ｒ、　Ｂ、　　４６４　　；　　Ｇｏｅｃｌｄｅｌ　　
ら　（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒ
ｅｓ。

８、４０５７−４０７４　；　Ｄｅｒｙｎｃｋら（１９
８０）　Ｎａｔｕｒｅ　２８７、１９３−１９７　ＨＤ
ｅｖｏｓら（１９８２）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ、　　１０．　２４８７−２５０１　　ＨＧｒ
ａｙら（１９８２）　Ｎａｔｕｒｅ　２９５、５０３−
５０８　）。また、これらの文献から公知の塩基配列の
一部をプローブとして、公知の方法〔０］（ａｙａｍａ
ら（１９８３）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１
ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ。

ｇｙ３　　、２８０：］により調製したｃＤＮＡライブ
ラリーよりコロニーハイブリダイゼーションにより運択
し得ることもできる。

これらのｃＤＮＡ配列からインターフェロン結合体を暗
号化する塩基配列を得るには、それぞれのｃＤＮＡを適
当な制限酵素により消化した後、そのまま、あるいはマ
ングビーンヌクレアーゼやＤＮＡポリメラーゼエのフレ
ノウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼなどによって平滑末
端を構成させた後結合すればよい。好ましくは制限酵素
処理により欠失したポリペプチドを暗号化する塩基配列
を合成りＮＡにより補って両ｃＤＮＡを連結すれば、完
全な長さのβ型インターフェロンとγ型インターフェロ
ンポリペプチドが連結されることになりよい。また、こ
の時スペーサーペプチドを暗号化する塩基配列を両ｖｊ
造遺伝子の間に挿入しておくこともできる。また連結の
他の方法として、あらかじめβ、７−型インターフェロ
ンの構造遺伝子の５′あるいは３′末端部位に合成りＮ
Ａを利用する手法により（Ｇｏｅｄｄｅ　ｌら（１９７
９）　Ｎａｔｕｒｅ　２８１、５４４−５４８　）制限
酵素部位を導入しておき、それらを消化、平滑末端化な
どの処理後、側構造遺伝子を連結してもよい。要はβ、
γ型インターフェロン構造道伝子の読み取り相が一致し
て連結されればどのような方法でもよい。

上記のインターフェロン結合体を暗号化する塩基配列を
利用してポリペプチドを生産させるには、動植物細胞、
酵母、大腸菌が用いられる。大腸菌内で前記の塩基配列
よりポリペプチドを発現させるためには、転写開始のた
めのプロモーター配列および翻訳のためのＳＤ配列、Ａ
ＴＧコドンをその前部に付与する必要がある。プロモー
ター配列としては、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡなどの遺
伝子のプロモーターが知られているが、プロモーターと
しての活性を有する配列であればどのようなものでもよ
い。好ましくは［叩プロモーターのような強いプロモー
ターを用いることがよい。ＳＤ配列はりボゾームＲＮＡ
の結合部位であり、翻訳には必須の部位である。本発明
においてはＳＤ配列についても特に限定するものではな
い。このように構成されたポリペプチド発現のための制
御部位に翻訳のための信号ＡＴＧコドンを付与したイン
ターフェロン結合体を暗号化する塩基配列を連結するこ
とによりポリペプチド発現は達成される。

ＡＴＧコドンの付与は公知の方法（ＧＯｅｄＣＩｅ　ｌ
ら（１９７９）　Ｎａｔｕｒｅ　２８１．５４４−５４
８　）に従い合成りＮＡを用いて行い得る。また、β型
インターフェロンノ場合は公知の方法（Ｔａｎｉｇｕｃ
ｈｉら（１９８０）　ＰｒＱＣ，Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７、５２３０−５２’３３　
）によりＡＴＧコドンを露出できる。

ここで得られたＤＮＡを宿主に導入するには、ベクター
ＤＮＡを利用する。大腸菌で用いられるベクターＤＮＡ
としてはＰＢＲ３２２、ｐｓｃｌｏｌなどに代表される
プラスミドＤＮＡ、およびλファージのようなファージ
ＤＮＡが挙げられるがいずれをも用い得る。このベクタ
ーＤＮＡと前記のインターフェロン結合体を発現するよ
う構成されたＤＮＡを連結し、公知の方法（Ｈａｎｉａ
ｔｉｓらＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ″Ｃｏ１
ｄ　Ｓｐｒｕｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　（１９８２）　ｐ２５０−２５５）に従い、大腸
菌とＤＮＡを接触させれば形質転換体を得ることができ
る。

形質転換された大腸菌株について、天然培地、半合成培
地、合成培地を用いて培養することによりインターフェ
ロン結合体の生産は達成される。

ここでの培養には液体培地が適しており、好ましくは、
たとえば発現系にｔｒｐプロモーターを用いた場合には
、インドールアクリル酸を培養途中に加え、インターフ
ェロンの生産を誘導することがよい。他のプロモーター
を用いる場合も、それぞれ特有の誘尋剤を用いることが
好ましく、これによりインターフェロン結合体の生産量
は増大する。

以上のごとく得られたインターフェロン結合体を生産す
る大腸菌を公知の方法〔堀江武−１山下仁平編集＝「蛋
白質・酵素の基礎実験法」南江堂（１９８１）　３−７
　）　、たとえば酵素処理、超音波処理、播漬法、加圧
処理などにより破砕することにより粗インターフェロン
結合体抽出液が得られる。グアニジン塩酸塩、尿素など
による処理（Ｄａｖｉｓら（１９８３）　Ｇｅｎｅ　　
２１．２７３−２８４　）と組み合わせれば抽出効率は
向上し好ましい。

さらに得られた粗抽出液から公知の方法〔堀江武−１山
下仁平編集＝「蛋白質・酵素の基礎実験法」南江堂（１
９８１）　　１８−３８２　）　、たとえば塩析、限外
濾過、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティークロマト
グラフィー、電気泳動等の方法、あるいはこれらを組み
合わせることによって、高純度のインターフェロン結合
体を得ることが゛できる。

動物細胞を用いてインターフェロン結合体を発現させる
には、動物細胞内で機能するプロモーターの制御下にイ
ンターフェロン結合体を暗号化する塩基配列を配置する
必要がある。動物細胞内で機能するプロモーターの例と
して、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモ
ーター、ＨＢウィルス遺伝子のプロモーター、ＭＭＴＶ
プロモーター、チミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター
、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター、熱シヨツク
蛋白のプロモーター、インターフェロン遺伝子のプロモ
ーターが挙げられる。これらプロモーターの制御下に、
大腸菌の場合と同様の方法でインターフェロン結合体を
暗号化する塩基配列を連結すればよい。プロモーターは
一種でも二種以上併用してもよい。なお、真核細胞型プ
ロモーターの上流に、転写効率を高めると言われている
Ｈａｒｂｅｙマウス肉腫ウィルスの５’ＬＴＲのエンハ
ンサ−配列やＳＶ４０のエンハンサ−配列を挿入しても
よい。好ましくは、細胞外分泌のためのシグナルペプチ
ドを暗号化する塩基配列を、インターフェロン結合体を
暗号化する塩基配列の前部に付加しておけば、ポリペプ
チドは培養上清に生産される。

ここで得られたＤＮＡを動物細胞に導入するなめ大量に
調製するには、大腸菌における複製開始点と薬剤耐性因
子を連結しておくと有用である。

複製開始点としては、コリシンＥ１プラスミド由来のも
の、たとえばｐＢＲ３２２およびこれに類縁のプラスミ
ドが望ましいが、これに限定されるものではない。薬剤
耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性、テトラサイク
リン耐性、カナマイシン耐性などを担う遺伝子が例とし
て挙げられる。

また、宿主細胞内での自律増殖が可能な複製開始点、た
とえばＳＶ４０、ポリオーマウィルスの複製開始点を連
結しておくとよい。これらのＤＮＡ断片を連結しインタ
ーフェロン結合体発現ベクターが得られれる。

ベクターＤＮＡの調製は一最的な方法で行うことができ
る（Ｔ、Ｈａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ｐ８６〜９６．１９８２
）。

ベクターＤＮＡを導入する動物細胞としては、ヒト、サ
ル、チャイニーズハムスター、マウス等の細胞を用いる
ことができるが、目的物がヒトインターフェロン結合体
である場合にはヒト細胞を用いることが望ましい。ヒト
細胞としては、産生される糖付加ポリペプチドで増殖阻
害のかからないものが用いられる。好ましいヒト細胞は
、ヒト肺癌由来細胞、特にＰＣ８およびＰＣ１２（Ｈ，
Ｋｉｎｊｏ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、
　３９．１５．１９７９）である。

ベクターＤＮＡの細胞への導入は公知のリン酸カルシウ
ム法により行うことができる（　Ｆ、　Ｌ、　Ｇｒａｈ
ａｍ　ｅｔ　ａｔ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　５４．５３
６．１９７３　）。

インターフェロン結合体発現プラスミドが導入された細
胞株を得るには、たとえばこのベクターを０４１８耐性
遺伝子発現ベクターｐｓＶ２ｎｅ。

（Ｐ、Ｊ、５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｈｏ
１．Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、、　１３２７、１９８２
　）あるいはｐＮＥＯ５’　　（Ｈ，Ｌｕ５ｋｙｅｔａ
ｌ、　ＣＱＩ＋、　３６　３９１．１９８４＞とともに
導入すれば、形質転換されなかった細胞が生き残れない
Ｇ４１８を含む選択培地で生育できるため容易に識別で
きる。

以上のようにして得られた形質転換体を、たとえば牛胎
児血清を含む培地で培養すればインターフェロン結合体
は培養上清に回収され、先に述べた方法により精製され
る。このようにして得られるインターフェロン結合体は
糖鎖を伴なうポリペプチドである。

上記の操作により得られたインターフェロン結合体は、
抗ヒトβ型インターフェロン抗体、抗ヒトγ型インター
フェロン抗体と結合することから、両者の抗原性を有し
ている。また各々の抗体による中和試験から、β、γ型
インターフェロン両方の活性を一つのポリペプチドで表
現していることが示されている。

〔実　施　例〕

以下に本発明の具体的な実施例を示す。実施例中に示さ
れる基本的な遺伝子操作の手法は、“Ｈｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　ｃｉｏｎｉｎｇ　”　［：Ｌｌａｎｉａｔｉｓら（
１９８２）　Ｃｏ１ｄ　ＳＤｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　ｃ
ａｂｏｒａｔｏｔｙ　）に従った。

本発明の具体例を示す前に、本発明の構成のために必要
なヒトβ型インターフェロン、ヒトγ型インターフェロ
ン発現プラスミドについて参考例として簡単に述べる。

すでに報告されている方法〔呑口＜１９８２＞生化学５
４．３６３−３７７　）に従い作製したヒトβ型インタ
ーフェロン発現プラスミドｐＴｕＩＦＮβ−５をＨｉｎ
ｄｌＩＩ消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断
片処理により平滑末端とし、ＢｇｌＩ［リンカ−を連結
、ＢｇｌＩＩ消化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
自己環化させプラスミドｐＹ〇−１０を得た。ｐＹｏ−
１０を５ａｌＩ、Ｃ１ａ工消化し、アガロースゲル電気
泳動により約８３０ｂｐのＤＮＡ断片を分取した。この
ＤＮＡ断片を特開昭６１−１９４８７号公報に記載され
ているプラスミドｐ６ｈｕ７−Ａ２のＣ１ａＩ−３ａｌ
Ｉ部位間に挿入した構造を持つプラスミドがｐＫＭ６で
ある。（第３図） ヒト扁桃由来リンパ球をＰＨＡ　（フィトヘモアグルチ
ニン）とＴ　Ｐ　Ａ　（１２−ｏ　−ｔｅｔｒａｄｅｃ
ａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｒ−１３−ａｃｅｔａｔｅ　）
で処理し、ヒトγ型インター　７　ｘ　Ｄ　’ｊ生産を
誘導した後〔ＶｉｌＣｅｋら＜１９８３）ｒｎｒｅｃｔ
；ｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３４　１３１）　、
細胞よりｍＲＮＡを調製しな。ｍ　ＲＮ　Ａの調製とｃ
ＤＮＡの調製およびプラスミドへのクローニングは、公
知の方法（Ｏｋａｙａｍａら（１９８３）　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌ　１ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ　　３　、２８０　）に従った。得られなＣＤＮＡラ
イブラリーの中から、公知のヒトγ型インターフェロン
ｔＲ造遺伝子（：　Ｇｏｃｄｄｅ　ｌらＮａｔｌＪｒｅ
（１９８２）飢５　．５０３−５０９　）の３′末端近
傍に対応する５′−八ＧＧＡＣＡＡＣＣＡＴＴＡＣＴ　
−３’の配クリを有する合成りＮＡをプローブとしてコ
ロニーハイブリダイゼーションを行い、ヒトγ型インタ
ーフェロンｃＤＮＡを有するプラスミドｐＩＦＮ−γ１
５を得た。次にｐＩＦＮ−γ１５をＮ　ｄ　ｅ　■、Ｂ
ａｍＨＩ消化後、アガロースゲル電気泳動により約０．
９ｋｂのＤＮＡ断片を分取しな。また５′−ＣＧＡＴＧ
ＣＡＧＧＡＣＣＣＡ−３”　、５　’　−ＴＡＴＧＧＧ
ＴＣＣＴＧＣＡＴ−３′のＤＮＡオリゴマーを合成し、
５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン
酸化した後、それぞれ約３ｐｍｏｌｅ／μｍとなるよう
に混合し、６５℃、３分間加熱、急冷しな後、再度６５
°Ｃで３分間加熱し、室温に放置することにより徐々に
冷却させ、アニーリングを行った。このＤＮＡオリゴマ
−７ｐｍｏｌｅ　、　ｐ　Ｉ　ＦＮ７−１５のＮｄｅニ
ーＢａｍＨＩ断片０．３ｐｍｏｌｅおよび（１）で示し
たｐＫＭ６を、ｃｌａＩ、ＢａｍＨＩ消化後ア消化−ア
ガロースゲル電気泳動取した約４２００ｂｐのＤＮＡ断
片０．１ｐｍｏｌｅを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結した後、Ｅ、ｃ。

１　ｉ　　ＭＣ１０６１（ＣａｓａｄａｂａｎらＪ、　
Ｉ’ＩＯ１，Ｂｉｏｌ、　　＜１９８０）　１３釘、　
１７９−２０７　）を形質転換しな。アンピシリン耐性
で選択した形質転換株について、５′＝Ｔ八ＴＧＧＧＴ
ＣＣＴＧＣ八Ｌ−３’ＤＮＡオリゴマーをプローブとし
てコロニーハイブリダイゼーションを行い、ヒトγ型イ
ンターフェロン発現プラスミドｐ６ｈｕｒ−Ｎｌ　（第
４図）を得な。

次にβおよびγ型インターフェロンｃＤＮＡを連結する
ために、それぞれの閘逍選伝子の５′末端、３′末端に
制限酵素部位を導入したプラスミドを作製した。

３　　　ＫＭ６−ｃｘｈｏの一コニ プラスミドｐＫＭ６−ｃｘｈｏの構造を第５図に示す。

ｐＫＭ６をＢｓ　ｔＥＩＩ、Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ消化し、
（２）に示した方法に準じて作製したアダプターＤＮＡ ＧＴＴＡＣＣＴＣＣＧＡＡＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＡＧΔ
ＧＧＣＴＴＴＧＡＧＣＴＣＧ八ＣＴＣＴＡＧを連結し、
プラスミドｐ　Ｋ　Ｍ　６−　ｃ　ｘ　ｈ　ｏを得たへ
ｐ　Ｋ　Ｍ　６−　ｃ　ｘ　ｈ　ｏをｘｈｏＩ消化し突
出した塩基を削りとることにより、ヒトβ型インターフ
ェロンのＣ末端アミノ酸アスパラギンを暗号化するＡＡ
Ｃが露出されることになる。

４　　６ｈｕ　　Ｎ１−ＣＫ　　ｎの　−１ニブラスミ
ドｐ６ｈｕγＮ１−ＣＫｐｎの構造を第６図に示す。ｐ
６ｈｕ７−ＮｌをＣＬａＩ、ＢａｍＨＩ消化し、アガロ
ースゲル電気泳動により約４２００ｂｐのＤＮＡ断片と
、約１０５０ｂＰのＤＮＡ［！？ｉ片を分取する。１０
５０ｂｐのＣ１ａＩ−ＢａｍＨＩ断片をさらにＨｉｎｆ
Ｉ消化し、アガロースゲル電気泳動により４００ｂＰの
ＤＮＡ断片を分取した。約４２００ｂｐのＣ１ａＩ−Ｂ
ａｍＨ工断片、４００ｂｐのＣ１ａＩ−ＨｉｎｆＩ断片
と（２）に示した方法に準じて６本のＤＮＡオリゴマー
より作製した下に示すＤＮＡアダプター ＡＧＴＣＡＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＧＣＧＧＴＣＧＡＣ
ＧＴＧＣＡＴＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＣＧＡＣＡＡＡＧＣ
ＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＧＴＡＧＧＧＴＣＧＴＡＣＣＡ
ＴＧＡＧＡＴＣＴＧ ＣＡＴＧＧＴＡＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＧを混合連結し
、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＭＣ１０６１を形質転換した。アン
ピシリン耐性を示す形質転換株について、５　’−ＧＡ
ＴＣＣＡＧΔＴＣＴＣＡＴＧをプローブとしてコロニー
ハイブリダイゼーションを行ったところ、１１８株中４
株が陽性を示し、これらはプラスミドｐ６ｈｕγ−ＣＫ
ｐｎを保持していた。

ｐ６ｈｕ７−ＣＫｐｎをＫｐｎＩ消化し突出した部分を
削ることにより、ヒトγ型インターフェロンのＣ末端ア
ミノ酸グルタミンを暗号化するＣＡＧが露出されること
になる。

５６ｈｕＮ１ΔＢＳ−ＮＨｉｎの　！１１ニブラスミド
ｐ６ｈｕ７Ｎ１△ＢＳ−ＮＨｉｎの構造を第７図に示す
。ｐ６ｈｕγ−Ｎ１をＢｓｔＥＩｒ消化し、得られた粘
着末端をＤＮＡポリメラーゼエのフレノウ断片を用いて
平滑末端とした後、Ｓａｌニリンカーを連結、Ｓａｌ工
消泡消化後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて自己環化させ
、プラスミドｐ６ｈｕγＮ１−△ＢＳを得た。次にｐＫ
Ｍ６をＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ、Ｓａｌ工消泡消化アガロース
ゲル電気泳動により約３７００ｂｐのＤＮＡ断片を分取
し、さらに別にｐ６ｈｕγＮ１−△ＢＳをＮｄｅＩ、Ｓ
ａｌ工消泡消化アガロースゲル電気泳動により約５ｏｏ
ｂｐのＤＮＡ断片を分取した。

これら２種のＤＮＡ断片と（２）の方法に準じて作製し
た下記のＤＮＡアダプターとを連結し、目的のプラスミ
ドｐ６ｈｕ７Ｎ１ΔＢＳ−Ｎ’ＨｉｎＡＡＴＴＧＣＧＣ
ＡＧＧＡＣＣＣ＾ ＣＧＣＧＴＣＣＴＧＧＧＴＡＴ を得た。ｐ６ｈｕ７Ｎ１△ＢＳ−ＮＨｉｎをＨｉｎＰ■
消化し突出部分を削ることにより、ヒトγ型インターフ
ェロンのＮ末端アミノ酸、グルタミンを暗号化するＣＡ
Ｇを露出できる。

ｐｔｒｐ６ｈｕ　ＩＦＮ−７βの作製方法を第８図に示
す。プラスミドＰＫＭ６　３０μｇを０１ａ工消化した
後、マングビーンヌクレアーゼ１５単位で３７℃１５分
間反応し、粘着末端を平滑末端とした。これをさらにＢ
ｇｌＩＩ消化した後、アガロースゲル電気泳動により約
ｃ；ｏｏｂｐのＤＮＡ断片を分取した。別にプラスミド
ｐ６ｈｕγＮ１−ＣＫｐｎをＫｐｎ工消化した後、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端を形成させ、さらに
ＢａｍＨＩ消化してアガロースゲル電気泳動により、約
４８００ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。それぞれのＤＮ
Ａ断片を混合、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、Ｅ、
　ｃｏ　１　ｉ　　ＨＢＩＯＩ　〔Ｂｏｙｃｒら（１９
６９）　Ｊ、Ｈｏ１．　［３ｉｏ１．　４１．４５９−
４７２　）を形質転換した。得られたアンピシリン耐性
の形質転換体について、上記の操作で得たｐＫＭ６のＣ
１ａＩ−Ｂｇｌ［断片をニックトランスレーションによ
って３２２ラベル化したＤＮＡをプローブとしてコロニ
ーハイブリダイゼーションを行ったところ、５６株中６
株が陽性を示した。これらの株についてプラスミドＤＮ
Ａを抽出し、制限酵素切断点地図を作製したところ、第
８図に示す構造を持っていた。さらに代表様γβ６の保
持するプラスミドＤＮＡのＳａｌ工消化物をＭ１３ファ
ージに組み込みＤＮＡ塩基配列を決定したところ、ＩＦ
Ｎ−γとＩＦＮ−βの構造遺伝子が読み取り枠が一致し
て連結されており、目的のプラスミドｐｔｒｐ６ｈｕＩ
ＦＮ−γβを得た。また同時に形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ
　　ＨＢＩＯＩ（ｐｔｒｐ６ｈｕＩＦＮ−γβ）を得た
。

ｐｔｒｐ６ｈｕＩＦＮ−βγの作製方法を第９図に示す
。プラスミドｐＫＭ６−ｃｘｈｏ　　２０μｇをｘｈｏ
工消化した後、１５単位のマングビーンヌクレアーゼで
３７℃１５分間処理し、平滑末端を形成させた後、５ａ
ｌＩ消化した。これをアガロースゲル電気泳動にかけ、
約４５００ｂｌ）のＤＮＡ断片を分取した。別にｐ６ｈ
ｕγＮ１ΔＢＳ−ＮＨｉｎ　　３０μｇをＨｉｎＰ工消
化した後、３０単位のマングビーンヌクレアーゼで３７
°Ｃ１５分間処理し、さらにこれを５ａｌＩ消化した後
、アガロースゲル電気泳動により、約８６０ｂｐのＤＮ
Ａ断片を分取した。それぞれのＤＮＡ断片を混合、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼにより連結し、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＨＢＩ
ＯＩを形質転換した。得られたアンピシリン耐性の形質
転換株のうち、５０株についてｐ６ｈｕγＮ　１−ＣＫ
ｐ　ｎを作製する際に利用したＤＮＡオリゴマー５　’
　−ＡＧＴＣＡＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣを用いてコロニ
ーハイブリダイゼーションを行ったところ、２８株が陽
性を示した。代表様βγ３１についてプラスミドＤＮＡ
を単離し、制限酵素切断点地図を作製したところ、第９
図の構造を示し、さらにＢｓｔＥＩ［−８ａＩ　Ｉ断片
をＭ１３ファージにクローン化し、ＤＮＡ塩基配列を調
べたところ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ構造遺伝子が読み
取り枠を合わせて連結されており、ｐｔｒｐ６ｈｕＩＦ
Ｎ−βγを得た。また同時に形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ　
　ＨＢＩＯＩ（ｐｔｒｐ６ｈｕＩＦＮ−βγ）を得た。

ｐｔｒｐｈｕ　ＩＦＮ−７ｃβの作製方法を第１０図に
示す。ｐＫＭ６をＣ１ａＩ消化した後、さらにＢｇｌＩ
［消化し、アガロースゲル電気泳動により約５００ｂｐ
のＤＮＡ断片を分取しな。別にスペーサーペプチドを暗
号化するＤＮＡ断片を（２）に示す方法に準じ、４本の
ＤＮＡオリゴマーより作製した。このＤＮＡ断片の構造
を第１１図に示す。このＤＮＡ断片１０ｐｍ０１６と先
に分離したｐＫＭ６のＣ１ａニーＢｇ　Ｉ　ＩＩ断片、
および□　　実施例１に示したｐ６ｈｕγＮ１−ＣＫｐ
ｎより分離した約４８００ｂｐのＤＮＡ断片を混合、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼにより連結し、Ｅ、ｃｏｌｉＨＢＩＯ
Ｉを形質転換した。得られたアンピシリン耐性を示す形
質転換株８２株について、実施例１に示したプローブを
用いてコロニーハイブリダイゼーションを行ったところ
３株が陽性を示した。

この３株よりプラスミドＤＮＡを得出し、制限酵素地図
を作製しなところ、１株のみが目的の構造のプラスミド
ｐｔｒｐ６ｈｕ　ＩＦＮ−γＣβを保持していた。この
時同時に形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＨＢＩＯＩ＜ｐｔ
ｒｐ６ｈｕＩＦＮ−ｒｃβ）を得た。

丈ＪＬｆ吐Ａ 坪　とイン　−フェロン　１　の１゛口実施例１〜３で
得られた形質転換体について、トリプトファン１００μ
ｇ　／　ｍｌ、アンピシリン１００μｇ　／　ｍｌを含
むＬＢ培地（バクトドリプトン１．０％、酵母エキス０
．５％、食塩０．５％、グルコース０．１％、水酸化ナ
トリウムを用いてｐＨ７，２に調製）に植菌し、３０℃
で８時間培養し、これをグｌレコース１．０％、カザミ
ノ酸１゜０％を含むＭ９培地（リン酸１カリウム０．３
％、リン酸２ナトリウム０６６％、塩化アンモニウム０
．１％、食塩０．５％に別滅菌したビタミンＢ１を１μ
ｇ　／　ｍｌ、硫酸マグネシウムを１ｍＭによるよう添
加する）に１０％植菌し、２５℃で培養を続ける。約１
０時間後にインドールアクリル酸を終濃度１０μｇ　／
　ｍｌとなるように添加し、さらに８時間培養を続行し
た。この間グルコース切れとならないよう適宜４０％グ
ルコース溶液を添加し、またｐＨが６．０〜７．０に保
たれるよう一１４％ＮＨ４ＯＨ溶液を用いて調製した。

その後２ｍ１の培養液より１００００ｔ、４分の遠心分
離により菌体を集菌、さらに生理食塩水で洗浄した後、
この菌体を１ｍｌのリゾチーム３■、ＥＤＴＡ２ｍＭ、
食塩３０ｍＭ、グリセロール２０％を含むトリス−塩酸
綬街液（ｐＨ７，５）に懸濁し、水中で６０分間放置し
た。凍結融解を３回繰り返し、菌体を破砕した後、３０
０００ｇ、２０分の遠心分離により細胞残滓を除去した
ものを活性測定用の標品とした。インターフェロンの抗
ウイルス活性測定法は“インターフェロンの科学”　〔
小林茂保編（１９８５）講談社ｐ１３−２０）に示され
ている、ＦＬ細胞−シンドビスウィルスを用いたＣ　Ｐ
　Ｅ　５０阻示法を用いた。活性測定の際の標準品とし
ては、ＮＩＨｎａｔｕｒａｌＩＦＮ　　ｒ　　Ｇｇ２３
　９０１−５３０によって力価較正した組換え体により
生産されたＩＦＮ−γラボリファレンスを用いた。活性
測定の結果を表１に示す。参考のため、ヒトβ型インタ
ーフェロンを発現するプラスミドｐＫＭ６、およびヒト
７−型インターフェロンを発現するプラスミドｐ６ｈｕ
γ−Ｎ１を保持するＥ、ｃ。

ｌｉ　　８８１０１株について、前記の操作により調製
したインターフェロン粗抽出液の抗ウィルス活性を示し
た。各々のプラスミド保持株はインターフェロンに特徴
的な抗ウィルス活性を示した。

第１表 実施例４の方法に従って培養した菌液１ｍｌより１００
００ｇ、４分の遠心分離により菌体を集菌した。この菌
体を５００μｌの２−メルカプトエタノール５％、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）２％を含む６２．５ｍＭ
トリス−塩酸Ｍ街液（ｐＨ６，８’）に懸濁した後、沸
胱水浴中で５゛分間加熱し、放冷した後に５０μｍのブ
ロムフェノールブルー０．０５％、グリセロール７０％
を含む６２．５ｍＭ）リスー塩酸ｌｔｉ液（ｐＨ６，８
）を添加し、電気泳動用のサンプルとした。５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動はレムリの方法［：Ｎａ
ｔｕｒｅ　２２７　（１９７０）　６８０　）に従った
。ゲル濃度は１５％を用い、マーカータンパク質として
は、リゾチーム分子Ｈ１４４００、トリプシンインヒビ
ター分子ｆｆ１２１５００、カルボニックアンヒドラー
ゼ分子１３１０００、オボアルブミン分子量４５０００
、ウシ血清アルブミン分子Ｍ　６６２００、ホスホリパ
ーゼ８分子ｆｆ１９２５００を用いた。

泳動終了後のゲルをウマシーブリリアントブルーＲ２５
０により染色し、タンパク質を検出した。

同時に泳動したゲルについて、公知の方法〔円部、（１
９８３）細胞工学２１０６１−１０６８）を用いてニト
ロセルロース膜にタンパク質を移した後、第一抗体とし
て市販の抗ヒトβ型インターフェロンウマイムノグロブ
リンあるいは抗ヒトγ型インターフェロンウマイムノグ
ロブリンを用い、さらにペルオキシダーゼ標識したプロ
ティンＡと反応させることによりインターフェロン結合
体の位置を決定した。上前ウェスタンブロッティングの
結果とマーカータンパク質の相対移動度の結果より、イ
ンターフェロン結合体の分子量はＩＦＮ−γβ、ＩＦＮ
−β７・は共に約３７０００であり、ＩＦＮ−γＣβは
約３８０００であった。すなわち、ヒトβ型インターフ
ェロン（分子量約２００００）とヒトγ型インターフェ
ロン（分子量約１７０００＞が連結され、一つのポリペ
プチドとなっていることがわかった。

実施例４に示す方法で調製したＥ、ｃｏｌｉＨＢＩＯＩ
　（ｐｔｒｐ６ｈｕＩＦＮ−ｒβ）からの租インターフ
ェロン抽出液を５％仔ウシ血清１０ｍＭ　　Ｈｅｐｅｓ
　（ｐＨ７，３＞を含むイーグルＭＥＭ培地で５倍に希
釈する。このインターフェロン液１ｍｌに対し、同培地
で５０倍に希釈した抗ＩＦＮ−βウサギ抗血清（中和価
２７００　Ｕ／ｍ１）、あるいは抗ＩＦＮ−γウサギ抗
血清（中和価２０００　Ｕ／ｍｌ　）を１ｍｌ加え、３
７℃で３０分間保温したものについて抗つイスル活性を
測定した。この時、対照として抗血清の代わりに培地の
みを入れたもの、また各々の抗血清希釈液０．５ｍ１ず
つ入れたものについても同様に測定した。結果を第２表
に示す。

第２表 各々の抗血清により活性が中和され、ヒトβ型あるいは
γ型インターフェロン両方の作用を持つことが明らかと
なった。また抗血清中和時にたとえば抗ＩＦＮ−γ抗血
清を用いた場合、６．０×１０”Ｕ／ｍｌを中和価２０
０／ｍｌの抗血清で中和すると、１　、７　Ｘ　１０３
Ｕ／ｍｌとなることから、このＩＦＮ−γβはＩＦＮ−
β、ＩＦＮ−γの相乗作用を現わしていることがわかっ
た。

ｐｔｒｐ６ｈｕ　ＩＦＮ−βＣγの作製方法を第１２図
に示す。プラスミドｐＫＭ６−ｃｘｈ。

２０μｇをｘｈｏＩ消化した後、１５単位のマングビー
ンヌクレアーゼで３７℃１５分間処理し、平滑末端を形
成させた後５ａｌＩ消化した。これをアガロースゲル電
気泳動にかけ約４５００ｂｐのＤＮＡ断片を分取した。

別にｐ６ｈｕγＮ１ΔＢＳ−ＮＨｉｎ　　３０ｔｔｇを
ＨｉｎＰＩ、Ｓａｌ工消化後、アガロースゲル電気泳動
により約８６０ｂｐのＤＮＡ断片を分取した。上記２つ
のＤＮＡ断片と実施例３に示す方法で得たスペーサーボ
リペプチドを暗号化するＤＮＡ断片１０ｐｍＯ１ｅを混
合、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、Ｅ、　ｃｏｌｉ
　　ＨＢＩＯＩを形質転換した。得られたアンピシリン
耐性を示す形質転換体２０４株について、実施例２に示
したプローブ、およびスペーサーポリペプチドを暗号化
するＤＮＡ断片作製の際に用いたＤＮＡオリゴマー５　
’　−ＣＧＴＴＡＣＣＧＡＣＴＴＡＧＣＡをプローブと
して、コロニーハイブリダイゼーションを行った。２株
が陽性を示し制限酵素を用いた分析結果から、１株が目
的のプラスミドｐｔｒｐ６ｈｕＩＦＮ−βＣγを保持し
ていた。この時同時に形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＨＢ
ＩＯＩ（ｐｔｒｐ６ｈｕＩＦＮ−βｃγ）を得た。実施
例４の方法に従ってこの菌株を培養、菌体抽出液を作製
し、抗ウィルス活性を測定しな。抽出液あたり３　、９
　Ｘ　１０４Ｕ／ｍｌの抗ウィルス活性が認められた。

実施例６に示す方法により、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＨＢＩＯ
Ｉ　＜ｐｔｒｐ６ｈｕ　ＩＦＮ−ｒｃβ）からの租イン
ターフェロン抽出液について、抗体による中和を検討し
な。比較のなめ、組換え体により製造されたＩＦＮ−β
、ＩＦＮ−γをほぼ等量混合したもの（ＩＦＮ混液：終
濃度ＩＦＮ−β　８６００　Ｕ／ｍｌ、ＩＦＮ　　７　
２４００Ｕ／ｍｌ）を用いて同様の実験を行った。結果
を第３表に示す。

第３表 ＩＦＮ−γＣβにおいても、それぞれ抗ＩＦＮ−β、抗
ＩＦＮ−γ抗血清により活性が部分的に中和され、さら
に側枕血清の存在により、はぼ完全に活性は失われた。

すなわち、ＩＦＮ−γＣβはＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γの
立体構造をとったものが１つのポリペプチドに連結され
ており、両者の活性を１つのポリペプチドで発揮してい
ることがわかった。

また、ＩＦＮ混液に見られる抗ウィルス作用に関する相
乗作用をＩＦＮ−γＣβも同様に示しており、この分子
が１分子でＩＦＮ−β、ＩＦＮ−７−の相乗作用を示す
ことを確認した。

ｐＳＶβは、ヒトインターフェロン３発現ベクエ ターｐＳＶ２圭ＦＮβ（特開昭６１−５２２８３＞から
真核細胞での複製を阻害する配列（Ｈ，ＬＵＳｋｙｅｔ
　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９３．７９．１９８１）
を除去したベクターである。作製方法は以下の通りであ
る。

工 まず、ｐＳＶ２４ＦＮβのＳＶ４０初期プロモーターの
上流にあるＰｖｕ　■サイトをＳａｌ■リンカ−を用い
てＳａｌエサイトに置き換えなあと、Ｂａ１工とＢａｍ
ＨＩで切断してヒトインターフェロンβの発現に必要な
１．７ＫｂのＮＤＡ断片を分離した。

次に、ｐＢＲ３２２から真核細胞での複製を阻害する配
列を除いたベクターｐＭＬ　２　ｄ　（Ｈ，Ｌｕ５ｋｙ
　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９３．７９．１９
８１）をＳａｌ工をＢａｍＨＩで切断し長鎖断片を分離
した。

これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合しｐＳＶβを得た。

上記Ａ項で得られたｐｓＶβを制限酵素Ｓａｌ■で切断
後、ＨｉｎｄｌＩ［リンカ−を用いてＳａｌ■サイトを
ＨｉｎｄＩＩＩサイトに置き換えたあと、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断してＳＶ４０初期プロモーターを含まない３．
８ＫｂのＤＮＡ断片を分離した。

さらに、ＢＡＰ　（大腸菌アルカリフォスファターゼ）
処理により末端のリンを除いた。

次に、ＭＭＴＶプロモーターを含むベクターｐＭＴＶｄ
　ｈ　ｆ　ｒ　＜Ｆ、Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｔ、　Ｎａｔｕ
ｒｅ、　２９４．２２８．１９８２）を制限酵素Ｈｉｎ
ｄ■で切断することによりＭＭＴＶプロモーターを含む
１．４ＫｂのＤＮＡ断片を分離した。

これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合することによりｐＭＴＶβを得た。

ｐＭＴＶγは、ヒトインターフェロンγ遺伝子をＭＭＴ
Ｖプロモーターの支配下に置いたベクターである。作製
方法は以下の通りである。

上記Ｂ項で得られたｐＭＴＶβをＭＭＴＶプロモーター
下流にあるＨｉｎｄｌＩ［サイトとヒトインターフェロ
ン遺伝子の下流にあるＢｇｌＩＩサイトで切断後、ＤＮ
Ａポリメラーゼ■Ｋｌｅｎｏｗ断片処理で平滑末端化し
てから、ＭＭＴＶプロモーターを含む３．９ｋｂのＤＮ
Ａ断片を分離した。

このＤＮＡ断片とｐ　ＳＶ　Ｉ　ＦＮγ（特開昭６ｌ−
５２２８６）をＤｐｎ工切断して得られるヒトインター
フェロンγ遺伝子を含む０．８ＫｂのＤＮＡ［片をＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて結合することによりｐＭＴＶγ
を得た。

ｐＭＴＶ　（ＳＶ）γは、ｐＭＴＶγのＭＭＴＶプロモ
ーターの上流にＳＶ４０初期プロモーターを導入したベ
クターである。作製方法は以下の通りである。

上記０項で得られたｐＭＴＶγをＢａｌ工で切断後、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩＫ１ｅｎｏｗ断片処理により平滑末
端化してからＢＡＰ処理により末端のリンを除いた。

次に、ｐＳＶ２　ＩＦＮβ（特開昭６ｌ−５２２８３）
をＰｖｕ：［［とＨｉｎｄ■で切断しＳＶ４０初期プロ
モーターを含む０．３ＫｂのＤＮＡ断片を分離してから
、ＤＮＡポリメラーゼエに１ｅｎｏｗ断片処理により平
滑末端化した。

これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合することによりｐＭＴＶ　（ＳＶ）γを得た。

ｐＭＴＶ（ＳＶ）ｒ−βはｐＭＴＶ（ＳＶ）ｒのヒトイ
ンターフェロンγ遺伝子をヒトインターフェロンγβ結
合体遺伝子に置き換えたベクターであって、次のように
して作製しなく第１４図参照入実施例１に従って得られ
たｐｔｒｐ６ｈｒＩＦＮ−γβの１ｃβｇをＮｄｅ　工
とＤｐｕ工で消化した後、アガロースゲル電気泳動によ
り約１３００ｂｐのＤＮＡ断片を分取しな。別に、前記
り項により得られたｐＭＴＶ　（ＳＶ）７をＢａｌ■で
消化した後、ＤＮＡポリメラーゼエに１ｅｎｏｗ断片処
理により平滑末端を形成させ、さらにＮｄｅＩで消Ｃヒ
してアガロースゲル電気泳動により約５１００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を分取した。それぞれのＤＮＡ断片を混合、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼにより連結し、ｐＭＴＶ　（ＳＶ）γ
・βを得た。

犬ｎＮ上旦 ヒトインターフェロン　Ｃ緒ム　・１ ブースミド　ＭＴＶＳＶｃ　　の　−ＩＪｐＭＴＶ　（
ＳＶ）ｒｃβは、ｐＭＴＶ（ＳＶ）γのヒトインターフ
ェロ執遺伝子をヒトインターフェロンγＣβ結合体遺伝
子に置き換えたベクターであって、次のようにして作製
しなく第１４図参照）。

実施例３に従って得られたｐｔｒｐ６ｈｒＩＦＮ−７ｃ
βの１ｃβｇをＮｄｅ　工とＤｐｕ■で消化した後、ア
ガロースゲル電気泳動により約１３００ｂｐのＤＮＡ断
片を分取した。別に、実施例９のＤ項により得られたｐ
ＭＴＶ　（ＳＶ）γをＢａｌ［で消化した後、ＤＮＡポ
リメラーゼＩＫＩｅｎｏｗ断片処理により平滑末端を形
成させ、さらにＮｄｅＩで消化してアガロースゲル電気
泳動により約５１００ｂｐのＤＮＡｒ４ｆＴ片を分取し
な。

それぞれのＤＮＡ断片を混合、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによ
り連結し、ｐＭＴＶ　（ＳＶ）γＣβを得た。

ｌ私狽 実施例９に従って得られたｐ　ＭＴＶ　（Ｓ　Ｖ　）γ
。

β４μｇとＧ４１８耐性遺伝子発現ベクターｐ　３Ｖ２
ｎｃｏ　　（Ｊ、Ｓｏ、ｕｔｈｅ伜ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、
Ｈｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｃｎｅｔ。

、　１　３２７．１９８２＞　０．４μｇとを、リン酸
カルシウム法（Ｆ、Ｌ、Ｇｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、　
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　５４．５３６゜１９７３）にて約
１０６個のヒト肺癌由来ＰＣＩ２細胞（Ｈ，Ｋｉｎｊｏ
　ｅｔ　ａｌ、　　Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、　　３９
．　１５．　１９７９）に導入した。蛋白阻害剤Ｇ４１
８（ＧＩＢＣＯ社）を４００μｇ　／　ｍｌの濃度で含
む遷択培地〔牛胎児血清１０％とカナマイシン１００μ
ｇ　／　ｍｌを含むＲＰＭ１１６４０培地（日永製薬）
〕にて培養したところ、２４個の形質転換体を得た。

培養上清の抗ウィルス活性を、ＦＬ絹胞−シンドビスウ
イルスを用いた実施例４に記載のＣＰＥ５ｏ阻止法で測
定したところ、２２個に活性が認められた。活性測定の
結果を第４表に示す。

以下余白 第４表 夾施伍１ユ 実施例１０に従って得られたｐＭＴＶ　（ＳＶ）ｒｃ／
３４ｔ−ｔ、ｇとｐ　Ｓ　Ｖ　２　ｎｅｏ　　（実施例
１１参照）０．４μｇとを、実施例１１に準じてリン酸
カルシウム法にて約１０６個のＰＣ１２細胞に導入した
。蛋白合成阻害剤０４１８（ＧＩＢＣＯ社）を４００μ
ｇ／ｍｌの濃度で含む２択培地〔牛胎児血清１０％とカ
ナマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＲＰＭ１１６４０培
地（日永製薬〉〕にて培養したところ、２６個の形質転
換体を得た。

培養上清の抗ウィルス活性を、実施例１１と同様にＦＬ
細胞−シンドビスウイルスを用いたＣＰＥ５ｏ阻止法で
測定したところ、２０個に活性が認められた。活性測定
の結果を第５表に示す。

第５表 〔発明の効果〕 以上のように、本発明はβ型インターフェロンとγ型イ
ンターフェロンを暗号化する塩基配列を連結し、遺伝子
操作の手法を用いて組換え体により、従来天然には存在
しなかったインターフェロン結合体を生産させたもので
ある。

本発明により得られたインターフェロン結合体は、従来
β型インターフェロンあるいはγ型インターフェロンそ
れぞれに担われていた作用を単独のポリペプチドで示す
ため、今までの単独のインターフェロンには見られなか
った幅広い抗ウイルス作用スペクトルあるいは抗細胞増
殖作用スペクトルなどの作用スペクトルを示すものであ
る。すなわち既存のインターフェロンよりすぐれた抗ウ
ィルス剤、抗腫瘍剤として使用することが可能である。

またインターフェロン結合体は、β、γ型インターフェ
ロン混合物が示す相乗作用を一つのポリペプチドで示す
ため、分子あたりの活性が増大し今までのインターフェ
ロンに見られない強力な作用を持つこととなる。このよ
うに相乗作用を期待するためインビトロの実験では既存
のβ、γ型インターフェロンを混合すればよいが、イン
ビボではそれぞれの体内動態が異なり、目的の部位に必
ずしもβ、γ型インターフェロン両者が存在していると
は限らない。インターフェロン結合体においては１分子
で元の相乗作用を発揮しているため、このような体内動
態の問題はおこらず期待される高い活性が発現される。

すなわちインターフェロン結合体は既存のインターフェ
ロン、あるいはその混合物より作用の高い抗ウィス剤、
抗腫瘍剤として利用できる。

またβ、γ型インターフェロン混合物を調製する際に、
従来はそれぞれのポリペプチドを別々に調製しその後混
合する必要があったが、本発明のポリペプチドであれば
一度の調製で同じ効果を発揮できる。このようにして生
産されたインターフェロン結合体はそのまま結合体ポリ
ペプチドとしても使用できるし、必要に応じて連結部分
を切り離してβ、γ型インターフェロン混合物としても
使用できる。いずれにしてもその調製の操作は、各々の
インターフェロンを別々に調製する場合にくらべ簡略化
されることになる。

【図面の簡単な説明】 第１図は成熟ヒトβ型インターフェロンのアミノ酸配列
の一例を、第２図は成熟ヒトＴ型インターフェロンのア
ミノ酸配列の一例を示す。第３図はヒトβ型インターフ
ェロン発現プラスミドｐＫＭ６の構造を示し、第４図は
ヒトγ型インターフェロン発現プラスミドｐ６ｈｕγ−
Ｎ１の構造を示す。第５図はヒトβ型インターフェロン
構造遺伝子を取り出すためにｘｈｏＩ部位を導入したプ
ラスミドｐｋＭ６−ｃｘｈｏの構造を示す。また第６図
、第７図にはヒトＴ型インターフェロン構造遺伝子を取
り出すために、それぞれＫｐｎ工、ＨｉｎＰ■部位を導
入したプラスミドｐ６ｈｕγＮ１−ＣＫｐｎ、ｐ６ｈｕ
７Ｎ１△ＢＳ−ＮＨｉｎの構造を示す。第８図はインタ
ーフェロンγ・β結合体発現プラスミド作成の概要を、
第９図はインターフェロンβ・γ結合体発現プラスミド
作成の概要を示す。第１０図はインターフェロンγＣβ
結合体発現プラスミド作成の概要を示す。第１１図には
スペーサーペプチドのアミノ酸配列および暗号化する塩
基配列を示す。第１２図はインターフェロンβＣγ結合
体発現プラスミド作成の概要を示す。 第１３図はヒトインターフェロンγ・β結合体動物細胞
発現プラスミド作成の概要を示す。第１４図はヒトイン
ターフェロンγＣβ結合体動物細胞発現プラスミド作成
の概要を示す。 １・・・・・・ヒトβ型インターフェロン構造遺伝子２
・・・・・・ヒトＴ型インターフェロン構造遺伝子３・
・・・・・ヒトＴ型インターフェロンｃＤＮＡのポリペ
プチドを暗号化しない部分 ４・・・・・・ＳＶ４０初期プロモーター５・・・・・
・ＭＭＴＶプロモーター ６・・・・・・ヒトＴ型インターフェロンのシグナルペ
プチド配列 特許出願人　　東　し　株　式　会　社墓　　巳　　さ
　　主　　己　　＝　　芋コ　　　ａ、　　　　ｕＪ　
　　　−コ　　　の　　　ロー　　　の　　　−　　　
く　　　−　　　と　　　＝−＜−〉　　　　ロ　　　
−　　　く コ　　　の　　　く　　　コ　　　コ　　　１．／３　
　　　騙−洲　　　−−騙　　　−＝ コ　　　−　　　く　　　ｚ　　　の　　　コ　　　−
１．１．Ｉ　　　　洲　　　−Ｃ／）　　　　（−）−
一　　　乙　　　　＝−七 φ　　Ｏ ト く ＜　　０ ＤＹＶ 所 弔９（２） Ｇ−−＾ＧＧＧＴＣτ＾Ｃ＋ＡＧ□＾ＣＴｌＣｌ＾ＧＴ
ＱＬＣＱＰＫＡＡＫＳＶＴ ＡＣＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＧＣＣＧＡＡＡＧＣＴＧ
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ＴＣＧＧＣＴＴ’ｌ’ＣＧＡＧＣＡＴＴＣＡＧＣＣＡＴ
ＴＧＣｖｕｒＩ ′烏口口 り 第１３図 す 第１４図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）β型インターフェロンとγ型インターフェロンを
   連結してなるインターフェロン結合体。
2. （２）β型インターフェロンとγ型インターフェロンを
   連結してなるインターフェロン結合体を暗号化する塩基
   配列を含み、その前部に該結合体の発現のための制御部
   位を暗号化する塩基配列を有する組換え体ＤＮＡにより
   形質転換された形質転換体を培養し、インターフェロン
   結合体を生成せしめ、該培養物よりインターフェロン結
   合体を単離精製することを特徴とするインターフェロン
   結合体の製造方法。