JPH03232897A - ポリペプチドおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産」Ｌ比例オ」Ｌ分厨− 本発明は、水痘帯状庖疹ウィルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ
−ｚｏｓｔｅｒｖｉｒｕｓ、以下、ＶＺＶと略称）の表
面抗原ｇＰＴ遺伝子を組換えＤＮＡ技術を用いて発現さ
せ、免疫学的に活性なりＺｖ表面抗原ｇＰＩを製造し、
ｖＺｖワクチンの免疫原や診断薬の抗原として利用する
技術に関する。

炎来吸技監 ＶＺＶは抗体を持たない幼児の呼吸気道粘膜、結膜に侵
入し、局所リンパ腺で増殖して第一次ウルス血症を起こ
す。ｖｚｖはさらに肝、牌などの臓器において増殖し、
第二次ウィルス血症が起こり、皮膚や呼吸気道粘膜の真
皮から表皮に達し、増殖して水痘を形成する。通常は、
一般に良好な経過をとり、約１２日で自然治癒する。し
かし、白血病やネフローゼなどの慢性疾患をもつ小児や
先天性免疫不全の小児が罹患すると重症になり、ときに
死亡に至ることがある。

初感染によって水痘を起こしたｖＺｖは、知覚神経に沿
って抜根神経節に達して神経細胞に潜伏感染する。この
ｖＺｖは加齢、抗癌剤による治療などにより免疫能が低
下すると、再活性化してその神経支配領域の皮膚に帯状
の水痘を形成し、帯状庖疹となる（回帰発症）。

ヒトから分離されたｖＺｖの岡株をモルモット３− の胎児細胞で継代培養することにより弱毒化した株が得
られ、さらにこの株をヒト２倍体細胞に継代培養するこ
とにより水痘弱毒生ワクチンが作製さ九た［Ｔａｋａｈ
ａｓｈｉ、　Ｍ　：ヴアリセラ　ワクチン（Ｖａｒｉｃ
ｅｌｌａ　ｖａｃｃｉｎｅ）、　Ｉｎ：ワクチン（Ｖａ
ｃｃｉｎｅ）　（ＰｒｏｔｏｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍ
ｅｒ編）、５２６〜５４８頁、Ｖ、Ｂ、５ａｕｎｄｅｒ
ｓ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９８８）　、この
岡株水痘ワクチンはわが国では１９８６年９月に認可さ
れ、１９８７年３月より発売されている。このワクチン
の接種対象はハイリスクの小児、ハイリスクの周囲の感
受性者、成人の未感染者および健康小児の希望者であり
、開発の経過から現段階ではすべての健康小児にルーチ
ンに接種することは勧められていない。

ＶＺＶの主要糖蛋白は、ウィルス粒子の表面に存在して
細胞への吸着や侵入に関与し、また細胞の表面に発現し
て抗体や感作リンパ球の標的となると考えられている。

ｖＺｖには４種類の糖蛋白が知られており、それぞれｇ
Ｐｌ、ｇｐｎ、ｇｐｍ、ｇｐ■と名付けられている（Ｄ
ａｖｉｓｏｎ、　Ａ、Ｊ。

ら、ジャーナルオブヴイロロジー（Ｊ、　ｖｉｒｏｌ、
）。

４− ５７、１１９５〜１１９７（１９８６））。これらの糖
蛋白に対するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）が分析さ
れたところ、ｇＰＩに対するＭ　ｏ　Ａ　ｂには、補体
存在下で中和能を示すものと抗体依存性細胞障害能を示
すものがある。ｇｐｎやｇＰｍに対するＭ　ｏ　Ａ　ｂ
には、補体なしに中和能を示すものが、ｇｐｒＶに対す
るＭ　ｏ　Ａ　ｂには、補体なしに中和能を示すものと
抗体依存性細胞障害を示すものがそれぞれ知られている
（　Ｉｔｏ　、阿、ら、ジャーナルオブヴイロロジ（Ｊ
、　Ｖｉｒｏｌ、）、５３．９８〜１０３（１９８５）
）。

一方、遺伝子組換え技術によってｖＺｖのゲノム構造の
解析が急速に進み、ＤｕｍａＳ株の全塩基配列が決定さ
れ、７１個のオープン・リーディング・フレームがｖｚ
ｖの遺伝子として提案された。そしてｇｐＩ（分子量９
４に、８３Ｋ）　、ｇｐＩＩ（分子量１１６に、１０６
に、６４Ｋ）　、ｇｐｍ（分子量１１５Ｋ）、ｇｐＩＶ
　（分子量５５Ｋ）は各々の性質から遺伝子６８，３１
，３７，６７に対応すると推定され、遺伝子１４には推
定上の蛋白ｇＰＶが割り当てられた（Ｄａｖｉｓｏｎ、
　Ａ、Ｊ、ら、ジャーナルオブヴイロロジー（Ｊ、　Ｖ
ｉｒｏｌ、）、５７゜１１９５〜１１９７（１９８６）
）。

発明が解決すべき課題 本発明者は、遺伝子工学的手法を用いて、ｖｚＶ糖蛋白
の中でウィルス中和能と抗体依存性細胞障害能の誘導が
予測されるｇＰＩを作製し、該物質をコンポーネントワ
クチンの免疫原および■Ｚ■抗体検出のための診断薬の
材料として利用することを目的とするもので、ＶＺＶの
表面抗原ｇｐＩを大量に生産する技術の開発が本発明に
おける課題である。

を　　するための手 本発明者等は、ＶＺＶの臨床分離株（Ｋｕｚｕｈａｒａ
株）の感染細胞から、パルスフィールド電気泳動によっ
てウィルスゲノムを分離し、そこからＤｕｍａＳ株にお
いて既に報告されている塩基配列をもとに、ｇＰＩ遺伝
子を含むＩ）ＮＡ断片をクローニングした。

本発明はこのクローニングに基づくもので、このたび解
析されたｇＰＩ遺伝子配列、それから推測されるアミノ
酸配列は新規なものである。即ち、本発明の４０位のア
ミノ酸はＩｌｅである点において、公知のもの（Ｄａｖ
ｉｓｏｎ、　Ａ、Ｊ、ら、ジャーナルオブジェネラルヴ
イロロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒ。

１、）、５７．１７５９（１９８６）、特開昭６１−８
１７９２号〕とは異なっている。

すなわち、本発明は、（１）その分子中に以下のアミノ
酸配列（１）を含有する蛋白質、即ち水痘帯状庖疹ウィ
ルスの表面抗原ｇＰＴおよびその誘導体： （Ｉ） ０ １１ｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａ
ｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌ
ｕ　Ｐｒｏ　ＴｙｒＴｙｒ　１（ｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ
　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　
Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　５ｅ■ Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｈ
ｉｓ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｔｒ
ｐ　Ｐｒｏ　ＡｒｇＡｓｎＡｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｇ
ｌｙ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　）ｕ
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■ Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａ
ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｍｅ
ｔ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　ＴｈｒＧｉｎ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　
Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌ８ｕ　Ｇｌｙ　Ａ
ｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇ取１１ｅ阻ｓ　Ｖａｌｌｌｅ
　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　
Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａ
ｓｎ　Ｖａｌ　ＡｓｐＧｉｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ
　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　
Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｇ
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ｎ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ７− Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｇ
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ｇ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　ＧｌｕＴｈｒ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　
Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｃ
ｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒ
。

Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｌ
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ｈｅ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｖａ■ Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ａ
ｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓ
ｐ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　ＡｌａＧｌｕ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　
Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌ
ｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇ］、ｎ　Ｐｒｏ　Ｔ
ｒ■ ｌｌｅ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔ
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ｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖ
ａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｈ
ｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ＧｌｎＴｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　
Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ａ
ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇ］、ｙ　Ｔｈｒ　５
ｅ■ Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｖ
ａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌ
ｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＡｒｇＡｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　
Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｐ
ｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｈｉ
ｓＭｅｔ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　
Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａ
ｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ６０ Ｌｅｕ　Ａｌａ、 （２）上記（１）記載の蛋白質をコードする塩基配列を
含有する組換えＤＮＡ、（３）上記（２）記載の組換え
ＤＮＡを保持する形質転換体、（４）上記（３）記載の
形質転換体を培養し、培養物中に上記（１）記載の蛋白
を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする該
■Ｚｖの表面抗原ｇＰＴの製造法を提供するものである
。

（１）の蛋白質の一例としては、第２図に示さ８− れるようなアミノ酸配列を含有する蛋白質が挙げられる
。このうち水痘帯状庖疹ウィルスの表面蛋白ｇＰＩのト
ランスメンブラン領域の除外されたｇＰ　１．すなわち
アミノ酸残基Ｎ０９１〜Ｎｏ。

５３５までのアミノ酸配列で構成される蛋白質は、遺伝
子工学的手法で製造した場合、細胞から分泌されてくる
ため精製が容易であり、また抗原性についてはｇＰＩ全
分子と同等であるため、本発明の目的に特に適ったもの
と言える。

アミノ酸配列（Ｉ）の蛋白質をコードする塩基配列を含
有するＤＮＡとしては第２図に示すものが一例として挙
げられる。第２図の塩基Ｎｏ、１９５からＮｏ、１１５
７までがアミノ酸配列（１）に相当する。

本発明における蛋白質（Ｉ）をコードする塩基配列を含
有する組換えＤＮＡのうち、例えば発現型ベクターは、
例えば（イ）Ｖ　Ｚ　Ｖ　Ｋｕｚｕｈａｒａ株からゲノ
ムＤＮＡを分離し、（ロ）ゲノムＤＮＡを制限酵素Ｘ　
ｂ　ａ　ＩとＨｉ　ｎ　ｄ　ｍで消化し、消化物を大腸
菌で複製できるプラスミドに組み込み、（ハ）得られた
組換えプラスミドで宿主大腸菌を形質転換し、（ニ）得
られた形質転換体を培養後、形質転換体から適当な方法
、例えばＤＮＡプローブを用いたコロニーハイブリダイ
ゼーション法によって目的とするＤＮＡを含有するプラ
スミドを単離し、（ホ）そのプラスミドから目的とする
クローン化ＤＮＡを切り出し、（へ）必要により該クロ
ーン化ＤＮＡを制限酵素処理、ヌクレアーゼ処理、適当
なリンカ−の付加反応に付した後、該クローン化ＤＮＡ
を、または該クローン化ＤＮＡの５′末端側に、ｇＰ１
本来のシグナル配列の代わりに他のシグナルペプチドの
すべてまたは一部をコードするＤＮＡを結合させたＤＮ
Ａを、外来遺伝子発現用ビークル中のプロモーターの下
流に読み枠が一致するように連結することにより、作製
することができる。

本発明に用いるベクター（例、プラスミド）としては、
宿主に対応して複製可能なものであれば何でもよい。宿
主が大腸菌である場合には、例えばｐ　Ｂ　Ｒ３２２（
Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、　Ｊ、Ｇ、ｅコールドスプリング
ハーバーシンポジウム（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉ
ａｒｂｏｒＳｙｍｐｏｓｉｕｍ）、４３．７７（１９７
９）］にプロモーターを挿入することによって外来遺伝
子発現用ビークルが得られる。宿主が酵母の場合には、
例えばｐｓＨ１９［Ｈａｒａｓｉｍａ、Ｓ、ら、モレキ
ュラーセルラーオブバイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ、）、４，７７１（１９８４））、ｐｓＨ１９
−１（ヨーロッパ特許出願公開ＥＰ−Ａ−０２３５４３
０）などが挙げられ、これらにプロモーターを挿入する
ことによって外来遺伝子発現用ビークルが得られる。宿
主が動物細胞の場合には、例えばｐ　Ｂ　Ｒ３２２にＳ
Ｖ４０由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモー
ターなどを挿入することによって外来遺伝子発現用ビー
クルが得られる。

本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。宿主が大腸菌である場合は、λ
ＰＬプロモーター、λＰＲプロモーター、ｔｒｐプロモ
ーター、ｔａｃプロモーターＴ７プロモーターなどが好
ましく用いられる。宿主が酵母である場合は、ＧＬＤ（
ＧＡＰＨ）ブロモ１１− −ター、ＰＨ○５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、
ＡＤＨプロモーター、ＰＨ○８１プロモーターなどが好
ましく用いられる。宿主が動物細胞である場合には、Ｓ
Ｖ４０由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモー
ターなどが挙げられる。

プロモーターは対応する遺伝子より酵素的に調製するこ
とができる。また、化学合成することもできる。

アミノ酸配列（Ｉ）を含有する蛋白質をコードするＤＮ
Ａを発現させる発現プラスミドは上記の発現用ベクター
のプロモーターの下流に該蛋白質をコードするＤＮＡを
挿入することによって得られる。このＤＮＡとしては、
先に述べたように第２図に示すもの、或いはその一部が
例として挙げられる。

宿主が大腸菌の場合は、発現用ベクターとしては、たと
えばｐ　Ｔ　ＲＰ　８０１　［Ｆｕｊｉｓａｖａ、　Ｙ
ら、ニュータレイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１１．３５８１（１９８３）］
、　ｐ　ＴＥ１０１　（Ｔａｎｉｙａｍａ、　Ｙ。

ら、ジャーナルオブザタケダリサーチラボラトリーズ（
Ｊ、Ｔａｋｅｄａ　Ｒｅｓ、　Ｌａｂｓ、）、４５，１
３６（１９８６））、　ｐＫ　Ｋ＋２３３−２（Ｐｈａ
ｒ＋ｎａｃｉａ　ＬＫＢ、　Ｓｗｅｄｅｎ）などが挙げ
られる。宿主が酵母の場合の発現用ベクターとしては、
たとえばｐＰＨＯ１７、ｐＧＬＤ９０６、ｐＧＬＤ９０
６−１、（Ｉｔｏｈ、Ｙ、ら、バイオケミカルアンドバ
イオフィジカルリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　、　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ
　、　）、　１３８　、２６８　、　（１９８６））が
あげられる。宿主が動物細胞の場合の発現ベクターとし
ては、たとえばｐ　ｃ　Ｄ　ｘ　（Ｐｈａｒｍａｃｊａ
　ＬＫＢ。

Ｓｗｅｄｅｎ）とｐ　ＭＡ　Ｍｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ　
Ｃｏ、　Ｌｔｄ、、　Ｊａｐａｎ）とを組み合わせて用
いることができる。この場合、アミノ酸配列（１）を含
有する蛋白質をコードするＤＮＡの下流にターミネータ
−を挿入することによって該ＤＮＡの発現量を高めるこ
とができる。

このターミネータ−としては、例えば酵母の場合には、
フォスフォグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）、２
μＤＮＡのＦＬＰ遺伝子、インベルターゼ遺伝子（ＳＵ
Ｃ２）などのターミネータ−が挙げられる。

本発明における発現プラスミドを構築するための方法は
公知であり、文献たとえばモレキュラークローニング（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８２）、
コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
（１９８２）に記載されている。

組換えＤＮＡにより形質転換される宿主としては、大腸
菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。

大腸菌としては、Ｃ６００，ＭＭ２９４．Ｎ４８３０−
１．ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳなどが挙げられ
る。酵母としては、たとえばサツカロマイセスセレビシ
ェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）ＡＨ２２Ｒ”−、ＮＡ　８７−１１　Ａ、　ＤＫＤ
　−５Ｄなどが挙られるが、特に、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅの呼吸欠損株（ρ−）が宿主として適している
。

呼吸能を有する酵母（親株ρ十）から呼吸欠損株（ρ−
）を得る方法自体は公知であり、例えば、〔「ラボラト
リーコースマニュアルフォーメソッズインイーストジェ
ネティクス（Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ｍｅｔｈ
ｏｄ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　ＧｅｎｅｔｉｃＳ）」、コー
ルドスプリングハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｃｌ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　ｔ（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
、　（１９８６）〕に記載されている。即ち、親株をエ
チジウムブロマイドを含む培地で培養したのち、炭素源
としてグルコースを含む培地では生育できるがグリセロ
ールを含む培地では生育できない菌株を分離することに
よって呼吸欠損株を容易に得ることができる。また頻度
は低いが親株の単一コロニーの中から呼吸欠損株を得る
ことができる。ここで言う親株が、発現プラスミドを有
する形質転換株（組換え体）の場合には、その呼吸欠損
株を得ることによって目的とする遺伝子発現量が高い組
換え体を直接に得ることができる。また親株が発現プラ
スミドを保持しない場合には、その呼吸欠損株を得たの
ち、これに発現プラスミドを導入することによって目的
の組換え体が得られる。

動物細胞としては、たとえばサル細胞Ｃ０８７、Ｖｅｒ
ｏ、チャイニーズハムスター（ＣＨＯ）細胞、マウスＬ
細胞、マウスミエローマ細胞、ヒトＦＬ細胞などが挙げ
られる。

発現プラスミド（組換えＤＮＡ）を用いて大腸菌を形質
転換する方法は自体公知の方法、たとえばプロシージン
グスオブザナショナルアカデミーオブサイエンス（Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、６９．
２１１０（１９７２）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）、　１７
．１０７（ＩＱ８２）などに記載の方法に従って行われ
る。

組換えＤＮＡ　（プラスミド）を用いて酵母を形質転換
する方法は自体公知の方法、たとえばリチウム法［Ｈ，
Ｉｔｏら、「ジャーナルオブバクテリオロジ−（Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、）、１５３，１６３（１９８３））
、プロトプラスト法（Ａ、Ｈｉｎｎｅｎら、プロシージ
ングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンス（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、７５
．１９２７（１９７８））などが挙げられる。動物細胞
を形質転換するには、たとえばヴイロロジー（Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ）　５２，４５６（１９７３）に記載の方法に
従って行なわれる。

宿主としては真核細胞、特に動物細胞が好ましい。

このようにして得られた形質転換体（組換え体）をそれ
自体公知の方法で培養する。

形質転換体を培養する際、培養に使用される培地として
は液体培地が適当であり、その中には該１５− 形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その
他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグル
コース、デキストリン、可溶性澱粉。

ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩
類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカーペプトン、カゼ
イン、肉エキス、大豆軸、バレイショ抽出液などの無機
または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシウ
ム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが
あげられる。

また、酵母、ビタミン類、成長促進因子などを添加して
もよい。

培地のｐＨは約６〜８がヌましい。

大腸菌用の培地としては、たとえばＬＢ培地〔モレキュ
ラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）　　（１９８２）、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。

グルコースやカザミノ酸を含むＭ９培地（Ｍｉｌｌｅｒ
＋ジャーナルオブエクスペリメンツインモレキュラージ
エネテイックス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ）、４３１−４３３．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ、１９７２）　）が好１６− ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働か
せるために、たとえばＩＡＡ　（３β−インドリルアク
リル酸）、ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオーβ−Ｄ
−ガラクトシド）のような薬剤を加えることができる。

培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要
により、通気や撹拌を加えることもできる。

酵母用の培地としては、たとえばパークホールダー（Ｂ
ｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔アメリカンジャーナル
オブボタニー（Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｂｏｔ、）、　３０．２
０６（１９４３）〕あるいはその改変培地（Ａ　、　Ｔ
ｏｈｅら、ジャーナルオブバクテリオロジー（Ｊ、Ｂａ
ｃｔｒｉｏｌ、）、　ｉＬ３゜７２７（１９７３））　
、または低リン酸培地（Ａ　、　Ｔｏｈｅら、ジャーナ
ルオブバクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌ。

）、υ、３．７２７（１９７３））が挙げられる。培養
は通常約１５℃〜４０°Ｃ１好ましくは２４°Ｃ〜３７
℃で１０〜１６８時間、好ましくは２４〜７２時間行う
。振とう培養でも静置培養でもよいが、必要に応じて通
気や攪拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を
培養する際、培地としては、たとえば約５〜２０％の胎
児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅＨ２２，５０１（１９５２））、　ＤＭＥＭ培地［ヴ
イロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、８，３９６（１９５
９）］、　ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地〔ジャーナルオ
ブザアメリカンメディカルアソシエーション（Ｔｈｅ　
Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅ
ｄｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）　１９９，５１
９（１９６７））、　１９９培地〔プロシージングオブ
ザソサイエテイ　フオーザバイオロジカルメデイスン（
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙ
　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ）７３．１　（１９５０）３などが挙げられる。

ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０
℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気
や攪拌を加える。

本発明によれば、ＶＺＶのｇＰＩ活性を有するペプチド
は通常の蛋白質抽出・精製法、例えばガラスピーズによ
る菌体破砕、遠心分離、塩析、等電点沈殿、ゲルろ過、
イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラ
フィー、アフイニティ・クロマトグラフィー、ショ糖グ
ラジェント超遠心、塩化セシウムグラジェント超遠心な
どの精製工程を適当に組み合わせることによって容易に
精製することができる。

なお、本明細書や図面において、塩基やアミノ酸などを
略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍ１
ｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎ
ｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣
用略号に基づくものであり、その例を次に挙げる。また
アミノ酸に関して光学異性体があり得る場合は、特に明
示しなければＬ一体を示すものとする。

ＤＮＡ　　：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 ＲＮＡ　　：リボ核酸 ｍ　ＲＮＡ　：メッセンジ＋−ＲＮＡ Ａ　　：アデニン Ｔ　　：チミン Ｇ　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオ
キシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸＝１９− ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ　　：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ　　ニドデシル硫酸ナトリウム ２−ＭＥ　：　２−メルカプトエタノールＧｌｙ　　ニ
ゲリシン（Ｇ） Ａｌａ　　：アラニン（Ａ） Ｖａｌ：バリン（Ｖ） Ｌｅｕ　　：ロイシン（Ｌ） １１ｅ　　：イソロイシン（Ｉ） Ｓｅｒ　　：セリン（Ｓ） Ｔｈｒ　　：スレオニン（Ｔ） Ｃｙｓ　　ニジスティン（Ｃ） １／２Ｃｙｓ　　：ハーフシスチン Ｍｅｔ：メチオニン（Ｍ） Ｇｌｕ　　：グルタミン酸（Ｅ） Ａｓｐ：アスパラギン酸（Ｄ） Ｌｙｓ　　：リジン（Ｋ） Ａｒｇ：アルギニン（Ｒ） Ｈｉｓ：ヒスチジン（Ｈ） ２Ｏ− Ｐｈｅ　　：フエニールアラニン（Ｆ）Ｔｙｒ　　：チ
ロシン（Ｙ） Ｔｒｐ　　ニトリブトファン（Ｗ） Ｐｒｏ　　ニブロリン（Ｐ） Ａｓｎ：アスパラギン（Ｎ） Ｇｉｎ　　：グルタミン（Ｑ） Ａ　ｍ　ｐ　ｒ：アンピシリン耐性遺伝子Ｔｃｒ　：テ
トラサイクリン耐性遺伝子ＡＲ８ｌオートノマス・レプ
リケーション・シーフェンス１（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ
　ｒｅｐｌｉｃａｔｉ。

ｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　１　） なお、本発明のペプチドにおいては、そのアミノ酸配列
の一部が修飾（付加、除去、その他のアミノ酸への置換
など）されていてもよい。

走朋及Ｕ羞果 本発明で得られるＶＺＶｇｐＩは■Ｚｖ感染細胞を原料
にして製造されるＶＺＶ　　ｇＰＩと同様の生物活性を
有し、ｖｚｖウィルスの予防のためのワクチンとして、
また診断用キットの材料として用いることができる。

矢】１殊 以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

後述の実施例５で得られた形質転換体ＣＨＯ／ＧＰＩ　
　４−１２は財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号
ＩＦＯ５０２１５として寄託されており、また該形質転
換体は通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（Ｆ
ＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−２６６４として寄託
されている。

実施例１．水痘帯状庖疹ウィルスＫｕｚｕｈａｒａ株の
ウィルスＤＮＡの調製 Ｆ１ｏｗ２０００細胞（ヒト胎児肺由来）のｍｏｎｏｌ
ａｙｅｒ（１５７５ｃｎＴ）に、水痘帯状庖疹ウィルス
Ｋｕｚｕｈａｒａ株（ＶＺＶ、ＫＹ株）の感染したＦｌ
ｏｗ２０００細胞を１０：１で接種し、ＧＩＴ培地（日
本製薬社製）中３７℃で培養した。５０％以上の細胞変
性が起きた時点で、トリプシン−ＥＤＴＡ処理を行って
感染細　７３− 胞を回収し、低速での遠心分離（１５００ｒｐｍ、　１
０分）によって上清を除去した。得られた感染細胞のベ
レットに０．３ｍ　ＱのＰＢＳ（０，８％　ＮａＣｆ１
，０．０２％Ｋ　Ｇ　ｇ　、　０．１１５％　Ｎａ２Ｈ
ＰＯ４，０，０２％ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７，２）を加え
て、懸濁液（０，６６ｍ　Ｑ　）を得た。

該懸濁液に０．６６ｍ　Ｑの低融点アガロース〔１％低
融点アガロース（ＦＭＣ社製）　、　１０ｍＭ　Ｔ　ｒ
ｉ　５−ＨＣＱ　（ｐＨ８，０）　、　１ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ）を加え、鋳型（５７ｍｍＸ２　ｍｍＸ９　ｍｎ＋）
に流し込んで、感染細胞を含むアガロースブロックを得
た。該アガロースブロックをＬｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ
　　（１％　ＳＤＳ。

１００ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡ、　２０ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃｆｌ
　、　１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣ１１（ｐ　Ｈ８
，０）　、　１ｍｇ／ｍｕ　　プロテイナーゼＫ）１５
ｍＭ中、３７℃で一夜インキユベーションした。上記Ｌ
ｙｓｉｓ　ＢｕｆｆｅｒからＳＤＳとプロテイナーゼＫ
を除いた緩衝液にアガロースブロックを移し、再度−夜
インキユベーシミンした後、ＴＥ緩衝液（５０ｍＭ　Ｔ
　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣ（１、５００ｍＭＥＤＴＡ、ｐＩ
（Ｂ、Ｏ）中で、電気泳動するまで４−９４＝ ℃で静置した。

ウィルスＤＮＡを含む上記アガロースブロックを１％の
アガロースゲル〔１％ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ社製）
、８９ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ、８９ｍＭホウ酸
、２ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０））に埋め込みパル
スフィールド電気泳動装置（ＬＫＢ社製）を用いて、２
４０Ｖ　、　６０ｓｅｃパルスで１８時間泳動した。

泳動後、ゲルを０．５μｇ／ｍＱのエチジウムブロマイ
ド液中で染色し、１２０Ｋｂ付近に出現したウィルスＤ
ＮＡをアガロースゲルごと切り出した。

該アガロースゲルを３０ｍＤ、のＴＥ緩衝液（１０ｍ　
ＭＴｒｉ　５−ＨＣＱ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０
）に浸し、４℃で２時間静置した。ＴＥ緩衝液を交換し
て２時間静置した後、もう−度新しい緩衝液に換えて一
夜静置した。該アガロースゲルを一度ＴＥ緩衝液で洗浄
した後、３０ｍｆｌの制限酵素反応液（１０ｍＭ　Ｔｒ
　ｉ　５−ＨＣＱ　（ｐＨ７，５）　、　７ｍＭ　Ｍｇ
ＣＯ２，１００ｍＭ　ＮａＣＱ、７ｍＭ　２−ＭＥ、０
．０１％ＢＳＡ　（牛血清アルブミン））に浸して２時
間４℃で静置した。この反応液を新しい反応液（１０ｍ
　４２　）に交換した後、１２００ユニツトの制限酵素
ＨｉｎｄｌＩＩ（全酒造社製）を加えて、３７℃で５時
間静置した。

反応の終わったアガロースゲルからＨｉ　ｎ　ｄ　ｍで
切断されたウィルスＤＮＡを透析チューブ内で電気的に
溶出させ、該溶出成約２ｍｆｌをセントリコン（Ａｍｌ
ｃｏｎ社製）で２００μＤまで濃縮し、エタノールを加
えてＤＮＡを沈殿させた。沈殿を２０μＱの制限酵素緩
衝液（組成は前述と同一）に溶解させ、ＸｂａＩとＨｉ
ｎｄｎｒ（全酒造社製）を各々１０ユニツト加えて３７
℃で２時間反応させた。

この反応液をそのまま０．７％ＧＴＧアガロースゲル（
ＦＭＣ社製）中で電気泳動にかけたところ、Ｄａｖｉｓ
ｏｎら〔ジャーナルオブジェネラルヴイロロジー（Ｊ、
　ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　）　６７、１７５９　（１
９８６）〕の報告した大きさと類似したフラグメントが
検出された。

実施例２．ＶＺＶ、ＫＹ株のＤＮＡ断片を含有するプラ
スミドの作製 実施例１で得られたＶＺＶ、ＫＹ株のＤＮＡのＸｂａＩ
−ＨｉｎｄｌＩＩ消化断片のうち約８−１０ｋｂの両分
をアガロースゲルから切り出し、電気的に溶出した後、
フェノール処理およびエタノール沈殿を行った。該ＤＮ
Ａ断片約５０ｎｇと、ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで開裂
されたｐｃＵ１８約３０ｎｇとを混合し、２５ｐＱの反
応液（６６ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣＱ　、　ｐ　
Ｈ７，６，６，６ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＱ、、　１０ｍＭジ
チオスレイトール、１ｍＭ　ＡＴＰ、２０ユニツトのＴ
４ＤＮＡリガーゼ（全酒造社製）〕中で１６℃、−夜反
応させた後、この液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転
換した。１００μｇ／ｍＡアンピシリン、０．２％　Ｘ
−ｇａｌ、及び１０ｍＭ　　ＩＰＴＧを含むアガープレ
ート上に出現した白色コロニに含まれるプラスミドをア
ルカリ抽出法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、モレキュラークロ
ーニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　Ｃ
Ｓ　ＨＬ　ａ　ｂ　、　１９８２）で単離し、クローニ
ングされたＶＺＶ　ＤＮＡのＸｂａＩ−Ｈｉｎｄｍ消化
断片の大きさを０．７％アガロースゲルを用いる電気泳
動によって検討した。約８．５ｋｂの断片を組込んだク
ローン（ｐＶＨＸ７）を選択し、該断片中の制限酵素地
図を作製したところ、Ｄａｖｉｓｏｎらの報告と類似し
、該断片に糖蛋白ｇｐＩ遺伝子の含まれることが予想さ
れた（第１図−１）。

該断片から５．１ｋｂのＸｂａ　Ｉ、Ｓｍａ　Ｉ消化断
片をｐＵｃｌＢのＸ　ｂ　ａ　Ｉ　／　Ｓ　ｍ　ａ　１
部位にサブクローニングし、ｐＵｃ１８ｇＰＩを作製し
た（第１図−１）。

ｐＵｃ１８ｇｐＩのインサートについて、Ｓｍａ１部位
からの約２．１ｋｂの領域の塩基配列をジデオキシヌク
レオチド合成鎖停止法により決定したところ、該領域に
ＶＺＶｇＰＩタンパクがコードされていることが分かっ
た（第２図）。

上記塩基配列から推定されるアミノ酸配列を第２図に示
す。該領域の塩基配列は、Ｄａｖｉｓｏｎらの報告と非
常によく似ているものの４塩基の変異（Ｎｏ、１９６の
Ｔ（本発明）　→ｃ　（Ｄａｖｉｓｏｎ）　＋Ｎｏ、２
７５のＣ−）Ｔ、Ｎｏ、１９６９のＴ−）Ｃ。

Ｎｏ、２０４０のＴ−）欠失〕　（１アミノ酸の変異：
４０位がＤａｖｉｓｏｎらではＴｈ　ｒ、本発明ではｌ
１ｅ）が見られた。

実施例３　　ＶＺＶｇｐＴ遺伝子の発現プラスミドの構
築−Ｉニドランケイテッド（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　）型
ｇｐＴトランジェント発現プラスミドの構築 （１）ｐＵｃ１８ｇｐｌ　（第１図−１）をＡｖａＩと
Ｎｃｏｌで消化し、ｇＰＩの翻訳開始コドン（ＡＴＧ）
の−５３から＋２９３の０．３５ｋｂの断片を単離した
。ベクターｐＵｃ１９のＳｍａ１部位にＮｃｏＩリンカ
−（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を挿入したｐ　Ｕ　Ｃ１
９Ｎ　ｃ　ｏをＮａｏｌとＢ　ａ　ｍ　ＨＩで開裂した
。このベクターと、上記０．３５ｋｂのＮｃｏＩＡｖａ
Ｉ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼでいったん結合させた後
、Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ　、　Ａ　ｖ　ａ　Ｔ　、　Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼで順次反応させ、最後にＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで閉環してプラスミドｐＵｃ１９ｇｐｌＮｃｏを
作製した（第１図−２）。

ｐ　Ｕ　Ｃ１９ｇ　ｐ　Ｉ　Ｎ　ｃ　ｏをＸｂａｌ、ク
レノー（Ｋｌｅｎｏｗ）　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ、Ｋ
ｐｎＩで順次反応して開環し、０．３５ｋ　ｂの断片を
得た。一方、ｐＵｃｌＢにＮｈｅリンカ−を挿入したｐ
Ｕｃ１８Ｎｈ　ｅを作製し、これをＥｃｏＲＩ、クレノ
ーＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｐｎｌで順次反応させること
により開環したベクターを得た。このベクターと上記０
．３５ｋｂ断片とを７４ＤＮＡリガーゼで結合させてｐ
Ｕｃ１８ＮｈｅｇｐＩＮｃｏを作製した（第１図−２）
。

（２）ｐＵｃ１８ｇｐ　ＩをＳｍａ　ＩとＮｃｏＩで消
化して得た１、８ｋ　ｂの断片と、ｐＵｃ１８Ｎｈｅｇ
ｐｌＮｃｏをＮｈｅｌ、クレノーＤＮＡポリメラーゼ、
ＮｃｏｌでＪ＠次反応させて得た３、１ｋｂのベクター
とをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させてプラスミドｐ　Ｕ
　Ｃ１８ｇ　ｐ　Ｉ　Ｓ　ｍ　ａを得た（第１図−３）
。

ｐＵｃ１８ｇｐ　Ｉ　ＳｍａをＥｃｏＴ２２Ｉで開裂し
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した後、Ｎｈｅｌリ
ンカ−を挿入したプラスミドＰＵＣＩ８ＮｈｅｇｐｌＥ
ｃＴを得た（第１図−３）。

（３）ｐＵｃ１８ＮｈｅｇｐＩＥｃＴをＸｂａＩで消化
し、得られた２、１ｋｂ断片をクレノーＤＮＡポリメラ
ーゼ処理した。この断片とｐＴＢ７０１　［（ｐＴＢ７
０１　：　ｐＴＢ６５２がらＣキナーゼ遺伝子を除去し
たベクター）　、　Ｏｎｏら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）、２３６．１１１６−１１２０（１９８７））を
ＥｃｏＲＩで開裂しクレノーＤＮＡポリメラーゼ処理し
たベクターとをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させ、発現プ
ラスミドｐＴＢｇｐＩＥｃＴを作製した（第１図〜４）
。

（４）ｐＵｃ１８ｇｐ　ＩをＳｍａＩ、５ａｃＩで開裂
し、エキソヌクレアーゼ■でｇＰＩ遺伝子の３′側を約
０．４５ｋｂ消化した後、マングビーンヌクレアーゼ、
クレノーＤＮＡポリメラーゼ処理を行って平滑化した後
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで閉環してｐＵｃ１８８ｓ６０を
作製した（第１図−５）。

ｐＵ（，１８ＳＳ６０をＫｐｎｌで開裂し、ＥｃｏＲＩ
で部分消化して得た２、３ｋｂ断片をＴ　４．　ＤＮＡ
ポリメラーゼで平滑化し、Ｎｈｅｌリンカ−（Ｎｅｗ　
Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を結合させた後
、Ｎ　ｃ　ｏ　ＩとＮｈｅＩでトリミングした１、３ｋ
ｂの３１− 断片を調製した。この断片とｐ　Ｕ　Ｃ１８Ｎ　ｈ　ｅ
　ｇｐｌＥｃＴをＮｃｏＩとＮ　ｈ　ｅ　Ｉで開裂した
ベクターとを結合させてｐＵｃ１８ｇｐ　Ｉ　５Ｓ６０
を作製した（第１図−５）。

（５）ｐＵｃ１８ｇｐ　Ｉ　５Ｓ６０をＥＱＯＲＩで部
分消化し、１ケ所だけで切断さ九たＤＮＡを回収し、ク
レノーＤＮＡポリメラーゼ処理し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
で閉環した。この中がらｐＵｃ１８ＳＳ６０におけるｐ
Ｕｃ１８由来のＥｃｏＲ１部位が消失したりｏ−ンｐＵ
Ｃ１８ＳＳ６０−Ｅ７を選択した（第１図−６）。

ｐＵｃ１８ｓｓ６０−Ｅ７をＸｂａＩ処理して得た２、
７ｋｂの断片をクレノーＤＮＡポリメラーゼで平滑化し
た。この断片とｐＴＢ７０１をＥｃｏＲＩで開裂した後
にクレノーＤＮＡポリメラーゼで平滑化したベクターと
を結合させ、発現プラスミドｐＴＢｇｐＩＥ７−１７を
作製した（第、１図−６）。

実施例４　　ＶＺＶｇｐｌ遺伝子の発現プラスミドの構
築−■ニドランケイテッド型ｇｐ ３２− Ｉステーブル発現プラスミドの構築 ハムスターのジヒドロ葉酸還元酵素（ｈＤＨＦＲ）の発
現プラスミドｐＴＴ３５６４　（ｐＴＢ３４８、ｐＴＢ
３９９およびｐ　Ｔ　Ｂ　４０１　（Ｓａｓａｄａ、Ｒ
。

ら、セルストラクチュアアンドファンクション（Ｃｅｌ
ｌ　５ｔｒｕｅｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ
）１２，２０５（１９８７）〕からそれぞれ、ＰｓｔＩ
とＢａｍＨＩ消化によって得た０、９ｋｂの断片、５ａ
ｌｌとＢ　ａ　ｍ　Ｈ１消化によって得た２、４ｋｂの
断片および５ａｌＩとＰｓｔＩ消化によって得た０、８
ｋｂの断片をＴ４　　ＤＮＡリガーゼで結合させたもの
）をＣ１ａＩで消化し、得られた１、９ｋｂの断片をク
レノーＤＮＡポリメラーゼで平滑化した。これと、ｐＴ
ＢｇｐｌＥ７−１７を５ａｌｌで開裂した後にクレノー
ＤＮＡポリメラーゼで平滑化したベクターとを結合させ
、発現プラスミドｐＴＢＥ７ｄｈｆｒ４を作製した（第
１図−７）。

実施例５　　ＶＺＶｇｐＩ遺伝子（トランケイテッド型
）の動物細胞における発現 （１）実施例３に記載のトランケイテッド型ｇｐ■発現
プラスミドｐＴＢｇｐＩＥｃＴおよびｐ’ｒＢｇｐＴＥ
７−１７をＣ０８−７細胞に導入シテー過性の発現を免
疫沈降法により検討した。

ＣＯ５−７細胞（５Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ／　１０ａ
ｎφｄｉｓｈ）を接種し、１８時間後に上記プラスミド
（３ａＩｇ／ｄｉｓｈ）をＷｉｇｌｅｒら〔セル（Ｃｅ
ｌｌ）　１６．７７７−７８５（１９７９））の方法に
従ってトランスフェクションした。この細胞を１０％牛
脂児血清（Ｆ　ＣＳ　；　Ｗｉｔｔａｃｋｅｒ　Ｂｉｏ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を含むダルベツコＭＥＭ培地（
ＧＩＢＣＯ社製）で２日間培養した後、メチオニン不含
の培地に交換して、２０ＩＬＣｉ／ｍｆｌ（０，７４Ｍ
　Ｂ　ｑ　／　ｍ　Ｑ　）の３５Ｓ−メチオニン（アマ
ジャム社製）を加えて一晩培養した。

培養上清を回収し、４００μＱの上清に対し、２０μ氾
の抗ｖＺｖウサギ抗血清〔不活化ＶＺＶ（ＬＥＥ　ＢＩ
ＯＭＯＬＥＣυＬＡＲＲＥＳＥＡＲＣＨＩＮＣ！を製）
５０１Ｌｇを３回ウサギに免疫して作製したもの〕を加
え、室温で２時間放置した。これにプロティンへ−セフ
ァロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を加えて室温で３
０分撹拌した。遠心分離によって沈殿を回収し、沈殿を
洗浄用緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉ　５−ＨＣｎ　（ｐＨ
７，５）、５ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ　　ＮａＣ
Ｑ、０．０５％　ＮＰ−４０，０，１％　ＢＳＡ）で３
回洗浄した後、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（６２，５ｍＭ　
Ｔｒｉ　５−ＨＣＱ　（ｐＨ８，０）、２％ＳＤＳ、１
０％グリセロール、５％２−ＭＥ　、　０．００１％Ｂ
ＰＢ）を加えて１００℃、３分間加熱した。この標品を
冷却後に１０〜２０％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドグ
ラジェントゲル（第一化学社製）を用いて電気泳動にか
けた。泳動後、ゲルを１０％酢酸／２５％メタノール中
で固定し、増感剤（Ａｍｐｌｉｆｙ、アマジャム社製）
を浸透させた。ゲルを乾燥後、フルオログラフィーを行
った結果、ｐＴＢｇｐｌＥｃＴを導入した細胞では分子
量約４０〜６０にのｐＴＢｇｐＩＥ７−１７を導入した
細胞では約７５〜９０にの遺伝子産物がそれぞれＣ０８
−７の培養上清に分泌されていることが分かった（第３
図）。

（２）実施例４に記載されている発現プラスミドｐＴＢ
Ｅ７ｄｈｆ　ｒ４　（２０μｇ／１０ｃｍφｄｉｓｈ）
をＣＨＯｃｌｈｆ’ｒ−細胞［Ｕｒｌａｕｂ、　Ｇ、お
よびＣｈａｓｉｍ。

３５ Ｌ、Ａ、、プロシージングスオブザナショナルアカデミ
ーオブサイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　７７、４２１６（１９８０）］に
Ｗｉｇｌｅｒらの方法に従ってトランスフェクションし
た。３〜４日毎に培養液（１０％ＦＣ８と３５μｇ　／
　ｍ　ｎプロリンを含むダルベツコＭＥＭ培地）を交換
しながら２週間培養して、出現したｄｈｆｒ＋のコロニ
ーを単離した。いくつかのコロニーについて培養上清中
へのトランケイテッド型ｇＰＩの分泌発現を前述の免疫
沈降法により検討した結果、分子量約８３にのトランケ
イテッド型ｇＰＩを発現しているクローン（ＣＨ○／Ｇ
ＰＩ　　４−１．２）を得た（第４図）。

【図面の簡単な説明】

第１図−１、第１図−２、第１図−３、第１図−４、第
１図−５、第１図−６および第１図−７は本発明の実施
例で用いているプラスミドの構築図であり、第２図は本
発明で得られたｇＰＩ遺伝子の塩基配列およびそれから
推定されるアミノ酸配列である。第３図および第４図は
本発明で得ら３６− れた発現プラスミドを用いた蛋白質の発現の結果を示す
電気泳動図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）分子中にアミノ酸配列（ I ）： 【遺伝子配列があります。】 を含有する蛋白質。
2. （２）請求項１記載の蛋白質をコードする塩基配列を含
   有する組換えＤＮＡ。
3. （３）請求項２記載の組換えＤＮＡを保持する形質転換
   体。
4. （４）請求項３記載の形質転換体を培養し、培養物中に
   請求項１記載の蛋白質を生成蓄積せしめ、これを採取す
   ることを特徴とする該蛋白質の製造法。