KR0123892B1 - 인간의 콜로니 자극 인자 - Google Patents

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Description

인간의 콜로니 자극 인자

제1도는λcM5의 cDNA의 제한효소에 대한 도면.

제2도는(제2a∼2d도)는 M13 파지를 사용한 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종지법 및 맥삼-길버트(Maxam-Gilbert)화학적 변이법으로 측정한 cDNA의 뉴클레오티드의 결합서열도.

제3도(제3a와 3b도)는 cDNA에 의하여 암호화된 M-CSF 선구 단백질의 1차 구조도.

제4도(제4a∼4d도)는 λcM11의 cDNA의 뉴클레오티드 결합 서열도.

제5도(제5a∼5c도)는 λcM11 cDNA에 의하여 암호화된 M-CSF 선구 단백질의 1차구조도.

제6도는 COS 세포 발현 매개자 pcDE를 제조하는 방법을 나타내는 도면.

제7도는 M-CSF 발현 플라스미드 pcDM·CSF를 제조하는 방법을 나타내는 도면.

제8도는 M-CSF 발현 플라스미드 pcDM·CSF11-185를 제조하는 방법을 나타내는 도면.

제9도(제9a∼9c도)는 M-CSF 발현 플라스미드 pIN-Ⅲ(lppP-5)-OmpA-MCSF11-NV151를 제조하는 방법을 나타내는 도면.

제10도는 M-CSF 발현 플라스미드 pIN-Ⅲ(lppP-5)-OmpA-MCSF11-NV151에 의하여 암호화된 아미노산 결합서열도.

제11도는 M-CSF 발현 플라스미드 pIN-Ⅲ(lppP-5)-OmpA-MCSF11-NV143에 의하여 암호화된 아미노산 결합서열도.

제12도(제12a∼12b)는 M-CSF 발현 플라스미드 pcDM·CSF11-dhfr를 제조하는 방법을 나타낸 도면.

제13도는 DEAE-5pw 이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피법으로 얻은 CHO·M-CSF 용리 단면도.

제14도는 CHO·M-CSF의 등전점을 측정해서 얻은 결과 그래프.

제15∼20도는 실시예3,(1)∼(4)에 따른 2-시스트론 발현계의 구조도.

제21도는 DEAE-5pw 이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피로 얻은 M-CSF 용리 단면도.

제22도는 M-CSF 발현 플라스미드인 pcDM·CSF11-dhrf RO·pSV25-MCSF11-dhrf 및 pRSVS-MCSF11-dhrf의 구조도.

본 발명은 의약품으로 유용하게 사용될 수 있는 새로운 인간의 콜로니 자극인자(human colony stimulating fautors; CSFs), 특히 재조합형 CSFs및 그 제조 공정에 관한 것이다.

일반적으로, 조혈세포들의 증식 및 분화에는 특이한 증식 및 분화인자들이 요구된다.

이러한 여러 인자들은 적혈구, 과립구, 대식세포, 호산구, 혈소판 및 임파구와 같은 다양한 형태의 혈구로 되는 조혈세포의 분화 및 증식에 참여한다(야스사다 미우라, 블러드스템쎌스(Blood Stem Cells), 수가이 이가꾸사, 1983).

이들 인자들중에서 CSFs는, 과립구의 전구세포와 대식세포의 전구세포의 증식과 분화를 자극하는 인자로 알려져 있다.

이러한 CSFs로는, 과립구의 생성에 특이한 G-CSF, 대식세포의 생성에 특이한 M-CSF, 과립구와 대식세포 양자의 생성에 작용하는 GM-CSF 및 잠재능력이 많은 간세포를 자극하는 것으로 알려져 있는 멀타-CSF(IL-3)등이 있다.

위에서 언급한 CSFs는, 그 생물학적 활성 때문에 암에 대한 화학요법과 방사능요법에서 기인하는 이들요법의 일반적인 결점인 백혈구 감소증을 완화시키는 작용이 있다고 생각된다.

CSFs에 대한 임상염구가 이러한 관점에서 수행되었다.

또한 CSFs는, 백혈구의 기능 활성화 능력을 갖는다는 것이 알려져 있으며(로페즈, A.F 등, 저널 오스 임뮤놀러지, 131, 2983(1983), 핸담, E 등, 저널 오브 임뮤놀러지, 122, 1134(1979) 및 베이더스 M.A 등, 저널 오브 임뮤놀러지, 130, 795(1983))따라서 여러가지 전염병의 예방과 치료제로서 효과적이라는 것도 알게 되었다.

더우기, CSFs는 분화유발활성을 갖고 있으므로, 골수성 백혈병의 치료에 효과적이라는 사실도 알려져 있다(메칼프 등, 인터내셔널 저널 오브 캔써, 30,773(1982)) .

CSFs의 활동은, 예컨대 인간의 소변 및 여러가지 배양된 세포계통의 배지에 있어서의 태아세포, 비장세포등의 배양에서 찾아볼 수 있으며, 이들의 활성부는 분리되어 사용된다.

그러나, 어떤 CSF는 유사한 이물질이나 출발물질에서 유래한 물질을 함유하는 또 그 자체는 저농도이므로, CSF를 제조하기 위해서는 이러한 제반 문제점들을 해결해야 한다.

균일성, 수율, 조작의 용이성등의 관점에서 볼 때, 의약품으로서의 CSFs를 상업적으로 제조하기 위해서는 여전히 많은 해결해야할 문제점을 가지고 있다.

본 발명자들은 이미 인간의 백혈병 T세포로부터 유도한 세포계통 AGR-ON을 확보하고 있는데, 이것은 항상 균일한 상태로 CSF를 다량 생산할 수 있는 능력을 갖고 있으며, 이 세포계통과 관련된 특허를 출원했다(일본 특허 공개번호 소59-169489).

본 발명자들은 AGR-ON으로 만든 CSF의 정제에 대한 실험을 반복한 끝에 높은 수율로 순수한 형태를 제조하는 방법을 개발하였으며, 이 CSF의 생화학적 특성 및 구조적 특성을 규명하여 이러한 특성들을 갖는 물질로서 CSF에 관련된 발명을 특허 출원했다(일본 특허 공개번호 소62-169799).

상기의 발명에 의한 CSF는, 정상적인 골수세포에 작용하여 대식세포의 분화 및 증식을 촉진시키는 당단백질인 M-CSF이며, 다음과 같은 물리화학적 특성을 갖는다. CSF는 AGR-ON·CSF라 칭하였다.

a) 분자량

비환원 상태하에서 SDS 폴리아크릴아마이드겔 전기이동법으로 측정하니 33000∼43000돌턴(daltons)이었으며, SDS 존재하의 비환원 상태하에서 겔여과법으로 결과는 23000∼40000돌턴이었다.

b) 단백질부의 N-말단 아미노산 결합서열

다음과 같은 1차 구조식의 결합서열

본 발명의 주목적은 유전공학기술에 의하여 인간의 M-CSFs를 제조 공급하는 기술 및 의약품으로서 유용한 인간의 McFs를 제공하는 것이다.

본 발명에 대한 이와 같은 목적과 다른 특성들은 다음의 세부적인 설명에서 잘 나타날 것이다.

본 발명에 따르면, 완성이나 미완성 상태로 다음의 식(1)에서 나타난 아미노산 결합서열에 대한 인간의 M-CSF 유전자 암호(gone coding)를 표시해서 얻는 생물학적 활성의 재조합된 인간의 M-CSF가 제공된다.

여기서 X는 Tyr 또는 Asp이다.

펩타이드와 아미노산은 이 분야에서 통상적으로 사용되는 기호나 이유팩(IUPAC)에서 채택한 아미노산 명명법에 따른 기호를 사용했다.

뉴클레오티드 결합서열 및 핵산들도 유사하게 표현하였다.

이미 서술한 바와 같이, 생물학적 활성도로 인하여 본 발명에 의한 M-CSF는, 백혈구 감소증을 포함한 질병의 예방과 치료제로서, 골수이식에 대한 보조제로서, 각종 전염병의 예방과 치료제로서, 그리고 항암제 등으로서 의약분야에서 특히 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서의 인간의 M-CSFs는, 유전공학 기술로 제조된 재조합형 M-CSFs이며, 앞서 언급한 분야에서 두루 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 인간의 M-CSF는, 숙주세포에 있어서 유전자를 표기하기 위한 재조합 DNA의 제조, 변환을 위한 DNA의 숙주세포로의 도입 및 결과적인 변환물(transformant)의 배양으로, 그 인자에 대한 유전자 암호전달(이하, 본 발명의 유전자라 함)을 실용화하고자 제조되었다.

본 발명에 따른 인간의 M-CSF를 제조하는데 있어 용도에 관하여는, 본 발명의 유전자 다음에 세부적인 설명이 있겠다.

본 발명의 유전자는, 예컨대 M-CSF를 만들 능력이 있는 인간의 세포로부터, 보다 구체적이고, 유리하게는 AGR-ON으로부터 분리한 mRNA로부터 제조된다.

유전자의 제조는, 비록 그 유전자가 다른 세포로부터 유사하게 제조가능하기는 하지만, 지금부터는 AGR-ON에 관하여 설명하기로 한다.

AGR-ON은 인간의 백혈병 T세포에서 유도된 인간세포이며, 일본국 특허 공개번호 소59-169489에 그 특징이 나타나 있다.

이 세포계통은 ATCC 기탁번호 CRL-8199로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁되어 있다.

mRNA는 기본적으로 일반적인 추출방법에 의하여 AGR-ON에서 분리된다.

보다 상세하게 말하자면, AGR-ON은, 예컨대, 필요하다면 태아송아지 혈청(FCS)등이나, 알부민과 같은 혈청 성분을 가한 CEM 배지, CMRL-1066 배지, DM-160 배지, 이글스최소필수배지(Eagle's MEM), 피셔배지, F-10 배지, F-12 배지, L-15 배지, NCTC-109 배지, RPMI-1640 배지등에서 배양된다. AGR-ON은 대략 1×10⁴∼1×10⁷세포/ml 농도의 배지에서 접종되고, 대략 30∼40℃에서, 보다 이상적이라면 37℃에서 1∼5일동안, CO₂인큐베이터에서 배양되는 바와 같은 일반적인 방법으로 배양한다. CSF가 생성축적되면, 배양된 세포들은, SDS, NP-40, 트리톤×100 또는 데옥시콜린산과 같은 적당한 세탁제를 사용하여 부분적으로 또는 완전히 용해시키거나, 균질가(homogenizer)나 동결해빙법(freeze-thaw method) 같은 몇몇 물리적인 방법으로 파쇄된다.

그 다음 염색체 DNA는, 폴리트론(polytron, 스위스 키네마티카사 제품)등의 믹서나 주서기로 절단된다.

그런 후, 전체 RNA를 추출하고자, 핵산부로부터 단백질을 제거한다.

이런 공정에는, 예컨대 구아니듐 CsCl 초원심분리법(쉬그윈, J.M 등, 바이오케미스트리, 18 , 5294(1979))이 통용된다.

RNase에 의한 RNA의 감성(degradation)을 방지하기 위하여, 상기의 방법과 절차는 헤파린, 폴리비닐설페이트, 디에틸피로카르보네이트, 바나딜-리보뉴클레오사이드 복합물 같은 RNase 억제인자들의 존재하에 수행 가능하다.

mRNA는 추출된 RNA로부터 분리 가능하고, 예컨대 올리고 dT-셀룰로오스, 폴리-U-세파로스등을 사용하는 컬럼법이나 배치와이즈(batchwise)법에 의해 정제할 수 있다.

원하는 M-CSF에 상응하는 mRNA는 예컨대, 설탕 농도구배 원심분리에 의한 mRNA들의 부분분리에 의해, 제노퍼스 레비스(Xenopus laevis) 난모세포들이나, 토끼의 망상적혈구 용해질, 밀의 배아 추출물등의 무세포계 같은 단백질 해독계(translation system)로 이 부분을 도입하여 단백질로 해독하도록 하고, 단백질의 M-CSF 활성을 조사하는 것으로 원하는 M-CSF의 존재를 확인할 수 있다. M-CSF 활성도 측정 대신에, M-CSF에 대항하는 항체를 사용하는 면역학적 검정이 소망하는 mRNA를 확인하는데 또한 유용하다.

이렇게 얻어진 정제 mRNA는, 보통 불안정하나 안정한 cDNA로 전환되고, 원하는 유전자를 증폭하기 위해 미생물로부터 유도된 레플리콘과 결합된다. mRNA의 cDNA로의 전이 즉, 본 발명이 원하는 유전자 합성은 통상적으로 다음의 조작에 따라 수행된다.

시발체(primer, dT가 붙은 매개자)로서 올리고 dT를 사용하고, 주형(template)으로서 mRNA를 사용하여, mRNA에 대해 단사상보적 DNA는 dNTP(dATP,dGTP, dCTP 또는 dTTP) 존재하에 리버스트랜스크립타제(reverse transcriptase)를 사용하여 합성된다.

다음 단계는, 올리고 dT를 사용하느냐 또는 dT 부착 매개자를 사용하느냐에 따라 다음과 같이 다르다.

전자의 경우에는 주형으로 사용된 mRNA는 알칼리성 가수분해로 제거되고, 이중사 DNA(double-stranded DNA)는, 리버스트랜스크립타제와 DNA 폴리머라제 I을 사용하여 주형으로 제공된 단사 DNA로부터 합성된다.

이어서, 이중사 DNA 양끝은 액소뉴클레아제(exonuclease)로 처리되고, 적당한 연결체 DNA나 어니일링(annealing)에 따른 염기들의 조합물이 각 끝에 부착되며, 이렇게 만들어진 DNA는 Ek형 플라스미드 매개자(plasmid vector)나, λgt상 매개자 같은 적합한 매개자로 삽입된다.

후자의 경우에는 선형 매개자-cDNA : mRNA 및 연결체 DNA(이렇게 사용되는 연결체 DNA는 종종, 동물세포내에서 자발적으로 복제가능한 부분을 갖는 DNA 부분 및 전사촉진제임)는 원형으로 어니일링된다.

이 mRNA는 cDNA 함유 재조합 플라스미드를 얻고자, dNTP의 존재 및 RNaseH와 DNA 폴리머라제 양자 존재하에 DNA 스트랜드로 교체된다.

따라서, 이렇게 얻어진 DNA는, 변형을 위해 Escherichia coli, Bacillus subt ilis 또는 saccharomyces cerevisiae와 같은 적당한 숙주내로 도입된다.

DNA는 통상적인 방법, 예를 들어 로그적 발육상으로 집적시키고, 이 DNA를 쉽게 받아들일 수 있도록 CaCl₂로 처리하여 숙주내로 도입시킬수 있다.

이러한 방법은 변형 효율을 향상시키고자 알려져 있는 MgCl₂나 RbCl의 존재하에 수행될 수 있다.

이러한 숙주세포는 변형전에 원형질체나 구형질체로 변환될 수 있다.

이렇게 하여 제조된 변환물중에서, 원하는 M-CSF의 cDNA를 함유하는 하버링(harboring)은 예컨대 다음 방법들중의 하나로 선발된다.

(1) 합성 올리고뉴클레오티드 프로부를 사용한 스크리닝

원하는 단백질의 아미노산 결합서열이 전체적으로나 부분적으로 밝혀졌을 때(즉, 단백질의 어떤 부분에서 여러가지 아미노산의 특이한 결합서열이 알려졌을 때), 그 아미노산에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 숙주세포의 코돈 사용법을 고려하여 합성된다.

이렇게 합성된 올리고뉴클레오티드는 하나 혹은 혼합된 프로브(probe)로 사용될 수 있다.

후자의 경우에, 조합의 수는 이노신 사용으로 줄일 수 있다.

올리고뉴클레오티드는 32P나 35S로 표시되고, 고정되어 있는 변환물의 DNA를 갖는 니트로셀룰로오스 필터에 잡종형성(hybridization)시킨다.

원하는 변형물이 얻어진 양성 잡종으로부터 유추된다.

(2) M-CSF를 생성하는 동물세포의 스크리닝

변환물을 원하는 유전자로의 증폭을 위해 배양되고, 동물세포들을 그 증폭된 유전자와 트랜스펙(transfec)된다(이 경우에 사용되는 플라스미드는 자발적으로 복제가능하고, mRNA 전사촉진제를 갖는 것이거나, 동물세포 염색체와 통합할 수 있는 것이다.).

따라서, 이러한 세포들은 각각의 유전자들에 의해서 암호화된 단백질들을 생산할 수 있게 된다.

이러한 세포들의 각 배양물의 상등액, 또는 세포추출물을 M-CSF 활성도에 대해 분석하거나, M-CSF에 대항하는 항체를 사용하여 M-CSF를 검출하는 것으로 M-CSF에 특이한 cDNA를 갖는 원하는 변환물이 선택된다.

(3) M-CSF에 대항하는 항체를 사용한 선택

단백질을 나타내도록 변환물을 허용하는 매개자속으로 cDNA를 도입한다.

M-CSF를 생산하는 바람직한 변환물은 M-CSF에 대항하는 항체 및 그 항체에 대항하는 2차 항체를 사용하여 검출한다.

(4) 선택적인 잡종형성-해독계의 사용

세포를 만들어내는 M-CSF로부터의 mRNA를 니트로셀룰로오스 필터에 고착된 변환물에서 유도된 cDNA와 잡종형성시켜, cDNA에 상응하는 바람직한 mRNA를 회수한다.

회수된 mRNA는 Xenopus laevis 난모세포나 토끼의 망상적혈구 용해질, 밀의 배아추출물등의 무세포계와 같은 단백질 해독계에 도입되어 단백질로 해독된다.

그러한 단백질은 M-CSF 활성도에 대해 분석되거나, M-CSF에 대항하는 항체를 사용하여 원하는 변형물을 확인하는데 쓰인다.

M-CSF에 대한 DNA 암호는, 기지의 방법, 예컨대, 세포로부터 플라스미드 DNA에 상응하는 부분을 분리하고, 플라스미드 DNA로부터 cDNA 부위를 분리해내는 방법으로 원하는 변환물로부터 얻는다.

따라서, 얻어진 DNA는, 제3도에서 나타난 372개의 아미노산 결합서열이나, 제5도에 나타난 아미노산 554개의 결합서열로 명백하여진 인간의 M-CSF 선구물질에 대한 본 발명의 암호의 일예이다.

본 발명의 유전자를 사용한 유전공학기술로 얻어진 인간의 생물학적 활성을 나타내는 물질에 있어서, 그 유전자는 위에서 언급한 DNA, 즉 인간의 M-CSF 선구물질의 전체 아미노산 결합서열에 대한 DNA 결합 서열 암호가 같을 필요는 없다.

예를 들어, 인간의 M-CSF의 생물학적 활성을 나타냄으로 해서, 아미노산 결합서열의 일부에 대한 DNA 암호는 본 발명의 유전자에 역시 포함된다.

식(1)에 나타난 전체 아미노산 결합서열이 인간의 M-CSF의 생물학적 활성의 발현에 항상 요구되지는 않는다는 사실은, 제3도의 결합서열을 갖는 선구물질이 그것의 C말단에서 식(1)의 372번째 아미노산(Pro)를 갖는다는 사실, AGR-ON·CSF가 그것의 N 말단에서 35번째 아미노산(Val)을 갖는다는 사실 및 BGR-ON·CSF를 제조할 때 그것의 N 말단에서 33번째 아미노산(Glu)이나 37번째 아미노산(Glu)를 갖으며, 생물학적으로 활성인 M-CSF를 부산물(소수성분)로 산출한다는 사실등으로부터 명백하다.

더우기, 헤모포이에틴(hemopoietin)들 사이의 1차 구조에 있어서의 유사성에 관한 발견들은, 천연적으로 생성되는 M-CSF가 그것의 N 말단에서 27번째 아미노산(Ala)을 갖는다는 것을 지적하고 있는 것 같다(J.W. 슈라더등, 프로세스 오브 내셔널 아카데믹 사이언스(proc, Natl, Acad Sci) 미국, 83권, pp 2458∼2462(1986)).

관련되고 차후에 주어지는 예에서 알 수 있겠지만, 164번째 아미노산(Trp)에서 C말단에서의 아미노산까지 식(11)의 아미노산 결합서열에 대한 부분은 인간의 M-CSF에 대한 생물학적 활성의 발현에 항상 필수적인 것은 아니라는 것이 확인되었다.

결과적으로, 본 발명의 유전자는, 생물학적으로 활성을 갖는 인간의 M-CSF 분자에 대하여 상세히 수록하고, 식(1)에 나타난 아미노산 결합서열의 정보에 근거한 신규의 DNA 결합서열을 갖는다는 것이 특징이다.

보다 구체적으로 말하자면, 본 발명에 의한 유전자는 식(1)로 표시되는 전체 아미노산 결합서열에 대한 DNA 암호 N 말단쪽에 인접한 부분, 예컨대 1∼32번째, 1∼34번째 또는 1∼36번째 아미노산들이나, C-말단쪽에 인접한 부분, 예컨대 164번째 아미노산으로부터 C-말단까지의 전체 또는 일부가 결핍된 식(1)의 아미노산 결합서열에 대한 DNA 암호를 모두 포함하여, 전자의 DNA는 본질적으로 후자의 DNA와 같은 것이다.

본 발명의 유전자는 또한, 위에서 언급한 정보에 기초하여 포스파이트 트리에스테르 공정(내이쳐, 310, 105(1984))와 같은 핵산의 화학적 합성법으로 제조될 수 있다.

본 발명의 유전자는 통상적인 공정으로 제3도에 나타낸 372개의 아미노산이나 제5도에서의 554개의 아미노산 결합서열로 구성된 폴리펩타이드에 대한 DNA 암호로부터 제조하는 것이 더 낫다.

372 또는 554개의 아미노산 결합서열로 구성된 폴리펩타이드에 대한 DNA 암호전달로부터 본 발명의 유전자를 제조할 때 사용되는 방법은 DNA 일부의 화학적 합성, DNA 스트랜드의 결찰, 첨가, 제거 또는 절단등의 효소적 처리와 원하는 DNA의 분리와 정제 또는 복제 및 선택등의 통상적인 방법을 사용한다.

따라서, 본 발명에서 언급된 방법들 이외에도 유전자나 DNA 스트랜드를 다루는 해당 기술분야에서 통상적으로 사용되는 다양한 기지의 방법들도 사용가능하다.

예를 들면, 우리가 바라는 DNA는, 아가로우즈 겔 전기이동법으로 분리, 정제될 수 있으며, 핵산 결합서열에 있어서의 코돈들은 국소에 특이한 돌연변이에 의해서 변이될 수 있다(프로세스 오브 내셔널 아카데믹 사이언스, 81, 5662∼5666(1984)).

바람직한 아미노산을 도입하기 위하여 선택되는 코돈은 특별한 제한은 없으나, 사용하는 숙주세포의 코돈 사용법을 고려하여 통상적인 방법에 따라 결정된다.

상기와 같은 방법으로 얻어진 본 발명의 유전자 DNA 결합서열은, 예컨대 맥삼-킬버트 화학적 변이방법(Metk, Enzym, 65, 499-560(1980)) 또는 M13 파지를 사용한 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종지법(메싱, J와 비에이라 J. 진, 19, 269-276(1982))으로 측정되고 확인될 수 있다.

따라서, 인간의 M-CSF는 본 발명의 유전자를 사용한 재조합 DNA 조작으로 대량으로 용이하게 제조될 수 있다.

본 발명의 유전자를 사용하는 것 이외에도, 인간의 M-CSF는 공지의 통상적인 유전자 조작으로도 제조될 수 있다(몰레큘라클 로닝, T. 마니아티스동저, 콜드 스프링 하버 레버로토리(1982), 사이언스, 224, 1431(1984); 바이오케미스트리 앤드 바이오 피직스 Res, Comn, 130, 692(1985); 프로세스 오브 내셔널 아카데믹 사이언스, 미국, 80, 5990(1983); 유럽 특허 출원 공개번호 187991).

보다 자세히 말하자면, 숙주내에서 본 발명의 유전자를 표현할 수 있는 재조합 DNA를 제조하고, 숙주세포내로 이 DNA를 변화시킨 다음 이 변환물을 배양하는 것으로 인간의 M-CSF를 생산할 수 있다.

유용하게 사용할 수 있는 숙주세포로 전핵세포와 원핵세포 모두 사용될 수 있다.

전핵세포로는 척추동물의 세포, 효모등이 있다.

척추동물의 세포로서 일반적으로 사용되는 것은, 예컨대 원숭이의 세포인 COS 세포(Y. 글루즈만, 셀, 23, 175∼182(1981)), 디하이드로폴레이트 환원효소 결핍종인 중국산 햄스터의 난소세포(G. 울라우브와 L.A. 체이신, 프로세스 오브 내셔널 아카데믹 사이언스, 미국, 77, 4216∼4220(1980))등이며, 그 외에도 다른 세포들도 사용될 수 있다.

척추동물세포의 유용한 발현 매개자는 발현될 유전자의 상부방향에 위치한 촉진자, RNA 접착부위, 폴리아데닐레이션부위, 전사종지 결합서열등을 갖고 있을 수도 있다. 이러한 매개자들은 필요한 경우 복제원을 갖을 수도 있다.

유용한 발현 매개자의 예로서는, 초기 촉진제 SV40을 갖는 pSV2dhfr이 있으나(S. 사브라미니, R. 물리칸 및 P. 베르그, 몰레큘라 셀 바이올러지, 1, 854∼864(1981)), 한정적이지는 않다.

효모는 진핵 미생물로서 널리 사용되며, 그 중에서도 Saccharomyces속의 것이 보통 유용하게 사용된다.

효모등의 진핵 미생물에 대한 통상적인 발현 매개자의 예로는 산 포스파타제 유전자에 대한 촉진제를 보유하고 있는 pAM82가 있다(A. 미야노하라등, 프로세스 오브 내셔널 아카데믹 사이언스, 미국, 80, 1-5(1983)). E. Coli 및 Bacillus Subtilis는 원핵 숙주로서 보편적으로 사용된다.

본 발명의 예를 들면 숙주내에서 복제가 가능한 플라스미드 매개자를 사용한다.

매개자 내에서 본 발명의 유전자를 발현시키기 위하여, 단백질 합성 착수에 필요한 ATG와 본 발명의 유전자 상부에 촉진제 및 SD(Shine-Dalgarno) 결합서열을 갖고 있는 발현 플라스미드를 사용할 수 있다.

숙주 대장균으로서 널리 사용되는 대장균은 E. Coli K12 균주이다.

pBR322는 일반적으로 사용되는 매개자이다.

그러나 이것은 제한적이지 않으며, 다양한 공지의 균주들과 매개자들도 사용될 수 있다.

사용 가능한 촉진제의 예로는, 트립토판 촉진제, PL 촉진제, lac 촉진제, lpp 촉진제등이 있다.

본 발명의 유전자는 상기의 촉진제중 어느 것에 의해서도 발현될 수 있다.

본 발명의 유전자를 사용해서 인간의 M-CSF를 제조하는데는, 예컨대 숙주세포로서 COS 세포를 사용하는 것이 바람직하다.

숙주세포로서 COS 세포가 사용되는 경우에는 사용된 발현 매개자는 SV40 복제원을 보유하며, COS 세포내에서 자발적으로 복제가능하고, 전사촉진제, 전사종결부호와 RNA 접착부위등을 갖는 매개자이다.

예를 들면, 다음의 실시예에서 나타난 바와 같은 플라스미드 pcDE가 사용될 때에는 본 발명의 유전자는 SV40 초기 촉진제로부터 하부방향에 위치한 제한효소 EcoR I의 부위에서 플라스미드와 부착되며, 이렇게하여 원하는 발현 플라스미드가 얻어지게 된다.

이렇게 해서 얻는 원하는 재조합 DNA는 통상적인 방법에 따라 숙주세포내로 도입된다.

예를 들면, 플라스미드 pcDE내로 유전자를 삽입시켜 제조한 발현 플라스미드는 DEAE-덱스트란법이나, 칼슘 포스페이트-DNA 공동침전법으로 COS 세포내로 도입되며, 이렇게 하여 원하는 변형물을 얻을 수 있다.

본 발명의 유전자를 사용해서 인간의 M-CSF를 제조하는데는 중국산 햄스터의 난소세포(CHO-Duk dhfr)의 디하이드로폴레이트 환원효소 결핍균주가 숙주로서 사용되는 다른 공정이 바람직하다.

본 발명의 유전자를 사용해서 인간의 M-CSF를 제조하는데에는, 숙주로 대장균과 같은 전핵 미생물이 사용되고, 내부막 바깥쪽의 원하는 M-CSF를 분비 및 발현하는데 부호 펩티드가 사용되는 다른 공정이 바람직하다.

널리 알려져 있는 부호 펩티드에는 Lpp, OmpA, OmpF, phoE등 외막단백질 그리고 phoA, Bla, pstS 등의 주변 세포질 단백질등이 있는데, 이중에서 OmpA가 가장 좋다.

본 발명의 유전자를 사용하여 인간의 M-CSF를 제조하는데는, 숙주로서 대장균과 같은 전핵 미생물이 사용되고, 결합서열에서 2개의 시스트론으로 구성되어 있는 유전자 발현계인 2-시스트론계로 M-CSF를 발현하는 다른 공정이 바람직하다.

이 공정은 숙주세포에서 누적되므로서 안정성이 좋은 많은 량의 원하는 M-CSF를 만들게 된다.

본 발명의 M-CSF를 제조하는 이 공정은 자세히 서술될 것이다.

첫째, 발현 플라스미드는, 2 시스트론 즉, 적합한 폴리펩티드에 대한 첫번째 시스트론 암호로서의 유전자, 그리고 두번째 시스트론으로서의 본 발명의 유전자로 제조된다.

플라스미드가 유전자를 발현하는데 필요한 촉진제 및 SD 결합서열에 대해 첫번째 시스트론으로부터의 상층부를 포함하고, 첫번째 시스트론의 마지막 코돈 및 두번째 시스트론의 시작 코돈에 대해, 두번째 시스트론의 발현을 위해 SD결합서열을 포함하는 합성 연결체 1개당, 두번째 시스트론으로부터 상층부를 제외한 첫번째 시스트론으로부터 하층부를 포함한다는 것은 비평적이다.

첫번째 시스트론으로 사용되는 유전자는 그 유전자가 숙주에 의해 발현될 수 있는 한, 합성이나 천연 유전자일 것이다.

그러나 첫번째 시스트론에서 암호화된 폴리펩티드를 본 발명의 M-CSF와는 차이가 있으며, 결과적으로 분리되어야만 하기 때문에, 그 폴리펩티드가 소수성이어야 하고, M-CSF의 그것으로부터 차이가 나는 분자량을 갖는다는 점에 주의하자.

따라서, 첫번째 시스트론은 이러한 폴리펩티드에 대해 한개의 암호인 것이 바람직하다.

선호된 첫번째 시스트론의 예로는, IL-2, IFN-α, -β, -γ 등에 대한 암호 및 대략 50∼100 정도의 아미노산 잔기들에 대한 암호의 유전자 및 단편들이 있다.

첫번째 시스트론으로부터 상층부에 배열된 촉진제와 SD 결합서열은 이미 알려진 것들이다.

이러한 촉진제에는 trp 촉진제, tac 촉진제, PL 촉진제, PR 촉진제, lpp 촉진제, OmpA 촉진제, lac 촉진제등이 있으며, 이들중 특히 trp 촉진제, PL 촉진제 및 PR 촉진제가 양호하다.

사용가능한 SD 결합서열로는, 원핵 세포의 16S rRNA의 3' 말단과 수소결합형성이 가능한 GGAG 및 AGGA 같은 3∼9 염기쌍의 결합서열이 있다.

시작 코돈과 마지막 코돈은, 첫번째 시스트론과 두번째 시스트론 사이에서 준비되도록 합성 연결체에 존재하고 자연 발생 가능하다.

이러한 코돈은, 예컨대 TGA 및 ATG와 같은 완전한 형태로 각기 사용될 필요는 없으나, 예컨대 TGATG, TAATG 등과 같은 부분적인 중첩 형태로 사용될 수는 있다.

2-시스트론계에서의 사용을 위해, 발현 플라스미드는 통상적인 방법으로 형성될 수 있다(Y. 사오또등, J. Biockem, 101, 1281∼1288(1987); B.S 쇼너등, 프로세스 오브 내셔널 아카데믹 사이언스, 미국, 83, 8506∼8510(1986)).

예컨대, 적당한 제한효소로 본 발명의 M-CSF 유전자를 함유하는 플라스미드를 절단하여, 통상적인 방법으로 M-CSF 유전자를 함유하는 부분을 분리, 정제하여, DNA합성제로 합성 연결체를 제조하여, T4 DNA 리가아제를 갖는 M-CSF 유전자의 상층부에서 그 부분에 연결체를 부착시켜서, 그리고 적합한 부분에서, 첫번째 시스트론을 함유하고 그것을 발현 가능한 플라스미드로 DNA 부분을 병합해서 플라스미드를 만드는 것이 특히 바람직하다.

선택적으로, 원하는 2-시스트론계에 적합한 발현 플라스미드는, 위의 방법으로 나오는 DNA 부분으로 부터 합성 연결체에 부착되는 바와 같이 두번째 시스트론을 함유해서, 그 부분의 상층부 끝에 첫번째 시스트론을 부착시켜서, 그리고 적절한 단백질 발현계를 갖는 플라스미드로 생성된 DNA 부분을 도입시켜서 제조될 수 있다.

이와 같이 얻어진 플라스미드는 변환을 위해 적합한 숙주세포로 도입되어, 2-시스트론계를 통해 원하는 변환물을 얻을 수 있다.

그 변환물이 사용될때에, 첫번째 시스트론에 관련된 단백질과 두번째 시스트론에 관련된 원하는 M-CSF는 각기 단독적으로 발현될 수 있다.

생성물은 예컨대, SDS-PAGE, 웨스턴 블로팅법(Western blotting)등으로 분석 또는 확인 가능하며, 나중에 설명되는 여러가지 방법으로 각자에게서 분리되어 정제될 수 있다.

바람직한 변환물은 통상적인 방법으로 배양될 수 있으며, 이렇게 해서 생물학적으로 활성인 인간이 M-CSF가 만들어지게 되고 누적된다.

배양된 필요한 배지는, 고용된 숙주세포에 종종 사용되는 것들로부터 적당히 선택되는 것이다.

숙주로 대장균등을 사용해서 변환물을 배양하는데는, 예컨대 LB 배지, E 배지, M9 배지, M63 배지등이 유용하다.

널리 알려져 있는 여러가지 탄소공급원, 질소공급원, 무기염, 비타민, 천연추출물, 생리학적 활성물질등이 필요에 따라 이들 배지에 첨가될 수 있겠다.

COS 세포에 유용한 배지의 예로는, RPMI-1640 배지, 듈베코의 변이 이글스 MEM(Dulbecco's modified Eagle's MEM)등이 있으며, 필요하다면 태아의 송아지 혈청(FCS)과 같은 혈청 성분을 보충할 수 있다.

변환물은 대장균의 경우에 숙주세포의 성장에 적합한 조건 즉, 대략 pH 5∼8 정도에서, 이상적인 pH는 7정도에서, 그리고 대략 온도 20∼43℃에서 이상적인 온도 37℃ 정도에서 배양될 수 있다.

세포내 또는 세포의 변환물에 의하여 생성된 M-CSF는 생성물의 물리적 화학적 특성들을 이용한 분리방법들로 분리되어 정제된다(바이올러지컬 데이타 북 Ⅱ pp 1175∼1259, 초판, 6월 23일, 1980, 가부시끼 가이샤 토꾜 가가꾸도진 발행; 바이오케미스트리, 25권, 25, 8274∼8277(1968); Eur. J. Biochem, 163, 313∼321(1987) 참조).

사용가능한 공정에는 재구성 조작, 통상적인 단백질 침전제 사용, 원심분리법, 삼투쇼크법, 초음파법, 한외거르기법(Ultrafiltration), 분자체 크로마토그래피법(겔여과), 흡착 크로마토그래피법, 이온 교환 크로마토그래피법, 친화성 크로마토그래피법, 고성능 액체 크로마토그래피법(HPLC)등의 액체 크로마토그래피법, 투석등이 있으며, 이러한 방법들을 조합해서 사용하기도 한다.

적절한 방법으로 분리하기 위하여 원하는 물질은 배양상청액으로부터 부분적으로 정제된다.

이러한 부분적인 정제는, 예컨대 암모니움설페이트나 소디움 설페이트와 같은 염석제를 사용한 처리와 평평한 한외거르기막, 유공섬유막등을 이용한 한외거르기법으로 수행된다.

이러한 조작은 통상적인 조건하에 일반적인 방법으로 수행된다.

이렇게 얻어진 대충 정제된 생성물은 흡착 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마트그래피등 또는 이와 같은 방법들을 조합한 방법으로 처리되며, 이렇게 하여 원하는 균질의 물질을 얻는다.

흡착 크로마토그래피법은, 예컨대 페닐-세파로스, 옥틸-세파로스 또는 이와 같은 수지를 사용해서 수행된다.

친화성 크로마토그래피는, 원하는 경우 ConA-세파로스, 렌틸렉틴-세파로스(파마시아 제품)등의 수지를 이용한 크로마토그래피로 가능하다.

겔여과는, 덱스트란 겔, 폴리아크릴아마이드 겔, 아가로스 겔, 폴리아크릴 아마이드, 아가로스 겔, 셀룰로오스등으로 된 것을 사용하여 수행된다.

상업적으로는 유용한 것의 예로는 세파덱스 G형, 세파로스형, 세파크릴형(모두 파마시아 제품), 셀룰로파인(씨소상사 제품), 바이오겔 P형, 바이오겔 A형(양자 모두 바이오래드 연구소 제품), 울트로겔 AcA(LKB 제품), TSK-GEL SW형(토소상사 제품)등이 있다.

이온 교환 크로마토그래피법은, 예컨대 디에틸아미노에틸(DEAE)등과 같은 교환 그룹으로서 제공되는 음이온 교환물질을 사용하는 크로마토그래피로 수행된다.

역상 크로마토그래피법은 실리카겔등의 기질을 포함하거나, C₁, C₃또는 C₄알킬, 시아노프로필 또는 페닐과 같은 작용기가 붙은 컬럼을 사용해서 수행된다.

보다 상세하게 설명하자면, 용리액으로 아세토니트릴, 트리플루오로아세트산(TFA), 증류수 또는 이들 용매의 혼합물을 사용하여 C₄하이포어 역상 HPLC 컬럼(C₄Hi-Pore Reverse-Phase HPLC Columm, RP-304, Bio-Rad Laboratories)을 이용해서 크로마토그래피법을 수행한다.

상술한 바와 같은 과정에 의해서, 원하는 M-CSF가 고도로 정제된 형태로, 높은 수율을 상업적으로 생산될 수 있다.

이러한 방법으로 얻을 수 있는 M-CSF는, 제조에 사용되는 유전자의 종류와 그 유전자를 발현하는데 필요한 계의 종류에 따라, 비록 N-말단 아미노산 결합서열, 분자량, 등전점등이 약간 차이는 있어도, 그것들이 CSF 활성을 갖는다는 점에서는 보편적이다.

이들 M-CSF 중에서도, 특히 후에 주어진 예에 의해 얻을 수 있는 것이 바람직하다.

의약품으로 사용하기 위하여, 이렇게 제조된 M-CSF는 효과적인 양으로 M-CSF를 함유함과 동시에 약리학적으로 수용가능한 무독성 부형제를 함유하는 약리학적 조성물로 제조된다.

이 조성물은, 조성물의 형태에 알맞는 투약 경로로 투여된다.

이러한 조성물은, 예컨대 용액, 현탁액, 유화액등과 같은 액체 제제의 형태로 하여 경구, 정맥내, 피하, 피내 또는 근육내로 투여된다.

이러한 투여 방법이나 형태는, 특별한 제한은 없고, 이 M-CSF 조성물은 경구나 그외의 보편적인 투여를 위하여 통상적으로 사용되는 적절한 형태로 제조될 수 있다.

이 조성물은 적당한 부형제를 첨가하여 액체 제제를 재구성시킨 건성제조로서 제공될 수 있다.

어떠한 형태로 제조하든간에 이 조성물의 투여량은 특별한 제한은 없으나, 질병의 종류, 환자의 나이와 성별, 질병의 정도등에 따라 적절하게 결정되며, 이 조성물은 활성 성분인 M-CSF 단백질의 양으로 계산하여 통상적으로 0.001∼1㎎/㎏/일 정도 투여된다.

이 일일 투여량은 한번으로 또는 나누어서 투여된다.

본 발명의 유전자를 제조하는 과정, 이 유전자를 사용하여 M-CSF를 제조하는 과정 및 본 발명의 특징들을 다음의 실시예에 따라 상세히 설명하기로 한다.

실시예에서 제조된 표본들은 다음의 방법에 따라 CSF 활성을 조사했다.

CSF 활성 측정법

태아 송아지 혈청(FCS, 20ml), 30ml의 배지와 2배 농도의 α-배지 20ml를 섞고, 용액을 37℃로 유지한다.

이 용액으로부터 23.3ml를 취한 다음 미리 50℃로 유지한 10ml의 1％ 한천용액(디프코 연구소 제품)을 가하여 한천 배지를 제조하고, 37℃로 유지한다.

BLAB/C 계통 쥐의 대퇴골로부터 채취한 골수세포(BMC)를 행크용액(Hank's blanced Solution)으로 두번 씻어내고, 그 후 10⁷세포/ml의 농도로 α 배지에 현탁시키고, 이 현탄액 1ml를 37℃로 유지된 한천 배지에 첨가한다.

이 혼합물을 강력히 교반하고, 37℃로 유지한다.

이 혼합물 0.5ml를 시험표본 50ml을 사전에 담고 있는 웰(Well, 조직배양 클러스터 12, 코스타상사 제품)들 속에 넣고, 이 혼합물을 신속히 교반한 다음 실온에 장치한다.

각 웰속의 혼합물이 고체화하기 시작하는 때에, 각 웰들을 CO₂배양기로 넣고 37℃에서 7일 동안 배양시킨다. CSF 활성에 대한 지표로 삼기 위해서 광학 현미경하에서 생성된 콜로니의 수를 계측한다.

형태학적으로 관찰한 바, 형성된 콜로니 모두는 대식세포 콜로니였다.

[실시예 1]

본 발명의 유전자의 제조

(1) AGR-ON 세포의 배양

배양된 인간의 T세포 계통 AGR-ON(ATCC 기탁번호 CRL-8199)을 10％의 갓태어난 송아지 혈청(NCS), 20mM N-2-하이드록시옥시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES), 100㎍ /ml 스트럽토마이신, 100단위/ml 의 페니실린 G, 50㎍/ml 겐타마이신, 5×10^-5M 2-머캡토에탄올 및 1mM 글루타민이 포함된 RPMI-1640 배지(플로우-랩사 제품)에 약 10⁵세포/ml의 농도로 현탁시켰다.

그 현탁액 1ℓ를 5개의 조직배양용 플라스크(코닝사 제품)에 넣고, 37℃에서 72시간 동안 배양시켰다.

(2)mRNA의 추출

4M 구아니딘 티오시아네이트 용액(4M 구아니디움 이소티오시아네이트, 50mM 트리스-HCl(pH 7.6), 10mM EDTA, 2％ 사코실 및 140mM 2-머캡토에탄올) 50ml에 공정(1)로 얻은 약 5×10⁸AGR-ON 세포들을 용해시키고, 60℃에서 용융시키고, 18G 분사침을 갖는 50ml 주사기를 사용해서 DNA를 절단시켰다.

이 용액 1부피부(one part by volume)에 대하여 페놀 1부피부, 100mM 소디움 아세테이트(pH 5.2)-10mM 트리스- HCl(pH 7.4)-1mM EDTA 용액 0.5부피부, 그리고 클로로포름-이소아밀알코올(24:1)혼합용액 1부피부를 60℃로 가열하면서 가했다.

이 혼합액을 60℃의 수조속에서 10분간 진탕한 다음, 4℃에서 3000r.p.m으로 15분간 원심분리시켰다.

수용액층을 분리하고, 페놀클로로포름으로 2회 추출한 다음 클로로포름으로 2회 더 추출했다.

이 혼합된 추출물에 이 추출물의 2배 부피의 냉각된 에탄올을 가했다.

이 혼합액을 -20℃에서 60분간 방치한 다음, 4℃에서 3000r.p.m으로 20분간 원심분리시켰다.

이렇게해서 얻은 RNA 침전물을 50ml의 100mM 트리스- HCl(pH 7.4)-50mM NaCl-10mM EDTA-0.2％ SDS용액을 용해시키고, 단백질 분해효소 K(머크사 제품)을 200㎍/ml의 농도로 위의 용액에 가한 다음 37℃에서 60분간 반응시켰다.

60℃에서 이 반응 혼합물을 페놀-클로로포름으로 2회 추출하고, 클로로포름으로 2회 더 추출했다.

이 혼합된 추출물에 추출물 부피의 1/10부피로 3M 소디움 아세테이트(pH 5.2)와 추출물 부피의 2배 부피로 냉각된 에탄올을 가했다.

이 혼합물을 -70℃에서 60분간 방치한 다음, 4℃에서 20분간 3000r.p.m으로 원심분리했다.

이렇게 하여 얻은 RNA 침전물을 냉각된 70％ 에탄올로 씻어낸 다음, TE 용액(10mM 트리스 -HCl(pH 7.5)와 1mM EDTA)에 용해시켰다.

이와 같이 하여, 5×10⁸AGR-ON 세포들로부터 총량 5㎎의 RNA를 얻었다.

이 전체 RNA로부터 mRNA를 얻고자, 이 RNA를 올리고(dT)-셀룰로오스(콜레보러티브 리서치 제품)를 사용한 컬럼 크로마토그래피에 적용시켰다.

흡착시키기 위하여 10mM 트리스-HCl(pH 7.5)-1mM EDTA-0.5M NaCl 용액을 사용했다.

이 컬럼을 동일한 용액으로 세척하고, 10mM 트리스-HCl(pH 7.5)-1mM EDTA-0.1M NaCl 용액으로 또 씻어낸 다음, 10mM 트리스-HCl(pH 7.5)-1mM EDTA로 RNA를 요리시켰다.

상기와 같은 방법으로 약 110㎍의 mRNA를 얻었다.

(3)cDNA 라이브러리의 제조

cDNA 합성계(아메르샴사 제품)를 사용하여 공정(2)에서 얻어진 mRNA 중 5㎍으로부터 cDNA를 얻었다.

얻은 cDNA(약 0.6㎍)을 진공 건조시키고, 50mM 트리스-HCl(pH 7.5)-10mM EDTA-50mM DTT-40mM S-아데노실-L-메티오닌 용액 20μ1에 용해시켰다.

EcoR Ⅰ 메틸라제(뉴잉글랜드 바이오래브 제품) 16단위를 가하고, 이 용액을 37℃에서 15분간 반응시켰다.

이 반응 혼합물을 70℃로 10분간 가열하여, 반응을 종결시키고 페놀-클로로포름으로 추출했다.

이 추출물에 3M 소디움 아세테이트(pH 5.2)를 추출물에 대하여 2.5배 부피로 가한 후, 이 혼합물을 -70℃에서 15분간 방치했다.

이 혼합물을 4℃에서 15000r.p.m으로 15분간 원심분리하고, 침전된 DNA를 EcoR I 연결체(5'-GGAATTCC-3', 일본 다까라 슈조사 제품)가 100㎍/ml 용해되어 있는 10㎍의 50mM 트리스-HCl(pH7.5)-10mM MgCl₂-10mM DTT-1mM ATT-100㎍/ml용액에 용해시킨후, 350단위의 T4 DNA 리가아제(다까라 슈조사 제품)를 이 용액에 가하고, 이 혼합물을 14℃에서 16시간동안 반응시켰다.

이렇게 해서 얻은 반응 혼합물을 70℃로 10분간 가열하여 반응을 종결시켰다.

이 혼합물에 10μl의 100mM NaCl-50mM 트리스-HCl(pH 7.5)-7mM MgCl₂-10mM DTT용액과 40단위의 제한효소 EcoR I(다까라 슈조사 제품)를 가하고, 이 혼합물을 37℃로 3시간 동안 침지(digestion)시켰다.

이 반응 혼합물에 0.8μl의 05M EDTA(pH 8.0)을 가하여 반응을 종결시키고, 과량의 EcoR I 연결체를 바이오겔 A 50m(바이오레드레보러토리 제품) 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 제거했다.

이 cDNA 단편에 제한효소 EcoR I를 소화시키는 λgt11 DNA(프로토클론 GT, 프로메가 바이오텍사) 1㎍을 가하고, 5'-인산기를 제거하기 위하여 알칼리성 포스파타제로 처리했다.

그 후, 이 단편에 3M의 소디움 아세테이트(pH 5.2)를 이 단편의 부피에 대하여 1/10부피로 가하고, 또 에탄올을 단편의 부피에 대하여 2.5배 부피로 가했다.

이 혼합물을 -70℃에서 30분간 방치하고, 4℃에서 15000r.p.m으로 15분간 원심분리했다.

침전된 DNA를 70％ 에탄올로 씻어낸 다음, 진공건조시키고 7μl의 증류수에 용해시켰다.

2μl의 500mM 트리스-HCl(pH 7.5)-100mM MgCl₂를 가한 후, 이 용액을 42℃로 15분간 유지한 다음, 실온으로 냉각시켰다.

이 용액 1μl의 100mM DTT, 1μl의 10mM ATP와 175단위의 T4 DNA 리가아제를 가했다.

이 혼합물을 14℃로 16시간 동안 배양했다.

이 반응 혼합물 10μl에 λ파지충전추출물(packaging extract, packagene system, 프로메가 바이오텍사)을 가하고, 이 혼합물을 22℃로 2시간 동안 방치해서 재조합 파지 DNA를 생체외(in Vitro)에서 충전했다.

0.5ml의 파지희석완충용액(100mM NaCl- 10mM 트리스- HCl(pH 7.9)-10mM MgSO₄, 7H₂O)과 25μl의 클로로포름을 가한 후, 이 용액을 4℃에서 저장했다.

(4)cDNA 라이브러리의 스크리닝

(4)-1 합성 프로브의 제조

다음의 결합서열은 AGR-ON 배양 상청액으로부터 정제된 AGR-ON·CSF의 아미노산 말단 결합서열(27잔기)의 정보에 근거한 합성프로브에 대한 것이다.

전술한 구조식의 결합서열에 상보적인 핵산 결합서열(바로 위에 나타낸)은 M-CSF에 대한 암호와 cDNA를 갖는 재조합 파지를 선별하기 위한 프로브로서 사용하기 위하여 다음의 절차에 따라 합성됐다.

원하는 완벽하게 보호된 DNA는, 고체상 포스파이트 트리에스테르 방법(solid-phase phosphite triester process)으로 자동 합성제(380A DNA 합성제, 어플라이드 바이오 시스템사)를 사용하여 합성되며(내이쳐 310, 105(1984), 여기서 N,N-디알킬메틸포스포로아미다이트 유도체가 축합단위로서 사용됐다.

이 완벽하게 보호된 DNA는 28％ 암모니아수로 55℃에서 10시간 동안 처리되며, 이렇게 하여 5'-말단에 위치한 수산기에 부착되어 보호기로서 제공된 DMTr(디메톡시트리틸)이외의 보호기들(예컨대 A, G, C의 아미노기에 대한 아실기들)이 제거되어, 부분적으로 보호된 DNA(DMTr 단위라 칭한다)로 된다.

이 DMTr 단위는 ODS(일본 야마우라 켄뀨쇼사 제품) 컬럼을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 정제되고, 본래 그대로의 올리고뉴클레오티드를 얻기 위하여 80％의 초산으로 실온에서 20분간 처리했다.

이 생성물로부터 원하는 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위하여, ODS 컬럼을 사용하여 역상 HPLC로 좀더 정제했다.

이렇게 얻어진 DNA(0.8㎍)는 32P로 DNA의 5' 말단을 표시하기 위하여, 100μl 의 반응배지(50mM 트리스-HCl(pH 7.6), 10M MgCl, 10mM 2-머캡토에탄올, 200μ Ci[r-32P]-ATP)를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 18단위의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(다까라 슈조사 제품)와 반응시켰다.

반응되지 않은 [r-32P]ATP로부터 표시된 DNA를 분리하기 위하여, 반응 혼합물을 바이오겔 P-30(바이오-레드래보러토리스)을 사용하여 겔여과시켰다.

이렇게 표식된 DNA 단편들을 모아서, -20℃에서 보존했다.

이렇게 하여 얻은 프로브는 비방사능이 최소 10⁸cpm/㎍ DNA였다.

(4)-2 플라크 잡종화

대장균 Y1090 균주를 50μg/ml의 암피실린과 0.2%의 맥아당이 함유된 40ml의 LB 배지(10g의 박토-트립톤,5g의 박토-효모 추출물과 5g/ℓ의 NaCl)에 접종하고, 300ml의 플라스크속에서 37℃로 하룻밤 동안 진탕, 배양했다.

배양액을 4℃에서 3000r.p.m으로 15분간 원심분리하여 균체들을 모았다.

집적된 균체의 작은 덩어리들은 20ml의 SM 배지(100mM NaCl-50mM 트리스-HCl(pH 7.5)-10mMgSO₄·7H₂O -0.01% 겔라틴)에 현탁시키고, 4℃에서 보관했다.

0.3ml의 균체 현탁액에 공정(3)으로부터 얻은 재조합 파지액 0.1ml을 가하고 3.5×10⁵pfu(플라크 형성 단위) 1ml이 되도록 SM 배지로 희석한 후, 이 혼합물을 37℃에서 15분간 배양시켰다.

이어서, 47℃로 미리 가온한 LB 연질 한천 배지(10g의 박토-트립톤, 5g의 효모 추출물, 5g의 NaCl과 7g/ℓ의 아가로스)를 이 혼합물에 가하고, 이렇게 혼합된 혼합물을 LB 한천 평판(10g의 칵토-트립톤, 5g의 박토-효모 추출물, 5g의 NaCl과 15g/ℓ의 박토-한천)에 부어 겹층으로 만든 다음, 42℃로 하룻밤 동안 배양했다.

각기 20개의 유리접시에 같은 과정을 반복했다.

복사판 필터를 제조하기 위하여, 거기에 형성된 플라크를 갖는 각각의 한천 평판상에 지름 132mm의 나일론필터(BNRG132, 팔울트라 화인 필 트레이션사 제품)을 위치시켰다.

이 한천평판을 마스터평판으로서 4℃로 보존했다.

이 필터들을 0.5M NaOH-1.5M NaCl로 처리하고, 0.5M 트리스-HCl(pH 7.5)-1.5M NaCl 처리한 후, 0.3M NaCl-0.02M NaH₂PO₄(pH 7.4)-0.002M EDTA(pH 7.4)로 처리했다.

그 다음, 공기 중에서 건조시키고, 진공하에서 80℃로 1시간 동안 구웠다.

이 구운 필터를 0.75M NaCl-0.075M 소디움시트레이트-1.0mg/ml의 피콜-1.0mg/ml의 폴리비닐피롤리딘-1.0mg/ml BSA-10mM 소디움포스페이트(pH 6.5)-0.2% SDS-0.1mg/ml 연어정층 DNA의 혼합용액 50ml 속에서 42℃로 6시간 동안 부드럽게 교반시켰다.

이어서, 이 필터를 앞에서 제조한 프로브가 10⁶cpm/ml의 농도로 가해진 위의 용액속에 넣고, 42℃로 20시간동안 부드럽게 교반하여 잡종화시켰다.

잡종화후 이 필터를 용액으로부터 꺼내어, 실온에서 0.9M NaCl-0.09M 소디움시트레이트 용액으로 3회 씻어내고, 56℃에서 5분동안 같은 용액으로 더 씻어냈다.

필터를 공기중에서 건조시킨 후, 감광지를 사용하여 -70℃로 2일간 x-선 필름(XR 5,이스트만 코닥사 제품) 위에 자동방사선투과사진(autoradiograph)를 찍었다.

필름을 현상한 후, 암호부위에 해당되는 마스터평판상의 플라크를 긁어내고, 양성의 암호를 갖는 플라크를 정제하기 위하여 상기의 절차를 반복했다.

이렇게 하여, 양성의 클로운(Clone) λcM5 및 λcM11을 최종적으로 분리해냈다.

(5) cDNA 클로운의 구조분석

λcM5의 제한효소 분석을 행하였으며, 제1도에 그 결과를 나타냈다.

제1도에 나타낸 바와 같이, 이 cDNA는 전체 길이가 약 2.5kb이고, BstEⅡ(뉴잉글랜드 바이오래브 제품), NcoⅠ(다까라 슈조사 제품), SmaⅠ(다까라), KpnⅠ(다까라), EcoRⅠ(다까라), NdeⅠ(뉴잉글랜드 바이오래브 제품)의 각각에 대하여 한개의 절단 부위를 갖고 있으며, StuⅠ와 BamHⅠ(모두 다까라 제품)의 각각에 대하여는 두개의 절단부위를 갖고 있다.

다음에, cDNA의 뉴클레오티드 결합서열을 맥삼-길버트 화학변이법과 M13 파지를 사용한 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종지법을 사용하여 결정했다.

제2도(제2a∼2d도)는 그 결과를 나타내고 있다.

제2도는 5'-말단으로부터 227번째에서 247번째까지의 부위(밑출친 부분)이 합성프로브와 상보적이라는 것을 보여주고 있다.

가장 긴 해석 구조를 λcM의 cDNA로 탐색한 바, 5'-말단으로부터 125번째에서 1240번째까지의 부위가 본 구조임이 판명되었다.

227번째로부터 307번째 염기의 결합서열과, 이것으로부터 코돈에 의하여 암호화된 아미노산 결합서열은 AGR-ON·CSF의 N-말단부위에 있는 27개의 아미노산과 완전히 일치하였다.

이것은 λcM5의 cDNA가 M-CSF 선구 단백질에 대한 cDNA 암호문이라는 것을 나타내고 있다.

제3도(제3a도와 제3b도)는 이러한 결과들로부터 예견된 M-CSF 선구 단백질의 1차 구조를 나타내고 있다.

제4도(제4a도∼제4d도)는 상기와 같은 방법으로 결정된 λcM5의 cDNA의 뉴클레오티드 결합서열을 나타내고 있으며, 제5도(제1도∼제5c도)는 M-CSF 선구 단백질에 대한 암호문과 이로부터 예견된 1차 구조를 나타내고 있다.

[실시예2]

재조합 M-CSF(r-MCSF)의 제조

(1) COS 세포 발현 매개자 pcDE의 제조.

본 실시예에서 사용한 COS-1 세포는 전형된 원숭이의 신장세포 계통 CV1에 의하여 얻어진 세포 계통이며, 복제원(Ori)-결핍 SV40을 가지고 있고, 이것에 의하여 SV40 초기 유전자를 발현하며, T 항원 양성(T antigen positive : 셀 23, 175∼182(1981))으로 된다. 플라스미드 pcDE1(오카야마와 베르그몰레큘라셀 바이올러지(Mol, Cell, Biol), 3, 280∼289(1983))을 우선 제한효소 KpnⅠ으로 절단하고, 그 생성 3'-말단을 둔단(Blunt end)으로 만들기 위하여 T4 DNA 폴리머라제(BRL 제품)로 처리하여 제거했다.

한편으로 EcoRⅠ 연결체(5'-GGAATTCC-3')(다까라 슈조사 제품)의 5'-말단을 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제를 인산화시키고, T4 DNA 리가아제를 사용하여 말단부위를 무디게한 DNA 절편과 결찰(ligate)시켰다. 이렇게 만들어진 결찰은 제한효소 EcoRⅠ와 HindⅢ로 절달된다. 이렇게 얻어진 반응 혼합물을 아가로스겔 전기이동법으로 처리하여 2590bp의 EcoRⅠ-HindⅢ DNA 절편을 분리 정제했다. 플라스미드 PL1(오카야마와 베르그, 몰레큘라셀 바이올러지, 3, 280∼189(1983))을 제한효소 PstⅠ(다까라 슈조사 제품)으로 절단시키고, 그 생성 3' 말단을 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 둔단으로 변환시켰다.

상기에서와 같은 방법으로, EcoRⅠ 연결체를 DNA 전편에 결찰시키고, 이렇게 만들어진 DNA 전편을 제한효소 HindⅢ으로 절단하고, 이 반응 생성물을 아가로스겔 전기이동법으로 처리하여 580bp의 EcoRⅠ-HindⅢ DNA 전편을 분리 정제했다.

얻어진 DNA 전편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여, 사전에 준비한 EcoRE-HindⅢ DNA 전편에 결찰시켜 원하는 플라스미드 pcDE를 생성시켰다.

제6도는 상기의 절차를 도식적으로 나타내고 있다.

(2) M-CSF 발현 플라스미드 pcDM·CSF의 제조

λcM5 DNA를 제한효소 EcoRⅠ로 부분적으로 소화시키고, 부분적으로 소화된 EcoRⅠ 절편들을 아가로스겔을 사용하여 크기별로 분획하여 약 2.5kb의 cDNA 절편들을 분리 정제해냈다.

공정(1)로부터 얻어진 COS 세포 발현 매개자 pcDE를 제한효소 EcoRⅠ로 절단시키고, T4 DNA 리가아제를 사용하여 위에서 준비한 cDNA 절편에 결찰시켜 원하는 플라스미드 pcDM·CSF를 얻었다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 대장균 HB101 균주내로 전형시켜 도입하였다. 원하는 전형체를 알칼리성 용해법(매니아티스등 몰레큘라클로닝, p 90, 콜드스프링 하버 라보라터리(1982))에 따라 얻어진 플라스미드 DNA의 제한효소 분석으로 선발하였다.

제7도는 상기의 공정을 도식적으로 나타내고 있다.

(3) r-MCSF의 제조

COS-1 세포를 DEAE-덱스트란법(프로세스 오브 내셔널 아카데믹 사이언스, 미국, 81권, p 1070(1984))으로 공정(2)에서 제조한 pcDM·CSF로 트랜스펙트(transfect)시켰다. COS-1 세포를 우선, 10% 태아, 송아지 혈청(FCS)을 가한 RPMI-1640 배지에 약 2.5×10⁵세포/ml의 농도로 현탁시켰다. 이 현탁액을 조직 배양용 클러스터-6(코스타사 제품)의 각 웰속에 2ml씩 넣고, CO₂배양기에서 37℃로 하룻밤동안 배양하였다. 이어서 배지를 제거하고, 세포들을 RPMI-1640 배지로 두차례 씻어낸 후, 절차(2)로부터 얻어진 10μg의 pcDM·CSF를 포함하는 1ml의 RPMI-1640(50mM 트리스-HCl(pH 7.4)과 400μg/ml DEAE-덱스트란(파마시아제)을 세포들에 가하고, 이 혼합물을 4시간동안 CO₂배양기속에 방치했다. 배지를 제거한 후, 세포들을 RPMI-1640 배지로 2차례 씻어낸 다음, 150μm 클로로퀸(chloroguine, 시그마케미칼사)이 포함된 3ml의 RPMI-1640 배지를 가하여 3시간동안 배양했다. 이어서, 배지를 제거하고, 세포들을 RPMI-1640 배지중에서 37℃로 72시간동안, CO₂배양기 중에서 배양했다. 배양상청액과 그 추출물들은 각 희석비율에 따라 CSF 활성을 검정하였다. 그 결과를 표1에 나타냈으며, pcDM·CSF 대신에 기준으로 pcDE를 사용하여 상기와 같은 절차로 얻어진 결과도 함께 나타냈다.

표1에 기재된 각 수치는 평판당 콜로니의 수이며, CSF 활성을 나타낸 이후의 표들도 이와 같다.

(4) M-CSF 발현 플라스미드 pcD·CSF-185의 제조.

공정(2)에 의하여 얻어진 플라스미드 pcDE·CSF를 사용하여 원하는 M-CSF 발현 플라스미드 pcDE·CSF-185는 제3도의 186번째 아미노산(Lys)에 대한 암호코돈(AAG)를 종지코돈(TAG)으로 바꾸는 국소-특이적 변이유발법(프로세스 오브 내셔널 아카데믹 사이언스, 81, 5662-5666(1934))으로 제조될 수 있으며, 따라서 이 발현 플라스미드는 C-말단에 제3도의 185번째 아미노산(Thr)을 갖는다.

이 공정을 더욱 상세히 설명하기로 한다.

EcoRⅠ-EcoRⅠ DNA 절편(크기 1.8kb)를 플라스미드 pcDM·CSF로부터 제거하고, 단사(SS) DNA(M13-CSF)를 얻기 위하여 EcoRⅠ 부위에 M13mp11파지(RF)를 클로운시켰다. 한편 합성 올리고뉴클레오타이드[5'-GTGGTGACCTAGCCTGATT-3'(프라이머)]를 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제로 인산화시키고, SS DNA(M13-CSF)로 잡종화시켰다.

어닐링(annealing) 후에 이 잡종을 dNTP의 존재하에서 DNA 폴리머라제 Ⅰ(Klenow 절편)과 T4 DNA 리가아제로 처리하고, 15℃로 18시간동안 배양했다. 이렇게 처리한 DNA를 JM105 컴피턴트 세포(JM105 competent cells)내로 도입하고, 형성된 폴라3들중 50개의 플라크를 한천평판상에 접종한 다음, 37℃로 18시간동안 배양했다. 콜로니들을 포함하고 있는 필터를 통상적인 방법에 따라 알카리-변성시키고, 건조시킨 다음 80℃로 2시간동안 구웠다. 이 필터를 사전 혼성화시킨 후, 실온에서 프라이머[r-32P]ATP의 5'-말단이 표시된 32P-프로브로 잡종화시켰다.

이렇게 잡종화된 필터를 우선 실온에서 6×SSC(Saline Sodium Citrate)로 10분동안 씻어내고, 그 다음 56℃로 4분간 씻어낸 다음 건조시키고, -70℃에서 18시간동안 자동발사선 투과사진(autorodiograph)을 찍었다. M13-CSF-185를 변이 클로운중에서 선발하고, SS DNA와 RF DNA를 제조하기 위해서 JM105에 트랜스펙테이션시켰다.

변이된 결합서열의 정확성은 디데옥시뉴클레오타이드 사슬 종지법으로 SS DNA를 결합서열시키는 것으로 확인될 수 있었다.

원하는 플라스미드 pcDM·CSF-185는, JM105내에서 증폭된 RF-DNA로부터 EcoRⅠ-EcoRⅠ절편을 제조하고, 공정(3)에서와 같은 방법으로 발현 플라스미드내로 이 절편을 삽입시켜서 얻어졌다. 이 플라스미드를 사용하여, COS-1 세포가 공정(3)에서와 같은 방법으로 r-MCSF를 발현하도록 했다.

(5) M-CSF 발현 플라스미드 pcDM·CSF-177의 제조.

프라이머로서 5'-GCTGAATGATCCAGCCAA-3'를 사용하여, 원하는 M-CSF 발현 플라스미드 pcDM·CSF-177은 제3도의 178번째 아미노산(Cys)에 대한 암호코돈(TGC)를 종지코돈(TGA)으로 바꾸는 공정(4)에서와 같은 방법으로 제조될 수 있으며, 따라서 발현 플라스미드는 C-말단에 제3도의 177번째 아미노산(Glu)을 갖는다. 이 플라스미드를 사용하여, COS-1 세포가 공정(3)에서와 같은 방법으로 r-MCSF를 발현하도록 했다.

그 결과를 표3에 나타냈다.

표2와 표3에 나타난 결과들은 M-CSF가 활성을 갖는 원하는 r-MCSF는 본 발명의 유전자를 보유시킨 pcDM·CSF-185와 pcDM·CSF-177에 의하여 발현될 수 있다는 사실을 나타내고 있다. 이것은 제3도에 나타낸 178번째 아미노산으로부터 C-말단까지의 아미노산 결합서열의 부위를 원하는 생물학적 활성을 갖는 M-CSF 분자의 발현에 근본적으로 어떠한 영향도 미치지 않는다는 사실을 나타내고 있는 것이다.

(6) M-CSF 발현 플라스미드 pcDM·CSF11의 제조.

플라스미드 pcDM·CSF11을 λcM5 cDNA 대신에 λcM11 cDNA를 사용하여 공정(2)에 따른 방법으로 얻었다.

r-MCSF는 플라스미드를 사용하여 공정(3)에 의하여 제조되는데 이미 얻은 결과들과 기본적으로 같았다.

더욱 상세히 설명하면, λcM11 DNA를 제한효소 EcoRⅠ로 부분적으로 소화시키고 아가로스겔 전기이동법으로 처리하여 부분적으로 소화된 EcoRⅠ단편으로 EcoRⅠ절편(약 2.5kb)을 정제했다.

공정(1)에 의하여 얻어진 COS 세포 발현 매개자 pcDE를 제한효소 EcoRⅠ로 절단시키고, T4 DNA 리가아제를 사용하여 제조한 cDNA 절편에 결찰시켜서 원하는 플라스미드 pcDM·CSF11을 얻었다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 대장균 HB101 균주내로 전형시켜 도입했다. 원하는 전형물을 알칼리성 용해법(매니아티스등, 몰레큘라클로닝, p 90, 콜드스프링 하버라보라터리(1982))에 따라 그것의 플라스미드 DNA를 제한효소로 분석법으로 선발했다. λcH11 DNA의 cDNA(EcoRⅠ로 부분 소화시킨 절편)를 EcoR Ⅰ클로닝 부위에서 클로닝 매개체로 puc19 DNA(다까라 슈조사 제품)내로 도입하여, 플라스미드 pucMCSF11을 얻었다.

대장균 HB101 균주내로 이 플라스미드를 도입하여 얻은 전형물은 1987년 7월 16일자로 에이전시 오브 인더스트리알 사이엔스 앤드 테크놀러지의 퍼멘테이션 리서치 인스티튜트(Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science Technology)에 기탁번호 FERM BP-1409, 균명 : Escherichia HB101/pVCMCSF 11로 기탁되어 있다.

(7) MCSF 발현 플라스미드 pcDM·cSF11-185의 제조

약 670bp의 EcoRⅠ-BstEⅡ DNA 절편을 분리 정제하기 위하여, 플라스미드 pcDM·CSF11을 제한효소 EcoRⅠ와 BstEⅡ로 소화시켰다.

이 DNA 절편의 BstE OO 말단에 다음의 합성 연결체를 결찰시켰다.

원하는 플라스미드 pcDM·CSF11-185를 얻기 위하여, 위에서 얻은 DNA 절편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 EcoRⅠ로 전술한 플라스미드 pcDE에 결찰시켰다.

이 플라스미드는 합성 연결체의 부위에 해독종지코돈을 갖으며, 따라서 이것의 C-말단에 제5도의 185번째 아미노산(Thr)을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다.

제8도는 상기의 공정을 도식적으로 나타내고 있다. 표4는 이 플라스미드를 사용하여 공정(3)과 같은 방법으로 얻어진 결과들을 나타낸다.

(8) M-CSF 발현 플라스미드 pcDM·CSF11-177의 제조

공정(7)로부터 얻은 플라스미드 pcDM·CSF11-185를 사용하여 제5도의 178번째 아미노산(Cys)에 대한 암호코돈(TGC)를 공정(5)에 따른 종지코돈(TGA)으로 바꾸는 것에 의하여 원하는 M-CSF 발현 플라스미드 pcDM·CSF11-177은 제조될 수 있으며, 이 발현 플라스미드는 그 C-말단에 제5도의 177번째 아미노산(Flu)을 갖는다. 이 플라스미드를 공정(3)과 같은 방법으로 발현시켰으며, 그 결과를 표5에 나타냈다.

(9) M-CSF 발현 플라스미드 pcDM·CSF11-163의 제조

공정(4)와 같은 방법으로, 그리고 프라이머로 5'-AAGGACTGAAATATTTC-3'를 사용하고 공정(7)로 얻은 플라스미드 pcDM·CSF11-185를 사용하여, 제5도에 나타난 164번째 아미노산에 대한 코돈(TGG) 암호를 말단 코돈(TGA)로 교환하여 원하는 M-CSF 발현 플라스미드 pcDM·CSF11-163을 만들었고, 그 발현 플라스미드는 제5도에서, C 말단에 173번째 아미노산(Asp)를 갖게 된다.

공정(3)과 비슷한 조작으로, 그 플라스미드가 COS-1 세포들내에서 r-MCSF를 발현하도록 했다.

이렇게 해서 얻은 상청액의 CSF 활성은 12 콜로니 평판이었다.

이 결과는, 식(1)의 아미노산 결합서열에서, 적어도 164번째 아미노산으로부터 C 말단까지의 아미노산 결합서열은, 원하는 생물학적 활성을 갖는 M-CSF 분자들의 발현에 전혀 영향을 끼치지 않는다는 것을 의미한다.

(10) M-CSF 분비 발현 플라스미드 pIN-Ⅲ(IppP-5)-OmpA-MCSF11-NV151의 제조

플라스미드 pcDM·CSF11-185 DNA를 EcoRⅠ와 BamHⅠ로 소화시킨 후, EcoRⅠ-BamHⅠ DNA 절편(약 680bp)을 분리 정제하고, 플라스미드 pIN-OmpA3-MCSF11-185를 얻고자, 이것을 분비 발현 매개자(secretory expression vector) pIN-Ⅲ-OmpA3(엠보 J. 3, 2437∼2442(1984))의 EcoRⅠ-BamHⅠ클로닝 부위에 삽입시켰다.

XbaⅠ-BamHⅠ DNA 절편(약 770bp)을 분리 정제해 내기 위하여, 이 플라스미드 DNA를 XbaⅠ와 BamHⅠ로 소화시킨 후, 단사의 DNA를 제조하기 위하여 클로닝벡터 puc118 DNA(다까라 슈조사 제품)의 XbaⅠ-BamHⅠ클로닝 부위로 삽입시켜서 플라스미드 puc118-OmpA3-MCSF11-185를 얻었다.

이 플라스미드를 사용하여, puc118-OmpA-MCSF11-NV151은 제5도에 나타낸 폴리펩타이드의 35번째 아미노산(Val)에 대한 암호코돈(GTG)가 OmpA 신호 펩타이드의 C-말단 아미노산(Ala)에 대한 암호코돈(GCC)으로 교체되는 앞에서 언급한 국소-특이한 변형유발법에 의해서 얻을 수 있다.

더욱 상세히 설명하면, 플라스미드 puc118-OmpA3-MCSF11-185 DNA에 의하여 변환된 대장균 JM105를 구원파지 K07(다까라 슈조사 제품)로 감염시키고 이어서 37℃로 14시간동안 배양하여, 단사(SS)의 puc118-OmpA3-MCSF11-185 DNA를 얻었다. 변이유발을 위한 주형으로서 이 DNA를 사용하고 또한, 프라이머로서 5'-TACCGTAGCGCAGGCCGTGTCGGAGTACTGTAGC-3'를 사용하여, 원하는 플라스미드 puc118-OmpA-MCSF11-NV151을 공정(4)에서와 같은 방법으로 하여 얻었다.

XbaⅠ-BamHⅠDNA 절편(약 540bp)을 분리 정제해내기 위하여, 이 플라스미드 DNA를 XbaⅠ와 BamHⅠ로 소화시켰다. 이렇게 하여 얻어진 DNA 절편을 발현 매개자 pIN-Ⅲ(1ppP-5)-A3(Nucl, Acids Res. 13, 310lanf3110(1985))의 XbaⅠ-BamHⅠ내로 삽입시키고, 이렇게 하여 원하는 분비 발현 플라스미드 pIN-Ⅲ(1ppP-5)-OmpA-MCSF11-NV151은 제5도의 351번째 아미노산(Val)으로부터 185번째 아미노산(Thr)까지의 결합서열 부위를 포함하고 있는 폴리펩타이드를 발현시켜 제조되었다.

제9a도∼제9c도는 위의 공정을 도식적으로 나타내고 있다. 제10도는 분비 발현 플라스미드내에 암호화된 아미노산 결합서열을 나타내고 있다. 제10도에서 OmpA 신호 펩타이드는 결합서열중에 밑줄친 부분으로 나타냈으며, 진행부위는 ↓표로 나타냈다.

(11)M-CSF의 분비발현

공정(10)에서 얻은 pIN-Ⅲ(lppP-5)-OmpA-MCSF11-NV151을 대장균 HB101과 JMI109내로 도입하여 외질(periplasm)내로 폴리펩타이드를 분비생산하도록 한 다음, CSF활성을 갖는 외질분액을 모왔다.

더욱 상세히 설명하면, M-CSF분비 발현 매개자를 품고 있는 균주를 50㎍/ml의 암피실린을 포함하고 있는 LB 배지 500ml이 들어있는 용량 2ℓ의 플라스크내에서 37℃로 시간동안 진탕 배양했다.

그후, 실온에서 5000r.p.m으로 5분동안 원심분리했다. 집적된 세포의 작은 덩어리를 50ml의 50mM 트리스-HCl(pH 8.0)-25% 설탕용액에 현탁시키고, 1.25ml의 250mM EDTA(pH 8.0)를 가한 후, 이 현탁액을 부드럽게 교반하면서 실온에 30분동안 유지했다. 그후, 집적된 세포의 작은 덩어리를 얻기 위하여 원심분리하고, 다시 얼음으로 냉각시킨, 증류수 25ml에 현탁시켰다. 이 현탁액을 간헐적으로 부드럽게 교반하면서 30분동안 얼음으로 냉각시킨 후, 외질 분액인 상청액을 모으기 위하여 4℃에서 1000r.p.m으로 5분간 원심분리했다.

(12)M-CSF 분리 발현 플라스미드 pIN-Ⅲ(lppP-5)-OmpA-MCSF11-NV143의 제조

원하는 M-CSF 분비 발현 플라스미드인 pIN-Ⅲ(lppP-5)-OmpA-MCSF11-NV143은, pcDM·CSF11-185대신에 pcDM·CSF11-177을 사용하여 공정 10에 따라 제5도의 35번째 아미노산(Val)으로부터 177번째 아미노산(Glu)까지의 결합서열 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 발현시켜 얻어졌다.

제11도는 플라스미드내에 암호화된 아미노산 결합서열을 나타낸다.

제11도에서 결합서열중 밑줄친 부분은 OmpA 신호 펩타이드를 나타내며, ↓표는 진행부위를 나타냈다.

공정(11)에서와 같은 방법으로 플라스미드는 대장균내로 도입되고 CSF 활성을 나타내는 상등액으로 얻어지게 되는데 이 부분이 외질분액이다.

(13)M-CSF의 HPLC

공정(6),(7),(8)과 (11)에 의하여 얻어진 상등액은 다음과 같은 조건하에 HPLC로 처리했다.

컬럼 : TSK 겔 G3000 SW(60cm×7.5mm(지름)), 토소상사 제품.

용리액 : PBS-함유 0.005% 폴리에틸렌글리릴콜과 0.15M NaCl

유속 : 0.8ml/min

분액부피 : 0.8ml/tube/min.

분자량 조사계(moleculer weight markers)(글구타메이트 수소이탈효소 : 290,000, 락테이트 수소이탈효소 : 142,000, 에놀라제 : 67,000, 아데닐레이트키나아제 : 32,000, 시토크롬 C : 12,400)로 시료들에 대하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

시료 : 공정(6)에 의해서 얻어진 4ml의 배양상청액을 센트리콘-10(아미콘사 제품)을 사용하여 150㎕로 농축시킨다.

CSF 활성은 분자량 범위 320,000-700,000(평균 480,000)에 해당되는 분액에서 발견되었다.

시료 : 공정(7)에 의해서 얻어진 4ml의 배양상청액을 위에서와 같은 방법으로 처리하였다.

CSF 활성은 분자량 범위 66,000-86,000(평균 76,000)에 해당되는 분액에서 발견되었다.

시료 : 공정(8)에 의해서 얻어진 4ml의 배양상청액을 위에서와 같은 방법으로 처리하였다. CSF 활성은 분자량 범위 52,000-86,000(평균 67,000)에 해당되는 분액에서 발견되었다.

시료 : 공정(11)에 의해서 얻어진 외질단편의 분액 2ml을 위에서와 같은 방법으로 약110㎕로 농축하였다. CSF활성은 분자량 범위 30,000-40,000(평균 35,000)에 해당되는 분액에서 발견되었다.

(14)M-CSF의 SDS-PAGE

공정 (6), (7), (8)에 의해서 얻어진 배양 상청액 10ml을 1ml의 conA-세파로스를 충전한 컬럼을 통과시키고, 5ml의 PBS로 씻어낸 다음, 0.5M메틸-α-D-만노사이드를 함유하는 PBS-(10ml)로 용리시켰다.

이렇게 얻어진 용축액 4ml을 센트리콘-10으로 농축시키고, 다음에 설명하는 SDS-PAGE로 농축물을 처리했다.

공정(11)에 의해서 얻어진 외질상청액은 다른 시료로서 사용되었다.

M-CSF는 SDS-PAGE의 웨스턴 블로링을 교질화한 후에 통상적인 방법으로 제조한 M-CSF에 대하여 토끼의 항혈청을 사용하여 검출했다.

더욱 상세히 설명하면, SDS-PAGE는 미니-수직평판세포(mini-vertical slab cell : 겔 농도 15%)를 사용하는 래믈리법(영국, Laemmli, 내이쳐, 2777, 680(1979))에 따라 수행하였다. 웨스턴 블로링은 트랜스볼트 세포(Transbolt Cell : 바이오-래드래보라터리사 제품)을 사용하여 수행하였다.

원하는 물질이 전가된 니트로셀룰로오스 필터를 송아지 혈청 알부민(BSA)이 1% 함유된 PBS-로 차단시키고, M-CSF를 토끼의 항혈청과 반응시킨 다음, 퍼록시다제로 표시된 염소의 항토끼항체(바이오-래드래보라이터리스 제품)과 반응시켰다.

이렇게 처리한 니트로셀룰로오스필터를 M-CSF띠의 검출을 위한 색상전개물질로서 사용되는 4-클로로-1-나프톨용액과 반응시켰다.

표6은 그 결과를 나타내고 있다.

(15)M-CSF발현 플라스미드 pcDM·CSF11-dhfr의 제조

플라스미드 pSV2-dhfr(몰레큘라 셀 바이올러지, 1, 854(1981))을 제한효소 HindⅢ와 BamHⅠ를 사용하여 2개의 절편으로 절단하고 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)유전자를 포함하는 절편을 분리 정제했다.

다음에, 플라스미드 pRSV-CAT(프로세스 오브 내셔널 아카데믹 사이언스, 미국, 79, 6777(1981))를 HindⅢ와 BamHI 를 사용하여 절단시키고, 로스사코마 바이러스(Rous Sarcoma Virus : RSV)의 LTR(long terminal repeat)를 포함하고 있는 절편을 분리 정제했다. 이 두개의 정제된 절편들을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 결찰시켰다. 대장균 HB101 컴피텐트 세포(E. Coli HB101 Competent Cells)에 의해 결찰생성물을 가하여 변화시켰다. 플라스미드 DNA를 항 암피실린 콜로니로부터 제조하고, 제한효소로 소화시켰다. 예측된 제한효소도를 나타내는 원하는 플라스미드 pRSV-dhfr 을 얻었다.

이 플라스미드는 RSV의 LTR부분, DHFR 유전자, SV40으로부터 유도된 개재결합서열(intervening sequence)와 폴리아데닐레이션 신호, 복제원, 대장균 플라스미드 pBR322로부터 유도된 항 암피실린 유전자를 포함하고 있으며 LTR부분에 포함되어 있는 촉진제의 조절하에서 DHFR를 발현시켰다.

이 플라스미드 pRSV-dhfr을 Nde I 와 BamH I를 사용하여 2개의 절편으로 절단시키고, DHFR 유전자를 포함하고 있는 절편을 분리 정제했다. 얻어진 DNA 절편을 DNA 폴리머라제 I(Klenow 절편)으로 처리하여 결합력이 있는 말단을 둔단으로 변환시켰다.

한편, 공정(6)으로부터 얻어진 플라스미드 pcDM·CSF11을 SalI을 사용하여 절단시키고, 절단된 말단을 DNA 폴리머라제 I으로 처리하여 둔단으로 변환시켰다.

얻어진 2개의 절편은 T4 DNA 리가아제를 사용하여 서로 결찰시키고, 이 결찰물을 대장균 JM-109컴피텐트 세포에 변환시켰다.

폴리스미드 DNA는 얻어진 항 암피실린 콜로니로부터 제조되며, 제한효소도를 작성하여, M-CSF와 DHFR 유전자 모두를 발현시킬 수 있는 원하는 pcDM·CSF11-dhfr을 얻었다.

이 플라스미드는, SV40 초기 촉진제(SV40 초기), SV40으로부터 유도된 개재결합서열(SV40 인트론), M-CSF유전자와 폴리아데닐레이션 신호(SV40 폴리 A)등의 M-CSF유전자 발현에 관한 결합서열들과 RSV 로부터 유도된 LTR(RSV-LTR), DHFR 유전자(dhfr), SV40 유래의 개재결합서열(SV40 인트론)과 폴리아데닐레이션 신호(SV40 폴리 A)등의 DHFR 유전자 발현에 관한 서열들을 포함하고 있다. 그 외에 이 플라스미드는 복제원(Ori)와 대장균 플라스미드 pBR322로부터 유도된 항 암피실린 유전자(Ampr)도 포함하고 있다.

그 플라스미드를 대장균 HB101 균주로 도입해서 얻은 변환물은, 기탁명 : Esch erichia Cali HB101/pcDM·CSF11-dhfr, 기탁번호 : FERM BP-2224로 1988년 12월 26일 이래, 에이전시 오브 인더스트리알 사이언스 앤드 테크놀러지의 퍼멘테이션 리서치 인스티튜트(Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science ＆ Technology)에 기탁되어 있다.

제12a도와 제12b도는 위의 과정을 도식적으로 나타내고 있다.

(16)r-MCSF의 제조

이렇게 얻어진 플라스미드 pcDM·CSF11-dhfr를 사용하여, r-MCSF를 공정(3)에 의하여 제조했다. 얻어진 배양상청액의 CSF활성은 평판당 콜로니 수(평균)로 환산하여 68이었다.(기준으로 삼은 플라스미드 pcDE에 대한 것은 0이다.)

(17)CHO세포에 있어서 pcDM·CSF11-dhfr에 의한 M-CSF의 발현

듈베코의 개선된 최소필수배지(DMEM 배지, GIBCO 연구소제품)에 10% FCS, 100mM 소디움 파이루베이트 10ml, 비필수아미노산 10ml, 페니실린 G 100,000단위, 스트렙토마이신 200ml, 겐타마이신 80mg 및 7% 소디움 하이드로젠카보네이트 53ml를 1ℓ당 채웠다.

이 배지에, 중국산 햄스터의 난소 dhfr-결핍세포(CHO-Duk dhfr-Cells : 프로세스 오브 내셔널 아카데믹 사이언스, 미국, 77, 4216(1980)을 75-㎠ 배양 플라스크(코스타상사 제품)내에서 배지 40ml당 대략 2×10 세포의 비율로 첨가했다.

6∼8일 동안 그 세포를 배양하고 배양물의 상청액을 모았다.

또한 통상적인 방법으로, 트립신(플로우래브 제품)으로 처리하고, 동일한 DME M에서 현탁시켰고, 동일한 배지로 세척하고, 그 배지로부터 분리해냈다.

그 다음, 이 세포들을 DNA 주입액(0.25M 만니톨-0.1mM CaCl ·2H O -0.1mM MgSO·7HO -0.2mM 트리스-HCl(pH 7.2), 와코퓨어케미칼 인더스트리스(Wako Pure Chemical Industries Ltd. 제품)에 현탁시켰다.

공정(15)에 의하여 얻은 M-CSF발현 플라스미드 pcDMM·CSF11-dhfr에 Cla I에 의하여 선형으로 절단시키고, DNA 주입액에 용해했다.

세포 현탁액(200㎕, 2×10 세포)과 DNA 용액(200㎕, 30㎍의 DNA)을 서로 혼합하고 이 혼합액을 퓨전챔버 CH-2(시마쯔 세이사꾸쇼 제품)에 넣고, 일렉트릭 퓨전 디바이스 SSH-1(시마쯔 세이사꾸쇼 제품)에 연결시켰다.

세포내로 이 DNA를 전기적으로 트랜스펙트시키기 위하여 1포에 두차례씩 이 혼합물에 4.2kV/㎠의 펄스를 가했다. 이 DNA가 트랜스펙트된 세포들을 10%의 투석된FCS-1%의 비필수 아미노산 용액(플로우래브 제품)-2%의 HT 용액(플로우래브 제품)-DMEM 배지의 혼합용액에 현탁시키고, 24-웰 평판(코스타사 제품)상에서 배양시켰다. 48시간 동안 배양시킨 후, 배지를 선발배지(10%의 투석된 FCS와 1%의 비필수 아미노산 용액이 포함된 DMEM 배지)로 교체했다. 그후 이 배지를 3∼4일 마다 신선한 배지로 교체했다. 이렇게 10∼14일 동안 배양하여 얻은 전형된 세포 200클로운 중에서 50분 클로운을 선발하고 통상적인 방법에 따라 트립신으로 처리한 다음 새로운 24-웰 평판으로 옮겼다.

DHFR유전자의 증폭은 높은 농도의 메토트레제트(MTX : methotrexate)에 대하여 내성을 나타내며(J. B. C., 253,1357(1978)), 또한 DHFR 유전자를 트랜스펙트시킨 유전자 MTX에 의해서 증폭된다.(저널오브 뮬레큘라 바이올러지, 159, 601(1982)).

변환된 세포들중의 50클론을 20nM MTX를 포함하는 선발 배지에서 배양했다.

증식된 내성을 갖는 클로운들을 트립신으로 처리하고, 50nM MTX를 포함하는 선발 배지에 현탁시킨 다음 배양한다. 마찬가지로 이렇게 하여 증식된 내성을 갖는 클로운을 100nM MTX를 함유하는 선발 배지에서 배양시켜, 궁극적으로 400nM MTX에 대하여도 내성을 갖춘 클로운을 산출했다.

다음의 표7은 이들 내성을 갖는 클로운의 배양 상등액에 대한 CSF 활성치를 나타내고 있다.

상기와 같은 과정에 의해 제조한 CHO 세포의 배양 상청액은 SDS-PAGE에 대한 시료로서 직접 사용되며, 공정(14)에서와 같은 방법으로 분자량을 측정했다.

M-CSF의 띠는, 비환원 상태하에서는 90,000에 상응하는 위치에서, 환원상태하에서는 44,000에 해당되는 위치에서 검출되었다.

(18) CHO·M-CSF의 분리와 정제

듈베코 개선된 최소필수배지(DMEM 배지, GIBCO 래보터토리 제품)에 1ℓ당 10% FCS, 100mM 소디움파이루베이트 10ml, 비필수마이신 10ml, 페니실린 G100,000단위 스트렙토마이신 200mg, 겐타마이신 80g 및 7% 소디움 하이드로젠 카보네이트를 충전했다.

이 배지에, 이 배지 40ml당 2×10 세포의 비율로 공정(17)에 따라 얻은 CHO세포 클로운 번호 2,3-8을 첨가했다.

이 클로운을 6∼8일 동안 배양했다.

다음과 같은 정제과정을 통해서, 그 배양물의 상청액으로부터 원하는 균질의 인간의 M-CSF(CHOM-CSF)를 분리했다.

다음 과정에서 웨스턴 블로팅법으로 원하는 단백직을 확인했다.

1)ConA-세파로스 친화성 크로마토그래피.

CHO 세포 배양물 상청액 650ml에, 1.0M NaCl이 들어 있는 50mM 소디움 보레이트 완충용액(pH 8.0)으로 650ml를 첨가하고, 그 혼합물을 교반하여 시료 용액을 만들었다.

이 시료용액은 5×60cm 컴럼에 충전시키고, ConA-세파로스 겔(부피(350ml)로 막고 0.5M NaCl을 함유하고 있는 50mM 소디움 보레이트 완충용액(pH8.0)으로 평형에 달하게 했다.

이 컬럼을 철저하게 동일한 완충용액으로 씻은후, 0.5M 메틸-α-D-만노사이드를 함유하고 있는 동일한 완충용액으로 용리시켰다.

CHO·M-CSF는 단지 메틸-α-D-만노사이드 용리부분에서만 검출되었다.

2) TSK gel DEAE-5W 이온교환 HPLC

과정 1)로 얻은 활성부분을 YM-10막을 사용해서 한외거르기법으로 농축했다.

이 농축물을 50mM 소디움 보레이트 완충용액(pH 8.0)에 대하여 투석하고, 다음 조건하에서 각각 4번에 걸쳐 음이온 교환으로 처리했다.

컬럼 : TSK gel DEAE-5PW(21 : 5mm I.D.×15㎝, 토소상사 제품)

용리액 A : 5% 메탄올 함유한 50mM 소디움 보레이트 완충용액(pH 8.0)

용리액 B : 1.0M NaCl 및 5% 메탄올을 함유한 50mM 소디움 보레이트 완충용액(pH 8.0)

유속 : 3.0ml/min

분액부피 : 6ml/tube/2min

결과적으로, CHO·M-CSF는 분액번호 34∼38에서 용리되었다.

분액은 시료주입후 즉시 시작되었다.

이 분액들을 모아 다음과정에 사용했다.

3) 겔여과 HPLC

과정 2)를 통해 얻은 CHO·M-CSF 분액은, YM-10막을 사용해서 한외거르기법으로 농축되었고 아래의 조건하에서 각기 6번에 걸쳐 겔 여과 HPLC를 행하였다.

컬럼 : TSK gel G3000 SW(60cm×21.5mm I.D. 토소상사 제품)

용리액 : 0.3M NaCl을 함유한 50mM 소디움 포스페이트 완충용액(pH 6.8)

유속 : 3.0ml/min

분액부피 : 6ml/tube/2min

그 결과 CHO·M-CSF는 분액번호 23-26에서 용리되었다.

CHO·M-CSF의 분자량은 겔여과 HPLC(오리엔탈 이스트사 제품)로, 표준단백질의 용리된 위치로부터 114,000인 것이 밝혀졌다.

4) 역상 HPLC(RP-HPLC)

과정 3)으로 얻은 CHO·M-CSF분액은, YM-10막을 사용하여 한외거르기법으로 농축한 다음, 아래의 조건하에서 RP-HPLC로 처리했다.

컬럼 : C₄하이-포어역상컬럼(Hi-pore RP-304, 바이오래드 레보러터리 제품, 4.6mm I.D.×250mm)

용리액 A : 0.1% TFA

용리액 B : 아세토니트릴-1% TFA(9 : 1)

유속 : 1ml/min

분액부피 : 2ml/tube/2min

C4RP-HPLC는, CHO·M-CSF를 함유하는 분액번호 31과 32(52-53% B)를 냈다.

이들 분액을 섞고, 2mM 소디움 보레이트 완충용액(pH 8.0)으로 중화시키고, 원심농축기(토미 세이코사제품)로 진공 농축시켰다.

5) TSK gel DEAE-5PW 이온교환 HPLC.

과정 4)로 얻은 CHO·M-CSF를 다음 조건하에 TSK gel DEAE-5PW 이온교환 HPLC로 처리했다.

컬럼 : TSK gel DEAE-5PW(7.5mm I.D.×75mm 토소상사 제품)

용리액 A : 5%메탄올을 함유한 50mM 소디움 보레이트 완충용액(pH 8.0)

용리액 B : 1.0M NaCl 및 5% 메탄올을 함유한 50mM 소디움 보레이트 완충용액(pH 8.0)

유속 : 1.0ml/min

분액부피 : 1ml/tube/min

그래디언트 프로그램

제13도에 용리의 윤곽이 나타나 있다.

이 도면에서 보면, 세로좌표에는 280mm(A280)에서 단백질의 흡광도가, 가로좌표에는 NaCl 농도(M) : 분액번호가 나타나 있다.

거기서 나타나 있는 2중 화살표(↔)는, 웨스턴 블로팅으로 검출한 CHO·M-CSF의 용리된 위치를 말한다.

이 도면은, CHO·M-CSF가 존재하고, 분배번호 39와 40에서 검출되었다는 것을 나타내고 있다.

이들 분배들을 모으고, 원심농축기로 진공농축한 다음, SDS-PAGE로 처리해서, 단일 단백질 띠를 검출했다.

이 띠는 웨스턴 블로팅법으로 결정한 띠위치와 일치했다.

6) CHO·M-CSF의 N-말단 아미노산 결합서열

기체상 순차기(gas phase sequencer, 어플라이드 바이오시스템스)를 사용하여 과정 5)에서 얻은 CHO·M-CSF의 N-말단 아미노산 결합서열을 결정했다.

그 결과, 10N-말단 아미노산의 다음과 같은 결합서열을 CHO·M-CSF가 갖는다는 것을 확인했다.

Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-X'-Ser-His-Met-사이클 7에 있는 아미노산(X')를 확인할 수 없었다.

이 ｃDNA 결합서열은, 이 아미노산 잔기가 Cys라는 것을 의미한다.

7) CHO·M-CSF의 SDS-PAGE

래블리(Laemmli, 영국, 내이쳐, 277, 680(1970))의 방법에 따라서, 과정 5)로 얻은 CHO·M-CSF 농축액을 (2-ME⁺) 또는 2-머캡토에탄올 (2-ME⁺)없이 래믈리의 시료완충용액에 용해시켰다.

그 용액을 가열하여 95℃로 5분간 유지한 다음, 다름 조건하에서 SDS-PAGE로 처리했다.

겔 : 12% 폴리아크릴아미드 겔, 두께 1.5mm

기종 : PROTEAN(바이오래드 래보러토리 제품)

전기이동상태 : 적충겔에 대해 정전류 20mA

분리겔에 대해서는 30mA

4시간 정도 전기이동시킴.

스테이닝 : 실버스테인키트(와코퓨어 케미칼 인더스트리 제품)

분자량 표지물 : 프리스테인드마이커(바이오래드 레보러토리 제품)

SDS-PAGE의 결과로부터, CHO·M-CSF의 분자량은 비환원조건(2-ME⁺)하에서는 76000 정도 그리고, 환원조건(2-MEE⁺)이 위치에서 단일 띠로 CSF가 전기이동되었다.

8)CHO·M-CSF의 등전점

과정 2)로 얻은 부분적으로 정제된 시료를 사용하여, 다음과 같은 방법으로 CHO·M-CSF의 등전점을 결정했다.

이 시료(100 μl)을 겔(LBK Ampholine PAAG plate, pH 3.5~9.5)에 올리고, 10W에서 2시간 전기이동시켰다.

이 겔을 5mm 간격으로 나눈 다음, 50mM 소디움보레이트(pH 8.0) 1ml에 넣고 24시간 전개후에 활성을 측정했다.

또한 이 겔을 1㎝ 간격으로 나눈 다음 증류수 50μl에 24시간동안 방치한 다음 pH를 측정했다.

이 결과가 제14도에 나타나 있는데, 세로좌표에는 pH와 전체 활성도(U)가, 가로좌표에는 음극으로부터의 거리가 나타나 있다.

이것은 CHO·M-CSF의 등전점이 pH 4.55라는 것을 보여주고 있다.

(19) M-CSF 발현 플라스미드 pcDM, CSF11-185-dhfr의 제조

공정(15)로부터 얻은 플라스미드 pcDM·CSF11-dhfr을 제한효소 Xho I을 써서 2단편으로 절단하고, DHFR 유전자를 함유한 단편을 분리, 정제했다.

한편, 공정(7)로 얻은 플라스미드 pcDM·CSF11-185를 제한효소 XhoI을 써서 2단편으로 절단하고 M-CSF11을 함유한 단편을 분리, 정제했다.

이렇게 해서 얻은 2종류의 단편들을 T4 DNA 리가아제를 함께 결찰하고, 그 산물을 대장균 HB101 컴피텐트 셀(다까라 슈조사 제품)로 도입시켜 변환을 꾀했다.

이렇게 해서 얻은 항 암피실린 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 제조하고, 제한효소도를 결정한 다음, 원하는 플라스미드 pcDM·CSF11-185-dhfr 를 얻었다.

이 플라스미드는, M-CSF11 DNA가 M-CSF11-185 DNA로 전이된 플라스미드 pcDM·CSF11-dhfr이다.

이것외에는 pcDM·CSF11-dhfr과 동일한 플라스미드이다.

이 플라스미드 pcDM·CSF11-185-dhfr 을 대장균 HB101 스트레인에 도입해서 얻은 변환물은, 기탁명 : 대장균 HB101 1pcDM·CSF11-185-dhfr, 기탁번호 : FERM BP-2223으로, 퍼멘테이션 리서치 인스티튜트 에이전시 오브 인더스트리얼 사이언스 ＆ 테크놀로지에 1988년 12월 26일 이래 기탁되어 있다.

(20) CHO 세포에서의 발현

공정(19)로 얻은 플라스미드 pcDM·CSF11-185-dhfr 을 CHO-Duk dhfr-세포내로 도입하고, 공정(17)에서와 같은 방법으로 배양해서, 400nM MTX에 대항하는 50클로운을 얻었다.

이 항 클로운 중에서 b 클로운을 취하고, 배양상청액의 CSF 활성을 조사했다.

그 결과 표 8에 나타냈다.

CSF 활성도(U/ml)는 다음의 식으로 계산했다.

CSF 활성도(U/ml)=(콜로니의 수)×(희석비율)÷1.5

공정(18)과 같은 방법으로 CHO 세포(클로운번호 4~12)를 배양하고, 상층액으로 있는 원하는 M-CSF를 유사한 방법(ConA-세파로스 크로마토그래피, TSK gel DEAE-5PW 이온교환 HPLC, 겔여과 HPLC, 역상 HPLC 및 TSK gel DEAE-5PW HPLC)으로 정제했다.

정제해서 얻은 원하는 단백질 즉, M-CSF는, 웨스턴 블로팅법으로 확인되었다.

공정(14)와 같은 방법으로 최종 정제과정에 의해 얻은 M-CSF 단편은 SDS-PAGE로 처리하고, 웨스턴 블로팅법으로 분자량을 결정했다.

또한, 이 단편을, 공정(18),8)에서와 같은 방법으로 등전점을 결정하기 위해 전기이동시켰다.

그후, 코마지 브릴리언트 블루 R250의 스테이닝과, 전이완충액으로 1% 아세트산 용액을 함유하는 10% 메탄올을 사용한 웨스턴 블로팅법으로 M-CSF를 확인했다.

그 결과, M-CSF는 비환원상태하에서는 42000과 46000의 분자량을 갖고 있고, 분자량 39000을 소수성분으로 함유하고 있었다.

환원조건하에서는, 분자량 주성분이 22000 및 27000였다.

또는 소수성분으로 16000에서 한개의 띠가 검출되었다.

M-CSF의 등전점(pI)는 3.5~4.6였다.

CSF는 기본적으로 5개의 분자로 구성되었다는 것을 확인했다.

(21) M-CSF 발현 플라스미드 pRSVS-MCSF11-dhfr의 제조

공정(15)로 얻은 DHFR 발현 플라스미드 pRSV-dhfr로부터 플라스미드 pRSV-S를 제조하고, 제한효소 HindⅢ와 BgⅢ로 절단해서 단편을 얻고, DHFR 유전자 부분을 결핍(devoid)시켰다. 그 단편의 양끝을 SalⅠ 연결체(다까와 슈조사 제품)를 써서 SalⅠ 끝으로 변환시키고, T4 DNA 리가아제로 결찰시켰다.

RSV-LTR을 포함한 DNA 단편을 플라스미드 pRSV-S로부터 분리, 정제하고, 그 플라스미드를 제한 효소 BamI으로 절단시키고, DNA 폴리머라제를 써서 둔단된 단편을 만들고, 그 다음 그 단편을 제한효소 Nde Ⅰ으로 더 절단했다.

반면에, 플라스미드 pSV2-dhfr (Mal, Cell, Bial, 1, 854(1981)) 를 제한효소 EcoR Ⅰ로 절단하고, Cla Ⅰ절단부에 Cla Ⅰ연결체(다까라 슈조사)를 첨가하여 플라스미드 pSV2-dhfr-EC를 제조했다.

이 플라스미드를 제한효소 NdeⅠ와 PvuⅡ로 절단하여 분리, 정제해서 DHFR 유전자를 갖는 DNA 단편을 얻었다.

이어서, 이 정제된 2 DNA 단편들을 T4 DNA 리가아제를 써서 함께 결찰해서 플라스미드 pRSVS-dhfr을 얻었다.

공정(15)로 각기 제조된 플라스미드 pcDM·CSF11-dhfr을 제한효소 EcoR Ⅰ를 써서 M-CSF 유전자를 얻었다.

그 단편의 양끝을 SalⅠ 연결체(다까라 슈조사 제품)를 사용하여 SalⅠ끝으로 변환시켰다.

그 단편을, 위의 플라스미드 pRSVS-dhfr와 SalⅠ 위치에서 T4 DAN 리가아제를 사용해서 결찰시켰다.

그 다음, 그 플라스미드를 대장균 HB101(다까라 슈조사)로 도입시켰다.

이렇게 해서 얻은 M-CSF 발현 플라스미드 pRSVS-MCSF11-dhfr를 원하는 플라스미드인가 확인하기 위해서 제한효소와 도표화했다.

제22도에 그 구조가 나타나 있다.

제22도에서 보는 바와 같이, 그 플라스미드는 M-CSF를 발현하는데 참여한 RSV(RSV-LTR), M-CSF 유전자(M-CSF), SV40-유래개재결합서열(SV40 인트론), 폴리아데닐레이션 신호(SV40 폴리 A), DHFR의 발현에 참여한 초기촉진제( SV40 초기), DHFR 유전자(dhfr), SV40- 유래개재결합서열(SV40 인트론)및 폴리아데닐레이션 신호(SV40 폴리 A)로 구성되어 있다.

그 플라스미드는 또한 대장균 플라스미드 pBR322로부터 유래된 항 암피실린 유전자(Apr) 및 복제원(pBR322 Ori)을 포함하고 있다.

(22) M-CSF 발현 플라스미드 pSV2S-MCSF11-dhfr의 제조

공정(21)로부터 나온 DHFR 발현 매개자 pSV2-dhfr-EC로부터 플라스미드 pSV2-S를 얻고, 그 매개자를 제한효소 HindⅢ 및 BglⅡ로 절단해서 DHFR 유전자를 제거하고, 그 단편의 양끝을 SalⅠ 연결체를 사용하여 SalⅠ끝으로 변환시키고, T4 DNA 리가아제로 그 끝들을 결찰시켰다.

한편, DHFR 유전자 함유 DNA 단편은, 플라스미드 pRSV-dhfr로부터 분리, 정제하고, 제한효소 Nde Ⅰ으로 그 플라스미드를 절단하고, 그 단편의 양끝을 BamHⅠ연결체(다까라 슈조사)를 써서 BamHⅠ로 변환시키고, 제한효소 BamHⅠ로 그 단편을 절단했다.

이렇게 해서 얻은 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제를 써서 플라스미드 pSV2-S의 BamHI 부분에서 결찰시켜 플라스미드 pSV2S-dhfr을 얻었다.

M-CSF 발현 플라스미드 pcDM·CSF11-dhfr을 제한효소 EcoRⅠ로 절단시키고, M-CSF 유전자를 분리하고, 그 단편의 양끝을 SalⅠ 연결체를 사용해서 SalⅠ끝으로 변환시키고, 그 플라스미드 pSV25-dhfr의 SalⅠ 부분에서 T4 DNA 리가아제를 써서 결찰시킨 다음, 그 플라스미드를 대장균 BH101로 도입시켰다.

이렇게 해서 얻은 플라스미드는, 제한효소 도표로 원하는 플라스미드 pSV2S-MCSF11-dhfr을 확인했다.

제22도는 그 플라스미드의 구조를 나타내고 있다. 제22도에서와 같이, 그 플라스미드는, SV40으로부터 유래된 초기촉진제(SV40 초기), M-CSF 유전자(M-CSF), SV40으로부터 유래된 개재결합서열(SV40 인트론), 폴리아데닐레이션 신호(SV40 폴리 A), RSV로부터 유래된 LTR부(RSV-LTR), DHFR 유전자(dhfr), SV40으로부터 유래된 개재결합서열(SV40 인트론)및 폴리아데닐레이션 신호(SV 폴리 A)로 구성되어 있다.

또한, 그 플라스미드는 대장균 플라스미드 pBR322로부터 유래된 항 암피실린 유전자(Apr) 및 복제원(pBV322 Ori)을 포함한다.

(23) M-CSF 발현 플라스미드 pcDM·CSF11-dhfrRO의 제조

DHFR 발현 매개자 pRSV-dhfr을 제한효소 BamR Ⅰ로 절단하고, 그 절단부위를 SalⅠ 연결체 사용으로 SalⅠ끝으로 만들고, 제한효소 Nde I 또 그 단편을 절단한 다음, Cla I 연결체를 사용하여 그 절단 부위에 Cla I 끝을 만들어서 플라스미드 pRSV-dhfr-CS를 얻었다.

이 플라스미드를 제한효소 ClaⅠ사용으로 절단해서 DHFR 유전자를 함유하는 한개의 DNA 단편을 분리, 정제했다.

한편, M-CSF 발현 플라스미드 pcDM·CSF11은 제한효소 ClaⅠ과 SalⅠ으로 절단해서, M-CSF 유전자를 함유하는 한개의 DNA 단편을 분리, 정제한 다음, T4 DNA 리가아제를 사용하여, DHFR 유전자를 함유하는 상기의 DNA 단편과 결찰시켰다.

이렇게 해서 얻은 단편을 대장균 HB101로 변환시켰다.

이렇게 해서 얻은 플라스미드 제한효소도표는, 거기에 있는 M-CSF 유전자와 DHFR 유전자가 전사방향과 반대에 있다는 것을 나타내고 있으며, 그 플라스미드가 우리가 원하던 플라스미드 pcDM·CSF11-dhfrRO였다는 것을 밝히고 있다.

제22도는 그 플라스미드의 구조를 보여주고 있다.

이 도면에 따르면, 그 플라스미드에는, SV40으로부터 유래된 초기촉진제(SV40 초기), 개재결합서열(SV 인트론), M-CSF 유전자( M-CSF)와 폴리아데닐레이션 신호(SV40 폴리 A)가 들어 있다.

또한, 그 플라스미드는, 전사방향과 반대쪽에 위치한, RSV의 LTR부(RSV-LTR), DHFR 유전자(dhfr), SV40으로부터 유래된 개재결합서열(SV40 인트론) 및 폴리아데닐레이션 신호(SV40 폴리 A)를 포함하고 있다.

그밖에, 그 플라스미드는 대장균 플라스미드 pBR322로부터 유래된 함 암피실린 유전자(Apr) 및 복제된(pBR322 Ori)를 포함한다.

(24) M-CSF 발현 플라스미드의, M-CSF의 발현 및 CHO 세포로의 도입

공정(15),(19),(22)와 (23)으로부터 얻은 M-CSF발현 플라스미드를 M-CSF를 발현하기 위해 CHO 세포내로 도입시켰다.

숙주 CHO 세포는 CHO-dhfr-DG44 세포(소마틱 셀 앤드 몰레큘라 제네릭스, 12(6), 555(1986))였다.

공정(17)에 포함된 방법들을, 플라스미드의 도입, CHO 세포의 배양 및 MTX로 유전자 증폭하는데 사용했다.

거기에 도입된 각 플라스미드를 갖는 세포들을, 400nM MTX를 유지한 선택배지에서 배양하여 항클로운을 얻었고, 1μM MTX를 유지한 같은 배지에서 더 배양했다.

그 배지에서 성장한 클로운을, 3μM MTX를 유지한 동일한 배지내에서 좀더 배양하여 항클로운을 얻었다.

이렇게 해서 나온 3μM MTX에 대한 항클로운을 24-웰 평판(코스타 제품)에서 배양시켰다.

세포들이 연합적으로 성장했을때 그 세포들을 모았다.

생성된 세포현탁물의 1/5을, 24-웰 평판상에서 10% FCS 함유의 무 MTX D-MEM 배지 1ml내로 신선하게 접종시킨 다음, 6일동안 배양해서 배양상청액을 모았다.

각 상청액은, 웨스턴 블로팅법에 따라, M-CSF의 분자량을 결정해서 M-CSF의 생성을 조사했다.

M-CSF에 대해 좋은 수율을 갖는 클로운을 M-CSF 활성도에 따라 조사했다.

표9에 그 결과가 나타나 있다.

사용된 모든 발현 플라스미드는 CHO 세포내에서 M-CSF를 발현했다.

웨스턴 블로팅으로 조사한 모든 시료들의 M-CSF는, 공정(17)에 있어서 숙주 CHO-Dukdhfr-세포로부터 얻은 M-CSF(CHO·M-CSF)와 분자량이 동일했다.

[실시예 3]

2-시스트론계에 의한 재조합 M-CSF(r-MCSF)의 제조

(1) M-CSF 발현 플라스미드 ptrpIL-2X·M·CSF101의 제조

실시예(2), 공정(7)로 얻은 플라스미드 pcDM·CSF11-185를 제한효소 Sca Ⅰ와 BamHⅠ와 소화시키고, ScaⅠ-BamHⅠDNA 단편(450bp 정도)을 아가로스겔 전기이동법으로 분리, 정제했다.

아래에 주어진 합성 연결체(Ⅰ)을, T4 DNA 리가아제를 사용하여 DNA 단편의 절단된 ScaⅠ끝과 결찰시켜, ScaⅠ끝을 향해 XbaⅠ 절단부를 갖는 XbaⅠ-BamHⅠDNA 단편(480bp 정도)를 얻었다.

합성 연결체(Ⅰ):

생성된 DNA 단편을, 인간의 IL-2 발현 플라스미드 ptrpIL-2D 8△(일본국 특허공개번호 소63-12958 참조)의 XbaⅠ-BamHⅠ절단부위내로 삽입시켜, 원하는 플라스미드 ptrpIL-2X·M·CSF101을 얻었다.

그 플라스미드를 대장균 HB101 균주내로 도입시켜 얻은 변환물은, 1988년 12월 26일 이래, 퍼멘테이션 리서치 인스티튜트 에이전시 오브 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀러지에, 기탁명 : Escherichia col : HB101/ptrpIL-2X'-M-CS1101, 기탁번호 FERM BP-2226로 기탁되어 있다.

이 플라스미드는, 대장균 트립토판 촉진제로 제어되는 전사단위 내에서 암호화된 2개의 폴리펩티드를 갖고 있다 : 해독시발메티오닌, 인간의 IL-2의 N-말단 60개 아미노산, 그리고 인터시스트로닉 결합서열(intercistronic sequence)에 의해 암호화된 4개의 아미노산을 포함하는 65개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드 1개.

제5도에 나타난 바와 같은, 35번째 아미노산(Val)에서 185번째 아미노산(Thr)까지의 151개의 아미노산으로 된 인간의 M-CSF 및 해독시발메티오닌을 포함하는 152개의 아미노산을 갖는 또 1개의 폴리펩티드.

이 2-시스트론 발현계에 있어서, 두번째 시스트론의 해독은, 인터시스트로닉 결합서열의 2번째 SD 결합서열 위치에서 리보솜(ribosome)의 부착으로 개시된다.

제15도는 위의 2-시스트론 발현 시스템의 구조를 도식적으로 보여주고 있다.

(2) M-CSF 발현 플라스미드 ptrpIL-2X·M·CSF102의 제조

인터시스트로닉 결합서열에 있어서 단지 위의 플라스미드와 차이가 나는, 원하는 플라스미드 ptrpIL-2X·M·CSF102는, 아래에 주어진 연결체(Ⅱ)의 사용외에는, 모두 공정(1)에서와 같은 방법으로 제조했다.

제16도는 그 플라스미드의 구조를 나타내고 있다.

합성 연결체(Ⅱ) :

(3) M-CSF 발현 플라스미드 ptrpIL-2X·M·CSF103의 제조

아래에 주어진 합성 연결체(Ⅲ)의 사용 이외에는, 모두 공정(1)에서와 같은 방법으로 우리가 원하는 플라스미드 ptrpIL-2X·M·CSF103을 제조했다.

합성 연결체(Ⅲ) :

그 플라스미드는, 그것이 두번째 시스트론이 154개의 아미노산으로 구성되어 있는 폴리펩티드 즉, 제5도에서 나타난 바와 같이 33번째 아미노산(Glu)로부터 185번째 아미노산(Thr)까지의 153개의 아미노산을 갖는 인간의 M-CSF 및 해독시발메티오닌에 대하여 암호화한다는 점이 특이하다.

제17도는 위의 구조를 나타내고 있다.

(4) M-CSF 발현 플라스미드 ptrpIL-2X·M·CSF104, ptrpIL-2X·M·CSF105 및 ptrpIL-2X·M·CSF106의 제조

플라스미드 pcDM·CSF1-185대신에, 실시예 2 공정(4)에서 얻은 플라스미드 pcDM·CSF-185를 사용하고, 전술한 공정(1)-(3)을 반복해서 원하는 플라스미드 ptrpIL-2X·M·CSF104(합성 연결체(I)을 사용해서 제조했고, 제18도에 나타난 구조를 갖음), ptrpIL-2X·M·CSF105(합성 연결체(Ⅱ)를 사용해서 제조했고, 제19도의 구조를 갖음), 그리고 ptrpIL-2X·M·CSF106(합성 연결체(Ⅲ)을 사용해서 제조했고, 제20도의 구조를 갖음)을 각각 얻었다.

그 플라스미드 ptrpIL-2X·M·CSF104를 대장균 HB101 균주내로 도입시켜 얻은 변환물은, 1988년 12월 26일 이래, 퍼멘테이션 리서치 인스티튜트 에이전시 오브 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀러지에, 기탁명 Escherichia col : HB101/ptrpIL-2X· M·CSF104, 기탁번호 : FERM BP-2225로 기탁되어 있다.

(5) M-CSF 발현 플라스미드의 대장균으로의 도입과, 변환물의 배양.

공정(1)-(4)로 얻은 각 플라스미드를 대장균 균주 SG21058(J. Bacteriol., 164, 1124-1135(1985))로 도입시켜, 생성된 각 변환물을 배양하고, 거기서 얻은 각 단백질을 다음에 나오는 웨스턴 블로팅법 및 SDS-PAGE로 분석했다.

그 플라스미드를 품고 있는 대장균 SG21058을, 50ml M9 배지를 유지한 300ml 플라스크내에서 37℃로 8시간 동안 진탕 배양하고, 1% 카사미노산, 0.4% 포도당, 티아민 하이드로클로라이드 5㎍/ml, L-시스테인 20㎍/ml 및 암피실린 50㎍/ml을 충전하고, 배양발효액을 원심분리(실온에서 5000r.p,m으로 5분간)하여 세포펠릿(pellets)을 채취한 다음, 생성된 단백질을 분석했다.

SDS-PAGE와 웨스턴 블로팅법을, 실시예 2공정(14)에서와 같은 방법으로 M-CSF를 확인하는데 사용했다.

공정(1)의 플라스미드로 변환된 대장균의 배양물이, 환원조건하에서, SDS-PAGE에 의한 CBB-채색상(CBB-stained images)으로부터 결정한바, 분자량이 대략 8kd와 17kd정도의 폴리펩티드를 대량으로 생산했다.

앞쪽의 분자량은, 첫번째 시스트론으로 암호화한 폴리펩티드의 생각했던 분자량과 일치하였고, 뒷쪽의 분자량은 두번째 시스트론에 의해 암호화된 폴리펩티드의 분자량과 일치했다.

항-인간의 IL-2 항체와 항-인간의 M-CSF 항체를 사용한 웨스턴 블로팅방법에 의한 분석은, 8kd의 폴리펩티드가 IL-2의 N-말단 60개의 아미노산을 갖는 첫번째 시스트론 해독산물(translation product)이며, 17kd의 폴리펩티드는 M-CSF를 포함하는 두번째 시스트론 해독산물이다는 것을 밝혔다.

공정(2)-(4)의 다른 플라스미드로 변환된 대장균의 배양물들도 위에서와 유사한 방법으로 분석하여, 그들이 두번째 시스트론의 해독산물(M-CSF)를 생산했다는 것을 확증했다.

(6) M-CSF의 분리와 정제

1) 대장균으로부터 M-CSF 단편의 제조

공정(1)로 얻은 플라스미드 ptrpIL-2X·M·CSF101을 갖고 있는 대장균 1.5g(습윤중량)에, 0.5M 수크로오스를 함유한 50mM 트리스 HCI 완충액(pH 7.0) 50ml를 가한 다음, 그 혼합물 강력히 교반했다.

그 다음, 리소자임(2mg/ml) 6ml와 0.14M EDTA 4ml를 혼합물에 첨가하고, 4℃에서 15분간 교반했다.

이어서, 그 혼합물을 20분동안 10000r.p.m으로 원심분리했다.

상층액은 버리고, 침전물을 위와 같이 완충액(0.5M 수크로오스를 함유한 트리스 HCI 50ml, pH 7.0)으로 세척하고, 20분간 10000r.p.m으로 원심분리하여 침전되 있는 스페로플라스트를 얻었다. 그후, 50mM 트리스 HCI(pH7.0) 50ml를 그 침전물에 첨가해서 현탁액을 얻은 다음, 20KHz에서 10분간 음파파쇄시키고, 10000r.p.m에서 20분간 원심분리한 다음, 동일한 완충액(50mM 트리스 HCI, pH 7.0)으로 세척하고, 위의 조건과 같은 조건하에서 또다시 원심분리해서 침전되 있는 M-CSF 단편을 얻었다.

2) M-CSF 단편으로부터 M-CSF의 재접힘(refolding)

위의 과정(1)로 얻은 M-CSF 단편에, 7.0M 구아니딘 하이드로클로라이드를 함유한 50mM 트리스 HCI(pH 7.0) 100ml를 가하고, 그 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 교반해서 용액을 얻었다.

이 용액을 10mM 트리스 HCI(pH 8.5) 300ml 함유한 비이커내로 교반과 함께 천천히 적하했다.

그런다음, 이 혼합물을 4℃에서 10mM 트리스 HCI(pH 8.5)에 대해 철저히 투석시켰다.

이 투석물을 20분간 10000r.p.m으로 원심분리하여 침전물을 제거하고 상청액을 얻었다.

재접힌 M-CSF는 상청액속에 존재했다.

3) M-CSF의 정제

과정(2)로 얻은 M-CSF는, 아래에 설명되는 바와 같이 실시예 2, 공정(18)에서와 같은 방법으로 정제했다.

3-1) 겔 여과 HPLC

위의 과정(2)로 얻은 상청액을 한외거르기장치(아미콘 제품, 막 : YM-10, 아미콘 제품)으로 농축하고, 그 농축물을 0.45-㎛밀리포어 필터에 통과시킨 다음, 다음 조건으로 겔 여과 HPLC로 처리했다.

조건

컬럼 : TSK gel G3000 SW(60㎝×21.5mm I.D., 토소상사 제품)

용리액 : 0.3M NaCI을 함유한 50mM 소디움포스페이트 완충용액(pH 6.8)

유속 : 3.0ml/min

분액부피 : 6ml/tube/2min

위의 공정으로, M-CSF의 분자량은, 겔여과 HPLC 표준 단백질(오리엔탈 이스트사 제품)즉, 글루타메이트 탈수소효소(분자량 290000), 락테이트 탈수소효소(142000), 에놀라제(67000) 및 아데닐레이트 키나아제(32000)의 용리된 위치로 보아 32000으로 판단되었다.

활성단편을 모은 다음, 한외거르기법을 사용하여 40mM 소디움 보레이트(pH 8.0)로 완충액 교환했다.

3-2) TSK gel DEAE-5PW 이온 교환 HPLC

과정 3-1로 얻은 활성단편은 다음 조건하에서 TSK gel DEAE-5PW 이온 교환 HPLC로 처리했다.

컬럼 : TSK gel DEAE-5PW(7.5mm I.D.×75mm, 토소상사 제품)

용리액 A : 5% 메탄올을 함유한 40mM 소디움보레이트 완추용액(pH 8.0)

용리액 B : 1.0M NaCl 및 5% 메탄올을 함유한 40mM 소디움 보레이트 완충

용액(pH 8.0)

유속 : 1.0 ml/min

분액부피 : 1.0ml/tube/min

그래디언트 프로그램 :

제21도는 크로마토그래피의 결과(용리액 단면도)를 나타내고 있다.

그 그림에서, 세로쪽에는 280mm에서의 흡광도(A280)이 나타나 있고, 가로쪽에는 NaCl 농도(M) : 분액번호가 나타나 있다.

이중화살표(↔)는 M-CSF활성도를 나타낸다.

분액번호 42와 43(NaCl농도 0.23-0.25M)에 대한 피크가 M-CSF 활성도에 해당한다.

이들 단편들을 모아서 대장균으로부터 M-CSF를 얻었다.

3-3) M-CSF의 N-말단 아미노산 결합서열

실시예 2, 고정(18), 6)에서와 같은 방법으로 위에서 얻은 M-CSF의 N-말단 아미노산 결합서열을 결정했다.

그 결과, 다음과 같은 결합서열이 결정되었다.

Met-Val-Ser-Glu-Tyr-

4) M-CSF의 SDS-PAGE

파마시아 파인 케미칼스로부터의 분자량 측정기(전기이동검정키트)를 사용하는 것 이외에는 모두 실시예 2, 공정(18), 7)에서와 같은 방법으로, 과정 3-2)로 얻은 M-CSF의 분자량을 SDS-PAGE에 의해 결정했다.

SDS-PAGE의 결과로부터, M-CSF의 분자량은 비환원조건(2-ME^-) 하에서는 29500 정도, 환원조건(2-ME⁺)하에서는 17400 정도로 추정했다.

CSF는 이들 위치에서 단일띠로 전기이동되었다.

5) M-CSF의 재접힘

공정(1)로 얻은 플라스미드 ptrpIL-2X·M·CSF101을 함유한 대장균 7.5g(습윤중량)에 0.5M 수크로오스를 함유한 50mM 트리스 HCI 완충액(pH7.0)을 첨가해 현탁액 100ml를 만든 다음, 강력히 교반했다.

그후, 이 현탁액에 리소자임 6ml(24mg/ml)와 0.14M EDTA 4ml를 첨가한 다음, 4℃에서 15분간 교반하고, 10000r.p.m으로 20분간 원심분리했다.

상청액은 버리고, 침전물을 위에서와 같은 완충용액(0.5M 수크로오스를 함유한 50mM 트리스 HCI, pH 7.0)으로 세척한 다음, 20분간 10000r.p.m으로 원심분리하여 침전된 스페로플라스트를 얻었다.

그후, 이 침전물에 50mM 트리스 HCI(pH 7.0) 100ml를 첨가해서 현탁액을 얻어서 음파파쇄(200kHz, 2분간, 200W)시킨 다음, 20분간 10000r.p.m으로 원심분리했다.

이렇게 해서 나온 침전물을 2% 트리톤 X-100이 함유된 50mM 트리스 HCI(pH 7.5)로 철저히 세척한 다음, 동일한 조건하에서 또다시 원심분리하여 침전된 M-CSF 단편을 얻었다.

생성된 M-CSF 단편에 7.0M 구아니딘 탈수소효소와 25mM 2-머캡토에탄올을 함유한 50mM 트리스 HCI(pH 7.5) 20ml를 첨가하여, 이 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반하여 단백질의 환원, 변성 및 용해를 꾀했다.

이 용액을 천천히 0.5mM 환원된 글루타티온, 0.1mM 산화된 글루타티온 및 2mM 우레아가 들어있는 40mM 트리스 HCI(pH 8.5) 2000ml를 갖는 비이커에 적하시키면서 교반하여 100배 희석된 용액을 얻었다.

그 다음, 이 용액을 4℃에서 1-2일 동안 방치하여 재접힌 M-CSF를 얻었다.

6) M-CSF의 등전점

과정 5)로 얻은 M-CSF의 등전점은 다음의 방법으로 결정했다.

M-CSF 100μl용량을 겔(앰폴린 PAG판, pH 3.5-9.5, LKB 제품)에 올리고 1W당 센티미터(넓이)에서 전기이동했다.

전류값을 일정하게 한 후에, 30분간 더 전기이동시켰다.

전기이동시키는 동안, 냉동기(COOLFLOW CFT-25, NESLAB 기기사 제품)를 사용하여 10℃에서 그 겔을 유지했다.

5mm 간격으로 겔을 자른 다음, 50mM 소디움 보레이트(pH 8.0)/ml에 넣고 24시간 전개했다.

CSF 활성도를 측정했다.

그 겔을 다시 1cm 간격으로 자른 다음, 24시간 동안 증류수 1ml에 방치했다.

그런 다음 pH 측정기로 물의 pH를 측정했다.

이렇게 해서, M-CSF의 등전점을 pH 4.8에서 찾았다.

Claims (12)

1. 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드의 결합서열이 하기식(1)의 1(Met) 및 35(Val)을 포함하는 기로부터 선택되는 아미노산에서 시작되며, 하기식(1)의 163(Asp), 177(Glu), 185(Thr), 372(Pro) 및 554(Val)을 포함하는 기로부터 선택되는 아미노산에서 끝나는 생물학적으로 활성인 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 인간 M-CSF 유전자 발현 플라스미드를 발현해서 얻게 되는 생물학적으로 활성인 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드에 있어서,

   식(1) :

   

   

   

   [여기서, X는 Try 또는 Asp임.]

   상기한 발현 플라스미드가 ptrpIL-2X·M·CSF101, ptrpIL-2X·M·CSF104, pcDM·CSF11-dhfr, pcDM·CSF11-185dhfr, pcDM·CSF11-177, pcDM·CSSF11-163 및 pcDM·CSF으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생물학적으로 활성인 절단형인간의 M-CSF 폴리펩티드.
2. (a) 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드의 결합서열이 하기식(1)의 1(Met)을 포함하는 기로부터 선택되는 아미노산에서 시작되며, 하기식(1)의 185(Thr) 및 554(Val)을 포함하는 기로부터 선택되는 아미노산에서 끝나는 암호화된 폴리펩티드를 발현시키는 조건하에 생물학적으로 활성인 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 발현 플라스미드를 함유하는 변환된 세포를, 숙주로 CHO를 사용하여 배양하며, (b) 하기식(1)로부터 발현되는 인간의 M-CSF 폴리펩티드를 정제하는 공정으로 이루어지는 생물학적으로 활성인 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드의 제조방법에 있어서,

   식(1) :

   

   

   

   

   [여기서, X는 Tyr 또는 Asp임.]

   상기한 발현 플라스미드가 pcDM·CSF11-dhfr·pcDM, CSF11-dhfrRO, pcDM, CSF11-185-dhfr, pRSVS-MCSF11-dhfr 및 pSV2S-MCSF11-dhfr을 포함하는 기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생물학적으로 활성인 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드의 제조방법.
3. 제2항에 기재된 방법으로 얻어지는 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드.
4. (a) 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드의 결합서열이 하기식(1)의 1(Met)을 포함하는 기로부터 선택되는 아미노산에서 시작되며, 하기식(1)의 163(Asp), 177(Glu), 185(Thr), 372(Pro) 및 554(Val)을 포함하는 기로부터 선택되는 아미노산에서 끝나는 암호화된 폴리펩티드를 발현시키는 조건하에 생물학적으로 활성인 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 발현 플라스미드를 함유하는 변환된 세포를, 숙주로 COS를 사용하여 배양하며, (b) 하기식(1)로부터 발현되는 인간의 M-CSF 폴리펩티드를 정제하는 공정으로 이루어지는 생물학적으로 활성인 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드의 제조방법에 있어서,

   식(1) :

   

   

   

   [여기서, X는 Tyr 또는 Asp임.]

   상기한 발현 플라스미드가 pcDM·CSF, pcDM·CSF-185, pcDM·CSF-177, pcDM·CSF11, pcDM·CSF11-185, pcDM·CSF11-177 및 pcDM·CSF11-163을 포함하는 기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생물학적으로 활성인 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드의 제조방법.
5. 제4항에 기재된 방법으로 얻어지는 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드.
6. (a) 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드가 하기식(1)의 결합서열을 갖는 암호화된 폴리펩티드를 발현시키는 조건하에 생물학적으로 활성인 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 발현 플라스미드를 함유하는 변환된 세포를 숙주로 E. coli를 사용하여 배양하며,

   식(1) :

   

   

   

   [여기서, X는 Tyr 또는 Asp임.]

   (b) 상기식(1)로부터 발현되는 인간의 M-CSF 폴리펩티드를 정제하는 공정으로 이루어지는 생물학적으로 활성인 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드의 제조방법에 있어서, 상기한 인간의 M-CSF 폴리펩티드가 2-시스트론으로 발현되는 것을 특징으로 하는 생물학적으로 활성인 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드의 제조방법.
7. 제6항에 있어서, 발현 플라스미드가 ptrpIL-2X·M·CSF101, ptrpIL-2X·M·CSF102, ptrpIL-2X·M·CSF103, ptrpIL-2X·M·CSF104, ptrpIL-2X·M·CSF105 및 ptrpIL-2X·M·CSF106을 포함하는 기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생물학적으로 활성인 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드의 제조방법.
8. (a) 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드가 하기식(1)의 결합서열을 갖는 암호화된 폴리펩티드를 발현시키는 조건하에 생물학적으로 활성인 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 발현 플라스미드를 함유하는 변환된 세포를, 숙주로 E. coli를 사용하여 배양하며,

   식(1) :

   

   [여기서, X는 Tyr 또는 Asp임.]

   (b) 상기식(1)로부터 발현되는 인간의 M-CSF 폴리펩티드를 정제하는 공정으로 이루어지는 생물학적으로 활성인 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드의 제조방법에 있어서, 상기한 인간의 M-CSF 폴리펩티드가 신호펩티드를 유용하게 하는 분비발현으로 발현되는 것을 특징으로 하는 생물학적으로 활성인 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드의 제조방법.
9. 제8항에 있어서, 발현 플라스미드가 pIN-Ⅲ(lppP-5)-OmpA-MCSF11-NV151 또는 pIN-Ⅲ(lppP-5)-OmpA-MCSF11-NV143인 것을 특징으로 하는 생물학적으로 활성인 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드의 제조방법.
10. 제9항의 방법으로 얻어지는 절단형 인간의 M-CSF.
11. 다음과 같은 물리화학적 특성을 갖고, (a) 분자량 : SDS-PAGE에 의하여, 2-머캡토에탄올 존재하에 17000 정도, 그리고 2-머캡토에탄올이 없을 시는 30000 정도, (b) 등전점 : pH 4.8, (c) N-말단 아미노산 결합서열 : (Met)-Val-Ser-Glu-Tyr-.

    여기서, (Met)는 존재하거나 존재안할 수 있음.

    식(1) :

    

    

    

    

    [여기서, X는 Tyr 또는 Asp임.]

    절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드가 하기식(1)의 결합서열을 갖는 것을 특징으로 하는 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드.
12. 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드의 결합서열이 하기식(1)의 1(Met), 33(Glu) 및 35(Val)을 포함하는 기로부터 선택도는 아미노산에서 시작되며, 하기식(1)의 163(Asp), 177(Glu), 185(Thr), 372(Pro) 및 554(Val)을 포함하는 기로부터 선택되는 아미노산에서 끝나는 암호화된 폴리펩티드를 발현하는 조건하에 생물학적으로 활성인 절단형 인간의 M-CSF 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 인간의 M-CSF 유전자 발현 플라스미드에 있어서,

    식(1) :

    

    

    

    [여기서, X는 Tyr 또는 Asp임.]

    상기한 발현 플라스미드가 ptrpIL-2X·M·CSF101, ptrpIL-2X·M·CSF102, ptrpIL-2X·M·CSF103, ptrpIL-2X·M·CSF104, ptrpIL-2X·M·CSF105, 및 ptrpIL-2X·M·CSF106, pcDM·CSF11-dhfr, pcDM·CSF11-dhfrRO, pcDM·CSF11-185-dhfr, pRSVS-MCSF11-dhfr pSV2S-MCSF11-dhfr, pcDM·CSF11, pcDM·CSF11-185, pcDM·CSF11-177, pcDM·CSF11-163, pcDM·CSF-185, pcDM·CSF-177, pIN-Ⅲ(lppP-5)-OmpA-MCSF11-NV151 또는 pIN-Ⅲ(lppP-5)-OmpA-MCSF11-NV143를 포함하는 기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인간의 M-CSF 유전자 발현 플라스미드.

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