JP2561255B2 - 組換コロニ−刺激因子▲下−▼１ - Google Patents

組換コロニ−刺激因子▲下−▼１

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Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、通常低濃度で生産されるリンホカインの
製造のための組換技法の使用に関する。さらに詳しく
は、この発明はヒト−コロニー刺激因子−１（CSF−
１）をコードするDNA配列のクローニング及び発現に関
する。
種々の組織中で非常に低濃度で生産される若干の因子
の、骨髄前駆細胞の増殖及び顆粒球及び／又はマクロフ
ァージへの発達を刺激する能力が最近15年来知られて来
た。多数の種からの血清、尿サンプル及び組織抽出物中
でのこれらの因子の存在は、半固体培地中にプレートさ
れた骨髄細胞によるコロニー形成の刺激を測定するイン
ビトロ測定法を用いて示される。これらの因子は、この
ようなコロニーの形成を誘導するため、コロニー刺激因
子（colony stimulating factor;CSF）と総称されてい
る。
一層最近になって、生ずるコロニー中に見出される細
胞のタイプに従って定義され得るヒトCSF蛋白質の少な
くとも４つのサブクラスが存在することが示された。１
つのサブクラスCSF−１は主としてクロマファージを含
有するコロニーをもたらす。他のサブクラスは、好中顆
粒球及びマクロファージの両者を含有するコロニー、主
として好中顆粒球を含有するコロニー、及び好中顆粒球
及び好酸顆粒球並びにマクロファージを含有するコロニ
ーを形成する。
上記ヒトCSFの最初の３種類に類似するネズミの因子
が存在する。さらに、IL−３と称されるネズミ因子はネ
ズミ骨髄細胞からコロニーを誘導し、このコロニーはこ
れらすべての細胞タイプのほかに巨核球、赤血球、及び
肥満細胞を種々の組み合わせで含有する。これらのCSF
類はDxter,T.M.,Nature（1984）309:746;及びVadas,M.
A.等、J.Immunol.（1983）130:793に総説されている。
この発明は、これらのサブクラスの第１の構成員であ
る蛋白質CSF−１の組換製造に関する。このサブクラス
は特異的ラジオイムノアッセイ及びラジオリセプターア
ッセイによりさらに特徴付けられそして描写されている
………例えば、精製されたCSF−１に対して生じた抗体
は他のサブクラスの生物学的活性に影響を与えることな
くCSF−１活性を特異的に抑制することができ、そして
マクロファージセルラインJ774はCSF−１に特異的に結
合するリセプターを含有する。これらのアッセイの記載
はDas,S.K.等、Blood（1981）58:650により発表されて
いる。
種々のCSF蛋白質の精製方法が発表されており、そし
て次のパラグラフで記載する。
Stanley,E.R.等、J.Biol.Chem.（1977）52:4305はネ
ズミL929細胞からのCSF蛋白質の約１×108ユニット/mg
までの精製を報告したが、これも主としてマクロファー
ジ生産を刺激した。Waheed,A.,等Blood（1982）60:238
はラビット抗体カラムを用いることによるマウスＬ−細
胞CSF−１の見かけ上均一への精製を記載し、そしてネ
ズミ配列の最初の25アミノ酸を報告した（Bem−Avram,
C.M.等、Proc.Natl.Acad.Sci(USA)（1985）882:448
6）。
Stanley,E.R.等、J.Biol.Chem.（1977）252:4305−43
12は、人尿からのCSF−１の精製方法を開示し、そしてD
as,S.K.等、Blood（1981）58:630;J.Biol.Chem.（198
2）257:13679はマクロファージコロニーのみを生成する
人尿CSF−１を５×107ユニット/mgの比活性で得、そし
て培養されたマウスＬ−細胞から及び人尿から調製され
たCSF−１蛋白質のグリコシル化とそれらの活性との間
の関連を要約している。Wang,F.F.等、J.Cell Biochem.
（1983）21:263は人尿CSF−１を108U/mgの比活性で単離
した。Waheed,A.等はラビット抗体カラム上での人尿CSF
−１の0.7〜2.3×107U/mgの比活性への精製を開示して
いる。〔Exp.Hemat.（1984）12:434〕。
Wu,M.等、J.Biol.Chem.（1979）254:6226は培養され
たヒト膵臓癌（MIAPaCa）細胞からのCSF蛋白質の調製を
報告しており、これはネズミ顆粒球及びマクロファージ
コロニーの増殖をもたらす。得られた蛋白質は約７×10
7ユニット/mgの比活性を有していた。
種々のCSFの部分的に精製された調製物も報告されて
おり、これらはヒト及びネズミ肺細胞条件化（conditio
ned）培地から〔Fojo,S.S等、Biochemistry（1978）17:
3109;Burgeses,A.W.等、J.Biol.Chem.（1977）252:199
8〕、ヒトＴ−リンパ芽球細胞から〔Lusis,A.J.等、Blo
od（1981）57:13;米国特許No.4,438,032〕、ヒト胎盤条
件化培地から見かけ上均一にそして７×107U/mgの比活
性に〔Wu,M.等、Biochemistry（1980）19:3846〕得られ
た。
一般にCSF蛋白質に、そして特にCSF−１になんらかの
有用な機能を行わせることの有意な困難性は、それらを
実際に又は可能性としてさえ療法的に使用するのに十分
な量で、区別し得るそして特徴付け得る形態で入手する
ことができないことであった。この発明は組換技法によ
り有用な量で精製されたヒト及びネズミCSF−１を提供
することによってこれらの不足を救済する。
異るサブクラスのCSF蛋白質、ネズミ及びヒトGM−CSF
が精製され、そしてcDNAがクローン化された。この蛋白
質は他のCSF、例えばCSF−１と異ることがGough等、Nar
ure（1984）309:763−767により示された。ネズミIL−
３はFung,M.C.等によりクローン化された〔M.C.Fung
等、Nature（1984）307:233〕。さらに、Yokota,T.等PN
AS（1984）81:1070−1074;Wong,G.G.等、Science（198
5）228:810−815;Lee,F.等、PNAS（1985）82:4360−436
4;及びCantrell,M.A.等、PNAS（1985）82:6250−6254を
参照のこと。
発明の開示 １つの観点において、この発明は組換CSF−１蛋白質
に関し、これには天然蛋白質の一次アミノ酸配列の変更
を含む生物学的に活性な蛋白質が包含される。組換形の
CSF−１蛋白質は多量に得られ、宿主により提供される
翻訳後プロセシングの制御により有利に修飾され得、そ
してその望ましい性質を増強するために遺伝子レベル又
は蛋白質レベルで意図的に変形され得る。例えば、ポリ
ペプチドのカルボキシ末端の３分の１の実質的部分の欠
失を有するミューテインは活性である。すなわち、組換
形のCSF−１の入手可能性は天然蛋白質に関しては得ら
れない柔軟性及び幾つかの量的利点を提供し、このため
蛋白質の療法的適用を可能にする。
他の観点において、この発明は組換CSF−１をコード
する単離されたDNA配列、この配列のための組換発現系
及びこれらを含有するベクター、これらのベクターによ
り形質転換された組換宿主、並びに組換蛋白質を生産す
る培養物に関する。この発明はさらに組換蛋白質の製造
方法及びその製造において重要な材料に関する。
さらに、この発明は医薬的及び療法的適用において有
用なCSF−１を含有する組成物、及びこのような組成物
の使用方法に関する。
図面の簡単な説明 第１図は精製された天然蛋白質から決定された、人尿
CSF−１及びネズミＬ−929細胞CSF−１の部分的アミノ
酸配列を示す。
第２図はネズミCSF−１のための幾つかのオリゴマー
プローブの配列を示す。
第３図はヒトゲノムCSF−１を得るために使用される
オリゴマープローブの配列を示す。
第４図は、ヒトCSF−１配列をコードする3.9kb HindI
II断片の配列決定された部分、及びエクソン領域につい
て推定されたアミノ酸配列を示す。
第５図はCSF−１をコードするcDNAクローンDNA配列及
び推定されるアミノ酸配列を示す。
第６図は、CSF−１及び他のコロニー刺激因子の、腫
瘍細胞を殺すマクロファージの能力を増強する活性の比
較を示す。
第７図はMIAPaCa mRNAのシュークロース・グラジェン
ト分画の結果を示す。
発明を実施するための態様 A.定義 “コロニー刺激因子−１（CSF−１）”は、当業界に
おいてCSF−１について理解されている活性のスペクト
ルを示す蛋白質を意味する……すなわち、Metcalf,P.J.
Cell Physiol.（1970）76:89の標準的インビトロコロニ
ー刺激アッセイに適用した場合に、このものは一次マク
ロファージコロニーの形成をもたらす。天然CSF−１は
グリコシル化されたダイマーであり；活性のためにダイ
マー化が必要である。ダイマー形及びモノマー形の両者
がこの発明の範囲内及びCSF−１の定義内のものと意図
される。モノマー形は細胞内条件のインビトロでの提供
によりダイマーに転換され、そしてモノマーはそれ自体
抗−CSF−１抗体を生産するための抗原として有用であ
る。
幾つかの種特異性が存在するようであり、ヒトCSF−
１はヒト及びネズミの両者の骨髄細胞に対して作用可能
であり；ネズミCSF−１はヒト細胞について活性を示さ
ない。従って、“ヒトCSF−１は、完全な相互関係が必
然的に存在するわけではないにしても、Das,S.K.等、Bl
ood（1981）58:630の特異的ネズミラジオリセプターア
ッセイにおいて陽性であるべきである。この蛋白質の生
物学的活性は一般にまた、人尿CSF−１に対する中和抗
血清によっても阻害されるであろう（Das,S.K.等、前
掲）。しかしながら、ある特別な状況（例えば、特定の
抗体調製物が生物学的機能のために必須でないCSF−１
エピトープを認識し、そしてこのエピトープが試験され
る特定のCSF−１ミューテイン中に存在しない場合のご
とき）においては、この基準は妥当しないであろう。
CSF−１の幾つかの他の性質が一層最近になって認識
されたが、これらの性質は一連のＥプロスタグランジ
ン、インターロイキン−１、及びインターフェロンの成
熟マクロファージからの分泌を刺激するこの蛋白質の能
力を含む〔Moore,R.等、Science（1984）223:178〕。こ
れら後者の活性のための機作は現在のところ理解されて
おらず、そしてここでの定義のため、定義の達成のため
の基準は出発材料として適切な種からの骨髄細胞を使用
しての単核球／マクロファージコロニーの形成を刺激す
る能力、ほとんどの状況（上記を参照のこと）のもとで
の精製人尿CSF−１に対する中和抗血清によるこの活性
の阻害、及び種タイプについて適切な場合にはラジオリ
セプターアッセイに対する陽性反応に存在する。〔CSF
−１の増殖効果が単核性貧食性系統の細胞に限定される
こと（Stanley,E.R.,The Lymphokines（1981）,Stewar
t,W.E.,II,等編集、Humana Press,クリフトン、NJ,102
−123頁）、並びにCSF−１のリセプターがこれらのセル
ラインに限定されること（Byrne,P.U.等、Cell Biol.
（1981）91:848）が知られている。〕 すべての蛋白質の場合と同様に、正確な化学構造は多
数の因子に依存する。分子中にイオン化可能なアミノ基
及びカルボキシル基が存在する場合、特定の蛋白質が酸
性塩もしくは塩基性塩として、又は中性の形で得られ
る。適当な環境条件に置かれた場合にそれらの活性を維
持しているそれらすべての調製物が定義に含まれる。さ
らに、一次アミノ酸配列に、糖成分を用いる誘導体化
（グリコシル化）により又は他の補足的分子、例えば脂
質、ホスフェート、アセチル基等により、さらに一般的
にはサッカライドとの接合により、付加を行うことがで
きる。一次アミノ酸構造はまた集合して複合体、最もし
ばしばダイマーを形成することができる。たしかに、天
然人尿CSF−１は高度にグリコシル化されたダイマーと
して単離される。このよな付加の幾つかの観点は生産宿
主の翻訳後プロセシング系により達成され、このような
他の変形はインビトロで導入される。ともかく、このよ
うな変形は、上に定義した蛋白質の活性が破壊されない
限り定義に含まれる。言うまでもなく、このような変形
は種々のアッセイにおいて蛋白質の活性を増強し又は低
下せしめることにより活性に量的又は質的な影響を与え
るであろうことが予想される。
さらに、鎖中の個々のアミノ酸残基を酸化、還元、又
は他の誘導体化により変形することができ、そして蛋白
質を切断して活性を維持している断片を得ることができ
る。活性を破壊しないこのような変形は蛋白質配列を定
義から排除しない。
翻訳中に配列中に導入されるアミノ酸の欠失、付加又
は変更により一次構造それ自体に対する変形を、蛋白質
の活性を喪失することなく行うことができる。このよう
な置換又は他の変更は“CSF−１のアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列を有する”蛋白質の定義に属す
るアミノ酸配列を有する蛋白質をもたらす。確かに、ヒ
ト及びネズミ由来CSF−１蛋白質は、高い相同性を示
す、同一ではないが類似の一次アミノ酸配列を有する。
便宜上、ここに例示される。cDNAクローンから推定さ
れる第５図中に示される、ダイマー蛋白質のモノマー部
分の成熟蛋白質アミノ酸配列をmCSF−１（成熟CSF−
１）と称する。第５図は、哺乳類細胞からの分泌の際に
おそらく開裂されるであろう32残基の推定上のシグナル
配列の存在を示す。mCSF−１はこの図においてアミノ酸
１−224により代表される。具体的には、そのモノマー
及びダイマーがmCSF−１、及びmCSF−１からのそれらの
差異により命名されるmCSF−１の関連形がヒトCSF−１
の定義に含まれる。他の種に由来するCSF−１は、ヒト
基質について上に示した活性の必要なパターンを示すこ
とにより“ヒト"CSF−１の定義に妥当する。
やはり便宜上、mCSF−１のアミノ酸配列が参照として
使用され、そして、CSF−１活性の点でこれと実質的に
同等である他の配列が第５図中に示される配列に言及す
ることにより命名されるであろう。特定のアミノ酸の置
換は、それを代替するアミノ酸残基への言及により示さ
れるであろう。従って、例えば、ser90CSF−１は90位の
アミノ酸がシステインではなくセリンである点を除き第
５図中に示される配列を有する蛋白質を意味する。欠失
はΔと、これに続くＮ−末端配列から除去されたアミノ
酸の個数により、あるいは残基がＣ−末端配列から除去
される場合には、残りのアミノ酸配列の個数とこれに続
くマイナス記号により示される。すなわち、Δ4CSF−１
はＮ−末端からの最初の４個のアミノ酸が欠失している
第５図のCSF−１を意味し；Δ130-はアミノ酸130に続く
最後の94個のアミノ酸が欠失しているCSF−１を意味す
る。例えば、59位においてcDNAによりコードされるチロ
シン残基ではなく遺伝子（第４図）によりコードされる
アスパラギン酸残基を含むasp59CSF-1、及びmCSF−１の
アミノ酸１−158のみから成るΔ158−CSF−１を下記に
例示する。
“作用可能に連結された”（operably linked）なる
語は、構成成分の正常な機能が達成され得るような並置
を意味する。すなわち制御配列に“作用可能に連結され
た”コード配列は、これらの配列の制御のもとに該コー
ド配列が発現され得るような配置を意味する。
“制御配列”は、特定の宿主生物中で、作用可能に連
結されたコード配列の発現のために必要なDNA配列を意
味する。原核生物のために適当な制御配列は、例えば、
プロモーター、場合によってはオペレータ配列、リボゾ
ーム結合部位、及びおそらく他の従来あまり理解されて
いない配列を包含する。真核生物はプロモーター、ポリ
アデニレーションシグナル及びエンハンサーを用いるこ
とが知られている。
“発現系”は、目的とするコード配列及び作用可能に
連結された制御配列を含有するDNA配列であって、これ
らの配列により形質転換された宿主がコードされた蛋白
質を生産することができるようなDNA配列を意味する。
形質転換を行うためには、発現系がベクター上に導入さ
れることができ、しかしながら該当するDNAはさらに宿
主の染色体中に取り込まれることもできる。
ここで使用する場合、“細胞”、“細胞系”（セルラ
イン）、及び“細胞培養物”は相互交換的に使用され、
そしてこれらすべての名称は子孫を含む。すなわち、
“形質転換体”又は“形質転換された細胞”は一次対象
細胞、及び経代の数に関係なくこれらに由来する培養物
を包含する。意図的な又は非意図的な変異に基き、すべ
ての子孫がDNA含有において正確に同一であるとは限ら
ないことが理解される。最初に形質転換された細胞にお
いてスクリーニングされたのと同一の機能を有する変異
体子孫が含まれる。区別された命名が意図される場合、
それは文脈から明らかであろう。
B.一般的記載 この発明のCSF−１蛋白質は、骨髄前駆細胞からの単
球−前駆体／マクロファージ細胞の生産を刺激して免疫
系の効率を増強すること、及び成熟マクロファージにお
けるリンホカインの分泌のごときこれらの分化した細胞
の機能を刺激すること、の両者を行うことができる。
１つの用途において、これらの蛋白質は化学療法への
付加物として有用である。化学療法剤による治療が免疫
系の抑制をもたらすことはよく理解されている。しばし
ば、これらがそれに対して向けられている腫瘍細胞を破
壊することに成功したとしても、化学療法剤による治療
は免疫系の細胞に対する化学毒性剤のこの副作用のため
に対象の死をもたらす。このような患者へのCSF−１の
投与は、骨髄由来前駆細胞の増殖及びマクロファージ及
び単球への分化を中介しそして増強しそしてこれらの成
熟細胞の機能を刺激するCSF−１の能力のために、免疫
系の再刺激をもたらし、これによってこの副作用が回避
され、そして患者が二次感染に倒れる傾向が回避され
る。このような治療によって救済されるであろう他の患
者には、骨髄移植によって白血病の治療をされる患者が
含まれる。これらはしばしば、拒絶を回避するために免
疫抑制状態にある。これらの患者についても、CSF−１
の投与により免疫抑制が逆転され得るであろう。
一般に、化学療法、骨髄移植、又は疾患（例えば後天
性免疫不全症候群）のごとき他の偶然的な形の免疫抑制
のいずれかにより免疫抑制にかかっているすべての対象
は、薬理学的使用のためCSF−１の入手可能性により利
益を得るであろう。さらに、生来的な系のそれを補足す
るために、CSF−１により処理された骨髄又は他の適当
な調製物のインビトロ培養により生産されるすでに分化
したマクロファージの増加した量を患者に提供すること
ができよう。これらの調製物には、培養され、そして局
所療法又は全身療法のために返還され得る患者自身の血
液単球の調製物が含まれる。
マクロファージによるリンホカインの生産を刺激し、
そして標的細胞を殺す能力を増強するCSF−１の能力は
また、新生物及び感染の治療においてCSF−１を直接有
用なものとしている。
CSF−１はネズミ由来マクロファージによるインター
フェロンの生産を刺激し〔Fleit,H.B.等J.Cell Physio
l.（1981）108:347〕、そしてMIAPaCa細胞からのヒトの
部分的に精製されたCSF−１は、後に示すように、ヒト
単球からのインターフェロン及びTNFのポリIC−誘導生
産を刺激する。さらに、CSF−１はヒト血液単球による
ミエロイドCSFの生産を刺激する。
さらに、ネズミ肉腫TU5標的を殺すために正常C3H/HeW
マウス抹消マクロファージを刺激するネズミCSF−１
（Ｌ−細胞−条件化培地から）の能力の証明を下記に示
す。この活性は、CSF−１が前処理として、そしてエフ
ァクター期間の間に使用される場合に最も有効である。
これを行うCSF−１の能力は、後で第６図に示す他のコ
ロニー刺激因子により示されるそれよりも非常に大き
い。さらに、ウイルスを攻撃するネズミ細胞の能力はCS
F−１により非常に増強される。
ネズミCSF−１は、P815腫瘍細胞（Wing,E.J.等、J.Cl
in.Invest.（1982）69:270）に対して制細胞的であるよ
うにネズミマクロファージを刺激するとして、又は他の
白血病標的を殺さない（Ralph,P.等、Cell Immunol.（1
983）76:10）として、一貫性なしに報告されている。No
gawa.R.T.等、Cell Immunol.（1980）53:116は、CSF−
１が酵母を摂食しそして殺すようにマクロファージを刺
激することを報告している。
従って、免疫抑制それ自体の克服に加えて、CSF−１
は、マクロファージの分泌及び活性の刺激により間接的
に侵入生物又は悪性細胞を破壊するため使用され得る。
この発明のCSF−１は、蛋白質物質の投与のために当
業界において標準的な常法において製剤化され得る。注
射による投与が好ましく、製剤は溶液もしくは懸濁液、
乳剤、又は注射可能に再構成するための固体組成物を包
含する。適当な賦形剤は例えばリンゲル溶液、ハンク溶
液、水、塩溶液、グリセリン、デキストロース溶液等を
包含する。さらに、この発明のCSF−１を該当する反応
を刺激するために細胞の調製物と共にプレインキュベー
トレ、そして全調製物又はその上清を対象に導入するこ
とができる。後に示すように、CSF−１刺激に反応して
種々のタイプの血液細胞により生産される物質は所望の
標的に対して効果的であり、そして侵入ウイルス又は新
生物を攻撃するこれらの血液細胞自体の性質が増強され
るであろう。対象自体の細胞を取り出し、そしてこの方
法において使用することができ、あるいは例えば、他の
適合性固体からの単球又はリンパ球をインキュベーショ
ンにおいて使用することができる。
CSF−１と称する活性のパターンの存在はしばらくの
間知られているが、対応する蛋白質は配列決定を可能に
するのに十分な純度及び十分な量においても、有用な療
法的機能を得るのに十分な純度及び量においても得られ
ていない。完全に純粋な実際的量の蛋白質も、そのコー
ド配列も得られていないので、上記Ａ項において記載し
たような代替物を提供するために構造への変形を最適に
することも不可能であり、療法的観点においてこの蛋白
質を使用することも不可能であった。
この発明はこれらの欠点を補う。種々の追加の精製手
順を通して、若干のアミノ酸配列を提供するのに十分な
純度のCSF−１が人尿から得られ、従ってDNAオリゴマー
プローブの造成が可能となった。このプローブは完全蛋
白質のコード配列を得るのに有用である。下に例示され
る１つの方法は、適当なコード配列部分を得るためにヒ
トゲノムライブラリーをプローブするためにヒトＮ−末
端配列ついて設計されたプローブを用いる。ヒトゲノム
クローン化配列はそれ自体の制御配列を用いて直接に、
又はイントロンをプロセシングすることができる哺乳類
系に適する造成物中で発現され得る。CSF−１を生産す
るセルラインから得れたヒトcDNAライブラリーのための
プローブとしてゲノム配列を使用してこの蛋白質をコー
ドするcDNAが得られる。cDNAは、適切に調製された場
合、COS又はCV−１細胞中で直接発現することができ、
また広範囲の宿主中での発現に適するベクターに造成す
ることができる。
従って、これらの道具はヒトCSF−１のための完全コ
ード配列を提供することができ、これから種々の宿主系
に適する発現ベクターを造成することができ、そしてコ
ード配列が発現される。入手し得る種々の宿主及び該宿
主のために適当な発現ベクターが翻訳後プロセシング系
中の、及びこうして生産された蛋白質のコンホーメーシ
ョン制御をもたらす環境因子の選択を可能にする。
C.適当な宿主、制御系及び方法 一般に、組換形のCSF−１の製造は次のことを含む： まず、成熟（ここでは、すべてのミューティンを含む
意味で使用される）蛋白質、プレ蛋白質、又はCSF−１
蛋白質とその活性を破壊しない追加の配列又は制御され
た条件下（例えばペプチダーゼによる処理）で開裂され
て活性な蛋白質をもたらす追加の配列との融合体をコー
ドするDNAを得る。配列がイントロンにより中断されて
いない場合、これは任意の宿主中での発現のために適当
である。イントロンが存在する場合、これらをプロセシ
ングすることができる哺乳動物系又は他の真核生物系に
おいて発現が得られる。この配列は切り出し可能であり
且つ回収可能な形であるべきである。次に、切り出され
又は回収されたコード配列は複製可能な発現ベクター中
で適当な制御配列と作用可能に連結される。このベクタ
ーが適当な宿主を形質転換するために使用され、そして
形質転換された宿主が組換CSF−１の生産を行うのに好
都合な条件下で培養される。場合によっては、CSF−１
が培地から又は細胞から単離される。幾らかの不純物が
許容される幾つかの場合においては、蛋白質の回収及び
精製は必要でない。例えば、対象に投与するためにリン
ホカイン因子が単離されるであろう細胞のインビトロ培
養のためには完全な純度は必要でない。しかしながら、
対象に投与することによる療法における直接的使用は、
言うまでもなく生産されたCSF−１の精製を必要とする
であろう。
上記の段階のそれぞれは種々の方法で行うことができ
る。例えば、所望のコード配列は、細胞性メッセージャ
ーから適当なcDNAを調製し、そしてこのcDNAを操作して
完全配列を得ることにより、得ることができる。別の方
法として、ゲノム断片を得、そして適切な宿主中で直接
使用することができる。種々の宿主中で作用可能な発現
ベクターの造成は、後に記載するように、適切なレプリ
コン及び制御配列を用いて行われる。天然に得られなけ
れば適当な制限部位をコード配列の末端に付加して、こ
れらのベクターに挿入するために切出し可能な遺伝子を
得ることができる。
制御配列、発現ベクター、及び形質転換法は遺伝子を
発現するために使用される宿主細胞のタイプに依存す
る。一般に、原核細胞、酵母、又は哺乳類細胞が現在の
ところ宿主として有用である。天然CSF−１はグリコシ
ル化されたダイマーとして分泌されるので、適切な翻訳
後プロセシングを行うことができる宿主系が好ましい。
従って、一般に、原核性宿主が組換蛋白質の生産のため
に最も効率的でありそして便利であるが、これらのプロ
セシングが可能であるためには真核細胞、そして特に哺
乳類細胞が好ましい。細菌により生産される組換CSF−
１はインビトロでのダイマー化を必要とするであろう。
さらに、天然シグナル配列が哺乳類細胞によって確認さ
れ、分泌を可能にし、そしてそれ故に精製を容易にする
であろうという一層の確信が存在する。
C.1.制御配列及び対応する宿主 原核生物は最もしばしばE.コリ（E.coli）の種々の株
によって代表される。しかしながら、他の微生物株、例
えばバシルス、例えばバシルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）、シュードモナス（Pseudomonas）の色々な
種、又は他の細菌株を使用することもできる。このよう
な原核系においては、宿主と適合性の種に由来する複製
部位及び制御配列を含有するプラスミドベクターが使用
される。例えば、E.コリは典型的には、Bolivar等、Gen
e（1977）２:95によってE.コリ種から誘導されたプラス
ミドであるpBR322の誘導体を用いて形質転換される。pB
R322はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性の遺伝子
を含有し、そしてそれ故に所望のベクターの造成におい
て維持され得るか又は破壊され得る追加のマーカーを提
供する。この明細書において転与開始のためのプロモー
ター、場合によってはオペレーター、及びリボゾーム結
合部位配列を含むものとして定義される、一般に使用さ
れる制御配列は、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）
及びラクトース（lac）プロモーター系〔Chang等、Natu
re（1977）198:1056〕及びトリプロファン（trp）プロ
モーター系〔Goeddel等、Nucleic,Acids Res.（1980）
８:4057〕、並びにPLプロモーター及びＮ−遺伝子リボ
ゾーム結合部位〔Shimatake等、Nature（1981）292:12
8〕（これは、米国特許No.4,711,845明細書中に記載さ
れているように、ポータブル制御カセットとして有用に
されている）のごとき一般に使用されるプロモーターを
包含する。しかしながら、原核生物と適合性の任意の入
手可能なプロモーター系を使用することができる。
細菌に加えて、真核性微生物、例えば酵母を宿主とし
て使用することもできる。パン酵母サッカロミセス・セ
レビシエー（Saccharomyces cerevisiae）の実験室株が
最も使用される。但し、他の多くの株も一般に入手可能
である。２ミクロン複製開始点を用いるベクターが例示
される〔Broach,J.R.,Meth Enz.（1983）101:307〕が、
酵母での発現に適当な他のプラスミドベクターが知られ
ている〔例えば、Stinchcomb等、Nature（1979）282:3
9、Tschempe等、Geve（1980）10:157、及びClarke,L.等
Meth.Enz.（1983）101:300〕。酵母ベクターのための制
御配列は、解糖系酵母の合成のためのプロモーターを包
含する〔Hess等、J.Adv.Enzyme Req.（1968）７:149;Ho
lland等、Biochemistry（1978）17:4900〕。当業界にお
いて知られている他のプロモーターは、３−ホスホグリ
セレートキナーゼのためのプロモーター〔Hitzeman等、
J.Biol.Chem.（1980）255:2073〕、並びに他の解糖系酵
素、例えばグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキ
シラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−
ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートム
ターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェート
イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグ
ルコキナーゼのそれを包含する。転写が増殖条件により
制御されるという追加の利点を有する他のプロモーター
はアルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクローム
Ｃ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵
素、並びにマルトース及びガラクトースの資化を担当す
る酵母（Holland、前掲）のためのプロモーター領域で
ある。さらに、コード配列の３′末端にターミネーター
配列が望ましいと信じられる。このようなターミネータ
ーは、酵母由来遺伝子のコード配列に続く３′非翻訳領
域中に見出される。例示されるベクターの多くが、エノ
ラーゼ遺伝子含有プラスミドpeno46〔Holland,M.J.等、
J.Biol.Chem.（1981）256:1385〕由来の制御配列又はYE
p13〔Broach,J.等、Gene（1978）８:121〕から得られた
LEU2遺伝子を含有するが、しかしながら、酵母に適合性
のプロモーター、複製開始点及び他の制御配列を含有す
る任意のベクターが適当である。
言うまでもなく、多細胞生物由来の真核性宿主細胞培
養物中でポリペプチドをコードする遺伝子を発現させる
ことも可能である。例えば、Tissue Culture、アカデミ
ックプレス、Cruz及びPatterson編集（1973）を参照の
こと。有用な宿主細胞系はネズミ骨髄腫N51、VERO及びH
ela細胞、並びにチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細
胞を含有する。このような細胞の発現ベクターは通常、
哺乳類細胞と適合性のプロモーター及び制御配列、例え
ばシミアンウイルス40（SV40）からの初期及び後期プロ
モーター〔Fiers等、Nature（1978）273:113〕、又は他
のウイルスプロモーター、例えばポリオーマ、アデノウ
イルス２、ウシ乳頭腫ウイルスもしくはトリ肉腫ウイル
ス、あるいは免疫グロブリンプロモーター及びヒートシ
ョックプロモーターを包含する。哺乳類細胞宿主系形質
転換の一般的観点は1983年８月16日に発行されたAxelの
米国特許No.4,399,216に記載されている。さらに、今や
“エンハンサー”領域が発現を最適化するために重要な
ようであり、これらは一般に、プロモーター領域の上流
に見出される配列である。必要であれば、ウイルス源か
ら複製開始点を得ることができる。しかしながら、染色
体への組み込みが真核生物におけるDNAの複製のための
一般的な機構である。今や植物細胞も宿主として利用可
能であり、そして植物細胞と適合性の制御配列、例えば
ノパリン合成酵素プロモーター及びポリアデニレーショ
ンシグナル配列〔Depicker,A.等、J.Mol.Appl.Gen.（19
82）１:561〕が利用可能である。
C.2.形質転換 使用される宿主細胞に依存して、これらの細胞に適す
る標準的技法を用いて形質転換が行われる。Cohen,S.
N.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1972）69:2110により
記載されているような、塩化カルシウムを用いるカルシ
ウム処理が原核生物又は実質的な細胞壁障壁を有する他
の細胞のために使用される。若干の植物細胞のためには
アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacter
ium tumefaciens）〔Shaw,C.H.等、Gene（1983）23:31
5〕による感染が用いられる。このような細胞壁を有し
ない哺乳類細胞についてはGraham及びvan derEb,Virolo
gy（1978）52:546のリン酸カルシウム沈澱法が好まし
い。酵母への形質転換は、Van Solingen,P.等、J.Bact.
（1977）130:946、及びHsiao,C.L.等、Proc.Natl.Acad,
Sci(USA)（1979）76:3829の方法に従って行われる。
C.3.ナサンブロットによるmRNAのプロービング:cDNA又
はゲノムライブラリーのプローブ 変性剤としてホルムアルデヒド〔Maniatis,T.等、Mol
ecular Cloning（1982）Cold Spring Harbor Press,202
−203頁〕又は10mMメチル水銀（CH3HgOH）〔Bailey,J.
M.等Anal.Biochem.（1976）70:75−85:及びSehgal,P.B.
等、Nature（1980）288:95−97〕を用いる十分な還元条
件下でのアガロース・スラブ・ゲル電気泳動により、RN
Aをナサンブロットのために分画する。メチル水銀ゲル
のため、ランニング緩衝液（100mM硼酸、6mM硼酸ナトリ
ウム、10mM硫酸ナトリウム、1mM EDTA,pH8.2）中でアガ
ロースを溶融し、60℃に冷却し、そして1/100容量の1M
CH3HgOHを添加することにより1.5％ゲルを調製する。RN
Aを0.5×ランニング緩衝液に溶解し、そして10mMメチル
水銀中で室温にて10分間インキュベートすることにより
変性する。グリセリン（20％）及びブロモフェノールブ
ルー（0.05％）を加えてサンプルを負荷する。緩衝液を
循環させながら500〜600ボルト−時で電気泳動する。電
気泳動の後、ゲルを10mM2−メルカプトエタノール中で4
0分間洗浄してメチル水銀を脱毒し、そしてRNAをゲルか
らメンブランフィルターに移すことによりナサンブロッ
トを調製する。
cDNA及びゲノムライブラリーを、コロニー又はプラー
クハイブリダイゼーション法を用いてスクリーニングす
る。細菌コロニー又はファージのプラークを２枚のニト
ロセルロース紙（Ｓ＆ＳタイプBA−85）に上げる。50
0mM NaOH及び1.5M NaClで５分間ずつ逐次的に処理する
ことにより、プラーク又はコロニーを溶解し、そしてフ
ィルターに固体する。フィルターを、５分間ずつ２回、
５×標準塩クエン酸塩（SSC）で洗浄し、そして空気乾
燥し、そして80℃にて２時間加熱（bake）する。
ナサンブロット用ゲル又はcDNAもしくはゲノムスクリ
ーニング用２枚の紙を、25〜42℃にて６〜８時間、フ
ィルター当り10mlのプローブを含まないDNAハイブリダ
イゼーション緩衝液〔０−50％ホルムアミド、５〜６×
SSC（pH7.0）、５×デンハート溶液（ポリビニルピロリ
ドン＋フィコール及びウシ血清アルブミン;1×＝0.02％
ずつ）、20〜50mMリン酸ナトリウム緩衝剤（pH7.0）、
0.2％SDS、20μg/mlポリＵ（cDNAをプローブする場
合）、及び50μg/ml変性サケ精子DNA〕とプレハイブリ
ダイズせしめる。次に、キナーゼ処理された（オリゴマ
ーについて）プローブを含有するハイブリダイゼーショ
ン緩衝液を用いて適当な温度での約24〜36時間のインキ
ュベーションにより、サンプルをハイブリダイズせしめ
る。一層長いcDNA又はゲノム断片プローブはニックトラ
ンスレーションにより又はプライマー延長によりラベル
された。
プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーシ
ョンの両者の条件は望まれるストリンジェンシー（stri
ngency）に依存し、そして例えばプローブの長さにより
異る。比較的長い（例えば30〜50ヌクレオチド以上）プ
ローブのための典型的な条件は42〜55℃の温度及び約20
〜50％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩
衝液を用いる。約15ヌクレオチドのオリゴマープローブ
のために必要とされる一層低いストリンジェンシーのた
めには、約25℃〜42℃の一層低い温度及び一層低いホル
ムアミド濃度（０％〜20％）を用いる。長いプローブに
ついては、フィルターを例えば30分間ずつ４回、各場合
に40℃〜55℃にて２×SSC、0.2％SDS及び50mMリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH7）により洗浄し、次に0.2×SSC及
び0.2％SDSにより２回洗浄し、空気乾燥し、そして−70
℃にて２〜３日間オートラジオグラフ処理する。洗浄条
件は、より短いプローブについては幾分苛酷である。
C.4.ベクターの造成 所望のコード配列及び制御配列を含有する適当なベク
ターの造成は、当業界においてよく理解されている標準
的連結及び制限酵素処理技法を用いる。単離されたプラ
スミド、DNA配列、又は合成オリゴヌクレオチドが開裂
され、仕立てられ、そして所望の形に再連結される。
部位特異的DNA開裂は、適当な制限酵素（１種類又は
複数種類）を用いて当業界において一般に理解されてい
る条件下で行われ、その詳細はこれらの商業的に入手可
能な制限酵素の製造者により記載されている。例えば、
ニューイングランドビオラブスの製品カタログを参照の
こと。一般に、約１μｇのプラスミド又はDNA配列が20
μｌの緩衝液中で１ユニットの酵素により開裂され、こ
の発明の例においては典型的にはDNA基質の完全な消化
を保証するために過剰の制限酵素が使用される。約37℃
における約１〜２時間のインキュベーション時間が実行
可能であるが、変更することも許容される。各インキュ
ベーションの後、フェノール／クロロホルムによる抽出
により蛋白質を除去し、そしてその後でエーテル抽出を
行い、そして核酸をエタノールを用いる沈澱により水性
画分から回収する。所望により、標準的技法を用いてポ
リアクリルアミドゲル又はアガロースゲル電気泳動によ
り、開裂された断片のサイズ分離を行うことができる。
サイズ分離の一般的記載がMethods in Enzymology（198
0）65:499−560に見出される。
制限開裂された断片は、４種類のデオキシヌクレオチ
ドトリホスクェート（dNTP）の存在下でE.コリDNAポリ
メラーゼＩの大断片（Klenow）により、50mM Tris（pH
7.6）、50mM NaCl、6mM MgCl2、6mM DTT及び５〜10μM
dNTP中20〜25℃にて約15〜25分間のインキュベーション
時間を用いて、平滑末端化することができる。Klenow断
片は５′接着末端においてフィルインするが、４種類の
dNTPが存在する場合でも突出３′単鎖をチューバックす
る。所望により、接着末端の種類により決定される制限
内で唯一の又は選択されたdNTPを供給することにより選
択的修復を行うことができる。Klenowで処理した後、混
合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタ
ノール沈澱を行う。S1ヌクレアーゼによる適当な条件下
での処理が単鎖部分の加水分解をもたらす。
合成オリゴヌクレオチドはMatteucci等〔J.Am.Chem.S
cc.（1981）103:3185−3191〕のトリエステル法によ
り、又は自動合成法を用いて調製することができる。ア
ニーリングに先立つ、又はラベル化のための単鎖のキナ
ーゼ処理は、過剰の、例えば1nmolの基質に対して約10
ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを用いて、50mM T
ris（pH7.6）、10mM MgCl2、5mMジチオスレイトール、
１〜2mM ATPの存在下で達成される。キナーゼ処理がプ
ローブのラベル化のためのものであれば、ATP高比活性3
2γＰを含む。
連結は15〜30μｌの容積中で次の標準的条件及び温度
のもとに行われる:20mM Tris−Cl（pH7.5）、10mM MgCl
2、10mM DTT、33μg/ml BSA、10mM−50mM NaCl:及び０
℃にて40μMATP,0.01−0.02（Weiss）ユニットのT4 DNA
リガーゼ（“接着末端”連結の場合）、又は14℃にて1m
M ATP、0.3−0.6（Weiss）ユニットのT4 DNAリガーゼ
（平滑末端連結の場合）。分子間“接着末端”連結は、
33〜100μg/mlの合計DNA濃度（５〜100nM合計末端濃
度）で通常行われる。分子間平滑末端連結（通常、10〜
30倍過剰のリンカーを用いる）は１μｍの合計末端濃度
において行われる。
“ベクター断片”を用いるベクターの造成において、
５′リン酸を除去しそしてベクターの再連結を防止する
ため、ベクター断片は一般に細菌アルカリホスファター
ゼ（BAP）で処理する。BAP消化はpH8にて約150mMのTris
中で、Na+及びMg+2の存在下でベクターμｇ当り約１ユ
ニットのBAPを用いて60℃にて約１時間行われる。核酸
断片を回収するため、調製物をフェノール／クロロホル
ムで抽出し、そしてエタノール沈澱を行う。別の方法と
して、不所望の断片の追加の制限酵素消化により二重消
化されたベクターにおいて再連結を防止することができ
る。
C.5.DNA配列の変更 cDNA又はゲノムDNA由来のベクターの配列の変更を必
要とする部分のため、部位特異的プライマー指令変異誘
発を用いる。この技法は当業界において標準的なもので
あり、そして所望の変異を代表する限定されたミスマッ
チを除き変異誘発されるべき単鎖ファージDNAに相補的
なプライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行われ
る。要約すれば、ファージに対して相補的な鎖の合成を
指令するためにプライマーとして合成オリゴヌクレオチ
ドが使用され、そして生ずる２本鎖DNAがファージ支持
性宿主微生物に形質転換される。形質転換された細菌の
培養物を上層寒天にプレートし、ファージを担持する単
一細胞からのプラーク形成を可能にする。
理論的には、新しいプラークの50％が変異形を単鎖と
して有するファージを含有し、50％がもとの配列を含有
するであろう。プラークをキナーゼ処理された合成プラ
イマーと、正確なマッチのハイブリダイゼーションを許
容するがもとの鎖とのミスマッチがハイブリダイゼーシ
ョンを回避するのに十分な温度においてハイブリダイズ
せしめる。次にプローブとハイブリダイズするプラーク
を拾い、培養し、そしてDNAを回収する。部位特異的変
異法の詳細を特定の例において下記する。
C.6.造成の確認 下記の造成において、プラスミド造成のための正しい
連結は、まずE.コリMM294株又は他の適当な宿主を連結
混合物により形質転換することにより確認される。好結
果の形質転換体は、当業界において理解されているよう
に、プラスミド造成の方法に依存して、アンピシリン、
テトラサイクリン又は他の抗生物質に対する耐性によ
り、あるいは他のマーカーを用いて、選択される。次
に、形質転換体からのプラスミドが、場合によってはク
ロラムフェニコール増幅〔Clewell,D.B.,J.Bacteriol.
（1972）110:667〕の後に、Clewell,D.B.等、Proc.Nat
l.Acad.Sci.（1969）62:1159の方法に従って調製され
る。単離されたDNAは制限処理により分析され、そして
／又はSanger,F.等、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（197
7）74:5463により記載されMessing等Nucleic Acids Re
s.（1981）９:309によりさらに記載されたジデオキシ法
により、又はMaxam等Methods in Enzymology（1980）6
5:499の方法により配列決定される。
C.7.宿主の例示 この発明でクローニング及び発現において使用される
宿主株は次の通りである。
クローニング及び配列決定のため、並びにほとんどの
細菌プロモーターの制御のもとでの造成物の発現のた
め、E.コリ・ゼネティックストックセンターGCSC＃6135
から得られるE.コリMM294株を宿主として使用した。PLN
RBSプロモーターの制御のもとでの発現のため、E.コリK
12株MC1000ラムダ溶原株、N7N53CI857 SusP80,ATCC 395
31が使用される。
M13ファージ組換体のため、ファージ感染に対して感
受性のE.コリ株、例えばE.コリK12株DG98が使用され
る。DG98株は、1984年７月13日にATCCに寄託され、そし
て受託番号39768を有する。
哺乳類発現はCOS−７及びCV−１細胞で行われた。
D.好ましい態様 この発明の組換CSF−１は、類似であるがしかし必ず
しも同一ではない一次アミノ酸配列を有し、そのすべて
がCSF−１に特徴的な活性パターンを示すか又はそのよ
うな活性パターンを示すミューテインに特異的に開裂さ
れ得る一セットのミューテインであると考えることがで
きる…すなわち、これらは支配的に単球に分化するよう
に骨髄細胞を刺激することができ、そして定義の項で前
記したように、天然CSF−１に対して生じた抗体及びCSF
−１活性と関連するリセプターと免疫反応性である。し
かしながら、これらのミューテインの幾つかの具体例が
好ましい。
mCSF−１について第５図に示す一次配列は要求される
活性を有し、そして言うまでもなく好ましい具体例に属
する。さらに、mCSF−１中の１又は複数のアミノ酸の欠
失又は保存的置換によって配列のある部分が変化してい
るミューテインが好ましい。“保存的”アミノ酸置換
は、蛋白質の活性特性を変化せしめずそして一般に交換
された２つの残基の側鎖の化学的類似性により特徴付け
られるそれを意味する。例えば、酸性残基は他の酸性残
基により、塩基性残基は塩基性残基により、疎水性残基
は疎水性残基により、バルキーな残基はバルキーな残基
により、等々で保存的に置き換えられる。要求される類
似性の程度は、言うまでもなく置換が行われるアミノ酸
の臨界性及びその性質に依存する。すなわち、一般に、
システインのための好ましい置換はセリン及びアラニン
であり；アスパラギン酸のためにはグルタミン酸であ
り；リジン又はアルギニン残基のためにはヒスチジン、
ロイシン、イソロイシン又はバリンであり；トリプトフ
ァン残基のためにはフェニルアラニン又はチロシンであ
り；等々である。
変化に対して最も耐えられるCSF−１蛋白質の領域
は、ヒト及びマウス種間の既知の低相同性領域（残基15
−20及び75−84）；蛋白質分解的開裂に対する感受性を
提供する領域（残基51と52、及び残基191−193）；ジス
ルフィド結合に関与しないシステイン、又は活性のため
に絶対的に必須ではない領域（残基158−224）である。
従って、mCSF−１の位置158及び224の間（158及び224
を含む）の１もしくは複数のアミノ酸及び／又はアミノ
酸の１もしくは複数の配列の欠失又は保存的置換により
特徴付けられるCSF−１ミューテインが特に好ましい。
さらに、mCSF−１の位置51及び52、及び／又は位置191,
192及び193の１又は複数のアミノ酸の欠失又は保存的置
換により特徴付けられるものが好ましい。これらは見か
け上低い相同様の領域を代表するので、他の好ましい１
セットの具体例はmCSF−１の位置15−20及び／又は位置
75−84における１又は複数のアミノ酸の欠失又は保存的
置換により特徴付けられるものである。さらに、ジスル
フィド結合の形成のために必須でない任意の部位のシス
テイン残基の欠失又は保存的置換により特徴付けられる
ミューテインも好ましい。さらに、mCSF−１の位置59の
チロシン残基の欠失又は置換、特にアスパラギン酸残基
による置換により特徴付けられる蛋白質が好ましい。
なお、特許請求の範囲において、「アミノ酸配列に対
して１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は
付加されているアミノ酸配列を有するポリペプチド」と
は、図５に示す224個のアミノ酸から成るヒト−コロニ
ー刺激因子−１のアミノ酸配列に対して１もしくは複数
のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されているアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドであって、ヒト−コロニ
ー刺激因子−１の生物学的活性を有しており、且つ例え
ば部位特定変異誘発法等、自体周知の方法により修飾で
きる程度の数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加さ
れて製造できるものを意味する。
E.ヒトCSF−１のクローニング及び発現 次に、ヒトCSF−１のコード配列を得、この配列を発
現ベクター中に配置し、そして目的蛋白質の発現を得る
のに使用した方法を例示する。
E.1.天然ヒトCSF−１の精製及びプローブの設計 人尿CSF−１をDas,S.K.等Blood（1981）58:630により
記載されている標準的方法により部分精製し、そしてセ
ファロースＢカラムに付加されたYYG106と称するネズミ
CSF−１に対するラットモノクローナル抗体を用いてア
フィニティー精製段階を行った。精製の最終段階に、0.
1％TFA/30％アセトニトリル−0.1％TFA/60％アセトニト
リル緩衝液系中の逆相HPLCであった。
ホルボールミリステートアセテートと共にインキュベ
ートすることにより無血清生産されたMIAPaCa CSF−１
について、細胞上清をリン酸カルシウムゲルクロマトグ
ラフィー〔Das（前掲）による〕にかけ、次にレンズ豆
レクチンを用いるアフィニティークロマトグラフィー
（DasのConAアフィニティー段階に代えて）を行い、そ
して次にセファロースＢに接合したYYG106モノクローナ
ル抗体を用いる免疫ファイニティー段階、及び逆相HPLC
（いずれも上記の通り）にかけた。
均一に精製された尿からの蛋白質及びMIAPaCa蛋白質
を自動化シーケンサー上でのエドマン分解を用いるアミ
ノ酸配列決定にかけた。第３図に示すプローブの造成を
可能にするのに十分なヒトCSFのＮ−末端配列を決定し
た。
E.2.ヒトゲノム配列の調製 ヒト蛋白質のＮ−末端配列をコードするように設計さ
れたプローブを用いて、λファージ・シャロン４中のMa
niatisヒトゲノムライブラリーから、CSF−１をコード
するヒトゲノム配列を得た。ヒト−ゲノムのHaeIII/Alu
I部分消化、EcoRIリンカーへの連結、及びEcoRI消化さ
れたシャロン４ファージヘの前記断片の挿入を用いてラ
イブラリーを造成した。上記のプローブとのハイブリダ
イゼーションにより判定された、CSF−１配列を含有し
そしてpHCSF−１と命名されたシャロンファージが、198
5年４月２日にアメリカン・タイプ・カルチュア・コレ
クション（ATCC）に寄託され、そして受託番号40177を
有する。このファージのその後の研究の際、再配置（re
arrangements）及び／又は除去が起こり、そして正しい
配列が維持されなかったことが見出された。従って、同
様にしてゲノムライブラリーから得られ、そして複製中
の安定性が増殖によって確認された他のコロニがpHCSF
−ａと命名され、そして1985年５月21日にATCCに寄託さ
れ、そして受託番号40185が与えられた。pHCSF−1aは18
kbの挿入部を含有し、そしてやはりプローブにハイブリ
ダイズすることができ、そして下記のようにして配列決
定及び追加のプローブ造成のために使用された。もしCS
F−１コード配列が完全な形で存在すれば、その存在はG
luzman,Y.,Cell（1981）23:175により記載されているよ
うにしてCOS−７細胞中での発現によって証明され得
る。試験断片を、SV40の複製開始点を含有するように変
形されたpBR322由来のプラスミド〔pGRI,Ringold,G.,J.
Mol,Appl.Genet（1982）１:165−175〕中にクローン化
した。生じた高コピー数ベクターをCOS−７細胞に形質
転換し、そしてCSF−１遺伝子の発現を24,48、及び72時
間後に、Das（前掲）により記載されたラジオリセプタ
ーアッセイ法によりアッセイする。発現は天然CSF−１
制御配列の制御のもとにある。この方法により試験され
たpH CSF−1aの約18kbの挿入部のHindIII消化物は発現
に失敗し、従ってHindIIIが遺伝子を消化したことが示
された。これは、その後のマッピングにより確認され
た。
しかしながら、最初の配列決定のため、3.9kbのHindI
II断片をpHCSF−1aファージから得、そしてM13クローニ
ングベクターにクローン化した。
HindIII断片は部分的に配列決定され、そしてその結
果が第４図中に推定ペプチド配列と共に示される。これ
は、第１図に示すようにアミノ酸配列が決定されている
ヒトCSF−１蛋白質の部分の正しいコドンを含む。約140
0bpのイントロンの存在が、得られるアミノ酸配列から
推定された。さらに、アミノ酸24−34をコードするゲノ
ム配列（第４図及び第５図中、上方に線を付した部分を
参照のこと）に基いて、cDNAライブラリーのための32−
マーのプローブを調製し、そして下記のように使用し
た。
さらに詳細には、ゲノムクローンpHCSF−1aを得るた
め、第３図中に示すオリゴマーの２つの混合物を用いて
Maniatisライブラリーをプローブした。EK14及びEK15を
選択した。但し、示されている他のオリゴマーも同様に
有用である。Ｎ−末端配列のための “十分な長さの”プローブを16種の35−マーの混合物と
して使用した。より短いオリゴマーEK15を64種の18−マ
ーの混合物として使用した。キナーゼ処理された両プロ
ーブにハイブリダイズするファージを拾い、そしてE.コ
リDG98又は他のコンピテント株の感染により培養した。
EK14及びEK15を用いるプロービングのための特定の条
件は次の通りである。EK14のためには、緩衝液は15％ホ
ルムアミド、６×SSC（pH7.0）、５×デンハート、20mM
リン酸ナトリウム、0.2％SDS及び50μg/mlの変性サケ精
子DNAを含有した。プレハイブリダイゼーション及びハ
イブリダイゼーションを42℃にて行い、そしてフィルタ
ーを２×SSC中で52℃にて洗浄した。
EK15のためには、ハイブリダイゼーション及びプレハイ
ブリダイゼーションのために同様の条件を使用したが、
但しホルムアルデヒド濃度を０％とし、洗浄をわずかに
低い温度である42℃にて行った。
陽性にハイブリダイズするファージpHCSF−1aから単
離された約18kbのDNA挿入部をHindIIIで処理し、そして
断片をSouthernの方法に従うアガロースゲル上での電気
泳動にかけた。ゲルをニトロセルロースフィルター上に
レプリカレ、そしてこのフィルターをEK14及びEK15によ
りさらにプローブした。両プローブが3.9kb断片にハイ
ブリダイズした。
陽性断片をゲルから切り出し、溶出し、そしてジデオ
キシ配列決定のためにHindIII処理されたM13mp19にサブ
クローン化した。部分配列を第４図に示す。下縁部はヒ
トCSF−１のすでに決定されているＮ−末端配列に正確
に対応し、点記号を有する残基はネズミ配列と相同であ
る。
第４図中、精製された蛋白質から決定されたヒト配列
から推定される、アミノ酸22及び23のコドン間の1.4kb
イントロン領域は翻訳されないで示されている。Ｎ−末
端配列の上流の配列は推定上のリーダーを含有し、cDNA
クローン（下記参照のこと）配列決定の予備的な結果に
より試しに確認された、成熟蛋白質にすぐ臨接するこの
リーダーの部分の翻訳が示される。しかしながら、上流
部分は翻訳して示されていない。これらの部分はcDNAと
の比較によりイントロンを含むことが確認される。
約13kbを得るための完全な18kb遺伝子の配列決定は、
遺伝子が８個のイントロンにより分離された９個のエク
ソンを含有することを示す。成熟蛋白質cDNAの領域は、
下にさらに記載するように、コドン59を除きゲノム・エ
クソンのコドンに正確に対応する。
HindIII3.9kb断片をPstIで消化して既知のＮ−末端配
列及び約1kbの追加の上流配列を含む1kbPstI/PstI断片
を生じさせることにより追加のM13サブクローンを得
た。
E.3.ヒトCSF−１をコードするcDNA ヒト膵臓癌セルラインMIAPaCa−２をmRNAの入手源と
して使用してプローブの有効性を確認し、そしてイント
ロンを含まない形のヒトCSF−１コード配列を含有す
る。cDNAライブラリーを形成した。MIAPaCaセルライン
は、ネズミＬ−929細胞に比べて約10倍低いレベルでCSF
−１を生産する。
血清不含有培地、すなわちCSF−１を生産しない条件
下、で維持されたMIAPaCa細胞から負対照mRNAを調製し
た。CSF−１を生産する細胞は、血清の除去の後のCSF−
１生産の再誘導により得られた。10％のウシ胎児血清を
含有するダルベコ改変イーグル培地（DMEM）を使用して
ローラーボトル中で細胞をコンフルエンスに増殖せし
め、そしてCSF−１を2000〜6000ユニット/ml生産せしめ
た。細胞培養物を洗浄し、そして無血清で再インキュベ
ートしてCSF−１の生成を抑制した。負対照について、
１日又は２日後に検出可能なCSF−１は生産されなかっ
た。ホルボールミリステートアセテート（100ng/ml）の
添加により再誘導された細胞を得て、数日後に1000〜20
00ユニット/mlの生産を得た。
リボヌクレオシド・パナジル複合体〔Berger,S.L.
等、Biochemistry（1979）18:5143〕の存在下での0.5％
NP−40を含有する等張緩衝液中での細胞の溶解、並びに
それに続くフェノール・クロロホルム抽出、エタノール
沈澱及びオリゴdTクロマトグラフィーによりmRNAを単離
し、そして濃縮されたmRNA調整物を得た。さらに詳細に
は、細胞をPBS（リン酸緩衝化塩溶液）中で２回洗浄
し、そして10mMのバナジル・アデノシン複合体（Berge
r,S.L.等、前掲）を含有するIHB（140mM NaCl、10mM Tr
is、1.5mM MgCl2、pH8）中に再懸濁する。
エチレンオキシドポリマータイプのイオン性浄剤（NP
−40）を0.5％に加えて細胞膜（しかし核膜ではない）
を溶解する。1000×ｇにて10分間の遠心により核を除去
する。核除去後（post−nuclear）の上清を、２容量のT
E〔10mM Tris、1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）,pH
7.5〕飽和フェノール・クロロホルム（1:1）に加え、そ
して0.5％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）及び10mM EDT
Aに調整する。上清を４回再抽出し、そして2,000×ｇで
の10分間の遠心により相分離を行う。サンプルを0.25M
NaClに調整し、２容量の100％エタノールを添加しそし
て−20℃に貯蔵することによりRNAを沈澱せしめる。RNA
を5,000×ｇにて30分間ペレット化し、70％及び100％の
エタノールで洗浄し、そして次に乾燥せしめる。オリゴ
dTセルロース〔Aviv,J.等、Proc.Natl.Acad.Sci.（197
2）69:1408−1412〕上でのクロマトグラフィーにより全
細胞質RNAからポリアデニル化（ポリA+）メッセンジャ
ーRNA（mRNA）を得る。RNAをETS（10mM Tris、1mM EDT
A、0.5％ SDS、pH7.5）中に2mg/mlの濃度で溶解する。
この溶液を65℃にて５分間加熱し、そして４℃に急速に
冷却する。RNA溶液を室温にした後、0.4M NaClに調整
し、そしてあらかじめ結合緩衝液（500mM NaCl、10mM T
ris、1mM EDTA、pH7.5、0.05％SDS）により平衡化した
オリゴdTセルロースカラムにゆっくりと通過せしめる。
流過液をさらに２回カラムに通す。次に、カラムを10容
量の結合緩衝液により洗浄する。ポリA+mRNAをETSのア
リコートにより溶出し、TE−飽和フェノール・クロロホ
ルムで１回抽出し、そして0.2MへのNaCl及び２容量の10
0％アルコールの添加により沈澱せしめる。RNAを２回再
沈澱せしめ、そして乾燥に先立って70％エタノール中で
１回、及び次に100％エタノール中で洗浄する。
全mRNAを、ベックマンSW40ローターを用いて20℃及び
27,000rpmにて17時間、10mM Tris−HCl（pH7.4）、1mM
EDTA及び0.5％SDS中５〜20重量％シュークロースグラジ
ェント遠心にかけた。次に、mRNA画分をエタノール沈澱
によりグラジェントから回収し、そして標準的形質転換
アッセイにおいてキセノプス（Xenopus）の卵母細胞に
注射した。RNA画分の卵母細胞生成物を骨髄増殖アッセ
イ〔Moore,R.N.等、J.Immunol.（1983）131:2374、及び
Prystowsky,M.B.等、Am.J.Pathol.（1984）114:149に記
載されている〕においてアッセイし、そして画分それ自
体をゲノム配列の第２エクソン（エクソンIIプローブ）
中のDNAに対応する32−マーのプローブへのドット・ブ
ロット・ハイブリダイゼーションによりアッセイした。
（第４図及び第５図中の上方の線はエクソンIIプローブ
を示す。）これらの結果を第７図に示す。
第７図中Ａの破線はキセノプス（Xenopus）卵母細胞
からの上清の骨髄増殖アッセイにおける反応を示し、第
７図中Ｂはドット・ブロットの結果を示す。最も強くハ
イブリダイズする画分11は18Sマーカーよりもわずかに
大きなサイズに相当し、他方最も活性な画分８及び９は
14〜16Sに相当する。画分8,9、及び11を用いて、下記の
ようにして濃縮されたcDNAライブラリーを形成した。
（mRNAはまた、変性ホルムアルデヒドゲル上で画分し、
ニトロセルロースに移し、そしてエクソンIIプローブに
よりプローブした。ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件下でさえ、1.5kbから4.5kbにわたるサイズ
の幾つかの区別される種が見出された。CSF−１をコー
ドする複数遺伝子の可能性を除去するため、種々の制限
酵素によるゲノムDNAの消化物をサザンブロットにか
け、そしてpcCSF−17DNAを用いてプローブした。制限パ
ターンはCSF−１をコードする１個のみの遺伝子の存在
と一致した。） プローブとハイブリダイズする能力は比較的低いが最
高の骨髄増殖活性を有するグラジェント画分８及び９か
らのmRNAを一緒にした。画分11（18Sよりわずかに大き
い）がプローブと最も強くハイブリダイブした。やはり
デクソンIIプローブにハイブリダイズする一層高分子の
画分は含めなかった。なぜなら、誘導されていないMIAP
aCa細胞からの対応するmRNAもエクソンIIプローブにハ
イブリダイズしたからである。
cDNAライブラリーを、全ヒトmRNA又は脳食されたヒト
mRNAから、２つの方法で調製した。１つの方法はλgt10
ファージベクターを用い、そしてHuynn,T.V.等、DNA Cl
oning Techniques:A Practical Approach IRL Press、
オックスホード、1984,D.Glover編、により記載されて
いる。
好ましい方法は、ポリＡテイルのオリゴdTプライミン
グ及びAMV逆転写酵素を用い、Okayam,H.等、Mol.Cell.B
iol.（1983）３:280−289を用いる。この記載を引用に
よりこの明細書に導入する。この方法は、ポリdGテイリ
ングに比べて高い比率で十分な長さのクローンをもたら
し、そして宿主ベクターとして、その分献に記載されて
おりそして著者から容易に入手できる２つのベクターpc
DV1及びpL1の部分を使用する。得られるベクターは、近
位BamHIびXhoI制限部位を含有するベクター断片間に挿
入部を含み；このベクターはpBR322複製開始点、及びAm
p耐性遺伝子、並びにCOS−７細胞中で挿入された配列の
発現を行うベクターの能力をもたらすSV40制御要素を含
有する。
次に、Okayama及びBerg法により上記の濃縮されたMIA
PaCamRNAから得られた300,000個のクローンライブラリ
ーを、エクソンIIプローブを用いて高ストリンジェンシ
ーの条件下でプローブした。このプローブにハイブリダ
イズする10個のコロニーを拾い、そしてコロニーを精製
した。これらのクローンを、COS−７細胞での一時的（t
ransient）発現によりCSF−１コード配列の存在につい
てアッセイした。SV40プロモーターを含むクローニング
ベクターは、COS−７細胞の形質転換においてそれ自体
使用された。
プラスミドDNAを10個の陽性クローンからCsClグラジ
ェエントを用いて精製し、そしてリン酸カルシウム共沈
法の変法〔Wang,A.M.等、Science（1985）228:149〕を
用いてCOS−７細胞を形質転換した。３日間のインキュ
ベーションの後、培養上清をDas,S.K.等、Blood（198
1）58:630により開示されているのと実質上同様にして
行われるラジオリセプターアッセイに、及びPrystowsk
y,M.B.等、Am.J.Pathol.（1984）114:146により開示さ
れているのと実質的に同様にして行われるコロニー刺激
（骨髄増殖）アッセイにかけることにより、CSF−１生
産をアッセイした。拾われた10コロニーの内９個はCOS
−７細胞中での一時的（transient）CSF−１生産を示す
ことに失敗した。発現を示した１つのコロニーを培養
し、プラスミドDNAを単離し、そいて挿入部を配列決定
する。DNA配列を推定されるアミノ酸配列と共に第５図
に示す。十分な長さのcDNAは1.64kbであり、そして224
アミノ酸の成熟CSF−１蛋白質をコードする。このクロ
ーンをCSF−17と称し、このものはシタス寄託番号CMCC2
347を有し、そして1985年６月14日に、受託番号No.5314
9として、アメリカン・タイプカルチュア・コレクショ
ンに寄託された。CSF−１コードDNAを有するプラスミド
はpcCSF−17と命名された。
E.4.CSF−１の一時的発現 CSF−17からのプラスミドDNAのCOS−７細胞中での発
現を、骨髄増殖アッセイ、コロニー刺激アッセイ及びラ
ジオリセプターアッセイを用いて確認しそして定量し
た。CSF−１についての骨髄増殖アッセイの特異性は活
性を減少せしめるCSF−１抗血清の能力のみに存するこ
と；コロニー刺激アッセイのそれが得られるコロニーの
性質に存することが思い出されよう。両アッセイは、CS
F−１生産がml当り数千ユニットのオーダーであること
を示した。
骨髄増殖 蛋白質の生物学的活性を測定する骨髄刺激アッセイの
ため、Balb/cマウスからの骨髄細胞を72時間上清の逐次
稀釈物により処理し、そして細胞の増殖を、Moore,R.N.
等、J.Immunol.（1983）131:2374;Prystowsky,M.B.等、
Am.J.Pathol.（1984）144:149により記載されているの
と実質的に同様にして、ラベルされたチミジンの取り込
みにより測定した。誘導されたMIAPcCa細胞からの培地
を対照として使用した。CSF−１の特異性を、チミジン
の取り込みを抑制する、人尿CSF−１に対するラビット
抗血清の能力により確認した。pcCSF−17によりトラン
スフェクトされたCOS−７細胞の上清の1:16稀釈におけ
る結果を第１表に示す。
（抗ヒトCSF−１血清はDas等、前掲の方法により調製さ
れた。） MIAPaCa上清（上に用いられた1:16稀釈における）は1
25U/mlのCSF活性を含有し、これは未稀釈の上清中2000U
/mlに相当した。ここで、コロニー刺激活性の１ユニッ
トは、Stanley,E.R.等、J.Lab.Clin.Med（1972）79:657
のアッセイにおいて、105/mlの骨髄細胞から１個のコロ
ニーを生じさせるのに必要な量として定義される。
チミジンの取り込みが抗−CSF−１血清により阻害さ
れるから、これらのデータは骨髄刺激活性がCSF−１と
関連していることを示している。1:8〜1:64の４つの稀
釈において得られたこの骨髄増殖アッセイにおける結果
の回帰はCSF−17上清中のCSF−１の2358U/mlの予想活性
を示し、これは抗血清の存在下で424U/mlに減少した
が、非−免疫血清の存在下で3693U/mlへの見かけの増加
を示した。これは下記のラジオリセプターアッセイにお
いて示されたレベルに匹敵した。
コロニー刺激 コロニー刺激についてのCSF−17上清の直接アッセイ
（Stanley,E.R.等、J.Lab.Clin.Med、前掲）は4287U/ml
を示し、これは非−免疫血清の存在により実質的に影響
を受けなかったが、ラビット抗ヒトCSF−１の存在下で0
U/mlに低下した。pcCSF−17によりトランスフェクトさ
れたCOS−７の上清により誘導されたコロニーの85％が
単核形態を有し、MIAPaCa上清により誘導されたコロニ
ーは94％のマクロファージ−６％の顆粒球の比率を示し
た。
ラジオリセプターアッセイ ラジオリセプターアッセイは、J774.2マウスのマクロ
ファージ細胞上の特異的リセプターに対する125I−ラベ
ル化CSF−１と試験化合物との間の競争を測定する。上
記のようにしてコロニー刺激活性についてアッセイされ
たMIAPaCa上清を標準（2000U/ml）として用いた。pcCSF
−17でトランスフェクトされたCOS−７の上清のCSF−１
濃度は、1:10稀釈に基いて2470U/mlであり、そして1:5
稀釈に基いて3239U/mlであることが見出された。
すなわち、pcCSF−17によりトランクフェクトされたC
OS−７細胞の培地中のCSF−１濃度について、すべての
アッセイにおいて匹敵する値が見出された。
E.5CSF−１の安定な発現 COS−７系は、ベクター配列の複製及び該配列からの
発現を許容することにより組換CSF−１をもたらす。
ヒトCSF−１配列はまた原核系又は真核系において安
定に発現され得る。一般に、原核宿主は生産の容易さを
もたらし、地方真核細胞は天然シグナル配列の使用を許
容しそして所望の翻訳後プロセシングを行う。これはCS
F−１の場合に特に重要である。なぜなら、この天然蛋
白質はダイマーだからである。細菌はCSF−１をモノマ
ーとして生産し、そしてこのモノマーは抽出後にダイマ
ー化条件にかけられるであろう。
原核性発現 原核性発現のため、cDNAクローン、又は例えば部位特
異的変異誘発によりイントロンが切り取られたゲノム配
列を変形してATG開始コドンをＮ−末端のグルタミン酸
のすぐ上流に置き、そしてこのATGのすぐ上流にHindIII
部位を置くことにより下記の標準的宿主発現ベクターへ
の挿入のために便利な部位を設ける。これは、天然リー
ダー配列及びＮ−末端コード配列を両端に有する目的AA
GCTTATGに相補的な新たな配列を含有する合成オリゴマ
ーによる挿入部位特異的変異誘発を用いて直接的に行う
ことができる。
OkayamaおよびBergの方法を用いて得られたcDNAにつ
いて、完全なコード配列を含有するDNA断片をpcCSF−17
から、XhoIによる消化によって切り出し（宿主クローニ
ングベクターから保持されている部位において）、アガ
ロースゲル電気泳動により単離し、そして電気溶出によ
り回収する。変異誘発を行うため、宿主バクテリオファ
ージM13mp18DNAもSalIにより処理し、そして精製された
断片と標準的条件下で連結し、そして凍結処理されたコ
ンピテントE.コリK12株DG98にトランスフェクトする。
細胞を、シグマ社（セントルイス,MO）から得られるイ
ソプロピルチオガラクトシド（IPTG）５×10-4Ｍ及びＸ
−gal40μg/mlを含有する培地上にプレートする。非補
完白色プラークを新しい培地に拾う。ミニ−カルチュア
を予想サイズの組換単鎖ファージDNAについてスクリー
ニングし、そして目的の組換ファージの培養物を制限分
析を用いて確認する。
CSF−１配列のＮ−末端コード部分及びリーダーコー
ド部分と相補的であるがしかし目的のAAGCTTATG配列に
対する相補体を含有する34−マーを合成し、そしてC.4
に記載の方法に従って精製する。この34−マー調製物の
部分を、C.4に前記したMaxam及びGilbert〔Maxam,A.
等、Methods in Enzymology（1980）68:521,アカデミッ
クプレス〕の技法の変法に従って放射性ラベルする。
変異を行うため、上に調製された組換バクテリオファ
ージをE.コリ12株DG98中に調製し、そして単鎖ファージ
DNAを精製する。1pmoleの単鎖ファージDNA及び10pmole
の上記合成ヌクレオチドプライマー（キナーゼ処理され
ていない）を、15μｌの20mM Tris−Cl（pH8）、20mM M
gCl2、100mM NaCl、20mM2−メルカプトエクノール中で6
7℃にて１分間そして次に37℃にて30分間加熱するおと
によりアニールする。アニールされたDNAをDNAポリメラ
ーゼＩ（Klenow）及び500μM dNTPと共に０℃にて30分
間インキュベートし、そして次に37℃にする。アリコー
ト（0.05又は0.25pmole）を５分、20分、及び45分後に
取り出し、E.コリK12株DG98に形質転換し、そしてプレ
ートとする。
増殖の後、プレートを４℃に冷却し、そしてプラーク
をBiodyneから得られるPalI膜又はＳ＆Ｓフィルターに
より取り上げる（第１のフィルターにおいては１〜２分
間、第２のフィルターのためには10分間以上）。フィル
ターを2.5M NaCl、0.5M NaOH中で変性する（ 分間）。
変性媒体を3M酢酸ナトリウムによりpH5.5に、又は1M Na
Clを含有する1M Tris−Cl（pH7.5）により中和し、フィ
ルターを真空中80℃にて１時間加熱（bake）し、そして
次に高ストリンジェンシーにおいてプレハイブリダイズ
せしめる。次に、フィルターを上記調製されたキナーゼ
処理された合成34−マーによりプローブし、洗浄し、そ
して−70℃にて一夜オートラジオグラフ処理する。
所望の変異したファージのRF形をEcoRIで処理し、Kle
nowで平滑末端化し、そして次にHindIIIで消化して遺伝
子をHindIII/平滑断片として切り出す。（全く類似の方
法で、pMCSFからのCSP−１コード配列を得、そして変形
することができる。） 次に、ヒト（又はネズミ）CSF−１コード配列を含有
するこの断片をHindIII/BamHI（平滑）消化されたpPLOP
又はpTRP3（下記参照のこと）と連結して、ATG開始コド
ンを含有するコード配列をそれぞれPLプロモーター又は
trpプロモーターのすぐ下流に置く。これらの得られた
プラスミドをE.コリMC1000ラムダ溶原株又はMM294に形
質転換し、そして次にそのプロモーターに適する手段に
より誘導する。細胞を遠心により取得し、高波処理し、
そして遊離したCSF−１を可溶化する。ヒト（又はネズ
ミ）CSF−１の存在は、音波処理物を前記のコロニー刺
激アッセイにかけることにより確認される。
真核性発現 SV40プロモーターの制御のもとにヒトCSF−１をコー
ドするcDNAを含有するOkayama−BergプラスミドpcCSF−
17はまた、前記COS−７セルラインがそれから誘導され
た親セルラインであるモンキーCV−１細胞での安定な発
現を行うために使用され得る。宿主モンキーCV−１細胞
をコンフルエンスに増殖せしめ、そして次に500,000細
胞当り10μｇのpcCSF−17及び種々の量（1,2,5,及び10
μｇ）のpRSV−NE02〔Gorman,C.等、Science（1983）22
1:551−553〕を用いて同時形質転換した。形質転換体
を、100μg/mlのG418抗生物質（pRSV−NE02プラスミド
がこれに対する耐性を付与する）を含有する10％FBSを
伴うDMEM培地中で増殖せしめた。CV−１セルラインは10
-5.12コロニー／106細胞／μgDNAのG418形質転換頻度を
示した。
CV−１細胞を上記のようにして同時形質転換し、そし
てG418含有培地中で選択した。耐性コロニーをG418不含
有培地中で増殖せしめそして次にG418含有培地に戻すこ
とによりG418耐性表現型の安定性について試験した。抗
生物質含有培地に戻された際のこれらの培養物の生存能
力が、pRSV−NE02DNAが細胞ゲノムに永久的に組み込ま
れたことを示唆する。マーカープラスミドにより安定に
形質転換された細胞は、約50％の確率で同時トランスフ
ェクトプラスミドのDNAを組み込んでいるから、これら
の細胞の約半数はさらにそれらの染色体DNA中にpcCSF−
17DNAを含有するでろう。
上記のように安定に形質転換されたことが証明された
CV−１細胞のG418耐性プールの幾つかのクローンを拾
い、そして２個のフラスコ中でコンフルエンス近くまで
増殖せしめた。各２個の内の１つのフラスコにSV−40ウ
イルスを５の感染多重度で感染せしめ、そしてラジオイ
ムノアッセイを用いるCSF−１のアッセイのため、感染
後６日目に培地を収得した。イムノアッセイは、精製さ
れた人尿CSF−１に対して生じた“ラビット52"ポリクロ
ーナル抗血清に対する125I−ラベル化MIAPcCa CSF−１
との競争に基く。
選択されたCV−１クローンの１つはこのアッセイに従
って2335U/mlのCSF−１の生産を示し、他方SV−40によ
り感染されていない細胞は20U/ml未満を示した。10μｇ
のpcCSF−17により形質転換されたCOS−７細胞を用いる
対照は、SV−40の感染を伴わないで2400U/mlのCSF−１
の生産を示した。
CSF−１生産性CV−１セルラインはそのゲノムに安定
に組み込まれてpcCSF−1DNAを含有し、そしてそれ故にS
V−40による感染の後のCSF−１の安定な生産のために使
用することができる。感染はゲノムからpcCSF−17DNAを
“救出”（resucue）し、そして救出されたDNAの複製に
必要なSV−40T−抗原を提供すると予想される。SV−40
感染がなければ、組込まれたpcCSF−17DNAは効果的に発
現されない。
CV−１（CSF−17）セルラインによるCSF−１コード配
列の発現の最適化は、１以上の感染多重度及び10％FBS
培地を用いるVS−40感染の６日後のラジオイムノアッセ
イにより測定した場合6500〜8000U/mlを示した。10の多
重度における発現の研究は匹敵する生産を示したが、し
かし生産は感染後２日目に培地からFBSを除去した後減
少した。
他の方法として、適当な制御系及び真核細胞における
発現を許容する宿主ベクターを、CSF−１コード挿入部
を受理するために用いることができる。例えば、同じ承
継人に承継され1982年11月１日に出願された米国出願N
o.438,991に記載されているように、CHO細胞及び適当な
ベクターを使用することができる。前記特許出願の記載
を引用によりこの明細書に組み入れる。
E.6.CSF−１の活性 CSF−１の活性の追加の定義が、CV−１により生産さ
れる組換材料のモデルとして、部分精製されたMIAPaCaC
SF−１又はネズミＬ細胞CSF−１を用いて与えられた。C
SF−１は、誘導されたヒト単球によるインターフェロン
及び腫瘍壊死因子の生産を10倍まで増強せしめることが
示された。CSF−１はまた、マクロファージ抗腫瘍毒性
を刺激することが示された。
ヒト単球によるTNF生産の刺激 MIAPaCaCSF−１を上清からリン酸カルシウムゲル過
及びレンズ豆レクチンクマトグラフィーにより精製し
た。リンホカイン生産のアッセイのため、末梢血−付着
細胞を107細胞ずつ収容する２本のフラスコ中でインキ
ュベートした。１つのフラスコは上記のように精製され
た1000U/mlのCSF−１により処理した。３日後、細胞を
収得し、そして洗浄し、そして５×105/mlの細胞濃度で
再懸濁し、そして24−ウエルプレートに0.5ml/ウエルで
プレートした。ウエルを10μg/mlのLPS及び20ng/mlのPM
Aで48時間処理し、そして上清をTNFアッセイのために収
得した。CSFで処理された細胞は、未処理細胞に比べて
約９倍多くのTNFの分泌を示した（162U/mlに対して1500
U/ml）。
ヒト単球によるインターフェロン生産の刺激 インターフェロン生産に対するCSF−１の効果を実験
するための類似の実験において、末梢血付着細胞を３日
間1000U/mlのCSF−１の存在下及び非存在下で前記のよ
うにしてインキュベートし、収得し、５×105/mlで再懸
濁し、そして上記のようにして25−ウエルプレート中に
プレートした。種々の量のポリICを加えることにより細
胞をインターフェロン生産のためにインキュベートし
た。上清を、VSVに感染されたGM2504細胞に対するそれ
らの細胞変性効果によりインターフェロン生産について
アッセイした。CSF−１で刺激された細胞は、McCormic
k,F.等、Mol.Cell Biol.（1984）４:166により記載され
ているようにして50μg/mlのポリICにより誘導された場
合、100U/mlの生産を示し、他方同様に誘導された未処
理細胞は3U/ml未満生産した。
ヒト単球による骨髄CSF生産の刺激 単球を±CSF−１にて３日間インキュベートし、そし
て第１表におけるごとく骨髄CSFの生産のために誘導し
た。示されている３つの代表的な実験は異る提供者から
の血液を用した。
ネズミマクロファージによる腫瘍細胞殺滅の刺激；他の
コロニー刺激因子との比較 マクロファージ刺激をアッセイするために、Ｌ−細胞
条件化培地から得られたネズミCSF−１を、肉腫標的を
殺すネズミマクロファージの能力の刺激を示すアッセイ
において、pcCSF−17から組換生産されたCSF−１のため
のモデルとして使用した。このアッセイにおいて、正常
２時間付着C3H/HeNマウス末梢マクロファージをインビ
トロで１日間CSF−１を伴って又は伴わないでインキュ
ベートし、そして次に20:1の比率で3H−チミジン−ラベ
ル化マウス肉腫TU5細胞及び10V/V％conA−誘導（10ng/m
l）の脾臓リンホカイン（LK）（ガンマ−インターフェ
ロンを含有する）と混合した。その後の48時間にわたる
ラベル化チミジンの放出を腫瘍細胞死滅の測定として用
いた。1200U/mlのCSF−１を含有するネズミＬ−細胞条
件化培地としてのCSF−１添加の効果を次の表に示す。
標的細胞を殺す能力の上昇は、CSF−１が増殖の予備
的１日の間に添加された場合又はインキュベーションの
間に添加された場合に認められた。しかしながらCSF−
１がこれらの両期間中に存在した場合に最も劇的な効果
が観察された。
単球及びマクロファージの刺激の原因としての細菌リ
ポポリサッカライド（LPS）の汚染の可能性は排除され
た。すなわち、適用されたCSF−１のLPS含量は低く〔リ
ムルス（Limulus）アメーバ細胞リセートアッセイによ
り、＜0.3ng/3000U CSF−１〕；抗−CSF−１カラムへの
適用により活性が除去され;C3H/HeJマウスからのマクロ
ファージはCSF−１に反応するがしかしLPSには反応しな
い。
５μｇのLPSのIV投与後５時間に得られた６個のマウ
スの肺からCSF−GMを調製した。肺を細断し、そして血
清不含有培地中で３日間インキュベートし、そして上清
をYYG106アフィニティーカラムを用いてCSF−１デプレ
ーション（deplete）した（CSF−１含量が270U/mlから7
8U/mlに減少した）。CSF−Ｇを、同様に処理したLDI血
清不含有培地から調製した。CSF−GM及びCSF−Ｇ含量を
2000U/mlにてコロニー刺激アッセイによりアッセイし
た。
末梢血マクロファージを40％の前記培地又はアッセイ
されたＬ−細胞培地のいずれかと共に2000U/mlにて１日
間インキュベートし、そして次に追加の培地と共に又は
LKと共に49時間イキュベートし、そして上記のようにし
てTU5の死滅についてアッセイした。
結果を第６図に示す。CSF−１はTU5に対する毒性の顕
著な増強を示したが、CSF−Ｇ及びCSF−GMはいずれもな
んらの効果も有しなかった。
ネズミ抗ウイルス活性の刺激 付着ネズミチオグリコレート誘導マクロファージをCS
F−１と共に３日間インキュベートし、そしてVSVにより
一夜感染せしめた。インターフェロンのLPS誘導をブロ
ックするためポリミキシンＢを試験サンプルに加えた。
次の表は付着したままの細胞のクリスタルバイオレット
染色を示す。
従って、CSF−１処理細胞はVSVに対するマクロファー
ジの保護を示した。
E.7.CSF−１の製剤化 組換生産されたヒトCSF−１を標準的製薬手順を用い
て投与のために製剤化することができる。通常、CSF−
１は注射用の形で調製され、そして唯一の活性成分とし
て、あるいは他の蛋白質又は補完的であるか類似する活
性を有する他の化合物との組合わせにおいて使用される
であろう。このような他の化合物には、代替可能な抗腫
瘍剤、例えばアドリアマイシン、又はリンホカイン、例
えばIL−1,−2,及び−３、α−，β、及びγ−インター
フェロン、及び腫瘍壊死因子が包含されよう。CSF−１
活性成分の効果はこのような追加の成分の存在によって
増強又は改良されよう。上記のように、CSF−１は有利
な態様で適切な血球と相互作用することができ、そして
それ故にこの発明の組成物は、場合によっては追加のリ
ンホカインの存在下でのこのような細胞とCSF−１との
イキュベーション混合物を包含することができる。この
ようなインキュベーション混合物の上清画分、又は細胞
も含有する全混合物を使用することができる。
F.ネズミCSF−１ ネズミCSF−１をコードするイントロン不含DNA配列
を、多量のCSF−１を生産するネズミ線維芽細胞セルラ
インを用いて調製する。cDNAライブラリーを形成するた
めのmRNA源として、ATCCから入手可能なＬ−929ライン
を用いる。既知のネズミＮ−末端及びCNBr−開裂内部ペ
プチド配列に基づいて造成されたオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いてこのcDNAライブラリーをプローブするこ
とにより、ネズミ型蛋白質のための完全コード配列を回
収する。Ｎ−末端配列の相同性、ヒト及びネズミの両者
のCSF−１調製物の骨髄細胞からのマクロファージコロ
ニーを刺激する能力、並びにラジオレセプター及びラジ
オイムノアッセイ〔Das,S.K.等、Blood（1981）58:63
0〕に関する限定された交差反応性に基き、ネズミCSF−
１はヒト物質におよそ80％相同であると信じられる。
F.1.蛋白質の精製 ネズミCSF−１を、Stanley,E.R.等、J.Immunol.Meth.
（1981）42:253−285、及びWang,F.F.等、J.Cell.Bioch
em.（1983）21:263−275により開示された方法、あるい
はHunkapiller,M.W.等、Science（1984）226:304により
総説されているSDSゲル電気泳動法に従って精製した。
位置10におけるサノゲンブロマイド開裂を用いて分解
法を延長することにより、ネズミ配列のアミノ酸１−39
を得た。マウス蛋白質からの内部開裂断片も得、そして
配列決定した。
マウス蛋白質の全体組成データも下記のように得た。
これらのデータは、良好な回収を示すアミノ酸について
正しい相対モル％を示す。しかしながら、ヒスチジン及
びシステインは良好な収率で回収されなかったので数値
は絶対的ではない。アミノ酸 モル％ 残基／125 Asp 20.1 25.1 Glu 20.0 25.0 His −− −− Ser 6.0 7.5 Thr 5.9 7.4 Gly 5.4 6.8 Ala 6.8 8.5 Arg 3.0 3.8 Pro 6.7 8.4 Val 5.3 6.6 Met 1.1 1.4 Ile 3.9 4.9 Leu 8.5 10.6 Phe 6.0 7.5 Lys 3.5 4.4 Tyr 4.1 5.1 残基/125への換算は分子量からの配列長さの概算に基
く。
F.2.ネズミCSF−1cDNAの調製 ネズミCSF−１のアミノ酸配列５−13及び内部配列を
プロブ造成の基礎として使用した。
ネズミ配列に対応する３セットのオリゴマーを調製し
た。第図に示すように、１つの配列は“領域A"−すなわ
ちアミノ酸９−13をコードするように調製され；他方は
“領域B"−すなわちアミノ酸５−９をコードするように
調製され；第３は内部配列“領域C"の位置０−６をコー
ドするように調製された。コドンの冗長性のため、オリ
ゴマーのこれらのクラスのそれぞれは高度に縮重性（de
generate）である。
すなわち、領域Ａに基いて造成された15−マーは48を
数え；領域Ｂ（ヒスチジンのコドンの最後のヌクレオチ
ドを欠く）に基いて造成された14−マーもやはり48を数
え；領域Ｃに基いて造成された20−マーは32を数える。
これとは異り、領域Ａをコードするようい造成された15
−マーは15個の位置の内の４個にミスマッチを有するこ
とができ、領域Ｂに関して造成された特定の14−マーは
６個の位置にミスマッチを有することができ；領域Ｃに
関して造成された特定の20−マーは５個の位置にミスマ
ッチを有することができる。
下に記載するように、適切な方法設計により、所望の
濃縮されたネズミcDNAライブラリーの形成のために濃縮
されたメッセンジャーRNA画分を見出すことができ、そ
してプローブとして使用するための精密に正しいオリゴ
マーも確認される。
ネズミＬ−929細胞から全メッセンジャーRNAを抽出し
そして精製する。ネズミＬ−929細胞をDME培地上で８日
間培養し、そして次に遠心により収得する。全細胞質リ
ボ核酸（RNA）を、MIAPaCa mRNAについて上記したのと
同じ方法により細胞から単離した。
mRNAを、C.3項に記載したようにナサンブロットのた
めにゲル上で画分する。領域Ａに対応する15−マー配列
を12ずつの４群にわける。これらの群のそれぞれを、対
照及びネズミＬ−929 mRNAスラブに低ストリシジェンシ
ーのもとにハイブリダイズせしめるために用い、そして
生ずるパターンをラジオオートグラフィーにより観察し
た。使用した低ストリンジェンシー条件のもとでは、適
当な配列を含有しない画分及び含有する画分に対してハ
イブリダイゼーションが生ずる。さらに対照セルライン
は、CSF−１を生産しないこと以外の点においてもＬ−9
29系のそれと異るので、Ｌ−929細胞ゲル中のCSF−１に
関連しない多数のサイズ位置（対照中には存在しない）
中にハイブリダイゼーションが生ずる。
匹敵するセットの対照及びＬ−929ゲルを領域Ｂを代
表する48個の14−マーの分離物（segregate）及び領域
Ｃを代表する32個の20−マーの分離物（segregate）を
用いてプローブする。次に、領域Ａ又はＢ、及びＣプロ
ーブに対してＬ−929スラブ中で排他的にハイブリダイ
ズするメッセンジャーRNAのバンドのみをさらに考慮す
る。段々強化されるストリンジェンシーの条件下で、領
域A15−マー混合物の１つ又は領域B14−マー混合物の１
つ、及び領域C20−マー混合物の１つと結合し続けるRNA
バンドを選択する。
正しいmRNAバンドを見出された場合、領域A15−マー
の各群を用いて種々のストリンジェンシーの条件下でプ
ローブする。最も高いストリンジェンシーにおいて結合
する群はおそらく、生産されたmRNAに正確に相補的な正
しい15−マーを含有する。最も高いストリンジェンシー
において結合する１個のオリゴマーが見出されるまで調
製物をさらに分割することによって正しい15−マーを確
認する。領域Ｂ又はＣと結合する正しい14−マー又は20
−マーを確認するために類似の方法を用いる。次に、こ
れらの特定のオリゴマーを、濃縮されたmRNA画分から調
製されるネズミcDNAライブラリーにおけるプローブとし
て使用することができる。
次に、CSF−１のためのコード配列を含有するものと
して同定されたmRNA画分を調製的規模で得る。この調製
においては、ポリA+mRNAを10mM Tris−HCl（pH7.4）、1
mEDTA、及び0.5％SDS中シュークロースグラジェント上
で分画した。ベックマンSW40ローター中で30,000rpmに
て17時間遠心した後、mRNAをグラジェントからエタノー
ル沈殿により回収する。グラジェントから回収されたRN
A画分をそれぞれ標準的翻訳アッセイにおいてキセノプ
ス（Xenopus）の卵母細胞に注射し、そしてネズミCSF−
１に対して生じた抗体によるラジオイムノアッセイを用
いて生成物をCSF−１についてアッセイする。陽性結果
が得られた画分をプールし、そしてcDNAライブラリーを
造成するために使用した。これら同じ画分はオリゴマー
プローブとハイブリダイズする。
cDNAライブラリーを調製するための他の方法が、言う
までもなく当業界においてよく知られている。今や古典
的となった１つの方法はオリゴdTプライマー、逆転写酵
素、ポリdGによる２本鎖cDNAのテイル形成、及び所望の
制限部位において開裂されそしてポリdCによりテイル形
成されている適当なベクター、例えばpBR322又はその誘
導体へのアニーリングを用いる。この代替法の詳細な記
載は、例えば、同一承継人に承継され1983年12月20日に
出願された米国特許出願No.564,224号に見出される。こ
の記載を引用によりこの明細書に組み入れる。
ここで使用される方法においては、濃縮されたmRNA
（５μｇ）を、10mMメチル水銀を用いて22℃にて５分間
処理することにより変性し、そして100mMの２−メルカ
プトエタノールの添加により脱毒する〔Payvar,F.等、
J.Biol.Chem.（1979）254:7636−7642〕。プラスミドpc
DV1をKpnIで開裂せしめ、dTTPによりテイル形成し、そ
して変性されたmRNAにアニールする。このオリゴdTによ
りプライムされたmRNAを逆転写酵素により処理し、そし
て新たに合成されたDNA鎖にdCTPによりテイル形成す
る。最後にpcDV1ベクターの不所望の部分をHindIIIによ
る開裂により除去する。別途、pL1をPstIで開裂せし
め、dGTPでテイル形成し、HindIIIで開裂せしめ、そし
て次にpcDV1ベクター断片により延長されたポリＴテイ
ル化mRNA/cDNA複合体と混合し、E.コリ（E.Coli）リガ
ーゼにより連結し、そして混合物をDNAポリメラーゼＩ
（Klenow）E.コリ（E.Coli）リガーゼ、及びRNアーゼＨ
により処理する。生ずるベクターによりE.コリK12MM294
をAmpRに形質転換する。
次に、生ずるcDNAライブラリーを、前記のようにして
mRNAコード配列に相補的であるとして同定されたオリゴ
マープローブを用いてスクリーニングする。領域Ａ又は
Ｂ、及びＢからのプローブにハイブリダイズするコロニ
ーを拾い、そして増殖せしめ、プラスミドDNAを単離
し、そしてCSF−１の完全な配列をコードするのに十分
なサイズの挿入部を含有するプラスミドを単離する。こ
れらのプラスミドのそれぞれの挿入部の配列を決定し、
そして上流部分に領域Ａ及びＢを含有する完全コード配
列を含有するプラスミド調製物をpcMCSFと命名する。
F.3.ネズミCSF−1DNAの発現 ヒトcDNAについて前記したのと同様にして、ネズミcD
NAをCOS細胞中での一時的（transient）発現について試
験し、そして安定に形質転換されたCV−１中での発現の
ために使用する。さらに、適切なHindIII/ATGコード配
列を変異誘発により成熟蛋白質の上流に挿入し、そして
原核性発現のためにコード配列をpPLOP又はpTRP3に挿入
する。
G.宿主ベクター pPLOPは、PLプロモーター、及びHindIII制限開裂部位
に隣接したＮ遺伝子リボゾーム結合部位を有し、そのた
めにHind部位に先行されるATG開始コドンを有するコー
ド配列の便利な挿入を許容する宿主発現ベクターであ
る。このベクターのバックボーンはpCS3由来の温度感受
性高コピー数プラスミドである。pPLOPは1984年12月18
日にATCCに寄託され、そして受託番号39947を有する。
pTRP3は、HindIII制限部位のすぐ上流にtrpプロモー
ターを含有し、そして上記のpPLOPと同様の態様でのコ
ード配列の挿入を許容する宿主発現ベクターである。pT
RP3のバックボーンベクターはpBR322である。pTRP3は19
84年12月18日にATCCに寄託され、そして受託番号39946
を有する。
pPLOPの造成 複製開始点 pCS3は、高温においてpPLOP宿主ベクターの高コピー
数をもたらす複製開始点を提供する。この造成物は1983
年10月14日に出願された米国特許出願No.541,948に十分
に記載されており、この記載を引用によりこの明細書に
組み入れる。pCS3は1982年６月３日に寄託され、そして
ATCC No.39142が割合てられた。
pCS3はpEW27及びpOP9に由来する。pEW27はE.M.Wong,P
roc.Natl.Acad.Sci.(USA)（1982）79:3570により記載さ
れている。このものはその複製開始点の近傍にコピー数
の温度制御をもたらす変異を含有する。
pOP9は、Col ElタイプのプラスミドpOP6〔Gelfand,D.
等、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)75:5869〕からのEcoRI/P
vuII開始点含有断片をpBR322に挿入することにより造成
された、全温度において高コピー数のプラスミドであ
る。挿入の前に、この断片を次のように変形した。50μ
ｇのpOP6を20ユニットずつのBamHI及びSstIにより完全
消化した。SstI3′突出末端を除去しそしてBamHI5′末
端をフィルインするため、消化されたpOP6DNAをE.コリD
NAポリメラーゼＩ（Klenow）により、まず20℃にて３′
SstI突出末端を除去しそして９℃にて５′末端を修復す
る２段階反応において処理した。平滑末端化された断片
を消化し、そして0.02pmoleを用いてコンピテントDG75
〔０′Farrell,P.等、J.Bacteriology（1978）134:645
−654〕を形質転換した。形質転換体を50μl/mlのアン
ピシリンを含有するＬプレート上で選択し、そして3.3k
bの欠失、SstI部位の喪失、及び新たに形成されたBamHI
部位の存在についてスクリーニングした。
pOP7と称する１つの候補を選択し、そして25μｇのpO
P7を20ユニットのBamHIで消化し、E.コリDNAポリメラー
ゼＩ断片（klenow）で修復し、そしてT4 DNAリガーゼに
より再連結することによりBamHI部位を除去した。コン
ピテントDG75を0.1μｇのDNAで処理し、そして形質転換
体を50μg/mlのアンピシリンを含有するＬプレート上で
選択した。pOP8を選択した。pOP9を得るため、pBR322か
らのAvaI（修復）/EcoRI−TetR断片を調製し、そして単
離し、そしてpOP8からの単離されたPvuII（部分的）/Ec
oRI−3560bp断片と連結した。
1.42kb EcoRI/AvaI（修復）TetR（断片Ａ）と3.56kb
EcoRI/PvuIIAmtR（断片Ｂ）との連結は、EcoRI末端の分
子間連結に好都合なように２段階反応において0.5μｇ
の断片Ｂ及び4.5μｇの断片Ａを用いた。
コンピテントDG75を５μｌの連結混合物により形質転
換し、そして形質転換体をアンピシリン（50μg/ml）含
有プレート上で選択した。AmpRTetR形質転換体から単離
されたpOP9は高コピー数、コリシン耐性、EcoRI、BamH
I、PvuII、HindIIIの１個ずつの制限部位、HincIIの２
個の制限部位、並びに適当なサイズ及びHaeIII消化パタ
ーンを示した。
pCS3を得るため、50μｇのpEW27DNAをPvuII及びEcoRI
により完全消化した。同様にして、50μｇのpOP9をPvuI
I及びEcoRIにより完全消化し、そして3.3kb断片を単離
した。
0.36μｇ（0.327pmole）pEW27断片及び0.35μｇ（0.1
6pmole）POP9断片を連結し、そしてE.コリMM294を形質
転換するために使用した。AmpRTetR形質転換体を選択し
た。好結果のコロニーをまずβ−ラクタマーゼアッセイ
プレート上で30℃及び41℃にてスクリーニングし、そし
て次に30℃及び41℃における増殖後のプラスミドDNAレ
ベルについてスクリーニングした。pCS3と称する好結果
の候補を配列決定により確認した。
PLNRBS挿入部の調製 PLファージプロモーター、及びＮ−遺伝子のためのリ
ボゾーム結合部位（NRBS）を含有するDNA配列をpFC5か
ら、そして究極的にはShimatake及びRosenberg,Nature
（1981）292:128により記載されているpKC30の誘導体か
ら得た。pKC30は、pBR322からのHindIV/BamHIベクター
断片にクローン化されたλファージからの2.34kb断片を
含有する。PLプロモーター及びNRBSはpKC30中のBglII及
びHpaI部位の間のセグメントを占める。pKC30の誘導体
はEcoRI部位に転換されたBglII部位を有する。
PLプロモーターに直接先行するBglII部位を次のよう
にしてEcoRI部位に転換した。pKC30をBglIIで消化し、K
lenow及びdNPTで修復しそしてT4リガーゼによりEcoRIリ
ンカー（ニューイングランドビオラブスから得られる）
に連結し、そしてE.コリK12株MM294λ+に形質転換し
た。プラスミドをAmpUTetU形質転換体から単離し、そし
て目的とする配列を制限分析及び配列決定により確認し
た。生じたプラスミドpFC3をPuvI及びHpaIにより２重消
化して単離された約540bpの断片を得、Klenow及びdATP
で処理し、そして次にS1ヌクレアーゼにより処理して
３′末端配列−AGGAGAA（ここで、−AGGAGAはNRBSであ
る）を有する平滑末端断片を生じさせた。この断片をEc
oRIで制限処理して、５′−EcoRI（接着）末端及びHinf
I（部分修復、S1平滑）−３′末端を有する347塩基対の
DNA断片を得た。
pFC5を完成するため、ｐβＩ−Z15を用いてNRBSの
３′のHindIII部位を形成した。ｐβＩ−Z15は、ATG＋l
acZに融合したβIINの140bpを含有する配列をpBR322に
融合せしめることにより調製されたものであり、そして
1984年１月13日にATCC No.39578として寄託された。ｐ
βＩ−Z15においては、pBR322のEcoRI部位が保持されて
おり、そして挿入部はβ−IFNのATG開始コドンに直接先
行するHindIII部位を含有する。ｐβＩ−Z15をHindIII
により制限処理し、Klenow及びdNTPにより修復し、そし
て次にEcoRIにより消化した。生ずるEcoRI/HindIII（修
復）ベクター断片を上記のEcoRI/HinfI（修復）断片と
連結し、そして連結混合物を使用してMC1000−39531を
形質転換した。好結果の造成物を含有する形質転換体
を、ラクトース最少プレート上で34℃にて増殖するが30
℃では増殖しない能力により同定した。（形質転換体を
30℃及び34℃にてＸ−gal−Ampプレート、並びに30℃及
び34℃にて最少−ラクトースプレート上にプレートし
た。適切な造成物を含有する形質転換体は両温度におい
てＸ−gal−Ampプレート上で青色であるが、しかし最少
ラクトースプレート上では34℃においてのみ増殖す
る。）好結果の造成物をpFC5と命名した。
pPLOPの完成 次に、pCS3を変形してPL及びNRBS制御配列を与えた。
pCS3をHindIIIで消化し、そして次にEcoRIで消化した。
ベクター断片を、PLNRBSを含有するpFC5からの単離され
たEcoRI/HindIIIと連結し、そしてE.コリMM294に形質転
換した。単離されたプラスミドDNAの正しい構成を制限
分析及び配列決定により確認し、そしてこのプラスミド
をpPLOPと命名した。
pTRP3の調製 HindIII部位の後にtrp制御配列を含有する宿主ベクタ
ーを造成するため、アテニュエーター領域を欠くtrpプ
ロモーター／オペレーター／リボゾーム結合部位配列
を、スタンホード大学C.Yanofskyから入手したpVH153か
ら得た。trp配列は、当業界において知られているこの
ような多くの種類のプラスミド中に得られる。pVH153を
HhaI（このものは、露出された３′接着末端を残してtr
pプロモーターのちょうど５′を切断する）で処理し、K
lenowにより平滑末端化し、そしてTaqIにより部分消化
した。TaqI部位に対応する99bp断片、trpリーダーのATG
開始コドンに先行する６ヌクレオチドを単離し、そして
EcoRI（修復）/ClaI消化されたpBR322に連結してpTRP3
を得た。
1985年４月２日、出願人はアメリカン・タイプ・カル
チュア・コレクション、ロックビル、M.D,米国（ATCC）
にE.コリDG98中ファージpHCSF−１を受託番号No.40177
として寄託した。1985年５月21日、シタスのコレクショ
ンにおいてCMCC2312と称されるpHCSF−1a及び寄託のた
めのpHCSF−１λシャロロ4AはATCCに寄託され、そして
受託番号No.40185を有する。1985年６月14日、E.コリMM
294中CSF−17は、CMCC2347と称され、ATCCに寄託され、
そして受託番号No.53149を有する。これらの寄託は、特
許手続のための微生物の寄託の国際的承認に関するブタ
ペスト条約及びそれに基く規則（ブタペスト条約）の規
定に基いて行われた。これは寄託の日から30年間生存微
生物の維持を保証する。寄託はブタペスト条約の規定の
もとにATCCにより入手可能にされ、そして関連する米国
特許の発行の後永久且つ無制限の入手可能性を保証する
出願人とATCCとの間の合意にゆだねられる。ここに承継
人は、培養物が適切な条件下で培養された場合に死滅
し、又は失われもしくは破損した場合に、通知の後すみ
やかに同じ培養物の生存検体により置き換えることに同
意する。寄託物の入手可能性は、いずれかの政府の権威
のもとでその特許法に従って認められた権利に反してこ
の発明を実施する承諾と解してはならない。
この発明の範囲は、この明細書に記載された例示的な
具体例により限定されると解されるべきではなく、添付
される請求の範囲に従って決定されるべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ７５６８１４ (32)優先日 1985年７月18日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ８２１０６８ (32)優先日 1986年１月21日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０１８５ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ５３１４９ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３９５３１ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３９７６８ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３９９４６ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３９９４７ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３９５７８ (72)発明者 バン アースデル，ジヤネレ エヌ アメリカ合衆国，カリフオルニア 94804，リツチモンド，サーテイフアー スト ストリート 519 (72)発明者 ウオング，アリス エム アメリカ合衆国，カリフオルニア 94596，ウオルナツト クリーク，プロ ビデンス コート 2423 (72)発明者 ラルフ，ピーター アメリカ合衆国，カリフオルニア 94563，オリンダ，クレスト ビユー ドライブ 119 (72)発明者 コイネ，メイチヤ ワイ アメリカ合衆国，カリフオルニア 94566，プレザントン，コルテ セリト ス 5967 (72)発明者 ウオーレン，マリー ケイ アメリカ合衆国，カリフオルニア 94577，サン レアンドロ，ホアクイー ン アベニユ 486

Claims (32)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒト−コロニー刺激因子−１の活性を有
    し、且つ次のアミノ酸配列（Ｉ）： において１位から224位までのアミノ酸から成るアミノ
    酸配列、あるいは該アミノ酸配列に対して１もしくは複
    数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されている
    アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているDN
    A。
  2. 【請求項２】前記ポリペプチドが、請求項１に記載のア
    ミノ酸配列（Ｉ）において１位から224位のアミノ酸か
    ら成るアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のDNA。
  3. 【請求項３】前記ポリペプチドが、請求項１に記載のア
    ミノ酸配列（Ｉ）において、158位〜224位に存在する１
    又は複数のアミノ酸の欠失又は保存的置換により特徴付
    けられるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のDN
    A。
  4. 【請求項４】前記ポリペプチドが、請求項１に記載のア
    ミノ酸配列（Ｉ）において、51位及び52位、及び／又は
    191位、192位及び193位のアミノ酸の１個又は複数個の
    欠失又は保存的置換により特徴付けられるアミノ酸配列
    を有する、請求項１に記載のDNA。
  5. 【請求項５】前記ポリペプチドが、請求項１に記載のア
    ミノ酸配列（Ｉ）において、15位〜20位、及び／又は75
    〜84位の１個又は複数個のアミノ酸の欠失又は保存的置
    換により特徴付けられるアミノ酸配列を有する、請求項
    １に記載のDNA。
  6. 【請求項６】前記ポリペプチドが、請求項１に記載のア
    ミノ酸配列（Ｉ）において、59位のチロシン残基の欠失
    又は置換により特徴付けられるアミノ酸配列を有する、
    請求項１に記載のDNA。
  7. 【請求項７】前記ポリペプチドが、成熟mCSF−１、請求
    項１に記載のアミノ酸配列（Ｉ）において１位から158
    位までのアミノ酸配列から成るCSF−１、及びasp59CSF-
    1から成る群から選択されたものである、請求項１に記
    載のDNA。
  8. 【請求項８】前記ポリペプチドが、pHCSF-1a又はpcCSF
    −17にコードされたアミノ酸配列を有する、請求項１に
    記載のDNA。
  9. 【請求項９】ポリペプチドをコードしているDNA及び単
    細胞生物において機能するレプリコンを含んで成る複製
    可能なクローニングベクターにおいて、該ポリペプチド
    が、ヒト−コロニー刺激因子−１の活性を有し、且つ次
    のアミノ酸配列（Ｉ）： において１位から224位までのアミノ酸から成るアミノ
    酸配列、あるいは該アミノ酸配列に対して１もしくは複
    数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されている
    アミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴と
    するクローニングベクター。
  10. 【請求項１０】前記ポリペプチドが、請求項９に記載の
    アミノ酸配列（Ｉ）において１位から224位のアミノ酸
    から成るアミノ酸配列を有する、請求項９に記載のクロ
    ーニングベクター。
  11. 【請求項１１】前記ポリペプチドが、請求項９に記載の
    アミノ酸配列（Ｉ）において、158位〜224位に存在する
    １又は複数のアミノ酸の欠失又は保存的置換により特徴
    付けられるアミノ酸配列を有する、請求項９に記載のク
    ローニングベクター。
  12. 【請求項１２】前記ポリペプチドが、請求項９に記載の
    アミノ酸配列（Ｉ）において、51位及び52位、及び／又
    は191位、192位及び193位のアミノ酸の１個又は複数個
    の欠失又は保存的置換により特徴付けられるアミノ酸配
    列を有する、請求項９に記載のクローニングベクター。
  13. 【請求項１３】前記ポリペプチドが、請求項９に記載の
    アミノ酸配列（Ｉ）において、15位〜20位、及び／又は
    75〜84位の１個又は複数個のアミノ酸の欠失又は保存的
    置換により特徴付けられるアミノ酸配列を有する、請求
    項９に記載のクローニングベクター。
  14. 【請求項１４】前記ポリペプチドが、請求項９に記載の
    アミノ酸配列（Ｉ）において、59位のチロシン残基の欠
    失又は置換により特徴付けられるアミノ酸配列を有す
    る、請求項９に記載のクローニングベクター。
  15. 【請求項１５】前記ポリペプチドが、成熟mCSF−１、請
    求項９に記載のアミノ酸配列（Ｉ）において１位から15
    8位までのアミノ酸配列から成るCSF−１、及びasp59CSF
    -1から成る群から選択されたものである、請求項９に記
    載のクローニングベクター。
  16. 【請求項１６】前記ポリペプチドが、pHCSF-1a又はpcCS
    F−17にコードされたアミノ酸配列を有する、請求項９
    に記載のクローニングベクター。
  17. 【請求項１７】ポリペプチドをコードしているDNA及び
    該DNAと作用可能に連結された適切な制御配列を含んで
    成る発現ベクターにおいて、該ポリペプチドが、ヒト−
    コロニー刺激因子−１の活性を有し、且つ次のアミノ酸
    配列（Ｉ）： において１位から224位までのアミノ酸から成るアミノ
    酸配列、あるいは該アミノ酸配列に対して１もしくは複
    数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されている
    アミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴と
    する発現ベクター。
  18. 【請求項１８】前記ポリペプチドが、請求項17に記載の
    アミノ酸配列（Ｉ）において１位から224位のアミノ酸
    から成るアミノ酸配列を有する、請求項17に記載の発現
    ベクター。
  19. 【請求項１９】前記ポリペプチドが、請求項17に記載の
    アミノ酸配列（Ｉ）において、158位〜224位に存在する
    １又は複数のアミノ酸の欠失又は保存的置換により特徴
    付けられるアミノ酸配列を有する、請求項17に記載の発
    現ベクター。
  20. 【請求項２０】前記ポリペプチドが、請求項17に記載の
    アミノ酸配列（Ｉ）において、51位及び52位、及び／又
    は191位、192位及び193位のアミノ酸の１個又は複数個
    の欠失又は保存的置換により特徴付けられるアミノ酸配
    列を有する、請求項17に記載の発現ベクター。
  21. 【請求項２１】前記ポリペプチドが、請求項17に記載の
    アミノ酸配列（Ｉ）において、15位〜20位、及び／又は
    75〜84位の１個又は複数個のアミノ酸の欠失又は保存的
    置換により特徴付けられるアミノ酸配列を有する、請求
    項17に記載の発現ベクター。
  22. 【請求項２２】前記ポリペプチドが、請求項17に記載の
    アミノ酸配列（Ｉ）において、59位のチロシン残基の欠
    失又は置換により特徴付けられるアミノ酸配列を有す
    る、請求項17に記載の発現ベクター。
  23. 【請求項２３】前記ポリペプチドが、成熟mCSF−１、請
    求項17に記載のアミノ酸配列（Ｉ）において１位から15
    8位までのアミノ酸配列から成るCSF−１、及びasp59CSF
    -1から成る群から選択されたものである、請求項17に記
    載の発現ベクター。
  24. 【請求項２４】前記ポリペプチドが、pHCSF-1a又はpcCS
    F−17にコードされたアミノ酸配列を有する、請求項17
    に記載の発現ベクター。
  25. 【請求項２５】ポリペプチドをコードするDNA、及び該D
    NAと作用可能に連結された適切な制御配列を含んで成る
    発現ベクターにより形質転換された宿主細胞において、
    該ポリペプチドが、ヒト−コロニー刺激因子−１の活性
    を有し、且つ次のアミノ酸配列（Ｉ）： において１位から224位までのアミノ酸から成るアミノ
    酸配列、あるいは該アミノ酸配列に対して１もしくは複
    数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されている
    アミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴と
    する宿主細胞。
  26. 【請求項２６】前記ポリペプチドが、請求項25に記載の
    アミノ酸配列（Ｉ）において、１位から224位のアミノ
    酸から成るアミノ酸配列を有する、請求項25に記載の宿
    主細胞。
  27. 【請求項２７】前記ポリペプチドが、請求項25に記載の
    アミノ酸配列（Ｉ）において、158位〜224位に存在する
    １又は複数のアミノ酸の欠失又は保存的置換より特徴付
    けられるアミノ酸配列を有する、請求項25に記載の宿主
    細胞。
  28. 【請求項２８】前記ポリペプチドが、請求項25に記載の
    アミノ酸配列（Ｉ）において、51位及び52位、及び／又
    は191位、192位及び193位のアミノ酸の１個又は複数個
    の欠失又は保存的置換により特徴付けられるアミノ酸配
    列を有する、請求項25に記載の宿主細胞。
  29. 【請求項２９】前記ポリペプチドが、請求項25に記載の
    アミノ酸配列（Ｉ）において、15位〜20位、及び／又は
    75〜84位の１個又は複数個のアミノ酸の欠失又は保存的
    置換により特徴付けられるアミノ酸配列を有する、請求
    項25に記載の宿主細胞。
  30. 【請求項３０】前記ポリペプチドが、請求項25に記載の
    アミノ酸配列（Ｉ）において、59位のチロシン残基の欠
    失又は置換により特徴付けられるアミノ酸配列を有す
    る、請求項25に記載の宿主細胞。
  31. 【請求項３１】前記ポリペプチドが、成熟mCSF−１、請
    求項25に記載のアミノ酸配列（Ｉ）において１位から15
    8位までのアミノ酸配列から成るCSF−１、及びasp59CSF
    -1から成る群から選択されたものである、請求項25に記
    載の宿主細胞。
  32. 【請求項３２】前記ポリペプチドが、pHCSF-1a又はpcCS
    F−17にコードされたアミノ酸配列を有する、請求項25
    に記載の宿主細胞。
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