FI100972B - Pesäkkeitä stimuloivaa tekijä-1:tä (CSF-1) koodaava DNA-sekvenssi ja m enetelmä CSF-1-proteiinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

100972

Pesäkkeitä stimuloivaa tekijä-1:tä (CSF-1) koodaava DNA-sekvenssi ja menetelmä CSP-l-proteiinin valmistamiseksi Tämä keksintö kohdistuu yhdistelmä-DNA-tekniikan käyttöön tavallisesti alhaisina pitoisuuksina muodostuvien lymfokiinien tuottamiseksi. Erityisemmin tämä keksintö kohdistuu ihmisen pesäkkeitä stimuloivaa (kiihottavaa) tekijä-l:tä (CSF-1) koo-daavan DNA-ketjun kloonaamiseen ja ilmentämiseen.

Tiettyjen, lukuisissa kudoksissa erittäin pieninä pitoisuuksina muodostuvien tekijöiden kyky kiihottaa luuytimen edeltäjäsolu-jen kasvua ja kehittymistä granulosyyteiksi ja/tai makrofaa-geiksi on tunnettu jo lähes 15 vuotta. Näiden tekijöiden läsnäolo lukuisista lajeista saaduissa seerumeissa, virtsanäytteissä ja kudosuutteissa voidaan osoittaa käyttämällä in vitro -koetta, jolla mitataan puolikiinteälle viljelyalustalle maljatuista luuydinsoluista saatavien pesäkkeiden muodostumisen kiihottumista. Tunnettuja in vivo -kokeita ei ole olemassa. Koska nämä tekijät indusoivat tällaisten pesäkkeiden muodostumista, niin näistä tekijöistä käytetään yhteistä nimitystä "pesäkkeitä stimuloivat tekijät" (CSF).

Jokin aika sitten saatiin osoitetuksi, että ihmisen CSF-prote-iineja on vähintään neljä alaluokkaa, jotka voidaan määritellä tuloksena olevista pesäkkeistä löydettyjen solutyyppien mukaan. Yksi alaluokka, CSF-1, johtaa pesäkkeisiin, jotka sisältävät etupäässä makrofaageja. Muut alaluokat tuottavat pesäkkeitä, jotka sisältävät sekä neutrofiilisiä granulosyyttejä ja makrofaageja, pesäkkeitä, jotka sisältävät yksinomaan neutrofiilisiä granulosyyttejä; ja pesäkkeitä, jotka sisältävät neutrofiilisiä ja eosinofiilisiä granulosyyttejä sekä makrofaageja.

Olemassa on hiiren tekijöitä, jotka ovat analogisia ensimmäiselle kolmelle edellä mainitulle ihmisen CSF-proteiinille. Tämän lisäksi hiiren tekijä, josta käytetään nimitystä IL-3, indusoi hiiren luuydinsoluista saatavia pesäkkeitä, jotka sisältävät kaikkia näitä solutyyppejä sekä megakariosyyttejä, erytrosyyt 2 100972 tejä sekä syöttösoluja erilaisina yhdistelminä. Yleiskatsaus näistä CSF-proteiineista on löydettävissä julkaisuista Dexter, T. M., Nature (1984) 309:746, ja Vadas, M.A., et ai, J. Immunol. (1983) 130:793.

Oheinen keksintö liittyy ensimmäiseen näistä alaluokista CSF-1 kuuluvien proteiinien tuottamiseen yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla. Tämän alaluokan tunnusomaisia piirteitä on selvitetty ja havainnollistettu edelleen erityisillä radioimmunokokeilla ja radioreseptoreihin perustuvilla kokeilla - esimerkiksi, puhdasta CSF-l-proteiinia vastaan muodostuneet vasta-aineet kykenevät tukahduttamaan spesifisesti CSF-l:n aktiivisuutta muiden alaluokkien biologiseen aktiivisuuteen vaikuttamatta, ja mak-rofaagien solulinja J774 sisältää reseptoreita, jotka sitovat spesifisesti CSF-l-proteiinia. Nämä kokeet kuvataan julkaisussa Das, S.K., et ai, Blood (1981) 58:630.

Eri CSF-proteiinien puhdistusmenetelmiä on julkaistu.

Julkaisussa Stanley, E.R., et ai, J. Biol. Chem. (1977) 252: 4305 esitetään CSF-oroteiinin puhdistaminen hiiren L929-soluis- g ta siten, että ominaisaktiivisuudeksi saatiin noin 1 x 10 yksik-köä/mg, joka proteiini kiihotti samoin pääasiallisesti makro-faagien tuotantoa. Julkaisussa Waheed, A., et ai, Blood(1982) 60^:238 esitetään hiiren L-soluista peräisin olevan CSF-l-pro-teiinin puhdistaminen ilmeisesti homogeeniseksi käyttäen kaniinin vasta-ainepylvästä, ja siinä esitetään tämän hiiriketjun ensimmäiset 25 aminohappoa (Ben-Avram, C.M., et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) (1985) 882:4486) .

Julkaisussa Stanley, E.R., et ai., J. Biol. Chem. (1977) 252: 4305-4312 esitetään CSF-l-proteiinin puhdistamistoimenpiteet ihmisvirtsasta lähtien ja julkaisussa Das, S.K., et ai.,

Blood (1981) 58^:630; J. Biol. Chem. (1982) 257:13679 saatiin ihmisen virtsasta CSF-l-proteiinia, jonka ominaisaktiivisuus 7 oli 5 x 10 yksikköä/mg, ja joka tuotti ainoastaan makrofaagi-pesäkkeitä, ja siinä selvitetään viljellyistä hiiren L-soluista 3 100972 ja ihmisen virtsasta eristettyjen CSF-1-proteiinien glykosylaa-tion suhdetta niiden aktiivisuuksiin. Julkaisussa Wang, F.F., et ai, J. Cell. Biochem. (1983) 21:263 ihmisen virtsasta eristettiin CSF-1-proteiinia siten, että ominaisaktiivisuudeksi saatiin 10* U/mg. Waheed, A., et ai, esittävät CSF-l-proteiinin puhdistamisen ihmisen virtsasta siten, että ominaisaktiivisuudeksi saadaan 0,7 - 2,3 x 107 U/mg, käyttäen kaniinin vasta-ainepylvästä (Exp. Hemat. (1984) 12:434).

Julkaisussa Wu, M., et ai, J. Biol. Chem. (1979) 254:6226 esitetään CSF-proteiinin puhdistaminen ihmisen viljellyistä haima-karsinooman (MIAPaCa) soluista, joka proteiini johti hiiren granulosyyttisten ja makrofaagisten pesäkkeiden kasvuun. Tuloksena olevan proteiinin ominaisaktiivisuus oli suurin piirtein 7 x 107 yksikköä/mg.

Samoin on esitetty, että eri CSF-proteiinien osittain puhdistettuja valmisteita on myös saatu ihmisen ja hiiren keuhkoso-luilla kunnostetuista alustoista (Fojo, S.S., et ai, Biochemistry (1978) 17:3109; Burgess, A.W., et ai, J. Biol. Chem.

(1977) 252:1998) ihmisen T-lymfoblastisolusta (Lusis, A.J., et ai, Blood (1981) S7.:13; US-patenttijulkaisu 4 438 032); ihmisen istukan kunnostetusta alustasta siten, että proteiini on ilmeisen homogeenista ja että sen ominaisaktiivisuus on 7 x 107 U/mg (Wu, M., et ai, Biochemistry (1980) 19:3846).

Merkittävänä vaikeutena pyrittäessä soveltamaan CSF-proteiineja yleensä, ja CSF-l-proteiineja erityisesti, jollain hyödyllisellä tavalla on se, ettei niitä ole saatavana puhtaassa ja ominaisuuksiltaan selvitetyssä muodossa niin suuria määriä, että niiden käyttö lääkinnässä olisi käytännöllistä tai edes mahdollista. Näistä vaikeuksista päästään eroon tämän keksinnön avulla, sillä keksinnössä saadaan aikaan ihmisen ja hiiren puhdasta CSF-l-proteiinia käyttökelpoisia määriä yhdistelmä-DNA-tekniikkaa hyväksi käyttäen.

Eri alaluokkaan kuuluva CSF-proteiini, hiiren ja ihmisen GMCSF, on puhdistettu ja vastaavat cDNA:t kloonattu. Tämän proteiinin todettiin eroavan muista CSF-proteiineista, esimerkiksi CSF-1- 4 100972 proteiinista, julkaisussa Gough, et ai. Nature (1984) 309:763767. Hiiren IL-3-proteiinin kloonaaminen esitetään julkaisussa Fung M. C., et ai, Nature (1984) 307:233. Katso myös: Yokota, T., et ai. PNAS (1984) 81:1070-1074; Wong, G.G., et ai, science (1985) 228:810-815: Lee, F., et ai, PNAS (1985) 82:4360-4364; ja Cantrell, M.A., et ai, PNAS (1985) 82:6250-6254.

Eräässä piirteessään tämä keksintö kohdistuu yhdistelmä-CSF-1-proteiiniin, mukaan lukien ne biologisesti aktiiviset proteiinit, jotka sisältävät muunnoksia luonnollisen proteiinin primäärissä aminohappoketjussa. CSF-l-proteiinia yhdistelmä-DNA-teknisessä muodossaan saadaan suuria määriä, sitä voidaan muuntaa edullisesti säätämällä luennan jälkeistä jatkokäsittelyä, josta isäntä huolehtii, ja sitä voidaan muuntaa tarkoituksellisesti geneettisellä tasolla tai proteiinitasolla sen toivottujen ominaisuuksien parantamiseksi. Täten aktiivisia ovat esimerkiksi muteiinit, joissa on olennaisten osien häviämiä poly-peptidin karboksipäätteen kolmanneksessa. Näin ollen CSF-l-pro-teiinin saatavuus yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla johtaa sekä joustavuuteen että tiettyihin kvantitatiivisiin etuihin, jotka mahdollistavat proteiinin lääkinnälliset sovellutukset, ja joita ei saavuteta luonnollisella proteiinilla.

Muissa piirteissään tämä keksintö kohdistuu yhdistelmä-CSF-l-proteiinia koodaavaan, eristettyyn DNA-ketjuun, tämän ketjun yhdistelmä-DNA-teknisiin ilmentämisjärjestelmiin sekä niitä sisältäviin vektoreihin, näillä vektoreilla transformoituihin yhdistelmä-DNA-isäntiin, sekä yhdistelmä-CSF-proteiinia tuottaviin viljelmiin. Tämä keksintö kohdistuu edelleen menetelmiin yhdistelmäproteiinin tuottamiseksi sekä materiaaleihin, jotka ovat merkittäviä proteiinin tuottamisessa.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .

100972 5

Piirustuksissa kuva 1 esittää ihmisen virtsasta ja hiiren L-929-soluista saadun CSF-l-proteiinin aminohappoketjua, joka on määritetty puhdistetuista luonnollisista proteiineista.

Kuva 2 esittää hiiren CSF-l-proteiinille sopivien tiettyjen oligomeeristen koettimien ketjua.

Kuva 3 esittää ihmisen genomisen CSF-l-proteiinin saamiseen käytettyjen oligomeeristen koettimien ketjua.

Kuva 4 esittää osaa, jonka järjestys on selvitetty, ihmisen CSF-l-ketjuja koodaavastä, 3,9 kiloemäsparin Hindlll-kappalees-ta, sekä eksonialueita vastaavia, pääteltyjä aminohappoket-juja.

Kuva 5 esittää CSF-l-proteiinia koodaavan cDNA-kloonin DNA-ketjua ja pääteltyjä aminohappoketjuja.

Kuvassa 6 verrataan CSF-l-proteiinin ja muiden pesäkkeitä stimuloivien tekijöiden aktiivisuuksia edistää makrofaagien kykyä tappaa syöpäsoluja.

Kuva 7 esittää tuloksia, jotka saatiin jaettaessa MIAPaCa mRNA fraktioihin sakkaroosigradienttia käyttäen.

Suoritusmuodot keksinnön toteuttamiseksi A. Määritelmät "Pesäkkeitä stimuloiva tekijä-1 (CSF-1)" viittaa proteiiniin, jolla on alalla CSF-l-proteiinilta odotettu aktiivisuusspektri -eli käytettäessä tätä proteiinia tavanomaisessa pesäkkeitä stimuloivassa in vitro kokeessa julkaisusta Metcalf. D., J.

Cell Physiol (1970) 2£:89 se johtaa pääasiallisesti makrofaagi-pesäkkeiden muodostumiseen. Luonnollinen CSF-1 on glykosyloitu-nut dimeeri; dimerisoituminen saattaa olla välttämätöntä aktiivisuudelle. Sekä dimeerisen että monomeerisen muodon katsotaan kuuluvan tämän keksinnön ja CSF-l-proteiinin määritelmän piiriin. Monomeerinen muoto voidaan muuntaa dimeeriksi saamalla aikaan in vitro solun sisäiset olosuhteet, ja monomeeri on sinänsä käyttökelpoinen antigeeni, jolla voidaan tuottaa anti-CSF-1-vasta-aineita.

6 100972 CSF-proteiineihin tuntuu liittyvän lajikohtaista spesifisyyttä: ihmisen CSF-1 vaikuttaa sekä ihmisen että hiiren luuydinsolui-hin; hiiren CSF-l-proteiinilla ei ole ihmissoluihin kohdistuvaa aktiivisuutta. Näin ollen "ihmisen" CSF-l-proteiinin tulisi olla positiivinen hiiren spesifisessä radioreseptorikokeessa, joka esitetään julkaisussa Das. S.K., et ai. Blood (1981) 58:630, vaikka korrelaatio ei välttämättä olekaan täydellinen. Proteiinin biologinen aktiivisuus inhiboituu myös yleensä ihmisen virtsasta saatua CSF-l-proteiinia vastaan vaikuttavan neutraloivan antiseerumin vaikutuksesta (Das, S.K., et.ai., edellä). Tämä vaatimus ei ehkä kuitenkaan täyty tietyissä erityisissä olosuhteissa (kuten esimerkiksi siinä tapauksessa, että tietty vasta-ainevalmiste tunnistaa CSF-l-epitoopin, joka ei ole olennainen biologiselle toiminnalle, ja joka epitooppi ei ole läsnä erityisessä testattavassa CSF-l-muteiinissa).

CSF-l-proteiinin tiettyjä muita ominaisuuksia on havaittu edelleen jokin aika sitten, mukaan lukien tämä proteiinin kyky kiihottaa joukon E-prostaglandiineja, interleukiinin-1 ja interferonin erittymistä täysin kehittyneistä makrofaageista (Moore, R., et ai. Science (1984) 223:178). Näiden viimeksi mainittujen aktiivisuuksien mekanismia ei toistaiseksi tunneta, ja ohessa esitettyjä määritelmiä ajatellen kriteerinä tämän määritelmän täyttämiselle käytetään kykyä kiihottaa monosyytti/makrofaagi-pesäkkeiden muodostumista, kun lähtömateriaaleina käytetään asianmukaisista lajeista saatuja luuydinsoluja, useimmissa olosuhteissa (katso edellä) tämän aktiivisuuden inhiboitumista ihmisen virtsasta saatua, puhdistettua CSF-l-proteiinia vastaan vaikuttavan, neutraloivan antiseerumin vaikutuksesta, sekä positiivista reaktiota radioreseptorikokeessa, mikäli asianmukaista kyseiselle lajille. (Tiedetään, että CSF-l-proteiinin uudiskasvua edistävä vaikutus rajoittuu sukuperältään yksitumaisiin fagosyyttisiin soluihin (Stanley, E.R., The Lymphokines (1981), Stewart, W.E. II, et ai. toim. Humana Press, Clifton.

NJ, sivut 102-132), ja että CSF-l-reseptorit rajoittuvat näihin solulinjoihin (Byrne, P.V., et ai. Cell Biol. (1981) 91:848) ) .

7 100972

Kaikkien muidenkin proteiinien tavoin CSF-proteiinin täsmällinen kemiallinen rakenne riippuu monista tekijöistä. Koska molekyylissä on läsnä ionisoituvia amino- ja karboksyyliryhmiä, niin tietty proteiini voidaan saada happamana tai emäksisenä suolana tai neutraalissa muodossa. Määritelmän piiriin kuuluvat kaikki ne valmisteet, joiden aktiivisuus palautuu, kun ne laitetaan sopiviin ympäristöllisiin olosuhteisiin. Edelleen, primääriä ami-nohappoketjua voidaan kasvattaa tekemällä siitä johdannaisia so-keriryhmiä käyttäen (glykosylaatio) tai käyttäen muita täydentäviä molekyylejä, kuten lipidejä, fosfaattiryhmiä, asetyyliryhmiä ja muita vastaavia, tavallisimmin sakkaridien kanssa konjugoi-malla. Primääri aminohapporakenne voi samoin kasautua ja muodostaa komplekseja, tavallisimmin dimeerejä. Ihmisen virtsasta saatu luonnollinen CSF-1 onkin eristetty erittäin glykosyloituneena dimeerinä. Tällaisen ketjun kasvattamisen eräät piirteet toteutuvat tuottavassa isännässä luennan jälkeisillä jatkokäsittely-järjestelmillä; muut tällaiset muunnokset voidaan saada aikaan in vitro. Joka tapauksessa nämä muunnokset sisältyvät määritelmään, mikäli ne eivät tuhoa proteiinin edellä määriteltyä aktiivisuutta. Luonnollisestikin on odotettavaa, että nämä muunnokset saattavat vaikuttaa kvantitatiivisesti tai kvalitatiivisesti mainittuun aktiivisuuteen, joko parantaen tai heikentäen proteiinin aktiivisuutta eri kokeissa.

Tämän lisäksi ketjun käsittämiä erillisiä aminohappojäännöksiä voidaan muuntaa hapettamalla tai pelkistämällä tai muunlaisia johdannaisia valmistamalla, ja proteiini voidaan pilkkoa kappaleiden, joiden aktiivisuus säilyy, saamiseksi. Sellaiset muunnokset, jotka eivät tuhoa proteiinin aktiivisuutta, eivät poista proteiiniketjua määritelmän piiristä.

Itse primääriä rakennetta voidaan muuntaa luennan aikana ketjuun liittyneitä aminohappoja hävittämällä, muuntamalla tai aminohappoja lisäämällä proteiinin aktiivisuutta täten tuhoamatta. Nämä korvaamiset tai muut muunnokset johtavat proteiineihin, joiden aminohappoketjut sisältyvät niiden proteiinien, 8 100972 joiden "aminohappoketju vastaa olennaisesti CSF-l-proteiinin aminohappoketjua", määritelmän piiriin. Todellakin, ihmisestä ja hiirestä saaduilla CSF-l-proteiineilla ei ole identtiset, vaan samankaltaiset primäärit aminohappoketjut, jotka ovat erittäin homologiset.

Yksinkertaisuuden vuoksi ohessa kuvatun cDNA-kloonin perusteella päätellystä, kuvassa 5 esitetystä dimeerisestä proteiinista saatavan monomeerisen osan täysin kehittyneeseen proteiiniin liittyvästä aminohappoketjusta käytetään nimitystä mCSF-1 (täysin kehittynyt CSF-1). Kuvassa 5 nähdään 32 jäännöstä käsittävän otaksutun signaaliketjun läsnäolo, joka ketju oletettavasti pilkkoutuu nisäkässoluista erittymisen aikana; mCSF-l-proteiinia esittävät mainitun kuvan aminohapot 1-224. Ihmisen CSF-l-proteiinin määritelmään kuuluvat erityisesti muteiinit, joiden mono-meerit ja dimeerit ovat mCSF-l-ketjuja ja mCSF-l-ketjujen kaltaisia muotoja, jotka mainitaan mCSF-l-ketjusta poikkeaviin kohtiin viittaamalla. Myös jostakin muusta lajista saatu CSF-1 voi täyttää "ihmisen" CSF-l-proteiinille esitetyn määritelmän siinä suhteessa, että sillä on edellä esitettyä, vaatimuksena olevaa, ihmisestä peräisin olevaan substraattiin kohdistuvaa aktiivisuutta .

Samoin yksinkertaisuuden vuoksi aminohappoketjua mCSF-1 käytetään vertailuna, ja niiden muiden ketjujen, jotka vastaavat tätä ketjua olennaisesti CSF-l-aktiivisuuden suhteen, tapauksessa viitataan kuvassa 5 esitettyyn ketjuun. Tietyn aminohapon korvautuminen esitetään mainitsemalla se aminohappojäännös, joka korvaa sen. Täten esimerkiksi lyhenteellä sergQCSF-l tarkoitetaan proteiinia, jolla on kuvassa 5 esitetty ketju, paitsi että asemassa 90 oleva aminohappo on seriini eikä kys-teiini. Häviämät esitetään merkinnällä V, jota seuraa N-päätteen ketjusta hävinneiden aminohappojen lukumäärä, tai jäljelle jääneiden aminohappojen lukumäärä, kun jäännökset ovat hävinneet C-päätteen ketjusta, jolloin lukumäärää seuraa miinus-merkki. Täten, merkinnällä V^CSF-1 tarkoitetaan kuvan 5 mukaista CSF-l-ketjua, josta N-päätteen ensimmäiset neljä 9 100972 aminohappoa ovat hävinneet; merkintä V^.jq_CSF-1 tarkoittaa CSF-l-ketjua, josta viimeiset 94, aminohappoa 130 seuraavat aminohapot ovat hävinneet. Jäljempänä havainnollistetaan esimerkiksi aspi-gCSF-l-ketjua (joka sisältää asemassa 59 geenin (kuva 4) koodaaman asparatiinijäännöksen, eikä cDNArn koodaamaa tyrosiini- jäännöstä, ja V CSF-l-ketjua, joka käsittää pelkästään amino- 15 8 — hapot 1-158 ketjusta mCSF-1.

Käsitteellä "toiminnallisesti kytketty" tarkoitetaan sijoittumista vierekkäin siten, että komponenttien normaalit toiminnot pääsevät tapahtumaan. Täten sanonnalla säätäviin ketjuihin "toiminnallisesti kytketty" koodaava ketju tarkoitetaan muodostelmaa, jossa koodaava ketju voi ilmentyä näiden ketjujen säätelemänä.

Käsitteellä "säätävät ketjut" tarkoitetaan DNA-ketjuja, jotka ovat välttämättömät toiminnallisesti kytketyn koodaavan ketjun ilmentymiselle tietyssä isäntäorganismissa. Esimerkiksi prokarioo-teille soveltuviin säätäviin ketjuihin kuuluvat promoottori, valinnaisesti operaattoriketju, ribosomien sitoutumiskohta, ja mahdollisesti muita, toistaiseksi kuitenkin huonosti tunnettuja ketjuja. Eukarioottisten solujen tiedetään käyttävän hyväkseen promoottoreita, polyadenylaation signaaleja sekä edistimiä.

Käsitteellä "ilmentämisjärjestelmä" tarkoitetaan DNA-ketjuja, jotka sisältävät toivotun koodaavan ketjun sekä säätävät ketjut toisiinsa toiminnallisesti kytkeytyneinä siten, että näillä ketjuilla transformoidut isännät kykenevät tuottamaan ketjuihin koodattuja proteiineja. Transformaation toteuttamiseksi ilmentämisjärjestelmä voidaan sisällyttää vektoriin; kuitenkin asiaan liittyvä DNA voi myös tämän jälkeen yhtenäistyä isännän kromosomiin.

Ohessa käytettyjä käsitteitä "solu", "solulinja" ja "soluviljelmä" voidaan käyttää toistensa asemasta, ja kaikkiin näihin käsitteisiin sisältyvät myös jälkeläiset. Täten "transformant-teja" tai "transformoituja soluja" ovat varsinaisesti käsitellyt 10 100972 solut sekä niistä saadut viljelmät siirtojen lukumäärästä riippumatta. Samoin on selvää, ettei kaikkien jälkeläisten DNA-sisältö ole täsmälleen samanlainen tahallisista tai tahattomista mutaatioista johtuen. Mukaan otetaan mutanttijälkeläiset, joilla on samaa toiminnallisuutta, jota seulottiin alunperin transformoidusta solusta. Asiayhteyden perusteella on selvää, milloin tarkoitetaan täsmällisiä määritelmiä.

B. Yleiskuvaus Tämän keksinnön mukaiset CSF-l-proteiinit kykenevät sekä kiihottamaan monosyyttiesiaste/makrofaagi-solujen muodostumista luuytimen edeltäjäsoluista, mikä parantaa immuunijärjestelmän tehokkuutta, sekä kiihottamaan näiden erikoistuneiden solujen tiettyjä toimintoja, kuten lymfokinien erittymistä täysin kehittyneissä makrofaageissa.

Eräässä sovellutuksessa näitä proteiineja voidaan käyttää komponenttina kemoterapiassa. Tiedetään hyvin, että kemoterapeuttinen käsittely johtaa immunojärjestelmän tukahtumiseen. Usein, vaikka kemoterapeuttisella käsittelyllä saadaankin menestyksellisesti tuhoutumaan ne syöpäsolut, joita vastaan se on kohdistettu, tällaiset käsittelyt johtavat käsiteltävän kohteen kuolemaan kemotoksisten aineiden näistä, immuunijärjestelmässä esiintyviin soluihin kohdistuvista sivuvaikutuksista johtuen. Koska CSF-1 kykenee välittämään ja edistämään luuytimestä peräisin olevien esiasteiden kasvua ja erikoistumista makrofaageiksi ja monosyytefksi ja stimuloiman näiden valmiiden solujen toimintaa, niin CSF-1-proteiinin antaminen tällaisille potilaille johtaa limuunijärjestelmän elpymiseen tämän sivuvaikutuksen estäen, jolloin samalla estetään potilaan taipumus menehtyä toisarvoiseen infektioon. Muita potilaita, joita voidaan mahdollisesti auttaa tällaisella käsittelyllä, ovat esimerkiksi leukemiaa sairastavat potilaat, joita hoidetaan luuydinsiirroilla; naiden potilaiden immuunijärjestelmä on usein tukehdutettu hylkimisreaktioiden estämiseksi. Myös näiden potilaiden kohdalla tukahdutettu immuunijärjestelmä voitaisiin elvyttää CSF-1-proteiinia antamalla.

u 100972

Yleisesti, mikä tahansa hoidettava kohde, joka kärsii tukahtuneesta immuunijärjestelmästä, johtuipa se kemoterapiasta, luu-ydinsiirrosta tai muista immuunijärjestelmän tukahtumiseen johtavista satunnaisista syistä, esimerkiksi jostakin sairaudesta (esimerkiksi saadun immunologisen puutostilan oireyhtymä; AIDS), hyötyisi siitä, että CSF-l-proteiinia olisi saatavilla farmakologisiin sovellutuksiin. Tämän lisäksi hoitoa tarvitseville kohteille voitaisiin antaa suurempia määriä edeltä käsin erikoistuneita makrofaageja täydentämään kohteen omaa, luonnollista järjestelmää, jotka makrofaagit on tuotettu luuytimen tai muiden sopivien preparaattien CSF-l-proteiinilla käsitellyissä in vitro viljelmissä. Näitä preparaatteja ovat esimerkiksi potilaan oman veren monosyytit, joita voidaan viljellä tällä tavalla ja jotka voidaan palauttaa paikallista tai koko järjestelmän kattavaa (systeemistä) hoitoa varten.

CSF-l-proteiinin kyky kiihottaa lymfokiinien muodostumista makro-faageissa, sekä parantaa niiden kykyä tappaa kohdesoluja saa aikaan sen, että CSF-l-proteiinia voidaan käyttää suoraan uudis-; muodostumien (neoplasmi) ja infektioiden hoitoon.

CSF-1 kiihottaa hiirestä peräisin olevan makrofaagin kykyä tuottaa interferoneita (Fleit, H.V., et ai, J. Cell. Physiol. (1981) 108:347), ja MIAPaCa-soluista saatu, ihmisen osittain puhdistettu CSF-1 kiihottaa interferonin ja TNF:n poly-IC-indusoitua muodostumista ihmisen monosyyteistä, kuten jäljempänä esitetään. Tämän lisäksi CSF-1 kiihottaa ihmisveren monosyyttien kykyä tuottaa myeloidista CSF-proteiinia.

Jäljempänä havainnollistetaan samoin hiiren CSF-l-proteiinin (saatu L-soluilla kunnostetusta alustasta) kykyä kiihottaa nor-' maaleja C3H/HeN-hiiren vatsakalvon makrofaageja tappamaan hiiren sarkooman TU5-kohteita. Tämä aktiivisuus on tehokkainta, kun CSF-l-proteiinia käytetään esikäsittelyyn sekä tehovaiheen aikana. CSF-l-proteiinin tällainen kyky on huomattavasti suurempi kuin vastaava, muilla pesäkkeitä stimuloivilla tekijöillä todettu vastaava kyky, kuten jäljempänä olevassa kuvassa 6 esitetään. Tämän lisäksi CSF-1 parantaa hiirisolujen kykyä hyökätä virusten kimppuun.

12 100972

Epäjohdonmukaisesti esitetään, että hiiren CSF-1 kiihottaa hiiren makrofaageja siten, että ne ovat sytostaattisia P815-syöpäsoluille (Wing, E.J., et ai, J. Clin. Invest. (1982) 69:270) tai etteivät ne tapa muita leukemiakohteita (Ralph, P. et ai,

Cell. Immunol. (1983) 7£:10). Julkaisussa Nogawa, R.T., et ai, Cell. Immunol. (1980) 52.:116 esitetään, että CSF-1 voi kiihottaa makrofaageja "syömään" ja tappamaan hiivoja.

Täten sen lisäksi, että CSF-1-proteiinilla voidaan välttää sinänsä tukahtunut immuunijärjestelmä, CSF-1-proteiinia voidaan käyttää tunkeutuvien organismien tai pahanlaatuisten solujen tuhoamiseen suoraan makrofaagien erittämistoimintaa ja aktiivisuutta kiihottamalla.

Keksinnön mukaiset CSF-l-proteiinit voidaan muodostaa lääkeaineiksi tavanomaisilla tavoilla, joita alalla käytetään proteii-niaineita annettaessa. Mieluiten käytetään injektioon perustuvaa antotapaa; valmistemuotona ovat tällöin liuokset tai suspensiot, emulsiot tai kiinteät seokset, jotka saadaan injektoitavaan muotoon vettä lisäämällä. Sopivia täyteaineita ovat esimerkiksi Ringerin liuos, Hankin liuos, vesi, suolaliuos, glyseroli, dekstroosiliuokset ja muut vastaavat. Tämän lisäksi keksinnön mukaista CSF-1-proteiinia voidaan inkuboida edeltä käsin solupreparaattien kanssa asianmukaisten reaktioiden sti-muloimiseksi, minkä jälkeen joko koko tällainen preparaatti tai siitä saatu supernatantti annetaan käsittelykohteelle. Kuten jäljempänä esitetään, CSF-l-proteiinilla kiihottamisen seurauksena erityyppisten verisolujen tuottamat materiaalit ovat tehokkaita toivottuja kohteita vastaan, ja itse näiden verisolujen kyky hyökätä sisään tunkeutuvien viruksien tai uudis-muodostuman kimppuun saattaa parantua. Käsittelykohteen omia soluja voidaan ottaa ja käyttää tällä tavalla tai esimerkiksi inkuboinnissa voidaan käyttää toisesta, yhteensopivasta yksilöstä saatuja monosyyttejä tai lymfosyyttejä.

Vaikka nimellä CSF-1 tunnetun aktiivisuusmallin olemassaolo onkin tunnettu jo jonkin aikaa, niin kuitenkaan aktiivisuuden aiheuttavaa proteiinia ei ole koskaan saatu sekä niin puhtaana että 13 100972 niin suurina määrinä, että ketjun määrittäminen olisi ollut mahdollista, eikä niin puhtaana eikä niin suurina määrinä, että proteiinia olisi voitu käyttää hyväksi lääkintähoidossa. Koska saatavana ei ole ollut täysin puhtaan proteiinin käyttökelpoisia määriä eikä sitä koodaavaa DNArta, niin on ollut mahdotonta optimoida rakenteen muutoksia saamalla aikaan esimerkiksi edellä kohdassa A kuvattuja vaihtoehtoja, ja samoin tämän proteiinin käyttö lääkinnällisessä yhteydessä on ollut mahdotonta.

Nämä puutteet voidaan poistaa tämän keksinnön avulla. Lukuisia uusia puhdistavia lisätoimenpiteitä käyttäen ihmisen virtsasta on saatu sen verran puhdasta CSF-l-proteiinia, että se riittää tiettyjen aminohappoketjujen selvittämiseen, mikä puolestaan mahdollistaa oligomeeristen DNA-koettimien muodostamisen. Näitä koettimia voidaan käyttää koko proteiinia koodaavan ketjun saamiseen. Eräässä menetelmässä, joka kuvataan jäljempänä, käytetään ihmisen N-päätteen ketjun suhteen muodostettuja koettimia, joilla kokeillaan ihmisen genomien kirjasto asianmukaisen koodaavan ketjunosan saamiseksi. Ihmisen genominen, kloonattu ketju voi ilmentyä suoraan omia säätäviä ketjujaan käyttäen, tai se voidaan ilmentää nisäkäsjärjestelmiin, jotka kykenevät käsittelemään introneita, sopivissa muodosteissa. Genomisia ketjuja käytetään myös CSF-l-proteiinia tuottavasta solulinjasta saadun, ihmisen cDNA-kirjaston koettimena tätä proteiinia koodaavan cDNA-ketjun saamiseksi. Tämä cDNA, mikäli sitä on käsitelty sopivasti, voidaan ilmentää suoraan COS- tai CV-l-soluissa, ja sitä voidaan käyttää vektoreiden muodostamiseen, jotka vektorit soveltuvat ilmennettäviksi monissa erilaisissa isännissä.

Näin ollen näillä toimenpiteillä voidaan saada aikaan täydellinen, ihmisen CSF-l-proteiinia koodaava ketju, josta voidaan muodostaa lukuisiin isäntäjärjestelmiin soveltuvia ilmentämisvek-toreita, jonka jälkeen koodaava ketju voidaan ilmentää. Käytettävissä olevat erilaiset isännät sekä näihin isäntiin sopivat ilmentämisvektorit mahdollistavat sen, että luennan jälkeinen jatkokäsittelyjärjestelmä sekä ympäristölliset tekijät voidaan valita, ja näin ollen täten muodostuneen proteiinin rakennetta säädellä.

14 100972 C. Sopivat isännät, säätelyjärjestelmät ja menetelmät Yleisesti, CSF-l-proteiinin tuotanto yhdistelmä-DNA-tekniikal-la käsittää seuraavat vaiheet:

Ensin saadaan DNA, joka koodaa täysin kehittynyttä (millä tarkoitetaan ohessa kaikkia muteiineja) proteiinia, esiproteiinia tai yhteensulautumaa, jossa CSF-l-proteiini on liittynyt lisä-ketjuun, joka ei tuhoa sen aktiivisuutta, tai lisäketjuun, joka voidaan pilkkoa irti hallituissa olosuhteissa (esimerkiksi peptidaasilla käsittelemällä), jolloin saadaan aktiivinen proteiini. Mikäli intronit eivät katkaise tätä ketjua, niin se soveltuu ilmennettäväksi missä tahansa isännässä. Mikäli läsnä on introneita, niin ilmentäminen on mahdollista nisäkässoluis-sa tai muissa eukarioottisissa järjestelmissä, jotka kykenevät käsittelemään introneita. Tämän ketjun tulisi olla irrotettavassa ja talteenotettavassa muodossa. Tämän jälkeen irrotettu tai talteenotettu koodaava ketju kytketään toiminnallisesti sopiviin säätäviin ketjuihin replikoituvassa ilmentymisvektoris-sa. Vektoria käytetään sopivan isännän transformoimiseen, ja transformoitua isäntää viljellään edullisissa olosuhteissa, jotta yhdistelmä-CSF-l-proteiinia saataisiin muodostumaan.

CSF-1 eristetään valinnaisesti alustasta tai soluista; eräissä tapauksissa proteiinin talteenotto ja puhdistaminen eivät ehkä ole välttämätöntä, mikäli pieni määrä epäpuhtauksia voidaan hyväksyä. Esimerkiksi täydellinen puhtaus ei ole välttämätöntä solujen in vitro viljelmässä, josta lymfokiinitekijä eristetään käsittelykohteelle antamista varten. Kuitenkin tuotetun CSF-l-proteiinin puhdistaminen olisi luonnollisesti välttämätöntä käytettäessä sitä suoraan lääkehoidossa käsittelykohteelle antamalla .

Kukin edellä esitetyistä vaiheista voidaan suorittaa lukuisalla tavalla. Esimerkiksi toivotut koodaavat ketjut voidaan saada eristämällä sopivaa cDNArta soluläheteistä, ja manipuloimalla cDNA:ta täydellisen ketjun saamiseksi. Vaihtoehtoisesti voidaan saada genomisia kappaleita, ja niitä käytetään suoraan asianmukaisissa isännissä. Muodosteet lukuisissa isännissä toimin 15 100972 nallisia ilmentämisvektoreita varten tehdään käyttämällä asianmukaisia replikoneja ja säätäviä ketjuja, kuten jäljempänä esitetään. Koodaavien ketjujen päihin voidaan lisätä sopivia restriktiokohtia, mikäli niitä ei ole luonnostaan saatavilla, jolloin saadaan aikaan irrotettavissa oleva geeni näihin vekto-reihin istuttamista varten.

Säätelevät ketjut, ilmentämisvektorit ja transformaatioon käytettävät menetelmät riippuvat geenin ilmentämiseen käytettävän isäntäsolun tyypistä. Yleisesti, isäntinä voidaan tällä hetkellä käyttää prokarioottisia soluja, hiivasoluja tai nisäkässoluja. Koska luonnollinen CSF-1 erittyy glykosyloitunee-na dimeerinä, niin isäntänä käytetään mieluiten järjestelmiä, jotka kykenevät toteuttamaan asianmukaisen, luennan jälkeisen jatkokäsittelyn. Näin ollen, vaikka prokarioottiset isännät ovatkin yleensä tehokkaimpia ja vaivattomimpia yhdistelmäpro-teiinien tuottamista ajatellen, niin kuitenkin mieluiten käytetään eukarioottisia soluja, ja erityisesti nisäkässoluja, niiden jatkokäsittelykyvystä johtuen. Bakteereissa tuotettu yhdistelmä-CSF-l-proteiini olisi dimeroitava in vitro. Tämän lisäksi on todennäköisempää, että isäntänä toimivat nisäkäs-solut tunnistavat luonnollisen signaaliketjun, mikä tekee erittämisen mahdolliseksi ja näin ollen puhdistamisen helpommaksi .

C.1. Säätävät ketjut ja vastaavat isännät

Prokariootteja edustavat tavallisimmin erilaiset E. coli-kannat. Kuitenkin, myös muita mikrobikantoja voidaan käyttää, kuten basilleja, esimerkiksi Bacillus subtilis-basillia, erilaisia Pseudomonas-lajeja, tai muita bakteerikantoja. Tällaisissa prokarioottisissa järjestelmissä käytetään plasmidivektoreita, joiden sisältämät replikaatiokohdat ja säätävät ketjut on saatu lajeista, jotka sopivat yhteen isännän kanssa. Esimerkiksi E. coli transformoidaan tyypillisesti käyttäen plasmidin pBR322 johdannaisia, jonka plasmidin Bolivar et ai., Gene (1977) 2^:95, ovat muodostaneet E. coli-lajista. pBR322 sisältää ampisilliinin ja tetrasykliinin vastustuskyvyn aikaansaavat 16 100972 geenit, ja täten siinä on käytettävissä lisämerkitsimiä, jotka voidaan joko säilyttää tai tuhota toivotun vektorin muodostamisen aikana. Tavallisesti käytettyjä prokarioottisia säätäviä ketjuja, joiden oheinen määritelmä käsittää promoottorit kopioitumisen käynnistymistä varten, valinnaisesti operaattorin kanssa, yhdessä ribosomien sitoutumiskohdista muodostuvien ketjujen kanssa, ovat esimerkiksi sellaiset tavallisesti käytetyt promoottorit, kuten beeta-laktamaasiin (penisillinaasi) ja laktoosiin (lac) perustuvat promoottori järjestelmät (Chang, et ai. Nature (1977) 198:1056 ja tryptofääniin (trp) perustuva promoottorijärjestelmä (Goeddel, et aL Nucleic Acids Res (1980) 8:4057 sekä lambda-peräisen P -promoottorin

Li ja N-geeniin kuuluva ribosomien sitoutumiskohta (Shimatake, et ai. Nature (1981) 292:128), joka on tehty käyttökelpoiseksi kannettavana säätelykasettina, mikä esitetään US-patentissa 4 711 845. Kuitenkin, keksinnössä voidaan käyttää mitä tahansa saatavilla olevaa promoottorijärjestelmää, joka sopii yhteen prokarioottien kanssa.

Bakteereiden lisäksi isäntinä voidaan käyttää myös eukariootti-sia mikrobeja, kuten hiivoja. Käytetyimpiä ovat leipomohiivan, Saccharomyces cerevisiae, laboratoriokannat, vaikka myös monia muitakin kantoja on vaivatta saatavilla. Vektorit, joissa käytetään 2 mikronin suuruista replikaation alkupistettä, kuvataan julkaisussa Broach, J.R., Meth Enz (1983) 101:307, mutta kuitenkin alalla tunnetaan myös muita plasmidivektoreita, jotka soveltuvat hiivassa ilmentämiseen (katso esimerkiksi julkaisut Stinchcomb, et ai. Nature (1979) 282:39, Tschempe, et ai. Gene (1980) 10:157 sekä Clarke, L. et ai. Meth Enz (1983) 101:300). Hiivassa käytettävien vektoreiden säätäviä ketjuja ovat esimerkiksi promoottorit glykolyyttisten entsyymien synteesiä varten (Hess, et ai. J. Adv Enzyme Reg (1968 ) j7:149; Holland, et ai. Biochemistry (1978) 1/7:4900). Muita alalla tunnettuja promoottoreita ovat esimerkiksi 3-fosfoglyseraattikinaasin promoottori (Hitzeman, et ai. J Biol. Chem. (1980) 255:2073) sekä muihin glykolyyttisiin entsyymeihin perustuvat promoottorit, 17 100972 joista entsyymeistä mainittakoon glyseraldehydi-3-fosfaatti-dehydrogenaasi, heksokinaasi, pyruvaatti-dekarboksylaasi, fosfofruktokinaasi, glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasi, 3-fosfo-glyseraatti-mutaasi, pyruvaatti-kinaasi, trioosifosfaatti-isomeraasi, fosfoglukoosi-isomeraasi ja glukokinaasi. Muita promoottoreita, joiden lisäetuna on kasvuolosuhteiden säätelemä kopioituminen, ovat promoottorialueet alkoholi-dehydroge-naasia 2, isosytokromia C, hapanta fosfataasia, jotka ovat typen metaboliaan liittyviä hajoittavia entsyymejä, sekä mal-toosin ja galaktoosin hyväksikäytöstä huolehtivia entsyymejä (Holland, edellä) varten. Samoin uskotaan, että päättäjäketjut ovat toivottuja koodaavien ketjujen 3'-päässä. Tällaisia päättäjiä on löydettävissä luentavaiheen läpikäymättömästä 3'-alueesta koodaavien ketjujen jälkeen hiivasta saaduissa geeneissä.

Monet kuvatut vektorit sisältävät säätäviä ketjuja, jotka ovat peräisin enolaasigeenin sisältävästä plasmidista peno46 (Holland, M.J., et ai. J Biol Chem (1981) 256:1385), tai plasmidista YEpl3 saadusta LEU2-geenistä (Broach, J., et ai.

Gene (1978) £:121), kuitenkin sopivia ovat ne kaikki vektorit, jotka sisältävät hiivaan sopivan promoottorin, replikaation alkupisteen sekä muita sääteleviä ketjuja.

Luonnollisestikin, polypeptidejä koodaavat geenit on mahdollista ilmentää eukarioottisten isäntäsolujen viljelmissä, jotka on saatu monisoluisista organismeista. Katso esimerkiksi Tissue Culture, Academic Press, Cruz ja Patterson (toimittajat) (1973). Käyttökelpoisia solulinjoja ovat hiiren myelomat N51, VERO- ja HeLa-solut, sekä kiinanhamsterin munasarjasolut (CHO-solut). Näiden solujen ilmentämisvektorit käsittävät tavallisesti sellaisia promoottoreita ja säätäviä ketjuja, jotka sopivat yhteen nisäkässolujen kanssa, ja niistä mainittakoon esimerkiksi usein käytetyt, varhainen ja myöhäinen promoottori Simian-viruksesta 40 (SV 40) (Fiers, et ai. Nature (1978) 273:113), tai viruspromoottorit, kuten ne, jotka on saatu polyomaviruksesta, Adenoviruksesta 2, naudan papillomaviruksesta tai lintujen sarcoma-viruksista, tai immunoglobuliiniin perustuvat promoottorit ja lämpöshokkipromoottorit. Nisäkässolun 18 100972 muodostaman isäntäjärjestelmän transformaatioihin liittyvät yleispiirteet on kuvattu US-patenttijulkaisussa 4 399 216.

Nyt on todettu, että myöskin "edistinalueet" ovat tärkeitä ilmentämistä optimoitaessa; nämä ovat yleensä ketjuja, jotka sijaitsevat ylävirran puolella promoottorialueesta. Replikaa-tion alkupisteitä voidaan saada tarvittaessa viruslähteistä. Kuitenkin, eukariooteissa DNA-replikaation tavallisena mekanismina on yhdentyminen kromosomiin. Isäntinä voidaan käyttää myös kasvisoluja, ja saatavilla on kasvisoluihin soveltuvia säätäviä ketjuja, joista mainittakoon nopaliini-syntaasiin perustuva promoottori ja polyadenylaation signaaliketjut (Depicker, A., et ai. J Mol App.1 Gen (1982) JL: 5 61) .

C.2. Transformaatiot Käytetystä isäntäsolusta riippuen transformaatio toteutetaan tavanomaisilla tekniikoilla, jotka soveltuvat tällaisille soluille. Kalsiumkloridilla toteutettavaa kalsiumkäsittelyä, joka kuvataan julkaisussa Cohen, S.N., Proc Natl Acad Sei (USA) (1972) ^9:2110, käytetään prokarioottien tai muiden sellaisten solujen tapauksessa, jotka solut sisältävät huomattavia soluseinäesteitä. Tiettyjen kasvisolujen tapauksessa käytetään infektointia Agrobacterium tumefaciens-bakteerilla (Shaw, C.H., et ai, Gene (1983) 2_3:315). Nisäkässolu jen, joilla tällaista soluseinää ei ole, tapauksessa käytetään mieluiten kal-siumfosfaatilla toteutettavaa saostamismenetelmää Graham ja van der Eb. Virology (1978) 5_2:546. Hiivoihin transformoinnit toteutetaan menetelmällä, joka kuvataan julkaisuissa Van Solingen, P., et ai. J Bact (1977) 130:946 sekä Hsiao, C.L., et ai. Proc Natl Acad Sei (USA) (1979) 76:3829.

C.3. mRNA:n luotaaminen Northern'in täplityksellä; cDNA-kirjastojen tai genomisten kirjastojen koettimet RNA pilkotaan fraktioikseen Northern’in täplitystä varten elektroforeettisesti agaroosigeelilevyllä, täysin denaturoivissa olosuhteissa käyttäen denaturoivana aineena formaldehydiä (Maniatis, T., et ai. Molecular Cloning (1982) Cold Spring Harbor Press, sivut 202-203) tai 10 mM metyylielohopeaa (CH^HgOH) (Bailey, J. M., et al. Anal Biochem (1976) 70:75-85; 19 100972 sekä Sehgal, P.B., et ai. Nature (1980) 288:95-97)♦ Metyylielo-hopeageelejä käytettäessä 1,5-prosenttiset geelit valmistetaan sulattamalla agaroosi liikkuvassa puskurissa (100 mM boori-happoa, 6 mM natriumboraattia, 10 mM natriumsulfaattia, 1 mM EDTA, pH 8,2), jonka jälkeen se jäähdytetään 60°C:n lämpötilaan ja siihen lisätään l/lOO tilavuutta 1 M CH^HgOH-liuosta. RNA liuotetaan 0,5 x liikkuvaan puskuriin ja se denaturoidaan inkuboi-malla 10 mM metyylielohopeassa 10 minuuttia huoneen lämpötilassa. Glyserolia (20 %) ja bromifenolisinistä (0,05 %) lisätään näytteiden lastaamista varten. Näytteitä käsitellään elektro-foreettisesti käyttäen arvoa 500-600 voltti-tunti, puskuria kierrättäen. Elektroforeesin jälkeen geeliä pestään 40 minuuttia 10 mM 2-merkaptoetanolissa metyylielohopean myrkyllisyyden poistamiseksi, ja Northern'in täplät valmistetaan siirtämällä RNA geeliltä kalvosuodattimelle.

cDNA-kirjasto tai genominen kirjasto seulotaan käyttäen pesäkkeisiin tai virusplakkeihin perustuvaa hybridisaatiomenetelmää. Bakteeripesäkkeet tai faagien tapauksessa plakit siirretään kahdelle nitroselluloosaa olevalle suodatinpaperille (tyyppi S&S BA-85). Plakit tai pesäkkeet lysoidaan ja DNA kiinnitetään suodatti-meen käsittelemällä peräkkäin 5 minuuttia 500 mM NaOH-liuoksella ja 1,5 M NaCl-liuoksella. Suodattimia pestään kahdesti, kulloinkin 5 minuuttia, 5 x tavanomaisella suolasitraatilla (SSC), kuvataan ilmassa ja lämmitetään 80°C:n lämpötilassa 2 tuntia.

Geelit Northern1in täplityksen tpaauksessa tai kaksi suodatinta cDNA-seulonnan tai genomisen seulonnan tapauksessa esihybridisoi-daan 25-42°C:n lämpötilassa 6-8 tuntia käyttämällä suodatinta kohden 10 ml DNA-hybridisaation puskuria ilman koetinta (0-50 % formamidia, 5-6 x SSC, pH 7,0, 5 x Denhardt'in liuos (polyvinyylipyrrolidiini, plus Ficoll ja naudan seerumin albumiini; 1 x = 0,02 % kutakin), 20-50 mM natriumfosfaattipuskuri, pH 7,0, 0,2 % SDS, 20 ^ug/ml poly U:ta (cDNArta luodattaessa), sekä 50 yUg/ml lohen sperman denaturoitua DNA:ta). Tämän jälkeen näytteet hybridoidaan inkuboimalla niitä asianmukaisessa lämpötilassa noin 24-36 tuntia käyttäen hybridisaatiopuskuria, 20 100972 joka sisältää kinasoitua koetinta (oligomeerien tapauksessa). Pitemmät cDNA-kappaleen tai genomisen kappaleen koettimet merkittiin "nick"-luennalla tai alukkeen jatkamisella.

Sekä esihybridisaation että hybridisaation olosuhteet riippuvat toivotusta ehdottomuudesta, ja ne vaihtelevat esimerkiksi koettimen pituuden mukaan. Tyypillisinä olosuhteina suhteellisen pitkiä (esimerkiksi yli 30-50 nukleotidiä) koettimia käytettäessä on 42-55°C:n lämpötila ja hybridisaatiopuskuri, joka sisältää noin 20-50 % formamidia. Noin 15 nukleotidiä käsittävien oligomeeristen koettimien tapauksessa tarvittavan alhaisemman ehdottomuuden tapauksessa käytetään alhaisempia lämpötiloja, noin 25-42°C sekä alhaisempia formamidipitoisuuksia (0-20 %).

Pitkiä koettimia käytettäessä suodattimet voidaan pestä esimerkiksi neljästi, kulloinkin 30 minuuttia 40-55°C:n lämpötilassa liuoksella, joka käsittää 2 x SSC, 0,2 % SDS ja 50 mM natrium-fosfaattipuskuria, pH 7, jonka jälkeen ne pestään kahdesti liuoksilla 0,2 x SSC ja 0,2 % SDS, kuivataan ilmassa, ja autoradiogra-foidaan -70°C:n lämpötilassa 2-3 vuorokautta. Pesuolosuhteet ovat jonkin verran lievemmät lyhyempien koettimien tapauksessa.

C.4. Vektoreiden muodostaminen

Toivotut koodaavat ja säätävät ketjut sisältävien, sopivien vektoreiden muodostamiseen käytetään tavanomaisia ligaatio-ja restriktiotekniikoita, jotka tunnetaan alalla hyvin.

Eristetyt plasmidit, DNA-ketjut tai syntetoidut oligonukleotidit pilkotaan, muovaillaan ja ligatoidaan uudestaan toivottuun nmotoon.

Kohtaspesifinen DNA-pilkkominen toteutetaan käsittelemällä sopivalla restriktioentsyymillä (tai entsyymeillä) alalla yleisesti tunnetuissa olosuhteissa, ja näiden kaupallisesti saatavien restriktioentsyymien valmistajat täsmentävät tämän pilkkomisen yksityiskohdat. Katso esimerkiksi yhtiön New England Biolabs tuoteluettelo. Yleisesti, noin 1 ^ug plasmidia tai DNA-ketjua pilkotaan yhdellä yksiköllä entsyymiä noin 20 mikrolitrassa 21 100972 puskuriliuosta; oheisissa esimerkeissä restriktioentsyymiä käytetään tyypillisesti ylimäärin DNA-substraatin täydellisen pilkkoontumisen takaamiseksi. Käyttökelpoiset inkubaatioajät 37°C:n lämpötilassa ovat yhdestä kahteen tunnin pituisia, vaikka poikkeamiakin voidaan hyväksyä. Kunkin inkuboinnin jälkeen proteiini poistetaan uuttamalla fenolin ja kloroformin seoksella, mitä voi seurata uutto eetterillä, ja nukleiinihappo otetaan talteen vesifraktioista etanolilla seostamalla. Toivottaessa pilkotut kappaleet voidaan erottaa kokonsa mukaan tavanomaisilla tekniikoilla elektroforeettisesti, käyttäen poly-akryyliamidigeeliä tai agaroosigeeliä. Kokoon perustuvan erottamisen yleiskuvaus on löydettävissä julkaisusta Methods in Enzymology (1980) 65;499-560.

Restriktioentsyymeillä pilkottujen kappaleiden päät voidaan tehdä tylpiksi käsittelemällä E. coli-bakteerista saadun DNA-polymeraasin I suurella kappaleella (Klenow) neljän deoksinukleo-tidi-trifosfaatin (dNTP) läsnäollessa, inkubointiaikojen ollessa noin 15-25 minuuttia 20-25°C:n lämpötilassa, liuoksessa, joka käsittää 50 mM Tris, pH 7,6, 50 mM NaCl, 6 mM MgCl^, 6 mM DTT ja 5-10 ^um dNTP-molekyylejä. Klenow-kappale täyttää tarttuvat 5'-päät mutta se hajottaa esiin työntyvät yksinkertaiset 3'-juosteet siinäkin tapauksessa, että neljää dNTP-tyyppiä on läsnä. Toivottaessa selektiivinen korjaaminen voidaan toteuttaa käyttämällä ainoastaan yhtä, eli valittua, dNTP-tyyppiä, joka täyttää tarttuvien päiden luonteen sanelemat rajoitukset. Klenow-kappaleella käsittelyn jälkeen seos uutetaan fenolin ja kloroformin seoksella ja saostetaan etanolilla. Käsittely asianmukaisissa olosuhteissa Sl-nukleaasilla johtaa mahdollisten yksijuosteis-ten osien hydrolysoitumiseen.

Synteettiset oligonukleotidit voidaan valmistaa triesterimenetel-mällä, joka kuvataan julkaisussa (J Am Chem Soc (1981) 103:3185-3191) tai käyttäen automaattisia synteesimenetelmiä. Yksinkertaisten juosteiden kinasoiminen ennen kiinnittämistä tai merkitsemistä varten toteutetaan käyttämällä ylimäärää, esimerkiksi 22 100972 noin 10 yksikköä polynukleotidikinaasia substraatin 1 nmoolia kohden liuoksessa, joka käsittää 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitolia, 1-2 mM ATP. Mikäli kinasointi tapahtuu koettimen merkitsemiseksi, niin ATP sisältää ominais-aktiivisuudeltaan suurta 32yP:tä.

Ligatoinnit toteutetaan 15-30 mikrolitran tilavuuksina seuraavia tavanomaisia olosuhteita ja lämpötiloja käyttäen: 20 mM Tris-Cl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 /ug/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl, ja joko 40 ^υΜ ATP, 0,01-0,02 (Weiss) yksikköä T4 DNA-ligaasia 0°C:n lämpötilassa (kun kyseessä on "tarttuvien päiden" ligaatio) tai 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) yksikköä T4 DNA-ligaasia 14°C:n lämpötilassa (kun kyseessä on "tylppien päiden" ligaatio). Molekyylien väliset "tarttuvien päiden" ligaatiot toteutetaan tavallisesti käyttäen DNA:n kokonaispitoisuutena 33-100 ^,ug/ml (jolloin kokonaispitoisuus lopussa on 5-100 nM). Molekyylien väliset tylppien päiden ligaatiot (joissa käytetään tavallisesti kytkijän 10-30-kertaista molaarista ylimäärää) toteutetaan siten, että lopun kokonaispitoisuus on 1 ^,uM.

Muodostettaessa vektori "vektorikappaleita" käyttäen, tämä vektorikappale käsitellään yleensä bakteeriperäisellä alkalisel-la fosfataasilla (BAP) 5'-fosfaatin poistamiseksi ja vektorin uudestaanligatoitumisen estämiseksi. BAP-pilkkominen toteutetaan pH-arvossa 8, suurin piirtein 150 mM Tris-puskurissa, siten, että läsnä on Na+- ja Mg2+-ioneja, käyttäen noin 1 yksikköä BAP vektorin mikrogrammaa kohden 60°C:n lämpötilassa, tunnin ajan. Nukleiinihappokappaleiden talteenottamiseksi preparaatti uutetaan fenolin ja kloroformin seoksella ja se saostetaan etanolilla. Vaihtoehtoisesti, ligatoituminen uudestaan voidaan estää vektoreissa, jotka on pilkottu kahdesti, pilkkomalla epätoivotut kappaleet ylimääräiseen kertaan restriktioentsyy-meillä.

C.5. DNA-ketjujen muuntaminen cDNA:sta tai genomisesta DNArsta peräisin olevien vektoriosien, joiden ketjuja on muunnettava, tapauksessa käytetään kohta- 23 100972 spesifistä, alukkeen ohjaamaa mutageneesiä. Tätä tekniikkaa käytetään nykyään rutiininomaisesti alalla, ja se toteutetaan käyttäen alukkeena synteettistä oligonukleotidia, joka on muta-genoitavan, yksijuosteisen faagi-DNA:n täydentäjä (komplementti) lukuunottamatta rajallista yhteensopimattomuutta, joka edustaa toivottua mutaatiota. Lyhyesti, synteettistä oligonukleotidiä käytetään faagia täydentävän juosteen synteesiä ohjaavana alukkeena, ja tuloksena oleva kaksijuosteinen DNA transformoidaan faagia tukevaan isäntäbakteeriin. Transformoidun bakteerin viljelmät maljataan agarin pinnalle siten, että faagiplakki voi muodostua erillisistä soluista, jotka sisältävät faagin.

Teoreettisesti, 50% uusista faagiplakeista sisältää faagin, joka on yksijuosteinen ja mutatoituneessa muodossa; 50%:lla faageista on alkuperäinen ketju. Faagiplakit hybridisoidaan synteettisen, kinasoidun alukkeen kanssa lämpötilassa, joka sallii toisiaan täysin vastaavien ketjujen hybridisaation, mutta jossa lämpötilassa alkuperäistä juostetta vastaamattomat kohdat riittävät estämään hybridisaation. Tämän jälkeen koettimen kanssa hybri-disoituvat faagiplakit otetaan talteen, niitä viljellään ja DNA otetaan talteen. Yksityiskohtia kohtaspesifisestä mutaatio-toimenpiteestä kuvataan jäljempänä erityisissä esimerkeissä.

C.6. Muodosteiden varmistaminen Jäljempänä esitettävissä muodosteissa plasmidin muodostamista ajatellen asianmukaiset ligaatiot varmistetaan transformoimalla ensin E. coli-kanta MM294, tai muu sopiva isäntä, ligaatioseok-sella. Toiveiden mukaiset transformantit valikoidaan ampisil-liinin, tetrasykliinin tai muun antibiootin vastustuskyvyn perusteella, tai käyttäen muita, plasmidimuodosteen tyypistä riippuvia merkitsimiä, kuten alalla tunnettua on. Tämän jälkeen plasmidit preparoidaan transformanteista menetelmällä, joka esitetään julkaisussa Clewell, D.B., et ai, Proc. Natl. Acad.

Sei (USA) (1969) 62^:1159, valinnaisesti kloramfenikolilla paisuttamisen jälkeen (Clewell D.B., J. Bacteriol. (1972) 110: 667). Eristetty DNA analysoidaan restriktioentsyymeillä ja/tai sen järjestys selvitetään dideoksi-menetelmällä Sanger, F., et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) (1977) J74:5463, jota kuvataan edelleen julkaisussa Messing et ai. Nucleic Acids Res. (1981) j?:309, tai menetelmällä, joka esitetään julkaisussa Maxam, et ai, Methods in Enzymology (1980) 65:499.

24 100972 C. 7. Esimerkkejä isännistä

Ohessa kloonaamiseen ja ilmentämiseen käytetyt isäntäkannat ovat seuraavat:

Kloonaamiseen ja järjestyksen selvittämiseen, sekä muodosteiden ilmentämiseen useimpien bakteeriperäisten promoottoreiden säätelyn alaisuudessa käytettiin isäntänä E. coli-kantaa MM294, joka saatiin kantakokoelmasta E. coli Genetic Stock Center, GCSC n:o 6135. Ilmentäminen Pr N__.c-promoottorin säätelyn alai-suudessa toteutettiin käyttäen isäntänä E. coli-kannan K12 MC1000 lambda-lysogeenia, N^N^2C1857 SusP80, ATCC 39531.

M13-faagiyhdistelmien tapauksessa käytettiin E. coli-kantoja, jotka ovat herkkiä faagi-infektioille, esimerkiksi E. coli-K12-kantaa DG98. DG98-kanta on tallennettu käntakokoelmaan ATCC heinäkuun 13. päivänä 1984, ja sen tallennusnumero on 39768.

Ilmentäminen nisäkässoluissa toteutettiin COS-7- ja CV-l-soluja käyttäen.

D. Edullisimmat suoritusmuodot Tämän keksinnön mukaisia yhdistelmä-DNA-tekniikalla saatuja CSF-l-proteiineja voidaan pitää muteiinijoukkona, joiden muteii-nien primäärit aminohappoketjut ovat samankaltaiset mutta eivät välttämättä identtiset, ja niillä kaikilla on, tai ne voidaan pilkkoa spesifisesti muteiiniksi, jolla on CSF-l-proteiinille tunnusomaista aktiivisuutta - eli ne kykenevät kiihottamaan luuydinsolujen erikoistumista monosyyteiksi, etupäässä, ja edellä Määritelmät-kappaleessa esitettyjen rajoitusten puitteissa, ne ovat immunoreaktiivisia luonnollista CSF-l-proteiinia vastaan muodostettujen vasta-aineiden sekä CSF-l-aktiivisuuteen liittyvien reseptoreiden kanssa. Kuitenkin näiden muteiinien eräät suoritusmuodot ovat muita edullisimpia.

25 1 0 0 9 7 2

Kuvassa 5 mCSF-l-proteiinille esitetyllä primäärillä ketjulla on vaadittua aktiivisuutta, ja se kuuluu luonnollisestikin edul-lisimpiin suoritusmuotoihin. Edullisiin muteiineihin kuuluvat samoin ne, joissa ketjun tietyt osat ovat muuntuneet joko yhden tai useamman mCSF-l-ketjussa esiintyvän aminohapon häviämänä tai konservatiivisen korvautumisen seurauksena. Aminohappojen konservatiivisella korvautumisella tarkoitetaan muunnosta, joka ei muuta proteiinille tunnusomaista aktiivisuutta, ja yleensä tällaisen korvautumisen tunnusomaisena piirteenä on kahden keskenään vaihtuvan jäännöksen sivuketjujen kemiallinen samankaltaisuus. Esimerkiksi happamat jäännökset voivat korvautua konservatiivisesti muilla happamilla jäännöksillä, emäksiset jäännökset emäksisillä, hydrofobiset hydrofobisilla, runsaasti tilaa vievät runsaasti tilaa vievillä, ja niin edelleen. Välttämätön samankaltaisuus riippuu luonnollisesti korvautuvan aminohapon tärkeydestä, sekä sen luonteesta. Täten yleisesti kysteiini-jäännökset voivat korvautua edullisesti seriinillä ja alaniinilla; asparatiinihappojäännökset glutaamihapolla; lysiini- tai arginii-nijäännökset histidiinillä, leusiinilla, isoleusiinilla tai va-: liinilla; tryptofaanijäännökset fenyylialaniinilla tai tyrosii- nilla; ja niin edelleen.

CSF-l-proteiinin ne alueet, joissa voi esiintyä eniten muunnoksia ovat ne alueet, joissa homologisuus ihmistyyppisen ja hiiri-tyyppisen proteiinin välillä on tunnetusti alhainen (jäännökset 15-20 ja 75-84); alueet, jotka ovat taipuvaisia pilkkoutumaan proteolyyttisesti (jäännökset 51 ja 52 sekä jäännökset 191-193); kysteiinijäännökset, jotka eivät osallistu disulfidisidosten muodostumiseen, tai jotka eivät ole absoluuttisen välttämättömiä aktiivisuudelle (jäännökset 158-224).

Näin ollen erityisen edullisia ovat ne CSF-l-muteiinit, joiden tunnusomaisena piirteenä on yhden tai useamman, mCSF-l-ketjussa asemien 158 ja 224 välillä, rajat mukaan lukien, sijaitsevan aminohapon ja/tai yhden tai useamman samalla alueella sijaitsevan aminohappoketjun häviämä tai konservatiivinen korvautuminen. Samoin edullisia ovat ne muteiinit, joiden tunnusomai 26 100972 sena piirteenä on yhden tai useamman, mCSF-l-ketjussa asemissa 51 ja 52 ja/tai asemissa 191, 192 ja 193 sijaitsevan aminohapon häviämä tai konservatiivinen korvautuminen. Koska asemien 15-20 ja 75-84 rajoittamissa alueissa homologisuus on ilmeisesti alhainen, niin toisen edullisen suoritusmuotojoukon tunnusomaisena piirteenä on yhden tai useamman, mCSF-l-ketjussa asemissa 15-20 ja/tai asemissa 75-84 sijaitsevan aminohapon häviämä tai konservatiivinen korvautuminen. Samoin edullisia ovat ne muteii-nit, joiden tunnusomaisena piirteenä on missä tahansa asemassa sijaitsevan kysteiinijäännöksen, joka ei ole olennainen disul-fidisidoksen muodostumiselle, häviämä tai konservatiivinen korvautuminen. Samoin edullisia ovat ne proteiinit, joiden tunnusomaisena piirteenä on mCSF-l-ketjun asemassa 59 sijaitsevan tyrosiinijäännöksen häviämä tai korvautuminen; erityisesti korvautuminen asparatiinihappojäännöksellä.

E. Ihmisen CSF-l-proteiinin kloonaaminen ja ilmentäminen Seuraavassa havainnollistetaan niitä menetelmiä, joita käytetään ihmisen CSF-l-proteiinia koodaavan ketjun saamiseksi, tämän ketjun sijoittamiseksi ilmentämisvektoreihin, sekä toivotun proteiinin ilmentämiseksi.

E.1. Ihmisen luonnollisen CSF-l-proteiinin puhdistaminen ja koettimen muodostaminen_

Ihmisen virtsassa esiintyvä CSF-1 puhdistettiin osittain menetelmillä, jotka kuvataan julkaisussa Das, S.K., et ai, Blood (1981) 5_8:630, mitä seurasi affiniteettiin perustuva puhdistus-vaihe käyttäen hiiren CSF-l-proteiinia vastaan vaikuttavaa rotan monoklonaalista vasta-ainetta, josta käytetään nimitystä YYG106, ja joka oli kiinnitetty Sepharose B-kolonniin (Stanley, E.R., Methods Enzymol (1985) 116:564). Puhdistuksen lopullisena vaiheena oli HPLC-käsittely käänteisfaasilla, käyttäen eluoimiseen puskurijärjestelmää, joka sisälsi 0,1% TFA/30% asetonitriiliä -0,1% TFA/60% asetonitriiliä.

MIAPaCa-peräisen CSF-l-proteiinin tapauksessa, jota proteiinia tuotettiin seerumivapaasti forbol-myristiiniasetaatilla indusoiden, solujen supernatantti käsiteltiin kalsiumfosfaattiin perustuvalla geelikromatografiällä (edellä mainitun Das'in julkaisun 27 100972 mukaisesti), mitä seurasi affiniteettikromatografinen käsittely käyttäen linssisiementen lektiiniä (Das'in julkaisussa esitetyn ConA-affiniteettivaiheen sijasta), jonka jälkeen supernatanttia käsiteltiin immunoaffiniteettiin perustuvassa vaiheessa käyttäen Sepharose-B-geeliin konjugoitua monoklonaalista vasta-ainetta YYG106, sekä lopulta HPLC-kromatografisesti käänteisfaasia käyttäen, jotka molemmat käsittelyt on kuvattu edellä.

Virtsasta saadun proteiinin ja MIAPaCa-proteiinin, jotka oli puhdistettu homogeenisiksi, aminohappoketjun järjestys määritettiin Edman-hajotusta ja automaattista järjestyksen määrityslaitetta käyttäen. Ihmisen CSF-proteiinin N-päätteen ketju selvitettiin riittävässä määrin kuvassa 3 esitettyjen koettimien muodostamisen mahdollistaen.

E.2. Ihmisen genomisen ketjun valmistaminen CSF-l-proteiinia koodaava, ihmisen genominen ketju saatiin Maniatis'in mukaisesti λ-faagiin Charon 4 muodostetusta ihmisen genomisesta kirjastosta käyttäen koettimia, jotka oli muodostettu siten, että ne koodaavat ihmisproteiinin N-päätteen ketjua. Kirjasto muodostettiin pilkkomalla ihmisgenomi osittain entsyymeillä Haelll ja AluI, jonka jälkeen EcoRI-kytkijät ligatoitiin ja kappaleet istutettiin EcoRI-entsyymillä pilkottuun Charon 4-faagiin. Charon 4A-faagi, joka sisältää CSF-l-ketjun, mikä päätellään jäljempänä kuvatulla tavalla koettimeen hybridisoitu-misen perusteella, ja josta käytetään nimitystä pHCSF-1, on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection (ATCC) huhtikuun 2. päivänä 1985, ja sen tallennusnumero on 40177. Tätä faagia myöhemmin tutkittaessa todettiin, että siinä oli tapahtunut uudestaan järjestäytymistä ja/tai häviä-miä, ja oikeat ketjut eivät olleet säilyneet. Tästä syystä vaihtoehtoinen, genomisesta kirjastosta identtisellä tavalla saatu pesäke, jota viljelemällä varmistuttiin faagin stabiilisuudes-ta replikoitumisten kuluessa, ja josta käytetään nimitystä pHCSF-la, tallennettiin kantakokoelmaan ATCC toukokuun 21. päivänä 1985, ja se sai tallennusnumeroksi 40185. pHCSF-la sisälsi 18 kiloemäsparin suuruisen istutteen, ja siitä kyettiin 28 100972 muodostamaan res.triktioentsyymeillä pilkkeitä, jotka hybridi-soituivat samoin koettimeen, ja sitä käytettiin järjestyksen määrittämiseen sekä uusien koettimien muodostamiseen jäljempänä esitetysti.

Mikäli CSF-l-proteiinia koodaava ketju on läsnä kokonaisuudessaan, niin sen läsnäolo voidaan osoittaa ilmentämällä COS-7-soluissa, kuten julkaisussa Gluzman, Y., Cell (1981) 23:175 kuvataan. Testattava kappale kloonataan plasmidista pBR322 saatuun plasmidiin, jota on muunnettu siten, että se on saatu sisältämään SV40-viruksen replikaation alkupisteen (pGRl Ringold, G., J. Mol. Appi. Genet. (1982) _1:165-175). Tuloksena olevat vektorit, joiden kopioiden lukumääräon suuri, transformoidaan COS-7-solui-hin ja CSF-l^-geenin ilmentymistä seurataan 24, 48 ja 72 tunnin kuluttua Das'in (edellä) julkaisussa kuvattua radioreseptoreihin perustuvaa koemenetelmää käyttäen. Ilmentyminen tapahtuu luonnollisten CSF-l-geenin säätävien ketjujen säätelyn alaisuudessa. Faagin pHCSF-la suurin piirtein 18 kiloemäsparin suuruisesta istutteesta saadut, tällä tavalla testatut Hindlll-pilkkeet eivät ilmentäneet geeniä, mikä osoittaa, että Hindlll pilkkoo geenin kohdalta. Tämä varmistettiin myöhemmin kartoituksella.

Kuitenkin, järjestyksen ensimmäistä selvittämistä varten faa-gista pCHSF-la saatiin 3,9 kiloemäsparin suuruinen Hindlll-kappale, ja se kloonattiin kloonaaviin M13-vektoreihin.

Järjestys tässä Hindlll-kappaleessa on selvitetty osittain, ja tulokset sekä päätelty peptidiketju esitetään kuvassa 4. Se sisältää ihmisen CSF-l-proteiinin sen osan, jonka aminohappojärjestys selvitettiin, kuten kuvasta 1 nähdään, suhteen oikeat kodonit. Suurin piirtein 1400 emäsparin suuruisen intronin läsnäolo pääteltiin käytettävissä olevan aminohappoketjun perusteella. Tämän lisäksi aminohappoja 24-34 koodaavan genomisen ketjun (katso kuvien 4 ja 5 päälleviivattu osa) perusteella muodostettiin 32-meerinen koetin cDNA-kirjastoa varten, ja sitä käytetään jäljempänä esitetyllä tavalla.

29 100972

Yksityiskohtaisemmin, genomisen kloonin pHCSF-la saamiseksi Maniatis-kirjasto luodattiin käyttäen kuvassa 3 esitettyjen oligomeerien kahta seosta. EK14 ja EK15 valikoitiin, vaikka myös muut esitetyt oligomeerit ovat käyttökelpoisia. N-päätteen ketjun "täysipituisen" koettimen saamiseksi EK14-oligonukleo-tidiä käytettiin 16:n 35-meerin seoksena. Lyhyempää oligomee-riä EK15 käytettiin 64:n 18-meerin seoksena. Ne faagit, jotka hybridisoituivat kumpaankin kinasoituun koettimeen, otettiin talteen, ja niitä viljeltiin E. coli DG98-kantaan tai johonkin muuhun kyvykkääksi tehtyyn kantaan infektoimalla.

Koettimena toimivia oligonukleotideja EK14 ja EK15 käyttäen toteutetun luotaamisen erityiset olosuhteet ovat seuraavat: EK14- oligonukleotidin tapauksessa puskuri sisälsi 15% formamidia, 6 x SSC, pH 7,0, 5 x Denhardt'n liuosta, 20 mM natriumfosfaat-tia, 0,2% SDS ja 50 ^ug/ml lohen sperman denaturoitua DNA:ta.

Esihybridisaatio ja hybridisaatio toteutettiin 42°C:n lämpötilassa, ja suodattimet pestiin 2 x SSC-liuoksessa 52°C:n lämpötilassa. EK15-oligomeerin tapauksessa hybridisaatioon ja esihybridisaatioon käytettiin samankaltaisia olosuhteita form-amidin pitoisuutta lukuunottamatta, joka pitoisuus oli 0%; pesu toteutettiin hieman alhaisemmassa lämpötilassa, joka oli 42°C.

Positiivisesti hybridisoituvasta faagista pHCSF-la eristetty, suurin piirtein 18 kiloemäsparin suuruinen DNA-istute käsiteltiin Hindlll-entsyymillä, ja kappaleet erotettiin elektroforeet-tisesti agaroosigeelillä Southern'in menetelmää käyttäen. Geelit toistettiin nitroselluloosaa oleville suodattimille, ja suodattimet luodattiin jälleen käyttäen koettimina oligonukleo-tidejä EK14 ja EK15. Molemmat koettimet hybridisoituivat 3,9 kiloemäsparin suuruiseen kappaleeseen.

Positiivinen kappale leikattiin irti geelistä, eluoitiin ja ali-kloonattiin Hindlll-entsyymillä käsiteltyyn Ml3mpl9-ketjuun järjestyksen selvittämiseksi dideoksimenetelmällä. Kuvassa 4 esitetään osittainen järjestys. Alleviivattu osa vastaa täsmälleen ihmisen CSF-l-proteiinista aikaisemmin määritettyä N-päätteen ketjua; ne jäännökset, joiden alla on tähti, ovat homologisia hiiren ketjun kanssa.

30 100972

Kuvassa 4 aminohappoja 22 ja 23 vastaavien kodonien välissä sijaitseva 1,4 kiloemäsparin suuruinen intronalue, ihmisen puhdistetusta proteiinista määritetyn ketjun perusteella päätellen, esitetään luentavaiheen läpikäymättömässä muodossaan. N-oäätteen jäännösten suhteen ylävirran puolella sijaitseva ketju sisältää otaksutun johtoketjun; tämän johtoketjun sen osan, joka sijaitsee välittömästi täysin kehittyneen proteiinin vieressä, jonka osan cDNA-kloonin (katso jäljempänä) järjestyksen selvityksestä saadut alustavat tulokset varmistavat kokeilullisesti, luentavaihe esitetään. Ylävirran puolella sijaitsevia osia ei esitetä kuitenkaan luentavaiheen läpikäyneinä; cDNA-ketjuun vertaamalla ollaan varmistettu, että nämä osat käsittävät intronin.

Järjestyksen selvittäminen edelleen noin 13 kiloemäsparin saamiseksi koko 18 kiloemäsparin suuruisesta geenistä osoittaa, että geeni sisältää 9 eksonia, joita erottaa 8 intronia. Täysin kehittyneen proteiinin cDNA-ketjun alueet vastaavat täsmälleen genomisia eksonikodoneita, kodonia 59 lukuun ottamatta, kuten jäljempänä esitetään.

Ylimääräinen Ml3-aliklooni saatiin pilkkomalla 3,9 kiloemäsparin suuruinen Hindlll-kappale entsyymillä PstI, jolloin muodostui 1 kiloemäsparin suuruinen Pstl/Pstl-kappale, joka sisältää tunnetun N-Däätteen ketjun sekä noin 1 kiloemäsparin verran muuta ylävirran puoleista ketjua.

E.3. Ihmisen CSF-l-proteiinia koodaava cDNA

Ihmisestä peräisin olevaa, haimakarsinooman solulinjaa MIAPaCa-2 käytettiin mRNA-lähteenä koettimen oikeuden todistamiseksi sekä cDNA-kirjaston muodostamiseksi, joka kirjasto sisältää ihmisen CSF-l-proteiinia koodaavan ketjun intronittomassa muodossa. MIAPaCa-solulinja tuottaa CSF-l-proteiinia suurin piirtein 10 kertaa heikommin kuin hiiren L-929-solut.

Negatiivisena vertailuna toimiva mRNA valmistettiin seerumitto-massa alustassa pidetyistä MIAPaCa-soluista, joita oli siis pidetty olosuhteissa, joissa solut eivät tuota CSF-l-proteiinia.

31 100972 CSF-l-proteiinia tuottavia soluja saatiin indusoimalla CSF-1-tuotanto uudestaan seerumin poistamisen jälkeen.

Solut kasvatettiin yhteen pyöritettävissä pulloissa käyttäen Dulbecco'n muunnettua Eagle-alustaa (DMEM), joka sisälsi 10¾ sikiöasteisen vasikan seerumia, ja jossa CSF-l-proteiinia muodostui 2000 - 6000 yksikköä/ml. Soluviljelmät pestiin, ja niitä inkuboitiin uudestaan seerumittomassa ympäristössä CSF-1-muodostumisen tukahduttamiseksi. Negatiivisten vertailujen tapauksessa CSF-l-proteiinia ei muodostunut ilmaistavissa olevia määriä vuorokauden tai parin kuluttua. Uudestaan indusoituja soluja saatiin lisäämällä forbol-myristiiniasetaattia (100 ng/ml), jolloin tuotanto useiden vuorokausien kuluttua oli 1000 - 2000 yksikköä/ml.

mRNA eristettiin hajottamalla solut isotonisessa puskurissa käyttämällä 0,5% NP-40-tuotetta ribonukleosidi-vanadyyli-komp-leksin läsnäollessa (Berger, S.L., et ai, Biochemistry (1979) 1^:5143), mitä seurasi uutto fenolilla ja kloroformilla, saos-taminen etanolilla ja oligo-dT-kromatografia, jolloin saatiin mRNArta runsaasti sisältävä preparaatti. Yksityiskohtaisemmin, solut pestiin kahdesti PBS-liuoksella (fosfaatilla puskuroitu suolaliuos) ja ne suspendoidaan uudestaan IHB-liuokseen (140 mM NaCl, 10 mM Tris, 1,5 mM MgCl^, dH 8), joka sisältää 10 mM vana-dyyli-adenosiini-kompleksia (Berger, S.L., et ai., edellä).

Etyleenioksidipolymeerin tyyppistä (NP-40) ei-ionista pinta-aktiivista ainetta lisätään pitoisuudeksi 0,5% solukalvojen hajottamiseksi, kuitenkaan tumakalvoja hajoittamatta. Tumat poistetaan sentrifugoimalla nopeudella 1000 x g 10 minuuttia. Tumien jälkeinen supernatantti lisätään kahteen tilavuuteen TE-liuoksella (10 mM Tris, 1 mM etyleenidiamiinitetraetikka-happoa (EDTA), pH 7,5), kyllästettyä fenolin ja kloroformin l:l-seosta, ja lisätään pitoisuudeksi 0,5% natriumdodekyyli-sulfaattia (SDS) ja 10 mM EDTAita. Supernatantti uutetaan uudestaan neljästi ja faasit erotetaan sentrifugoimalla nopeudella 2000 x g 10 minuuttia. RNA saostetaan lisäämällä NaCl-suolaa pitoisuudeksi 0,25 N, jonka jälkeen lisätään 2 tila 32 100972 vuutta 100/6 etanolia ja seisotetaan -20°C:n lämpötilassa. RNA-preparaattia sentrifugoidaan nopeudella 5000 x g 30 minuuttia, pestään 70% ja 100% etanolilla, ja kuivataan tämän jälkeen. Polyadenyloitunutta (poly A+) lähetti-RNA:ta (mRNA) saadaan koko sytoplasmisesta RNArsta kromatografoimalla oligo-dT-sellu-loosaa käyttäen (Aviv, J., et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. (1972) 69^:1408-1412). RNA liuotetaan ETS-liuokseen (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5% SDS, pH 7,5) pitoisuudeksi 2 mg/ml. Tätä liuosta lämmitetään 65°C:n lämpötilassa 5 minuuttia, jonka jälkeen se jäähdytetään nopeasti 4°C:n lämpötilaan. Sen jälkeen, kun RNA-liuoksen on annettu lämmetä huoneen lämpötilaan, siihen lisätään NaCl-suolaa pitoisuudeksi 0,4 M, ja se johdetaan hitaasti oligo-dT-selluloosalla täytetyn kolonnin läpi, joka kolonni on tasapainotettu edeltä käsin sitovalla puskurilla (500 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5, 0,05% SDS). Läpi virtaama johdetaan vielä kahdesti kolonnin läpi. Tämän jälkeen kolonni pestään 10 tilavuudella sitovaa puskuria. Poly A+-mRNA eluoidaan ETS-liuoksella, se uutetaan kertaalleen TErllä kyllästetyllä fenolin ja kloroformin seoksella, ja saostetaan lisäämällä siihen NaCl-suolaa pitoisuudeksi 0,2 M sekä 2 tilavuutta 100% etanolia. RNA saostetaan uudestaan kahdesti, pestään kertaalleen 70% ja sitten 100% etanolilla ennen kuivaamista.

Koko mRNA sentrifugoitiin 5-20 painoprosenttista sakkaroosigra-dienttia käyttäen liuoksessa, joka käsitti 10 mM Tris HC1, pH

7,4, 1 mM EDTA sekä 0,5% SDS, Beckman SW40-roottorilla 20°C:n lämpötilassa, nopeudella 27 000 rpm, 17 tunnin ajan. Tämän jälkeen mRNA-fraktiot otettiin talteen gradientista etanolilla seostamalla, ja ne injektoitiin Xenopus-varhaismunasoluihin (oosyytteihin) tavanomaisessa luentavaiheen kokeessa. RNA-fraktioilla saadut varhaismunasolutuotteet testattiin luuytimen lisääntymiskokeella (kuten on kuvannut Moore, R.N., et ai, J. Immunol.

(1983) 131:2374 ja Prystowsky, M.B., et ai, Am. J. Pathol.

(1984) 114:149), ja fraktiot itse testattiin käyttämällä piste-täplä-hybridisaatiota 32-meeriseen koettimeen, joka vastaa DNA:ta genomisen ketjun toisessa eksonissa (eksonin II koetin). (Kuvien 4 ja 5 päälleviivaukset esittävät eksonin II koetinta.) Näiden tulosten yhteenveto esitetään kuvassa 7.

33 100972

Kuvan 7A katkoviiva esittää Xenopus-oosyyteistä saatujen supernatant tien aiheuttamaa reaktiota luuytimen lisääntymiskokeessa; kuva 7B esittää piste-täplä-hybridisaation tulokset. Voimakkaimmin hybridisoituva fraktio 11 vastaa kokoa, joka on hieman suurempi kuin 18S-markkeri, kun taas aktiivisimmat fraktiot 8 ja 9 vastaavat arvoja 14-16S. Fraktioita 8, 9 ja 11 käytettiin rikastuneen cDNA-kirjaston muodostamiseen, kuten jäljempänä esitetään.

(mRNA jaettiin samoin fraktioihin denaturoivalla formaldehydi-geelillä, siirrettiin nitroselluloosalle, ja sen luotaamiseen käytettiin eksonin II koetinta. Tällöin löydettiin useita toisistaan erottuvia osia, joiden koko vaihteli alueella 1,5 - 4,5 kb, vaikka käytettiinkin ehdottomia hybiridisaation olosuhteita. Useiden, CSF-l-proteiinia koodaavien geenien mahdollisuuden poistamiseksi genominen DNA pilkottiin eri restriktioentsyymeillä, ja näillä pilkkeillä toteutettiin Southern'in täplitysmenetelmä, ja ne luodattiin käyttäen pcCSF-17 DNA:ta. Restriktiokuvio osoitti, että läsnä oli ainoastaan yksi CSF-l-proteiinia koo-daava geeni.)

Rikastettu mRNA-fraktio valmistettiin yhdistämällä ne gradient-tifraktioista 8 ja 9 saadut mENA-erät, joilla oli korkein luuydintä lisäävä aktiivisuus, vaikkakin niiden kyky hybridisoitua koet-timeen on suhteellisen alhainen (14S-16S) verrattuna fraktioon (11), joka h^bridisoituu voimakkaimmin koettimeen, joka on hieman suurempi kuin (18S). Molekyylipainoltaan suurempia fraktioita, jotka hybridisoitu-vat samoin eksonin II koettimeen, ei käytetty, koska vastaava mRNA indusoimattomista MIAPaCa-soluista hybridisoitui samoin eksonin II koettimeen.

cDNA-kirjastot valmistettiin kahdella tavalla joko ihmisen koko mRNArsta tai rikastetusta mRNArsta. Ensimmäisessä menetelmässä käytetään AgtlO-faagivektoreita, ja se kuvataan teoksessa Huynh, T.V., et ai, DNA Cloning Technigues: A Practical Approach IRL Press, Oxford 1984. D. Glover, toim.

34 100972

Edullisessa menetelmässä käytetään poly A-häntien oligo-dT-aloittamista sekä käänteistranskriptaasia AMV, ja tämä menetelmä kuvataan julkaisussa Okayama, H., et ai, Mol. Cell Biol. (1983) 3^:280-289, ja se liitetään oheen tällä viittauksella.

Tämä menetelmä johtaa täysipitkien kloonien suurempaan osuuteen kuin poly-dG-hännitys, ja siinä käytetään tehokkaasti isäntä-vektorina osia tässä julkaisussa kuvatusta kahdesta vektorista pcDVl ja pLl, joita on saatavana julkaisun laatijoilta. Tuloksena olevat vektorit sisältävät istutteen entsyymeiden BamHI ja XhoI läheisimmät (proksimaaliset) restriktiokohdat sisältävien vektorikappaleiden välissä; vektori sisältää plasmidista pBR322 replikaation alkupisteen, sekä Amp-vastustuskyvyn geenin ja SV40-viruksen säätävät elementit, jotka mahdollistavat sen, että vektori kykenee ilmentämään istutettuja ketjuja COS-7-soluissa.

Tämän jälkeen 300 000 kloonin kirjasto, joka saatiin Okayama'n ja Berg'in menetelmällä MIAPaCa-solujen edellä rikastetusta mRNArsta, luodattiin eksonin II koetinta käyttäen erittäin ehdottomissa olosuhteissa. Kymmenen koettimeen hybridisoituvaa pesäkettä otettiin talteen ja nämä pesäkkeet puhdistettiin.

Näistä klooneista määritettiin CSF-l-proteiinia koodaavien ketjujen läsnäolo ilmentämällä väliaikaisesti COS-7-soluissa. Kloonaavaa vektoria, joka sisältää SV40-promoottorin, käytettiin sellaisenaan COS-7-solujen transformointiin.

Plasmidi-DNA puhdistettiin 10 positiivisesta kloonista käyttäen CsCl-gradienttia, ja COS-7-solut transfektoitiin käyttäen muunnosta (Wang, A.M., et ai, Science (1985) 228:149) kalsiumfos-faatilla yhteissaostamiseen perustuvasta tekniikasta. Kolme vuorokautta kestäneen inkuboinnin jälkeen CSF-l-tuotanto määritettiin viljelmien supernatanteista radioreseptoreihin perustuvalla kokeella, joka toteutettiin olennaisesti julkaisussa Das, S.K., et ai, Blood (1981) 5jB:630 esitetysti, sekä pesäkkeiden kiihottumista (luuytimen lisääntyminen) mittavalla kokeella, joka toteutettiin olennaisesti julkaisussa Prystowsky, M.B., et ai, Am. J. Pathol. (1984) 114:149 kuvatulla tavalla.

35 100972

Yhdeksässä kymmenestä tarkastellusta kloonista ei todettu tilapäistä CSF-l-tuotantoa COS-7-soluissa. Yhtä kloonia, jonka todettiin ilmentyvän, viljeltiin, plasmidi-DNA-eristettiin ja järjestys istutteessa määritettiin. Tämä DNA-ketju, sekä siitä päätelty aminohappoketju, esitetään kuvassa 5. Täysipituinen cDNA on 1,64 kiloemäsparin kokoinen ja se koodaa 224 aminohaposta muodostuvaa täysinkehittynyttä CSF-l-proteiinia. Kloonista käytetään nimitystä CSF-17 ja sen Cetus-tallennusnumero on CMCC 2347, ja se tallennettiin kantakokoelmaan American Type Culture Collection kesäkuun 14. päivänä 1985, taltiointinume-rolla 53149. Plasmidista, joka käsittää CSF-l-proteiinia koo-daavan DNA-ketjun, käytetään nimitystä pcCSF-17.

E.4. CSF-l-proteiinin tilapäinen ilmentäminen Kloonista CSF-17 (pcCSF-17) saadun plasmidi-DNA:n ilmentyminen COS-7-soluissa varmistettiin ja kvantitoitiin käyttäen luuydin-ten lisääntymiseen perustuvaa koetta, pesäkkeiden stimulointi-koetta sekä radioreseptoreihin perustuvaa koetta. Muistutettakoon, että CSF-l-proteiinin määrittämiseen käytettävän, luuytimen lisääntymiseen perustuvan kokeen spesifisyys rajoittuu pelkästään CSF-l-antiseerumin kykyyn alentaa aktiivisuutta; ja pesäkkeiden stimulointikokeen spesifisyys saatujen pesäkkeiden luonteeseen. Molempien kokeiden perusteella CSF-1-tuotanto oli suuruusluokaltaan useita tuhansia yksiköitä mil-lilitraa kohden.

Luuytimen lisääntyminen

Luuytimen kiihottamiskokeessa, joka mittaa proteiinin biologista aktiivisuutta, Balb/C-hiiristä saatuja luuydinsoluja käsiteltiin 72 tunnin supernatanteista valmistetulla sarjalla laimennoksia, ja solujen lisääntyminen mitattiin merkityn t tymidiinin kulumisesta, olennaisesti julkaisuissa Moore, R.N., et ai, J. Immunol. (1983) 131:2374; Prystowsky, M.B., et ai,

Am. J. Pathol. (1984) 114:149 kuvatusti. Vertailuna käytettiin indusoiduista MIAPaCa-soluista saatua alustaa. CSF-l-proteiinin spesifisyys varmistettiin sillä perusteella, että ihmisen virtsasta saatua CSF-l-proteiinia vastaan muodostetut 36 100972 kaniinin antiseerumit kykenivät tukahduttamaan tymidiinin kulumisen. Taulukossa 1 esitetään tulokset, jotka on saatu plas-midilla pcCSF-17 transfektoitujen COS-7-solujen supernatanteil-la (CSF-17 supernatantti) 1:16-laimennoksena.

Taulukko 1 ^H-tymidiinin sisältyminen (cpm)

Ei lisäyksiä normaali anti-ihmisen-CSF-1 _ seerumi seerumi__ alusta 861 786 2682 MIAPaCa-supernatantti 12255 16498 3302 CSF-17-supernatantti 16685 21996 2324 (Anti-ihmisen-CSF-l-seerumi valmistettiin edellä mainitussa Das'in et ai. julkaisussa esitetyllä tavalla.) MIAPaCa-supernatantti (edellä käytettynä 1:16-laimennoksena) sisälsi 125 U/ml CSF-aktiivisuutta, mikä vastaa aktiivisuutta 2000 U/ml laimentamattomassa supernatantissa, jolloin 1 yksikkö pesäkkeitä stimuloivaa aktiivisuutta määritellään sellaiseksi CSF-määräksi, joka tarvitaan yhden pesäkkeen tuottamiseen 10^ luuydinsolusta millilitraa kohden kokeessa, joka kuvataan julkaisussa Stanley, E.R. et ai. J. Lab. Clin. Med. (1972) 79: 657.

Nämä tiedot osoittavat, että CSF-l-proteiiniin liittyy luuydin-soluja kiihottavaa aktiivisuutta, koska anti-CSF-l-seerumi inhiboi tymidiinin kulumisen. Tässä luuydinsolujen lisääntymiseen liittyvässä kokeessa neljällä laimennoksella, jotka ovat alueella 1:8 - 1:64, saatujen tulosten regressio antoi CSF-l-proteiinin arvioiduksi aktiivisuudeksi CSF-17-supernatanteissa 2385 U/ml, joka pieneni arvoon 424 U/ml antiseerumin läsnäollessa, mutta joka vaikutti kohoavan arvoon 3693 U/ml ei-immuuniseerumin läsnäollessa. Nämä tulokset ovat verrannolliset alla esitetyssä radioreseptoriin perustuvassa kokeessa saatuihin tuloksiin.

37 100972

Pesäkkeiden stimuloiminen CSF-17-supernatanttien suora testaaminen pesäkkeitä stimuloivan aktiivisuuden suhteen (Stanley, E.R., et ai, J. Lab. Clin. Med. edellä), antoi tulokseksi 4287 U/ml, johon ei-immuuniseerumin läsnäolo ei vaikuttanut olennaisesti, mutta joka aleni arvoon 0 U/ml kaniinin anti-ihmisen-CSF-l-seerumin läsnäollessa. Tätä voidaan verrata arvoon 2562 U/ml MIAPaCa-supernatanteissa. Kahdeksallakymmenelläviidellä prosentilla plasmidilla pcCSF-17 transformoitujen COS-7-solujen supernatanteilla indusoiduista pesäkkeistä oli yksitumainen morfologia; MIAPaCa-supernatantilla indusoiduissa pesäkkeissä todettiin suhde 94% makrofaageja -6% granulosyyttejä.

Radioreseptoriin perustuva koe 125

Radioreseptoreihin perustuva koe mittaa I-merkityn CSF-l-pro-teiinin ja testattavan yhdisteen välistä kilpailua J774.2-hiiren makrofaagisoluissa sijaitsevista spesifisistä reseptoreista. Standardina käytettiin MIAPaCa-supernatanttia, josta mitattiin edellä pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus (standardi: 2000 U/ml). CSF-l-pitoisuudeksi plasmidilla pcCSF-17 transformoitujen COS- 7-solujen supernatantissa todettiin 2470 U/ml 1:10-laimennoksena perustuen, ja 3239 U/ml 1:5-laimennoksena perustuen.

Täten kaikissa kokeissa saatiin toisiinsa verrannollisia arvoja CSF-l-proteiinin pitoisuudella plasmidilla pcCSF-17 transformoitujen COS-7-solujen supernatantissa.

E.5. CSF-l-proteiinin stabiili ilmentäminen COS-7-järjestelmällä saadaan aikaan yhdistelmä-CSF-l-proteiinia koska siinä vektoriketjut voivat replikoitua ja ilmentyä. Se on tilapäinen ilmentämisjärjestelmä.

Ihmisen CSF-l-ketju voidaan myös ilmentää stabiilisti (pysyvästi) prokarioottisissa tai eukarioottisissa järjestelmissä. Yleisesti, prokarioottisissa isännissä tuotanto on vaivatonta, kun taas eukariooteissa voidaan käyttää luonnollisia signaaliketjuja ja niissä voidaan toteuttaa toivottu luennan jälkeinen jatkokäsittely. Tämä saattaa olla erityisen tärkeätä CSF-l-proteiinin ta 38 100972 pauksessa, koska luonnollinen proteiini on dimeeri. Bakteerit tuottavat CSF-l:tä monomeerinä, joka olisi eristämisensä jälkeen käsiteltävä dimeroitumiseen johtavissa olosuhteissa.

Prokarioottinen ilmentäminen

Prokarioottiseksi ilmentämiseksi cDNA-klooni, tai esimerkiksi kohta-spesifisellä mutageneesillä leikattu, introneja käsittävä genominen ketju, muutetaan ATG-käynnistyskodonin sijoittamiseksi välittömästi ylävirran puolelle glutaamihaposta N-päätteessä, sekä Hindlll-kohdan sijoittamiseksi välittömästi ylävirran puolelle ATG-kodonista, jolloin saadaan aikaan käyttökelpoinen kohta tavanomaisiin, alla kuvattuihin, isäntäsoluihin sopiviin il-. mentämisvektoreihin istuttamista varten. Tämä voidaan toteuttaa suoraan käyttämällä istuttamiskohdalle spesifistä mutageneesiä ja synteettistä oligomeeriä, joka sisältää uuden, toivottua ketjua AAGCTTATG täydentävän ketjun, jota uutta ketjua reunustavat luonnollista johtoketjua ja N-päätteen koodaavia ketjuja täydentävät nukleotidiketjut.

Okayama'n ja Berg1 in menetelmää käyttäen saadun cDNA:n tapauksessa, koko koodaavan ketjun sisältävä DNA-kappale leikataan irti kloonista pcCSF-17 entsyymillä XhoI pilkkomalla (isännän kloonaavasta vektorista säilyneistä kohdista), eristetään aga-roosigeeliä käyttäen elektroforeettisesti, ja otetaan talteen sähköisesti eluoimalla. Mutageneesin toteuttamiseksi isäntänä toimivan bakteriogaafin Ml3mpl8 DNArta käsitellään samoin entsyymillä Sali, ja se ligatoidaan puhdistetun kappaleen kanssa tavanomaisissa olosuhteissa, ja transfektoidaan pakastettuun, kyvykkääseen E. coli K12-kantaan DG98. Solut maljataan alus-talle, joka sisältää 5 x 10 M yhtiöstä Sigma Chem. (St. Louis, - MO) saatua isopropyyli-tiogalaktosidia (IPTG) ja 40 ^ug/ml yhdistettä X-gal. TäydentämättÖmät valkoiset plakit siirretään uusille alustoille. Miniviljelmistä seulotaan odotetun kokoinen, yksijuosteinen, yhdistelmätekninen faagi-DNA, ja toivotun yhdis-telmäfaagin rakenne varmistetaan käyttäen restriktioanalyysiä.

34_meeri, joka täydentää CSF-l-ketjun osia koodaavaa N-päätteen ketjua ja johtoketjua, mutta joka sisältää toivotun ketjun 39 100972 AAGCTTATG täydentäjäketjun, syntetoidaan ja puhdistetaan kohdassa C.4. esitettyjen toimenpiteiden mukaisesti. Osa tästä 34-meerisestä preparaatista merkitään radioaktiivisesti käyttäen muunnosta Maxam'in ja Gilbert'in tekniikasta (Maxam, A., et ai. Methods in Enzymology (1980) 6j):521, Academic Press), kuten edellä kohdassa C.4. esitetään.

Mutageneesin toteuttamiseksi edellä valmistettu yhdistelmätekni-nen bakteeriofaagi eristetään C. coli Kl2-kannasta DG98, ja yksijuosteinen faagi-DNA puhdistetaan. Yksi pikomooli yksijuos-teista faagi-DNA:ta ja 10 pikomoolia edellä syntetoitua nukleo-tidialuketta (ei kinasoitu) kiinnitetään toisiinsa lämmittämällä 1 minuutin ajan 67°C:n lämpötilassa, ja sitten 30 minuuttia 37°C:n lämpötilassa liuoksessa, joka käsittää 15^ul 20 mM Tris-C1, pH 8, 20 mM MgC^, 100 mM NaCl, 20 mM 2-merkaptoetanolia. Kiinnitettyä DNArta inkuboidaan DNA-polymeraasin I (Klenow) ja 500^,uM dNTP-ryhmien kanssa 30 minuuttia 0°C:n lämpötilassa, jonka jälkeen seos lämmitettiin 37°C:n lämpötilaan. Näytteitä (0,05 tai 0,25 pmol) poistetaan 5 minuutin, 20 minuutin ja 45 minuutin kuluttua, transformoidaan E. coli Kl2-kantaan DG98, ja maljataan.

Kasvatuksen jälkeen maljat jäähdytetään 4°C:n lämpötilaan, ja plakit poistetaan maljoilta yhtiöstä Biodyne saaduilla Pall-kal-voilla tai S&S-suodattimilla (1-2 minuuttia ensimmäisen suodattimen, enemmän kuin 10 minuuttia toisen suodattimen tapauksessa). Suodattimet denaturoidaan liuoksessa, joka käsittää 2,5 M NaCl, 0,5 M NaOH (5 min.). Denaturoiva liuos neutraloidaan 3 M nat-riumasetaatilla pH-arvoon 5,5, tai käyttäen 1 M Tris-Cl-pusku-ria, pH 7,5, joka sisältää 1 M NaCl, suodattimia lämpökäsitel-lään 80°C:n lämpötilassa vakuumissa 1 tunti, jonka jälkeen ne . esihybridisoidaan erittäin ehdottomissa olosuhteissa. Tämän jälkeen suodattimien luotaamiseen käytetään edellä valmistettuja kinasoituja, synteettisiä 34-meerejä erittäin ehdottomissa olosuhteissa, suodattimet pestään ja niitä autoradiografoidaan yön yli -70°C:n lämpötilassa.

Toivotun mutatoituneen faagin RF-muotoa käsitellään entsyymillä EcoRI, sen päät tehdään tylpiksi Klenow-kappaleella, jonka jäi- 40 100972 keen se pilkotaan entsyymillä Hindlll geenin irrottamiseksi tylppänä Hindlll-kappaleena. (Täysin analogisesti voidaan saada CSF-l-proteiinia koodaava ketju plasmidista pMCSF, ja muuntaa se.) Tämän jälkeen ihmisen (tai hiiren) CSF-l-proteiinia koodaavan ketjun sisältävä kappale ligatoidaan entsyymeillä Hindlll ja BamHI (tylppä) pilkottuun plasmidiin pPLOP tai pTRP3 (katso alla) ATG-käynnistyskodonin sisältävän koodaavan ketjun sijoittamiseksi välittömästi alavirran puolelle P^- tai trp-promoot-torista, vastaavasti. Nämä tuloksena olevat plasmidit transformoidaan E. coli-bakteerin MC1000 lambda-lysogeeniin, MM294, ja soluja kasvatetaan indusoimattomissa olosuhteissa, jonka jälkeen ne indusoidaan promoottorille sopivin keinoin. Solut otetaan talteen sentrifugoimalla, sonikoidaan ja vapautunut CSF-1 tehdään liukoiseksi. Ihmisen (tai hiiren) CSF-l-pro-teiinin läsnäolo varmistetaan toteuttamalla sonikaatilla edellä esitetty pesäkkeiden kiihottamiskoe.

Eukarioottinen ilmentäminen

Okayama-Berg'in mukaista plasmidia pcCSF-17, joka sisältää ihmisen CSF-l-proteiinia koodaavan cDNA-ketjun SV40-promoottorin säätelyn alaisuudessa, voidaan myös käyttää pysyvän ilmentämisen toteuttamiseksi apinan CV-l-soluissa, joista edeltäjäsolu-linjana saatiin COS-7-solulinja. Isäntänä toimivat apinan CV-1-solut kasvatettiin yhteen, jonka jälkeen ne yhteistransfor-moitiin käyttäen lO^ug plasmidia pcCSF-17 sekä erilaisia määriä (1, 2, 5 ja lO^ug) plasmidia pRSV-NE02 (Gorman, C., et ai,

Science (1983) 221:551-553) 500 000 solua kohden. Transfor-mantteja kasvatettiin DMEM-alustalla, joka käsitti 10% FBS-alustaa, joka sisälsi puolestaan lOO^ug/ml G418-antibioottia, jonka vastustuskyvyn plasmidi pRSV-NE02 saa aikaan. CV-l-solu-linjassa G418-transformaation esiintymistiheydeksi todettiin r I λ zr 10 ' ^ pesäkettä 10 solua ja mikrogrammaa DNA:ta kohden.

CV-l-solut yhteistransformoitiin edellä kuvatusti, ja valikoitiin G418-antibioottia sisältävässä alustassa. Vastustuskykyiset pesäkkeet testattiin G418-antibiootille vastustuskykyisen fenotyypin stabiilisuuden suhteen kasvattamalla niitä ensin 41 100972 G418-antibioottia sisältämättömässä alustassa, jonka jälkeen ne palautettiin G418-antibioottia sisältävään alustaan. Näiden viljelmien kyvystä pysyä elossa sen jälkeen, kun ne on siirretty takaisin antibioottia sisältävään alustaan, voidaan päätellä, että pRSV-NE02-DNA oli yhtenäistynyt pysyvästi solun genomiin. Koska yhteistransfektoivan plasmidin DNA on yhtenäistynyt 50% todennäköisyydellä merkitsevällä plasmidilla pysyvästi transformoituneisiin soluihin, niin suurin piirtein puolet näistä soluista sisältää kromosomaalisessa DNArssaan plasmidin pCSF-17 DNA:n.

Useita G418-antibiootille vastustuskykyisten CV-l-solujen klooneja, jotka osoitettiin pysyvästi transformoituneiksi edellä esi-tetysti, otettiin talteen ja niitä viljeltiin kulloinkin kahdessa pullossa lähes toisiinsa yhtyviksi. Kaksinkertaisten viljelmien toinen pullo infektoitiin SV-40-viruksella infektiokertoimen ollessa 5, ja alusta otetaan talteen 6 vuorokauden kuluttua infektoinnista, ja siitä määritetään CSF-l-proteiinin läsnäolo 125 radioimmunokoetta käyttäen. Tämä immunokoe perustuu I-merki-tyn MIAPaCa CSF-l-proteiinin kilpailemiseen "kaniinin 52" poly-klonaalisesta antiseerumista, jota on muodostettu ihmisen virtsasta saatua, puhdasta CSF-l-proteiinia vastaan.

Tämän kokeen perusteella yhdessä valitussa CV-l-kloonissa CSF-1-tuotanto oli 2335 U/ml, kun taas soluissa, joita ei infektoitu SV40-viruksella, tämä tuotanto oli alle 20 U/ml. 10 mikrogrammalla faagia pcCSF-17 transformoiduissa, vertailuna toimivissa COS-7—soluissa CSF-l-tuotanto oli 2400 U/ml ilman SV40-viruk-sella infektoimista.

CSF-l-proteiinia tuottava CV-l-solulinja sisältää plasmidin pcCSF-17 DNA:n genomiinsa pysyvästi yhdentyneenä, ja näin ollen sitä voidaan käyttää CSF-l-proteiinin pysyvään tuotantoon SV40-viruksella infektoimalla. Infektion oletetaan "vapauttavan" plasmidin pcCSF-17 DNA:n genomista, ja saavan aikaan SV40-viruk-sen T-antigeenin, joka on välttämätön vapautetun DNA:n repli-koitumiselle. Genomiin yhtenäistynyt plasmidin pcCSF-17 DNA ei kykene ilmentymään tehokkaasti ilman SV40-infektiota.

42 100972 CSF-l-proteiinia koodaavan ketjun ilmentämisen optimoinnilla CV-1- (CSF-17) solulinjassa päästiin arvoon 6500 - 8000 U/ml radioimmunokokeella määritettynä 6 vuorokautta SV40-infektion jälkeen käyttäen infektiokertoimena vähintään arvoa 1, 10% FBS-alustassa. Ilmentymistason tutkimukset kertoimen ollessa 10 osoittavat tuotannon olevan aikaisempiin verrannolliseksi, mutta tuotanto aleni, kun FBS poistettiin alustasta vuorokauden kuluttua infektiosta.

Vaihtoehtoisesti, muita asianmukaisia säätelyjärjestelmiä ja isäntävektoreita, jotka mahdollistavat ilmentämisen eukarioot-tisissa isännissä, voidaan käyttää CSF-l-proteiinia koodaavien istutteiden saamiseksi. Esimerkiksi CHO-soluja ja sopivia vektoreita voidaan käyttää, mikä kuvataan US-patenttihakemuksessa, jonka sarjanumero on 438 991, jätetty marraskuun 1. päivänä 1982 samalle valtuutetulle, ja joka liitetään oheen tällä viittauksella .

E.6. CSF-l-proteiinin aktiivisuus CSF-l-proteiinin aktiivisuudelle saatiin lisämääritelmä käyttämällä osittain puhdistettua MIAPaCa-solujen CSF-l-proteiinia tai hiiren L-solujen CSF-l-proteiinia CV-l-soluissa tuotetun yhdistelmä-DNA-teknisen materiaalin malleina. CSF-l-proteiinin todettiin edistävän interferonin ja tuumorin necrosis-tekijän (TNF) tuotantoa indusoiduissa ihmisen monosyyteissä jopa 10-kertaisesti. Samoin osoitettiin, että CSF-1 kiihottaa myös makrofaagien tuumoreita vastaan kohdistuvaa toksisuutta.

TNF-tuotamon stimuloiminen ihmisen monosyyteissä MIAPaCa-solujen CSF-1 puhdistettiin supernatantista kalsiumfos-faattiin perustuvalla geelisuodatuksella ja linssikasvin lek-tiiniin perustuvalla kromatografisella käsittelyllä. Lymfokiini-tuotannon mittaamiseksi ääreisvereen tarttuvia soluja inkuboi- 7 tiin kulloinkin kahdessa pullossa, joista kukin sisälsi 10 solua. Yhden pullon sisältö käsiteltiin 1000 U/ml edellä esi-tetysti puhdistettua CSF-l-proteiinia. Solut otettiin talteen 3 vuorokauden kuluttua, ne pestiin ja suspendoitiin uudestaan solupitoisuudeksi 5 x 10 /ml, ja maljättiin 24-koloisille levyil- 43 100972 le, 0,5 ml koloa kohden. Koloja käsiteltiin 48 tunnin ajan liuoksilla 10 ^ug/ml LPS ja 20 ng/ml PMA, ja supernatantit otettiin talteen TNF-koetta varten. Todettiin, että CSF-proteii-nilla käsitellyissä soluissa TNFrää erittyi suurin piirtein 9 kertaa enemmän kuin käsittelemättömissä soluissa (1500 U/ml, verrattuna arvoon 162 U/ml).

Interferonin tuotannon stimuloiminen ihmisen monosyyteissä Analogisessa kokeessa, jolla määritetään CSF-l-proteiinin vaikutus interferonin muodostumiseen, ääreisvereen tarttuvia soluja inkuboitiin 3 vuorokautta siten, että läsnä oli 1000 U/ml CSF-1-proteiinia, sekä CSF-l-proteiinin puuttuessa, edellä kuvatusti. Solut otettiin talteen, suspendoitiin uudestaan pitoisuudeksi 5 x 10 , ja maljattiin 25-koloiselle levylle edellä esitetyllä tavalla. Solut indusoitiin interferonin muodostumiseksi lisäämällä niihin eri määriä poly-IC:tä. Supernatanteista määritettiin muodostunut interferoni niiden VSV-infektoituihin GM 2504-so-luihin kohdistuvan sytopaattisen vaikutuksen perusteella. CSF-l-proteiinilla stimuloiduissa soluissa tuotannon suuruudeksi todettiin 100 U/ml, kun solut indusoidaan 50 ^ug/ml suuruisella määrällä poly-IC:tä, kuten julkaisussa McCormick, F., et ai. Mol Cell Biol (1984) £:166 esitetään, kun taas tuotannon suuruus vastaavasti indusoiduissa, käsittelemättömissä soluissa oli alle 3 U/ml.

Myeloidisen CSF-tuotannon stimuloiminen ihmisen monosyyteissä Monosyyttejä inkuboitiin CSF-l-proteiinin läsnäollessa ja sen puuttuessa 3 vuorokautta, jonka jälkeen ne indusoitiin myeloidisen CSF-proteiinin muodostamiseksi taulukossa 2 esitetyllä tavalla. Näissä kolmessa esitetyssä edustavassa kokeessa käytettiin eri luovuttajilta saatua verta.

44 100972

Taulukko 2

Myeloidinen CSF (U/ml)

Induktio Koe 1 Koe 2 Koe 3

-CSF +CSF -CSF +CSF -CSF +CSF

Alusta 0 0 0 0 O O

0,1 ^ug/ml LPS - - 0 0 O 80+17 1 ^ug/ml LPS O 700+72 40+20 200+20 103+12 377+57 0,1 .ug/ml - - 617+50 993+101 1120+82 1280+60 LPS + 2 ng/ml

PMA

1 ,ug/ml LPS 283+42 983+252 360+92 1400+180 537+47 1080+122

+ 2 ng/ml PMA

2 ng/ml PMA - 370+17 297+6 183+15 380+52 716+76

Hiiren makrofaagin tuumorisoluja tappavan kyvyn stimuloiminen; Vertaaminen muihin pesäkkeitä stimuloiviin tekijöihin Makrofaagien kiihottumisen määrittämiseksi L-soluilla kunnostetusta alustasta saatua hiiren CSF-l-proteiinia käytettiin mallina plasmidilla pcCSF-17 yhdistelmä-DNA-teknisesti tuotetulle CSF-l-proteiinille kokeessa, joka osoittaa hiiren makrofaagien kyvyn tappaa sarkoomasoluja kiihottumisen. Tässä kokeessa C3H/HeN-hiiren normaaleja 2 tunnin kiinnittyviä vatsakalvon makrofaageja inkuboitiin 1 vuorokausi in vitro CSF-l-proteii-nin läsnäollessa tai sen puuttuessa, jonka jälkeen nämä solut 3 sekoitettiin suhteessa 20:1 H-tymidiinillä merkittyihin hiiren sarkoomasoluihin TU5 yhdessä gamma-interferonia sisältävän, conA-indusoidun (10 ^ug/ml) pernan lymfokiinin, 10 % tilavuus/tilavuus, kanssa. Merkityn tymidiinin vapautumista seuraavan 48 tunnin aikana käytettiin tuumorisoluja tappavan kyvyn mittana. Seuraavassa taulukossa esitetään CSF-l-lisäyksen vaikutus, käytettäessä 1200 U/ml CSF-l-proteiinia sisältävää, hiiren L-soluilla kunnostettua alustaa.

45 100972 Käsittely Tappamis-% Kasvu CSF-l-proteiinista vrk vrk _johtuen_ 0-1 0-3 % - - 13 LK 39 CSF-l+LK 49 26 CSF-1 LK 51 31 CSF-1 CSF-l+LK 60 54 - 3 LK 35 CSF-l+LK 47 34 CSF-1 - 7 CSF-1 LK 49 40 CSF-1 CSF-l+LK 69 97

Kyvyn tappaa kohdesoluja voitiin todeta kasvavan, lisättiinpä CSF-l-proteiinia 1 vuorokauden pituisen alustavan kasvatuksen aikana tai inkubointijakson aikana; kuitenkin dramaattisimmat vaikutukset olivat todettavissa, kun CSF-l-proteiinia oli läsnä näiden kummankin vaiheen aikana.

Se, että kontaminoiva bakteeriperäinen lipopolysakkaridi (LPS) olisi monosyyttien ja makrofaagien stimuloitumisen syynä, on mahdotonta: käytetyn CSF-l-proteiinin LPS-pitoisuus oli alhainen (< 0,3 ng/3000 U CSF-1, Limulus amoebosyytin lysaattiin perustuvalla kokeella määrittäen); aktiivisuus katosi käsiteltäessä anti-CSF-l-kolonnilla; LPS:n neutraloimiseen käytettiin polymyksiiniä B; C3H/HeJ-hiiristä saadut makrofaagit reagoivat CSF-l-proteiiniin, mutta eivät LPSrään.

CSF-GM eristettiin 6 hiiren keuhkoista, jotka saatiin 5 tuntia LPS:n 5 mikrogramman IV antamisen jälkeen. Keuhkot pilkottiin ja niitä inkuboitiin 3 vuorokautta seerumittomassa alustassa, ja CSF-1 poistettiin supernatantista käyttäen YYGl06-affiniteet tiko lonn ia (CSF-l-pitoisuus aleni arvosta 270 U/ml arvoon 78 U/ml). CSF-G eristettiin samalla tavalla käsitellystä 46 100972 seerumittomasta LDI-alustasta. Sekä CSF-GM- että CSF-G-pitoisuudeksi todettiin 2000 U/ml pesäkkeiden stimulointi-koetta käyttäen.

Vatsakalvon makrofaageja inkuboitiin joko jomman kumman edellä mainitun alustan 40 % kanssa tai L-solujen alustan, jonka CSF-l-pitoisuudeksi oli määritetty 2000 U/ml, kanssa, 1 vuorokauden ajan, jonka jälkeen niitä inkuboitiin 48 tuntia joko lisäalustan tai LK-liuoksen kanssa, ja niiden kyky tappaa TU5-soluja määritettiin edellä esitetysti. Tulokset esitetään kuvassa 6. TU5-soluihin kohdistuvan toksisuuden todettiin voimistuvan merkittävästi CSF-l-proteiinin vaikutuksesta, kun taas CSF-G- tai CSF-GM-proteiinilla ei ollut minkäänlaista vaikutusta.

Viruksia vastaan kohdistuvan aktiivisuuden stimuloituminen hiirissä_

Hiiren tarttuneita, tioglykolaatilla aiheutettuja makrofaageja inkuboitiin yhdessä CSF-l-proteiinin kanssa 3 vuorokautta, ja niitä infektoitiin VSVrllä yön yli. Koenäytteisiin lisättiin polymyksiiniä B, mikä salpaa interferonin LPS-induktion. Seuraava taulukko esittää tarttuneina pysyvien solujen värjäy-tymisen kiteisellä violetilla.

Taulukko 3 Käsittely Kiteinen violetti

- Polymyksiini B + Polymyksiini B (keskiarvo + stand. poikkeamaT

Alusta/ei VSVrtä 0,158+0,019

Alusta + VSV 0,583+0,02 0,049+0,009 CSF-1625 U/ml + VSV 0,139+0,018 0,177+0,04 1250 + VSV 0,167+0,06 0,205+0,07 2500 + VSV 0,160+0,06 0,219+0,04 5000 + VSV 0,150+0,03 0,202+0,06 Täten CSF-l:llä käsitellyt solut suojasivat makrofaageja VSV:tä vastaan.

47 100972 E. 7. CSF-l-proteiinin muodostaminen lääkeainevalmisteeksi Yhdistelmä-DNA-tekniikalla tuotettu ihmisen CSF-l-proteiini voidaan muodostaa lääkeainevalmisteeksi potilaalle antamista varten käyttäen tavanomaisia farmaseuttisia toimenpiteitä.

CSF-1 saatetaan tavallisesti injektoitavaan muotoon, ja sitä voidaan käyttää joko ainoana aktiivisena aineosana tai yhdessä muiden sellaisten proteiinien tai yhdisteiden kanssa, joilla on täydentävää tai samankaltaista aktiivisuutta. Näitä muita yhdisteitä voivat olla vaihtoehtoiset, tuumoria vastaan vaikuttavat aineet, kuten adriamysiini, tai lymfokiinit, esimerkiksi IL-1, -2 ja -3, alfa-, beeta- sekä gamma-interferonit ja tuumorin nekroosis-tekijä. Aktiivisen CSF-l-komponentin vaikutus voi voimistua tai parantua tällaisten muiden läsnäolevien komponenttien vaikutuksesta. Kuten edellä esitetään, CSF-1 voi vaikuttaa edullisesti asianmukaisiin verisoluihin, ja näin ollen tämän keksinnön mukaisiin valmisteisiin kuuluvat myös näitä soluja ja CSF-l-proteiinia sisältävät inkubointiseok-set, valinnaisesti muiden lymfokiinien läsnäollessa. Näistä in-kubaatioseoksista voidaan käyttää joko supernatantin muodostama fraktio, tai koko seos, joka sisältää myös solut.

F. Hiiren CSF-1

Hiiren CSF-l-proteiinia koodaava, introneja käsittämätön DNA-ketju valmistetaan käyttäen hiiren fibroblastista solulinjaa, joka tuottaa suuria määriä CSF-l-proteiinia. Kantakokoelmasta ATCC saatavaa L-929-solulinjaa käytetään mRNA-lähteenä cDNA-kirjaston tuottamiseksi. Proteiinin hiirissä esiintyvää muotoa koodaavan koko ketjun selvittämiseksi tämä cDNA-kirjasto luodataan käyttäen oligomeerisiä koettimia, jotka on muodostettu hiiren proteiinista tunnetun N-päätteen ja CNBr-pilkotun sisäisen peptidiketjun perusteella. Hiiren CSF-l-proteiinin uskotaan olevan suurin piirtein 80-prosenttisesti homologista ihmis-proteiinin kanssa, koska niiden N-päätteen ketjut ovat homologiset, koska sekä ihmisen että hiiren CSF-l-preparaatit kykenevät kiihottamaan makrofaagipesäkkeiden muodostumista luuydinsoluista, ja koska ne ovat rajoitetusti ristireaktiivisia radioreseptoreihin 48 100972 perustuvissa kokeissa ja radioimmunokokeissa (Das, S.K., et ai. Blood (1981) 58:630).

F.1. Proteiinin puhdistaminen

Hiiren CSF-1 puhdistettiin standardimenetelmillä, joiden kaltaisia kuvataan julkaisuissa Stanley, E.R. et ai. J. Immunol Meth (1981) 42: 253-284 ja Wang, F.F. et ai. J Cell Biochem (1983) 21:263-275, tai elektroforeettisesti SDS-geelin avulla, kuten yleiskatsauksessa Hunkapiller, M.W., et ai. Science (1984) 226:304 esitetään.

Hiiren ketjusta saatiin aminohapot 1-39 käyttäen hyväksi syano-geenibromidilla pilkkomista asemasta 10, mikä jatkaa hajotta-mistoimenpidettä. Hiiren proteiinista saatiin myös molekyylin sisäinen pilkkoutumiskappale, jonka järjestys selvitettiin.

Myös tietoutta hiiren koko proteiinin koostumuksesta saatiin, alla esitetysti. Nämä tiedot esittävät niiden aminohappojen, jotka saatiin hyvin talteen, täsmällisiä suhteellisia mooliosuuk-sia prosentteina: arvot eivät ole kuitenkaan absoluuttisia, koska histidiiniä ja kysteiiniä ei saatu talteen hyvällä saannolla.

Aminohappo Mooliosuus, % Jäännökset/125

Asp 20,1 25,1

Glu 20,0 25,0

His

Ser 6,0 7,5

Thr 5,9 7,4

Gly 5,4 6,8

Ala 6,8 8,5

Arg 3,0 3,8

Pro 6,7 8,4

Vai 5,3 6,6

Met 1,1 1,4

Ile 3,9 4,9

Leu 8,5 10,6

Phe 6,0 7,5

Lys 3,5 4,4

Tyr 4,1 5,1 49 100972

Muuntaminen yksiköiksi jäännökset/125 perustuu ketjun pituuden arviointiin molekyylipainon perusteella.

F.2. Hiiren CSF-l-proteiinia vastaavan cDNA-ketjun valmistaminen Hiiren CSF-l-proteiinin aminohappoketjua 5-13 ja molekyylin sisäistä ketjua käytettiin perustana koettimia muodostettaessa.

Kolme hiiren ketjua vastaavien oligomeerien joukkoa valmistettiin. Yksi ketju valmistettiin koodaamaan "aluetta A" -eli aminohappoja 9-13; toinen valmistettiin koodaamaan "aluetta B" - eli aminohappoja 5-9, kuten kuvassa 2 esitetään; kolmas ketju valmistettiin koodaamaan sisäisen ketjun asemia 0-6, eli "aluetta C". Kodonien toistuvuudesta johtuen kukin näistä oligomeerien luokista on erittäin degeneroitunut.

Täten,alueen A perusteella muodostettuja 15-meerejä on 48 kappaletta; alueen B perusteella muodostettuja 14-meerejä (joista histidiinikodonin viimeinen nukleotidi on hävitetty) on samoin 48 kappaletta; alueen C perusteella muodostettuja 20-meerejä on 32 kappaletta. Toisin sanoen, aluetta A koodaavaksi muodostetussa 15-meerissä neljä viidestätoista asemasta voi vaihdella; tietyn, aluetta B vastaavaksi muodostetun 14-meerissä 6 asemaa voi vaihdella; erityisessä, alueen C perusteella muodostetussa 20-meerissä viisi asemaa voi vaihdella.

Kuten jäljempänä esitetään, sopivia toimenpiteitä käyttäen, rikastunut lähetti-RNA-fraktio on löydettävissä hiiren toivotun, rikastuneen cDNA-kirjaston valmistamiseksi, ja täsmälleen oikeat, koettimina käyttökelpoiset oligomeerit saadaan varmistetuksi .

Koko lähetti-RNA uutetaan ja puhdistetaan hiiren L-929-soluis-ta. Hiiren L-929-soluja viljellään 8 vuorokautta DME-alustassa, jonka jälkeen ne otetaan talteen sentrifugoimalla. Koko sytoplasminen ribonukleiinihappo (RNA) eristettiin soluista sillä samalla menetelmällä, joka esitetään edellä MIAPaCa-solujen mRNArn yhteydessä.

50 100972 mRNA jaetaan fraktioihin geeleillä Northern'in täplitystä varten, kuten kohdassa C.3. esitetään. Aluetta A vastaavat 15-meeriset ketjut jaetaan neljään ryhmään, joissa kussakin on 12 oligomeeriä. Kutakin näistä ryhmistä käytettiin oligomee-rien hybridisoimiseksi heikosti ehdottomissa olosuhteissa sekä vertailuna toimiviin mRNA-geelilevyihin että hiiren L-929-soluista peräisin oleviin mRNA-levyihin, ja tuloksena olevat kuviot tehtiin näkyviksi autoradiografisesti. Käytetyissä heikosti ehdottomissa olosuhteissa koettimet hybridisoituvat fraktioihin, jotka eivät sisällä oikeata ketjua, sekä myöskin oikean ketjun sisältäviin fraktioihin. Samoin, koska vertailuna toimiva solulinja eroaa L-929-solulinjasta muussa suhteessa, kuin kyvyttömyytenä tuottaa CSF-l-proteiinia, niin hybridisoi-tumista tapahtuu lukuisiin sivukohtiin, jotka eivät liity CSF-l-proteiiniin L-929-solujen geeleillä, ja joita ei ole läsnä vertailuissa.

Vertailugeelien ja L-929-geelien verrannollisten sarjojen koetti-mina käytetään 48:stä aluetta B edustavista 14-meereistä erotettuja oligomeerejä sekä 32:sta aluetta C edustavista 20-meereis-ta erotettuja oligomeerejä. Tämän jälkeen huomioidaan ainoastaan lähetti-RNA:n ne vyöhykkeet, jotka hybridisoituvat yksinomaan L-929-geelilevyillä joko aluetta A tai B ja C vastaaviin koettimiin.

Se RNA-vyöhyke, joka jatkaa sitoutumistaan yhteen A-aluetta vastaavien 15-meerien seokseen tai yhteen aluetta B vastaavien 14-meerien seokseen ja yhteen aluetta C vastaavien 20-meerien seokseen jatkuvasti tiukentuvan ehdottomuuden olosuhteissa, valikoidaan.

Kun toivottu mRNA-vyöhyke on löydetty, kutakin alueeseen A perustuvan 15-meerin ryhmää käytetään koettimena ehdottomuudeltaan vaihtelevissa olosuhteissa. Se ryhmä, joka sitoutuu ehdottomimmissa olosuhteissa, sisältää oletettavasti oikean, tuotettua mRNA:ta täsmällisesti täydentävän 15-meerin. 15-meerin oikeus varmistetaan osittamalla oreparaattia edelleen 51 100972 niin kauan, kunnes löydetään yksi oligomeeri, joka sitoutuu ehdottomimmissa olosuhteissa. Samankaltaista menetelmää käytetään alueeseen B tai C sitoutuvan oikean 14-meerin tai 20-meerin varmistamiseksi. Tämän jälkeen näitä spesifisiä oligomeerejä voidaan käyttää koettimina hiiren cDNA-kirjastossa, joka valmistetaan rikastetusta mRNA-fraktiosta.

Tämän jälkeen mRNA-fraktio, jonka voidaan tunnistaa sisältävän CSF-l-proteiinia koodaava ketju, saadaan alustavasti. Tässä alustavassa preparaatissa poly A+-mRNA jaettiin fraktioihin sakkaroosigradientilla liuoksessa, joka käsitti 10 mM Tris-HC1, pH 7,4, 1 mM EDTA ja 0,5 % SDS. Sen jälkeen, kun näytteitä on sentrifugoitu Beckman SW40-roottorissa nopeudella 30 000 rpm 17 tuntia, mRNA-fraktiot otetaan talteen gradientista etanolilla saostamalla. Kukin gradientista talteen saatu RNA-fraktio injektoitiin Xenopus-varhaismunasoluihin tavanomaisessa luentaa selventävässä kokeessa, ja tuotteista määritettiin CSF-1 käyttäen radioimmunokoetta, joka perustui hiiren CSF-l-proteiinia vastaan tuotettuihin vasta-aineisiin. Ne fraktiot, joilla saatiin positiiviset tulokset, yhdistettiin, ja niitä käytettiin cDNA-kirjaston muodostamiseen. Nämä samat fraktiot hybridisoi-tuvat oligomeerisiin koettimiin.

Alalla tunnetaan luonnollisesti myös muita menetelmiä cDNA-kir jastojen valmistamiseksi. Eräässä nykyään klassisessa menetelmässä käytetään oligo-dT-aluketta, käänteiskopioivaa entsyymiä, kaksijuosteisen cDNA:n hännitystä poly-dG:llä, sekä kiinnittämistä sopivaan vektoriin, kuten pBR322 tai sen johdannaiseen, joka on pilkottu toivotusta restriktiokohdasta, ja hännitetty poly-dC:llä. Yksityiskohtainen kuvaus tästä vaihtoehtoisesta menetelmästä on löydettävissä esimerkiksi US-patentti-hakemuksesta 564 224, ja joka on jätetty joulukuun 20. päivänä 1983 ja joka liitetään oheen tällä viittauksella.

Ohessa käytetyssä menetelmässä rikastettu mRNA (5 ^,ug) denaturoidaan käsittelemällä sitä 10 mM metyylielohopealla 22°C:n lämpötilassa 5 minuuttia, jonka jälkeen toksisuus poistetaan 52 100972 lisäämällä 100 mM 2-merkaptoetanolia (Payvar, F., et ai. J Biol Chem (1979) 254:7636-7642). Plasmidi pcDVl pilkotaan entsyymillä Kpnl, hännitetään dTTP:llä ja kiinnitetään denaturoituun mRNArhan. Tätä oligo-dT-alukkeella varustettua mRNArta käsitellään käänteiskopioivalla entsyymillä, ja täten syntetoitunut DNA-juoste hännitetään dCTPrllä. Lopuksi, epätoivottu osa pcDVl-vektorista poistetaan entsyymillä Hindlll pilkkomalla.

Tästä erillään, pLl pilkotaan entsyymillä PstI, hännitetään dGTP:llä, pilkotaan entsyymillä Hindlll, ja sekoitetaan sitten poly-T-hännitettyyn mRNA/cDNA-kompleksiin, joka on jatkettu pcDVl-vektorin kappaleella, ligatoidaan E. coli-ligaasilla, ja seosta käsitellään DNA-polymeraasilla I (Klenow), E. coli-ligaasilla ja RNaasilla H. Tuloksena olevat vektorit trans- p formoidaan E. coli K12-kantaan MM294, Amp .

Tämän jälkeen tuloksena oleva cDNA-kirjasto seulotaan käyttäen niitä oligomeerisiä koettimia, jotka edellä tunnistettiin koo-daavaa mRNA-ketjua täydentäviksi. Pesäkkeet, jotka hybridisoi-tuvat alueista A tai B ja C saatuihin koettimiin, otetaan talteen ja niitä kasvatetaan; plasmidi-DNA eristetään ja ne plasmi-dit, joiden sisältämien istutteiden koko on riittävä koko CSF-1-ketjun koodaamiseksi, eristetään. Kussakin näissä plasmidissa olleen istutteen järjestys selvitetään, ja plasmidipreparaatis-ta, joka sisältää koko koodaavan ketjun mukaan lukien alueet A ja B ylävirran puoleisessa osassa, käytetään nimitystä pcMCSF.

F.3. Hiiren CSF-l-proteiinia vastaavan DNA:n ilmentäminen Edellä ihmisen cDNA:n yhteydessä kuvatulla tavalla hiiren cDNA testataan tilapäisen ilmentämisen suhteen COS-soluissa, ja sitä käytetään ilmentämiseen pysyvästi transformoidussa CV-l-soluissa. Tämän lisäksi asianmukaiset koodautuvat HindIII/ATG-ketjut istutetaan mutageneesin avulla ylävirran puolelle täysin kehittyneestä proteiinista ja koodaavat ketjut istutetaan klooneihin pPLOP tai pTRP3 prokarioottista ilmentämistä varten.

53 100972 G. Isäntävektorit pPLOP on isäntään tarkoitettu ilmentämisvektori, joka käsittää Pr-promoottorin ja N-geenin ribosomien sitoutumiskohdan restrik-tioentsyymin Hindlll pilkkomiskohdan vieressä, mikä mahdollistaa koodaavan ketjun, jossa ATG-käynnistyskodonia edeltää Hindlll-kohta, vaivattoman istuttamisen. Tämän vektorin runkona toimii lämpötilaherkkä, kloonista pCS3 saatu plasmidi, jonka kopioiden lukumäärä on suuri. pPLOP tallennettiin kantakokoel-maan ATCC joulukuun 18. päivänä 1984, ja sen tallennusnumero on 39947.

pTRP3 on isäntään tarkoitettu ilmentämisvektori, joka sisältää trp-promoottorin välittömästi ylävirran puolella entsyymin Hindlll restriktiokohdasta, mikä mahdollistaa koodaavan ketjun istuttamisen analogisesti edellä vektorin pPLOP yhteydessä esitetyllä tavalla. Vektorin pTRP3 runkona toimii pBR322. pTRP3 tallennettiin kantakokoelmaan ATCC joulukuun 18. päivänä 1984, ja sen tallennusnumero on 39946.

Vektorin pPLOP muodostaminen Replikaation alkupiste

Kloonista pCS3 saadaan replikaation alkupiste, joka saa aikaan isäntävektorin pPLOP kopioiden suuren lukumäärän korkeissa lämpötiloissa. Sen muodostaminen kuvataan yksityiskohtaisesti US-patenttihakemuksessa, jonka sarjanumero on 541 948, ja joka on jätetty lokakuun 14. päivänä 1983, ja joka liitetään oheen tällä viittauksella. pCS3 tallennettiin kesäkuun 3. päivänä 1982, ja sen tallennusnumero on ATCC 39142.

pCS3 saadaan klooneista pEW27 ja pOP9. pEW27 kuvataan julkaisussa E.M. Wong, Proc. Natl. Acad. Sei (USA) (1982) 79:3570.

Se sisältää reolikaation alkupisteensä läheisyydessä mutaatioita, jotka saavat aikaan sen, että lämpötila säätelee kopioiden lukumäärää. Näiden mutaatioiden seurauksena replikaatio johtaa kopioiden suureen lukumäärään korkeissa lämpötiloissa, mutta kopioiden pieneen lukumäärään alhaisissa lämpötiloissa.

54 100972 pOP9 on plasmidi, jonka kopioiden lukumäärä on suuri kaikissa lämpötiloissa, ja joka muodostettiin istuttamalla plasmidiin pBR322 EcoRI/PvuII-alkupisteen sisältävä kappale Col El-tyyp-pisestä plasmidista pOP6 (Gelfand, D., et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) (1978) 75.:5869)· Tämä kappale muunnettiin ennen istuttamista seuraavasti: 50^ug pOP6-plasmidia pilkottiin täydellisesti 20 yksiköllä sekä entsyymiä BamHI että entsyymiä Sstl. Sstl-entsyymistä johtuvien ulostyöntyvien 31-päiden poistamiseksi ja BamHI-entsyymin muodostamien 5'-päiden "täyttämiseksi" pilkottu plasmidin pOP6 DNA käsiteltiin E. coli DNA-polymeraa-silla I (Klenow) kaksivaiheisessa reaktiossa, ensin 20°C:n lämpötilassa Sstl-entsyymin tuottamien ensiintyöntyvien 3'-päiden eliminomiseksi ja sitten 9°C:n lämpötilassa 5'-pään muokkaamiseksi. Tylppäpäinen kappale pilkottiin ja 0,02 pikomoolia käytettiin kyvykkäiksi tehtyjen DG75-solujen transformoimiseen (O'Farrell, P., et ai. J. Bacteriology (1978) 134:645-654). Transformantit valikoitiin L-maljoilla, jotka sisälsivät 50^u/ml ampisilliinia, ja ne seulottiin 3,3 kiloemäsparin suuruisen häviämän, Sstl-kohdan katoamisen ja juuri muodostuneen BamHI-kohdan läsnäolon suhteen.

Yksi mahdollisista klooneista, josta käytetään nimitystä pOP7, valittiin, ja BamHI-kohta hävitettiin pilkkomalla 25^ug kloonia pOP7 20 yksiköllä entsyymiä BamHI, päät muokattiin E. coli DNA polymeraasin I kappaleella (Klenow), ja ligatoitiin uudestaan T4 DNA-ligaasilla. Kyvykkäät DG75-solut käsiteltiin 0,1 mikro-grammalla tätä DNA:ta, ja transformantit valikoitiin L-maljoilla, jotka sisälsivät 50yug/ml ampisilliinia. Mahdolliset kloonit seulottiin BamHI-entsyymin restriktiokohdan katoamisen suhteen. pOP8 valikoitiin. Kloonin pOP9 saamiseksi plasmidista pBR322 valmistettiin ja eristettiin Aval(muokattu)/EcoRI Tet kappale joka ligatoitiin kloonista pOP8 eristettyyn PvuII(osittainen)/ EcoRI-kappaleeseen, joka oli 3560 emäsparin kokoinen.

Ligatoitaessa 1,42 kiloemäsparin suuruista EcoRI/Aval (muokattu) TetR-kappaletta (kappale A) sekä 3,46 kiloemäsparin suuruista EcoRI/PvuII AmpR-kappaletta (kappale B) toisiinsa käytettiin 0,5^ug kappaletta B ja 4,5 ^ug kappaletta A kaksivaiheisessa reaktiossa, mikä on edullista EcoRI-päiden molekyylin sisäiselle ligatoitumiselle.

55 100972

Kyvykkäiden DG75-solujen transformointiin käytettiin 5^ul ligaa-tioseosta, ja transformantit valikoitiin ampisilliinia (50/Ug/ml) sisältävillä maljoilla. Kloonista pOP9, joka eristettiin Amp

O

Tet transformanteista, todettiin, että sen kopioiden lukumäärä oli suuri, se oli vastustuskykyinen kolisiinille, se käsitti yhden ainoan restriktiokohdan entsyymeille EcoRI, BamHI, PvuII, Hindlll, 2 restriktiokohtaa entsyymille Hindi, se oli kooltaan ja entsyymin Haelll pilkkoutumiskuvioiltaan asianmukainen.

Kloonin pCS3 saamiseksi 50^ug kloonin pEW27 DNA:ta pilkottiin täydellisesti entsyymeillä PvuII ja EcoRI. Samoin, 50^uG POP9-DNArta pilkottiin täydellisesti entsyymeillä PvuII ja EcoRI, ja 3,3 kiloemäsparin suuruinen kappale eristettiin.

0,36^ug (0,327 pikomoolia) pEW27-kappaletta ja 0,35^ug (0,16 pikomoolia) pOP9-kappaletta ligatoitiin ja käytettiin E. coli-

R R

kannan MM294 transformointiin. Amp Tet -transformantit valikoitiin. Toivotut pesäkkeet seulottiin aluksi 30°C:n ja 41°C:n lämpötilassa beeta-laktamaasia sisältävillä koemaljoilla, ja sitten 30 ja 41°C:n lämpötiloissa toteutetun kasvatuksen jälkeen plasmidi-DNA:n pitoisuuden suhteen. Toivotunlainen klooni, josta käytetään nimitystä pCS3, varmistettiin määrittämällä sen järjestys.

PrNdd.—istutteen valmistaminen L Kdo DNA-ketju, joka sisälsi PL~faagin promoottorin ja ribosomien sitoutumiskohdan N-geenistä (ND_„), saatiin kloonista pFC5, ja

Kdo lopulta pKC30:n johdannaisesta, joka kuvataan julkaisussa Shimatake ja Rosenberg, Nature (1981) 292:128. pKC30 sisältää 2,34 kiloemäsparin suuruisen kappaleen lambda-faagista, joka on kloonattu plasmidista pBR322 peräisin olevaan Hindlll/

BamHI-rajoitteiseen vektorikappaleeseen. P^-promoottori ja NnDo-kohta sijaitsevat pKC30-kloonissa Bglll- ja Hpal-kohtien välissä. pKC30:n johdannaisessa Bglll-kohta on muunnettu EcoRI-kohdaksi .

Välittömästi P -promoottoria edeltävä Bglll-kohta muunnettiin

Lj

EcoRI-kohdaksi seuraavasti: pKC30 pilkottiin entsyymillä Bglll, 56 100972 muokattiin Klenow-kappaleella dNTP-molekyylejä käyttäen, ja ligatoitiin T4-ligaasilla EcoRI-kytkijään (saatavana yhtiöstä New England Biolabs), ja transformoitiin E. coli K12-kantaan MM294 lambda . Plasmidit eristettiin Amp Tet transformanteis-ta ja toivottu ketju varmistettiin restriktioanalyysillä, sekä määrittämällä sen järjestys. Tuloksena oleva plasmidi pFC3 pilkottiin kaksinkertaisesti entsyymeillä PvuI ja Hpal suurin piirtein 540 emäsparin suuruisen kappaleen saamiseksi, joka kappale eristettiin ja käsiteltiin Klenow-kappaleella ja dATP:llä, ja sitten Sl-nukleaasilla tylppäpäisen kappaleen muodostamiseksi, jossa kappaleessa 3'-päätteen ketju on -AGGAGAA, missä -AGGAGA-osa on N___. Tämä kappale käsiteltiin restriktioentsyymillä EcoRI, jolla saatiin 347 emäsparin suuruinen DNA-kappale, jossa oli 5'-EcoRI-pää (tarttuva) ja Hinfl 3'-HinfI-pää (osittain muokattu , SI tylppä).

pFC5:n täydentämiseksi p gI-Z15-ketjua käytettiin Hindlll-kohdan muodostamiseen 3'-puolelle N -kohdasta. pgI-Z15 tallennettiin tammikuun 13. päivänä 1984, ATCC n:o 39578, ja se valmistettiin sulauttamalla plasmidiin pBR322 ketju, joka sisälsi ATG:n sekä 140 emäsparin pituisen, lac Z-operonin kanssa yhteensulautetun β-IFN-ketjun. Kloonissa ρβΙ-Ζΐ5 plasmidin pBR322 EcoRI-kohta on säilynyt, ja istute sisältää Hindlll-kohdan välittömästi ennen g-IFN:n ATG-käynnistyskodonia. ρβΙ-Ζ15 käsiteltiin restriktioentsyymillä Hindlll, muokattiin Klenow-kappaleella dNTP-molekyylejä käyttäen, ja pilkottiin sitten entsyymillä EcoRI. Tuloksena oleva (muokattu) EcoRI/Hindlll-vektorikappale ligatoitiin edellä saatuun (muokattuun) EcoRI/HinfI-kappaleeseen, ja tällä ligaatioseoksella transformoitiin solut MC1000-39531. Toivotunlaisen muodosteen sisältävät transformantit tunnistettiin sillä perusteella, että ne kykenevät kasvamaan laktoosia sisältävillä vähimmäismaljoilla 34°C:n lämpötilassa mutta eivät 30°C:n lämpötilassa. (Transformantit maljattiin X-gal-Amp-maljoille 30 ja 34°C:n lämpötilassa, ja laktoosiin perustuville vähimmäisalustoille 30 ja 34°C:n lämpötilassa. Oikealla tavalla muodostuneet transformantit ovat sinisiä X-gal-Amp-maljoilla kummassakin lämpötilassa, mutta ne kasvavat laktoosiin perustuvilla vähimmäismaljoilla ainoastaan 34°c:n lämpötilassa.) Toivotusta muodosteesta käytetään nimitystä pFC5.

57 100972 pPLOP:n täydentäminen Tämän jälkeen kloonia pCS3 muunnettiin säätävien PL~ ja NRBS~ ketjujen saamiseksi. pCS3 pilkottiin ensin entsyymillä Hindlll ja sitten entsyymillä EcoRI. Vektorikappale ligatoitiin kloonista pFC5 peräisin olevan, eristetyn EcoRI/Hindlll-kappaleen, joka sisälsi PTN c-osan, kanssa, ja transformoitiin E. coli-kantaan MM294. Eristetyn plasmidi-DNA:n oikea rakenne varmistettiin restriktioanalyysillä ja selvittämällä järjestys, ja plasmidista käytetään nimitystä pPLOP.

pTRP3:n valmistaminen

Jotta voitaisiin valmistaa isäntävektori, joka sisältää säätävät trp-ketjut Hindlll-kohdan jälkeen, ketju, joka käsitti trp-promoottorin, operaattorin ja ribosomien sitoutumiskohdan, mutta josta puuttuu vaimentava alue, saatiin plasmidista pVH153, joka oli puolestaan peräisin tutkijalta C. Yanofsky, Standford University. Trp-ketjuja on saatavana monista tällaisista alalla tunnetuista plasmideista. pVH153 käsiteltiin entsyymillä HhaI (joka katkaisee ketjun siten, että paljaat, tarttuvat 3'-päät sijaitsevat juuri 5'-pään puolella trp-promoottorista) tehtiin tylpäksi Klenow-kappaleella, ja pilkottiin osittain entsyymillä TaqI. 99 emäsparin kappale, joka vastaa restriktiota Taql-koh-dassa, trp-johtoketjun ATG-käynnistyskodonia edeltävät 6 nukleotidiä eristettiin, ja ligatoitiin entsyymeillä EcoRI (muokattu) ja Clal pilkottuun plasmidiin pBR322 plasmidin pTRP3 muodostamiseksi .

Tämän hakemuksen laatijat ovat tallentaneet huhtikuun 2. päivänä 1985 kantakokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) faagin pHCSF-1 E. coli-kannassa DG98, tal-• letusnumerolla 40177. Toukokuun 21. päivänä 1985 faagi pHCSF-la, josta käytetään nimitystä CMCC 2312 Cetus-kokoelmassa ja nimitystä pHCSF-1 λ Charon 4A tallentamista varten, tallennettiin kanta-kokoelmaan ATCC tunnusnumerolla 40185. Kesäkuun 14. päivänä 1985 CSF-17 E. coli-kannassa MM294, josta käytetään nimitystä CMCC 2347, tallennettiin kantakokoelmaan ATCC, ja sen tallennus-numero on 53149. Nämä taltioinnit tehtiin Budapestin sopimuksen mukaisesti, joka sopimus kohdistuu patenttialaa varten tallennettujen mikro-organismien kansainväliseen tunnustamiseen (Budapest „ 100972

DO

Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure), sekä tässä sopimuksessa esitettyjen säädösten mukaisesti. Tämä varmistaa elävien viljelmien säilymisen 30 vuotta tallennuksen päivämäärästä. Talletettuja mikro-organismeja on saatavana kantakokoelmasta ATCC Budapestin sopimuksen mukaisesti hakijoiden ja ATCC:n välisen suostumuksen ehdoilla, millä taataan tallennusten jatkuva ja rajoittamaton saatavuus asiaa käsittelevän US-patentin myöntämisestä lähtien. Oheinen valtuutettu lupaa huolehtia siitä, että jos tallennettu viljelmä kuolee, häviää tai tuhoutuu sopivissa olosuhteissa viljelemisestä huolimatta, niin kyseinen viljelmä korvataan huomautettaessa välittömästi saman viljelmän elävällä näytteellä. Tallennettujen organismien saatavuutta ei pidä tulkita luvaksi toteuttaa tämä keksintö siten, että kyseessä olevan hallituksen patenttilakiensa puitteissa antamat oikeudet rikotaan.

Tämä keksintö ei rajoitu edellä esitettyihin havainnollistaviin suoritusmuotoihinsa, vaan se määritellään liitteenä olevissa patenttivaatimuksissa.

Claims (16)

100972

1. Isolerad DNA-sekvens, kännetecknad av att den kodar antin-gen för en polypeptid med aminosyrasekvensen i resterna 1 tili 224 säsom visas i fig. 5 eller en modifikation av nämnda amino-syrasekvens genom deletion, addition eller förändring, förut-satt att dimerer av nämnda modifierade polypeptidsekvens stimu-lerar bildningen av framför allt makrofagkolonier vid CSF-1-analysen in vitro.

1. Eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa joko polypeptidiä, jonka tähteiden 1-224 aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 5, tai mainitun aminohapposekvenssin modifikaatiota, jossa on deleetio, additio tai muuntelu, edellyttäen, että mainitun modifioidun polypeptidisekvenssin dimeerit stimuloivat ensisijaisesti makrofagipesäkkeiden muodostumista in vitro CSF-1-analyysissä.

2. DNA-sekvens enligt patentkrav l, kännetecknad av att den kodar för hioman CSF-L.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa ihmisen CSF-1-proteiinia.

3. DNA-sekvens enligt patentkrav 2, kännetecknad av att poly-peptiden har en aminosyrasekvens som i huvudsak är ekvivalent med den hos nativt humant mCSF-l-protein.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että polypeptidin aminohappoketju on olennaisesti sama kuin ihmisen natiivin mCSF-1-proteiinin.

4. DNA-sekvens enligt patentkrav 2, kännetecknad av att an-tingen: (a) human CSF-1 har en aminosyrasekvens, som karakteriseras av deletionen eller den konservativa substitutionen av en eller 100972 flera aminosyror som är belägna mellan positionerna 158 och 224 inkluderade i CSF-l säsom visas i fig. 5; eller (b) human CSF-l har en aminosyrasekvens, som karakteriseras av deletion eller konservativ substitution av en eller flera av aminosyrorna i positionerna 51 och 52 och/eller positionerna 191, 192 och 193 i mSCF-1 säsom visas i fig. 5; eller (c) human CSF-l har en aminosyrasekvens, som karakteriseras av deletion eller konservativ substitution av en eller flera av aminosyrorna i position 15-20 och/eller positionerna 75 till 84 i mCSF-l säsom visas i fig. 5; eller (d) human CSF-l har en aminosyrasekvens, som karakteriseras av deletion eller substitution av tyrosinresten i position 59 i mCSF-l säsom visas i fig. 5.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että joko (a) ihmisen CSF-l:llä on aminohappoketju, jolle on tunnusomaista, että siinä yksi tai useampi, kuviossa 5 esitetyssä mCSF-1-ketjussa asemien 150 ja 224 välissä sijaitseva aminohappo on hävinnyt tai korvautunut konservatiivisesti; tai (b) ihmisen CSF-l:llä on aminohappoketju, jolle on tunnusomaista, että siinä yksi tai useampi kuviossa 5 esitetyssä mCSF-l-ketjussa asemissa 51 ja 52 ja/tai asemissa 191, 192 ja 193 sijaitseva aminohappo on hävinnyt tai korvautunut konservatiivisesti; tai (c) ihmisen CSF-l:llä on aminohappoketju, jolle on tunnusomaista, että siinä yksi tai useampi kuviossa 5 esitetyssä mCSF-1-ketjussa asemissa 15-20 ja/tai asemissa 75-84 sijaitseva aminohappo on hävinnyt tai korvautunut konservatiivisesti; tai (d) ihmisen CSF-l:llä on aminohappoketju, jolle on tunnusomaista, että siinä yksi tai useampi kuviossa 5 esitetyssä mCSF-l-ketjussa asemassa 59 sijaitseva tyrosiinijäännös on hävinnyt tai korvautunut konservatiivisesti.

5. DNA-sekvens enligt patentkrav 2, kännetecknad av att human CSF-l har en aminosyrasekvens, som är vald bland proteiner mCSF-l, V15g-CSF-l och aspJ9CSF-l.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että ihmisen CSF-l:llä on aminohapposekvenssi, joka va- 100972 Iitaan proteiinien mCSF- ^158" CSF-1, ja asp59CSF-l muodostamasta ryhmästä.

6. DNA-sekvens enligt patentkrav l, kännetecknad av att CSF-l har aminosyrasekvensen i nativ murin CSF-l.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että CSF-1:llä on hiiren luonnollisen CSF-1:n aminohap-poketju.

7. DNA-sekvens enligt patentkrav l, kännetecknad av att den kodar för ett protein i en aminosyrasekvens kodad i den fag, som erhälles frän ATCC 40185 eller den plasmid, som erhälles frän ATCC 53149.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa proteiinia, jolla on faagiin, jota on saatavissa ATCC 40185:stä, tai plasmidiin, jota on saatavissa ATCC 53149:stä, koodattu aminohapposekvenssi.

8. DNA-sekvens enligt patentkrav l, kännetecknad av att CSF- 1-polypeptid har en N-terminal aminosyrasekvens, som innefattar en sekvens vald frän Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Ser-Gly-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu Ile-Asp-Ser-Gln-Met-Glu-Thr-Ser-Cys-Gin-lie-Thr-Phe-Glu-Phe-Val-Asp-Gin-Glu-Gin-Leu och Lys-Glu-Val-Ser-Glu-His-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Asn-Gly-His-Leu-Lys-Val-Leu-Gln-Gln-Leu-Ile-Asp-Ser-Gln-Met-Glu-Thr-Ser.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että CSF-1-polypeptidin N-päätteen aminohappoketju valitaan ketjuista Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Ser-Gly-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-Ser-Gln-Met-Glu-Thr-Ser-Cys -Gln-Ile-Thr-Phe-Glu-Phe-Vai-Asp-Gin-Glu-Gin-Leu ja Lys-Glu-Val-Ser-Glu-His-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Asn-Gly-His-Leu-Lys-Val-Leu-Gln-Gln-Leu-Ile-Asp-Ser-Gln-Met-Glu-Thr-Ser.

9. DNA-sekvens enligt patentkrav 1, kännetecknad av att den är upptagen i en klon, som kan erhällas frän ATCC 40185 eller en klon som kan erhällas frän ATCC 53149. „ 100972 6 3

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se on sisällytetty klooniin, jota on saatavissa ATCC 40185:stä, tai klooniin, jota on saatavissa ATCC 53149:stä.

10. Replikerbar kloningsvektor, kannetecknad av att den inklu-derar en DNA-sekvens enligt nägot av patentkraven 1 till 3.

10. Replikoituva kloonausvektori, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukaisen DNA-sekvenssin.

11. Replikerbar kloningsvektor, kännetecknad av att den inne-fattar DNA-sekvensen som definieras i patentkrav 8 och en rep-likon som är operativ i en encellig organism.

11. Replikoituva kloonausvektori, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksessa 8 määritellyn DNA-sekvenssin ja replikonin, joka toimii yksisoluisessa organismissa.

12. Expressionssystem, kännetecknad av att det innefattar DNA:et enligt nägot av patentkraven 1 till 3, funktionsmässigt bundet till lämpliga kontrollsekvenser.

12. Ilmentymissysteemi, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaisen DNA:n, joka on toiminnallisesti yhdistetty sopiviin kontrollisekvensseihin. 100972

13. Expressionssystem enligt patentkrav 12, kännetecknat av att det är upptaget i en vektor som har förmäga till replika-tion en lämplig värdcell.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen ilmentymissysteemi, tunnettu siitä, että se on sisällytetty vektoriin, joka kykenee replikoitumaan sopivassa isäntäsolussa.

14. Rekombinanta värdceller transformerade med expressionssys-temet enligt patentkrav 13.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukaisella ilmentymissysteemillä transformoidut yhdistelmäisäntäsolut.

15. Menetelmä CSF-1-proteiinin valmistamiseksi, joka proteiini stimuloi ensisijaisesti makrofagipesäkkeiden muodostumista in vitro, tunnettu siitä, että (a) isäntäsolu transformoidaan kuvion 5 mukaisella DNA:11a tai sen fragmentilla ja CSF-l-proteiini ilmentyy DNA:sta, tai (b) viljellään patenttivaatimuksen 14 mukaisia soluja.

16. Menetelmä solujen tekemiseksi kykeneviksi ilmentämään CSF-l:tä, tunnettu siitä, että transformoidaan isäntäsolut patenttivaatimuksen 13 mukaisella ilmentämissysteemillä.

15. Förfarande för framställning av ett CSF-l-protein, vilket stimulerar bildningen av primärt makrofaga kolonier in vitro, kännetecknat av att a) värdcellen transformeras med DNA:et enligt fig. 5 eller en fragment därav och CFS-l-proteinet uttrycks frän DNA:et; eller b) odlas celler enligt patentkrav 14.

, 16. Metod för framställning av celler med förmäga att uttrycka CSF-1, kännetecknad av att värdceller transformeras med ett expressionssystem enligt patentkrav 13.