DE3689391T2

DE3689391T2 - Rekombinanter koloniestimulierender faktor-1.

Info

Publication number: DE3689391T2
Application number: DE3689391T
Authority: DE
Inventors: Mazie Y. Pleasanton Ca 94566 Coyne; Ernest S. Richmond Ca 94804 Kawasaki; Martha B. Richmond Ca 94804 Ladner; Peter Orinda Ca 94563 Ralph; Janelle N. Richmond Ca 94804 Van Arsdell; Alice M. Walnut Creek Ca 94596 Wang; Mary K. San Leandro Ca 94577 Warren
Original assignee: Cetus Oncology Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1985-02-05
Filing date: 1986-02-03
Publication date: 1994-06-30
Anticipated expiration: 2006-02-04
Also published as: US5470569A; FI864016A; NO863952L; FI100972B; BG49941A3; NO179109B; DK172843B1; AU594045B2; JP2561255B2; NO863952D0; NO179109C; EP0209601A1; JPH07163391A; IL77789A; AU626639B2; AU5013090A; DE3689391D1; JP2553829B2; JPS62501607A; DK474686A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung rekombinanter Technologie zur Herstellung von gewöhnlich in geringer Konzentration hergestellten Lymphokinen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Clonierung und Expression einer den menschlichen Kolonie-stimulierenden Faktor-1 (CSF-1 codierenden DNA-Sequenz.
Seit etwa 15 Jahren ist die Fähigkeit bestimmter, in sehr geringer Konzentration in verschiedenen Geweben hergestellter Faktoren bekannt, das Wachstum und die Entwicklung von Knochenmarks-Vorläuferzellen zu Granulocyten und/oder Makrophagen zu stimulieren. Die Gegenwart derartiger Faktoren in Seren, Urinproben und Gewebeextrakten einiger Spezies kann mittels eines die Stimulierung der Koloniebildung von auf halbfestem Kulturmedium plattierten Knochenmarkszellen messenden in vitro Tests nachgewiesen werden. Es ist kein in vivo Test bekannt. Da diese Faktoren die Bildung derartiger Kolonien induzieren, wurden sie unter dem Namen Kolonie-stimulierende Faktoren (CSF) zusammengefaßt.
Kürzlich wurde gezeigt, daß es mindestens vier Unterklassen menschlicher CSF-Proteine gibt, die sich gemäß der in den erhaltenen Kolonien gefundenen Zelltypen bestimmen lassen. Eine Unterklasse, CSF-1, führt hauptsächlich zu Makrophagen enthaltenden Kolonien. Andere Unterklassen produzieren neutrophile Granulocyten und Makrophagen, hauptsächlich neutrophile Granulocyten oder neutrophile und eosinophile Granulocyten und Makrophagen enthaltende Kolonien.
Zu den ersten drei vorstehenden menschlichen CSFs existieren analoge Maus-Faktoren. Zusätzlich gibt es einen IL-3 genannten Maus-Faktor, der aus Maus-Knochenmarkszellen all diese Zelltypen sowie Megakaryocyten, Erythrocyten und Mastzellen in verschiedenen Kombinationen enthaltende Kolonien induziert. Diese CSFs wurden von Dexter T.M. (Nature 309 (1984), 746) und Vadas M.A. et al. (J. Immunol. 130 (1983), 793) beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft die rekombinante Herstellung von zu der ersten dieser Unterklassen, CSF-1, gehörenden Proteinen. Diese Unterklasse wurde mittels spezifischer Radioimmun- und Radiorezeptor-Tests weiter charakterisiert und abgegrenzt, beispielsweise sind gegen gereinigten CSF-1 gerichtete Antikörper zur spezifischen Unterdrückung der CSF-1 Aktivität fähig, ohne die biologischen Aktivitäten der anderen Unterklassen zu beeinträchtigen. Ein anderes Beispiel ist die Makrophagen-Zellinie J774, die CSF-1 spezifisch bindende Rezeptoren enthält. Eine Beschreibung dieser Tests wurde von Das S.K. et al. (Blood 58 (1981), 630) veröffentlicht. Reinigungsverfahren für verschiedene CSF-Proteine sind in den folgenden Abschnitten beschrieben und wurden veröffentlicht. Stanley E.R. et al. (J. Biol. Chem. 252 (1977), 4305) berichten von der Reinigung eines ebenfalls hauptsächlich die Makrophagenproduktion stimulierenden CSF-Proteins aus Maus- L929-Zellen zu einer spezifischen Aktivität von etwa 1 · 10&sup8; "Units"/mg. Waheed A. et al. (Blood 60 (1982), 238) beschreiben die Reinigung von Maus-L-Zellen-CSF-1 mittels einer Kaninchen-Antikörper-Säule zu scheinbarer Homogenität und offenbaren die ersten 25 Aminosäuren der Maussequenz (Ben- Avram C.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 882 (1985), 4486).
Stanley E.R. et al. (J. Biol. Chem. 252 (1977)) 4305-4312, offenbaren ein Reinigungsverfahren für CSF-1 aus menschlichem Urin und Das S.K. et al. (Blood 58 (1981), 630, J. Biol. Chem. 257 (1982), 13679) erhielten einen menschlichen, nur Makrophagenkolonien produzierenden Urin-CSF-1 mit einer spezifischen Aktivität von 5 · 10&sup7; U/mg. Sie zeigten das Verhältnis von Glykosylierung der aus kultivierten Maus-L-Zellen und menschlichem Urin hergestellten CSF-1-Proteine zu ihren Aktivitäten auf. Wang F.F. et al. (J. Cell. Biochem. 21 (1983), 263) isolierten menschlichen Urin-CSF-1 mit einer spezifischen Aktivität von 108 U/mg. Waheed A. et al. offenbarten die Reinigung von menschlichem Urin-CSF-1 mittels einer Kaninchen-Antikörper-Säule zu einer spezifischen Aktivität von 0.7-2.3 · 10&sup7; U/mg (Exp. Hemat. 12 (1984), 434).
Wu M. et al. (J. Biol. Chem. 254 (1979), 6226) beschreiben die Präparation eines CSF-1-Proteins aus menschlichen kultivierten Pankreaskarzinom-Zellen (MIAPaCa), die zum Wachstum von Maus-Granulocyten- und Makrophagen-Kolonien führten. Das erhaltene Protein wies eine spezifische Aktivität von etwa 7 · 10&sup7; U/mg auf.
Beschrieben sind auch teilweise gereinigte Präparationen verschiedener CSFs aus Menschen- und Maus-Lungenzell-konditionierten Medien (Fojo S.S. et al., Biochemistry 17 (1978), 3109; Burgess A.W. et al., J. Biol. Chem. 252 (1977), 1998; aus menschlichen T-Lymphoblasten-Zellen (Lusis A.J. et al., Blood 57 (1981), 13; U.S. Patent 4,438,032); und aus Menschen-Plazenta konditioniertem Medium mit scheinbarer Homogenität und einer spezifischen Aktivität von 7 · 10&sup7; U/mg (Wu M. et al., Biochemistry 19 (1980), 3846).
Eine besondere Schwierigkeit, CSF-Proteine allgemein und CSF- 1 insbesondere für irgendeine brauchbare Funktion einzusetzen, bestand darin, daß sie nicht in ausreichenden Mengen in unterscheidbarer, charakterisierbarer Form verfügbar waren, um ihre therapeutische Anwendung ausführbar oder möglich zu machen. Die vorliegende Erfindung hilft diesen Mängeln ab, indem sie mittels rekombinanter Techniken gereinigten menschlichen und Maus-CSF-1 in brauchbaren Mengen bereitstellt.
Ein CSF-Protein einer anderen Unterklasse, das Maus- und menschliche GM-CSF wurde gereinigt und die cDNAs cloniert. Es wurde gezeigt, daß sich dieses Protein von anderen CSFs, z. B. CSF-1 unterscheidet (Gough et al., Nature 309 (1984), 763- 767). Maus-IL-3 wurde von Fung M.C. et al. (Nature 307 (1984), 233) cloniert (siehe auch Yokota T. et al., PNAS 81 (1984), 1070-1074; Wong G.G. et al., Science 228 (1985), 810-815; Lee F. et al., PNAS 82 (1985), 4360-4364; und Cantrell M.A. et al., PNAS 82 (1985), 6250-6254).

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinantes CSF-1-Protein, einschließlich der biologisch aktiven Proteine, die Modifikationen der primären Aminosäuresequenz des nativen Proteins enthalten. Das CSF-1-Protein kann in rekombinanter Form in großer Menge erhalten werden. Es kann durch Regulation des vom Wirt bereitgestellten posttranslationalen Prozessierens und zielgerichtet auf genetischer oder Protein-Ebene vorteilhaft modifiziert werden, um seine gewünschten Eigenschaften zu verstärken. So sind beispielsweise Deletionen von wesentlichen Teilen des carboxyterminalen Drittels des Polypeptids aufweisende Muteine aktiv. Demgemäß liefert die Verfügbarkeit von CSF-1 in rekombinanter Form Flexibilität und bestimmte quantitative Vorteile, die therapeutische Verwendungen des Proteins ermöglichen. Diese Vorteile treffen hinsichtlich des nativen Proteins nicht zu.
Die Erfindung betrifft außerdem eine isolierte, rekombinanten CSF-1 codierende DNA-Sequenz, rekombinante Expressions-Systeme für diese Sequenz, diese enthaltende Vektoren, rekombinante, mit diesen Vektoren transformierte Wirte und das rekombinante Protein produzierende Kulturen. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Proteins und für ihre Herstellung wichtige Materialien.
Zusätzlich betrifft die Erfindung CSF-1 enthaltende Zusammensetzungen, die für pharmazeutische und therapeutische Verwendungen brauchbar sind und Verfahren zur Verwendung derartiger Zusammensetzungen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 stellt die von den gereinigten, nativen Proteinen bestimmten partiellen Aminosäuresequenzen des menschlichen Urin- und Maus-L-929-Zell-CSF-1 dar.
Fig. 2 stellt die Sequenz verschiedener Oligomer-Sonden für Maus-CSF-1 dar.
Fig. 3 stellt die Sequenz der zum Erhalt von menschlichem genomischen CSF-1 verwendeten Oligomer-Sonden dar.
Fig. 4 stellt den sequenzierten Teil eines menschliche CSF-1 Sequenzen codierenden 3.9 kb Hind III-Fragments und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Exon-Bereiche dar.
Fig. 5 stellt die DNA- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen eines CSF-1 codierenden cDNA Clons dar.
Fig. 6 stellt einen Vergleich der Aktivitäten von CSF-1 und anderen Kolonie-stimulierenden Faktoren dar, wobei die Verstärkung der Fähigkeit von Makrophagen untersucht wird, Tumorzellen abzutöten.
Fig. 7 stellt die Ergebnisse einer Saccharose-Gradienten- Fraktionierung von MIAPaCa mRNA dar.

Ausführungsformen der Erfindung

A. Definitionen

"Kolonie-stimulierender Faktor-1 (CSF-1)" bezieht sich auf ein Protein, das ein im Fachgebiet CSF-1 zugeordnetes Aktivitätsspektrum aufweist, d. h. Anwendung des in vitro Standard- Kolonie-stimulierenden Tests von Metcalf D. (J. Cell. Physiol. 76 (1970), 89) führt zur primären Bildung von Makrophagen-Kolonien. Nativer CSF-1 ist ein glykosyliertes Dimer; die Dimerisierung kann für die Aktivität notwendig sein. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung werden unter der Definition von CSF-1 beide, dimere und monomere, Formen verstanden. Die monomere Form kann durch Schaffung der intrazellulären Bedingungen in vitro in das Dimer überführt werden. Das Monomer ist per se zur Herstellung von anti-CSF-1 Antikörpern brauchbar.
Es scheint einige Spezies-Besonderheiten zu geben:
Menschlicher CSF-1 wirkt auf menschliche und Maus-Knochenmarkszellen; Maus-CSF-1 zeigt mit menschlichen Zellen keine Aktivität. Daher sollte "menschlicher" CSF-1 positiv in dem spezifischen Maus-Radiorezeptor-Test von Das S.K. et al. (Blood 58 (1981), 630) sein, obgleich nicht notwendigerweise eine vollständige Korrelation besteht. Die biologische Aktivität des Proteins wird generell auch durch neutralisierendes Antiserum gegen menschlichen Urin-CSF-1 (Das S.K. et al., vorstehend) gehemmt. Unter bestimmten, speziellen Verhältnissen (wenn beispielsweise eine bestimmte Antikörperpräparation ein für die biologische Funktion nicht essentielles CSF-1-Epitop erkennt, und dieses Epitop in dem bestimmten getesteten CSF-1-Mutein nicht vorhanden ist) wird dieses Kriterium unter Umständen nicht erfüllt.
Bestimmte andere Eigenschaften von CSF-1, die die Fähigkeit des Proteins einschließen, die Sekretion einer Reihe von E- Prostaglandinen, Interleukin-1 und Interferon aus reifen Makrophagen zu stimulieren (Moore R. et al., Science 223 (1984), 178) wurden erst kürzlich erkannt. Der Mechanismus dieser letzteren Aktivitäten ist bisher nicht verstanden. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung besteht das Kriterium für die Erfüllung der Definition darin, die Bildung von Monocyten/Makrophagen-Kolonien unter Verwendung von Knochenmarkszellen geeigneter Spezies als Ausgangsmaterial stimulieren zu können, in den meisten Fällen (siehe vorstehend) in der Hemmung dieser Aktivität durch neutraliserendes Antiserum gegen gereinigten, menschlichen Urin-CSF-1 und, je nach Speziestyp, eine positive Reaktion auf den Radiorezeptor-Test zu erhalten. (Es ist bekannt, daß sich der proliferierende Effekt von CSF-1 auf Zellen der mononuclearen, phagocytierenden Linie beschränkt (Stanley E.R., The Lymphokines, Stewart, W.E. II et al., Hrsg. Humana Press, Clifton NJ (1981), 102- 132) und daß CSF-1-Rezeptoren auf diese Zellinien beschränkt sind (Byrne P.V. et al., Cell Biol. 91 (1981), 848)).
Für alle Proteine gilt, daß die genaue chemische Struktur von einer Reihe von Faktoren abhängt. Da ionisierbare Amino- und Carboxylgruppen in dem Molekül vorhanden sind, kann ein bestimmtes Protein als saures oder basisches Salz oder in neutraler Form erhalten werden. Unter die Definition fallen alle derartigen Präparationen, die nach Schaffung von geeigneten Bedingungen in der Umgebung ihre Aktivität behalten. Ferner kann die primäre Aminosäuresequenz durch Derivatisierung mittels Zuckereinheiten (Glycosylierung) oder anderer zusätzlicher Moleküle, wie Lipide, Phosphat, Acetylgruppen und ähnliche, häufiger durch Konjugation mit Sacchariden modifiziert werden. Die primäre Aminosäurestruktur kann auch aggregieren, wobei Komplexe, am häufigsten Dimere, gebildet werden. Nativer, menschlicher Urin-CSF-1 wird tatsächlich als ein stark glycosyliertes Dimer isoliert. Bestimmte Formen derartiger Modifikationen werden von posttranslationalen Prozessierungs-Systemen des produzierenden Wirts ausgeführt; andere derartige Modifikationen können in vitro eingeführt werden. In jedem Fall fallen derartige Modifikationen unter die Definition, so lange die vorstehend definierte Aktivität des Proteins nicht zerstört wird. Es wird selbstverständlich erwartet, daß derartige Modifikationen die Aktivität entweder durch Verstärkung oder Verringerung der Aktivität des Proteins quantitativ oder qualitativ in den verschiedenen Tests beeinflussen.
Ferner können individuelle Aminosäurereste innerhalb der Kette durch Oxidation, Reduktion oder andere Derivatisierung modifiziert werden. Das Protein kann geschnitten werden, um Fragmente zu erhalten, die ihre Aktivität behalten. Derartige Veränderungen, die die Aktivität nicht zerstören, schließen die Proteinsequenz nicht von der Definition aus.
Modifikationen der Primärstruktur selbst durch Deletion, Addition oder Veränderung von während der Translation in die Sequenz eingebauten Aminosäuren können ohne Zerstörung der Aktivität des Proteins vorgenommen werden. Derartige Substitutionen oder weitere Veränderungen führen zu Proteinen mit einer Aminosäuresequenz, die in die Definition der Proteine fallen, "die eine im wesentlichen CSF-1-äquivalente Aminosäuresequenz aufweisen". Vom Menschen und der Maus stammende CSF-1-Proteine weisen tatsächlich ähnliche, jedoch nicht identische primäre Aminosäuresequenzen auf, die eine hohe Homologie widerspiegeln.
Die von dem hier dargestellten cDNA-Clon abgeleitete, in Fig. 5 gezeigte Aminosäuresequenz des reifen Proteins des monomeren Anteils eines dimeren Proteins wird als mCSF-1 ("reifer" CSF-1) bezeichnet. Fig. 5 zeigt die Gegenwart einer 32 Reste umfassenden putativen Signalsequenz, die vermutlich bei der Sekretion aus den Säuger-Zellen abgespalten wird; mCSF-1 wird von den in dieser Figur gezeigten Aminosäuren 1-224 dargestellt. In die Definition des menschlichen CSF-1 speziell mit eingeschlossen sind Muteine, deren Monomere und Dimere mCSF-1 und verwandte, durch ihre Unterschiede zu mCSF-1 gekennzeichnete, Formen von mCSF-1 sind. Da aus anderen Spezies stammender CSF-1 das bezüglich menschlichen Substrats vorstehend erläuterte, notwendige Aktivitätsmusters aufweisen kann, kann auf dieses die Definition "menschlichen" CSF-1 zutreffen.
Die Aminosäuresequenz von mCSF-1 wird ebenfalls als Referenz verwendet. Andere, im wesentlichen zu dieser hinsichtlich CSF-1-Aktivität, äquivalente Sequenzen werden unter Bezugnahme auf die in Fig. 5 dargestellte Sequenz bezeichnet.
Der Austausch einer bestimmten Aminosäure wird unter Verweis auf den ersetzten Aminosäurerest erwähnt. So verweist beispielsweise ser&sub9;&sub0;CSF-1 auf das Protein mit der in Fig. 5 dargestellten Sequenz außer, daß die Aminosäure in Position 90 Serin statt Cystein ist. Deletionen werden durch ein A gefolgt von der Zahl der von der N-terminalen Sequenz deletierten Aminosäuren markiert oder, wenn nach Deletion von Resten von der C-terminalen Sequenz der Zahl ein Minuszeichen folgt, von der Zahl der verbleibenden Aminosäuren. So verweist Δ &sub4;CSF-1 auf CSF-1 in Fig. 5, wobei die ersten 4 Aminosäuren vom N-Terminus deletiert wurden. Δ &sub1;&sub3;&sub0;- verweist auf CSF-1, wobei die letzten 94 der Aminosäure 130 folgenden Aminosäuren deletiert wurden. Nachstehend beschrieben sind beispielsweise asp&sub5;&sub9;CSF-1 (das einen vom Gen (Fig. 5) in Position 59 codierten Asparaginrest anstelle des von der cDNA codierten Tyrosinrests enthält) und Δ &sub1;&sub5;&sub8;-CSF-1, das nur die Aminosäuren 1-158 von mCSF-1 umfaßt.
"Funktionell gebunden" bezieht sich auf benachbarte Positionen derart, daß die normale Funktion der Bestandteile ausgeführt werden kann. Demgemäß bezieht sich eine funktionell an Kontrollsequenzen gebundene codierende Sequenz auf eine Konfiguration, in der die codierende Sequenz unter der Kontrolle dieser Sequenzen exprimiert werden kann.
"Kontrollsequenzen bezieht sich auf für die Expression einer codierenden, funktionell gebundenen Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendige DNA-Sequenzen. Die für Procaryoten geeigneten Kontrollsequenzen beinhalten beispielsweise einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, Ribosomen-Bindungsstelle und möglicherweise andere bisher wenig verstandene Sequenzen. Für eucaryotische Zellen ist bekannt, daß sie Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer verwenden.
"Expressions-System" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die eine gewünschte codierende Sequenz in funktioneller Bindung an Kontrollsequenzen enthalten, so daß mit diesen Sequenzen transformierte Wirte fähig sind, die codierten Proteine zu produzieren. Zur Ausführung der Transformation kann das Expressions-System in einem Vektor enthalten sein: die relevante DNA kann dann jedoch auch in das Wirtschromosom integriert werden.
"Zelle", "Zell-Linie" und "Zellkultur" sind hier untereinander austauschbar verwendet, und alle diese Bezeichnungen beinhalten Nachkommenschaft. "Transformanten" oder "transformierte Zellen" beinhalten die primäre Zelle und davon stammende Kulturen ohne die Zahl der "Transfers" zu berücksichtigen. Man geht davon aus, daß bedingt durch erwünschte oder zufällige Mutationen nicht alle Nachkommen vollständig identisch in ihrem DNA-Gehalt sind. Mutierte Nachkommen mit der gleichen Funktionalität, wie die in der ursprünglich transformierten Zelle gesuchten, sind eingeschlossen. Wo genaue Bezeichnungen beabsichtigt sind, wird dies aus dem Zusammenhang deutlich.

B. Allgemeine Beschreibung

Die erfindungsgemäßen CSF-1 Proteine sind fähig, sowohl die Bildung von Monocyten-Vorläufer/Makrophagen-Zellen aus Knochenmarksvorläufer-Zellen zu stimulieren, wodurch die Wirksamkeit des Immunsystems gesteigert wird, als auch Funktionen dieser differenzierten Zellen zu stimulieren, wie die Sekretion von Lymphokinen in den reifen Makrophagen.
Diese Proteine sind unter anderem als Zusätze bei der Chemotherapie brauchbar. Es ist bekannt, daß eine chemotherapeutische Behandlung zur Suppression des Immunsystems führt.
Häufig führen chemotherapeutischen Behandlungen aufgrund dieser Nebenwirkung chemotoxischer Agentien auf die Zellen des Immunsystems zum Tod des Patienten, obgleich sie erfolgreich bei der Zerstörung der Tumorzellen wirken, gegen die sie gerichtet sind. Die Verabreichung von CSF-1 an derartige Patienten führt zur Vermeidung dieser Nebenwirkung, da die
Fähigkeit von CSF-1, das Wachstum und die Differenzierung von aus dem Knochenmark stammenden Vorläufern zu Makrophagen und Monocyten zu vermitteln und zu steigern, zur Restimulierung des Immunsystems führt. So wird der Anfälligkeit des Patienten vorgebeugt, an einer sekundären Infektion zu sterben. Andere Patienten, denen durch eine derartige Behandlung geholfen werden kann, umfassen solche, die mittels Knochenmarkstransplantation gegen Leukämie behandelt werden; sie befinden sich häufig in einem Zustand der Immunsuppression, um eine Abstoßung zu verhindern. Auch bei diesen Patienten kann die Immunsuppression durch Verabreichung von CSF-1 aufgehoben werden.
Allgemein kommt jedem an einer Immunsuppression leidenden Patienten, unabhängig davon, ob durch Chemotherapie, Knochenmarkstransplantation oder andere zufällige Formen der Immunsuppression, wie Krankheit (z. B. erworbene Immunschwäche) bedingt, die Verfügbarkeit von CSF-1 zur pharmakologischen Anwendung zugute. Zusätzlich können Patienten erhöhte Mengen von zuvor differenzierten Makrophagen als Ergänzung zu denen des körpereigenen Systems verabreicht werden, wobei die Makrophagen durch in vitro Kultur von Knochenmarks- oder anderen geeigneten, mit CSF-1 behandelten Präparationen hergestellt wurden. Unter diese Präparationen fallen auch aus dem eigenen Blut des Patienten stammenden Monocyten-Präparationen, die so kultiviert und zur lokalen oder systemischen Therapie wieder verabreicht werden können.
Die Fähigkeit von CSF-1, die Produktion von Lymphokinen durch Makrophagen zu stimulieren und deren Fähigkeit zu steigern, Zielzellen abzutöten, zeigt die direkte Verwendbarkeit von CSF-1 bei der Behandlung von Neoplasmen und Infektionen.
CSF-1 stimuliert die Produktion von Interferon durch aus der Maus stammende Makrophagen (Fleit et al., J. Cell. Physiol. 108 (1981), 347). Menschlicher, teilweise gereinigter aus MIAPaCa-Zellen stammender CSF-1 stimuliert die poly(I)-, poly(C)-induzierte Produktion von Interferon und TNF durch menschliche Monocyten, wie nachstehend beschrieben. Zusätzlich stimuliert CSF-1 die Produktion von myeloischem CSF durch Monocyten des menschlichen Blutes.
Nachstehend wird auch die Fähigkeit von Maus-CSF-1 (aus L- Zell-konditioniertem Medium) gezeigt, normale C3H/HeN peritoneale Maus-Makrophagen zum Abtöten von Maus-Sarcom TU5 Zielzellen zu stimulieren. Diese Aktivität ist am wirksamsten, wenn CSF-1 zur Vorbehandlung und während der Effektor-Phase verwendet wird. Die Fähigkeit von CSF-1 derart zu wirken ist, wie nachstehend in Fig. 6 dargestellt, erheblich größer, als die, die von anderen Kolonie-stimulierenden Faktoren ausgeübt wird. Zusätzlich wird durch CSF-1 die Fähigkeit von Mauszellen gesteigert, Viren anzugreifen.
Von Maus-CSF-1 wird nicht übereinstimmend berichtet, daß er Maus-Makrophagen stimuliert, cytostatisch auf P815-Tumorzellen wirkt (Wing E.J. et al., J. Clin. Invest. 69 (1982), 270) oder andere Leukämie-Zielzellen nicht abtötet (Ralph P. et al., Cell Immunol. 76 (1983), 10). Nowaga R.T. et al., Cell Immunol. 53 (1980), 116, berichten, daß CSF-1 Makrophagen stimulieren kann, Hefe aufzunehmen und abzutöten.
Demgemäß kann CSF-1 indirekt zusätzlich zur Überwindung von Immunsuppression per se durch Stimulierung von Sekretion und Aktivität der Makrophagen zur Zerstörung von eindringenden Organismen und bösartigen Zellen verwendet werden.
Der erfindungsgemäße CSF-1 kann in herkömmlicher, im Fachgebiet zur Verabreichung von Proteinen üblicher Weise formuliert werden. Die Verabreichung durch Injektion ist bevorzugt; Formulierungen beinhalten Lösungen oder Suspensionen, Emulsionen oder eine feste Zusammensetzung, die in eine injizierbare Form überführbar ist. Geeignete Excipienten umfassen beispielsweise Ringer-Lösung, Hank-Lösung, Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin, Dextrose-Lösungen und ähnliche. Zusätzlich kann der erfindungsgemäße CSF-1 mit Zellpräparationen zur Stimulierung geeigneter Reaktionen vorinkubiert werden. Dem Patienten wird entweder die gesamte Präparation oder der überstand davon verabreicht. Wie nachstehend dargestellt, sind die als Reaktion auf die CSF-1 Stimulierung von verschiedenen Blutzelltypen produzierten Stoffe gegen die gewünschten Zielzellen wirksam. Die Eigenschaften dieser Blutzellen selbst, eindringende Viren und Neoplasmen anzugreifen, können gesteigert werden. Es können die eigenen Zellen des Patienten entnommen und in dieser Weise verwendet werden oder beispielsweise Monocyten oder Lymphocyten anderer kompatibler Individuen für die Inkubation verwendet werden.
Obgleich ein als CSF-1 bezeichnetes Aktivitätsmuster seit einiger Zeit bekannt war, wurde das verantwortliche Protein nie in ausreichender Menge und Reinheit erhalten, um eine Sequenzbestimmung oder eine brauchbare therapeutische Anwendung zu ermöglichen. Da weder praktisch anwendbare Mengen des vollständig reinen Proteins noch seine codierende DNA verfügbar waren, war es nicht möglich, Modifikationen an der Struktur zu optimieren, indem wie im Abschnitt A beschriebene Alternativen bereitgestellt werden. Es war auch nicht möglich, dieses Protein für einen therapeutischen Zweck zu nutzen.
Die vorliegende Erfindung überwindet diese Nachteile. Durch eine Reihe zusätzlicher Reinigungsverfahren wurde aus menschlichem Urin ausreichend reiner CSF-1 erhalten, um einen Teil der Aminosäuresequenz zu liefern. Dadurch wurde die Konstruktion von DNA-Sonden in Form von Oligomeren ermöglicht. Die Sonden waren bei der Bestimmung der codierenden Sequenz des gesamten Proteins nützlich. Ein nachstehend dargestellter Versuch verwendet entsprechend der menschlichen N-terminalen Sequenz hergestellte Sonden zum Absuchen einer genomischen Genbank aus dem Menschen, um den entsprechenden codierenden Sequenz-Teil zu erhalten. Die clonierte, genomische Sequenz aus dem Menschen kann direkt mittels seiner eigenen Kontrollsequenzen oder in Konstrukten exprimiert werden, die für zum Prozessieren von Introns fähige Säugetier-Systeme geeignet sind. Die genomischen Sequenzen wurden auch als Sonden für eine aus einer CSF-1 produzierenden Zellinie erstellte cDNA-Bank aus dem Menschen verwendet. Man erhielt die dieses Protein codierende cDNA. Die cDNA kann bei geeigneter Präparation direkt in COS- oder CV-1-Zellen exprimiert werden, und sie kann in Vektoren cloniert werden, die eine Expression in einer Reihe von Wirten ermöglichen.
So können diese Hilfsmittel die vollständige codierende Sequenz des menschlichen CSF-1 liefern. Diese codierende Sequenz kann in in einer Reihe von Wirtssystemen anwendbare Expressionsvektoren cloniert und exprimiert werden. Die Auswahl von mit den Expressionsvektoren zur Verfügung stehenden Wirten ermöglicht sowohl eine Wahl zwischen posttranslationalen Prozessierungssystemen als auch zwischen Umweltfaktoren, die eine Regulation über die Konformation des so hergestellten Proteins ermöglichen.

C. Geeignete Wirte Kontrollsysteme und Verfahren

Allgemein umfaßt die Herstellung von CSF-1 in rekombinanter Form üblicherweise folgendes:
Erstens wird eine DNA erhalten, die das reife Protein (hier so verwendet, daß alle Muteine eingeschlossen sind), das Vorläuferprotein oder eine Fusion des CSF-1-Proteins mit einer zusätzlichen Sequenz codiert, die seine Aktivität nicht zerstört oder die sich unter kontrollierten Bedingungen (wie eine Behandlung mit Peptidase) unter Erhalt eines aktiven Proteins schneiden läßt. Eine nicht durch Introns unterbrochene Sequenz kann in jedem Wirt exprimiert werden. Wenn Introns vorhanden sind, ist eine Expression in Säugetier- oder anderen eukaryotischen Systemen möglich, die zum Prozessieren fähig sind. Diese Sequenz sollte sich wieder herausschneiden und zurückgewinnen lassen. Diese herausgeschnittene oder zurückgewonnene codierende Sequenz wird dann funktionell an geeignete Kontrollsequenzen gebunden in einen replikationsfähigen Expressionsvektor cloniert. Der Vektor wird zur Transformation eines geeigneten Wirts verwendet. Der transformierte Wirt wird unter geeigneten Bedingungen kultiviert, um die Produktion von rekombinantem CSF-1 zu bewirken. Gegebenenfalls wird CSF-1 aus dem Medium oder aus den Zellen isoliert; die Wiedergewinnung und Reinigung des Proteins kann in einigen Fällen, in denen gewisse Verunreinigungen toleriert werden, nicht erforderlich sein. Beispielsweise ist bei der in vitro Kultivierung von Zellen, aus denen ein Lymphokin-Faktor zur Verabreichung an einen Patienten isoliert wird, vollständige Reinheit nicht erforderlich. Dennoch würde selbstverständlich die direkte Verwendung zur Therapie durch Verabreichung an einen Patienten eine Reinigung des produzierten CSF-1 erforderlich machen.
Jeder der vorstehenden Schritte kann auf mehrere, verschiedene Weisen ausgeführt werden. Die gewünschten codierenden Sequenzen können beispielsweise durch Präparation von geeigneter cDNA aus cellulärer messenger-RNA erhalten werden, wobei man durch Manipulation der cDNA die vollständige Sequenz erhält. Alternativ können genomische Fragmente erhalten und direkt in geeigneten Wirten verwendet werden. Die Konstruktionen von in einer Vielzahl von Wirten funktionellen Expressionsvektoren werden mittels geeigneter Replicons und Kontrollsequenzen, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt. Falls normalerweise nicht vorhanden, können die Enden der codierenden Sequenz mit geeigneten Restriktionsstellen versehen werden, so daß ein in diese Vektoren inserierbares, herausschneidbares Gen zur Verfügung steht.
Die Kontrollsequenzen, Expressionsvektoren und Transformationsverfahren sind vom Typ der zur Expression des Gens verwendeten Wirtszelle abhängig. Allgemein sind gegenwärtig prokaryotische, Hefe- oder Säugerzellen als Wirte verwendbar. Da nativer CSF-1 als glykosyliertes Dimer sekretiert wird, werden Wirtssysteme bevorzugt, die zum korrekten posttranslationalen Prozessieren fähig sind. Obwohl prokaryotische Wirte im allgemeinen für die Herstellung von rekombinanten Proteinen am geeignetsten und effizientesten sind, werden folglich eukaryotische und insbesondere Säugerzellen wegen ihrer Fähigkeit zum Prozessieren bevorzugt. Von Bakterien hergestellter, rekombinanter CSF-1 würde eine in vitro Dimerisierung erfordern. Zusätzlich besteht eine größere Gewißheit, daß die native Signalsequenz von den Säuger-Wirtszellen erkannt, die Sekretion ermöglicht und die Reinigung dadurch erleichtert wird.

C.1. Kontrollsequenzen und entsprechende Wirte

Prokaryoten sind am häufigsten durch verschiedene E.coli- Stämme vertreten. Dennoch können auch andere Mikrobenstämme, wie Bacilli, z. B. Bacillus subtilis, verschiedene Pseudomonas-Spezies oder andere Bakterienstämme verwendet werden. In derartigen prokaryotischen Systemen werden Plasmidvektoren verwendet, die Replikationsstartpunkte und Kontrollsequenzen enthalten, welche von einer mit dem Wirt kompatiblen Spezies stammen. Üblicherweise wird beispielsweise E.coli mittels Derivaten von pBR322, eines von einer E.coli-Spezies stammenden Plasmids, transformiert (Bolivar et al., Gene 2 (1977), 95). pBR322 enthält Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenzgene. Es stellt somit zusätzliche Marker bereit, die bei der Konstruktion des gewünschten Vektors entweder erhalten bleiben oder zerstört werden können. Gewöhnlich verwendete prokaryotische Kontrollsequenzen beinhalten hier definitionsgemäß Promotoren zur Transkriptionsinitiation, gegebenenfalls mit einem Operator, mit Sequenzen für Ribosomen-Bindungsstellen, wie die gewöhnlich verwendeten Beta-Lactamase- (Penicillinase) und Lactose (lac)-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 198 (1977), 1056), das Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8(1980), 4057) und den von Lambda stammenden PL-Promotor und die Ribosomen-Bindungsstelle des N-Gens (Shimatake et al., Nature 292 (1981), 128), welche, wie in W085/03522 beschrieben, als übertragbare Kontrollkassetten verwendbar ist.
Es kann jedoch jedes verfügbare, mit Prokaryoten kompatible Promotorsystem verwendet werden.
Zusätzlich zu den Bakterien können auch eukaryotische Mikroben, wie Hefe, als Wirte verwendet werden. Obgleich gewöhnlich eine Zahl anderer Stämme verfügbar ist, werden meistens Laborstämme von Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) verwendet. Neben den dargestellten, den 2 Micron-Replikationsstartpunkt verwendenden Vektoren (Broach J.R., Meth. Enz. 101 (1983), 307) sind auch andere für die Expression in Hefe geeignete Plasmidvektoren bekannt (siehe z. B. Stinchcomb et al., Nature 282 (1979), 39; Tschempe et al., Gene 10 (1980), 157 und Clarke L. et al., Meth. Enz. 101 (1983), 300). Kontrollsequenzen für Hefevektoren umfassen Promotoren für die Synthese von glykosylierten Enzymen (Hess et al., J. Adv. Enzyme Req. 7 (1968), 149; Holland et al., Biochemistry 17 (1978), 4900). Zusätzlich im Fachgebiet bekannte Promotoren umfassen den Promotor der 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 2073) und die anderer glykolytischer Enzyme, wie Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. Andere Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil, daß die Transkription durch Wachstumsbedingungen kontrolliert ist, sind die Promotorregionen der Alkohol-Dehydrogenase 2, der sauren Isocytochrom-C-Phosphatase, der mit dem Stickstoffmetabolismus in Zusammenhang stehenden Abbau-Enzyme und der für die Maltose- und Galactoseverwendung verantwortlichen Enzyme (Holland, a.a.O.). Es ist auch bekannt, daß Terminatorsequenzen am 3'-Ende der codierenden Sequenzen erwünscht sind. Derartige Terminatoren findet man bei von Hefe stammenden Genen in der den codierenden Sequenzen folgenden 3'-nichttranslatierten Region. Viele der dargestellten Vektoren enthalten Kontrollsequenzen, die aus dem das Enolasegen enthaltenden Plasmid peno46 (Holland M.J. et al., J. Biol. Chem. 256 (1981), 1385) oder dem aus YEp13 erhaltenen LEU2-Gen (Broach J. et al., Gene 8 (1978), 121) stammen. Jeder einen Hefe-kompatiblen Promotor, einen Replikationsstartpunkt und andere Kontrollsequenzen enthaltende Vektor ist jedoch geeignet.
Es ist selbstverständlich auch möglich, Polypeptide codierende Gene in von mehrzelligen Organismen stammenden eukaryotischen Wirtszellkulturen zu exprimieren. Siehe beispielsweise "Tissue culture", Hrsg. Cruz und Patterson, Academic Press (1973). Verwendbare Wirts-Zellinien umfassen Maus- Myelome N51, VERO und HeLa-Zellen und Zellen des Ovariums von chinesischen Hamstern (CHO). Expressionsvektoren für derartige Zellen beinhalten gewöhnlich mit Säugerzellen kompatible Promotoren und Kontrollsequenzen, wie die gewöhnlich verwendeten frühen und späten Promotoren des "Simian"-Virus 40 (SV 40)(Fiers et al., Nature 273 (1978), 113) oder andere virale Promotoren, wie die vom Polyomavirus, vom Adenovirus 2, vom Rinder-Papilloma-Virus, von Vogel-Sarkoma-Viren stammenden Promotoren oder Immunglobulin und Hitzeschock-Promotoren. Allgemeine Gesichtspunkte bei der Transformation von Säugerzell-Wirtssystemen wurden von Axel beschrieben (U.S. Patent Nr. 4,399,216 erteilt am 16. August 1983). Inzwischen scheint es auch, daß "Enhancer"-Regionen für eine Optimierung der Expression wichtig sind. Es handelt sich dabei allgemein um Sequenzen, die stromaufwärts von der Promotorregion liegen. Replikationsstartpunkte können, falls erforderlich, aus viralen Quellen erhalten werden. Integration in das Chromosom ist jedoch ein üblicher Mechanismus bei der DNA-Replikation in Eukaryoten. Pflanzenzellen sind inzwischen auch als Wirte verfügbar. Mit Pflanzenzellen kompatible Kontrollsequenzen, wie der Nopalinsynthase-Promotor und Polyadenylierungs-Signalsequenzen (Depicker A. et al., J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 561) stehen zur Verfügung.

C.2. Transformationen

In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung der für derartige Zellen geeigneten Standardtechniken durchgeführt. Die von Cohen S.N. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69 (1972), 2110) beschriebene Calciumchlorid verwendende Calciumbehandlung wird für Prokaryoten oder andere, kräftige Zellwand-Barrieren enthaltende Zellen verwendet. Die Infektion mit Agrobakterium tumefaciens wird für bestimmte Pflanzenzellen verwendet (Shaw C.H. et al., Gene 23 (1983), 315). Für Säuger-Zellen ohne derartige Zellwände wird das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham und van der Eb (Virology 52 (1978), 546) bevorzugt. Transformationen von Hefe werden gemäß dem Verfahren von Van Solingen P. et al. (J Bact 130 (1977), 946 und Hsiao C.L. et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 76 (1979), 3829) durchgeführt

C.3. mRNA Analyse mittels Northernblot; Sonde aus cDNA- oder genomischen Banken

Die RNA wird für den Northernblot durch Agarose-Flachgelelektrophorese unter vollständig denaturierenden Bedingungen fraktioniert (Maniatis T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press (1982), 202-203). Zur Denaturierung wurden Formaldehyd oder 10 mM Methylquecksilber (CH&sub3;HgOH) als denaturierendes Agens verwendet (Bailey J.M. et al., Anal. Biochem. 70 (1976), 75-85; und Sehgal P.B. et al., Nature 288 (1980), 95-97). Für die Methylquecksilbergele werden 1.5%ige Gele hergestellt, indem die Agarose im Laufpuffer (100 mM Borsäure, 6 mM Natriumborat, 10 mM Natriumsulfat, 1 mM EDTA, pH 8.2) geschmolzen wird, auf 60ºC abgekühlt und 1/100 Volumen 1 M CH&sub3;HgOH zugesetzt wird. Die RNA wird in 0.5 · Laufpuffer gelöst und durch 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur in 10 mM Methylquecksilber denaturiert. Beim Laden der Proben werden Glycerin (20%) und Bromphenolblau (0.05%) zugesetzt. Die Proben werden bei 500-600 Volt-Std. unter Rezirkularisierung des Puffers elektrophoretisch aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wird das Gel 40 Minuten in 10 mM 2- Mercaptoethanol gewaschen, um das Methylquecksilber zu entgiften. Northernblots werden durch Übertragung der RNA aus dem Gel auf einen Membranfilter hergestellt.
cDNA oder genomische Banken werden mittels des Kolonie- oder Plaque-Hybridisierungs-Verfahrens abgesucht. Bakterienkolonien oder die Phagenplaques werden auf Replica-Nitrocellulosefilterpapiere (S & S Typ BA 85) übertragen. Durch 5 minütige Behandlung in Folge mit 500 mM NaOH, 1.5 M NaCl werden die Plaques oder Kolonien lysiert und die DNA auf den Filter fixiert. Die Filter werden zweimal jeweils 5 Minuten mit 5 · "standard saline citrate" (SSC) gewaschen, luftgetrocknet und 2 Stunden bei 80ºC gebacken.
Die Northernblot-Gele oder Replikafilter für das Absuchen von cDNA oder genomischen Banken werden 6-8 Stunden bei 25-42ºC mit 10 ml DNA-Hybridisierungspuffer ohne Sonde je Filter vorhybridisiert (0-50% Formamid, 5-6 · SSC, pH 7.0, 5 · Denhardt's-Lösung (Polyvinylpyrrolidin mit Ficoll und Rinderserum-Albumin; 1 · = 0.02% von jedem), 20-50 mM Natriumphosphat-Puffer pH 7.0, 0.2% SDS, 20 ug/ml Poly U (bei Hybridisierung von cDNA) und 50 ug/ml denaturierte Lachssperma- DNA). Die Proben wurden dann durch 24-36 Stunden Inkubation bei geeigneter Temperatur in dem eine Kinase-behandelte Sonde (bei Oligomeren) enthaltenden Hybridisierungspuffer hybridisiert. Längere als Sondenmoleküle verwendete cDNA oder genomische Fragmente wurden mittels "nick-Translation" oder "primer-extension" markiert.
Die Bedingungen für die Vorhybridisierung und die Hybridisierung sind abhängig von der gewünschten Stringenz und variieren beispielsweise mit der Länge der Sonde. Eine Temperatur von 42-55ºC und ein etwa 20-50% Formamid enthaltender Hybridisierungspuffer wird unter typischen Bedingungen für relativ lange Sonden (z. B. mehr als 30-50 Nucleotide) verwendet. Für Oligomersonden von etwa 15 Nucleotiden werden weniger stringente Bedingungen benötigt. Es werden niedrigere Temperaturen von etwa 25-42ºC und niedrigere Formamid-Konzentrationen (0%-20%) verwendet. Bei längeren Sonden können die Filter beispielsweise 4 mal 30 Minuten bei 40-55ºC mit 2 · SSC, 0.2% SDS und 50 mM Natriumphosphat-Puffer pH 7 und anschließend zweimal mit 0.2 · SSC und 0.2% SDS gewaschen, luftgetrocknet und 2 bis 3 Tage bei -70ºC autoradiographiert werden. Die Waschbedingungen sind bei kürzeren Sonden weniger stringent.

C.4. Vektorkonstruktion

Bei der Konstruktion von geeigneten, die gewünschten codierenden und Kontrollsequenzen enthaltenden Vektoren werden im Fachgebiet bekannte Standard-Ligations- und -Restriktionstechniken verwendet. Isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonucleotide werden geschnitten, angepaßt und zur gewünschten Form religiert.
Das Schneiden der DNA an spezifischen Stellen erfolgt durch Behandlung mit dem geeigneten Restriktionsenzym (oder Enzymen) gemäß den allgemein verwendeten und den besonderen vom Hersteller dieser im Handel erhältlichen Restriktionsenzyme spezifizierten Bedingungen. Siehe z. B. New England Biolabs, Produktkatalog. Allgemein wird etwa 1 ug Plasmid oder DNA- Sequenz mit einer "Unit" Enzym in etwa 20 ul Pufferlösung geschnitten. In den hier angegebenen Beispielen wird üblicherweise ein Überschuß an Restriktionsenzym verwendet, um eine vollständige Spaltung des DNA-Substrats zu gewährleisten. Es wird mit Inkubationszeiten von ein bis zwei Stunden bei etwa 37ºC gearbeitet, obwohl Abweichungen davon toleriert werden können. Nach jeder Inkubation wird das Protein durch eine Phenol/Chloroform-, eventuell gefolgt von einer Ether-Extraktion entfernt. Die Nucleinsäure wird durch Ethanolfällung aus den wäßrigen Fraktionen zurückgewonnen. Eine Größentrennung der geschnittenen Fragmente kann, falls erwünscht, durch Polyacrylamid- oder Agarose-Gelelektrophorese mittels Standardtechniken ausgeführt werden. Eine allgemeine Beschreibung der Größentrennungen ist in "Methods in Enzymology" 65 (1980), 499-560, zu finden.
Mit Restriktionsenzymen gespaltene Fragmente können durch Behandlung mit dem großen Fragment der E.coli DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart der vier Desoxynukleotid-Triphosphate (dNTPs) mit glatten Enden versehen werden. Die verwendeten Inkubationszeiten betragen etwa 15 bis 25 Minuten bei 20 bis 25ºC in 50 mM Tris pH 7.6, 50 mM NaCl, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM DTT und 5-10 uM dNTPs. Das Klenow-Fragment füllt 5'-überhängende Enden auf, spaltet jedoch trotz der Gegenwart der vier dNTPs 3'-überstehende Einzelstränge ab. Selektive Reparatur kann, falls erwünscht, durch Zugabe von nur einem oder ausgewählten dNTPs im Rahmen der von der Natur der überhängenden Enden vorgeschriebenen Begrenzungen erfolgen. Nach der Klenow-Behandlung wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Eine S1 Nuclease-Behandlung führt unter geeigneten Bedingungen zur Hydrolyse jeglicher einzelsträngiger Bereiche.
Synthetische Oligonucleotide können nach dem Triester-Verfahren von Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103 (1981), 3185-3191) oder mittels automatisierter Syntheseverfahren hergestellt werden. Eine Kinasebehandlung von Einzelsträngen vor der Hybridisierung oder zur Markierung wird durch einen Überschuß von beispielsweise 10 "Units" Polynucleotid-Kinase zu 1 nmol Substrat in Gegenwart von 50 mM Tris pH 7.6, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreitol, 1-2 mM ATP erreicht. Falls die Kinasebehandlung zum Markieren einer Sonde dient, enthält das ATP eine hohe spezifische, ³²γ P- Aktivität.
Ligationen werden in 15-30 ul Volumina unter den folgenden Standard-Bedingungen und Temperaturen ausgeführt: 20 mM Tris- Cl pH 7.5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 33 ug/ml BSA, 10 mM-SO mM NaCl und entweder 40 uM ATP, 0.01-0.02 (Weiss) "Units" T4-DNA Ligase bei 0ºC (zur Ligation von überhängenden Enden) oder 1 mM ATP, 0.3-0.6 (Weiss) "Units" T4-DNA Ligase bei 14ºC (zur Ligation von glatten Enden). Intermolekulare Ligationen von überhängenden Enden werden gewöhnlich bei Gesamt-DNA-Konzentrationen von 33-100 ug/ml (5-100 nM Gesamtkonzentration der Enden) ausgeführt. Intermolekulare Ligationen von glatten Enden (verwenden gewöhnlich einen 10-30 fachen Überschuß an "Linkern") werden bei einer Gesamtkonzentration von Enden von 1 uM ausgeführt.
Bei "Vektorfragmente" verwendenden Vektorkonstruktionen wird das Vektorfragment gewöhnlich mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) behandelt, um das 5'-Phosphat zu entfernen und eine Religation des Vektors zu verhindern. BAP-Spaltungen werden bei pH 8 in etwa 150 mM Tris in Gegenwart von Na&spplus; und Mg²&spplus; mittels etwa 1 "Unit" BAP pro ug Vektor etwa 1 Stunde bei 6OºC durchgeführt. Zur Rückgewinnung der Nucleinsäurefragmente wird die Präparation mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Alternativ kann eine Religation bei Vektoren verhindert werden, bei denen die unerwünschten Fragmente durch Spaltung mit einem zusätzlichen Restriktionsenzym doppelt gespalten werden.

C.5. Modifikationen der DNA-Sequenzen

Für Teile von von cDNA oder genomischer DNA stammenden Vektoren, die Sequenz-Modifikationen erfordern, wird die zielgerichtete Mutagenese mittels spezifischer Startermoleküle verwendet. Diese Technik ist allgemein bekannt. Sie wird mittels eines zu einer einzelsträngigen zu mutagenisierenden Phagen- DNA komplementären synthetischen Oligonucleotid-Startermoleküls durchgeführt, welches die gewünschte Mutation enthält. Das synthetische Oligonucleotid wird als Startermolekül für die direkte Synthese eines zu dem Phagen komplementären Stranges verwendet. Die erhaltene doppelsträngige DNA wird in ein mit dem Phagen kompatibles Wirtsbakterium transformiert. Kulturen der transformierten Bakterien werden in Top-Agar plattiert, der eine von einer einzelnen, den Phagen enthaltenden Zelle ausgehende Plaquebildung ermöglicht.
Theoretisch enthalten 50% der neuen Plaques den Phagen mit dem mutierten Einzelstrang; 50% weisen die ursprüngliche Sequenz auf. Die Plaques werden mit einem Kinase-behandelten synthetischen Startermolekül bei einer Temperatur hybridisiert, die bei exakter Paarung eine Hybridisierung erlaubt, bei der jedoch Fehlpaarungen mit dem ursprünglichen Strang ausreichen, eine Hybridisierung zu verhindern. Die mit der Sonde hybridisierenden Plaques werden dann isoliert, kultiviert und die DNA gewonnen. Details der zielgerichteten Mutations-Verfahren werden nachstehend in besonderen Beispielen beschrieben.

C.6. Überprüfung der Konstruktion

Bei den nachstehenden Konstruktionen werden korrekte Ligationen zur Plasmidkonstruktion zuerst durch Transformation des E.coli-Stamms MM294 oder anderer geeigneter Wirte mit dem Ligationsgemisch bestätigt. Erfolgreiche Transformanten werden in Abhängigkeit von der Art der Plasmidkonstruktion in bekannter Art und Weise durch Ampicillin-, Tetracyclin- oder andere Antibiotika-Resistenzen oder andere Marker selektioniert. Die Plasmide werden dann aus den Transformanten gemäß dem Verfahren von Clewell D.B. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 62 (1969), 1159), gegebenenfalls nach einer Chloramphenicol-Amplifikation (Clewell D.B., J. Bacteriol. 110 (1972), 667) aufgearbeitet. Die isolierte DNA wird durch Restriktions- und/oder Sequenzanalyse mittels des Didesoxy- Verfahrens von Sanger F. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74 (1977), 5463) wie weiter von Messing et al. (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 309) beschrieben oder mittels des Verfahrens von Maxam et al. (Methods in Enzymology 65 (1980), 499) analysiert.

C.7. Als Beispiel dienende Wirte

Die hier zur Klonierung und Expression verwendeten Wirtsstämme sind folgende:
Zur Clonierung, Sequenzierung und zur Expression der Konstruktion unter Kontrolle der meisten bakteriellen Promotoren wurde der vom E.coli Genetic Stock Center GCSC #6135 erhaltene E.coli-Stamm MM294 als Wirt verwendet. Zur Expression unter Kontrolle des PLNRBS-Promotors wird der Lambda-lysogene E.coli-Stamm K12 MC1000, N&sub7;N&sub5;&sub3;cI857 SusP80, ATCC 39531 verwendet.
Für rekombinante M13-Phagen werden für Phagen-Infektion empfängliche E.coli-Stämme, wie der Stamm E.coli K12 DG98 verwendet. Der DG98-Stamm ist unter der Hinterlegungsnummer 39768 am 13. Juli 1984 bei der ATCC hinterlegt worden.
Expression in Säugern wurde in COS-7 und CV-1-Zellen durchgeführt.

D. Bevorzugte Ausführungsformen

Der erfindungsgemäße, rekombinante CSF-1 kann als eine Reihe von Muteinen mit ähnlichen, jedoch nicht notwendigerweise identischen primären Aminosäuresequenzen betrachtet werden, die alle das für CSF-1 charakteristische Aktivitätsmuster aufweisen oder nach spezifischem Schneiden ein Mutein ergeben, das das für CSF-1 charakteristische Aktivitätsmuster aufweist, d. h. sie sind fähig, Knochenmarkszellen zur Differenzierung zu überwiegend Monocyten zu stimulieren und, im Rahmen der in den vorstehend ausgeführten Definitionen, mit gegen nativen CSF-1 und die mit der CSF-1 Aktivität assoziierten Rezeptoren gerichteten Antikörpern zu reagieren. Es gibt jedoch bestimmte bevorzugte Ausführungsformen dieser Muteine.
Die in Fig. 5 dargestellte Primärsequenz von mCSF-1 besitzt die geforderte Aktivität und fällt selbstverständlich unter die bevorzugten Ausführungsformen. Muteine, in denen bestimmte Sequenzbereiche entweder durch Deletion oder konservativen Austausch von einer oder mehreren Aminosäuren in mCSF-1 verändert wurden, sind ebenfalls bevorzugt. "Konservativer" Aminosäureaustausch bedeutet, daß die Aktivitätscharakteristika des Proteins nicht verändert werden und die Seitenketten der beiden ausgetauschten Reste im allgemeinen durch chemische Ahnlichkeit charakterisiert sind. Saure Reste werden beispielsweise durch andere saure Reste konservativ ersetzt, basische durch basische, hydrophobe durch hydrophobe, sperrige durch sperrige usw. Der Grad der geforderten Ahnlichkeit ist selbstverständlich von der Bedeutung und Beschaffenheit der substituierten Aminosäure abhängig. So sind im allgemeinen bevorzugte Substitutionen für Cystein-Reste, Serin und Alanin; für Asparaginsäure-Reste, Glutaminsäure; für Lysin- oder Arginin-Reste, Histidin, Leucin, Isoleucin oder Valin; für Tryptophan-Reste, Phenylalanin oder Tyrosin usw.
Bereiche des CSF-1-Proteins, die am tolerantesten gegenüber einer Veränderung sind, umfassen Bereiche, die für ihre geringe Homologie zwischen Mensch und Maus-Spezies bekannt sind (Reste 15-20 und 75-84); Bereiche, die Empfindlichkeit gegenüber proteolytischer Spaltung verursachen (Reste 51 und 52 und Reste 191-193); Cysteinreste, die nicht an Disulfidbrücken beteiligt sind oder Reste, die für die Aktivität nicht absolut wesentlich sind (Reste 158-224).
Daher sind die CSF-1 Muteine besonders bevorzugt, die durch die Deletion oder konservative Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder einer oder mehreren Aminosäuresequenzen zwischen den (und einschließlich der) Positionen 158 und 224 von mCSF-1 charakterisiert sind. Ebenfalls bevorzugt sind die durch die Deletion oder konservative Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren in den Positionen 51 und 52 und/oder 191, 192 und 193 von mCSF-1 charakterisierten. Da sie Bereiche scheinbar niedriger Homologie repräsentieren, ist eine andere Reihe von bevorzugten Ausführungsformen durch die Deletion oder konservative Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren in den Positionen 15-20 und/oder 75-84 von mCSF-1 charakterisiert. Ebenfalls bevorzugt sind die Muteine, die durch die Deletion oder konservative Substitution von Cysteinresten in jeder nicht für die Disulfidbrücken-Bildung wesentlichen Position charakterisiert sind. Ebenfalls bevorzugt sind die durch die Deletion oder Substitution des Tyrosinrestes in Position 59 von mCSF-1 charakterisierten Proteine, insbesondere die, die durch einen Asparaginsäurerest substituiert sind.

E. Clonierung und Expression von menschlichem CSF-1

Im folgenden sind die zum Erhalt der menschlichen CSF-1 codierenden Sequenz, zur Clonierung dieser Sequenz in Expressionsvektoren und zur Expression des gewünschten Proteins verwendeten Verfahren dargestellt.

E.1. Reinigung von nativem menschlichem CSF-1 und Sondenherstellung

Urin-CSF-1 aus dem Menschen wurde teilweise gemäß den von Das S.K. et al. (Blood 58 (1981), 630) beschriebenen Standard- Verfahren gereinigt, gefolgt von einem Affinitäts-Reinigungsschritt mittels eines an eine Sepharose B Säule gebundenen monoclonalen, als YYG106 bezeichneten Ratten-Antikörpers gegen Maus-CSF-1 (Stanley E.R., Methods Enzymol. 116 (1985), 564). Der letzte Reinigungsschritt bestand in Umkehrphasen- HPLC in einem 0.1% TFA/30% Acetonitril - 0.1% TFA/60% Acetonitril Puffersystem.
Zur Reinigung des serumfrei durch Induktion mit Phorbol- Myristinacetat hergestellten MIAPaCa-CSF-1, wurde der Zellüberstand einer Calciumphosphat-Gelchromatographie unterzogen (gemäß Das (vorstehend)), gefolgt von einer Affinitätschromatographie mittels Linsen-Lectin (anstelle des ConA-Affinitätsschritts bei Das). Anschließend wurde der den an Sepharose B konjugierten YYG106 monoclonalen Antikörper verwendende Immunaffinitätsschritt und die Umkehrphasen-HPLC wie vorstehend beschrieben ausgeführt.
Mit den bis zur Homogenität gereinigten Urin- und MIAPaCa- Proteinen wurde eine Aminosäure-Sequenzbestimmung mittels eines automatischen Sequenzierers nach dem Edman-Abbau durchgeführt. Es wurde ein ausreichender Teil der N-terminalen Sequenz bestimmt, um die Konstruktion der in Fig. 3 dargestellten Sonden zu ermöglichen.

E.2. Bereitstellung der menschlichen genomischen Sequenz

Die CSF-1 codierende genomische Sequenz des Menschen wurde aus der mit dem Lambda-Phagen Charon 4 angelegten genomischen Bank aus dem Menschen nach Maniatis mittels die N-terminale Sequenz des menschlichen Proteins codierenden Sonden erhalten. Die Genbank wurde mittels partieller HaeIII/AluI- Spaltung des menschlichen Genoms, Ligation mit EcoRI-Linkern und Insertion der Fragmente in EcoRI gespaltene Charon 4 Phagen konstruiert. Ein die CSF-1 Sequenz enthaltender, wie durch Hybridisierung mit der nachstehend beschriebenen Sonde verifiziert, als pHCSF-1 bezeichneter Charon 4A Phage wurde am 2. April 1985 unter der Hinterlegungsnr. 40177 bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt. Spätere Untersuchungen dieses Phagen ergaben, daß Rearrangements und/oder Deletionen erfolgt waren und die korrekten Sequenzen nicht erhalten worden waren. Daher wurde eine alternative als pHCSF-a bezeichnete, in gleicher Weise aus der genomischen Bank erhaltene Kolonie, die zur Bestätigung der Stabilität durch Replikation vermehrt wurde, am 21. Mai 1985 unter der Hinterlegungsnummer 40185 bei der ATCC hinterlegt. pHCSF-1a enthielt eine 18 kb Insertion. Daraus konnten durch Spaltungen mit Restriktionsenzymen Fragmente hergestellt werden, die auch mit der Sonde hybridisierten und zur Sequenzbestimmung und Konstruktion zusätzlicher Sonden, wie nachstehend beschrieben, verwendet wurden.
Falls die CSF-1 codierende Sequenz in ihrer Gesamtheit vorliegt, kann ihre Gegenwart durch Expression in COS-7 Zellen bestätigt werden, wie bei Gluzman Y. (Cell 23 (1981), 175) beschrieben. Das Testfragment wird in ein von pBR322 stammendes modifiziertes Plasmid cloniert, das den SV 40 Replikationsstartpunkt enthält (pGRI Ringold G., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 165-175). Die erhaltenen Vektoren mit hoher Kopienzahl werden in COS-7 Zellen transformiert und nach 24, 48 und 72 Stunden mittels des von Das (vorstehend) beschriebenen Radiorezeptor-Testverfahrens auf die Expression des CSF-1-Gens untersucht. Die Expression steht unter Kontrolle der nativen CSF-1 Kontrollsequenzen. Die in dieser Weise getesteten HindIII-Spaltungen der etwa 18 kb Insertion von pHCSF-1a weisen keine Expression auf. Dies zeigt an, daß HindIII innerhalb des Gens spaltet. Dies wurde durch eine nachfolgende Kartierung bestätigt.
Für die Ausgangssequenzierung wurde jedoch ein 3.9 kb HindIII-Fragment aus dem pHCSF-1a Phagen erhalten und in M13 Clonierungsvektoren cloniert.
Das HindIII-Fragment wurde teilweise sequenziert und die Ergebnisse sind zusammen mit der abgeleiteten Peptidsequenz in Fig. 4 dargestellt. Es enthält die korrekten Codons für den Bereich des menschlichen CSF-1-Proteins, dessen Aminosäuresequenz, wie in Fig. 1 dargestellt, bestimmt wurde. Die Gegenwart eines Introns von etwa 1400 bp wurde von der verfügbaren Aminosäuresequenz abgeleitet. Zusätzlich wurde eine 32-mer Sonde, basierend auf der die Aminosäuren 24-34 codierenden (siehe Bereiche in den Fig. 4 und 5 mit Linien über den Sequenzen) genomischen Sequenz für die cDNA-Bank konstruiert und wie nachstehend beschrieben verwendet.
Genauer wurde die Maniatis-Genbank zum Erhalt des genomischen Clons pHCSF-1a, mit zwei in Fig. 3 dargestellten Oligomergemischen hybridisiert. EK14 und EK15 wurden selektiert, obwohl die anderen dargestellten Oligomere auch brauchbar sind. Eine Sonde "vollständiger Länge" für die N-terminale Sequenz, EK14, wurde als ein Gemisch aus 16 35-meren verwendet. Ein kürzeres Oligomer, EK15, wurde als Gemisch aus 64 18-meren verwendet. Die mit beiden Kinase-behandelten Sonden hybridisierenden Phagen wurden isoliert und durch Infektion von E.coli DG98 oder anderen kompetenten Stämmen kultiviert.
Besondere Bedingungen zur Hybridisierung mit EK14 und EK15 waren wie folgt bei EK14 enthielt der Puffer 15% Formamid, 6·SSC pH 7.0, 5 · Denhardt's, 20 mM Natriumphosphat, 0.2% SDS und 50 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA. Vorhybridisierung und Hybridisierung wurden bei 42ºC durchgeführt und die Filter wurden bei 52ºC in 2 · SSC gewaschen. Bei EK15 wurden ähnliche Bedingungen zur Hybridisierung und Vorhybridisierung verwendet, außer daß die Formamidkonzentration 0% betrug; gewaschen wurde bei etwas niedrigerer Temperatur, 42ºC.
Die aus dem positiv hybridisisierenden Phagen pHCSF-1a isolierte etwa 18 kb DNA-Insertion wurde mit HindIII behandelt und die Fragmente gemäß dem Verfahren von Southern mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Gele wurden auf Nitrocellulosefilter übertragen. Die Filter wurden wieder mit EK14 und EK15 hybridisiert. Beide Sonden hybridisierten mit einem 3.9 kb Fragment.
Das positive Fragment wurde aus dem Gel ausgeschnitten, eluiert und zur Didesoxy-Sequenzierung in einen HindIII-behandelten M13mp19 subcloniert. Ein Teil der Sequenz ist in Fig. 4 dargestellt. Das Unterstrichene entspricht genau der zuvor bestimmten N-terminalen Sequenz des menschlichen CSF-1; die mit Sternchen unterhalb der Sequenz markierten Reste sind zu der Maussequenz homolog.
In Fig. 4 ist der 1.4 kb Intronbereich zwischen den Codons für die Aminosäuren 22 und 23, wie von der von dem gereinigten Protein bestimmten menschlichen Sequenz abgeleitet, als nicht translatiert dargestellt. Die stromaufwärts von den N-terminalen Resten liegende Sequenz enthält den putativen "Leader"; es wird die Translation des unmittelbar benachbart zu dem reifen Protein liegenden Leaderbereichs dargestellt, die tentativ durch vorläufige Sequenzergebnisse des cDNA Clons (siehe nachstehend) verifiziert wurde. Die stromaufwärts liegenden Bereiche werden jedoch als nicht translatiert dargestellt; durch Vergleich mit der cDNA wird bestätigt, daß diese Bereiche ein Intron umfassen.
Die weitere Sequenzierung von etwa 13 kb des gesamten 18 kb Gens zeigt, daß das Gen 9, von 8 Introns getrennte, Exons enthält. Die Bereiche der das reife Protein codierenden cDNA entsprechen genau den genomischen Exon-Codons mit Ausnahme des Codons 59, wie nachstehend weiter beschrieben.
Ein zusätzlicher M13-Subclon wurde durch PstI-Spaltung des 3.9 kb HindIII-Fragments erhalten, wobei ein die bekannte N- terminale Sequenz und etwa 1 kb zusätzliche stromaufwärts liegende Sequenzen umfassendes 1 kb PstI/PstI Fragment entsteht.

E.3. Menschlichen CSF-1 codierende cDNA

Die vom Menschen stammende Pankreas-Carzinom Zellinie MIAPaCa-2 wurde als Quelle für mRNA zur Bestätigung der Sonden und zur Herstellung einer eine intronfreie Form der den menschlichen CSF-1 codierenden Sequenz enthaltende cDNA- Bank verwendet. Die MIAPaCa-Zellinie produziert im Vergleich zu den Maus-L-929 Zellen einen etwa 10 mal niedrigeren CSF-1- Spiegel.
mRNA für die Negativkontrolle wurde aus einer in serumfreiem Medium gehaltenen MIAPaCa-Zellinie hergestellt, d. h. unter Bedingungen, unter denen sie keinen CSF-1 produzieren. CSF-1 produzierende Zellen wurden nach Reinduzierung der CSF-1 Produktion nach Entfernen des Serums erhalten.
Die Zellen wurden bis zur Konfluenz in Roller-Flaschen unter Verwendung des 10% fetales Kalbsserum enthaltenden Dulbecco's Modified Eagles' Mediums (DMEM) wachsen gelassen und produzieren 2000-6000 "Units"/ml CSF-1. Die Zellkulturen wurden gewaschen und nochmals serumfrei inkubiert, um die CSF-1- Bildung zu unterdrücken. Bei Negativkontrollen wurde nach ein bis zwei Tagen kein nachweisbarer CSF-1 produziert. Reinduzierte Zellen wurden nach Zusatz von Phorbol-Myristinacetat (100 ng/ml) erhalten, wobei nach mehreren Tagen eine Produktion von 1000-2000 "Units"/ml erhalten wurde.
Die mRNA wurde durch Lysieren der Zellen in isotonischem 0.5% NP-40 enthaltendem Puffer in Gegenwart des Ribonucleosid- Vanadyl-Komplexes (Berger S.L. et al., Biochemistry 18 (1979), 5143) isoliert, gefolgt von einer Phenol/Chloroform- Extraktion, Ethanolfällung und Oligo-dT-Chromatographie. Man erhielt eine angereicherte mRNA Präparation. Genauer wurden die Zellen zweimal mit PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) gewaschen und in 10 mM Vanadyl-Adenosin-Komplex (Berger S.L. et al., vorstehend) enthaltendem IHB (140 mM NaCl, 10 mM Tris, 1.5 mM MgCl&sub2;, pH 8) resuspensiert.
Ein nicht-ionisches Detergenz vom Ethylenoxid-Polymertyp (NP- 40) wird bis zu 0.5% zum Lysieren der zellulären, jedoch nicht der nucleären Membranen zugesetzt. Die Kerne werden mittels Zentrifugation, für 10 Minuten bei 1000 · g entfernt. Der postnucleäre Überstand wird zu mit zwei Volumen TE (10 mM Tris, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 7.5) gesättigtem Phenol/Chloroform (1 : 1) zugesetzt und auf 0.5% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 10 mM EDTA eingestellt. Der Überstand wird 4 mal reextrahiert. Die Phasentrennung erfolgt mittels Zentrifugation, für 10 Minuten bei 2000 · g. Die RNA wird durch Einstellen der Probe auf 0.25 M NaCl, Zugabe von 2 Volumen Ethanol und Lagerung bei -20ºC gefällt. Die RNA wird 30 Minuten bei 5000 · g pelletiert, mit 70% und 100% Ethanol gewaschen und dann getrocknet. Die polyadenylierte (poly A&spplus;) Boten-RNA (mRNA) wird mittels Chromatographie über Oligo-dT- Cellulose (Aviv J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 69 (1972), 1408-1412) aus der cytoplasmatischen Gesamt-RNA erhalten. Die RNA wird zu einer Konzentration von 2 mg/ml in ETS (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.5% SDS, pH 7.5) gelöst. Die Lösung wird 5 Minuten bei 65ºC erhitzt und anschließend schnell auf 4ºC abgekühlt. Nachdem die RNA-Lösung Raumtemperatur erreicht hat, wird sie auf 0.4 M NaCl eingestellt und langsam über eine zuvor mit Bindungspuffer (500 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5, 0.05% SDS) equilibrierte Oligo-dT-Cellulose- Säule gegeben. Der Durchlauf wird noch zweimal über die Säule gegeben. Die Säule wird dann mit 10 Volumen Bindungspuffer gewaschen. Die Poly A&spplus; mRNA wird mit Aliquots von ETS eluiert, einmal mit TE-gesättigtem Phenol/Chloroform extrahiert und durch Einstellen von 0.2 M NaCl und Zusatz von 2 Volumen 100% Ethanol gefällt. Die RNA wird zweimal umgefällt, einmal in 70% und dann vor dem Trocknen in 100% Ethanol gewaschen.
Die gesamte mRNA wurde 17 Stunden bei 20ºC einer 5-20% (Gewichtsprozent) Saccharose-Gradienten-Zentrifugation in 10 mM Tris HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA und 0.5% SDS unter Verwendung eines Beckman SW40 Rotors bei 27000 Upm unterzogen. Die mRNA- Fraktionen wurden dann mittels Ethanolfällung aus dem Gradienten gewonnen und gemäß dem Standard-Translationstest in Xenoaus Oocyten injiziert. Die von den Oocyten aus den RNA- Fraktionen hergestellten Produkte wurden in dem von Moore R.N. et al. (J. Immunol. 131 (1983), 2374) und Prystowsky M.B. et al. (Am. J. Pathol. 114 (1984), 149) beschriebenen Knochenmarks-Proliferationstest getestet. Die Fraktionen selbst wurden in einer Dotblot-Hybridisierung mit einer der DNA im zweiten Exon der genomischen Sequenz entsprechenden 32-mer Sonde (Exon-II-Sonde) getestet. (Die Linie über den Sequenzen in den Fig. 4 und 5 stellt die Exon-II-Sonde dar). Diese Ergebnisse sind in Fig. 7 zusammengefaßt.
Die unterbrochene Linie in Fig. 7A stellt die Reaktion der Xenopus-Oocyten-Überstände im Knochenmarks-Proliferationstest dar; Fig. 7B stellt die Dotblot-Ergebnisse dar. Die am stärksten hybridisierende Fraktion 11 entspricht einer etwas über der des 18S-Markers liegenden Größe, während die aktivsten Fraktionen 8 und 9 einer Größe von 14-16S entsprechen. Die Fraktionen 8, 9 und 11 wurden, wie nachstehend beschrieben, zur Herstellung einer angereicherten cDNA-Bank verwendet.
(Die mRNA wurde auch auf einem denaturierenden Formaldehydgel fraktioniert, auf Nitrocellulose übertragen und mit der Exon- II-Sonde hybridisiert. Sogar unter stringenten Hybridisierungsbedingungen wurden mehrere distinkte Klassen mit Größen von 1.5 kb bis 4.5 kb gefunden. Um die Möglichkeit auszuschließen, daß mehrere Gene CSF-1 codieren, wurde genomische DNA mit verschiedene Restriktionsenzymen gespalten, ein Southernblot durchgeführt und mit pcCSF-17 DNA hybridisiert. Das Restriktionsmuster stimmte mit der Gegenwart nur eines CSF-1 codierenden Gens überein.)
Der angereicherte mRNA-Pool wurde durch Vereinen der mRNA aus den Gradientenfraktionen (8 und 9), die die höchste Knochenmarks-Proliferations-Aktivität aufweisen, trotz relativ geringer Fähigkeit, mit der Sonde zu hybridisieren (14-16S), mit der am stärksten mit der Sonde hybridisierenden Fraktion (11) hergestellt (etwas größer als 18S). Höhere Molekulargewichte aufweisende, ebenfalls mit der Exon-II-Sonde hybridisierende Fraktionen wurden nicht eingeschlossen, da auch entsprechende mRNA von nicht-induzierten MIAPaCa-Zellen mit der Exon-II-Sonde hybridisierte.
cDNA-Banken wurden aus Gesamt- oder angereicherter menschlicher RNA auf zwei Arten hergestellt. Eine verwendet λ gt10 Phagenvektoren und ist bei Huynh T.V. et al. (in: DNA Cloning Techniques: A Practical Approach IRL Press, Oxford 1984, Hrsg. D. Glover) beschrieben.
Ein bevorzugtes Verfahren verwendet das Starten an den Poly(A)-Schwänzen mittels Oligo-dT und AMV reverser Transcriptase gemäß dem Verfahren von Okayama H. et al. (Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 280-289), das hier per Referenz eingeschlossen ist. Dieses Verfahren führt zu einem höheren Anteil an Clonen vollständiger Länge als das Versehen mit poly-dG- Schwänzen und verwendet wirksam als Wirtsvektor Teile von zwei darin beschriebenen und von den Autoren leicht zu erhaltenen Vektoren, pcDV1 und pL1. Die sich ergebenen Vektoren enthalten die Insertion zwischen proximale BamHI und XhoI Restriktionsstellen enthaltenden Vektorfragmenten. Der Vektor enthält den pBR322-Replikationsstartpunkt, das Amp-Resistenzgen und SV 40-Kontrollelemente, die dem Vektor die Fähigkeit verleihen, die Expression der inserierten Sequenzen in COS-7- Zellen auszuführen.
Eine 300000 Clone umfassende Genbank, die von der vorstehend nach dem "Okayama und Berg-Verfahren" angereicherten MIAPaCamRNA erhaltenen worden war, wurde mittels der Exon-II-Sonde unter sehr stringenten Bedingungen hybridisiert. 10 mit der Sonde hybridisierende Kolonien wurden isoliert und gereinigt. Diese Clone wurden mittels transienter Expression in COS-7- Zellen auf die Gegenwart von CSF-1 codierenden Sequenzen untersucht. Der den SV 40-Promotor enthaltende Clonierungsvektor wurde per se für die Transformation von COS-7-Zellen verwendet.
Plasmid-DNA wurde aus den 10 positiven Clonen mittels eines CsCl-Gradienten gereinigt und die COS-7-Zellen wurden mittels einer Abwandlung der Calciumphosphat-Copräzipitationstechnik (Wang A.M. et al., Science 228 (1985), 149) transfiziert. Nach Inkubation über 3 Tage wurde die CSF-1 Produktion durch Testen der Kulturüberstände mit dem im wesentlichen nach Das S.K. et al. (Blood 58 (1981), 630) durchgeführten Radiorezeptor-Test und dem im wesentlichen nach Prystowsky M.B. et al. (Am. J. Pathol. 114 (1984), 149) durchgeführten Kolonie-Stimulierungs (Knochenmarks-Proliferations)-Test untersucht. Neun der 10 isolierten Kolonien wiesen keine transiente CSF-1 Produktion in COS-7-Zellen auf. Ein Expression aufweisender Clon wurde kultiviert, die Plasmid-DNA isoliert und die Insertion sequenziert. Die DNA-Sequenz ist zusammen mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz in Fig. 5 dargestellt. Die cDNA vollständiger Länge umfaßt 1.64 kb und codiert ein reifes CSF-1 Protein von 224 Aminosäuren. Der Clon wurde als CSF-17 bezeichnet und mit der Cetus Hinterlegungsnr. CMCC 2347 versehen. Er wurde am 14. Juni 1985 bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer 53149 hinterlegt. Das die CSF-1 codierende Sequenz enthaltende Plasmid wurde als pcCSF-17 bezeichnet.

E.4. Transiente Expression von CSF-1

Die Expression der CSF-17 Plasmid-DNA (pcCSF-17) in COS-7- Zellen wurde mittels des Knochenmarks-Proliferations-, des Kolonie-Stimulierungs- und des Radiorezeptor-Tests bestätigt und quantifiziert. Es soll daran erinnert werden, daß die Spezifität des CSF-1 Knochenmarks-Proliferationstests lediglich in der Fähigkeit von CSF-1 Antiserum besteht, die Aktivität zu verringern, während die für den Kolonie-Stimulierungs- Test im Charakter der erhaltenen Kolonien besteht. Beide Tests zeigten CSF-1 Produktion in der Größenordnung von mehreren tausend "Units" pro ml.

Knochenmarks-Proliferation

Für den die biologische Aktivität des Proteins messenden Knochenmarks-Stimulierungstest werden Knochenmarkszellen aus Balb/C Mäusen mit Verdünnungsreihen der 72-Stunden-Überstände behandelt. Die Proliferation der Zellen wurde über die Aufnahme von markiertem Thymidin gemessen (im wesentlichen, wie bei Moore R.N. et al., J. Immunol. 131 (1983), 2374; Prystowsky M.B. et al., Am. J. Pathol. 114 (1984), 149 beschrieben). Das Medium induzierter MIAPaCa-Zellen wurde als Kontrolle verwendet. Die Spezifität für CSF-1 wurde bestätigt, durch die Fähigkeit von gegen Urin-CSF-1 aus dem Menschen gerichteten Kaninchen-Antiseren, die Thymidinaufnahme zu unterdrücken. Die Ergebnisse einer 1 : 16 Verdünnung der von mit pcCSF-17 transfizierten COS-7-Zellüberstände (CSF-17 Überstände) sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1 ³H-Thymidin Einbau (cpm) Keine Zusätze normales Serum anti-Menschen-CSF-1-Serum Medium MIAPaCa-Überstand CSF-17-Überstand
(Das anti-Menschen-CSF-1 Serum wurde-wie von Das et al., vorstehend beschrieben, hergestellt.)
Der MIAPaCa-Überstand (der vorstehend verwendeten 1 : 16 Verdünnung) enthielt 125 U/ml CSF-Aktivität, die 2000 U/ml in dem unverdünnten Überstand entsprechen. 1 "Unit" der Koloniestimulierenden Aktivität ist als die zur Herstellung einer Kolonie aus 10&sup5; Knochenmarkszellen/ml gemäß dem Test von Stanley E.R. et al. (J.Lab. Clin. Med. 79 (1972), 657) benötigte Menge an CSF definiert.
Diese Daten zeigen, daß die Knochenmarks-stimulierende Aktivität mit CSF-1 assoziiert ist, da die Thymidinaufnahme durch anti-CSF-1-Serum gehemmt wird. Die in diesem Knochenmarks- Proliferationstest mit vier Verdünnungen im Bereich von 1 : 8 bis 1 : 64 erhaltene Regression der Ergebnisse ergab eine geschätzte CSF-1 Aktivität in CSF-17 Überständen von 2358 U/ml. Diese wurde in der Gegenwart des Antiserums auf 424 U/ml reduziert, zeigte jedoch in der Gegenwart eines Nicht-Immun- Serums einen scheinbaren Anstieg auf 3693 U/ml. Dies war mit in dem nachstehenden Radiorezeptor-Test gezeigten Ergebnissen vergleichbar.

Kolonie-Stimulierung

Der direkte Test der CSF-17 Überstände auf Kolonie-Stimulierung (Stanley E.R. et al., J. Lab. Clin. Med., vorstehend) ergab 4287 U/ml, die in der Gegenwart von Nicht-Immun-Serum im wesentlichen nicht beeinflußt wurde, jedoch auf 0 U/ml in der Gegenwart des anti-Menschen-CSF-1 aus Kaninchen reduziert wurden. Dies steht im Vergleich zu 2562 U/ml in den MIAPaCa- Überständen. 85 Prozent der mit pcCSF-17 transformierten COS- 7-Überständen induzierten Kolonien wiesen mononucleäre Morphologie auf; mit MIAPaCa-Überstand induzierte Kolonien wiesen ein Verhältnis von 94% Makrophagen - 6% Granulocyten auf.

Radiorezeptor-Test

Der Radiorezeptor-Test mißt die Kompetition zwischen ¹²&sup5;I- markiertem CSF-1 und der Testverbindung um spezifische Rezeptoren auf J774.2 Maus-Makrophagenzellen. Der wie vorstehend auf Kolonie-stimulierende Aktivität getestete MIAPaCa-Überstand wurde als Standard (2000 U/ml) verwendet. Die mit einer 1 : 10 Verdünnung ermittelte CSF-1 Konzentration von mit pcCSF- 17 transformierten COS-7-Überständen betrug 2470 U/ml, die mit einer 1 : 5 Verdünnung ermittelte betrug 3239 U/ml. Demgemäß wurden in den Medien von mit pcCSF-17 transformierten COS-7 Zellen in allen Tests vergleichbare Werte für die CSF-1 Konzentration ermittelt.

E.S. Stabile CSF-1 Expression

Das COS-7 System liefert rekombinantes CSF-1, indem es die Replikation und Expression der Vektorsequenzen ermöglicht. Es handelt sich um ein transientes Expressions-System.
Die menschliche CSF-1-Sequenz kann auch in pro- und eukaryotischen Systemen stabil exprimiert werden. Im allgemeinen erlauben prokaryotische Wirte eine leichte Produktion, während eukaryotische Wirte die Verwendung der nativen Signalsequenz und das Ausführen des erwünschten post-translationalen Prozessierens erlauben. Dies kann im Fall von CSF-1 besonders wichtig sein, da das native Protein als Dimer vorliegt.
Bakterien stellen CSF-1 als Monomer her, das dann nach der Extraktion Dimerisierungs-Bedingungen ausgesetzt werden kann.

Prokaryotische Expression

Für die prokaryotische Expression wird der cDNA-Clon oder die genomische Sequenz, deren Introns beispielsweise durch zielgerichtete Mutagenese herausgeschnitten wurden, derart verändert, daß das ATG-Startcodon unmittelbar stromaufwärts der N-terminalen Glutaminsäure liegt. Unmittelbar stromaufwärts des ATG liegt zur Bereitstellung einer passenden Schnittstelle für die Insertion in die nachstehenden Standard-Wirts- Expressionsvektoren eine HindIII-Stelle. Dies kann direkt mittels zielgerichteter Insertions-Mutagenese mit einem synthetischen Oligomer geschehen, das eine neue, zu dem gewünschten AAGCTTATG komplementäre Sequenz enthält, die von Nucleotidsequenzen flankiert wird, die zu den nativen "Leader" codierenden und den N-terminalen Sequenzen komplementär sind.
Bei der mittels des Verfahrens von Okayama und Berg erhaltenen cDNA wird das die gesamte codierende Sequenz enthaltende DNA-Fragment durch Spaltung mit XhoI (an aus dem Wirts-Clonierungsvektor stammenden Schnittstellen) aus pcCSF- 17 herausgeschnitten, mittels Agarose-Gelelektrophorese isoliert und durch Elektroelution zurückgewonnen. Für die Mutagenese wird die DNA des Wirts-Bakteriophagen M13mp18 ebenfalls mit SalI behandelt, mit dem gereinigten Fragment unter Standardbedingungen ligiert und in gefrorene kompetente Zellen des E.coli-Stamms K12 DG98 transfiziert. Die Zellen werden auf 5 · 10&supmin;&sup4; M Isopropylthiogalactosid (IPTG) der Firma Sigma Chem. (St. Louis, MO) und 40 ug/ml X-Gal enthaltendem Medium plattiert. Nicht komplementierende weiße Plaques werden in frische Medien überführt. Minikulturen werden nach der rekombinanten einzelsträngigen Phagen-DNA der erwarteten Größe abgesucht. Die Struktur des gewünschten rekombinanten Phagen wird mittels Restriktionsanalyse bestätigt.
Ein zu den N-terminalen und den "Leader" codierenden Bereichen der CSF-1-Sequenz komplementäres 34-mer, das jedoch die zu der gewünschten AAGCTTATG-Sequenz komplementäre Sequenz enthält, wird synthetisiert und gemäß den vorstehend in C.4. beschriebenen Verfahren isoliert. Ein Teil dieser 34-mer Präparation wird gemäß einer abgewandelten Technik von Maxam und Gilbert (Maxam A. et al., Methods in Enzymology 68 Academic Press (1980), 521), wie vorstehend in C.4. beschrieben, radioaktiv markiert.
Zur Ausführung der Mutagenese wird der vorstehend hergestellte rekombinante Bakteriophage im E.coli-Stamm K12 DG98 hergestellt und die einzelsträngige Phagen-DNA gereinigt. Ein pmol der einzelsträngigen Phagen-DNA und 10 pmol des vorstehenden synthetischen Nucleotid-Startermoleküls (nicht Kinase-behandelt) wurden durch Erhitzen für 1 Minute bei 67ºC hybridisiert und dann 30 Minuten bei 37ºC in 15 ul 20 mM Tris-Cl pH 8, 20 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 20 mM 2-Mercaptoethanol inkubiert. Die hybridisierte DNA wird mit DNA-Polymerase I (Klenow) und 500 uM dNTPs 30 Minuten bei 0ºC inkubiert und dann auf 37ºC gebracht. Aliquots (0.05 oder 0.25 pmol) werden nach 5, 20 und 45 Minuten entnommen, in den E.coli-Stamm K12 DG98 transformiert und ausplattiert.
Nach dem Wachstum werden die Platten auf 4ºC abgekühlt und die Plaques auf von Biodyne erhaltene PalI-Membranen oder S & S Filter übertragen (1-2 Minuten für den ersten Filter, mehr als 10 Minuten für den zweiten Filter). Die Filter wurden in 2.5 M NaCl, 0.5 M NaOH (5 Minuten) denaturiert. Das denaturierende Medium wird mit 3 M Natriumacetat auf pH 5.5 gebracht oder mit 1 M NaCl enthaltendem 1 M Tris-Cl pH 7.5 neutralisiert. Die Filter werden dann unter Vakuum 1 Stunde bei 80ºC gebacken und dann bei hoher Stringenz vorhybridisiert. Die Filter werden dann mit dem Kinase-behandelten, vorstehend hergestellten synthetischen 34-mer hochstringent hybridisiert, gewaschen und über Nacht bei -70ºC autoradiographiert.
Die RF-Form des gewünschten mutierten Phagen wird mit EcoRI behandelt, mittels Klenow mit glatten Enden versehen und dann mit HindIII gespalten, wobei das Gen als ein HindIII/glattes Ende-Fragment herausgeschnitten wird. (In vollkommen gleicher Weise kann die CSF-1 codierende Sequenz aus pMCSF erhalten und modifiziert werden.)
Dieses die menschliche (oder Maus) CSF-1 codierende Sequenz enthaltende Fragment wird dann mit einem mit HindIII/BamHI (glattendig) gespaltenen pPLOP oder pTRP3 (siehe nachstehend) ligiert, so daß die codierende das ATG Startcodon enthaltende Sequenz unmittelbar stromabwärts von dem PL- bzw. Trp-Promotor liegt. Die erhaltenen Plasmide werden in den Lambdalysogenen E.coli-Stamm MC1000 oder den MM294 Stamm transformiert und die Zellen unter nicht-induzierenden Bedingungen wachsen gelassen. Anschließend wird mit für den Promotor geeigneten Mitteln induziert. Die Zellen werden mittels Zentrifugation geerntet, Ultraschall-behandelt und das freigesetzte CSF-1 gelöst. Die Gegenwart von menschlichem (oder Maus) CSF-1 wird bestätigt, indem mit den Ultraschall-behandelten Zellen der vorstehend beschriebene Kolonie-stimulierende Test durchgeführt wird.

Eukaryotische Expression

Das die menschlichen CSF-1 unter Kontrolle des SV 40- Promotors codierende cDNA enthaltende Okayama-Berg Plasmid pcCSF-17 kann auch für die stabile Expression in Affen CV-1- Zellen verwendet werden. Dies ist die Ausgangs-Zellinie, von der die COS-7-Linie stammte. Die Affen-CV-1 Wirtszellen wurden bis zur Konfluenz kultiviert und dann mittels 10 ug pcCSF-17 und verschiedenen Mengen (1, 2, 5 und 10 ug) pRSV- NEO2 (Gorman C. et al., Science 221 (1983), 551-553) pro 500000 Zellen cotransformiert. Die Transformanten wurden in 100 ug/ml G418 Antibiotikum enthaltendem DMEM-Medium mit 10% FBS wachsen gelassen, wogegen das Plasmid pRSV-NE02 Resistenz verleiht. Die CV-1 Zellinie zeigte eine G418-Transformationsfrequenz von 10&supmin;&sup5; 12 Kolonien pro 106 Zellen pro ug DNA.
Die CV-1 Zellen wurden wie vorstehend beschrieben cotransformiert und in G418-haltigem Medium selektiert. Die resistenten Clone wurden auf die Stabilität ihres G418-resistenten Phänotyps getestet, indem sie in G418-freiem Medium kultiviert und anschließend wieder in G418-haltiges Medium überführt wurden. Die Fähigkeit dieser Kulturen nach Überführung in Antibiotika-haltiges Medium zu überleben, weist darauf hin, daß die pRSV-NE02 DNA permanent in das Genom der Zelle integriert wurde. Da mit einem Marker-Plasmid stabil transformierte Zellen mit einer Wahrscheinlichkeit von etwa 50% auch die DNA des cotransfizierten Plasmids integriert haben, werden etwa die Hälfte dieser Zellen auch die pcCSF-17 DNA in ihrer chromosomalen DNA enthalten.
Verschiedene Clone der G418-resistenten Pools von CV-1 Zellen, von denen wie vorstehend gezeigt wurde, daß sie stabil transformiert sind, wurden isoliert und in einem doppelten Ansatz in Flaschen annähernd bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Eine Flasche von jedem Ansatz wurde mit SV 40-Virus mit einer Infektions-Multiplizität von 5 infiziert und das Medium zum Nachweis von CSF-1 mittels eines Radioimmun-Tests 6 Tage nach der Infektion gesammelt. Der Immuntest basiert auf der Kompetition von ¹²&sup5;I-markiertem MIAPaCa CSF-1 um gegen gereinigten Urin-CSF-1 aus dem Menschen gerichtetes "Rabbit 52" polyclonales Antiserum.
Einer der selektierten CV-1-Clone zeigte gemäß diesem Test eine CSF-1 Produktion von 2335 U/ml, während nicht mit SV 40 infizierte Zellen weniger als 20 U/ml zeigten. Kontrollen, die mit 10 ug pcCSF-17 transformierte COS-7-Zellen verwenden, zeigten ohne SV 40 Infektion eine CSF-1 Produktion von 2400 U/ml.
Bei der CSF-1 produzierenden CV-1 Zellinie ist die pcCSF-17 DNA stabil in ihr Genom integriert und kann so zur stabilen CSF-1 Produktion nach Infektion mit SV 40 verwendet werden. Von der Infektion wird angenommen, daß sie die pcCSF-17 DNA aus dem Genom "befreit" und das für die Replikation der "befreiten" DNA erforderliche SV 40 T-Antigen bereitstellt. Ohne SV 40 Infektion wird die integrierte pcCSF-17 DNA nicht effektiv exprimiert.
Eine Optimierung der Expression der CSF-1 codierenden Sequenz durch die CV-1 (CSF-17) Zellinie wies bei Messung mittels des Radioimmun-Tests sechs Tage nach einer mit einer Infektions- Multiplizität von mindestens 1 erfolgten SV 40 Infektion und eines 10% FBS-Mediums 6500-8000 U/ml auf. Studien der Expressionsraten bei einer Multiplizität von 10 ergaben eine vergleichbare Produktion. Die Produktion wurde jedoch nach Entfernen des FBS aus dem Medium am zweiten Tag nach der Infektion reduziert.
Alternativ können geeignete Kontrollsysteme und Expression in eukaryotischen Wirten erlaubende Wirtsvektoren zur Insertion der CSF-1 codierenden Insertionen verwendet werden. CHO-Zellen und geeignete Vektoren können beispielsweise verwendet werden, wie in der am 1.November 1982 angemeldeten US-Anmeldung Nr. 438,991 beschrieben, die auf den gleichen Rechtsnachfolger übertragen und per Referenz hier eingeschlossen ist.

E.6. CSF-1 Aktivität

Eine zusätzliche Definition der CSF-1 Aktivität wurde mittels partiell gereinigtem MIAPaCa CSF-1 oder Maus-L-Zell CSF-1 als Modelle für das von CV-1 produzierte, rekombinante Material bereitgestellt. Es wurde gezeigt, daß CSF-1 die Produktion von Interferon und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) mittels induzierter menschlicher Monocyten bis auf das 10-fache steigern kann. Es wurde auch gezeigt, daß CSF-1 Makrophagen- Antitumor-Toxizität stimulieren kann.
Stimulierung der TNF-Produktion mittels menschlicher Monocyten MIAPaCa CSF-1 wurde mittels Calciumphosphat-Gelfiltration und Linsen-Lektin Chromatographie aus dem Überstand gereinigt.
Zum Test der Lymphokinproduktion wurden in doppeltem Ansatz periphere Blut-adhärente Zellen in jeweils 10&sup7; Zellen enthaltenden Flaschen inkubiert. Eine Flasche wurde mit 1000 U/ml wie vorstehend gereinigtem CSF-1 behandelt. Nach 3 Tagen wurden die Zellen geerntet, gewaschen, zu einer Zellkonzentration von 5 · 10&sup5;/ml resuspendiert und auf 24 Vertiefungen enthaltenden Platten mit 0.5 ml/Vertiefung ausplattiert. Die Vertiefungen wurden 48 Stunden mit 10 ug/ml LPS und 20 ng/ml PMA behandelt und die Überstände für den TNF-Test gesammelt. Die mit CSF behandelten Zellen zeigten annährend 9 mal höhere TNF-Sekretionen als die unbehandelten Zellen (1500 U/ml im Vergleich zu 162 U/ml).

Stimulierung der Interferon-Produktion mittels menschlicher Monocyten

In einem analogen Experiment wurden zur Bestimmung der CSF-1 Wirkung auf die Interferon-Produktion periphere Blut-adhärente Zellen 3 Tage in Gegenwart und Abwesenheit von 1000 U/ml CSF-1 wie vorstehend beschrieben inkubiert, geerntet, zu 5 · 10&sup5; ml resuspendiert und auf einer 25 Vertiefungen enthaltenden Platte wie vorstehend beschrieben plattiert. Die Interferon-Produktion wurde durch Zusatz variierender Mengen von poly(I):poly(C) zu den Zellen induziert. Die Überstände wurden mittels ihrer cytopathischen Wirkung auf VSV-infizierte GM 2504 Zellen auf die Interferon-Produktion getestet. Die CSF-1 stimulierten Zellen zeigten nach Induktion mit 50 ug/ml poly(I):poly(C), wie bei McCormick F. et al. (Mol. Cell. Biol. 4 (1984), 166) beschrieben eine Produktion von 100 U/ml, während vergleichbar induzierte nicht-behandelte Zellen weniger als 3 U/ml produzierten.

Stimulierung der Myeloid-CSF-Produktion mittels menschlicher Monocyten

Die Monocyten wurden ± CSF-1 3 Tage inkubiert und anschließend zur Produktion von Myeloid-CSF wie in Tabelle 1 induziert. Die drei dargestellten, repräsentativen Experimente verwendeten Blut von verschiedenen Spendern. Tabelle 2 Myeloid-CSF (U/ml) Induktion Medium

Stimulierung des Abtötens von Tumorzellen mittels Maus-Makrophagen: Vergleich mit anderen Kolonie-stimulierenden-Faktoren

Zum Testen der Makrophagen-Stimulierung wurde in einem Test, der die Stimulierung der Fähigkeit von Maus-Makrophagen zeigte, Sarcom-Zielzellen abzutöten, aus L-Zell-konditioniertem Medium erhaltenes Maus-CSF-1 als ein Modell für den von pcCSF-17 rekombinant hergestellten CSF-1 verwendet. In diesem Test wurden normale, 2 Stunden adhärente C3H/HeN peritoneale Maus-Makrophagen einen Tag in vitro mit und ohne CSF-1 inkubiert. Anschließend wurden sie in einem Verhältnis von 20 : 1 mit ³H-Thymidin-markierten Maus-Sarcom-TU5-Zellen zusammen mit 10% V/V conA-induziertem (10 ug/ml) Gamma-Interferon enthaltendem Milz-Lymphokin (LK) gemischt. Die Freisetzung von markiertem Thymidin in den folgenden 48 Stunden wurde als ein Maß für das Abtöten der Tumorzellen verwendet. Die Wirkung der Zugabe von CSF-1 in Form eines 1200 U/ml CSF-1 enthaltenden L-Zell- konditionierten Mediums ist in der folgenden Tabelle dargestellt. Behandlung Sterberate CSF-1 bedingter Anstieg Tag
Ein Anstieg der Fähigkeit, die Zielzellen abzutöten, wurde unabhängig davon beobachtet, ob CSF-1 während des ersten vorbereitenden Tages des Wachstums oder während des Zeitraums der Induktion zugesetzt wurde. Die deutlichste Wirkung wurde jedoch in Gegenwart von CSF-1 während dieser beiden Zeiträume beobachtet.
Die Möglichkeit der durch kontaminierende bakterielle Lipopolysaccharide (LPS) verursachten Stimulierung von Monocyten und Makrophagen wurde ausgeschlossen: Der LPS-Gehalt des zugesetzten CSF-1 war gering (< 0.3 ng/3000 U CSF-1, mittels des Limulus-Amoebocyten-Lysat-Tests bestimmt). Die Aktivität wurde durch Anwendung einer anti-CSF-1-Säule entfernt. Polymyxin B wurde zur Neutralisierung von LPS verwendet. Die Makrophagen der C3H/HeJ-Mäuse reagierten auf CSF-1, jedoch nicht auf LPS.
CSF-GM wurde aus sechs, 5 Stunden nach der IV Verabreichung von 5 ug LPS erhaltenen Mäuselungen präpariert. Die Lungen wurden zerkleinert und 3 Tage in Serum-freiem Medium inkubiert. Aus dem Überstand wurde CSF-1 mittels einer YYG106 Affinitätssäule entfernt (der CSF-1-Gehalt wurde von 270 U/ml auf 78 U/ml reduziert). CSF-G wurde aus ähnlich behandeltem LDI Serum-freiem Medium präpariert. Sowohl die CSF-GM als auch die CSF-G-Gehalte wurden mittels des Kolonie-Stimulierungs-Tests auf 2000 U/ml bestimmt.
Die peritonealen Makrophagen wurden einen Tag entweder mit 40% eines der vorstehenden Medien oder mit L-Zell-Medium inkubiert, das 2000 U/ml CSF-1 enthielt, anschließend entweder mit zusätzlichem Medium oder mit LK 48 Stunden inkubiert und wie vorstehend beschrieben auf das Abtöten von TU5-Zellen getestet.
Die Ergebnisse sind in Fig. 6 zusammengefaßt. Während CSF-1 einen deutlichen Anstieg der TU5-Toxizität zeigte, wiesen weder CSF-G noch CSF-GM irgendeinen Effekt auf.

Stimulierung der antiviralen Aktivität bei der Maus

Adhärente, Thioglykolat-elicitierte Maus-Makrophagen wurden 3 Tage mit CSF-1 inkubiert und über Nacht mit VSV infiziert. Zu den Testproben wurde Polymyxin B zugesetzt, um die Induktion von Interferon durch LPS zu blockieren. Die folgende Tabelle zeigt die adhärent verbleibenden Zellen mittels Kristallviolettfärbung auf. Tabelle 3 Behandlung Kristallviolett -Polymyxin B +Polymyxin B (Mittelwert) Standardabweichung) Medium/Nr.
CSF-1 behandelte Zellen zeigten daher einen Schutz der Makrophagen gegen VSV.

E.7. Formulierung von CSF-1

Der rekombinant hergestellte, menschliche CSF-1 kann mittels pharmazeutischer Standardverfahren zur Verabreichung formuliert werden. Gewöhnlich wird CSF-1 in injizierbarer Form hergestellt. Er kann entweder als einziger Wirkstoff oder in Verbindung mit anderen Proteinen oder Verbindungen mit komplementären oder ähnlichen Eigenschaften verwendet werden. Derartige andere Verbindungen können alternative anti-Tumor- Agentien, wie Adriamycin oder Lymphokine, wie IL-1, -2 und - 3, Alpha-, Beta- und Gamma-Interferone und den Tumor-Nekrose- Faktor umfassen. Die Wirkung des CSF-1 Wirkstoffs kann in Gegenwart derartiger zusätzlicher Komponenten gesteigert oder verbessert werden. Wie vorstehend beschrieben, kann CSF-1 auf vorteilhafte Weise mit geeigneten Blutzellen interagieren. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen daher Inkubationsgemische derartiger Zellen mit CSF-1, gegebenenfalls in Gegenwart zusätzlicher Lymphokine. Es können entweder die Überstand-Fraktionen derartiger Inkubationsgemische oder das gesamte, auch die Zellen enthaltende Gemisch verwendet werden.

F. Maus-CSF-1

Eine Maus-CSF-1 codierende, intronfreie DNA-Sequenz wird mittels einer große CSF-1-Mengen produzierenden Maus-Fibroblasten Zellinie hergestellt. Die von der ATCC erhältliche L- 929-Linie wird als mRNA-Quelle zur Herstellung einer cDNA- Bank verwendet. Diese cDNA-Bank wird mittels auf der Basis der bekannten N-terminalen und CNBr-gespaltenen internen Maus-Peptidsequenz konstruierter Oligomer-Sonden zur Gewinnung der gesamten codierenden Sequenz des Maus-Proteins abgesucht. Aufgrund der Homologie der N-terminalen Sequenzen, der Fähigkeit der menschlichen und der Maus-CSF-1 Präparationen Makrophagenkolonien aus Knochenmarkszellen zu stimulieren und der begrenzten Kreuz-Reaktivität bezüglich der Radiorezeptor- und Radioimmun-Tests (Das S.K. et al., Blood 58 (1981), 630) wird angenommen, daß der Maus-CSF-1 etwa 80% Homologie zu dem menschlichen Material aufweist.

F.1. Protein-Reinigung

Maus-CSF-1 wurde mittels Standardverfahren, ähnlich den von Stanley E.R. et al. (J. Immunol. Meth. 42 (1981), 253-284) und von Wang F. F. et al. (J. Cell. Biochem. 21 (1983), 263- 275) offenbarten oder mittels SDS-Gelelektrophorese gereinigt, wie von Hunkapiller M.W. et al. (Science 226 (1984), 304) zusammengefaßt.
Die Aminosäuren 1-39 der Maussequenz wurden unter Berücksichtigung der Bromcyan-Spaltung in Position 10 zur Erweiterung des Degradations-Verfahrens erhalten. Ein internes Spaltfragment des Mausproteins wurde ebenfalls erhalten und sequenziert.
Die Daten der Gesamt-Zusammensetzung des Maus-Proteins wurden, wie nachstehend dargestellt, ebenfalls erhalten. Diese Daten zeigen korrekte relative Mol % für die gute Zurückgewinnung zeigenden Aminosäuren; die Zahlen sind jedoch nicht absolut, da Histidin und Cystein nicht in guter Ausbeute zurückgewonnen wurden. Aminosäure Mol % Reste/125
Die Umrechnung auf Reste/125 basierte auf einer Abschätzung der Sequenzlänge aus dem Molekulargewicht.

F.2. Präparation der Maus-CSF-1 cDNA

Die Maus-CSF-1 Aminosäuresequenz 5-13 und die interne Sequenz wurden als Grundlage für die Konstruktion der Sonden verwendet.
Drei Sätze von zu der Maussequenz korrespondierenden Oligomeren wurden hergestellt. Es wurde eine "Region A" codierende Sequenz hergestellt, d. h. Aminosäuren 9-13; eine andere "Region B" codierende, d. h. Aminosäuren 5-9, wie in Fig. 2 dargestellt; und eine dritte codierte die Positionen 0-6 einer internen Sequenz, "Region C". Aufgrund der Codon-Redundanz ist jede dieser Oligomer-Klassen hoch degeneriert.
So wurden 15-mere auf der Basis von Region A, Anzahl 48; 14- mere auf der Basis der Region B (wobei das letzte Nucleotid des Codons für Histidin deletiert wurde), ebenfalls Anzahl 48; und 20-mere auf der Basis der Region C, Anzahl 32 konstruiert. Anders dargestellt kann ein so konstruiertes, die Region A codierendes 15-mer eine Fehlpaarung in vier der fünfzehn Positionen aufweisen; ein bestimmtes, hinsichtlich der Region B konstruiertes 14-mer kann eine Fehlpaarung in sechs Positionen aufweisen; ein bestimmtes, hinsichtlich der Region C konstruiertes 20-mer kann eine Fehlpaarung in fünf Positionen aufweisen.
Wie nachstehend beschrieben kann durch geeignete Protokolle eine angereicherte mRNA-Fraktion für die Herstellung der gewünschten angereicherten cDNA-Bank aus der Maus breitgestellt werden und die genau richtigen Oligomere zur Verwendung als Sonden bestätigt werden.
Gesamt-mRNA wird aus Maus-L-929 Zellen extrahiert und gereinigt. Die Maus-L-929 Zellen werden 8 Tage auf DME-Medium kultiviert und dann durch Zentrifugation geerntet. Totale cytoplasmatische Ribonucleinsäure (RNA) wurde nach dem selben Protokoll isoliert, wie vorstehend für MIAPaCa mRNA beschrieben.
Die mRNA wird für den Northernblot, wie in Paragraph C.3. beschrieben, auf Gelen fraktioniert. Die zu Region A korrespondierenden 15-mer Sequenzen werden in vier Gruppen zu jeweils 12 aufgeteilt. Jede dieser Gruppen wurde zur Hybridisierung der Kontroll- und Maus-L-929 mRNA-Flachgele bei niedriger Stringenz verwendet und die erhaltenen Muster mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Unter den verwendeten wenig stringenten Bedingungen erfolgt eine Hybridisierung sowohl mit Fraktionen, die nicht die richtige Sequenz, als auch mit denen, die die richtige Sequenz enthalten. Da sich die Kontrollzellinie von der L-929-Linie auch in anderer Weise als ihrer Unfähigkeit zur Herstellung von CSF-1 unterscheidet, erfolgt eine Hybridisierung bei einer Reihe von mit CSF-1 nicht in Zusammenhang stehenden Größenpositionen in den L-929-Zell-Gelen, die in den Kontrollgelen nicht vorhanden sind.
Vergleichbare Reihen von Kontroll- und L-929-Gelen werden mit den die Region B repräsentierenden Segregaten der 48 14-mere und den die Region C repräsentierenden Segregaten der 32 20- mere hybridisiert. Nur die mRNA-Banden in den L-929-Gelen, die ausschließlich mit entweder den Region A oder B und C- Sonden hybridisieren, werden weiter in Betracht gezogen.
Die RNA-Bande wird selektiert, die unverändert unter Bedingungen steigender hoher Stringenz an eine Sonde des A- Region 15-mer Gemischs oder eine des Region B 14-mer Gemischs und eine des Region C 20-mer Gemischs bindet.
Nach Auffinden der korrekten mRNA-Bande wird jede der Gruppen der Region A 15-mere zur Hybridisierung unter Bedingungen unterschiedlicher Stringenz verwendet. Die bei der höchsten Stringenz bindende Gruppe enthält vermutlich das korrekte 15- mer, welches exakt komplementär zur produzierten mRNA ist. Das korrekte 15-mer wird durch weiteres Aufteilen der Präparation ermittelt, bis ein einziges Oligomer gefunden ist, das unter der höchsten Stringenz bindet. Ein ähnlicher Versuch wird zur Ermittlung des korrekten, an Region B oder C bindenden 14- oder 20-mers verwendet. Diese spezifischen Oligomere stehen dann als Sonden für eine aus der angereicherten mRNA-Fraktion hergestellte Maus-cDNA-Bank zur Verfügung.
Die mRNA-Fraktion, die als die CSF-1 codierende Sequenz enthaltend identifiziert wurde, wird dann in präparativem Maßstab erhalten. In dieser Präparation wurde die Poly A+ mRNA auf einem Saccharose-Gradienten in 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA und 0.5% SDS fraktioniert. Nach 17 Stunden Zentrifugation bei 30000 Upm in einem Beckman SW40-Rotor wurden die mRNA-Fraktionen mittels Ethanolfällung aus dem Gradienten zurückgewonnen. Die aus dem Gradienten zurückgewonnenen RNA- Fraktionen wurden gemäß einem Standard-Translationstest jeweils in Xenopus Oocyten injiziert und die Produkte mittels eines gegen Maus-CSF-1 gerichtete Antikörper verwendenden Radioimmuntests auf CSF-1 getestet. Fraktionen, die positive Ergebnisse ergaben, wurden gepolt und zur Konstruktion der cDNA-Bank verwendet. Diese gleichen Fraktionen hybridisieren mit den Oligomer-Sonden.
Andere Verfahren zur Herstellung von cDNA-Banken sind selbstverständlich bekannt. Ein inzwischen klassisches Verfahren verwendet Oligo-dT Startermoleküle, reverse Transcriptase, Versehen der doppelsträngigen cDNA mit poly-dG-Schwänzen und Inserieren in einen geeigneten, an einer gewünschten Restriktions-Stelle gespaltenen und mit einem poly-dC-Schwanz versehenen Vektor, wie pBR322 oder einem Derivat von diesem. Eine detaillierte Beschreibung dieses alternativen Verfahrens ist beispielsweise in der am 20. Dezember 1983 angemeldeten US Anmeldung Nr. 564,224 zu finden, die auf den gleichen Rechtsnachfolger übertragen ist und die hier als Referenz eingeschlossen ist.
In dem hier verwendeten Verfahren wird die angereicherte mRNA (5 ug) durch Behandlung mit 10 mM Methyl-Quecksilber 5 Minuten bei 22ºC denaturiert und durch Zusatz von 100 mM 2- Mercaptoethanol entgiftet (Payvar F. et al., J. Biol. Chem. 254 (1979), 7636-7642). Das Plasmid pcDV1 wird mit KpnI gespalten, mit dTTP versehen und mit der denaturierten mRNA hybridisiert. Diese Oligo-dT Startermolekül versehene mRNA wird mit reverser Transcriptase behandelt, und der neu synthetisierte DNA-Strang mit dCTP versehen. Schließlich wird der unerwünschte Teil des pcDV1-Vektors durch Spaltung mit HindIII entfernt. pLI wird separat mit PstI gespalten, mit dGTP versehen, mit HindIII gespalten und dann mit dem mit einem poly-T-Schwanz versehenen, um das pcDV1-Vektorfragment erweiterten mRNA/cDNA-Komplex gemischt, mit E.coli-Ligase ligiert und das Gemisch mit DNA-Polymerase 1 (Klenow), E.coli- Ligase und RNase H behandelt. Die erhaltenen Vektoren werden in E.coli K12 MM294 zur AmpR transformiert.
Die erhaltene cDNA-Bank wird dann mittels der Oligomer-Sonden abgesucht, die als komplementär zur mRNA codierenden Sequenz, wie vorstehend beschrieben, identifiziert wurden. Mit den Sonden der Regionen A oder B und C hybridisierende Kolonien werden isoliert und kultiviert; Plasmid-DNA wird isoliert und Plasmide werden isoliert, die Insertionen von ausreichender Größe enthalten, um die gesamte CSF-1-Sequenz zu codieren. Die Sequenz der Insertionen jedes dieser Plasmide wird bestimmt, und eine Plasmidpräparation, die die gesamte codierende Sequenz einschließlich der im stromaufwärts gelegenen Bereich liegenden Regionen A und B enthält, wird als pcMCSF bezeichnet.

F.3. Expression der Maus-CSF-1-DNA

Die Maus-cDNA wird in ähnlicher Weise, wie vorstehend für die menschliche cDNA beschrieben, auf transiente Expression in COS-Zellen getestet und zur Expression in stabil transformierten CV-1-Zellen verwendet. Zusätzlich werden die geeigneten HindIII/ATG codierenden Sequenzen mittels Mutagenese stromaufwärts des reifen Proteins inseriert und die codierenden Sequenzen zur prokaryotischen Expression in pPLOP oder pTRP3 inseriert.

G. Wirts-Vektoren

pPLOP ist ein Wirts-Expressionsvektor, der den PL-Promotor und die Ribosomen-Bindungsstelle des N-Gens benachbart zu einer HindIII-Restriktions-Schnittstelle enthält, wodurch eine passende Insertion einer codierenden Sequenz mit einem ATG-Startcodon ermöglicht wird, dem eine HindIII-Stelle vorangeht. Das Grundgerüst dieses Vektors ist ein temperatursensitives, in hoher Kopienzahl vorliegendes, von pCS3 stammendes Plasmid. pPLOP wurde am 18. Dezember 1984 bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 39947 hinterlegt.
pTRP3 ist ein einen Trp-Promotor unmittelbar stromaufwärts von einer HindIII-Restriktionsstelle enthaltender Expressionsvektor. So wird die Insertion einer codierenden Sequenz in analoger Weise ermöglicht, wie vorstehend für pPLOP erläutert. Das Vektor-Grundgerüst für pTRP3 ist pBR322. pTRP3 wurde am 18. Dezember 1984 bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 39946 hinterlegt.

Konstruktion von pPLOP

Realikations-Startpunkt

pCS3 stellt einen Replikations-Startpunkt bereit, der zu hoher Kopienzahl des pPLOP-Wirtsvektors bei hohen Temperaturen führt. Seine Konstruktion ist ausführlich in der am 14. Oktober 1983 angemeldeten, hier als Referenz eingeschlossenen U.S. Anmeldung Nr. 541,948 beschrieben. pCS3 wurde am 3. Juni 1982 hinterlegt und mit der ATCC Nummer 39142 versehen.
pCS3 stammt von pEW27 und pOP9 ab. pEW27 ist von Wong E.M. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79 (1982), 3570) beschrieben. Es enthält in der Nähe seines Replikations-Startpunkts Mutationen, die für die Temperaturregulation der Kopienzahl verantwortlich sind. Bedingt durch diese Mutationen erfolgt die Replikation bei hohen Temperaturen in hoher und bei niedrigen Temperaturen in geringer Kopienzahl.
pOP9 ist ein Plasmid, das bei allen Temperaturen in hoher Kopienzahl vorliegt. Es wurde durch Insertion des den Replikations-Startpunkt enthaltenden EcoRI/PvuII-Fragments aus dem Plasmid pOP6 des ColE1-Typs (Gelfand D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75 (1978), 5869) in pBR322 konstruiert. Vor der Insertion wurde das Fragment folgendermaßen modifiziert: 50 ug pOP6 wurden vollständig mit jeweils 20 "Units" BamHI und SstI gespalten. Zur Beseitigung der SstI 3'-überhängenden Enden und zum Auffüllen der BamHI 5'-Enden wurde die gespaltene pOP6-DNA in einer Zwei-Schritt-Reaktion zunächst bei 20ºC zur Beseitigung des 3'-überhängenden SstI-Endes und dann zur Reparatur am 5'-Ende bei 9ºC mit E.coli DNA-Polymerase I (Klenow) behandelt. Das mit glatten Enden versehene Fragment wurde gespalten und 0.02 pmol wurden zur Transformation von kompetenten DG75-Zellen (O'Farrell P. et al., J. Bacteriology 134 (1978), 645-654) verwendet. Transformanten wurden auf 50 ug/ml Ampicillin enthaltenden L-Platten selektiert und nach einer 3.3 kb Deletion, dem Verlust einer SstI-Stelle und der Existenz einer neu gebildeten BamHI-Stelle abgesucht.
Ein als pOP7 bezeichneter Kandidat wurde ausgewählt, und die BamHI-Stelle deletiert. Die Deletion erfolgte mittels Spaltung von 25 ug pOP7 mit 20 "Units" BamHI, Reparatur mit dem E.coli DNA-Polymerase I-Fragment (Klenow) und Religierung mit T4 DNA-Ligase. Kompetente DG75-Zellen wurden mit 0.1 ug der DNA behandelt und die Transformanten auf 50 ug/ml Ampicillin enthaltenden L-Platten selektiert. Die Kandidaten wurden auf Verlust der BamHI-Restriktionsstelle abgesucht. pOP8 wurde selektiert. Zum Erhalt von pOP9 wurde das AvaI (repariert)/EcoRI TetR-Fragment aus pBR322 präpariert, isoliert und mit dem isolierten PvuII (partiell)/EcoRI 3560 bp Fragment aus pOP8 ligiert.
Zur Ligierung des 1.42 kb EcoRI/AvaI (repariert) TetR-Fragments (Fragment A) und des 3.56 kb EcoRI/PvuII AmpR-Fragments (Fragment B) wurden 0.5 ug Fragment B und 4.5 ug Fragment A in einer Zwei-Schritt-Reaktion verwendet, um die intermolekulare Ligierung der EcoRI-Enden zu fördern.
Kompetente DG75-Zellen wurden mit 5 ul des Ligierungs-Gemischs transformiert und die Transformanten auf Ampicillinhaltigen Platten (50 ug/ml) selektiert. pOP9 wurde aus AmpRTetR-Transformanten isoliert und wies hohe Kopienzahl, Colicin-Resistenz, einmal vorkommende EcoRI-, BamHI-, PvuII-, HindIII-Restriktionsstellen, 2 HincII-Restriktionsstellen und die passende Größe sowie das passende HaeIII-Spaltungsmuster auf.
Zum Erhalt von pCS3 wurden 50 ug pEW27-DNA vollständig mit PvuII und EcoRI gespalten. Analog wurden 50 ug pOP9 vollständig mit PvuII und EcoRI gespalten. Das 3.3kb-Fragment wurde isoliert.
0.36 ug (0.327 pmol) pEW27-Fragment wurden mit 0.35 ug (0.16 pmol) pOP9-Fragment ligiert und zur Transformation von E.coli MM294-Zellen verwendet. AmpRTetR-Transformanten wurden selektiert. Erfolgreich transformierte Kolonien wurden anfangs bei 30ºC und 41ºC auf Beta-Lactamase Testplatten und dann auf den dem Wachstum bei 30ºC und 41ºC folgenden Plasmid-DNA-Gehalt abgesucht. Ein als pCS3 bezeichneter, erwünschter Kandidat wurde durch Sequenzieren bestätigt.

Präparation der PLNRBS-Insertion

Die den PL-Phagen-Promotor und die Ribosomen-Bindungsstelle des N-Gens (NRSS) enthaltende DNA-Sequenz wurde aus pFC5 und letztendlich von einem von Shimatake und Rosenberg (Nature 292 (1981), 128) beschriebenen pKC3O-Derivat erhalten. pKC30 enthält ein in das HindIII/BamHI pBR322 Vektorfragment cloniertes 2.34 kb-Fragment des Lambda-Phagen. Der PL-Promotor und NR8S befinden sich auf einem zwischen der BglII- und HpaI-Stelle liegenden pKC3O-Segment. Bei dem Derivat von pKC30 wurde die BglII-Stelle in eine EcoRI-Stelle umgewandelt.
Die unmittelbar vor dem PL-Promotor liegende BglII-Stelle wurde folgendermaßen in eine EcoRI-Stelle umgewandelt: pKC3O wurde mit BglII gespalten, mit Klenow und dNTPs repariert, mit T4-Ligase zu einem EcoRI-Linker ligiert (bei New England Biolabs erhältlich) und in den E.coli K12 MM294 Lambda+-Stamm transformiert. Plasmide wurden aus AmpRTetR-Transformanten isoliert und die gewünschte Sequenz durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung bestätigt. Das erhaltene Plasmid pFC3 wurde mit PvuI und HpaI doppelt gespalten. Man erhielt ein etwa 540 bp-Fragment, welches isoliert, mit Klenow und dATP, gefolgt von S1-Nuclease, zur Herstellung eines mit glatten Enden versehenen und die folgende 3'-terminale Sequenz aufweisenden Fragmentes behandelt wurde. Die 3'-terminale Sequenz des Fragments lautet -AGGAGAA, wobei der -AGGAGA-Anteil die NRBS ist. Dieses Fragment wurde mit EcoRI gespalten. Man erhielt ein 347 bp-Fragment mit 5'-EcoRI (überhängend) und HinfI (partielle Reparatur, S1 glattendig) -3'-Termini.
Zur Vervollständigung von pFC5 wurde pßI-Z15 zur Herstellung einer 3' von der NRBS liegenden HindIII-Stelle verwendet. pβI-Z15 wurde am 13. Januar 1984 unter der ATCC Nr. 39578 hinterlegt, und hergestellt, indem eine das ATG mit 140 bp von β-IFN enthaltende Sequenz mit LacZ in pBR322 fusioniert wurde. In pβI-Z15 ist die EcoRI-Stelle aus pBR322 erhalten, und die Insertion enthält eine unmittelbar vor dem β-IFN ATG- Startcodon liegende HindIII-Stelle. pβI-Z15 wurde mit HindIII gespalten, mit Klenow und dNTPs repariert und dann mit EcoRI gespalten. Das erhaltene EcoRI/HindIII (reparierte)-Vektorfragment wurde mit dem vorstehenden EcoRI/HinfI (repariert)- Fragment ligiert und das Ligierungsgemisch zur Transformation von MC1000-39531 verwendet. Die gewünschte Konstruktion enthaltende Transformanten wurden durch ihre Fähigkeit identifiziert bei 34ºC, jedoch nicht bei 30ºC auf Lactose-Minimalplatten zu wachsen. (Transformanten wurden bei 300 und 340 auf X-Gal-Amp-Platten und Minimal-Lactose-Platten ausplattiert. Tranformanten mit der gewünschten Konstruktion sind bei beiden Temperaturen auf X-Gal-Amp-Platten blau, wachsen jedoch nur bei 34ºC auf Lactose-Minimalplatten). Das gewünschte Konstrukt wurde als pFC5 bezeichnet.

Vervollständigung von pPLOP

pCS3 wurde zur Bereitstellung der PL- und NRBS-Kontrollsequenzen modifiziert. pCS3 wurde mit HindIII und dann mit EcoRI gespalten. Das Vektorfragment wurde mit einem aus pFC5 isolierten, PLNRBS enthaltenden EcoRI/HindIII-Fragment ligiert und in E.coli MM294 transformiert. Durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung wurde die gewünschte Struktur der isolierten Plasmid-DNA bestätigt. Das Plasmid wurde als pPLOP bezeichnet.

Herstellung von DTRP3

Zur Konstruktion des die trp-Kontrollsequenzen hinter einer HindIII-Stelle enthaltenden Wirtsvektors wurde die trp-Promotor/Operator/Ribosomen-Bindungsstelle-Sequenz ohne die Attenuator-Region aus von C. Yanofsky, Stanford University, erhaltenem pVH153 erhalten. Trp-Sequenzen stehen in einer Reihe derartiger, bekannter Plasmide zur Verfügung. pVH153 wurde mit HhaI behandelt (das unter Bildung eines exponierten 3'- überhängenden Endes direkt 5' des trp-Promotors schneidet), mittels Klenow mit glatten Enden versehen und mit TaqI partiell gespalten. Das 99 bp-Fragment, das einer Spaltung an der 6 Nucleotide vor dem ATG-Startcodon des trp-Leaders liegenden TaqI-Stelle entspricht, wurde isoliert und dann mit dem EcoRI (repariert)/ClaI gespaltenen pBR322 ligiert. Man erhält pTRP3.
Am 21. Mai 1985 wurden pHCSF-1a, in der Cetus-Sammlung als CMCC 2312 bezeichnet, und pHCSF-1 λCharon 4A zur Hinterlegung unter der Hinterlegungsnummer 40185 bei der ATCC hinterlegt. Am 14. Juni 1985 wurde das als CMCC 2347 bezeichnete in E.coli MM294 enthaltene CSF-17 bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 53149 hinterlegt. Diese Hinterlegungen wurden nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und deren Ausführungsordnung (Budapester Vertrag) vorgenommen. Dies sichert die Zugänglichkeit einer lebensfähigen Kultur 30 Jahre vom Datum der Hinterlegung an. Die Hinterlegungen werden durch die ATCC zugänglich gemacht gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags und aufgrund einer Vereinbarung zwischen den Anmeldern und der ATCC, die ständige und unbeschränkte Zugänglichkeit nach der Veröffentlichung des entsprechenden US-Patents sicherstellt. Wenn die hinterlegte Kultur nach Kultivierung unter geeigneten Bedingungen abstirbt, verlorengeht oder zerstört wird, stimmt der Rechtsnachfolger hier zu, daß diese unverzüglich nach Mitteilung durch einen lebensfähigen Mikroorganismus der gleichen Kultur ersetzt wird. Die Zugänglichkeit der Hinterlegungen ist nicht als Lizenz zur Ausübung der Erfindung konträr zu den jeweiligen staatlichen, in Übereinstimmung mit deren Patentgesetzen erteilten Rechten zu verstehen.

Claims

1. Isolierte DNA-Sequenz, die entweder ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der Reste 1 bis 224 von Fig. 5

oder eine Modifikation dieser Aminosäuresequenz durch Deletion, Addition oder Änderung codiert, mit der Maßgabe, daß Dimere der modifizierten Polypeptidsequenz die primäre Bildung von Makrophagen-Kolonien in dem in vitro-CSF-1-Test stimulieren.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die menschlichen CSF-1 codiert.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz hat, die im wesentlichen äquivalent zu der von nativem menschlichem mCSF-1 ist.

4. DNA-Sequenz nach Anspruch 2, wobei entweder (a) der menschliche CSF-1 eine Aminosäuresequenz hat, die gekennzeichnet ist durch die Deletion oder konservative Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren, die sich zwischen den Positionen 158 und 224 befinden, einschließlich des in Fig. 5 angegebenen mCSF-1; oder (b) der menschliche CSF-1 eine Aminosäuresequenz hat, die gekennzeichnet ist durch die Deletion oder konservative Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren an den Positionen 51 und 52 und/oder den Positionen 191, 192 und 193 des in Fig. 5 angegebenen mCSF-1; oder (c) der menschliche CSF-1 eine Aminosäuresequenz hat, die gekennzeichnet ist durch die Deletion oder konservative Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren an den Positionen 15 bis 20 und/oder den Positionen 75 bis 84 des in Fig. 5 angegebenen mCSF-1; oder (d) der menschliche CSF-1 eine Aminosäuresequenz hat, die gekennzeichnet ist durch die Deletion oder Substitution des Tyrosinrests an Position 59 des in Fig. 5 angegebenen mCSF-1.

5. DNA-Sequenz nach Anspruch 2, wobei der menschliche CSF-1 eine Aminosäuresequenz hat, die ausgewählt ist aus mCSF-1, 158cSF-1 und Asp&sub5;&sub9;CSF-1.

6. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei der CSF-1 die Aminosäuresequenz von natürlichem Maus-CSF-1 hat.

7. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die ein Protein mit einer Aminosäuresequenz codiert, die in dem Phagen erhältlich unter ATCC 40185 oder dem Plasmid erhältlich unter ATCC 53149 codiert wird.

8. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die ein menschliches bzw. ein Maus-CSF-1-Polypeptid codiert, wobei der CSF-1 eine N-terminale Aminosäuresequenz hat, die eine Sequenz umfaßt, ausgewählt aus

9. Verfahren, umfassend die Herstellung von cDNA aus mRNA, die aus der unter ATCC CRL 1420 erhältlichen Zellinie extrahiert ist, und Isolierung einer DNA-Sequenz daraus, die die in Fig. 5 angegebenen Aminosäuren i bis 224 codiert.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die cDNA mit einem 32- mer-Sondenmolekül, das der DNA im zweiten Exon des menschlichen CSF-1-Gens entspricht, unter hoher Stringenz nachgewiesen wird.

11. Verfahren, das die Herstellung eines Proteins umfaßt, das in dimerer Form die primere Bildung von Makrophagenkolonien im in vitro-CSF-1-Test stimuliert, wobei das Protein in rekombinanten Wirtszellen hergestellt wird, indem transformierende DMA exprimiert wird, die eine isolierte DNA-Sequenz umfaßt, die durch das Verfahren nach Anspruch 9 oder 10 hergestellt wurde.

12. Protein, das entweder eine Aminosäuresequenz hat, die durch die in Fig. 5 angegebenen Aminosäuren 1 bis 224 repräsentiert wird; oder das eine Aminosäuresequenz hat, die im wesentlichen äquivalent mit der genannten Sequenz ist.

13. Replikativer Clonierungsvektor, der eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 einschließt.

14. Replikativer Clonierungsvektor, der die in Anspruch 8 definierte DNA-Sequenz und ein in einem einzelligen Organismus funktionelles Replikon umfaßt.

15. Expressionssystem, das die DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 8 funktionell gebunden an geeignete Kontroll-Sequenzen umfaßt.

16. Expressionssystem nach Anspruch 15, angeordnet in einem Vektor, der zur Replikation in geeigneten Wirtszellen fähig ist.

17. Rekombinante Wirtszellen, die mit dem Expressionssystem nach Anspruch 16 transformiert sind.

18. Verfahren zur Herstellung von rekombinantem CSF-1, das die Züchtung der Zellen von Anspruch 17 umfaßt.

19. DNA nach Anspruch 1, die in einem unter ATCC 40185 oder ATCC 53149 erhältlichen Clon angeordnet ist.

20. Protein nach der Definition in Anspruch 12, das von einer DNA nach einem der Ansprüche 4, 5, 7 oder 8 codiert wird.

21. Protein nach Anspruch 1? oder Anspruch 20 zu einer der folgenden Verwendungen:

(a) Stimulierung des Immunsystems; oder

(b) Behandlung von Infektionen; oder

(c) Behandlung von Neoplasmen; oder

(d) Zusatztherapie bei Chemotherapie; oder

(e) Zusatztherapie bei Knochenmarkstransplantation; oder

(f) Stimulierung von Makrophagen oder Monocyten; oder

(g) Stimulierung von Makrophagen zum Aufnehmen und Abtöten von Hefe; oder

(h) Behandlung von Makrophagen oder Monocyten in vitro für anschließende Verabreichung.

22. Verwendung eines Proteins nach Anspruch 12 oder Anspruch 20 zur Herstellung eines Medikaments, wobei das Medikament:

(a) zur Verwendung bei der Stimulierung des Immunsystems; oder

(b) zur Behandlung von Infektionen; oder

(c) zur Behandlung von Neoplasmen; oder

(d) zur Verwendung als Zusatztherapie bei der Chemotherapie; oder

(e) zur Verwendung als Zusatztherapie bei einer Knochenmarkstransplantation vorgesehen ist; oder

(f) als Ergebnis der Makrophagen-Stimulierung wirksam; oder

(g) als Ergebnis der Monocyten-Stimulierung wirksam ist.

23. Verwendung nach Anspruch 22, wobei das Medikament so hergestellt wird, daß es zur Verabreichung des Proteins in Verbindung mit α-, β- oder γ-Interferon, IL-2, TNF, IL-1, IL-3 oder Adriamycin geeignet ist.

24. Formulierung für eine der im Anspruch 21 definierten Verwendungen, die ein Protein nach Anspruch 12 oder Anspruch 20 formuliert für diese Verwendung umfaßt.

25. Formulierung nach Anspruch 24, die auch ein pharmazeutischen Excipienten, einen Zellkultur-Überstand oder eine Zellkultur enthält.

26. Verfahren, in dem Zellen zur Expression von CSF-1 befähigt werden, das die Transformation von Wirtszellen mit einem Expressions-System nach Anspruch 16 umfaßt.

27. Therapeutische Formulierung, umfassend ein Protein nach Anspruch 12 oder Anspruch 20 formuliert zur medizinischen Verwendung.

28. Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Formulierung, umfassend die Formulierung eines Proteins nach' Anspruch 12 oder Anspruch 20 zur medizinischen Verwendung.