-
Die Erfindung betrifft ein neues physiologisch aktives
Polypeptid, insbesondere ein neues Polypeptid mit
Lymphotoxinaktivität, und sie betrifft eine
Antitumorzusammensetzung, die das neue Polypeptid als einen
Wirkstoff enthält.
-
Man kennt Lymphotoxin (im folgenden als LT bezeichnet) als
eine Art Lymphokin, das spezifisch oder unspezifisch aus
Lymphozyten und Lymphoid-Zellinien freigesetzt wird und
cytotoxische Aktivität hat. LT ist nicht nur gegen
verschiedene Krebszellen cytotoxisch, sondern auch in der
Lage, die cytotoxische Aktivität von bestimmten
Antikrebsmitteln oder Interferonen zu verstärken, und man
erwartet daher, daß es im medizinischen Bereich als ein
Antitumormittel von Nutzen ist (Granger G. A. et al., 14th
International Congress of Chemotherapy, Kyoto, Japan, 23. bis
28. Juni 1985, Abstracts, S. 15; Matsunaga K. et al., ibid,
S. 352)
-
Man kennt eine Vielzahl von Verfahren zur LT-Herstellung
unter Verwendung von aus dem Menschen stammender Zellen. Nach
einem Verfahren [Peter J. B. et al., Journal of Immunology,
111, 770 (1973); Walker S. M und Lucas Z. J., ibid, 109, 1233
(1972)] werden z. B. Mandelzellen oder periphere
Blutlymphocyten in Gegenwart eines Phytohaemagglutinins (im
folgenden als PHA bezeichnet) kultiviert, und das Produkt LT
wird aus dem Kulturüberstand isoliert. Nach einem anderen
Verfahren [Yamamoto B. S. et al., Journal of Biological
Response Modifiers, 3, 76 (1984)] wird eine Lymphoid-Zellinie
in Gegenwart von Phorbolmyristatacetat (im folgenden als PMA
bezeichnet) kultiviert, und das Produkt LT wird aus dem
Kulturüberstand isoliert. Nach einem weiteren Verfahren
[Asada M. et al., Cellular Immunology, 177, 150 (1983)] werden
humane T-Zellen-Hybridoma in Gegenwart von PMA und/oder
Concanavalin A (im folgenden als Con A bezeichnet)
kultiviert.
-
Bei diesen bekannten Verfahren treten jedoch Probleme
dahingehend auf, daß sie LT nur in kleinen Mengen produzieren
können und teure Nährquellen (z. B. fetales Kalbsserum) zur
Verwendung in den Kulturmedien erforderlich machen. Daher ist
eine wirtschaftliche Produktion von LT von hoher Reinheit
nach den bekannten Verfahren sehr schwierig.
-
Als ein alternatives Verfahren, welches zur Herstellung von
LT in großen Mengen dienen könnte, wurde ein Verfahren
vorgeschlagen, welches das Einfügen eines dem LT
entsprechenden Gen in einen Vektor unter Verwendung
sogenannter gentechnischer Verfahren umfassen würde, was
ermöglichen würde, daß sich das Gen im Bakterium, Pilzen,
Hefen oder tierischen Zellen unter Herstellung von LT in
diesen replizieren würde, transkribiert und translatiert
würde. Demnach wurde die Isolierung eines dem LT
entsprechenden Gens erwartet.
-
Die Erfinder haben jüngst einen LT-produzierenden humanen T-
Zellen-Hybridoma-Klon erhalten, nämlich den Klon A-C5-8,
durch Zellfusion nach dem Emetinactinomycin-D-Verfahren
[Asada M. et al., Cellulare Immunology, 177, 150 (1983)]. Wenn
jedoch der Klon A-C5-8 in Gegenwart von Con A und/oder PMA
unter optimalen Bedingungen für die LT-Produktion kultiviert
wurde (Inkubationsperiode von 30 Stunden oder länger), konnte
keine dem LT entsprechende Messenger-RNA (im folgenden als
mRNA bezeichnet) beobachtet werden, und es konnte daher kein
dem LT entsprechendes Gen erhalten werden.
-
Die Erfinder haben daher intensive Untersuchungen
durchgeführt, um die Bedingungen herauszufinden, unter denen
eine dem LT entsprechende mRNA erhalten werden könnte, und
haben als Ergebnis gefunden, daß, wenn der Klon A-C5-8 in
Gegenwart von PMA und/oder Con A für einen Zeitraum von nicht
länger als 24 Stunden (vorzugsweise nicht länger als
4 Stunden) kultiviert wird, kann eine dem in den Zellen
gebildeten LT-Polypeptid entsprechende mRNA beobachtet
werden. Sie klonierten dann ein neues Gen, das für das LT-
Polypeptid kodiert, unter Anwendung gentechnischer Verfahren
auf diese mRNA (japanische Patentanmeldung (OPI) Nr.
151182/87, entsprechend EP-A-0230781; der Begriff "OPI"
bedeutet hier ungeprüfte veröffentlichte Anmeldung).
-
Die Erfinder führten ferner intensive Untersuchungen durch
und ihnen gelang die Herstellung von LT-Polypeptid in
Mikroorganismen, die mit einem phenotypischen
Expressionsvektor transformiert worden war, indem das für das
LT-Polypeptid kodierende klonierte Gen (cDNA) eingefügt
worden war. Ihnen gelang ferner die Gewinnung im wesentlichen
von Verunreinigungen freiein humanen LT-Polypeptid aus dem so
erhaltenen, das humane LT-Polypeptid enthaltende
Kultivierungsprodukt. Sie bestätigten, daß dieses humane LT-
Polypeptid als hervorragendes therapeutisches Mittel gegen
bösartige Tumoren dienen kann. Die Erfindung beruht auf
dieser Erkenntnis.
-
Gray P. W. et al. [Nature, 312, 721 (1984)] berichten von
einem Verfahren zur Herstellung von LT unter Verwendung
rekombinanter DNA-Techniken. Sie kultivierten auf diese Weise
nicht anhaftende humane periphere Blutlymphocyten in
Gegenwart von PMA, Staphylococcenenterotoxin B und
Thymosinα&sub1; für 48 Stunden, isolierten eine mRNA aus den Zellen,
stellten eine cDNA auf Grundlage dieser mRNA her,
ligatisierten die cDNA nach Restriktionsenzymspaltung mit
einem synthetischen Oligonukleotid, und bewirkten die LT-
Expression in Escherichia coli. Auf Basis der in diesem
Bericht erwähnten Daten nimmt man an, daß das LT, das sie
erhielten, aus 171 oder 172 Aminosäureresten aufgebaut ist
und ein Molekulargewicht von 18600 hat.
-
Die von den Erfindern erhaltene mRNA unterscheidet sich vom
LT von Gray et al. darin, daß sie von humanen T-Zellen-
Hybridoma-Ursprung ist, daß die aus der mRNA abgeleitete cDNA
eine verschiedene Nukleotidsequenz hat und daß das
erfindungsgemäße LT-Polypeptid aus 151 Aminosäureresten
aufgebaut ist und ein unterschiedliches Molekulargewicht und
eine unterschiedliche Aminosäuresequenz hat.
-
Die Erfindung stellt daher ein neues Polypeptid mit LT-
Aktivität zur Verfügung.
-
Insbesondere betrifft die Erfindung ein im wesentlichen von
Verunreinigungen freies humanes LT-Polypeptid, das durch
Spaltung der cDNA (Tabelle 1), die für das nach dem in der
japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 151182/87 beschriebene
Verfahren erhaltene LT-Polypeptid kodiert, mit einem
Restriktionsenzym, Ligatisieren der gespaltenen cDNA mit
einem phenotypischen Expressionsvektor mit einer eingebauten
Translationsinitiierungsstelle und der zuvor rnit dem gleichen
Restriktionsenzym gespalten wurde, Einschleusen des
erhaltenen phenotypischen Expressionsvektors in einen
geeigneten Wirt, z. B. Escherichia coli, Kultivieren der so
erhaltenen Transformante, Extraktion und Reinigen aus der so
erhaltenen Kultur, erhalten wurde.
TABELLE (1)
-
Es wird daher nach einem erfindungsgemäßen Aspekt ein
homogenes physiologisch aktives rekombinantes humanes
Lymphotoxinpolypeptid zur Verfügung gestellt, welches (a) im
wesentlichen frei von Verunreinigungen ist, (b) eine N-
terminale Aminosäuresequenz von Met-His-Leu-Ala-Ser-Asn-Leu-
Lys-Pro-Ala-Ala-His-Leu-Ile-Gly-Asp-Pro-Ser-Lys-Gly-Asn- hat
und (c) die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
-
Im folgenden wird die obige Sequenz als Formel (1)
bezeichnet.
-
Der Kern der Erfindung ist somit die DNA, die für ein
physiologisch aktives Peptid mit der Aminosäuresequenz der
Formel (1) kodiert, und eine Antitumorzusammensetzung, die
als Wirkstoff eine für die Tumorbehandlung wirksame Menge
eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz der Formel (1)
enthält.
-
Die in der obigen Formel (1) verwendeten Symbole (Polypeptid)
und in Tabelle 1 (Nukleotidseguenz) sind wie folgt definiert:
-
ALA : Alanin,
-
ASN : Asparagin,
-
CYS : Cystein,
-
GLU : Glutaminsäure,
-
HIS : Histidin,
-
LEU : Leucin,
-
MET : Methionin,
-
PRO : Prolin,
-
THR : Threonin,
-
TYR : Tyrosin,
-
A : Adenin,
-
G : Guanin,
-
ARG : Arginin,
-
ASP : Aspararaginsäure,
-
GLN : Glutamin,
-
GLY : Glycin,
-
ILE : Isoleucin,
-
LYS : Lysin,
-
PHE : Phenylalanin,
-
SER : Serin,
-
TRP : Tryptophan,
-
VAL : Valin,
-
C : Cytosin,
-
T : Thymin
-
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der
Restriktionsenzymkarte, die im erf indungsgemäßen
Arbeitsbeispiel erhalten wurde.
-
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung der
Restriktionsschnittstellen, die zur Bestimmung der im
erfindungsgemäßen Arbeitsbeispiel verwendeten
Nukleotids, wie auch der Richtungen und Bereiche zu
Bestimmung der Nukleotidsequenz verwendet wurde.
-
In diesen Figuren bedeutet B BamHI, E EcoRI und P PstI.
-
Fig. 3 zeigt das Konstruktionsschema für einen
Expressionsvektor, pDK101, der ein Gen enthält, das
für die Aminosäuresequenz des LT-Polypeptids aus
Beispiel 5 kodiert, worin der Pfeil die Richtung und
Reaktion des Promotors andeutet.
-
Fig. 4 zeigt das Konstruktionsschema für einen
Expressionsvektor, pDK20, der ein Gen enthält, das
für die Aminosäuresequenz des in der japanischen
Patentanmeldung (OPI) Nr. 8399/88 (entsprechend EP-A-
0230781) in Beispiel 10 beschriebenem LT-Polypeptid.
Der Pfeil bedeutet die Richtung und Reaktion des
Promotors.
-
Insoweit die Aminosäuresequenzen der Polypeptide mit LT-
Aktivität betroffen sind, beschrieb der Bericht von Aggarwal
B. B. et al. [Journal of Biological Chemistry, 260, 2334
(1985)], daß zwei aus der humanen Lymphoblast-Zellinie
RPMI 1788 abgeleiteten LTs ein Molekulargewicht von 20000 und
25000 haben. Der sechste Aminosäurerest (ASN) in der
Aminosäuresequenzen [Formel (1)] und die N-terminale
Aminosäurezusammensetzung des erfindungsgemäßen LT-
Polypeptids unterscheiden sich von diesen beiden LTs. Daher
ist in dem oben erwähnten LT mit einem Molekulargewicht von
20000 die terminale Aininosäure HIS das Gegenstück zur N-
terminalen Aminosäuresequenz ET-HIS-LEU- LA in Formel (1).
-
Im LT mit einem Molekulargewicht von 25000 ist das Gegenstück
zur N-terminalen Aminosäuresequenz ET-HIS-LEU- LA in der
Formel LEU-PRO-GLY-VAL-GLY-LEU-THR-PRO-SER-ALA-ALA-GLN-THR-
ALA-ARG-GLN-HIS-PRO-LYS-MET-HIS-LEU-ALA-HIS. Die drei
Polypeptide unterscheiden sich daher voneinander auf der
molekularen Stufe.
-
Wenn ein Gen in Escherichia coli exprimiert wird, tritt im
allgemeinen ein zusätzlicher Methioninrest am N-Terminus auf,
und dies kann negative Wirkungen haben, wie Antigenität, bei
der Anwendung des Expressionsproduktes als Arzneimittel.
Erfindungsgemäß werden die 222sten bis 224sten Nukleotide
(ATG), wie in Tabelle 1 gezeigt, als Startkodon verwendet, so
daß die Anfügung eines zusätzlichen Methioninrestes vermieden
werden kann.
-
Für eine weite und sichere Anwendung des LT-Polypeptids als
Arzneimittel ist es wichtig, das Expressionsprodukt-LT-
Polypeptid als eine Einzelkomponentensubstanz zu isolieren.
-
Die soweit bekannten Lymphotoxine, z. B. die in der
japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 8398/88 (entsprechend
EP-A-0230781) beschriebenes LT-Polypeptid ist dahingehend
nachteilig, daß der N-terminale Teil unstabil ist, und
während der Kultivierung, Reinigung und/oder Lagerung leicht
gespalten wird, und daher ist eine weitere Reinigung zum
Erhalt eines Polypeptids mit der erwünschten
Aminosäuresequenz erforderlich, obwohl das Spaltungs-
Polypeptidprodukt seine LT-Aktivität behält. In anderen
Worten, es ist schwierig sie als homogene Produkte zu
erhalten. Z. B. zeigen, daß in der japanischen
Patentanmeldung (OPI) Nr. 8398/88 und das von Gray et al.
berichtete Lymphotoxin, das 172 Aminosäurereste enthält, zur
Umwandlung während der Reinigung in LT-Polypeptide, bei denen
ein Teil der N-terminalen Aminosäuresequenz fehlt.
-
Vermutliche Gründe für solche Spaltung im N-terminalen Teil
sind Spaltung aufgrund von Protease, die intrazellulär
während der Kultivierung und/oder Zell-Erntung freigesetzt
wird und Spaltung aufgrund verschiedener Faktoren während der
Reinigungsschritte und Lagerung, z. B. Protease, Hitze, pH,
Ionenstärke, Wechselwirkung mit Harz, Lösungsmittel und
mechanische Scher-Kräfte. Das erfindungsgemäße LT-Polypeptid
ist gegenüber den obigen Spaltungsfaktoren sehr stabil und
zeigt kein Anzeichen einer Spaltung im N-terminalen Bereich,
und daher kann das LT-Polypeptid der Formel (1) allein in
hoher Reinheit erhalten werden.
-
Als Polypeptid mit humaner LT-Aktivität, kann das in der
japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 8399/88 beschriebene
LT-Polypeptid Erwähnung finden. Diese LT-Polypeptid
unterscheidet sich jedoch vom erf indungsgemäßen LT-Polypeptid
auf der molekularen Stufe, da die N-terminale
Aminosäuresequenz des ersteren ¹MET-HIS-LEU-ALA HIS-SER ist,
und die letztere M T-HIS-LEU-ALA-S R-ASN ist. Ferner ist die
Menge des LT-Polypeptids, erhältlich durch Einschleusen eines
Gens für das LT-Polypeptid, wie in der japanischen
Patentanmeldung (OPI) Nr. 8399/88 in einen Expressionsvektor
zur erfindungsgemäßen Verwendung beschrieben, wobei man
ermöglicht, daß das Gen im gleichen Wirt wie in der
erfindungsgemäßen Verwendung exprimiert wird, wodurch die
Akkumulierung des LT-Polypeptids in Wirt (Zellen) erfolgt,
und Extraktion desselben hieraus, ein Drittel der LT-
Polypeptidmenge, die erfindungsgemäß erhältlich ist. Dies
legt nahe, daß die Produktivität des erfindungsgemäßen LT-
Polypeptids in Wirtszellen sehr hoch ist, oder daß eine
Stabilität in Wirten derjenigen des in der japanischen
Patentanmeldung (OPI) Nr. 8399/88 beschriebenen LT-
Polypeptids überlegen ist.
-
Das erfindungsgemäße LT-Polypeptid, wie durch Formel (1)
definiert, wurde auf Grundlage der obigen Erkenntnisse
ausgewählt.
-
Die Erfindung wird im folgenden in weiteren Einzelheiten
beschrieben.
(1) Auswahl von Zellen mit hoher LT-Produktivität:
-
Als LT-produzierende Zellen sind normale humane
Lymphocyten, humane T-Lymphoid-Zellinien, wie CCRF-CEM,
MOLT-4F und JURKAT und klonierte Zellinien davon, wie
auch humane B-Lymphoid-Zellinien, wie RPMI-1788,
einsetzbar. Insbesondere werden LT-produzierende humane
T-Zell-Hybridoma, erhalten durch Zellfusion von normalen
humanen T-Lymphocyten mit einer etablierten humanen T-
Lymphoid-Zellinie, besonders bevorzugt, da sie eine hohe
LT-Produktivität haben, und Subkultivierung der Zellen
möglich ist. Die LT-produzierenden humanen T-Zellen-
Hybridoma haben eine höhere LT-Produktivität als die
humane T-Lymphoid-Stammzellinie, und es können daher
größere Mengen an mRNA aus den Zellen extrahiert und
isoliert werden.
-
Die LT-Aktivitätsmessung wurde nach dem Verfahren von
Kobayashi Y. et al. [Journal of Immunology, 122, 791
(1979)] durchgeführt. Daher wurde cytotoxische Aktivität
einer Probe, nämlich des Kulturüberstandes oder eines
Zellextraktes gegenüber Maus-LP3-Zellen (sublinie von L-
Zellen) als ein Index verwendet. Eine Einheit/ml (E/ml)
entspricht der Konzentration von LT, die einen
cytophatischen Effekt bei 50 % der Zielzellen auslöst.
-
Die LT-produzierenden humanen T-Zell-Hybridoma können
nach bekannten Verfahren Hergestellt werden (japanische
Patentanmeldung (OPI) Nr. 72520/83).
-
Z. B. werden daher humane T-Lymphoid-Tumorzellen mit
einem Proteinsyntheseinhibitor oder mit einer
Kombination des Inhibitors und einem RNA-
Syntheseinhibitor behandelt. Getrennt davon werden
humane T-Lymphocyten mit einem Mitogen oder einem
Antigen stimuliert. Beide werden dann in Gegenwart eines
Hybridisierungsbeschleunigers (z. B. Polyethylenglycol)
hybridisiert, und die erhaltenen Hybridzellen (humane T-
Zell-Hybridoma) werden isoliert. Die so erhaltenen
humanen T-Zell-Hybridoma werden in einem Kulturmedium
(z. B. einem Kulturmedium, hergestellt durch Zugabe von
10%igen fetalem Kalbsserum, 5 x 10&supmin;&sup5; M, was im folgenden
als RPMI-Medium bezeichnet wird) bei 37ºC unter O&sub2;(5 %)-
Luft (95 %)-Atmosphäre inkubiert, und die obigen LT-
produzierenden humanen T-Zell-Hybridoma werden
gescreent.
(2) Inkubation der Zellen:
-
Für den Erhalt von mRNA aus den LT-produzierenden
humanen T-Zell-Hybridoma sind mindestens 10&sup9; oder mehr
Zellen erforderlich, und diese Zellen werden im
allgemeinen durch Inkubation der Hybridoma erhalten.
Z. B. werden die Zellen in ein Nährmedium in einer Menge
von 10&sup5; bis 10&sup7; Zellen/ml und in einer Laborschale oder
in einem Rotationsflascheninkubator für die Gewebekultur
(Spinnerflasche) unter einer CO&sub2;(5 %)-Luft-(95 %)-
Atmosphäre bei 37ºC inkubiert.
-
Der Inkubationszeitrauin ist ca. 1 bis 5 Tage, obwohl der
von der Zusammensetzung des Mediums und/oder der
Ausgangszellkonzentration abhängen kann. Nach Inkubation
wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet.
-
Das Nährmedium kann ein Basismedium sein, das mit einem
oder mehreren Bestandteilen, ausgewählt aus Sacchariden,
Aminosäuren, Vitaminen, Hormonen, Proteinen,
Antibiotika, Wachstumsfaktoren, anorganischen Salzen und
ähnlichen ergänzt ist, oder ein Basismedium, das mit
einem Tierserum ergänzt wurde.
-
Als Basismedium sind handelsüblich erhältliche RPMI-
1640-Medium, MEM-Medium, Dulbecco's-modifiziertes MEM-
Medium, usw. einsetzbar.
-
Das Tierserum, z. B. fetales Kalbsserum, neugeborenes
Kalbsserum, Pferdeserum oder humanes Serum, kann dem
Basismedium in einer Menge von 1 bis 20 % des Mediums
zugesetzt werden.
-
Alternativ können die Zellen in Nacktmäusen, Hamstern
oder anderen warmblütigen, nicht menschlichen Tieren
vermehrt werden.
(3) Amplifizierung der mRNA:
-
Die LT-produzierenden humanen T-Zell-Hybridoma aus
Schritt (2) werden in ein Nährmedium in einer Menge von
10&sup6; bis 10&sup7; Zellen/ml gegeben, dann wird PMA und/oder
Con A zugegeben, und inkubiert. Auf diese Weise können
Zellen, die die dem LT entsprechenden mRNA enthalten, in
großen Mengen erhalten werden. Die optimale
Konzentration von PMA liegt im allgemeinen im Bereich
von 20 bis 200 ng/ml, und die von Con A im Bereich von 5
bis 50 ug/ml.
-
Der Inkubationszeitraum sollte daher nicht länger als
24 Stunden sein, besonders bevorzugt nicht länger als
8 Stunden. Dies liegt daran, daß der Gehalt an mRNA
entsprechend der Lymphotoxinaktivität in den
kultivierenden Zellen mit der Zeit abnimmt. Falls die
Inkubationszeit 24 Stunden übersteigt, insbesondere
falls die Inkubationszeit 24 bis 72 Stunden beträgt, von
der man weiß, daß sie optimal zur Gewinnung von LT aus
dem Kulturüberstand bei LT-produzierenden humanen T-
Zell-Hybridoma im allgemeinen ist, wird die
intrazelluläre Menge an der dem LT entsprechenden mRNA
sehr klein, und es wird sehr schwierig diese mRNA zu
gewinnen.
(4) Extraktion der gesamten RNA aus den Zellen:
-
Die Extraktion der gesamten zellulären RNA aus den in
Schritt (3) erhaltenen Zellen kann nach einem bekannten
Verfahren durchgeführt werden, z. B. nach dem Guanidin-
Hydrochlorid-Verfahren [Deeley R. G. et al., Journal of
Biological Chemistry, 252, 8310 (1977)].
-
Daher werden z. B. die Zellen (10&sup9; oder mehr Zellen) die
in Schritt (3) erhalten wurden, in einem Homogenatpuffer
(enthaltend 8 M Guanidinhydrochlorid, 5 mM
Dithiothreitol und 20 mM Natriumacetat; pH auf 7 mit
NaOH eingestellt) suspendiert, und mittels eines
Homogenisators oder ähnlichem zerstört. Die gesamte
Nukleinsäurefraktion wird aus dem erhaltenen Homogenat
durch Ethanolpräzipitation und Phenolextraktion
extrahiert, und anschließend wird die gesamtzelluläre
RNA aus dem Extrakt durch Präzipitation mit
Lithiumchlorid gewonnen. Während des
Extraktionsverfahrens empfiehlt man, daß die Apparatur
und Gerätschaften trocken erhitzt sein sollten, oder mit
Diethylenpyrocarbonat behandelt und anschließend in
einem Autoklaven sterilisiert sein sollten, und daß das
technische Personal Vinylplastik-Handschuhe an ihren
Händen tragen sollte, um Zersetzung der RNA durch
Wirkung durch RNase zu vermeiden.
(5) Isolierung von mRNA aus Gesamt-RNA:
-
Die erwünschte mRNA kann aus der gesamten zellulären RNA
nach konventionellen Verfahren, einschließlich der
Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation,
Gelfiltration, Elektrophorese, Membranfiltration, Oligo-
dT-Säulenchromatographie und Kombinationen davon
isoliert werden.
-
Zur Bestätigung der so erhaltenen mRNA als die
erwünschte LT-kodierende mRNA reicht es aus, die
Translation der mRNA in ein Protein zu veranlassen, und
die biologische Aktivität des Proteins zu testen. Z. B.
wird die mRNA einem geeigneten Proteinsynthesesystem
injiziert oder zugegeben, wie den Eizellen von Xenopus
laevis, einem Reticulocytenlysat oder Weizenkeimlingen,
um die Translation hierin in ein Protein durchzuführen,
und man überprüft, ob das erhaltene Protein gegenüber
Maus L-P3 cytotoxisch ist. Genauer wird das Verfahren,
umfassend die Verwendung von Xenopus laevis-Eizellen,
z. B. wie folgt durchgeführt:
-
Die mRNA wird in jede Eizelle in einer Menge von ca. 50
bis 100 ng nach dem Mikroinjektionsverfahren injiziert,
und 20 so behandelte Eizellen werden in 200 ul
modifizierter Barth-Salzlösung (enthaltend pro Liter
0,13 g Nacl, 0,075 g HCl, 0,2 g NaHCO&sub3;, 0,2 g
MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,08 g Ca(NO&sub3;)&sub2; 4H&sub2;O, 0,09 g CaCl&sub2; 6H&sub2;O,
2,38 g HEPES, 100 mg Streptomycin und 100000 Einheiten
Penicillin G; pH 7,4; im folgenden als MBS bezeichnet)
bei 23ºC 48 Stunden inkubiert. Der so erhaltene
Kulturüberstand wurde als Probe verwendet und auf LT-
Aktivität mit der cytopathischen Aktivität gegen L-P3-
Zellen als Index getestet.
-
Die erfindungsgemäße LT-kodierende mRNA hat die
folgenden Eigenschaften:
-
(i) Sie hat einen Sedimentationskoeffizienten von
12,6S bis 14,6S;
-
(ii) Sie hat eine Polyadenylensäurestruktur an ihrem
3'-Terminus;
-
(iii) Sie kodiert für ein LT-Polypeptid.
(6) Klonierung von Lymphotoxin-cDNA:
-
Die in Schritt (5) erhaltene mRNA wird als Matrize und
Oligo(dT) als ein Primer verwendet und eine
einzelsträngige cDNA, die komplementär zur mRNA ist,
wird mit reverser Transkriptase (d. h. Vogel-
Myeloblastosis-Virus-abgeleitete reverse Transkriptase)
in Gegenwart von dATP, dGTP, dCTP und dTTP
synthetisiert. Die Matrizen-mRNA wird dann durch
Hitzebehandlung denaturiert. Dann wird diese
einzelstängige cDNA als Matrize verwendet und eine
doppelsträngige DNA wird unter Verwendung von DNA-
Polymerase I (Klenow-Fragment) aus Escherichia coli
synthetisiert. Diese doppelsträngige DNA wird aus der
denaturierten mRNA und Protein durch Alkalibehandlung
und Phenolextraktion isoliert. Man läßt auf die
doppelsträngige DNA eine reverse Transkriptase
einwirken, um diese in eine komplette doppelsträngige
DNA zu überführen. Die so erhaltene DNA hat eine
Haarnadelschleifenstruktur, die mit S&sub1;-Nuklease (S&sub1;-
Nuklease aus Aspergillus oryzae) gespalten wird. Die so
erhaltene DNA mit einer kompletten doppelsträngigen
Struktur wird z. B. in das Plasmid pBR322 an der Pstl
(Restriktionsenzym)-Schnittstelle nach üblicher Weise
eingefügt, z. B. durch das Poly(dG)-Poly(dC)- oder
Poly(dA)-Poly(dT)-Homopolymerextensionsverfahren [Noda
M. et al., Nature, 295, 202 (1982); Maniatis T. et al.,
"Molecular Cloning (A Laboratory Manual)", 217 (1982),
Cold Spring Harbor Laboratory, New York]. Das erhaltene
rekombinante Plasmid wird in einen Wirt, wie Escherichia
coli HB101 für seine Tranformation nach dem Verfahren
von Perbal B. ["A Practical Guide to Molecular Cloning",
268 (1984), John Wiley & Sons Inc., Canada]
eingeschleust, es wird ein Tetracyclin-resistenter Stamm
selektiert und eine DNA-Bank gebildet.
-
Die cDNA-Bank wird einem Kolonie-Hybridisierungstest
unter Verwendung einer synthetischen Sonde, um nach dem
gesuchten Klon zu screenen, unterzogen [Montgomery D. L.
et al., Cell, 14, 673 (1978); Goeddel D. V. et al.,
Nucleic Acids Research, 8, 4057 (1980)]. Auf diese Weise
werden zwei Oligonukleotide chemisch synthetisiert, die
in komplementärer Weise den 18 Nukleotiden von den
404ten bis 421sten Nukleotiden und den 18 Nukleotiden
vom 500sten bis 517ten Nukleotid in von Gray et al.
[Nature, 312, 721 (1984)] beschriebenen Lymphotoxin-Gen
entsprechen, und mit ³²P durch Phosphattransfer von [γ-
³²P]-ATP auf die 5'-terminale Hydroxylgruppe in
Gegenwart einer Polynukleotidkinase (T4-
Polynukleotidkinase aus T4-Phasen-infiziertes
Escherichia coli) markiert. Die beiden markierten
Oligonukleotide wurden als Sonden zur Selektion eines
Klons aus der obigen cDNA-Bank verwendet, der zur
starken Bindung an beide Sonden in der Lage ist. Die
Plasmid-DNA wird aus dem so erhaltenen Klon isoliert, in
die einzelsträngige Form durch Erhitzen oder alkalische
Denaturierung umgewandelt, und auf einem
Nitrozellulosefilter fixiert. Hierzu wird eine
Lymphotoxin-mRNA-haltige mRNA-Fraktion zur
Hybridisierung zugegeben, und die gebundene mRNA wird
durch Elution gewonnen. Diese wird in Eizellen von
Xenopus laevis injiziert, und die gewonnene RNA wird
überprüft, ob sie für Lymphotoxin kodiert oder nicht.
(Dieser Test wird im folgenden als "Hybridisierungs-
Translations-Test" bezeichnet.) Das oben erwähnte
Verfahren kann eine klonierte DNA ergeben, die als
Insert ein DNA-Fragment enthält, welches eine
Basensequenz enthält, die komplementär zur Lymphotoxin-
mRNA ist.
-
Ferner kann dieses in einem Dauertransformantenstamm
klonierte DNA-Fragment mit einem geeigneten
Restriktionsenzym ausgeschnitten, mit ³²P markiert und
als Sonde zum Vorscreenen der obigen cDNA-Bank verwendet
werden, so daß ein größeres cDNA-Fragment selektiert
werden kann.
-
Eine Restriktionsenzymkarte des so erhaltenen DNA-
Fragments wird erstellt, das Fragment wird unter
Verwendung von M13-Phagen kloniert, die Nukleotidsequenz
des Fragments wird durch das Dideoxysequenzverfahren
nach Sanger E. et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74,
5463 (1977)] analysiert, die Nukleotidsequenz, die die
Aminosäuresequenz von Lymphotoxin, welches bereits
bestimmt wurde, kodiert, und abschließend wird die cDNA,
die die Nukleotidsequenz (d. h. die Nukleotidsequenz vom
165sten bis 677sten Nukleotid in Tabelle 1) die dem
kompletten Translationsbereich für Lymphotoxin
entspricht, ausgewählt, wodurch die klonierte DNA
(Tabelle 1) mit der für ein Polypeptid, enthaltend die
Aminsäuresequenz des Lyinphotoxins, kodierende
Nukleotidsequenz erhalten werden kann.
-
Eine Rekombinante des Plasmid pBR322, die durch
Insertion der klonierten DNA, die für ein Polypeptid
kodiert, das die Aminosäuresequenz des Lymphotoxins wie
in Tabelle 1 enthält, wurde als pLT13 bezeichnet. Eine
Transformante von Escherichia coli HB101, erhalten durch
Transfektion mit pLT13, wurde gemäß Budapester Vertrag
beim Fermentation Research Institute (Bikoken), Agency
of Industrial Science and Technology, Ministry of
Interantional Trade and Industry, Japan, unter der
Hinterlegungsnummer FERM BP-1226 am 29. November 1986
hinterlegt.
-
(7) Herstellung eines phenotypischen Expressionsvektors, der
das für die Aminosäuresequenz des LT-Polypeptids
kodierende Gen enthält, und seine Expression einem
Mikroorganismus:
-
Zur Durchführung der Expression des Gens, das für die
Aminosäuresequenz des in Formel (1) gezeigten LT-
Polypeptids kodiert, in einem Mikroorganismus, z. B.
Escherichia coli, ist es notwendig, daß LT-cDNA-Gen
zusammen mit den daran angehefteten Initiierungskodon
(ATG) stromabwärts eines ständigen Promotors, wie dem
tac-(trc)-Promotor oder trp-Promotor, einzuschleusen.
Eine ribosomale Bindungsstelle ist ebenfalls 5 bis
15 Nucleotide stromaufwärts des Initiierungskodon
erforderlich.
-
Im allgemeinen sind die Ausbeuten manchmal gering, wenn
ein Säugergen zur Expression in einem Mikroorganismus,
z. B. Escherichia coli, veranlaßt werden soll.
Vermutlich liegt dies z. B. (1) an der
Transkriptionseffizienz des Promotors, (2) der
Nukleotidsequenz und der Sekundärstruktur der
ribosomalen Bindungsstelle und der Benachbartheit des
ATGs, (3) der Kodonhäufigkeiten und (4) am Abbau des
Produkts. Was Punkt (1) betrifft, so wird allgemein der
tac-(lac-Reihe)-Promotor oder trp-Promotor verwendet.
Was Punkt (2) betrifft, sollte man nach einer optimalen
ribosomalen Bindungsstelle unter verschiedenen
ribosomalen Bindungsstellen suchen. Was Punkt (3)
betrifft, so unterscheiden sich Säugetiere in der
Kodonhäufigkeit von Escherichia coli, und daher sind
Veränderungen gegenüber im Escherichia coli verwendeten
Kodons manchmal erwünscht. Was Punkt (4) betrifft, ist
die Einschleusung in verschiedene Escherichia coli-
Stämme und/oder Einbau, für eine vollständigere
Kontrolle, eines Repressorgens in den Expressionsvektor
wichtig. Es ist auch wichtig, diejenigen Nukleotide zu
substituieren oder zu deletieren, die Aminosäureresten
entsprechen, die leicht mit einer Protease gespalten
werden können. Es ist auch wirksam, die dem Signalpeptid
entsprechende Nukleotidsequenz mit der LT-cDNA zu
fusionieren, so daß das Expressionsprodukt in das
Periplasma oder Kulturmedium ausgeschleust werden kann.
-
Bei der Durchführung der Erfindung wird empfohlen, daß
der LT-Expressionsvektor unter besonderer
Berücksichtigung der Punkte (1), (3) und (4) konstruiert
wird. Daher wird trc (eine Art eines tac-Promotors)
verwendet, und der synthetische DNA-Teil, der dem N-
Terminus des LTs entspricht, wird modifiziert, um das
anschließende Gen-Manipulationsverfahren durchzuführen,
so daß dieses solche Kodons enthält, die am besten für
Escherichia coli geeignet sind, mit Ausnahme für die
Einführung der Erkennungsstelle für das
Restriktionsenzym.
-
Ferner wird für das Wirts-Screenen und für eine
effiziente Induktion eine Repressorgen in dem
Expressionsvektor eingebaut.
-
Zur Expression von erfindungsgemäßen,
LT-Polypeptidkodierender cDNA kann der bekannte Escherichia coli-
Stamm, wie HB101 (Bethesda Research Laboratories), JM105
(Pharmacia), W3110 (ATCC 27325) und Y1089 (ATCC 37196)
als ein Wirt verwendet werden. Der Stamm W3110 kann
bevorzugt aufgrund seiner hohen LT-Produktivität
eingesetzt werden.
-
Das Medium zur Verwendung bei der Kultur von Escherichia
coli-Transformanten, die den auf obige Weise
konstruierten LT-Expressionsvektor enthalten, kann ein
natürliches oder synthetisches Medium sein.
-
Was die Kulturbedingungen betrifft, ist es notwendig
nach solchen für die Inkubationstemperatur, pH,
Schüttelrate und Belüftungsrate zu suchen, die für die
LT-Produktion geeignet sind.
(8) Kultur von LT-Polypeptid-produzierenden Escherichia coli
und Reinigung des LT-Polypeptids:
-
Die in Schritt (7) erhaltenen Transformante (LT-
porduzierende Escherichia coli) wird in einem IPTG-
haltigen Medium kultiviert, bis eine ausreichende Menge
an LT-Polypeptid produziert ist. Das inkubierte Material
wird dann durch Ultraschallbehandlung, mittels einem
APV-Gaulin-Hochdruck-Homogenisator oder durch ähnliche
Maßnahmen aufgebrochen, und die aufgebrochenen Zellen
oder der durch Zentrifugation desselben erhaltene
Überstand wird einer Kombination von Aussalzen mit
Amoniumsulfat, Ultrafiltration,
Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration,
Hitzebehandlung, Umkehrphasenchromatographie,
Chelatharzchromatographie und
Umkehrphasenchroamtographie behandelt, wodurch das LT-
Polypeptid als ein im wesentlichen reines Produkt
erhalten werden kann.
-
Das in Schritt (8) erhaltene Polypeptid wurde auf seine
Aminosäurezusammensetzung und eines N-terminale
Aminosäuresequenz untersucht. Die erhaltenen Daten
stimmten mit den von Formel (1) geschätzten Werten
überein, wie das maßgebliche Arbeitsbeispiel zeigt.
-
Die DNA-Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz
nach Formel (1) kodiert, ist im folgenden als
Nukleotidsequenz (1) gezeigt.
NUKLEOTIDSEQUENZ (1)
(9) Antitumoraktivität des LT-Polypeptids:
-
Es wurde gezeigt, daß das LT-Polypeptid cytocidal
gegenüber Tiertumorzellen in vitro und in vivo wirkt,
und als ein Antitumormittel verwendet werden kann. Eine
erfindungsgemäße Antitumorzusammensetzung umfaßt eine
für die Tumorbehandlung wirksame Menge des LT-
Polypeptids und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Die erfindungsgemäße Antitumorzusammensetzung kann durch
Mischen des LT-Polypeptids mit einem pharmazeutisch
annehmbaren Stabilisator, wie Gelatine, Serumalbumin
oder Maltitol und einem geeigneten Exzipienten, falls
erwünscht, hergestellt werden. Die Dosis variiert je
nach Verabreichungsweg, der Art des Krebses und dem
Körpergewicht des Patienten. Die nicht-toxische Menge
des LT-Polypeptids für eine Maus ist 1 x 10&supmin;³ bis
5 x 10&sup7; Einheiten/kg/Tag bei intravenöser Injektion
(i.v.) oder intratumoraler Injektion (i.t.)
-
Die vorliegende Erfindung wird in Einzelheiten unter
Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erläutert, die jedoch
nicht als den Umfang der Erfindung einschränkend ausgelegt
werden sollen.
BEISPIEL 1
Herstellung von Lymphotoxin-produzierenden humanen T-Zell-
Hybridoma:
-
Humane periphere Blutlymphocyten (im folgenden als PBL
bezeichnet; 10&sup6; Zellen/ml) wurden mit 20 ug/ml Concanavalin A
(Con A) im RPMI-Medium 2 Tage behandelt, und dann wurde das
an die Zellen gebundene Con A so weit wie möglich unter
Verwendung von 0,2 M α-Methyl-D-Mannosid entfernt.
-
Getrennt hiervon wurden humane T-lymphoide Tumorzellen, CCRF-
CEM (im folgenden als CEM bezeichnet), die sich im
Wachstumsstadium in RPMI-Medium befanden, durch
Zentrifugation gesammelt. Sie wurden in RPMI 1640-10 mM
HEPES-Medium in einer Menge von 2 x 10&sup5; Zellen/ml
suspendiert. Zu der Suspension wurde Emetinhydrochlorid
(Nakarai Chemicals) und Actinomycin D (PL Biochemicals) an
Konzentrationen von 5 x 10&supmin;&sup5; M und 0,25 ug/ml zugegeben, und
die Zellen wurden bei 37ºC 2 Stunden behandelt. Anschließend
wurde Emetinhydrochlorid und Actinomycin D aus dem
Kulturüberstand durch Zentrifugation entfernt.
-
Die so hergestellten PBL-Zellen und CEM-Zellen wurde in einem
Verhältnis von 10:1 gemischt, und die Mischung wurde
zentrifugiert. Zum so erhaltenen Zellpellet wurden 0,5 ml
46%iges Polyethylenglycol (PEG-1540; Wako pure Chemical
Industries) und MEM-Medium, das 5 ug/ml Poly-L-arginin und
15 % Dimethylsulfoxid enthielt, zugegeben, und die erhaltene
Mischung wurde sanft bei 37ºC 45 Sekunden zur Bewirkung der
Hybridisierung gerührt. Anschließend wurden 10 ml vom MEM-
Medium, das mit 10 ml 25 mM HEPES (pH 7,2) gepuffert war,
langsam zugegeben, und die erhaltene Mischung wurde
zentrifugiert.
-
Zum Zellpellet wurde RPMI-Medium zugegeben um die Zellzahl
auf 10&sup6;/ml einzustellen. Ein 100-ul-Anteil des zellhaltigen
Mediums wurde mit 100 ul RPMI-Medium, das Mitomycin-C-
behandelte CEM-Zellen (4 x 10&sup5; Zellen/ml) als Futterzellen
enthielt, vermischt, und die erhaltene Mischung wurde in die
Vertiefung einer 96-Platten-Kulturplatte verteilt und bei
37ºC unter CO&sub2;-(5 %)-Luft-(95 %)-Atmosphäre für ca. 3 bis 4
Wochen inkubiert. Nach der Inkubation wurden die gewachsenen
Hybridoma nach dem Limitationsverdünnungsverfahren unter
Verwendung der oben erwähnten Mitomycin-C-behandelten CEM-
Zellen als Futterzellen kloniert. Nach weiterem Wachstum
wurde jeder Klon auf Lymphotoxinaktivität getestet.
-
Im folgenden wurde die Inkubation unter einer CO&sub2;-(5 %)-Luft-
(95 %)-Atmosphäre bei 37ºC inkubiert, sofern nicht anders
angegeben.
-
Der Lymphotoxin-produzierende humane T-Zell-Hybridom-Klon A-
C5-8 zur erfindungsgemäßen Verwendung zeigte bei Stimulation
mit 20 ug/ml Con A und 20 ng/ml PMA bei einer
Zellkonzentration von 2,5 x 10&sup5; Zellen/ml und Inkubation über
24 Stunden eine Lymphotoxinaktivität von 250 Einheiten/ml.
Ohne Stimulation zeigte der Klon A-C5-8 eine
Lymphotoxinaktivität von 4,0 Einheiten/ml.
BEISPIEL 2
Isolierung und Reinigung von mRNA-Fraktion aus
Lymphotoxinproduzierenden humanen T-Zell-Hybridoma (A-C5-8):
(1) Kultur von Lymphotoxin-produzierenden humanen
T-Zell-Hybridoma (A-C5-8):
-
Der Klon A-C5-8 wurde bei einer Konzentration von
5 x 10&sup6; bis 10&sup7; Zellen/ml 2, 4, 8, 24 oder 48 Stunden
kultiviert, wobei PMA und Con A in Endkonzentrationen
von 100 ng/ml und 20 ug/ml zugegebenen wurden.
(2) Herstellung der zellulären RNA:
-
Die gesamte zelluläre RNA des Klons A-C5-8 wurde im
wesentlichen nach dem Guanidinhydrochloridverfahren
extrahiert. Speziell wurden nach jedem oben erwähnten
Inkubationszeitraum A-C5-8-Zellen durch Zentrifugation
(1000 Upm, 5 Minuten) gesammelt und in PBS (enthaltend
5 mM Phosphatpuffer und 0,15 M NaCl; pH 7,4) suspendiert
und die Suspension wurde nochmals bei 1000 Upm 5 Minuten
zum Waschen der Zellen zentrifugiert.
-
Die Zellen [in einer Menge von 4 x 10&sup8;, 6 x 10&sup8;, 3,2
x 10&sup8;, 1,8 x 10&sup9; oder 2 x 10&sup9; Zellen für den
entsprechenden, in Schritt (1) angegebenen
Inkubationszeitraum] wurden in einem Homogenatpuffer
suspendiert und darin homogenisiert. Zu diesem Homogenat
wurden 0,025 Äquivalente 1 M Essigsäure und 1,5 Volumen
von kaltem Ethanol (-20ºC) zugegeben, und nach
Vermischen ließ man die Mischung bei -20ºC für einen
Zeitraum von nicht kürzer als 3 Tagen stehen. Die
Mischung wurde dann bei -10ºC und 15000 Upm (Hitachi RPR
18-1 Rotor) 30 Minuten zentrifugiert. Zum so erhaltenen
Sediment wurde ein Waschpuffer (hergestellt durch Zugabe
von ETA zum Homogenatpuffer in einer Konzentration von
20 mM; im folgenden als WB bezeichnet) zugegeben, und es
wurde zur Einstellung einer einheitlichen Lösung
pipettiert. Dann wurde die Lösung auf den pH 5 durch
Zugabe von 1 M Essigsäure eingestellt, es wurde
1,5 Volumen von kaltem Ethanol zugegeben, und man ließ
die Mischung bei -20ºC für einen Zeitraum von nicht
kürzer als 3 Tagen stehen, und danach zentrifugierte man
bei -10ºC und 15000 Upm 30 Minuten. Das Sediment wurde
in WB gelöst, und die pH-Einstellung mit 1 M Essigsäure
und die Präzipitation mit kaltem Ethanol wurden drei mal
wiederholt.
-
Eine kleine Menge 0,1 % SDS wurde zum Ethanolpräzipitat
unter Herstellung einer Suspension zugegeben. Hierzu
wurde ein Volumen eines Extraktionspuffers (enthaltend
0,5 % SDS, 0,1 M NaCl, 50 mM Natriumacetat und 5 mM
EDTA-Dinatrium; pH 5,2) und zwei Volumen
Wassergesättigten Phenols [enthaltend 0,1 % 8-Chinolinol und
gesättigt mit 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH
8,0)]Chloroformisoamylalkoholmischung
(Volumenverhältnis = 50:50:1) zugegeben. Nach 10-
minütigem Schütteln wurde die gesamte Mischung bei
3000 Upm 10 Minuten zentrifugiert, wodurch sie sich in
drei Phasen auftrennte. Die unterste Phase wurde
entfernt, ein gleiches Volumen an
Chloroformisomylalkoholmischung
(Volumenverhältnis = 50:1) wurde auf die oberste und die
mittlere Phase aufgegeben, und die erhaltene Mischung
wurde nach 10-minütigem Schütteln bei 3000 Upm
10 Minuten zentrifugiert. Die unterste Phase wurde
verworfen. Diese Extraktion mit Chloroformisoamylalkohol
wurde drei mal wiederholt. Ein-Zehntel Volumen an 3 M
Natriumacetat (pH 5,2) wurden zur obersten Phase, die
DNAs, RNAs, Saccharide, usw. enthielt, zugegeben, man
ließ die erhaltene Mischung bei -20ºC für einen Zeitraum
von nicht kürzer als 3 Stunden stehen, und
zentrifugierte bei 15000 Upm (RPR 18-2 Rotor)
30 Minuten. Eine kleine Menge sterilen Wassers wurde zum
Sediment zugegeben. nach Lösung wurde ein gleiches
Volumen an kaltem 4 M Lithiumchlorid zugegeben, und man
ließ die Mischung über Nacht bei 0ºC stehen und
zentrifugierte bei 15000 Upm 30 Minuten. Das Sediment
wurde mit einer kleinen Menge an 2 M Lithiumchlorid
gewaschen, steril destilliertes Wasser wurde zur Lösung
des Sediments zugegeben. nach Zugabe von einem Zehntel
Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und anschließender
Zugabe von 2 Volumen kaltem Ethanol, ließ man die
erhaltene Mischung bei -20ºC für einen Zeitraum von
nicht weniger als 3 Stunden stehen, worauf sich eine 30-
minütige Zentrifugation bei 15000 Upm anschloß. Das
Sediment wurde in 0,01 M Tris-HCl-Puffer (enthaltend
0,5 M NaCl, 0,1 % SDS und 1 mM ETDA-Trinatrium; pH 7,5),
gelöst, und die Lösung, die die gesamte zelluläre RNA
enthielt, wurde auf eine Säule (1 cm Durchmesser)
aufgegeben, die mit 3 ml Oligo(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub5;-Zellulose (PL
Biochemicals) gepackt und zuvor mit dem gleichen Puffer
gepuffert worden, aufgegeben. Nach Waschen mit dem
gleichen Puffer, bis die Absorption bei 260 nm und 0,05
oder weniger war, begann die Elution mit 0,01 M Tris-
HCl-Puffer (enthaltend 0,1 M NaCl, 0,1 % SDS und 1 mM
EDTA-Trinatrium; pH 7,5) und die Säule wurde
kontinuierlich gewaschen, bis die Absorption bei 260 nm
ein Maß von nicht höher als 0,05 erreichte. Anschließend
wurde die Polyadenylsäure-gebundene RNA-(mRNA)-Fraktion
von der Säule mit 0,01 M Tris-HCl-Puffer (enthaltend
0,1 % SDS und 1 mM EDTA-Trinatrium; pH 7,5) in
Fraktionskollektoren eluiert. Fraktionen mit einer
nachweisbaren Absorption bei 260 nm wurden gepoolt. Auf
diese Weise wurden 58 ug, 120 ug, 180 ug, 160 ug, 120 ug
und 258 ug mRNA aus in für 2, 4, 8, 24 und 48 Stunden
inkubierten A-C5-8-Zellen gewonnen.
(3) Bestätigung der Translation von LT entsprechender mRNA
in Eizellen:
-
Serum-Gonadotropin von einer schwangeren Stute (Peamex-
Injektion zur veterinären Verwendung; Sankyo) wurde
jeweils einem ca. 2 Jahre alten Xenopus laevis
(weiblich; mit einem Gewicht von nicht weniger als 50 g;
erworben von Japan Bilogical Material Center) durch
intramuskuläre Injektion in die Hüfte in einer Dosis von
200 Einheiten/Tier verabreicht. Am nächsten Tag wurden
die Tiere durch Eintauchen in Eiswasser anästhesiert und
laparotemiesiert, anschließend wurden die Eizellen
entnommen und in MBS isoliert. Eine Lösung der in
Schritt (2) erhaltenen mRNA in sterilem destilliertem
Wasser (1 mg/ml) wurde in die Eizellen mit einem
Durchmesser von 1 mm oder mehr mit einer Dosis von 50 nl
(50 ng) pro Eizelle mittels einer Mikrokapillare und
eines Mikroinjektors (Seimo Scientific Instruments)
unter einem Steroskopmikroskop injiziert. Zwanzig
solcher behandelter Eizellen wurden in 0,2 ml MBS bei
23ºC inkubiert. In einem Kontrollauf wurden 20 Eizellen,
denen nur 50 nl sterilen destillierten Wassers zugegeben
wurde, in 0,2 ml MBS bei 23ºC inkubiert.
-
Bei 24- oder 48-stündiger Inkubation wurde jeder
Kulturüberstand auf LT-Aktivität getestet. Als Ergebnis
wurde gefunden, daß 48 Stunden der optimale
Inkubationszeitraum für die Eizellen ist. Zusätzlich
wurde gefunden, daß 2 Stunden der optimale
Inkubationszeitraum für A-C5-8-Zellen ist, die mit Con A
und PMA stimuliert wurden, da die LT-Aktivität aus der
Translation der mRNA in für 2, 4, 8, 24 oder 48 Stunden
inkubierten Zellen 7,8, 4,6, 4,1, 2,7 oder
0 Einheiten/ml war. Keine LT-Aktivität wurde in den
Kontrolleizellen nachgewiesen und es wurde daher
bestätigt, daß die mRNA für LT in den Eizellen
translatiert wird.
(4) Massenkultur von A-C5-8-Zellen und Herstellung von mRNA:
-
A-C5-8-Zellen wurden unter den als optimal in Schritt
(3) gefundenen Bedingungen für die Inkubation unter
Stimulierung mit Con A und PMA kultiviert, und es wurden
3 x 10&sup9;-Zellen geerntet. Das Verfahren gemäß Schritt (2)
zum mRNA-Isolierung und -Reinigung wurde angewandt, und
es wurden 512 ug einer mRNA-Fraktion erhalten.
(5) Fraktionierung der mRNA durch Saccharose-
Dichtengradienten-Zentrifugation und Bestimmung des
Sedimentationskoeffizienten von LT entsprechender mRNA:
-
Die gesamte mRNA (512 ug) wurde in 0,01 M Tris-HCl-
Puffer (enthaltend 0,1 M EDTA-Dinatrium und 0,2 % SDS;
pH 7,5) gelöst, die Lösung wurde auf einen 5 bis 30%igen
Saccharose-Dichtegradienten überschichtet (5 ml; gelöst
im gleichen Puffer), und es wurde 16 Stunden bei 15ºC
und 28000 Upm unter Verwendung eines Hitachi RPR-556-
208-Rotors zentrifugiert. Die Inhalte der
Zentrifugenröhrchen wurden in 216-ul-Portionen in 25
Probenröhrchen fraktioniert. Ein Zehntel Volumen 3 M
Natriumacetat und 2 Volumen kalten Ethanols wurden jeder
Fraktion zugegeben, man ließ die Mischung über Nacht bei
-20ºC stehen, und die präzipitierte mRNA wurde gewonnen.
-
Die so erhaltene mRNA wurde in sterilem destilliertem
Wasser (0,5 mg/ml) gelöst, und 100 nl der Lösung wurden
in jeweils 20 Xenopus laevis-Eiszellen auf die gleiche
Weise wie in Schritt (3) injiziert. Die Eizellen wurden
in 0,2 ml MBS 48 Stunden inkubiert, und der
Kulturüberstand wurde auf LT-Aktivität getestet. Als
Ergebnis wurde gefunden, daß Fraktion Nr. 13 die höchste
LT-Aktivität aufweist, und auf Basis der Arbeitskurve,
konstruiert unter Verwendung von Standard-
Sedimentations-Koeffizientenmarkern (5S, 18S und 28S)
wurde der Sedimentationskoeffizient der LT
entsprechenden mRNA zu 12,65 bis 14,65 gefunden.
-
Die in diesem Beispiel erhaltene gereinigte mRNA wurde in den
folgenden Experimenten eingesetzt.
BEISPIEL 3
(1) Synthese von cDNA:
-
Die cDNA-Synthese erfolgte unter Verwendung von 5 ug der
gereinigten mRNA im reversen Transkriptasesystem [³²P]
(New England Nuclear Corp.) das teilweise modifiziert
wurde. Auf diese Weise ließ man daher eine reverse
Transkription in einem System fortschreiten (100 ul
Volumen), das 20 ul reverse Transkriptase-
Reaktionspuffer, 10 ul
Deoxynukleosidtriphosphatmischung, 20 Einheiten
Ribonuklease-A-Inhibitor, 10 ug Oligo (dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8;-Primer,
5 ul 600 mM β-Merkaptoethanol, ³²P-markiertes dCTP
[spezifische Aktivität 800 Ci/mmol (100 uCi)], 5 ug mRNA
und 50 Einheiten Vogel-Myeloblastosie-Virus-abgeleitete
reverse Transkriptase enthielt, bei 42ºC für 1 Stunde.
Die Reaktion wurde dann durch Eiskühlen abgebrochen.
Nach Zentrifugation wurde der Hybrid zwischen mRNA und
cDNA auf einem kochenden Wasserbad 3 Minuten zur
Trennung der mRNA und cDNA voneinander hitzebehandelt,
worauf sich 5-minütiges Abkühlen in einem Eisbad
anschloß.
-
Man ließ die denaturierten Proteine durch Zentrifugation
(12000 x g, 2 Minuten) präzipitieren, und der Überstand
wurde wiederum mit Eis gekühlt. Zur Reaktionslösung
(99 ul) wurden unter Eiskühlung 16,2 ul steriles
destilliertes Wasser, 46,8 ul DNA-Polymerase I-
Reakationspuffer, 10,4 ul
Deoxynukleosidtriphosphatmischung, ³²P-markiertes dCTP
[80 Ci/mmol (100 uCi)] und 15,6 ul DNA-Polymerase I aus
Escherichia coli (8000 Einheiten/ml) unter Einstellung
eines Gesamtvolumens von 198 ul zugegeben. Die Mischung
wurde gut gerührt, zentrifugiert und bei 15ºC 20 Stunden
gehalten. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 39,4 ul
0,2 M EDTA-Dinatrium zur Reaktionslösung (197 ul)
abgebrochen, dann wurden 49,25 ul 1 N NaOH zugegeben,
und die Mischung wurde bei 65ºC unter alkalischen
Bedingungen 1 Stunde unter Zersetzung der mRNA
hitzebehandelt, dann eisgekühlt, zentrifugiert und durch
Zugabe von 49,25 ul 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) und
49,25 ul 1 N HCl neutralisiert.
-
Dieses wurde mit einem halben Volumen an
Wassergesättigtem Phenol und einem halben Volumen an
Chloroformisoamylalkohol (50:1) extrahiert. Nach
Zentrifugation wurde die obere Phase abgetrennt, während
die unter Phase noch einmal mit dem gleichen Volumen an
10 mM Tris-HCl-Puffer (enthaltend 100 mM Nacl und 1 mM
EDTA-Dinatrium; pH 8,0) extrahiert wurde, und die obere
Phase abgetrennt wurde. Beide oberen Phasen wurden
vereinigt und mit einem gleichen Volumen an
Chloroformisoamylalkohol extrahiert, und nach
Zentrifugation wurde die unter Phase (organische Phase)
entfernt. Nach vier Wiederholungen dieses
Extraktionsverfahrens wurde die wäßrige Phase drei mal
mit einem gleichen Volumen an Wasser-gesättigtem
Ethylether extrahiert. Nach Entfernen der organischen
Phase wurde die wäßrige Phase auf einem Wasserbad bei
60ºC unter Entfernung des restlichen Ethylethers
erhitzt.
-
Die so erhaltenen wäßrigen Phasen wurden mit sec-Butanol
konzentriert, anschließend wurde MgCl&sub2; (mit seiner
Endkonzentration von 0,01 M) und 2 Volumen kalten
Ethanols (-20ºC) zugegeben, und man ließ die Mischung
über Nacht bei -80ºC stehen, und zentrifugierte dann
(12000 x g, 10 Minuten). Das erhaltene Sediment wurde
unter vermindertem Druck getrocknet und in 50 ul
sterilem destilliertem Wasser gelöst. Zur Lösung wurden
20 ul reverse Transkriptase-Reaktionspuffer, 5 ul 600 mM
β-Merkaptoethanol, 10 ul
Deoxynukleosidtriphosphatmischung und ³²P-markiertes
dCTP [800 Ci/mmol (100 uCi)] zugegeben. Nach heftigem
Rühren und Zentrifugation der Mischung wurden 5 ul der
oben erwähnten reversen Transkriptase zugegeben, und man
ließ die Reaktion bei 42ºC 1 Stunde fortschreiten. Die
Reaktion wurde dann durch Eiskühlen abgebrochen. Auf
diese Weise wurde eine cDNA mit einer
Haarnadelschlaufenstruktur erhalten.
-
Zur obigen Reaktionsmischung (99 ul) wurden 92,1 ul
sterilen destillierten Wassers, 23,4 ul des oben
erwähnten DNA-Polymerase-I-Reaktionspuffers, 55 ul S&sub1;-
Nukleasereaktionspuffer und 5,5 ul S&sub1;-Nuklease
(50 Einheiten/ml) aus Aspergillus oryzae zugegeben, und
die Reaktion wurde bei 37ºC 30 Minuten durchgeführt,
wodurch die Haarnadelschlaufenstruktur abgespalten wurde
und eine doppelstängige cDNA gebildet wurde. Zu dieser
Lösung wurden 46 ul 0,1 M Tris-HCl-Puffer (enthaltend
0,1 M EDTA-Dinatrium; pH 7,5) zugegeben, und die
Mischung wurde auf eine Sephacryl-S-200-Säule
(1,0 x 25 cm; Bettvolumen 20 ml) aufgegeben und mit
10 mM Tris-HCl-Puffer (enthaltend 0,1 M NaCl und 2 mM
EDTA-Dinatrium; pH 7,5) eluiert. Das Eluat wurde in 300-
ul-Portionen fraktioniert, und eine Fraktion die nahe am
Ausschlußvolumen eluierte, wurde mit sec-Butanol
konzentriert und die cDNA wurde hieraus durch
Ethanolpräzipitation gewonnen.
(2) Herstellung von Oligo(dC)-verlängerter cDNA:
-
Die wie oben beschrieben erhaltene doppelstängige cDNA
wurde zu einem Reaktionspuffer mit der im folgenden
angegebenen Zusammensetzung gegeben, und die Reaktion
wurde bei 37ºC 5 Minuten durchgeführt, wodurch eine
Oligo(dC)-Verlägerung an die doppelstängige cDNA
angefügt wurde.
-
Der verwendete Reaktionspuffer war 0,2 M
Kaliumcacodylat-25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 6,9), der 2 mM
DTT, 5 mM CoCl&sub2;, 0,25 mg/ml RSA, 5 uM dCTP, H-
markiertes dCTP [25 Ci/mmol (15 uCi)] und 30 Einheiten
terminale Deoxynukleotidyl-Transferase enthielt.
-
Die Reaktion wurde durch Eiskühlen abgebrochen, und die
Reaktionsmischung wurde mit einem gleichen Volumen an
Wasser-gesättigtem Phenolchloroformisoamylalkohol
(50:50:1) extrahiert. Es wurde nochmals mit
Chloroformisoamylalkohol (50:1) extrahiert. Ribosomale
RNA (40 ug) aus Escherichia coli und ein Fünfzehntel
Volumen von 5 M NaCl wurden zur wäßrigen Phase zugegeben
und nach weiterer Zugabe von 2 Volumen kalten Ethanols
ließ man die Mischung über Nacht bei -80ºC stehen. Die
oligo (dC)-verlängert cDNA wurde durch Zentrifugation
gewonnen und in sterilem destilliertem Wasser unter
Erhalt einer Lösung mit einer Konzentration von
0,5 ng/u1 gelöst.
(3) Bildung von rekombinantem Plasmid:
-
Eine Anteil von 1,375 ng der Oligo(dC)-verlängerten cDNA
und 10 ng Oligo(dG)&sub1;&sub0;&submin;&sub2;&sub0;-verlängerter pBR322-DNA
(Amersham) wurden 25 ul einer Paarungslösung (10 mM
Tris-HCl-Puffer, der 100 mM NaCl und 0,1 mM EDTA-
Dinatrium enthielt; pH 7,8) bei 65ºC 15 Minuten
inkubiert, und die Mischung wurde weiter 2 Stunden bei
dieser Temperatur inkubiert und dann für die Paarung
abgekühlt. Auf diese Weise wurde eine rekombinante
Plasmid-haltige Lösung erhalten.
(4) Selektion der Transformante:
-
Die wie oben beschrieben erhaltene rekombinante
Plasmidlösung wurde zur Transformation von Escherichia
coli HB101 verwendet. Speziell Escherichia coli HB101
wurde in 10 ml L-Medium, enthaltend 0,1 % Glucose, bei
37ºC inkubiert, bis die Absorption (650 nm) des
Kulturmediums 0,05 erreichte. Ein 5-ml-Anteil des
Kulturmediums wurde in 500 ml L-Medium, enthaltend 0,1 %
Glucose, überführt, und die Inkubation wurde bei 25ºC
weitergeführt, bis die Absorption (650 nm) 0,3
erreichte. Nach Abkühlen mit Eis für 30 Minuten wurde
das Kulturmedium bei 4ºC 5 Minuten bei 3000 Upm (Hitachi
RPR9-2 Rotor) zur Zellgewinnung zentrifugiert. Die
gesamten Zellen wurden in 250 ml kalter 50 mM CaCl&sub2;
dispergiert. Die Dispersion wurde 15 Minuten eisgekühlt
und zentrifugiert (RPR9-2-Rotor; 4ºC, 5 Minuten,
2500 Upm). Die gesammelten Bakterienzellen wurden wieder
in 25 ml 50 mM CaCl&sub2;, enthaltend 2 % Glycerin,
dispergiert, und die Dispersion wurde in l-ml-Portionen
auf Ampullen verteilt, mit Trockeneispulver eingefroren
und dann bei -80ºC gelagert. Die gelagerte
Bakteriendispersion wurde unter Eiskühlung aufgetaut und
es wurden 0,3 ml der so aufgetauten Bakteriendispersion
mit 0,15 ml der obig erwähnten rekombinanten
Plasmidlösung und 0,15 ml von 20 mM CaCl&sub2;-60 mM MnCl&sub2;-
20 mM RbCl-Lösungsmischung vermischt, und man ließ die
erhaltene Mischung bei 0ºC 20 Minuten und dann bei
Raumtemperatur 10 Minuten stehen. Anschließend wurden
2,4 ml auf 37ºC erwärmtes L-Medium, enthaltend 0,1 %
Glucose, zugegeben, und die Mischung wurde bei 37ºC
1 Stunde unter Schütteln inkubiert. Ein Anteil des
inkubierten Mediums wurde herausgenommen, auf einer L-
Medium-Agar-Platte, enthalten 15 ug/ml Tetracyclin
zusätzlich zu den oben erwähnten Bestandteilen,
ausgebreitet und bei 37ºC für ca. 12 Stunden inkubiert.
Tetracyclin-resistente Bakterienkolonien wurden zur
Herstellung einer cDNA-Bank selektiert.
(5) Hybridisierungstest:
-
Um Transformanten auszumustern, die das Plasmid mit der
LT-kodierenden CDNA enthielt, wurde die obige cDNA-Bank
einem Kolonie-Hybridisierungstest unter Verwendung von
³²P-markierten synthetischen cDNA-Sonden unterzogen.
-
Zur Herstellung der synthetischen cDNA-Sonden wurden
zwei Oligonukleotide, die entsprechend komplementär zu
den 18 Nukleotiden von dem 404ten bis 421sten Nukleotid
und den 18 Nukleotiden vom 500sten bis 517ten Nukleotid
im LT-Gen, wie von Gray et al. berichtet [Nature, 312,
721 (1984)], nämlich 5'-GTCTACTCCCAGGTGGTC-3' und 5'-
CACATGGAAGGGGTACTG-3', chemisch synthetisiert, und
jeweils 16,6 Pikomol davon wurden mit 5 Einheiten
Polynukleotidkinase aus T4-infizierten Escherichia coli
und [γ-³²P]-ATP [5 uCi/pmol (20 uCi)] in 50 mM Tris-HCl-
Puffer (der 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 0,1 mM Spermidin und
0,1 mM EDTA-Dinatrium enthielt; pH 7,6] bei 37ºC
30 Minuten behandelt.
-
Die Reaktion wurde durch Zugabe einer EDTA-Lösung und
Abkühlen der Mischung mit Eis auf 0ºC abgebrochen. Diese
beiden ³²P-markierten cDNA-Sonden wurden im
Hybridisierungstest verwendet, und Transformanten, die
ein rekombinantes Plasmid trugen, das zur Hybridisierung
mit beiden Sonden unter schwachen Bedingungen in der
Lage war, wurden selektiert. Auf diese Weise wurden
sechs Kolonien aus ca. 10000 Kolonien ausselektiert.
-
Das rekombinante Plasmid wurde aus jeder der so
selektierten Stämme gewonnen. Das Plasmid wurde mit dem
Restriktionsenzym HindIII gespalten, einer
Agarose-Gelelktrophorese unterzogen, auf einen
Nitrozellulosefilter überführt und wiederum mit ³²P-
markierten synthetisierten cDNA-Sonden unter strengen
Bedingungen hybridisiert. Als Ergebnis wurde ein Klon
ausselektiert.
-
Der so selektrierte Stamm wurde einem Hybridisierungs-
Translationstest unterzogen, der nach dem Verfahren,
beschrieben von Maniatis T. et al. in Molecular Cloning,
329 (1980) (Cold Spring Harbor Laboratory) durchgeführt
wurde. Die Plasmid-DNA wurde aus diesem
Transformantenstamm extrahiert und nach Erhitzen und
Denaturierung auf Nitrozellulosefilter fixiert. Die LT-
mRNA-haltige mRNA-Fraktion aus Schritte (4) von Beispiel
2 wurde zugegeben, und die Hybridisierungsreaktion wurde
bei 50ºC 3 Stunden durchgeführt. Die gebundene mRNA
wurde durch Elution wiedergewonnen und in Xenopus
laevis-Eizellen auf dieselbe Weise wie in Schritt (3)
von Beispiel 2 injiziert, und die erhaltene mRNA wurde
überprüft, ob sie LT-mRNA war oder nicht.
-
Als Ergebnis wurden 10 Einheiten/ml LT-Aktivität bei
pLT13 nachgewiesen, wogegen keine LT-Aktivität in der
Kontrolle von pBR322 nachgewiesen wurde.
-
Diese cDNA wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII
gespalten, und ihre Größe wurde durch
Agarose-Gelelektrophorese gemessen. Das Ergebnis wurde
bestätigt, daß diese cDNA ein cDNA-Segment von ca.
1,35 Kbp hatte.
-
Die diese cDNA (Stammnummer: LT13; klonierte DNA-Nummer:
pLT13) haltige Transformante wurde zur Isolierung der
klonierten cDNA behandelt, und die Nukleotidsequenz
davon wurde nach dem im folgenden beschriebenem
Verfahren bestimmt.
BEISPIEL 4
Bestimmung der Nukleotidsequenz der klonierten DNA:
(1) Konstruktion der Restriktionsenzym-Spaltungskarte:
-
Der in Schritt (5) von Beispiel 3 erhaltene Stamm LTl3
wurde im L-Medium, das 0,1 % Glucose und 15 ug/ml
Tetracyclin enthielt, inkubiert. Aus den erhaltenen
Bakterienzellen wurde die Plasmid-DNA gewonnen, und eine
Restriktionsenzym-Spaltungskarte davon wurde für die
Restriktionsenzyme EcoRI, SmaI, BamHI, PstI, SalI und
HindIII erstellt, deren Erkennungsstellen in M13mp8 und
M13mp9, wie im folgenden beschrieben, eingeführt werden
können. (siehe Fig. 1)
(2) Bestimmung der Nukleotidsequenz der klonierten DNA:
-
Zur Bestimmung der Nukleotidsequenz der geklonten DNA
wurde das cDNA in M13mp8 oder M13mp9 nach dem Verfahren
von Messing et al. [Gene, 19, 269 (1982)] subkloniert,
und anschließend mit dem Dideoxy-Kettenabbruchverfahren
von Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463
(1977); Journal of Biological Chemistry, 162, 729
(1982)] für die Primer-Verpaarung, Synthese der
komplementären Kette unter Verwendung des Klenow-
Fragments der DNA-Polymerase I [markiert mit ³²P-
markiertem dCTP [800 Ci/mmol (20 uCi)]],
Gelelektrophorese und Autoradiographie weiter
verarbeitet.
-
Fig. 2 zeigt die für die Nukleotidsequenzbestimmung
verwendeten Restriktionsenzym-Schnittstellen mit den
Richtungen, die für die Nukleotidsequenzbestimmung
eingesetzt wurden, und dem Sequenzierbereich, der durch
die Pfeile darin angegeben ist. Der durch viereckig
gekennzeichnete Bereich ist der Teil, der den LT-
Translationsbereich kodiert. Die Nukleotidsequenz vom
63sten bis 677sten Nukleotid kodiert vermutlich ein
Polypeptid, das zur Konstruktion eines Vorläufers für LT
notwendig ist.
-
Von diesen Nukleotiden nimmt man an, daß diejenigen, die
mit dem 165sten Nukleotid beginnen, LT kodieren, und daß
die Nukleotidsequenz unterschiedlich von der von LT ist,
wie von Gray P. W. et al. berichtet [Nature, 312, 721
(1984)] nämlich dahingehend, daß die 26ste Aminosäure
Asn (AAC) in der ersteren ist, während die Aminosäure
Thr (ACC) in der letzteren ist. Bei der vorliegenden
Sequenz folgt das Abbruchkodon (TAG) dem Kodon für die
C-terminale Aminosäure (Leucin). Zusätzlich ist die
vorliegende Sequenz weiter von der Sequenz von Gray et
al. im anderen Teil und dem Peptid-kodiertenden Teil
dahingehend verschieden, daß die als 1. bis 4. Nukleotid
CGGG anstelle von GGTC ist, und daß das 862ste bis
865ste Nukleotid ACAC anstelle von CACA ist und daß das
1306ste bis 1310te Nukleotid CCCCT anstelle von TGAAA
ist.
BEISPIEL 5
(1) Spaltung der LT-cDNA mit Restriktionsenzymen:
-
Die in Beispiel 3 erhaltene klonierte DNA (pLT13) wurde
in Escherichia coli SK383 (ein dam&supmin;-Stamm; erhältlich
von der Tokyo Universität) eingeschleust, da das
Restriktionsenzym BclI gegenüber dam empfindlich ist,
und es wurde die Plasmid-DNA hergestellt.
-
Dieses pLT13 wurde mit BclI verdaut und an den 5'-Enden
mit bakterieller alkalischer Phosphatase
dephosphoryliert (BAP; Bethesda Research Laboratories).
-
Es wurden die folgenden HindIII-Linker hergestellt:
-
GATCAAGCTT
-
TTCGAACTAG
-
Die beiden Oligonukleotide wurden von dem 5'-Ende mit
T4-DNA-Kinase (Takaro Shuzo) phosphoryliert und dann
unter Erhalt der doppelstängigen DNA gepaart.
-
Der BclI-Verdau von pLT13 und die HindIII-Linker wurden
miteinander in Gegenwart von T4-DNA-Ligase ligatisiert,
und das Ligationsprodukt wurde in Escherichia coli HB101
eingeschleust. Ein Plasmid pLT13H mit den darin
eingebauten HindIII-Linker wurde erhalten.
-
pLT13H wurde mit RsrII und HindIII verdaut, und der
Verdau wurde auf übliche Weise durch 4%ige
Acrylamid-Gelelektrophorese fraktioniert, und ein Fragment von
501 bp wurde erhalten.
(2) Synthese der Oligonukeotide:
-
Die beiden Olegonukleotide mit den im folgenden
gezeigten Strukturen, nämlich M1 (88mer) und L2 (87mer)
wurden nach dem β-Cyanoethylphosphamidid-Verfahren
(Biosearch model 8600) synthetisiert. Die synthetischen
Oligonukleotide wurden durch Umkehrphasen-
Chromatographie (C18-Säulen; Waters) nach der Vorschrift
von Biosearch gereinigt. Nach Phosphorylierung am 5'-
Ende wurden sie unter Erhalt doppelstängiger DNA
gepaart.
(3) Einführung des LT-cDNA-Fragments in den
Expressionsvektor:
-
Der Expressionsvektor pKK233-2 (Pharmacia) wurde mit
NcoI und HindIII verdaut, der Verdau wurde auf übliche
Weise durch 0,7%ige Agarose-Gelelektrophorese
fraktioniert, und der Vektor wurde gewonnen. Die DNAs,
hergestellt in Schritt (1) und Schritt (2) und der obige
Vektor wurden miteinander ligatisiert, das
Ligationsprodukt wurde in Escherichia coli JM105
eingeschleust, und Selektion erfolgt in LB-Medium, das
Ampicillin enthielt. Es wurden ca. 2500 Transformanten
erhalten.
(4) Screenen mit synthetischer Sonde:
-
Die in Schritt (3) erhaltenen Transformanten wurden
einem Kolonie-Hybridisierungstest unterzogen, wobei als
Sonde das synthetische Oligonukleotid L1, hergestellt in
Schritt (2), verwendet wurde, das mit [γ-³²P]-ATP an
seinem 5'-Ende markiert wurde. Unter dem hybridisierten
Transformanten wurden 24 Klone selektiert und mit NsiI
(Bethesda Research Laboratories) und RsrII (New England
Biolabs) verdaut. Die Verdaus wurden einer Agarose-
Gelelektrophorese unterzogen, und es wurde nach dem
erwünschten Fragment gesucht, und seine Richtung wurde
bestimmt. Ein Plasmid, pDK100, wurde als das erwünschte
erhalten.
(5) Bestimmung der Nukleotidsequenz der synthetischen DNA:
-
Das in Schritt (4) erhaltene Plasmid pDK100 wurde mit
NsiI und HindIII verdaut, der Verdau wurde durch
Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, und das LT-cDNA-
Fragment wurde gewonnen. Dieses Fragment wurde in
M13mp19 zwischen den PstI- und HindIII-Stellen
eingefügt, und die Basensequenz des Anteils des
synthetischen DNA wurde durch das Dideoxy-Verfahren
bestimmt, und es wurde gefunden, daß es in
Übereinstimmung mit dem gesuchten war.
(6) Einführung eines Repressorgens:
-
Das Plasmid pMJR1560 (Ainersham) wurde mit HindIII
verdaut, die 5'-Enden wurden mit DNA-Polymerase I
(Klenow-Fragment) glatt gemacht, der glatt gemachte
Verdau wurde weiter mit EcoRI verdaut, der erhaltene
Verdau wurde durch 1%ige Agarose-Gelelektrophore
fraktioniert, und ein 1261-bp-Fragment, das das
lac-Repressor-(lac
Iq)-Gen enthielt, wurde erhalten.
-
Das in Schritt (4) erhaltene Plasmid pDK100 wurde mit
EcoRI und PvuII verdaut, ein Fragment, das das LT-Gen
enthielt, wurde gewonnen und mit dem Fragment, das das
lac-Repressor-Gen enthielt, ligatisiert, und das
Ligationsprodukt wurde in Escherichia coli HP101
eingeführt. Auf diese Weise wurde pDK101 erhalten. Das
Konstruktionsverfahren einschließlich der obigen
Schritte (1) bis (6) ist in Fig. 3 gezeigt.
(7) Einführung in verschiedene Escherichia coli-Stämme:
-
Die DNA des im Schritt (6) erhaltenen Plasmids pDK101
wurde gereinigt und in Escherichia coli JM105, W3110
(ATCC 27325) und Y1089 (ATCC 371986) eingeführt.
BEISPIEL 6
-
Die Escherichia coli-Stämme HB101, JM105, W3110 und Y1089,
die das Plasmid pDK101 trugen und in Schritt (7) aus Beispiel
5 erhalten wurden, wurden jeweils im LB-Medium (siehe
Anmerkung 1 unten), das 50 ug/ml Ampicillin enthielt,
kultiviert, bis die O.D.&sub5;&sub5;&sub0; 0,5 erreichte. Dann wurde
Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) bis zu einer
Endkonzentration von 1 mM zugegeben, und die Inkubation wurde
weitere 4 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden geerntet,
gewaschen, in Desintegrationspuffer [50 mM Tris-HCl (pH 8,0),
10 mM EDTA, 30 mM NaCl, 0,01 mM (p-
Amidinophenyl)methansulfonylfluorid] suspendiert und nach dem
Lysozym/Einfrier-Auftau-Verfahren desintegriert, und der
Überstand wurde auf LT-Aktivität getestet. Die so erhaltenen
Aktivitätswerte sind in Tabelle 2 gezeigt.
TABELLE 2
Stamm [Plasmid]
Aktivität (Einheiten/ml)
Spezifische Aktivität (Einheiten/ml OD&sub5;&sub5;&sub0;)
-
Anmerkung 1: Zusammensetzung des LB-Mediums pro Liter:
Bacto-Trypton 10 g, Bacto-Hefeextrakt 5 g, NaCl
10 g; pH 7 bis 7,5.
BEISPIEL 7
-
Der in Beispiel 6 erhaltene Escherichia coli-Stamm W3110
[pDK101] wurde nach dem Verfahren von Beispiel 6 kultiviert,
und es wurden 10 Liter einer Kultur erhalten. Diese wurde
durch Ultrafiltration konzentriert, und die Zellen wurden
mittels eines Hochdruck-Homogenisators (APV-Gaulin)
aufgebrochen. Polyethylenimin (Endkonzentration 0,5 %) wurde
zum Homogenat zur Entfernung der Nukleinsäure zugegeben, und
dann wurde mit Ammoniumsulfat (40 % Sättigung) ausgesalzen.
Das erhaltene Präzipitat wurde in 5 mmol Tris-HCl-Puffer (pH
8) gelöst. Die Lösung wurde bei 60ºC 30 Minuten
hitzebehandelt und auf eine DEAE-Cellulofine-AM-Säule (Chisso
Corp.; 9 x 50 cm) für die Adsorption aufgegeben. Die Elution
erfolgte mit einem Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,2 M
NaCl. Eine aktive Fraktion wurde auf eine Zinkchelat-
Sepharose-Säule (Pharmacia; 1,6 x 20 cm) zur Adsorption
aufgegeben, worauf sich die Elution mit einem
Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,2 M Imidazol (pH 7,5)
anschloß. Eine aktive Fraktion wurde gelfiltiert unter
Verwendung einer Sephacryl-S-200-Säule (Pharmacia;
5 x 100 cm), die eine aktive Fraktion ergab (S-200-
fraktionierte Fraktion). Das LT-Polypeptid in der S-200-
fraktionierten Fraktion hat eine spezifische Aktivität von
7 x 10&sup7; Einheiten/ml Protein, und die Aktivitätsausbeute aus
dem Zellhomogenat war 30 %. Das Molekulargewicht des LT-
Polypeptids wurde durch Elektrophorese der S-200-
fraktionierten Fraktion auf einem 0,1 % SDS-haltigem
Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) [Laemmli U. K., Nature, 227, 680
(1970)] gemessen und zu ca. 16000 bestimmt. Ferner wurde
überhaupt keine Zersetzung (Verringerung des
Molekulargewichts) des LT-Polypeptids in jeder
Reinigungsstufe (SDS-PAGE-Analyse) beobachtet.
TABELLE 3
Aminosäurezusammensetzung des LT-Polypeptids
Aminosäure
Gemessener Wert (mol)
Berechneter Wert bezogen auf die Formel (1) (mol)
BEISPIEL 8
-
Die in Beispiel 7 erhaltene S-200-fraktionierte Fraktion
wurde auf einer C18-Umkehrphasen-Chromatographiesäule
(Waters; 0,39 x 30 cm) gereinigt, und die C18-fraktionierte
Fraktion wurde auf ihre Aminosäurezusammensetzung und auf die
N-terminale Aminosäuresequenz analysiert.
(1) Aminosäurezusammensetzung:
-
Die C18-fraktionierte Fraktion wurde unter vermindertem
Druck bis zur Trockne eingedampft. Auf einer
Arbeitsstation (Waters) wurde der erhaltene Festkörper
mit Salzsäure hydrolysiert, und das Hydrolysat mit
Phenylisothiocyanat zur Umwandlung in PTC-Aminosäuren
umgesetzt, und die Analyse der Zusammensetzung erfolgte
unter Verwendung eines Aminosäureanalysators
(Umkehrphasen-Partitionsverfahren; Waters). Die
quantitative Bestimmung von Tryptophan und Cystein
erfolgte nach dem Verfahren von Inglis A. S., Methods in
Enzymology, Bd. 91, S. 26, herausgegeben von Hirs C. H.
W. et al. Academic Press, 1983). Die erhaltenen
Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
-
Die Meßwerte stimmten gut mit den auf Basis der Formel
(1) berechneten Werten überein.
(2) N-terminale Aminosäuresequenz:
-
Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde nach dem Edman-
Verfahren bestimmt [Edman P., Arch. Biochem. Biophys.,
22, 475 (1949)] unter Verwendung eines Gasphasen-
Proteinsequenzators (Applied Biosystems model 477A) und
einem PTH-Analysator (Applied Biosystems model 120A).
-
Die so gefundene N-terminale Aminosäuresequenz des LT-
Polypeptids, nämlich
-
MET-HIS-LEU-ALA-SER-ASN-LEU-LYS-PRO-ALA-
ALA-HIS-LEU-ILE-GLY-ASP-PRO-SER-LYS-GLN-ASN- stimmte vollkommen mit der Sequenz aus der N-terminalen
Aminosäure bis zur 21sten Aminosäure der Formel (1)
überein.
BEISPIEL 9
-
Balb/c-Mäuse (8 Wochen alte weibliche Tiere; erworben von
Nippon Charles River) wurden durch subkutane Injektion in die
rechte Inguinalregion mit Meth A-Maus-Tumorzellen mit einem
Inoculumansatz von 1 x 10&sup5; Zellen pro Tier (Tag 0)
inokuliert. Am Tag 7 war die Tumorgröße 40 bis 60 mm². Eine
durch Verdünnung der in Beispiel 7 erhaltenen S-200-
fraktionierten Fraktion mit PBS, das 100 ug/ml Gelatine
enthielt, hergestellte LT-Präparation wurde den Mäusen
entweder intravenös (i.v.) oder intratumoral (i.t.) für 5
hintereinander folgende Tage beginnend vom 7. Tag
verabreicht. Ein vollständiges Verschwinden des Tumors wurde
am 25. Tag in der i.v.-Gruppe in der i.t.-Gruppe mit einer
LT-Dosis von 1 x 10&sup4; Einheiten/Maus/Tag und
5 x 10² Einheiten/Maus/Tag erreicht.
BEISPIEL 10
(1) Konstruktion des Expressionsvektors zur Herstellung von
LT, wie in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr.
8399/88 beschrieben.
-
Das in Schritt (6) von Beispiel 5 erhaltene Plasmid
pDK101 wurde mit NsiI und HindIII verdaut, der Verdau
wurde auf übliche Weise durch 0,7%ige Agarose-
Gelelektrophorese fraktioniert, und der Vektor wurde
gewonnen. Getrennt hiervon wurde aus Schritt (1) von
Beispiel 5 erhaltenes pLT13H mit NsiI und HindIII
verdaut, der Verdau wurde auf übliche Weise mit 1,2%iger
Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, und ein
Fragment, das das LT-Gen enthielt, wurde gewonnen. Der
Vektor und das LT-Gen-haltige Fragment wurden
miteinander ligatisiert, das Ligationsprodukt wurde in
Escherichia coli W3110 eingeführt, und es wurde ein LT-
Expressionsvektor, pDK20, erhalten. Das oben erwähnte
Konstruktionsverfahren ist in Fig. 4 erläutert.
(2) Einführung von pDK20 in Escherichia coli W3110, LT-
Produktion und LT-Produktivität im Vergleich zu W3110
[pDK101]:
-
Die im Schritt (1) erhaltene DNA von pDK20 wurde
gereinigt und in W3110 (Name des Transformantenstammes:
W3110 [pDK20]) eingeführt. W3110 [pDK20] und W3110
[pDK101] wurden jeweils im LB-Medium, das 50 ug/ml
Ampicillin enthielt, bis zu eiern O.D.&sub5;&sub5;&sub0; = 0,5
kultiviert, dann wurde IPTG mit einer Endkonzentration
von 1 mM zugegeben, und die Inkubation wurde weitere
4 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden gesammelt,
gewaschen in Desintegrationspuffer [50 mM Tris-HCl (pH
8,0), 10 mM EDTA-Dinatrium, 30 mM NaCl, 0,01 mM (p-
Amidinophenyl)methansulfonylfluorid] suspendiert und
durch das Lysozym/Einfrier-Auftau-Verfahren
aufgebrochen, und der Überstand wurde auf LT-Aktivität
getestet. Wie in Tabelle 4 gezeigt, wurde als Ergebnis
gefunden, daß das erfindungsgemäße LT-Polypeptid ca. 3
mal mehr im Überschuß in Escherichia coli hergestellt
werden kann als im Vergleich zum LT-Polypeptid,
beschrieben in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr.
8399/88.
TABELLE 4
Stamm [Plasmid]
Aktivität (Einheiten/ml)
Spezifische Aktivität (Einheiten/ml OD&sub5;&sub5;&sub0;)
REFERENZBEISPIEL
-
Das LT-Polypeptid der Formel (2) (unten gezeigt), geschrieben
in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 8399/88 ergab
nach Durchführung der in Beispiel 8 beschriebenen
Reinigungsschritte teilweise Polypeptide, denen in der N-
terminalen Aminosäuresequenz MET-ASP-PRO-ALA-GLN-THR-ALA-,
MET-ASP-PRO-ALA-GLN-THR-ALA-ARG-GLN-HIS-PRO-LYS-MET-oder MET-
ASP-PRO-ALA-GLN-THR-ALA-ARG-GLN-HIS-PRO-LYS-MET-HIS- fehlte.
Alle diese Polypeptide hatten LT-Aktivität.
FORMEL (2)