JPS62111928A - 新規リンホトキシン - Google Patents
新規リンホトキシンInfo
- Publication number
- JPS62111928A JPS62111928A JP60230744A JP23074485A JPS62111928A JP S62111928 A JPS62111928 A JP S62111928A JP 60230744 A JP60230744 A JP 60230744A JP 23074485 A JP23074485 A JP 23074485A JP S62111928 A JPS62111928 A JP S62111928A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- dna sequence
- gene
- expression vector
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
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- Organic Chemistry (AREA)
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- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、新規なリンホトキシンポリペプヂド、該ポリ
ペプチドをコードするＤ Ｎ Ａ配列、該ＤＮＡ配列と
プロモーター配列からなる発現ベクター、該発現ベクタ
ーによって形質転換された培養細胞或いは微生物及び該
培養細胞或いは微生物を用いた糖鎖を有する或いは有さ
ない新規リンホＩ・キシンの製法に係る。
ペプチドをコードするＤ Ｎ Ａ配列、該ＤＮＡ配列と
プロモーター配列からなる発現ベクター、該発現ベクタ
ーによって形質転換された培養細胞或いは微生物及び該
培養細胞或いは微生物を用いた糖鎖を有する或いは有さ
ない新規リンホＩ・キシンの製法に係る。
（従来の技術）
リンポトキシン（Ｌ’Ｊ”）は、癌細胞を選択的に攻撃
し、壊死させる抗腫瘍物質で（ＥＶａｎＳ 、 ０．
Ｈ。
し、壊死させる抗腫瘍物質で（ＥＶａｎＳ 、 ０．
Ｈ。
ら（１９７７年）キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ、 ）、 ８７巻、８９８頁）、制癌剤としての
臨床応用が期待されている。
Ｒｅｓ、 ）、 ８７巻、８９８頁）、制癌剤としての
臨床応用が期待されている。
Ｌ Ｔは、ヒト或いはマウス等のリンパ球細胞をフィト
ヘマグルチニン、コンカナバリンＡ等のレクチン或いは
フォルボールエステルで刺激することにより誘導される
リンホカインの一種である（ Ｄｅｖｌｉｎ、 Ｊ、
Ｊ、 （１９８４年）リンホカインズ（Ｌｙｍｐｈｏｋ
ｉｎｅｓ ）、 ９巻、３１３頁）。
ヘマグルチニン、コンカナバリンＡ等のレクチン或いは
フォルボールエステルで刺激することにより誘導される
リンホカインの一種である（ Ｄｅｖｌｉｎ、 Ｊ、
Ｊ、 （１９８４年）リンホカインズ（Ｌｙｍｐｈｏｋ
ｉｎｅｓ ）、 ９巻、３１３頁）。
Ｔ、 Ｔの蛋白化学的性質はいくつかのグループで研究
されているが、分子量約２０，（１０）０の成分がその
最小単位であり、その単位成分が会合したものや他の成
分との複合体があるとされている（Ａｇｇａｒｗａｌ。
されているが、分子量約２０，（１０）０の成分がその
最小単位であり、その単位成分が会合したものや他の成
分との複合体があるとされている（Ａｇｇａｒｗａｌ。
Ｂ、Ｂ、ら（１９８４年）ザ・ジャーナル・オフ・バイ
オロジカル・ケミストリー、２５９巻、６８６頁）。
オロジカル・ケミストリー、２５９巻、６８６頁）。
ＬＴは、フォルボールエステル、マイト−ジエン等で刺
激されたリンパ球が産生ずることが知られているが、こ
のような生産法では生産されるＬＴは極めて微量であり
、また大量の新鮮なリンパ球が必要となり量産には不向
きである。また株化されたリンパ球由来の細胞（株化細
胞）をマイト−ジエン等で刺激するとＪ、 Ｔが誘導的
に産生されることが知られているが、生産能は用いる細
胞の能力に大きく依存しており、やはり量産に適した系
とは言えない。近年ＬＴのｃＤＮＡがクローニングされ
、大腸菌でＬ Ｔ様蛋白の生産が可能になった（ Ｇｒ
ａｙ、 Ｐ、 Ｗ、ら（１９８４年）ネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ ） 、 ８１２巻、７２１頁）。しかしＧ
ｒ ａ’）’らによるｃＤＮＡのクローン化に用いた細
胞はＲＰＭＩ １７８８と名付けられた株化細胞であ
った。
激されたリンパ球が産生ずることが知られているが、こ
のような生産法では生産されるＬＴは極めて微量であり
、また大量の新鮮なリンパ球が必要となり量産には不向
きである。また株化されたリンパ球由来の細胞（株化細
胞）をマイト−ジエン等で刺激するとＪ、 Ｔが誘導的
に産生されることが知られているが、生産能は用いる細
胞の能力に大きく依存しており、やはり量産に適した系
とは言えない。近年ＬＴのｃＤＮＡがクローニングされ
、大腸菌でＬ Ｔ様蛋白の生産が可能になった（ Ｇｒ
ａｙ、 Ｐ、 Ｗ、ら（１９８４年）ネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ ） 、 ８１２巻、７２１頁）。しかしＧ
ｒ ａ’）’らによるｃＤＮＡのクローン化に用いた細
胞はＲＰＭＩ １７８８と名付けられた株化細胞であ
った。
（発明が解決しようとする問題点）
ＧｒａｙらによるＬＴのｃ 、’ｌ） Ｎ Ａのクロー
ン化に用いた株化細胞ＲＰＭＩ １７８８はＪ”３８
歳になる男性の末梢血から株化、継杭維持された細胞で
ある。
ン化に用いた株化細胞ＲＰＭＩ １７８８はＪ”３８
歳になる男性の末梢血から株化、継杭維持された細胞で
ある。
現在までＲＰＭＩ １７８８株の分泌するＬＴが、正
常ヒト白血球から誘導される天然型Ｔ、Ｔの持つアミノ
酸配列と同一であるか否かは明らかではなかった。
常ヒト白血球から誘導される天然型Ｔ、Ｔの持つアミノ
酸配列と同一であるか否かは明らかではなかった。
ヒｌ−Ｔ、 ’Ｉ’は糖鎖を有する蛋白である。本発明
者らは糖鎖を有する天然のＬＴを動物培養細胞で量産す
る目的でヒトＬＴ遺伝子をヒト正常白血球細胞からクロ
ーニングし、発現用ベクターの作製及びヒ）ＬＴ遺伝子
の塩基配列の決定を行った。その結果、本発明者らがク
ローニングしたヒト正常リンパ球由来のＬＴ遺伝子は、
先述のＲＰＭ１１７８８株の分泌するＬＴとアミノ酸配
列の異なる新規リンホトキシンをコードしている事が明
らかになり、本発明に至った。この新規リンホトキシン
は、ヒト正常リンパ球の有する遺伝子にコードされてお
り、新規リンホトキシンと言うよりは、むしろ人におい
て抗原性のないと思われる天然型リンホトキシンと言え
よう。
者らは糖鎖を有する天然のＬＴを動物培養細胞で量産す
る目的でヒトＬＴ遺伝子をヒト正常白血球細胞からクロ
ーニングし、発現用ベクターの作製及びヒ）ＬＴ遺伝子
の塩基配列の決定を行った。その結果、本発明者らがク
ローニングしたヒト正常リンパ球由来のＬＴ遺伝子は、
先述のＲＰＭ１１７８８株の分泌するＬＴとアミノ酸配
列の異なる新規リンホトキシンをコードしている事が明
らかになり、本発明に至った。この新規リンホトキシン
は、ヒト正常リンパ球の有する遺伝子にコードされてお
り、新規リンホトキシンと言うよりは、むしろ人におい
て抗原性のないと思われる天然型リンホトキシンと言え
よう。
本発明は、今までに知られていない新規リンホトキシン
（以下、ＬＴ−にと略紀する）を組換えＤＮＡの手法を
用いて、動物培養細胞或いは微生物を宿主としてＪｌｌ
産することを目的としている。
（以下、ＬＴ−にと略紀する）を組換えＤＮＡの手法を
用いて、動物培養細胞或いは微生物を宿主としてＪｌｌ
産することを目的としている。
以下に本発明を更にｎｍ＋＋ｉこ説明する。
（問題点を解決するための手段）
ａ、 ＬＴ−に遺伝子のクローニングＬＴ−Ｋをコー
ドしている遺伝子は、正常ヒト白血球ＤＮＡからクロー
ニングされる。また正常ヒト組織或いはＬ’ｌ’−に遺
伝子を持つ株化細胞のＤＮＡからもクローニングする事
が可能である。
ドしている遺伝子は、正常ヒト白血球ＤＮＡからクロー
ニングされる。また正常ヒト組織或いはＬ’ｌ’−に遺
伝子を持つ株化細胞のＤＮＡからもクローニングする事
が可能である。
ＤＮＡは、例えば１Ｆ常ヒト白血球細胞或いは組織など
を用い、：ｒ３Ｈ−ｎらの方法（１’３］−：ｉ−ｎ
、 Ｎ、ら（１９７６年）ヌクレイツク・アシッズ・リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｃｌｓ Ｒｅｓ、 ）
、 ３巻、２８０８頁）により調製される。Ｌ’ｌ’−
に遺伝子のクローニングに用いるベクターはＣｂａｒｏ
ｎ ２８に代表される大ファージベクター、ｐＢ］Ｌ３
２２に代表されるプラスミドベクター或いはｐ Ｉ−、
Ｉ Ｏ７９に代表されるコスミッドなどが利用できるが
、一般的には、高率で長鎖のＤＮＡ断片をクローニング
できるλファージをベクターとして用いる遺伝子操作法
が用いられる。すなわちヒト高分子ＤＮＡを適切な制限
酵素で切断後、λフアージＤＮＡの置換可能領域の代り
に挿入し、リコンビナントファージＤＮＡをつくる。次
にインビトロパッケージングの手法を用い、感染性のあ
るファージ粒子を作製する。
を用い、：ｒ３Ｈ−ｎらの方法（１’３］−：ｉ−ｎ
、 Ｎ、ら（１９７６年）ヌクレイツク・アシッズ・リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｃｌｓ Ｒｅｓ、 ）
、 ３巻、２８０８頁）により調製される。Ｌ’ｌ’−
に遺伝子のクローニングに用いるベクターはＣｂａｒｏ
ｎ ２８に代表される大ファージベクター、ｐＢ］Ｌ３
２２に代表されるプラスミドベクター或いはｐ Ｉ−、
Ｉ Ｏ７９に代表されるコスミッドなどが利用できるが
、一般的には、高率で長鎖のＤＮＡ断片をクローニング
できるλファージをベクターとして用いる遺伝子操作法
が用いられる。すなわちヒト高分子ＤＮＡを適切な制限
酵素で切断後、λフアージＤＮＡの置換可能領域の代り
に挿入し、リコンビナントファージＤＮＡをつくる。次
にインビトロパッケージングの手法を用い、感染性のあ
るファージ粒子を作製する。
次に宿主大腸菌とともにプレートにまき、組換え型ファ
ージのプラークを形成させる（Ｅｎｑｕｉｓｔ。
ージのプラークを形成させる（Ｅｎｑｕｉｓｔ。
Ｌ、ら（１９７９年）メソラス・イン・エンザイモロジ
ー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
、 ６８巻。
ー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
、 ６８巻。
２８１頁； Ｈｏｒｎ、 Ｅ、 （１９７９年）メソッ
ズ・イン・エンサイモロジー、６８巻、２９９頁）。
ズ・イン・エンサイモロジー、６８巻、２９９頁）。
ＬＴ−Ｋをコードする］） Ｎ Ａ断片を持つ組換え型
ファージのプラークの検出には、ｃＤＮＡや合成ＤＮＡ
をプローブとしたプラークハイブリダイゼーションの手
法（Ｗｏｏ、 Ｓ、 Ｌ、 Ｃ，（１９７９年）メソッ
ズ・イン・エンザイモロジー、６８巻、３８９頁； ５
ｚｏｓｔａｋ、 Ｊ、Ｗ、ら（１９７９年）メソッズ・
イン・エンサイモロジー、 ６８巻、 ４１９頁）カ利
用できる。またＬＴ−にの遺伝子を持つ組換え型ファー
ジは、プラークハイブリダイゼーションによって選択さ
れたプラークから回収し宿主大腸菌と共に培養すること
により大量に調製できる。
ファージのプラークの検出には、ｃＤＮＡや合成ＤＮＡ
をプローブとしたプラークハイブリダイゼーションの手
法（Ｗｏｏ、 Ｓ、 Ｌ、 Ｃ，（１９７９年）メソッ
ズ・イン・エンザイモロジー、６８巻、３８９頁； ５
ｚｏｓｔａｋ、 Ｊ、Ｗ、ら（１９７９年）メソッズ・
イン・エンサイモロジー、 ６８巻、 ４１９頁）カ利
用できる。またＬＴ−にの遺伝子を持つ組換え型ファー
ジは、プラークハイブリダイゼーションによって選択さ
れたプラークから回収し宿主大腸菌と共に培養すること
により大量に調製できる。
また組換え型ファージのＤＮＡはフェノール法等により
調製できる（ Ｍａｎｉａｔｉｓ 、 ’Ｉ’、ら（１
９８２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ 。
調製できる（ Ｍａｎｉａｔｉｓ 、 ’Ｉ’、ら（１
９８２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ 。
（１０）］、ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）。
ｏｒａｔｏｒｙ）。
ｂ、塩基配列の決定とアミノ酸配列
クローン化された遺伝子の塩基配列はマキサム−ギルバ
ート法（Ｍａｘａｍ、 Ａ、 Ｍ、ら（２９８０年）メ
ソッズ・イン・エンサイモロジー、６５巻、４９９頁）
、或いはＳａｎｇｅｒのタイチオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ
。
ート法（Ｍａｘａｍ、 Ａ、 Ｍ、ら（２９８０年）メ
ソッズ・イン・エンサイモロジー、６５巻、４９９頁）
、或いはＳａｎｇｅｒのタイチオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ
。
Ｆ、（１９８１年）→Ｊイエンス（Ｓｃｊ−ｅｎｃｅ）
、 ２１４巻、１２０５頁）等で決定される。またタイ
チオキシ法の一種であるファージＭ １．３を用いたＭ
２Ｓ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｊ、 （１９８３年）メソ
ッズ・イン・エンザイモロジー、１０１巻、２ＯＮ）等
が利用できる。また、Ｌ Ｔ−にのアミノ酸配列は、ク
ローニングされた遺伝子のエクソン部分の塩基配列から
推定可能である。クローニングされた遺伝子の塩基配列
を実施例３に示したように決定した結果（第１図参照）
、Ｇｒａｙらが決定したＴＬＰＭ１１７８８株のリンホ
トキシンポリペプチド（Ｇｒａｙ。
、 ２１４巻、１２０５頁）等で決定される。またタイ
チオキシ法の一種であるファージＭ １．３を用いたＭ
２Ｓ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｊ、 （１９８３年）メソ
ッズ・イン・エンザイモロジー、１０１巻、２ＯＮ）等
が利用できる。また、Ｌ Ｔ−にのアミノ酸配列は、ク
ローニングされた遺伝子のエクソン部分の塩基配列から
推定可能である。クローニングされた遺伝子の塩基配列
を実施例３に示したように決定した結果（第１図参照）
、Ｇｒａｙらが決定したＴＬＰＭ１１７８８株のリンホ
トキシンポリペプチド（Ｇｒａｙ。
Ｐ、Ｗ、ら（１，９８４年）不イチー）□ −（Ｎａｔ
ｕｒｅ ） 。
ｕｒｅ ） 。
３１２巻、７２１頁）のＮ端のロイシンから数えて２６
番目のアミノ酸Ｔｈｒ（スレオニン）のコドンＡＣＣが
ＡＡＣであり、ＬＴ−１（遺伝子がコードするポリペプ
チドの２６番目のアミノ酸がＡｓｎ（アスパラギン）で
あることが判った。従って、ＬＴ−Ｋが今までに見い出
されたことのない新規リンホトキシンである事が明らか
になった。
番目のアミノ酸Ｔｈｒ（スレオニン）のコドンＡＣＣが
ＡＡＣであり、ＬＴ−１（遺伝子がコードするポリペプ
チドの２６番目のアミノ酸がＡｓｎ（アスパラギン）で
あることが判った。従って、ＬＴ−Ｋが今までに見い出
されたことのない新規リンホトキシンである事が明らか
になった。
Ｃ１動物培養細胞用発現ベクターの作製ＬＴ−にの動物
培養細胞用発現ベクターとしては、実施例４に示したイ
ントロン−エクソンの構造を有するＬＴ−に遺伝子配列
を動物培養細胞で機能するプロモーター配列の下流に結
合させたプラスミドｐ Ｓ Ｖ ｅ Ｓ ｍ ａ ｌ
Ｌ Ｔや実施例８に示したイントロン構造を持たないＬ
Ｔ−Ｋ ｃＤＮＡ配列をプロモーター配列の下流に結
合させたプラスミドｐｓＶｅｓｍａ（ｃＬＴ を挙げる
ことができる。これらのＬＴ−に発現ベクターは同一配
列上に微生物でのＤＮＡ複製起点（ｏｒｉ ）及び選択
マーカー遺伝子（ａｍｐ）を有し、ベクターＤＮＡの調
製を容易にしている。また、これらのベクターは、動物
培養細胞での選択マーカー遺伝子を同一ＤＮＡ配列上に
持ち、動物培養細胞へ導入後の形質転換株の分離を容易
にしている。上記発現ベクターは動物細胞での選択マー
カー遺伝子としてＥｃＯｇｐｔ （Ｍｕ１、１ｊ−ｇａ
ｎ、 Ｒ，Ｃ，ら（１９８０年）サイエンス（５ｃｉｅ
ｎｃｅ ）、 ２０９巻、１／１．２２頁）を用いてい
るが、ｎｅｏ （５ｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｐ、 、Ｔ、ら
（１９８２年）ジャーナル・オフ・モレキュラー・アン
ド・アプライド・ジエネティックス（Ｊ、 Ｍｏ１．
ＡＩ）ｐｌ。
培養細胞用発現ベクターとしては、実施例４に示したイ
ントロン−エクソンの構造を有するＬＴ−に遺伝子配列
を動物培養細胞で機能するプロモーター配列の下流に結
合させたプラスミドｐ Ｓ Ｖ ｅ Ｓ ｍ ａ ｌ
Ｌ Ｔや実施例８に示したイントロン構造を持たないＬ
Ｔ−Ｋ ｃＤＮＡ配列をプロモーター配列の下流に結
合させたプラスミドｐｓＶｅｓｍａ（ｃＬＴ を挙げる
ことができる。これらのＬＴ−に発現ベクターは同一配
列上に微生物でのＤＮＡ複製起点（ｏｒｉ ）及び選択
マーカー遺伝子（ａｍｐ）を有し、ベクターＤＮＡの調
製を容易にしている。また、これらのベクターは、動物
培養細胞での選択マーカー遺伝子を同一ＤＮＡ配列上に
持ち、動物培養細胞へ導入後の形質転換株の分離を容易
にしている。上記発現ベクターは動物細胞での選択マー
カー遺伝子としてＥｃＯｇｐｔ （Ｍｕ１、１ｊ−ｇａ
ｎ、 Ｒ，Ｃ，ら（１９８０年）サイエンス（５ｃｉｅ
ｎｃｅ ）、 ２０９巻、１／１．２２頁）を用いてい
るが、ｎｅｏ （５ｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｐ、 、Ｔ、ら
（１９８２年）ジャーナル・オフ・モレキュラー・アン
ド・アプライド・ジエネティックス（Ｊ、 Ｍｏ１．
ＡＩ）ｐｌ。
Ｇｅｎｅｔ、 ） 、 １巻、３２７頁）、ｄｈｆｒ
（Ｗｉｇｌｅｒ。
（Ｗｉｇｌｅｒ。
Ｍ、ら（１９８０年）プロシーディングズ・オフ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス・ニーニス
ニー、７７巻、８５６７頁）などの遺伝子を用いること
もできる。ｄ １１． ｆ ｒを用いた場合には、形質
転換株からメソトロキセート耐性株を分離し生産性の高
い遺伝子増幅株を分離するこζができる。プロモーター
としては動物培養細胞で機能する、すなわちｍＲＮＡの
合成を行えるプロモーターなら何れのプロモーターでも
よい。すなわち単純ヘルペス・ウィルスのチミジンキナ
ーゼプロモーターやヒート・ショック蛋白のプロモータ
ー等が利用できる。
ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス・ニーニス
ニー、７７巻、８５６７頁）などの遺伝子を用いること
もできる。ｄ １１． ｆ ｒを用いた場合には、形質
転換株からメソトロキセート耐性株を分離し生産性の高
い遺伝子増幅株を分離するこζができる。プロモーター
としては動物培養細胞で機能する、すなわちｍＲＮＡの
合成を行えるプロモーターなら何れのプロモーターでも
よい。すなわち単純ヘルペス・ウィルスのチミジンキナ
ーゼプロモーターやヒート・ショック蛋白のプロモータ
ー等が利用できる。
ＬＴ−ＫをコードするＤＮＡ配列としては、染色体ＤＮ
Ａ配列やｃＤＮＡ配列の他に、Ｉ、’Ｉ’−にのアミノ
酸配列に対応するＤＮＡ配列（例えば、合成ＤＮＡ配列
）であれば全て利用可能である。
Ａ配列やｃＤＮＡ配列の他に、Ｉ、’Ｉ’−にのアミノ
酸配列に対応するＤＮＡ配列（例えば、合成ＤＮＡ配列
）であれば全て利用可能である。
ｄ、動物培養細胞でのＬＴ−にの発現
動物培養細胞・＼のＤＮＡの導入法として、トランスフ
ェクション効率に差はあるが、リン酸カルシウム法（Ｗ
ｊ−ｇｌｅｒ、 Ｍ、ら（１９７７年）セル（Ｃｅｌｌ
）、 １．１巻、２２８頁）、マイクロインジェクシ
ョン法（Ａｎｃｌｅｒｓｏｎ、 Ｗ、 Ｉｉ”、ら（１
９８０年）プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル
・アカテミー・オフ・サイエンス・ニーニスニー、７７
巻、５８９９頁）、リボゾーム法、ＤＥＡＥ−デキスト
ラン法或いは細胞融合法（５ｃｈｏｆｆｎｅｒ、 ｗ。
ェクション効率に差はあるが、リン酸カルシウム法（Ｗ
ｊ−ｇｌｅｒ、 Ｍ、ら（１９７７年）セル（Ｃｅｌｌ
）、 １．１巻、２２８頁）、マイクロインジェクシ
ョン法（Ａｎｃｌｅｒｓｏｎ、 Ｗ、 Ｉｉ”、ら（１
９８０年）プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル
・アカテミー・オフ・サイエンス・ニーニスニー、７７
巻、５８９９頁）、リボゾーム法、ＤＥＡＥ−デキスト
ラン法或いは細胞融合法（５ｃｈｏｆｆｎｅｒ、 ｗ。
ら（１９８０年）プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナシ
ョナル・アカテミー・オフ・サイエンス・ニーニスニー
、７７巻、２１１頁）等が用いられている。リン酸カル
シウム法として用いるＤＮＡ材料としては、ＤＮＡ溶液
の他に大腸菌などの微生物、ファージなども利用できる
。細胞融合法では目的ＤＮＡ配列をプラスミドとして保
有している微生物のプロトプラスト ベクターの動物培養細胞への導入とＬ’Ｉ’−にの発現
を実施例５，６及び９１こ示Ｌ７た。
ョナル・アカテミー・オフ・サイエンス・ニーニスニー
、７７巻、２１１頁）等が用いられている。リン酸カル
シウム法として用いるＤＮＡ材料としては、ＤＮＡ溶液
の他に大腸菌などの微生物、ファージなども利用できる
。細胞融合法では目的ＤＮＡ配列をプラスミドとして保
有している微生物のプロトプラスト ベクターの動物培養細胞への導入とＬ’Ｉ’−にの発現
を実施例５，６及び９１こ示Ｌ７た。
Ｌ’Ｔ’−Ｋをコードする遺伝子は、ＡＳｎ Ｘ Ｓｅ
Ｔ：というＮ−グリコジル化されるアミノ酸配列をコー
ドしている為に、発現ベクターによる形質転換細胞が生
産するＬＴ−には糖鎖を有している。また一部糖鎖を持
たないＬ Ｔ−１（を生産する可能性は他の分泌蛋白の
例から類推される。
Ｔ：というＮ−グリコジル化されるアミノ酸配列をコー
ドしている為に、発現ベクターによる形質転換細胞が生
産するＬＴ−には糖鎖を有している。また一部糖鎖を持
たないＬ Ｔ−１（を生産する可能性は他の分泌蛋白の
例から類推される。
株化細胞且ＰＭＩ １７８８株に由来するＬＴは細胞
中でプロセスされ、Ｎ端がＬｅｕ（ロイシン）である１
７１アミノ酸残基のものとＮ端が．ＩＴｉｓ（ヒスチジ
ン）である１４８アミノ酸残基のものが知られている（
Ｇｒａｙ 、 Ｐ． Ｗ．ら（ １． ９ ８ ４年
）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ ）、 ３ １ ２巻，７
２１頁； ＡｇｇａｒＷａｌ。
中でプロセスされ、Ｎ端がＬｅｕ（ロイシン）である１
７１アミノ酸残基のものとＮ端が．ＩＴｉｓ（ヒスチジ
ン）である１４８アミノ酸残基のものが知られている（
Ｇｒａｙ 、 Ｐ． Ｗ．ら（ １． ９ ８ ４年
）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ ）、 ３ １ ２巻，７
２１頁； ＡｇｇａｒＷａｌ。
Ｂ． Ｂ．ら（１９８５年）ザ・ジャーナル・オフ・バ
イオロジカル・ケミストリー（ Ｊ 、 Ｂｉｏｌ．
Ｏｈｅｍ．）。
イオロジカル・ケミストリー（ Ｊ 、 Ｂｉｏｌ．
Ｏｈｅｍ．）。
２６０巻，２８３４頁）。Ｌ ’Ｉ’ − Ｋの発現ベ
クターの形質転換細胞によって分泌されるＬＴ−Ｋが同
様なプロセスを受け、Ｎ端がＴＪ ｅ ｕである１７１
アミノ酸残基のものとＩＩｉｓである４４８アミノ酸残
基のポリペブタイドから成ることがある。
クターの形質転換細胞によって分泌されるＬＴ−Ｋが同
様なプロセスを受け、Ｎ端がＴＪ ｅ ｕである１７１
アミノ酸残基のものとＩＩｉｓである４４８アミノ酸残
基のポリペブタイドから成ることがある。
ＬＴ−にの生産に用いる宿主細胞としては、本明細書に
示されているＬＴ−にの製造法を用いれば、少なくとも
を椎動物由来の培養細胞、融合細胞、正常及び変異細胞
、ウィルスによる形質転換細胞等において活性あるＬ’
ｌ−Ｋを産生ずることが可能である。またヒトの細胞を
ＳＶ４０で形質転換した株化細胞を生産細胞として用い
る事は、原因不明で癌化或いは株化Ｉノだ細胞に比して
、適切な手段を講じることにより生産物の安全性の向上
が期待される。ＳＶ４０の形質転換細胞としてＷｉ−２
６ ＶＡ４が知られている。
示されているＬＴ−にの製造法を用いれば、少なくとも
を椎動物由来の培養細胞、融合細胞、正常及び変異細胞
、ウィルスによる形質転換細胞等において活性あるＬ’
ｌ−Ｋを産生ずることが可能である。またヒトの細胞を
ＳＶ４０で形質転換した株化細胞を生産細胞として用い
る事は、原因不明で癌化或いは株化Ｉノだ細胞に比して
、適切な手段を講じることにより生産物の安全性の向上
が期待される。ＳＶ４０の形質転換細胞としてＷｉ−２
６ ＶＡ４が知られている。
Ｉ’Ｔ−Ｋを産生ずるようになった細胞は、通常、細胞
の培養に用いられる血清を含んだ培地だけでなく、無血
清培地でもＬＴ−にの生産が可能である。無血清培地を
用いることは、ＬＴ−にの回収、精製を容易にする。
の培養に用いられる血清を含んだ培地だけでなく、無血
清培地でもＬＴ−にの生産が可能である。無血清培地を
用いることは、ＬＴ−にの回収、精製を容易にする。
ｅ．ＬＴ−Ｋ ｃＤＮＡの取得
］ＬＴ−にのｍＲＮＡは正常リンパ球をレクチンやフォ
ルボールエステルで刺激した細胞からも抽出可能である
が、本発明者らは培養細胞用発現ベクターｐｓＶｅｓｍ
ａｌＬ’ｌ’を導入したｉ３ ＩＴ Ｋ形質転換株の一
株（ Ｌ Ｔ−Ｋを約５， ０ ０ ０ Ｕ ／ｒｔｔ
ｔ／日で分泌）からｍＲＮＡを抽出し、Ｏｋａｙａｍａ
−Ｂｅｒｇの方法にてＬＴ−にのｃＤＮＡをクローニン
グした。
ルボールエステルで刺激した細胞からも抽出可能である
が、本発明者らは培養細胞用発現ベクターｐｓＶｅｓｍ
ａｌＬ’ｌ’を導入したｉ３ ＩＴ Ｋ形質転換株の一
株（ Ｌ Ｔ−Ｋを約５， ０ ０ ０ Ｕ ／ｒｔｔ
ｔ／日で分泌）からｍＲＮＡを抽出し、Ｏｋａｙａｍａ
−Ｂｅｒｇの方法にてＬＴ−にのｃＤＮＡをクローニン
グした。
ＬＴ−にのｃＤＮＡのクローニングについては実施例７
に示した。
に示した。
ｆ．微生物用発現ベクターの作製とＬＴ−にの微生物で
の発現 Ｌ’Ｔ’−にのアミノ酸配列を有するｃＤＮＡ断片を微
生物中で発現させるには、微生物で機能する適当なプロ
モーター、例えば大腸菌においては、ｔｒｐプロモータ
ー、ｌａｃプロモーター或いはｔａｃプロモーターの配
列の下流に該ｃＤＮＡの配列を結合させた発現ベクター
を作製する必要がある。
の発現 Ｌ’Ｔ’−にのアミノ酸配列を有するｃＤＮＡ断片を微
生物中で発現させるには、微生物で機能する適当なプロ
モーター、例えば大腸菌においては、ｔｒｐプロモータ
ー、ｌａｃプロモーター或いはｔａｃプロモーターの配
列の下流に該ｃＤＮＡの配列を結合させた発現ベクター
を作製する必要がある。
この場合、一般的には、開始コドン（Ａ．ＴＧ）の５′
側６から１８塩基対上流にはシャイン−ダルガノ配列を
配置したプラスミドが適切である。発現ベクターの作製
を実施例１０に示した。
側６から１８塩基対上流にはシャイン−ダルガノ配列を
配置したプラスミドが適切である。発現ベクターの作製
を実施例１０に示した。
発現ベクターを有する微生物の培養に用いる培地として
は、微生物の生育及びＴ， Ｔ − Ｋの生産が可能な
ものならば合成培地、天然培地のいずれも使用できる。
は、微生物の生育及びＴ， Ｔ − Ｋの生産が可能な
ものならば合成培地、天然培地のいずれも使用できる。
また培養条件についても、微生物の生育及びＬＴ−にの
生産が可能な条件であれば、どのような培養条件でもよ
い。例えば使用する微生物に適したｐ■、培養温度を用
いて、振とう、撹拌、通気培養により行なわれ得る。
生産が可能な条件であれば、どのような培養条件でもよ
い。例えば使用する微生物に適したｐ■、培養温度を用
いて、振とう、撹拌、通気培養により行なわれ得る。
宿主微生物としては、大腸菌のみならず枯草菌、酵母、
等も適切なプロモーター配列をＬＴ−にのｃＤＮＡ配列
の上流に接続させた発現ベクターを作製し、宿主微生物
に導入しＬＴ−Ｋを生産させることが可能である。また
、適切なプロモーターを付加することにより、菌体外に
分泌させることが可能である。
等も適切なプロモーター配列をＬＴ−にのｃＤＮＡ配列
の上流に接続させた発現ベクターを作製し、宿主微生物
に導入しＬＴ−Ｋを生産させることが可能である。また
、適切なプロモーターを付加することにより、菌体外に
分泌させることが可能である。
前述したように株化細胞ＲＰＭＩ １７８８株に由来
するＬＴは、Ｎ端がＬｅｕである１７１アミノ酸残基の
ものとＮ端がＨｊ−ｓである１４８アミノ酸残基のもの
とが知られている。本発明者らは、これら２種のアミノ
酸配列に対応するＬＴ−にのｃＤ ＮＡ配列の５′端に
メチオニンコドンであるＡＴＧを付した配列を有する２
種の発現ベクターを作製し、大腸菌にてＬＴ−にの発現
に成功した。１７１アミノ酸残基のＮ端の２３残基はＬ
Ｔの活性には影響のないアミノ酸配列であると考えら
れるので、１７１アミノ酸残基からＮ端のアミノ酸が１
アミノ酸残基ずつ少ない１７０乃至１４９アミノ酸残基
のＬＴに対応するＬ Ｔ −Ｋの発現ベクターの構築及
び発現がｒ＋Ｊ能である。
するＬＴは、Ｎ端がＬｅｕである１７１アミノ酸残基の
ものとＮ端がＨｊ−ｓである１４８アミノ酸残基のもの
とが知られている。本発明者らは、これら２種のアミノ
酸配列に対応するＬＴ−にのｃＤ ＮＡ配列の５′端に
メチオニンコドンであるＡＴＧを付した配列を有する２
種の発現ベクターを作製し、大腸菌にてＬＴ−にの発現
に成功した。１７１アミノ酸残基のＮ端の２３残基はＬ
Ｔの活性には影響のないアミノ酸配列であると考えら
れるので、１７１アミノ酸残基からＮ端のアミノ酸が１
アミノ酸残基ずつ少ない１７０乃至１４９アミノ酸残基
のＬＴに対応するＬ Ｔ −Ｋの発現ベクターの構築及
び発現がｒ＋Ｊ能である。
微生物で生産されたＩ、 ’Ｔ”−には、動物培養細胞
の場合と同じように、生体内でプロセスされ、ペプチド
のＮ端、Ｃ端が部分的に欠落する場合がある。また、糖
鎖による修飾を受ける場合がある。
の場合と同じように、生体内でプロセスされ、ペプチド
のＮ端、Ｃ端が部分的に欠落する場合がある。また、糖
鎖による修飾を受ける場合がある。
ＬＴ−Ｋをコードする一Ｄ Ｎ Ａ配列としては、ｃ
：Ｄ Ｎ Ａの他にＬＴ−にのアミノ酸配列に対応する
ＤＮＡ配列（例えば合成ＤＮＡ配列）であれば全て利用
可能である。
：Ｄ Ｎ Ａの他にＬＴ−にのアミノ酸配列に対応する
ＤＮＡ配列（例えば合成ＤＮＡ配列）であれば全て利用
可能である。
以上ａ乃至ｆに記述した方法により、動物培養細胞或い
は微生物で生産されたＬＴ−には、既知のＲＰＭＩ
１７８８株のリンホトキシンポリペプチド（Ａｇｇａｒ
ｗａｌ 、 Ｂ、 Ｂ、ら（１，９８５年）ジャーナル
・オフ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。
は微生物で生産されたＬＴ−には、既知のＲＰＭＩ
１７８８株のリンホトキシンポリペプチド（Ａｇｇａｒ
ｗａｌ 、 Ｂ、 Ｂ、ら（１，９８５年）ジャーナル
・オフ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。
Ｂｉｏ１、 Ｏｈｅｍ、 ）、 ２６０巻、２８８４頁
）或いは組換えＤＮＡの手法によって大腸菌でつくられ
たリンホトキシンポリペプチド（Ｇｒａｙ、 Ｐ、 Ｗ
、ら（１９８４年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
８１２巻。
）或いは組換えＤＮＡの手法によって大腸菌でつくられ
たリンホトキシンポリペプチド（Ｇｒａｙ、 Ｐ、 Ｗ
、ら（１９８４年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
８１２巻。
７２１頁）とアミノ酸配列が異なり、明う゛かに新規リ
ンホトキシンである。特に本発明のＬＴ−にのＤＮＡ配
列は、ヒト正常リンパ球に見い出されたもので、実際に
生体内で生理的に機能しているリンホトキシンはＬＴ−
に配列を有すると考えられる。
ンホトキシンである。特に本発明のＬＴ−にのＤＮＡ配
列は、ヒト正常リンパ球に見い出されたもので、実際に
生体内で生理的に機能しているリンホトキシンはＬＴ−
に配列を有すると考えられる。
本発明者らは、動物培養細胞によってつくられたＬ’ｒ
’−にの性質を調べる目的で、ＬＴ−にの部分精製を行
った。その結果、ＬＴ−Ｋがレンチル・レクチン・セフ
ァロースカラムに吸着されα−メチルマンノシドで溶出
されることが分った。このことは動物培養細胞でつくら
れたＬＴ−Ｋが糖鎖を有していることを示している。
’−にの性質を調べる目的で、ＬＴ−にの部分精製を行
った。その結果、ＬＴ−Ｋがレンチル・レクチン・セフ
ァロースカラムに吸着されα−メチルマンノシドで溶出
されることが分った。このことは動物培養細胞でつくら
れたＬＴ−Ｋが糖鎖を有していることを示している。
ＬＴ−にはＬ９２９細胞（ＯＯＬ−１）に対して細胞致
死因子として働くが、本発明者らがヒトの癌株化細胞（
肺癌細胞等）を標的細胞として、その致死因子としての
作用を調べた結果、■、ｌ−Ｋがヒト・インターフェロ
ン−γと相乗的に癌細胞に対し致死活性を有しているこ
とが分った。
死因子として働くが、本発明者らがヒトの癌株化細胞（
肺癌細胞等）を標的細胞として、その致死因子としての
作用を調べた結果、■、ｌ−Ｋがヒト・インターフェロ
ン−γと相乗的に癌細胞に対し致死活性を有しているこ
とが分った。
（実施例）
以下に実施例を示すが、本発明に係る諸実験は内閣総理
大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」に従って行った
。また実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、種々
の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は下記の雑誌、成
書を参考とした。
大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」に従って行った
。また実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、種々
の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は下記の雑誌、成
書を参考とした。
１）蛋白質 核酸 酵素、２６巻、４号、（１９８１年
）臨時増刊 遺伝子操作（共立出版）２）遺伝子操作実
験法、高木康敬編著（１９８０年）講談社 ３）遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著（１９８２年
） 講談社 ４） Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ！ｌｏｎｉｎｇ ａ ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａ１、 Ｔ’、 Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら編（１９８２年） Ｃｏｌｄｓｐｒｉ−ｎｇ
Ｊ（ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ５） Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 ６５巻、Ｌ
。
）臨時増刊 遺伝子操作（共立出版）２）遺伝子操作実
験法、高木康敬編著（１９８０年）講談社 ３）遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著（１９８２年
） 講談社 ４） Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ！ｌｏｎｉｎｇ ａ ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａ１、 Ｔ’、 Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら編（１９８２年） Ｃｏｌｄｓｐｒｉ−ｎｇ
Ｊ（ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ５） Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 ６５巻、Ｌ
。
Ｇｒｏｓｓｍａｎら編（１９８０年） Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ６） Ｍｅｔｂｏｄｓｉｎ ：Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ、 ６８巻、Ｒ，、Ｗｕ＆（１９７９年）
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ実施例Ｉ ＬＴ’−に遺伝子のクローニング 複数の健康成人からヘパリン採血し、市販のリン酸緩衝
液（ＰＢＳ）（フローラボラトリー社製）で２倍１後、
フィコールパック（ファルマシア社製）液に上層し、２
（１０）０回転、３０分遠心し白血球層を分離し、更に
ＰＢＳで２回洗浄した。
ｃ Ｐｒｅｓｓ６） Ｍｅｔｂｏｄｓｉｎ ：Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ、 ６８巻、Ｒ，、Ｗｕ＆（１９７９年）
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ実施例Ｉ ＬＴ’−に遺伝子のクローニング 複数の健康成人からヘパリン採血し、市販のリン酸緩衝
液（ＰＢＳ）（フローラボラトリー社製）で２倍１後、
フィコールパック（ファルマシア社製）液に上層し、２
（１０）０回転、３０分遠心し白血球層を分離し、更に
ＰＢＳで２回洗浄した。
１０８個の細胞に対し２０ ｍｌの０．５Ｍ ＥＤ’
ｌ’Ａ−０，５％ザルコシル溶液を加え、２〜のプロテ
アーゼＫを入れ、５０°Ｃで３時間インキュベートした
。
ｌ’Ａ−０，５％ザルコシル溶液を加え、２〜のプロテ
アーゼＫを入れ、５０°Ｃで３時間インキュベートした
。
フェノール抽出を２回行い、水層を５０ ？ｎＭ ｌ−
リス−１（１７７２Ｍ ＥＤＴＡ−１（１７７１Ｍ塩
化ナトリウム（ｐＨ８，０）に１晩透析した。ＲＮａｓ
ｅＡを１（１０）１１ｇ／肩ｌになるように加え、３７
°Ｃで３時間処理後、フェノール抽出を２回行い、水層
を５（１７ノ２Ｍ＋−リスー１（１７７２Ｍ ＥＤ’
ｌ”Ａｉｉ：透析し、高分子ヒｌ−Ｄ Ｎ Ａを得た。
リス−１（１７７２Ｍ ＥＤＴＡ−１（１７７１Ｍ塩
化ナトリウム（ｐＨ８，０）に１晩透析した。ＲＮａｓ
ｅＡを１（１０）１１ｇ／肩ｌになるように加え、３７
°Ｃで３時間処理後、フェノール抽出を２回行い、水層
を５（１７ノ２Ｍ＋−リスー１（１７７２Ｍ ＥＤ’
ｌ”Ａｉｉ：透析し、高分子ヒｌ−Ｄ Ｎ Ａを得た。
ヒトＤＮＡを制限酵素５ａｕ８Ａｌで部分切断後、蔗糖
密度勾配遠心により約１５〜２０キロベース（Ｋｂ）の
大きさのＳ ａ ｕ ８ Ａ ｌＤＮＡ断片を調製した
。ラノ・ダファージベクターＣ！ｈａｒｏｎ ２８ Ｄ
Ｎ ＡをＢａｍＩ−Ｉ）で切断後、蔗糖密度勾配遠心
により ０ｈａｒｏｎ ２８の左端断片及び右端断片を
含む両分を集め、エタノール沈澱により回収した。
密度勾配遠心により約１５〜２０キロベース（Ｋｂ）の
大きさのＳ ａ ｕ ８ Ａ ｌＤＮＡ断片を調製した
。ラノ・ダファージベクターＣ！ｈａｒｏｎ ２８ Ｄ
Ｎ ＡをＢａｍＩ−Ｉ）で切断後、蔗糖密度勾配遠心
により ０ｈａｒｏｎ ２８の左端断片及び右端断片を
含む両分を集め、エタノール沈澱により回収した。
Ｃ！ｈａｒｏｎ ２８の両端のＤＮＡ断片とヒト１５〜
２０ （Ｋｂ）Ｓａｕ８ＡＩ断片をＴ４．１）ＮＡリガ
ーゼで結合後、エンキストとスタンバーブの方法（ＩＬ
。
２０ （Ｋｂ）Ｓａｕ８ＡＩ断片をＴ４．１）ＮＡリガ
ーゼで結合後、エンキストとスタンバーブの方法（ＩＬ
。
Ｅｎｑ ｕｌｓ ｊとＮ、 Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ （１
９７９年）メソッズ・イン・エンザイモロジー、６８巻
、２８１頁）によりインビトロパッケージングを行い、
大腸菌ＬＥ８９２（ＡＴＯＯ３８５７２）を宿主として
組換え型ファージのゾラークを形成させた。次にブラー
クハイプリタイゼーションの手法（Ｂｅｎｔｏｎ 。
９７９年）メソッズ・イン・エンザイモロジー、６８巻
、２８１頁）によりインビトロパッケージングを行い、
大腸菌ＬＥ８９２（ＡＴＯＯ３８５７２）を宿主として
組換え型ファージのゾラークを形成させた。次にブラー
クハイプリタイゼーションの手法（Ｂｅｎｔｏｎ 。
Ｗ、Ｄ、、 Ｄａｖｉｓ、 Ｒ，Ｗ、 （１９７７年）
サイエンス。
サイエンス。
１９６巻、１８０頁）によりＬ １”−にの遺伝子を持
つ組換え型ファージクローンを選択した。プローブとし
ては、ＬＴの遺伝子に存在する配列を持つオリゴヌクレ
オチＦ Ａ’ｌ”ＧＡＯＡＯＯＡｃＯ’ｌｌ’ＧＡＡＣ
Ｇ’Ｉ’、 ’ｆ’（ＷＡＣＸｆＩＣＯＯＡＧＣＪＴＧ
ＧＴＯ及びＡＣ’ｌ”Ｇ’Ｉ’Ｇ！’Ｉ’ＴＯ’Ｉ’Ｔ
ＴＧＧＡＧＣＣ（これらの配列はＬＴのアミノ酸配列−
３４から−２９，７５から８０及び１６３から１６８に
対応している： Ｇｒａｙ、 Ｐ、Ｗ。
つ組換え型ファージクローンを選択した。プローブとし
ては、ＬＴの遺伝子に存在する配列を持つオリゴヌクレ
オチＦ Ａ’ｌ”ＧＡＯＡＯＯＡｃＯ’ｌｌ’ＧＡＡＣ
Ｇ’Ｉ’、 ’ｆ’（ＷＡＣＸｆＩＣＯＯＡＧＣＪＴＧ
ＧＴＯ及びＡＣ’ｌ”Ｇ’Ｉ’Ｇ！’Ｉ’ＴＯ’Ｉ’Ｔ
ＴＧＧＡＧＣＣ（これらの配列はＬＴのアミノ酸配列−
３４から−２９，７５から８０及び１６３から１６８に
対応している： Ｇｒａｙ、 Ｐ、Ｗ。
ら（１，９８４年）ネイヂャー、３１２巻、７２１頁）
をホスホトリエステル法（Ｍｉｙｏｓｈｉ、 Ｋ、ら（
１９８０年）ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ。
をホスホトリエステル法（Ｍｉｙｏｓｈｉ、 Ｋ、ら（
１９８０年）ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ。
８巻、５５（１７頁）で合成し、５’ＯＨを〔γ−８２
Ｐ〕Ａ’Ｊ’Ｐ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標
識して用いた。
Ｐ〕Ａ’Ｊ’Ｐ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標
識して用いた。
約６０万の組換え型ファージクローンから用いた３種の
合成ＤＮＡプローブすべてとハイブリダイズするファー
ジクローン１１株を得た。このうちの１つのファージク
ローン４−１を種々の制限酵素で切断し、アガロース電
気泳動を行い、ニトロセルロースフィルターにトランス
ファー後、３種の合成ＤＮＡプローブを用いたザザーン
ハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ、Ｍ、
（１９７５年）ジャーナル・オフ・モレキュラー・バイ
オロジー（、Ｔ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏ１、 ） ９８巻
、５０３頁）を行つたところ、ＢａｍＩ−Ｉ ｆ ４
．２ Ｋｂ 、 ＥｃｏＲＩ ２．８ＫｂおよびＳｍ
ａｌ ２．７Ｋｂ断片が３種のプローブとハイブリダ
イズした。また、いくつかのファージクローンのＤＮＡ
の制限酵素解析の結果、Ｌ’Ｉ’−に染色体ＤＮＡ配列
及び隣接した配列の制限酵素認識部位は第２図のように
マツプされた。
合成ＤＮＡプローブすべてとハイブリダイズするファー
ジクローン１１株を得た。このうちの１つのファージク
ローン４−１を種々の制限酵素で切断し、アガロース電
気泳動を行い、ニトロセルロースフィルターにトランス
ファー後、３種の合成ＤＮＡプローブを用いたザザーン
ハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ、Ｍ、
（１９７５年）ジャーナル・オフ・モレキュラー・バイ
オロジー（、Ｔ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏ１、 ） ９８巻
、５０３頁）を行つたところ、ＢａｍＩ−Ｉ ｆ ４
．２ Ｋｂ 、 ＥｃｏＲＩ ２．８ＫｂおよびＳｍ
ａｌ ２．７Ｋｂ断片が３種のプローブとハイブリダ
イズした。また、いくつかのファージクローンのＤＮＡ
の制限酵素解析の結果、Ｌ’Ｉ’−に染色体ＤＮＡ配列
及び隣接した配列の制限酵素認識部位は第２図のように
マツプされた。
実施例２
Ｌ’Ｉ”−に遺伝子のサブクローニングファージクロー
ン４−１のＪ） Ｎ Ａを制御 酵素ＥａｍＨ１で切断
し、生じた４、２Ｋｂの断片をプラスミドｐＵＯ９（フ
ァルマシア社から購入）（Ｖｉｅｉｒａ、 ＪとＭｅｓ
ｓｊ−ｎｇ、 Ｊ （１９８２年）シーン（Ｇｅｎｅ）
、 １９巻、２５９頁）のＴ３ａｍＨ１部位に挿入しｐ
ＬＴＢ４．２を作製した（第３図）。
ン４−１のＪ） Ｎ Ａを制御 酵素ＥａｍＨ１で切断
し、生じた４、２Ｋｂの断片をプラスミドｐＵＯ９（フ
ァルマシア社から購入）（Ｖｉｅｉｒａ、 ＪとＭｅｓ
ｓｊ−ｎｇ、 Ｊ （１９８２年）シーン（Ｇｅｎｅ）
、 １９巻、２５９頁）のＴ３ａｍＨ１部位に挿入しｐ
ＬＴＢ４．２を作製した（第３図）。
市販されているｐＵＣ！９のブライマー０ＡＧＧＡＡＡ
ＯＡＧＯＴＡＴＧＡ、Ｃ！、ＡＧＴＯＡＣＧＡＯＧ’Ｉ
’甲ＧＴＡ （以上、宝酒造製）及びＬＴのアミノ酸−
２３から−２８，７５から８０．１６３から１６８に対
応するオリゴ−マー ＡＯＯＯＴＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧ
ＡＧ。
ＯＡＧＯＴＡＴＧＡ、Ｃ！、ＡＧＴＯＡＣＧＡＯＧ’Ｉ
’甲ＧＴＡ （以上、宝酒造製）及びＬＴのアミノ酸−
２３から−２８，７５から８０．１６３から１６８に対
応するオリゴ−マー ＡＯＯＯＴＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧ
ＡＧ。
ＴＯＴＡＣ’ｌ”０ＯＯＡＧ（ＪＴＧＧＴＯ，Ａ（：！
ＴＧ’Ｊ”Ｇ！Ｔ’Ｉ’Ｃ’ｌｌ’Ｔ’Ｊ’ＧＧＡＧｏ
ｏ をプライマーとしたダイデオキシ法による塩基配列
の決定（〜Ｖａｌｌａｃｅ、 、Ｒ，Ｂ、ら（１９８１
年）シーン、１６巻、２１頁）をｐＬＴＥ４．２に実施
した。その結果ＬＴ−にの５′側は、ＧＧＡＴＯＣＣＣ
ＧＧＣＧ！ＴＧＣＯＴＧＧＧＣＯＴＧＧＧの配列を有し
、３′側は、 ｂＵ ＧＡＡＡＡＡＴＣＣ！ＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＡＡ
’ｌ”ＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＡＣＣＴＴＯ’Ｔ’０ＣＣ
ＣＡ’ｌｌ’ＴＯＴＧＯＯＴＯＣＡＴＴＣＴＧＡＯＣＡ
Ｔ’Ｔ’ＴＣＡ、ＧＧＧＧＴＯＱ’Ｔ’０ＡＣＯＡＣＣ
ＴＣＴＣＩＣＴＴＴＧＧＣＣＡ〒’ｒ（１０）ＡＡＯＡ
ＧＣ’ｌｌ”ＣＡＡＧＴＯＴＴＯＣＯＴＧＡＴＣＡＡＧ
ＴＯＡＣＯＧＧＡＧＣＴＴ〒ＣＡ、ＡＡＧＡＡの配列を
有していることが分った。
ＴＧ’Ｊ”Ｇ！Ｔ’Ｉ’Ｃ’ｌｌ’Ｔ’Ｊ’ＧＧＡＧｏ
ｏ をプライマーとしたダイデオキシ法による塩基配列
の決定（〜Ｖａｌｌａｃｅ、 、Ｒ，Ｂ、ら（１９８１
年）シーン、１６巻、２１頁）をｐＬＴＥ４．２に実施
した。その結果ＬＴ−にの５′側は、ＧＧＡＴＯＣＣＣ
ＧＧＣＧ！ＴＧＣＯＴＧＧＧＣＯＴＧＧＧの配列を有し
、３′側は、 ｂＵ ＧＡＡＡＡＡＴＣＣ！ＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＡＡ
’ｌ”ＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＡＣＣＴＴＯ’Ｔ’０ＣＣ
ＣＡ’ｌｌ’ＴＯＴＧＯＯＴＯＣＡＴＴＣＴＧＡＯＣＡ
Ｔ’Ｔ’ＴＣＡ、ＧＧＧＧＴＯＱ’Ｔ’０ＡＣＯＡＣＣ
ＴＣＴＣＩＣＴＴＴＧＧＣＣＡ〒’ｒ（１０）ＡＡＯＡ
ＧＣ’ｌｌ”ＣＡＡＧＴＯＴＴＯＣＯＴＧＡＴＣＡＡＧ
ＴＯＡＣＯＧＧＡＧＣＴＴ〒ＣＡ、ＡＡＧＡＡの配列を
有していることが分った。
プラスミドｐＬＴ’１４．２には、Ｌ’Ｉ’−にのアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ配列はすべて含まれるが、
５′側上流に存在するべき転写開始領域は含まれていな
い。従って、次にｉ、Ｔ−に遺伝子を含むファージクロ
ーン４−１株の］） Ｎ Ａを制限酵素ＥｃｏＲ１で切
断し、生じた２、８Ｋｂの断片をプラスミドｐＵＣ９の
ＥＯＯ几１部位に挿入し、ｐＬＴＥ２．３を作製した（
プラスミドｐ１．’ｆ’Ｅ２．８の構造を第４図に示し
た）。
ノ酸配列をコードするＤＮＡ配列はすべて含まれるが、
５′側上流に存在するべき転写開始領域は含まれていな
い。従って、次にｉ、Ｔ−に遺伝子を含むファージクロ
ーン４−１株の］） Ｎ Ａを制限酵素ＥｃｏＲ１で切
断し、生じた２、８Ｋｂの断片をプラスミドｐＵＣ９の
ＥＯＯ几１部位に挿入し、ｐＬＴＥ２．３を作製した（
プラスミドｐ１．’ｆ’Ｅ２．８の構造を第４図に示し
た）。
実施例３
ＬＴ−に遺伝子の塩基配列決定
プラスミドｐＬＴＢ４．２を制限酵素ＢａｍＩ［で切断
し、１３ ａｍＢ：Ｉ Ｉ４．２ Ｋｂ断片をアガロー
スゲル電気泳動により調製した。またｐＬＴ３２．３を
制限酵素Ｐｓｔ Ｉ或いはＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌで切断
して得られるｐｓｔｌ ｏ、ｓ Ｋｂ及びＥＣＯＲｌ
−ｐｓｔ １１、、２ Ｋｂ断片を調製した。これら３
種のＤＮＡ断片を制限酵素５ａｕ８Ａ１． Ａ、１ｕ
Ｉ、 Ｈａｅｌ［、ＲｓａＬＡｃｃ ＩＩ 、 Ｈｐａ
ＩＩ或いはＴａｑｌで切断し、ファージＭ１３ｍｐＨ
（アマジャム ジャパンより購入）のＢａｍ：Ｆ（ｌ
、 Ｓｍａ Ｉ或いはＡＣＣＩ部位に挿入し、大腸菌Ｊ
Ｍ１０３（ファルマシア■より購入）を宿主として組み
換え型ファージのプラークを形成させた。分離した組み
換え型ファージから１本鎖ファージＤＮＡを調製し、こ
れと合成ＤＮＡプライマーＡ’ｌ’ＧＴＴＧ（Ｊ、ＧＯ
ＡＣ’Ｊ’ＧＡ （宝酒造）を用いてダイデオキシ法に
よる塩基配列の決定を行った。
し、１３ ａｍＢ：Ｉ Ｉ４．２ Ｋｂ断片をアガロー
スゲル電気泳動により調製した。またｐＬＴ３２．３を
制限酵素Ｐｓｔ Ｉ或いはＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌで切断
して得られるｐｓｔｌ ｏ、ｓ Ｋｂ及びＥＣＯＲｌ
−ｐｓｔ １１、、２ Ｋｂ断片を調製した。これら３
種のＤＮＡ断片を制限酵素５ａｕ８Ａ１． Ａ、１ｕ
Ｉ、 Ｈａｅｌ［、ＲｓａＬＡｃｃ ＩＩ 、 Ｈｐａ
ＩＩ或いはＴａｑｌで切断し、ファージＭ１３ｍｐＨ
（アマジャム ジャパンより購入）のＢａｍ：Ｆ（ｌ
、 Ｓｍａ Ｉ或いはＡＣＣＩ部位に挿入し、大腸菌Ｊ
Ｍ１０３（ファルマシア■より購入）を宿主として組み
換え型ファージのプラークを形成させた。分離した組み
換え型ファージから１本鎖ファージＤＮＡを調製し、こ
れと合成ＤＮＡプライマーＡ’ｌ’ＧＴＴＧ（Ｊ、ＧＯ
ＡＣ’Ｊ’ＧＡ （宝酒造）を用いてダイデオキシ法に
よる塩基配列の決定を行った。
第１図に決定したＬ’ｌ”−に遺伝子の塩基配列及びエ
クソンの配列から推定されるアミノ酸配列を示１ノｊこ
。
クソンの配列から推定されるアミノ酸配列を示１ノｊこ
。
Ｔ、 Ｔ −Ｋ遺伝子は少なくとも４つのエクソンと３
つのイントロンより構成されている。第１エクソンには
真核生物のプロモーター領域に見い出される“’［ｌ”
ＡＴＡ”ボックス様配列（’Ｊ’ＡＴＡＡＡ）が見うれ
、第２エクソンには開始コドン（ＡＴＧ）が、第４エク
ソンには終止コドン（ＴＡＧ）及びポ！Ｉ （Ａ）付加
シグナル（Ａ、ＡＴ ＡＡ、Ａ ）が存在している。公
知のリンホトキシンｃＤＮＡ配列（Ｇｒａｙ。
つのイントロンより構成されている。第１エクソンには
真核生物のプロモーター領域に見い出される“’［ｌ”
ＡＴＡ”ボックス様配列（’Ｊ’ＡＴＡＡＡ）が見うれ
、第２エクソンには開始コドン（ＡＴＧ）が、第４エク
ソンには終止コドン（ＴＡＧ）及びポ！Ｉ （Ａ）付加
シグナル（Ａ、ＡＴ ＡＡ、Ａ ）が存在している。公
知のリンホトキシンｃＤＮＡ配列（Ｇｒａｙ。
ｐ、ｗ、ら（１９８４年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ
） 。
） 。
３１２巻、７２１頁）には第４図に示した４７８番目の
Ｃ，１９５９番１」のＣ，２０／１．４番目のＣ及び２
１８６１８６番目対応する塩基がいずれも欠失している
。また公知ｏ Ｊ） Ｎ Ａ配列の５′末端に存在して
いるＧＡＧＧＴＴＴＡ’Ｉ’の９塩基の配列はＬ’ｌ’
−に遺伝子の配列中には見い出されなかった。更に公知
のリンホトキシンポリペプチドの２６番目のアミノ酸に
対応するコドンがＡ ＯＯでり１ｈｒ （スレオニン）
をコードしているのに対し１．Ｔ、Ｔ−に遺伝子ではＡ
ＡＣでＡｓｎ （アスパラギン）をコードしていること
が判り、Ｌ’Ｊ’−に遺伝子がコードしているポリペブ
タイドが今までに児い出されたことのない新規リン小ト
キシンである事が明らかになつｔこ。
Ｃ，１９５９番１」のＣ，２０／１．４番目のＣ及び２
１８６１８６番目対応する塩基がいずれも欠失している
。また公知ｏ Ｊ） Ｎ Ａ配列の５′末端に存在して
いるＧＡＧＧＴＴＴＡ’Ｉ’の９塩基の配列はＬ’ｌ’
−に遺伝子の配列中には見い出されなかった。更に公知
のリンホトキシンポリペプチドの２６番目のアミノ酸に
対応するコドンがＡ ＯＯでり１ｈｒ （スレオニン）
をコードしているのに対し１．Ｔ、Ｔ−に遺伝子ではＡ
ＡＣでＡｓｎ （アスパラギン）をコードしていること
が判り、Ｌ’Ｊ’−に遺伝子がコードしているポリペブ
タイドが今までに児い出されたことのない新規リン小ト
キシンである事が明らかになつｔこ。
実施例４ 発現ベクターの作製
（ａ） ｐＳＶｅＳｍａ ＩＬＴの作製ＳＶ４０の初
期遺伝子プロモーター領域の配列とｒ、’ｒ−に染色体
ＤＮＡ配列とが接続した配列を持つプラスミドであるｐ
ｓＶｅｓｍａｌＬＴはｐＬＴＢ４．．２゜ｐｓＶ２ｇｐ
ｔ（ＡＴＯＧ！ ８７１４．５）及びｐｓｖｓｇｐｔ
。
期遺伝子プロモーター領域の配列とｒ、’ｒ−に染色体
ＤＮＡ配列とが接続した配列を持つプラスミドであるｐ
ｓＶｅｓｍａｌＬＴはｐＬＴＢ４．．２゜ｐｓＶ２ｇｐ
ｔ（ＡＴＯＧ！ ８７１４．５）及びｐｓｖｓｇｐｔ
。
（ＡＴＯＯ３７１４４）（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｒ，Ｏ，
とＢｅｒｇ 。
とＢｅｒｇ 。
］）、（１１，９８０年サイエンス、２０９巻、１４２
２頁）を出発材料として、第５図−（ａ）、 −（ｂ）
に示した手順により作製した。
２頁）を出発材料として、第５図−（ａ）、 −（ｂ）
に示した手順により作製した。
すなわちｐｓＶ３ｇｐｔをＨｉｎｄｌｌで切断し、最も
大きいＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ！Ｊガーセで環状化しｐ
Ｉ−１１を作製した。次にｐＨＪのＰｖｕ Ｈ部位を
５ａｌｌリンカ−を用いてＳ ａ １１部位に改め、ｐ
Ｈ１ｌを作製した。更にｐＩ−ＩＩのＨｉｎｃ１１部位
をＴ（ｉｎｄｌｌｌ−８ｍａｌアダプターを用いてＳｍ
ａ１部位を導入し、ｐＨ８ＶＬＴ を作製した。ｐＩ
（Ｓｍａｌ を５ａｌ（。
大きいＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ！Ｊガーセで環状化しｐ
Ｉ−１１を作製した。次にｐＨＪのＰｖｕ Ｈ部位を
５ａｌｌリンカ−を用いてＳ ａ １１部位に改め、ｐ
Ｈ１ｌを作製した。更にｐＩ−ＩＩのＨｉｎｃ１１部位
をＴ（ｉｎｄｌｌｌ−８ｍａｌアダプターを用いてＳｍ
ａ１部位を導入し、ｐＨ８ＶＬＴ を作製した。ｐＩ
（Ｓｍａｌ を５ａｌ（。
ＢＣｏＲＩ切断し、ｐｓＶ２ｇｐｔのＢａｍＩ月部位全
部位ｍＨＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼｌ （Ｋｌｅ
ｎｏｗ）で平滑末端にしＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼで環状化
して作製したｐｓＩを同じ（Ｓａｄ、 ｌ 、 Ｅｃｏ
Ｒ，ｌ切断し、アンピシリン耐性遺伝子を持っ］） Ｎ
Ａ断片と〒４ＤＮＡリガーセで結合させ、ｐｓＶｅｓ
ｍａ Ｉ をつくった。次にｐＬ’Ｊ’Ｂ ４．、２
をＳｍａｌで切断し、Ｔ、’Ｉ”−に遺伝子配列を持つ
］） Ｎ Ａ断片を得、これをＳｍａ ｌ切断したｐｓ
ＶｅｓｍａＪに導入し、ｐｓＶｅｓｍａｌＬＴを作製し
た。
部位ｍＨＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼｌ （Ｋｌｅ
ｎｏｗ）で平滑末端にしＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼで環状化
して作製したｐｓＩを同じ（Ｓａｄ、 ｌ 、 Ｅｃｏ
Ｒ，ｌ切断し、アンピシリン耐性遺伝子を持っ］） Ｎ
Ａ断片と〒４ＤＮＡリガーセで結合させ、ｐｓＶｅｓ
ｍａ Ｉ をつくった。次にｐＬ’Ｊ’Ｂ ４．、２
をＳｍａｌで切断し、Ｔ、’Ｉ”−に遺伝子配列を持つ
］） Ｎ Ａ断片を得、これをＳｍａ ｌ切断したｐｓ
ＶｅｓｍａＪに導入し、ｐｓＶｅｓｍａｌＬＴを作製し
た。
用いたＳａｌ ｌリンカ−とＳｍａｌアダプターは、そ
れぞれｄ（ｐＧＧ〒ＣＧＡＣＣ）及びｄ （ｐＡＧＯｌ
”Ｃ！０ＣＧＧＧ＞の配列を持つものを使用した。また
ＤＮＡ−ポリメラーゼＩはＫｌ ｅ ｎ ｏｗフラグメ
ントを用いた。
れぞれｄ（ｐＧＧ〒ＣＧＡＣＣ）及びｄ （ｐＡＧＯｌ
”Ｃ！０ＣＧＧＧ＞の配列を持つものを使用した。また
ＤＮＡ−ポリメラーゼＩはＫｌ ｅ ｎ ｏｗフラグメ
ントを用いた。
（ｂ） ｐＳＶｐＴＫＬ’ｌ”（７）作製ヘルペスシ
ンプレックスウィルスクイブ１のチミジンキナーゼのプ
ロモーター領域の配列とＬＴ−に遺伝子が接続した配列
を持つプラスミドであるｐｓＶｐＴＫＬＴは、ｐＬＴＢ
４．２． ｐＴ−ＩＳＶＩ−０６（ヘセスダリサーチ・
ラボラトリ−より入手）（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、 Ｓ、
Ｌ、とＧａｂｊ、ｓ、 Ｅ、 １％、 （１９８０年）
ヌクレイツク・アシラス・リサーチ、８４５９８１頁）
及びｐｓＶｅｓｍａｌを出発材料にして第６図に示した
方法により作製した。すなわちｐＬＴＢ ４．２に含ま
れるＬＴ遺伝子ＢａｍＨ１−Ｓｍａｌ断片をｐＩ（ＳＶ
１０６のＢｇｌｌ［−Ｓｍａ１部位に挿入しｐ ）ｉ
Ｓ Ｖ Ｌ Ｔを作製した。次にｐＨ８ＶＬＴからＴＫ
プロモーターのついたＬＴ−に遺伝子ＢａｍＨｌ−８ｍ
ａ Ｉ断片をｐｓＶｅｓｍａｉのＢａｍＩ（Ｉ−Ｓｍａ
■部位に導入しｐＳＶｐＴＫＬＴを作製した。
ンプレックスウィルスクイブ１のチミジンキナーゼのプ
ロモーター領域の配列とＬＴ−に遺伝子が接続した配列
を持つプラスミドであるｐｓＶｐＴＫＬＴは、ｐＬＴＢ
４．２． ｐＴ−ＩＳＶＩ−０６（ヘセスダリサーチ・
ラボラトリ−より入手）（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、 Ｓ、
Ｌ、とＧａｂｊ、ｓ、 Ｅ、 １％、 （１９８０年）
ヌクレイツク・アシラス・リサーチ、８４５９８１頁）
及びｐｓＶｅｓｍａｌを出発材料にして第６図に示した
方法により作製した。すなわちｐＬＴＢ ４．２に含ま
れるＬＴ遺伝子ＢａｍＨ１−Ｓｍａｌ断片をｐＩ（ＳＶ
１０６のＢｇｌｌ［−Ｓｍａ１部位に挿入しｐ ）ｉ
Ｓ Ｖ Ｌ Ｔを作製した。次にｐＨ８ＶＬＴからＴＫ
プロモーターのついたＬＴ−に遺伝子ＢａｍＨｌ−８ｍ
ａ Ｉ断片をｐｓＶｅｓｍａｉのＢａｍＩ（Ｉ−Ｓｍａ
■部位に導入しｐＳＶｐＴＫＬＴを作製した。
（Ｃ） Ｉ）ＳＶ２ＬＬ’ｌ”及びｐＨ８ＶＬＴの作
製またＳＶ４０の後期遺伝子プロモーター領域の配列と
ＬＴ−に遺伝子が接続した配列を持つプラスミドである
ｐＳＶ２ＬＬＴ及びｐＨＶＬＴはｐ、Ｔ、ＴＢ４．２
、ｐＳＶ２ｇｐｔ及びｐｓｖｓｇｐｔを出発材料にして
、第７図、第８図に示した方法により作製した。すなわ
ちｐＬＴＢ４．２に含まれるＬ’ｌ’−に遺伝子Ｓｍａ
ｌ ２．５ Ｋｂ断片をｐｓＶ２ｇｌｌ）ｔのＰｖｕ
■部位に結合させｐＳＶ２ＬＬＴを作製した。次にｐｓ
Ｖ２ＬＬＴをＢａｍＨｒで部分切断し、そこへｐｓＶ８
ｇｐｔの持つＴ抗原遺伝子ＥａｍＨＪ断片を結合させｐ
Ｓ Ｖ ８ Ｌ Ｌ Ｔ を作製した。
製またＳＶ４０の後期遺伝子プロモーター領域の配列と
ＬＴ−に遺伝子が接続した配列を持つプラスミドである
ｐＳＶ２ＬＬＴ及びｐＨＶＬＴはｐ、Ｔ、ＴＢ４．２
、ｐＳＶ２ｇｐｔ及びｐｓｖｓｇｐｔを出発材料にして
、第７図、第８図に示した方法により作製した。すなわ
ちｐＬＴＢ４．２に含まれるＬ’ｌ’−に遺伝子Ｓｍａ
ｌ ２．５ Ｋｂ断片をｐｓＶ２ｇｌｌ）ｔのＰｖｕ
■部位に結合させｐＳＶ２ＬＬＴを作製した。次にｐｓ
Ｖ２ＬＬＴをＢａｍＨｒで部分切断し、そこへｐｓＶ８
ｇｐｔの持つＴ抗原遺伝子ＥａｍＨＪ断片を結合させｐ
Ｓ Ｖ ８ Ｌ Ｌ Ｔ を作製した。
実施例５
ｐｓＶｅｓｍａｌＬＴ、 ｐｓＶｐ 「Ｊ’Ｔ（、Ｔ
、Ｔ、 ｐＳＶ２ＬＪ’、Ｔ及びｐｓ’１ＬＬＴの培
養細胞−＼の導入とＪ、’Ｊ’−にの産生形質発現ベク
ターｐｓＶｅｓｍａｆＴ、’Ｊ’、 ｐｓ’ＶｐＴＩ（
ＬＴ。
、Ｔ、 ｐＳＶ２ＬＪ’、Ｔ及びｐｓ’１ＬＬＴの培
養細胞−＼の導入とＪ、’Ｊ’−にの産生形質発現ベク
ターｐｓＶｅｓｍａｆＴ、’Ｊ’、 ｐｓ’ＶｐＴＩ（
ＬＴ。
ｐｓＶ２ＬＬＴ及び１）ＳＶ８ＬＬＴに含まれるＬ Ｔ
−に遺伝子の発現を調べる為に、種々の動物培養細胞へ
Ｗｉｇｌｅｒらの方法（Ｗｉ−ｇｌｅｒら（１９７７年
）セル。
−に遺伝子の発現を調べる為に、種々の動物培養細胞へ
Ｗｉｇｌｅｒらの方法（Ｗｉ−ｇｌｅｒら（１９７７年
）セル。
１１巻、２２８頁）に準じてプラスミドの導入を行った
。プラスミド−リン酸カルシウム共沈澱物を予め１０％
牛新生児血清を含むイーグルＭＥＭ培地で生育させた細
胞（２Ｘ１０５細胞／ ８ ｍｌ培地／直径６α培養皿
）に加え、１５時間後に培地を更新し、培養をつづけ４
８時間後の培地に含まれるＬＴ−Ｋを、Ｌ９２９細胞を
標的細胞とする細胞致死効果で測定した（ＩＬｕｆｆ、
Ｍ、 Ｒ，とＧｉｆｆｏｒｄ 。
。プラスミド−リン酸カルシウム共沈澱物を予め１０％
牛新生児血清を含むイーグルＭＥＭ培地で生育させた細
胞（２Ｘ１０５細胞／ ８ ｍｌ培地／直径６α培養皿
）に加え、１５時間後に培地を更新し、培養をつづけ４
８時間後の培地に含まれるＬＴ−Ｋを、Ｌ９２９細胞を
標的細胞とする細胞致死効果で測定した（ＩＬｕｆｆ、
Ｍ、 Ｒ，とＧｉｆｆｏｒｄ 。
Ｇ、Ｅ、（１９８１年）リンホカインズ、２巻、２３５
頁）。すなオつち９６穴マルチデイツシユに２×１０４
細胞／ｗｅｌｌ ／ Ｉ （１０） ｔｔ（ｊ培地で１
日培養後、培養液を除き、アクチノマイシンＤ １１
１Ｆ／／ｙｔｔ１、５％牛脂児血清を含むイーグルＭＥ
Ｍ培地で種々の濃度に希釈したサンプルを１（１０）μ
４加え、２０時間後の細胞の変性致死効果を測定した。
頁）。すなオつち９６穴マルチデイツシユに２×１０４
細胞／ｗｅｌｌ ／ Ｉ （１０） ｔｔ（ｊ培地で１
日培養後、培養液を除き、アクチノマイシンＤ １１
１Ｆ／／ｙｔｔ１、５％牛脂児血清を含むイーグルＭＥ
Ｍ培地で種々の濃度に希釈したサンプルを１（１０）μ
４加え、２０時間後の細胞の変性致死効果を測定した。
Ｌ’Ｉ’−に１ユニットは５０％の致死率を与える濃度
とした。
とした。
下表に示すようにｐｓＶｅｓｍａｌＬＴ、 ｐｓＶｐＴ
ＫＴ、Ｔ。
ＫＴ、Ｔ。
ｐ Ｓ Ｖ ２ Ｔ、ＬＴ或イハ、ｐｓＶ８ＬＬ’ｌ’
を導入シタ全テノ培養細胞でＬ’Ｊ”−にの発現がみ
られた。また全ての培養細胞でｐｓＶ２ＬＬＴ よりも
ｐｓＶ８ＬＬＴ（Ｄ発現が高かった。
を導入シタ全テノ培養細胞でＬ’Ｊ”−にの発現がみ
られた。また全ての培養細胞でｐｓＶ２ＬＬＴ よりも
ｐｓＶ８ＬＬＴ（Ｄ発現が高かった。
以下余白
実施例６
ＬＴ−にの通常培地及び無血清培地での生産実施例５で
ｐｓＶｅｓｍａＩＬＴ、ｐｓＶｐＴＫＬＴ或いはｐＳＶ
８ＬＬＴを導入したＢＨＫ−２１（Ｃ−１８）の培地を
１０％牛脂児血清（ＦＣ８）、２５μＩ／ ｍｌミコフ
ェノール酸、２５０μｇ ／ｍ／！キサンチンヲ含ムＭ
ＥＭ培地に更新し、ミコフェノール酸耐性株を分離しｔ
こ。ミコフェノール酸耐性株を２４穴マルチデイツシユ
の底面全面に生育させ、５％ＦＯ８を含むＭＨＭ培地と
ＦＣ８を全く含まないＭＥＭ培地で２４時間培養し、培
地中に含まれるＬＴ−に活性を測定した。下表に示すよ
うに、分離された細胞株は血清の有無にかかわらずＬＴ
−Ｋを生産した。
ｐｓＶｅｓｍａＩＬＴ、ｐｓＶｐＴＫＬＴ或いはｐＳＶ
８ＬＬＴを導入したＢＨＫ−２１（Ｃ−１８）の培地を
１０％牛脂児血清（ＦＣ８）、２５μＩ／ ｍｌミコフ
ェノール酸、２５０μｇ ／ｍ／！キサンチンヲ含ムＭ
ＥＭ培地に更新し、ミコフェノール酸耐性株を分離しｔ
こ。ミコフェノール酸耐性株を２４穴マルチデイツシユ
の底面全面に生育させ、５％ＦＯ８を含むＭＨＭ培地と
ＦＣ８を全く含まないＭＥＭ培地で２４時間培養し、培
地中に含まれるＬＴ−に活性を測定した。下表に示すよ
うに、分離された細胞株は血清の有無にかかわらずＬＴ
−Ｋを生産した。
以下余白
実施例７
新規リンホトキシンｃＤＮＡのクローニング実施例６に
記述したＢＩ−ＩＫ−２１（０−１３）（７）ｐｓＶｅ
ＳｍａｌＬＴ形質転換株の１っＪｌ−１から単コロニー
分離したＬ Ｔ −Ｋ高生産株Ｂ−１−１（約６，（１
０）０１−ニット／ｖｔｌ ／日のＬＴ−に生産能を有
する）を５％ＦＣ８を含むＭ ＪＣＭ培地で生付させ約
１０９の細胞を得た。細胞をリン酸緩衝液で洗浄後、１
０ｍＭハナジルーリホヌクレオシド コンプレックス。
記述したＢＩ−ＩＫ−２１（０−１３）（７）ｐｓＶｅ
ＳｍａｌＬＴ形質転換株の１っＪｌ−１から単コロニー
分離したＬ Ｔ −Ｋ高生産株Ｂ−１−１（約６，（１
０）０１−ニット／ｖｔｌ ／日のＬＴ−に生産能を有
する）を５％ＦＣ８を含むＭ ＪＣＭ培地で生付させ約
１０９の細胞を得た。細胞をリン酸緩衝液で洗浄後、１
０ｍＭハナジルーリホヌクレオシド コンプレックス。
０．１４Ｍ Ｎａ１１、 １．５７７２Ｍ Ｍ７
０１２． １（１７７２ＭＴｒｉ、ｓ −ＨＣｌ （ｐ
、Ｔ（８，０）、 ０．５％ＮＰ−４０（溶解緩衝液）
を２０ｙｔｔｉ加え、溶解させた。２４％蔗糖を含む溶
解緩衝液に重層し、４°Ｃ，１０，０ＯＯｙで２０分遠
心した。上層（細胞質層）を回収し、０．２Ｍ Ｔｒ
ｉＳ−ＩＴＣｌ （ｐＨ７，５）、 ２５ ｎｌＭＥ
ＤＴＡ、０．８Ｍ Ｎａ１１、２％ドデシル硫酸ナト
リウムを等量、加え、プロテアーゼに処理をした。
０１２． １（１７７２ＭＴｒｉ、ｓ −ＨＣｌ （ｐ
、Ｔ（８，０）、 ０．５％ＮＰ−４０（溶解緩衝液）
を２０ｙｔｔｉ加え、溶解させた。２４％蔗糖を含む溶
解緩衝液に重層し、４°Ｃ，１０，０ＯＯｙで２０分遠
心した。上層（細胞質層）を回収し、０．２Ｍ Ｔｒ
ｉＳ−ＩＴＣｌ （ｐＨ７，５）、 ２５ ｎｌＭＥ
ＤＴＡ、０．８Ｍ Ｎａ１１、２％ドデシル硫酸ナト
リウムを等量、加え、プロテアーゼに処理をした。
フェノール−クロロホルム抽出を３回行い、エタノール
沈澱にてＩ（、Ｎ Ａ約１０〜を得た。次に、オリゴ（
ｄＴ）−セルロースカラムクロマトグラフィー（Ａｖｉ
ｖ、 Ｉ−ＴとＬｅａｅｒ、 Ｐ （１９７２年）、プ
ロシーテイングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカテミー
・オフ・ザイエンス・Ｕ Ｓ Ａ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ。
沈澱にてＩ（、Ｎ Ａ約１０〜を得た。次に、オリゴ（
ｄＴ）−セルロースカラムクロマトグラフィー（Ａｖｉ
ｖ、 Ｉ−ＴとＬｅａｅｒ、 Ｐ （１９７２年）、プ
ロシーテイングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカテミー
・オフ・ザイエンス・Ｕ Ｓ Ａ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ。
Ａｃａｃｉ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、 ６９巻、１４０８
頁）により、ポリ（Ａ、）” ＲＮ Ａを８０１ｉ調製
した。ＬＴｃＤＮＡのクローニングは、オカヤマーベル
グ法（Ｏｋａｙａｍａ、比と１３ｅｒｇ、 Ｐ、 （１
９８２年）モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロ
ジー（Ｍｏｌ。
頁）により、ポリ（Ａ、）” ＲＮ Ａを８０１ｉ調製
した。ＬＴｃＤＮＡのクローニングは、オカヤマーベル
グ法（Ｏｋａｙａｍａ、比と１３ｅｒｇ、 Ｐ、 （１
９８２年）モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロ
ジー（Ｍｏｌ。
Ｃｅ１１． Ｂｉｏ１、 ） 、 ２巻、１６１頁）で
行った。プラスミドｐｓＶ７１８６山来のオリゴｄ （
Ｔ）付加したベクター−プライマー（ファルマシア社製
）とポリ（Ａ） Ｉ（ＮＡを混合、アニーリング後、リ
バーストランスクリプターゼによりｃＤＮＡを合成した
。次に、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トラン
スフエラーセでｃ ｉＤ Ｎ Ａの３′端にオリゴｄ（
Ｃ）を付加し、次に制限酵素ＪＴｊ−ｎｄｌｌｌでプラ
スミド−ｃＤＮＡ複合体を切断した。次にプラスミドｐ
ｓＶ１９８２由来のオリゴｄ（’］”）を付加した。Ｈ
ｉｎｄ■リンカ−（ファルマシア社製）とアニーリング
し、大腸菌ＤＮＡリガーゼにより環状化（ッた。次にＲ
ＮＡ−鎖を大腸菌Ｒ，Ｎ ａ ｓ ｅ Ｉ丁と］） Ｎ
ＡポリメラーゼＩ及び大腸菌ｒ）ＮＡ！Ｊガーセによ
りＤ Ｎ Ａ鎖に変換し、大腸菌Ｊ−，ＩＴ３１．０１
（Ａ、ＴＣｏ ３８６９４）を形質転換した。形質転
換株約２８，（１０）０株を得た。
行った。プラスミドｐｓＶ７１８６山来のオリゴｄ （
Ｔ）付加したベクター−プライマー（ファルマシア社製
）とポリ（Ａ） Ｉ（ＮＡを混合、アニーリング後、リ
バーストランスクリプターゼによりｃＤＮＡを合成した
。次に、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トラン
スフエラーセでｃ ｉＤ Ｎ Ａの３′端にオリゴｄ（
Ｃ）を付加し、次に制限酵素ＪＴｊ−ｎｄｌｌｌでプラ
スミド−ｃＤＮＡ複合体を切断した。次にプラスミドｐ
ｓＶ１９８２由来のオリゴｄ（’］”）を付加した。Ｈ
ｉｎｄ■リンカ−（ファルマシア社製）とアニーリング
し、大腸菌ＤＮＡリガーゼにより環状化（ッた。次にＲ
ＮＡ−鎖を大腸菌Ｒ，Ｎ ａ ｓ ｅ Ｉ丁と］） Ｎ
ＡポリメラーゼＩ及び大腸菌ｒ）ＮＡ！Ｊガーセによ
りＤ Ｎ Ａ鎖に変換し、大腸菌Ｊ−，ＩＴ３１．０１
（Ａ、ＴＣｏ ３８６９４）を形質転換した。形質転
換株約２８，（１０）０株を得た。
プラスミドルＬ甲１３４２に含まれるＢａｍ１−Ｉ）−
ＥｃｏＲ１約１．４Ｋｂフラグメントをプローブとして
コロニーハイブリダイゼーションを行ったところ、プロ
ーブとハイブリタイズする７株のクローンを得た。
ＥｃｏＲ１約１．４Ｋｂフラグメントをプローブとして
コロニーハイブリダイゼーションを行ったところ、プロ
ーブとハイブリタイズする７株のクローンを得た。
このうちの−株はＬＴ−にのｃＤＮＡに相当するＳｍａ
、ｌ −ＥｃｏＲＩ ８（１０） ｂｐのフラグメン
トを有していたので、このフラグメントをｐＵＣ９のＳ
ｍａ−Ｅｃｏ 部位に挿入し、プラスミドｐＬＴｃｓＢ
を作製した。ｐ Ｌ Ｔ ｃ Ｓ Ｈの構造を第９図に
示した。
、ｌ −ＥｃｏＲＩ ８（１０） ｂｐのフラグメン
トを有していたので、このフラグメントをｐＵＣ９のＳ
ｍａ−Ｅｃｏ 部位に挿入し、プラスミドｐＬＴｃｓＢ
を作製した。ｐ Ｌ Ｔ ｃ Ｓ Ｈの構造を第９図に
示した。
実施例８
ｐｓＶｅｓｍａ（ｃＬＴの作製
ＳＶ４０の初期遺伝子プロモーター領域の配列とＬ’Ｊ
’−にのＣＤＮＡ配列とが接続した配列を持つプラスミ
ドｐｓＶｅｓｍａ １ｃＬＴはｐｓＶｅｓｍａｌＬＴと
ｐＬＴｃｓＥを出発材料として第１０図に示した手順に
より作製した。すなわち１）ＴＪＴＯ８Ｅに含まれるＢ
ａｍＨＩ−Ｂａｌ−１約７５０ ｂｐ断片をｐｓＶｅｓ
ｍａ ｌ ＬＴのＢａｍＨＩ −１３ａｌ Ｉ部位に結
合し、ｐｓＶｅｓｍａｌｃＬＴを作製した。
’−にのＣＤＮＡ配列とが接続した配列を持つプラスミ
ドｐｓＶｅｓｍａ １ｃＬＴはｐｓＶｅｓｍａｌＬＴと
ｐＬＴｃｓＥを出発材料として第１０図に示した手順に
より作製した。すなわち１）ＴＪＴＯ８Ｅに含まれるＢ
ａｍＨＩ−Ｂａｌ−１約７５０ ｂｐ断片をｐｓＶｅｓ
ｍａ ｌ ＬＴのＢａｍＨＩ −１３ａｌ Ｉ部位に結
合し、ｐｓＶｅｓｍａｌｃＬＴを作製した。
実施例９
ｐｓＶｅｓｍａｌｃＬＴの培養細胞への導入とＬＴ−に
生産 実施例５と同様にｐｓＶｅｓｍａｌｃＬＴを０ＨＯ−Ｋ
ｌ。
生産 実施例５と同様にｐｓＶｅｓｍａｌｃＬＴを０ＨＯ−Ｋ
ｌ。
ＢＩ（Ｋ−２１（Ｃ−１３）に導入し、ＬＴの一過性の
発現を測定した。その結果、いずれの細胞でもＩ’Ｔの
発現（２〜４ユニツｈ／ｍｅ）が認められた７、また導
入後、ミコフェノール酸耐性株を分離したところ、６４
ユニツ１〜／ ｍｌ ７日のＬＴ−に生産を示すＢＨＫ
−２１（Ｃ！−１８）の形質転換株が得られた。
発現を測定した。その結果、いずれの細胞でもＩ’Ｔの
発現（２〜４ユニツｈ／ｍｅ）が認められた７、また導
入後、ミコフェノール酸耐性株を分離したところ、６４
ユニツ１〜／ ｍｌ ７日のＬＴ−に生産を示すＢＨＫ
−２１（Ｃ！−１８）の形質転換株が得られた。
実施例１０
ｐＴＡＣ！ｃＬＴ１７１．ｐＴＡ、ｏｃＬＴ１４８の作
製と大腸菌での発現 発現プラスミドｐ ’、１．’ Ａ Ｏｃ ＬＴ ］
７１ は、Ｌ’［ｌ’−にのＣＤＮＡ配列を有するプラ
スミドｐＬＴｃｓＥ。
製と大腸菌での発現 発現プラスミドｐ ’、１．’ Ａ Ｏｃ ＬＴ ］
７１ は、Ｌ’［ｌ’−にのＣＤＮＡ配列を有するプラ
スミドｐＬＴｃｓＥ。
ｐＫ、に２２８−８ （ファルマシア社から入手）及
びＬ’Ｉ”−にのｃＤＮＡの一部を含む合成ＤＮＡから
第１１図に示した手順により作製した。すなわちｐＬＴ
ｃｓＥをＢａｎ ｌ切断、Ｓ１ヌクレアーゼ処理し、第
１１図に示した５′末端をリン酸化した合成ＤＮＡクリ
ンカを接続後、ＥＣ０ＲＩ切断によって生じる約０．７
Ｋｂ断片をアガロースゲル電気泳動により回収し、ｐＫ
Ｋ２２８−８のＥｃｏＲｌ 部位に挿入し、大腸菌ＪＭ
１０５（ファルマシア社より入手）を形質転換した。
びＬ’Ｉ”−にのｃＤＮＡの一部を含む合成ＤＮＡから
第１１図に示した手順により作製した。すなわちｐＬＴ
ｃｓＥをＢａｎ ｌ切断、Ｓ１ヌクレアーゼ処理し、第
１１図に示した５′末端をリン酸化した合成ＤＮＡクリ
ンカを接続後、ＥＣ０ＲＩ切断によって生じる約０．７
Ｋｂ断片をアガロースゲル電気泳動により回収し、ｐＫ
Ｋ２２８−８のＥｃｏＲｌ 部位に挿入し、大腸菌ＪＭ
１０５（ファルマシア社より入手）を形質転換した。
ｐＴＡＣｃＬＴ１７１ を持つ大腸菌ＪＭ１０５の６株
を５０ ｔｔｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地１０
ｍ１でＡ ５５０が０．７になるまで培養し、イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトシドを終濃度０．４ｍＭに
なるように加え、更に６時間培養した。集菌、洗浄後、
２回凍結融解を行い、１ｍｌのリン酸緩衝液を加え、超
音波処理を行い細胞を破砕し、遠心により菌体抽出液を
得た。実施例５に記載の方法で菌体抽出液に含まれるＬ
Ｔ−に活性を測定した結果、最高約１６，（１０）０ユ
＝ツト／ ｍｌのＬＴ−に活性が得られた。
を５０ ｔｔｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地１０
ｍ１でＡ ５５０が０．７になるまで培養し、イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトシドを終濃度０．４ｍＭに
なるように加え、更に６時間培養した。集菌、洗浄後、
２回凍結融解を行い、１ｍｌのリン酸緩衝液を加え、超
音波処理を行い細胞を破砕し、遠心により菌体抽出液を
得た。実施例５に記載の方法で菌体抽出液に含まれるＬ
Ｔ−に活性を測定した結果、最高約１６，（１０）０ユ
＝ツト／ ｍｌのＬＴ−に活性が得られた。
発現プラスミドｐＴＡｃｃＴ、Ｔ １４８はｐＴＡＯｃ
Ｌ’［’１７１と同様にプラスミドｐＬＴｃＳＥ、 ｐ
Ｋ、に２２８−８及び合成ＤＮＡから第１２図に示した
手順により作製した。すなわちｐＬＴｃＳＥに含まれる
ＥｂｖＪ−Ｐｓｔ ｌ約８（１０） ｂｐ断片及びＰＳ
ｔｌ−ＥｃｏＲ１約８（１０）ｂｐ断片をアクリルアミ
ドゲル電気泳動により回収し、両者をＴ４１）ＮＡ！Ｊ
ガーゼで連結後、ＥｃｏＲＩで切断し、ＢｂｖＪ−Ｅｃ
ｏＲＪ約６（１０）ｂｐ断片を得た。この断片と第１２
図に示した合成ＤＮＡ−断片をプラスミドｐ Ｋ Ｋ
２２８−３のＥＣｏＲｌ部位に挿入し、発現ベクターｐ
ＴＡＯｃＬＴ１４８を作製した。
Ｌ’［’１７１と同様にプラスミドｐＬＴｃＳＥ、 ｐ
Ｋ、に２２８−８及び合成ＤＮＡから第１２図に示した
手順により作製した。すなわちｐＬＴｃＳＥに含まれる
ＥｂｖＪ−Ｐｓｔ ｌ約８（１０） ｂｐ断片及びＰＳ
ｔｌ−ＥｃｏＲ１約８（１０）ｂｐ断片をアクリルアミ
ドゲル電気泳動により回収し、両者をＴ４１）ＮＡ！Ｊ
ガーゼで連結後、ＥｃｏＲＩで切断し、ＢｂｖＪ−Ｅｃ
ｏＲＪ約６（１０）ｂｐ断片を得た。この断片と第１２
図に示した合成ＤＮＡ−断片をプラスミドｐ Ｋ Ｋ
２２８−３のＥＣｏＲｌ部位に挿入し、発現ベクターｐ
ＴＡＯｃＬＴ１４８を作製した。
ｐＴＡ、ｃｃＬＴ１、４．８を持つ大腸菌Ｊ Ｍ １０
５からは最高約ｓ、ｏｏｏユニット／肩ｔのＬ ｉＩ’
−に活性を持つ菌体抽出液が得られた。
５からは最高約ｓ、ｏｏｏユニット／肩ｔのＬ ｉＩ’
−に活性を持つ菌体抽出液が得られた。
実施例１１
ＬＴ−にの精製
実施例７に記載したＬ Ｔ−に生産株１ｕ−１−１を５
％ＦＯ８を含むＭＥＭ培地で培養した。培養液７０肩ｌ
を５ｍＭ’）ン酸緩衝液で透析後、ＤＥＡＥ−セルロー
スカラム（２Ｘ１０（７））に吸着させ、０〜０．３Ｍ
Ｎａ１ｌの濃度勾配で溶出させた。溶出した活性画
分をレンチル・レクチン・セファロース４Ｂカラム（０
，７Ｘ１０α）に吸着させ、０．１Ｍ α−メチルマン
ノシドで溶出させた。収率は２０％であった。
％ＦＯ８を含むＭＥＭ培地で培養した。培養液７０肩ｌ
を５ｍＭ’）ン酸緩衝液で透析後、ＤＥＡＥ−セルロー
スカラム（２Ｘ１０（７））に吸着させ、０〜０．３Ｍ
Ｎａ１ｌの濃度勾配で溶出させた。溶出した活性画
分をレンチル・レクチン・セファロース４Ｂカラム（０
，７Ｘ１０α）に吸着させ、０．１Ｍ α−メチルマン
ノシドで溶出させた。収率は２０％であった。
Ｅ−１−１株の生産したＬｌ−には、レンチル・レクチ
ン・セファロースに吸着されたことから、糖鎖を有して
いると推定された。またＬＴ−には、ヒト・インターフ
ェロン−γ（組み換えＤＮＡ技術によりＣＨＣｌ−Ｋ１
細胞によって生産されたもの）と相乗的ニヒト癌細胞Ｃ
Ｂ’Ｐ−２０（ＡＴＯＯ、Ｔ（’Ｉ’Ｅ１９）、ＭＥ−
１８０（ＡＴＯＯＨＴＢ８８））に対し致死効果を持つ
ことが判った。
ン・セファロースに吸着されたことから、糖鎖を有して
いると推定された。またＬＴ−には、ヒト・インターフ
ェロン−γ（組み換えＤＮＡ技術によりＣＨＣｌ−Ｋ１
細胞によって生産されたもの）と相乗的ニヒト癌細胞Ｃ
Ｂ’Ｐ−２０（ＡＴＯＯ、Ｔ（’Ｉ’Ｅ１９）、ＭＥ−
１８０（ＡＴＯＯＨＴＢ８８））に対し致死効果を持つ
ことが判った。
第１図は新規リンホトキシンをコードする染色体ＤＮＡ
の塩基配列及び配列から推定される新規リンホトキシン
ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。第２図はＬ’Ｉ’
−に遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片をクローニングした
組み換えファージＤＮＡを示す模式図、第３図はプラス
ミドｐＬＴＢ４．２を示す模式図、第４図はプラスミド
ｐＬＴＦｉ２．３を示す模式図、第５図−（ａ）はプラ
スミドｐｓＶｅｓｍａ１作製の模式図、第５図−（ｂ）
はプラスミドｐＳＶｅＳｍａｌＬＴ作製の模式図、第６
図はプラスミドｐｓＶｐＴＫＬＴ作製の模式図、第７図
はプラスミドｐｓＶ２ＬＬＴ作製の模式図、第８図はプ
ラスミドｐｓＶ８ＬＬＴ作製の模式図、第９図はプラス
ミドｐＬＴｃｓＥを示す模式図、ｉｌＯ図はシラスミド
ｐｓＶｅｓｍａｌｃＬＴ作製の模式図、第１１図はプラ
スミドｐＴＡＯｃＬＴ１７１作製の模式図、第１２図は
プラスミドｐ ＴＡ、０ｃＬＴ １４８作製の模式図で
ある。 第２図中、Ｅは制限酵素１（ｃｏＲＩの認識部位を、Ｂ
は制限酵素ＢａｍＪＩｌの認識部位を示す。第３〜第１
２図中、Ｓｍａ１、 Ａｖａ１、 Ｂａｍ１（１，Ａｃ
ｃｌ。 ５ｃａ１． ＥｃｏＲ１、 ５ａａ１． ｌｌ１ｎｃｌ
ｌｌ［、Ｐｖｕｌ１、 ５ａ１１、 Ｂｇｌ１、 Ａｐ
ａ１、 Ｐｓｔ１、 Ｘｈｏ１、Ｂａ１１． ＢａｎＨ
及びＥｂｖ ｌは夫々の制限酵素の認識部位を示す。 ＬＴ−Ｎは新規リンホトキシン遺伝子、ｐＵＯ９はベク
タープラスミドｐＵ０９山来の領域、Ａｍｐｒはアンピ
シリン耐性遺伝子、ｕｃｏｇｐｔ は大腸菌のグアニ
ン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＳＶｅ
はＳＶ４０ウィルスの初期遺伝子プロモーター領域、Ｔ
−ａｇはＳＶ４０のＴ−抗原遺伝子、ｐＴＫはチミジン
キナーゼのプロモーター領域、ＴＫはチミジンキナーゼ
遺伝子、（Ｐｖｕｌ／Ｓｍａｌ）は制限酵素Ｐｖｕｌ切
断部位・とＳｍａ ｌ切断部位を結合したもの、ｐ ｔ
ａｃはｔａｃプロモーター、’Ｊ’ｅｔｒはテトラサイ
クリン耐性遺伝子を示す。
の塩基配列及び配列から推定される新規リンホトキシン
ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。第２図はＬ’Ｉ’
−に遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片をクローニングした
組み換えファージＤＮＡを示す模式図、第３図はプラス
ミドｐＬＴＢ４．２を示す模式図、第４図はプラスミド
ｐＬＴＦｉ２．３を示す模式図、第５図−（ａ）はプラ
スミドｐｓＶｅｓｍａ１作製の模式図、第５図−（ｂ）
はプラスミドｐＳＶｅＳｍａｌＬＴ作製の模式図、第６
図はプラスミドｐｓＶｐＴＫＬＴ作製の模式図、第７図
はプラスミドｐｓＶ２ＬＬＴ作製の模式図、第８図はプ
ラスミドｐｓＶ８ＬＬＴ作製の模式図、第９図はプラス
ミドｐＬＴｃｓＥを示す模式図、ｉｌＯ図はシラスミド
ｐｓＶｅｓｍａｌｃＬＴ作製の模式図、第１１図はプラ
スミドｐＴＡＯｃＬＴ１７１作製の模式図、第１２図は
プラスミドｐ ＴＡ、０ｃＬＴ １４８作製の模式図で
ある。 第２図中、Ｅは制限酵素１（ｃｏＲＩの認識部位を、Ｂ
は制限酵素ＢａｍＪＩｌの認識部位を示す。第３〜第１
２図中、Ｓｍａ１、 Ａｖａ１、 Ｂａｍ１（１，Ａｃ
ｃｌ。 ５ｃａ１． ＥｃｏＲ１、 ５ａａ１． ｌｌ１ｎｃｌ
ｌｌ［、Ｐｖｕｌ１、 ５ａ１１、 Ｂｇｌ１、 Ａｐ
ａ１、 Ｐｓｔ１、 Ｘｈｏ１、Ｂａ１１． ＢａｎＨ
及びＥｂｖ ｌは夫々の制限酵素の認識部位を示す。 ＬＴ−Ｎは新規リンホトキシン遺伝子、ｐＵＯ９はベク
タープラスミドｐＵ０９山来の領域、Ａｍｐｒはアンピ
シリン耐性遺伝子、ｕｃｏｇｐｔ は大腸菌のグアニ
ン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＳＶｅ
はＳＶ４０ウィルスの初期遺伝子プロモーター領域、Ｔ
−ａｇはＳＶ４０のＴ−抗原遺伝子、ｐＴＫはチミジン
キナーゼのプロモーター領域、ＴＫはチミジンキナーゼ
遺伝子、（Ｐｖｕｌ／Ｓｍａｌ）は制限酵素Ｐｖｕｌ切
断部位・とＳｍａ ｌ切断部位を結合したもの、ｐ ｔ
ａｃはｔａｃプロモーター、’Ｊ’ｅｔｒはテトラサイ
クリン耐性遺伝子を示す。
Claims (31)
- （１）一般式 【遺伝子配列があります】 （但し、Ｘは【遺伝子配列があります】 、Ｍｅｔ又はＨを示す。Ｙは糖鎖又はＨを示す。）で表
わされる抗腫瘍物質。 - （２）一般式 【遺伝子配列があります】 （但し、Ｘは【遺伝子配列があります】、 Ｍｅｔ又はＨを示す。） で表わされるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含
むＤＮＡ配列。 - （３）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、正常ヒ
ト細胞の染色体ＤＮＡ配列である特許請求の範囲第２項
記載のＤＮＡ配列。 - （４）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、【遺伝
子配列があります】 である特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列。 - （５）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、ｃＤＮ
Ａ配列である特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列。 - （６）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、合成Ｄ
ＮＡ配列である特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列
。 - （７）一般式 【遺伝子配列があります】 （但し、Ｘは【遺伝子配列があります】、又はＨを示す
。）で表わされるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
を含むＤＮＡ配列と動物培養細胞で機能するプロモータ
ー配列からなる発現ベクター。 - （８）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、正常ヒ
ト細胞の染色体ＤＮＡ配列である特許請求の範囲第７項
記載の発現ベクター。 - （９）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、ｃＤＮ
Ａ配列である特許請求の範囲第７項記載の発現ベクター
。 - （１０）動物培養細胞で機能するプロモーター配列が、
ＳＶ４０の初期遺伝子、単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ
− I ）のチミジンキナーゼ遺伝子或いはＳＶ４０の後
期遺伝子のプロモーター配列である特許請求の範囲第７
項乃至第９項の何れかの項記載の発現ベクター。 - （１１）動物培養細胞での選択マーカー遺伝子が同一Ｄ
ＮＡ配列上に存在する特許請求の範囲第７項乃至第１０
項の何れかの項記載の発現ベクター。 - （１２）動物培養細胞での選択マーカー遺伝子が、Ｅｃ
ｏｇｐｔ、Ｎｅｏあるいはｄｈｆｒの何れかである特許
請求の範囲第１１項記載の発現ベクター。 - （１３）発現ベクターが、プラスミドｐＳＶｅＳｍａ
I ＬＴ、ｐＳＶｐＴＫＬＴ、ｐＳＶ２ＬＬＴ、ｐＳＶ３
ＬＬＴ或いはｐＳＶｅＳｍａ I ｃＬＴである特許請求
の範囲第７項乃至第１２項の何れかの項記載の発現ベク
ター。 - （１４）一般式 【遺伝子配列があります】 （但し、Ｘは【遺伝子配列があります】、又はＨを示す
。）で表わされるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
を含むＤＮＡ配列と動物培養細胞で機能するプロモータ
ー配列からなる発現ベクターによつて形質転換された動
物培養細胞。 - （１５）細胞の由来が脊椎動物である特許請求の範囲第
１４項記載の動物培養細胞。 - （１６）細胞の由来が哺乳類動物である特許請求の範囲
第１４項記載の動物培養細胞。 - （１７）細胞の由来がヒトである特許請求の範囲第１４
項記載の動物培養細胞。 - （１８）細胞がＳＶ４０で形質転換された細胞である特
許請求の範囲第１４項乃至第１７項の何れかの項記載の
動物培養細胞。 - （１９）細胞がＣＨＯ−Ｋ１、Ｖｅｒｏ、ＷＩ−２６Ｖ
Ａ４、ＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）或いはＬ９２９である
特許請求の範囲第１４項記載の動物培養細胞。 - （２０）一般式 【遺伝子配列があります】 （但し、Ｘは【遺伝子配列があります】、又はＨを示す
。）で表わされるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
を含むＤＮＡ配列と動物培養細胞で機能するプロモータ
ー配列からなる発現ベクターによつて形質転換された動
物培養細胞を培養して、抗腫瘍物質を生成せしめ、これ
を採取することを特徴とする抗腫瘍物質の製造方法。 - （２１）動物培養細胞を培養液中で培養し、培養液から
抗腫瘍物質を回収する特許請求の範囲第２０項記載の製
造方法。 - （２２）培養液が無血清培養液である特許請求の範囲第
２１項記載の製造方法。 - （２３）一般式 【遺伝子配列があります】 （但し、Ｘは【遺伝子配列があります】、 Ｍｅｔ又はＨを示す。） で表わされるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含
むＤＮＡ配列と微生物で機能するプロモーター配列から
なる発現ベクター。 - （２４）ポリペプチドをコードする配列が、ｃＤＮＡ配
列である特許請求の範囲第２３項記載の発現ベクター。 - （２５）微生物で機能するプロモーター配列が、ｔａｃ
プロモーター配列である特許請求の範囲第２３項または
第２４項記載の発現ベクター。 - （２６）発現ベクターがプラスミドｐＴＡＣｃＬＴ１７
１或いはｐＴＡＣｃＬＴ１４８である特許請求の範囲第
２３項乃至第２５項の何れかの項記載の発現ベクター。 - （２７）一般式 【遺伝子配列があります】 （但し、Ｘは【遺伝子配列があります】、 Ｍｅｔ又はＨを示す。） で表わされるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含
むＤＮＡ配列と微生物で機能するプロモーター配列から
なる発現ベクタープラスミドとを有する微生物を培養し
て抗腫瘍物質を生成せしめ、これを採取することを特徴
とする抗腫瘍物質の製造方法。 - （２８）微生物を培養液中で培養し、微生物を集め、そ
の微生物から抗腫瘍物質を回収する特許請求の範囲第２
７項記載の製造方法。 - （２９）微生物がバクテリアである特許請求の範囲第２
７項または第２８項記載の製造方法。 - （３０）微生物が大腸菌である特許請求の範囲第２７項
または第２８項記載の製造方法。 - （３１）微生物が酵母である特許請求の範囲第２７項ま
たは第２８項記載の製造方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60230744A JPS62111928A (ja) | 1985-10-15 | 1985-10-15 | 新規リンホトキシン |
| AU59453/86A AU603768B2 (en) | 1985-07-04 | 1986-07-01 | Lymphotoxin dna, lymphotoxin expression vector, lymphotoxin resistant cell, transformant with lymphotoxin expression vector and process for preparing lymphotoxin |
| CA000512923A CA1302921C (en) | 1985-07-04 | 1986-07-02 | Lymphotoxin dna, lymphotoxin expression vector, lymphotoxin resistant cell, transformant with lymphotoxin expression vector and process for preparing lymphotoxin |
| DE8686109069T DE3686909T2 (de) | 1985-07-04 | 1986-07-03 | Lymphotoxin-dns, lymphotoxin-expressionsvektor, lymphotoxin-expressionsvektor enthaltender transformant und verfahren zur herstellung von lymphotoxin. |
| EP86109069A EP0207518B1 (en) | 1985-07-04 | 1986-07-03 | Lymphotoxin dna, lymphotoxin expression vector, transformant with lymphotoxin expression vector and process for preparing lymphotoxin |
| US06/882,109 US4988624A (en) | 1985-07-04 | 1986-07-03 | Lymphotoxin DNA, lymphotoxin expression vector |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60230744A JPS62111928A (ja) | 1985-10-15 | 1985-10-15 | 新規リンホトキシン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62111928A true JPS62111928A (ja) | 1987-05-22 |
Family
ID=16912612
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60230744A Pending JPS62111928A (ja) | 1985-07-04 | 1985-10-15 | 新規リンホトキシン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62111928A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62151182A (ja) * | 1985-12-24 | 1987-07-06 | Denki Kagaku Kogyo Kk | 遺伝子及びその製造方法 |
| JPS646298A (en) * | 1987-06-27 | 1989-01-10 | Denki Kagaku Kogyo Kk | Novel physiologically active polypeptide |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6156197A (ja) * | 1984-05-31 | 1986-03-20 | ジエネンテク，インコ−ポレイテツド | リンホトキシンの細胞溶解活性を中和する抗体 |
-
1985
- 1985-10-15 JP JP60230744A patent/JPS62111928A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6156197A (ja) * | 1984-05-31 | 1986-03-20 | ジエネンテク，インコ−ポレイテツド | リンホトキシンの細胞溶解活性を中和する抗体 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62151182A (ja) * | 1985-12-24 | 1987-07-06 | Denki Kagaku Kogyo Kk | 遺伝子及びその製造方法 |
| JPS646298A (en) * | 1987-06-27 | 1989-01-10 | Denki Kagaku Kogyo Kk | Novel physiologically active polypeptide |
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