JPH0638749B2 - ヒトアンギオゲニン（脈管形成因子）のためのｃｄｎａ及び遺伝子及び発現方法 - Google Patents
ヒトアンギオゲニン（脈管形成因子）のためのｃｄｎａ及び遺伝子及び発現方法Info
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- JPH0638749B2 JPH0638749B2 JP50244786A JP50244786A JPH0638749B2 JP H0638749 B2 JPH0638749 B2 JP H0638749B2 JP 50244786 A JP50244786 A JP 50244786A JP 50244786 A JP50244786 A JP 50244786A JP H0638749 B2 JPH0638749 B2 JP H0638749B2
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
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- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は組換えＤＮＡ技術によるタンパク質製造に関す
る。より詳しくは、本発明は脈管形成活性を有するタン
パク質をコード化するＤＮＡ配列及びそれらの配列を発
現する方法に関する。
る。より詳しくは、本発明は脈管形成活性を有するタン
パク質をコード化するＤＮＡ配列及びそれらの配列を発
現する方法に関する。
背景技術 脈管形成、血管網目の発達過程は固体腫瘍の増殖に必須
であり、且つ正常の傷治瘉及び増殖過程の一成分であ
る。それは又アテローム発生、関節炎及び糖尿病性網膜
症の病態生理学においても関係してきた。それは新たな
毛細血管の特定の刺戟に向けての方向付けられた増殖に
より特徴付けられる。この内皮細胞の移動により媒介さ
れる増殖は内皮細胞有糸分裂とは独立に進行することが
ある。
であり、且つ正常の傷治瘉及び増殖過程の一成分であ
る。それは又アテローム発生、関節炎及び糖尿病性網膜
症の病態生理学においても関係してきた。それは新たな
毛細血管の特定の刺戟に向けての方向付けられた増殖に
より特徴付けられる。この内皮細胞の移動により媒介さ
れる増殖は内皮細胞有糸分裂とは独立に進行することが
ある。
脈管形成の過程に対する原因となる分子メツセンジヤー
が長く探索されてきた。グリーンブラツト及びシユビツ
ク（Greenblatt and Shubik）は（Ｊ．Natl.Cancer Ins
t.４１：１１１−１２４、１９６８）、腫瘍−誘発新血
管形成は核酸性物質により媒介されていると結論した。
引続き、各種の可溶性媒介物質が新血管形成の誘発に係
わつてきた。これらには、プロスタグランジン類〔アウ
エルバツハ（Auerbach）、Pick and Landy編「リンホカ
イン類（Lymphokines）」、６９−８８、Academic Pres
s,New York１９８１〕、ヒトウロキナーゼ〔ベルマン等
（Berman et al.）、Invest Opthalm.Vis.Sci.２２：１
９１−１９９、１９８２〕、銅〔ラジユ等（Raju et a
l.）、Ｊ．Natl.Cancer Inst.６９：１１８３−１１８
８、１９８２〕及び各種「脈管形成因子」が含まれる。
が長く探索されてきた。グリーンブラツト及びシユビツ
ク（Greenblatt and Shubik）は（Ｊ．Natl.Cancer Ins
t.４１：１１１−１２４、１９６８）、腫瘍−誘発新血
管形成は核酸性物質により媒介されていると結論した。
引続き、各種の可溶性媒介物質が新血管形成の誘発に係
わつてきた。これらには、プロスタグランジン類〔アウ
エルバツハ（Auerbach）、Pick and Landy編「リンホカ
イン類（Lymphokines）」、６９−８８、Academic Pres
s,New York１９８１〕、ヒトウロキナーゼ〔ベルマン等
（Berman et al.）、Invest Opthalm.Vis.Sci.２２：１
９１−１９９、１９８２〕、銅〔ラジユ等（Raju et a
l.）、Ｊ．Natl.Cancer Inst.６９：１１８３−１１８
８、１９８２〕及び各種「脈管形成因子」が含まれる。
脈管形成因子は腫瘍細胞、創傷流体〔バンダ等（Banda
et al.）、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ ７９：７７７
３−７７７７、１９８２年；バンダ等（Banda et al.）
米国特許４，５０３，０３８号明細書）及び網膜細胞
〔ダモーレ（Ｄ′Amore）、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ
７８：３８６８−３０７２、１９８１年〕から得られ
てきた。腫瘍−由来の脈管形成因子は一般的に貧弱に特
徴付けられているにすぎない。フオークマン等（Folkma
n et al.）（Ｊ．Exp.Med.１３３：２７５−２８８、１
９７１年）はWalker２５６ラツト腹水腫瘍から腫瘍脈管
形成因子を単離した。この因子は毛細管内皮細胞に対し
て有糸分裂誘発性であり、RNaseにより不活性化され
た。チユアン等（Tuan et al.）（Biochemistry１２：
３１５９−３１６５、１９７３年）はWalker２５６腫瘍
の非ヒストンタンパク質に有糸分裂誘発性及び脈管形成
活性を見出した。活性画分はタンパク質と炭水化物の混
合物であつた。各種動物及びヒト腫瘍は脈管形成因子を
産生することが示された〔フイリツプス及びクマール
（Phillips and Kumar）、Int.J.Cancer２３；８２−８
８、１９７９年〕が、しかしこれらの因子の化学的性質
は決定されなかつた。Walker２５６腫瘍からの低分子量
非タンパク質成分も又脈管形成及び有糸分裂誘発性であ
ることが示された〔ワイス等（Weiss et al.）、Br.J.C
ancer４０：４９３−４９６、１９７９年〕。４００〜
８００ダルトンの分子量を有する脈管形成因子がフエン
スラウ等（Fenselau et al.）（J.Biol.Chem.２５６：
９６０５−９６１１、１９８１年）により均質になるま
で精製されたが、それは更に特徴付けられなかつた。ヒ
トの肺腫瘍細胞が高分子量担体及び低分子量の、おそら
くは非−タンパク質、活性成分よりなる脈管形成因子を
分泌することが示された〔クマール等（Kumar et al.）
Int.J.Cancer ３２：４６１−４６４、１９８３年〕。
バレー等（Vallee et al.）（Experientia.４１：１−
１５、１９８５年）はWalker２５６腫瘍からの三つの画
分に関連した脈管形成活性を見出した。トルバート等
（Tolbert et al.）（米国特許４，２２９，５３１号明
細書）はヒト腺癌細胞系統ＨＴ−２９からの脈管形成因
子の産生を開示しているが、しかしこの物質は単に部分
的に精製されたに過ぎず、化学的に特徴付けられなかつ
た。脈管形成因子の産生を荷う遺伝子の単離は少なくと
も部分的にこれらの因子の純度及び特徴付けの欠乏によ
りこれ迄報告されていない。
et al.）、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ ７９：７７７
３−７７７７、１９８２年；バンダ等（Banda et al.）
米国特許４，５０３，０３８号明細書）及び網膜細胞
〔ダモーレ（Ｄ′Amore）、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ
７８：３８６８−３０７２、１９８１年〕から得られ
てきた。腫瘍−由来の脈管形成因子は一般的に貧弱に特
徴付けられているにすぎない。フオークマン等（Folkma
n et al.）（Ｊ．Exp.Med.１３３：２７５−２８８、１
９７１年）はWalker２５６ラツト腹水腫瘍から腫瘍脈管
形成因子を単離した。この因子は毛細管内皮細胞に対し
て有糸分裂誘発性であり、RNaseにより不活性化され
た。チユアン等（Tuan et al.）（Biochemistry１２：
３１５９−３１６５、１９７３年）はWalker２５６腫瘍
の非ヒストンタンパク質に有糸分裂誘発性及び脈管形成
活性を見出した。活性画分はタンパク質と炭水化物の混
合物であつた。各種動物及びヒト腫瘍は脈管形成因子を
産生することが示された〔フイリツプス及びクマール
（Phillips and Kumar）、Int.J.Cancer２３；８２−８
８、１９７９年〕が、しかしこれらの因子の化学的性質
は決定されなかつた。Walker２５６腫瘍からの低分子量
非タンパク質成分も又脈管形成及び有糸分裂誘発性であ
ることが示された〔ワイス等（Weiss et al.）、Br.J.C
ancer４０：４９３−４９６、１９７９年〕。４００〜
８００ダルトンの分子量を有する脈管形成因子がフエン
スラウ等（Fenselau et al.）（J.Biol.Chem.２５６：
９６０５−９６１１、１９８１年）により均質になるま
で精製されたが、それは更に特徴付けられなかつた。ヒ
トの肺腫瘍細胞が高分子量担体及び低分子量の、おそら
くは非−タンパク質、活性成分よりなる脈管形成因子を
分泌することが示された〔クマール等（Kumar et al.）
Int.J.Cancer ３２：４６１−４６４、１９８３年〕。
バレー等（Vallee et al.）（Experientia.４１：１−
１５、１９８５年）はWalker２５６腫瘍からの三つの画
分に関連した脈管形成活性を見出した。トルバート等
（Tolbert et al.）（米国特許４，２２９，５３１号明
細書）はヒト腺癌細胞系統ＨＴ−２９からの脈管形成因
子の産生を開示しているが、しかしこの物質は単に部分
的に精製されたに過ぎず、化学的に特徴付けられなかつ
た。脈管形成因子の産生を荷う遺伝子の単離は少なくと
も部分的にこれらの因子の純度及び特徴付けの欠乏によ
りこれ迄報告されていない。
脈管形成因子の単離は高性能液体クロマトグラフイ〔バ
ンダ等（Banda et al.）、前記〕；溶媒抽出〔前記フオ
ークマン（Folkman）等〕；シリカゲル上クロマトグラ
フイ〔前記フエンスロウ（Fenselau）等〕、ＤＥＡＥセ
ルロース〔前記ワイス（Weiss）等〕或いはSephadex
〔前記チユアン（Tuan）等〕及びアフイニテイクロマト
グラフイ〔前記ワイス（Weiss）等〕を用いてきた。
ンダ等（Banda et al.）、前記〕；溶媒抽出〔前記フオ
ークマン（Folkman）等〕；シリカゲル上クロマトグラ
フイ〔前記フエンスロウ（Fenselau）等〕、ＤＥＡＥセ
ルロース〔前記ワイス（Weiss）等〕或いはSephadex
〔前記チユアン（Tuan）等〕及びアフイニテイクロマト
グラフイ〔前記ワイス（Weiss）等〕を用いてきた。
最近、バレー（Vallee）等（米国特許出願＝Ｓｅｒｉａ
ｌ No.７２４，０８８、１９８５年４月１７日出願及
び本出願と同時に出願したＵＳＳＮ 、これら
の両者は本発明において準用する）はヒト腺癌細胞系統
からの脈管形成タンパク質を精製した。このアンギオゲ
ニンとして知られる精製タンパク質は化学的に特徴付け
られ、及びそのアミノ酸配列が決定された。
ｌ No.７２４，０８８、１９８５年４月１７日出願及
び本出願と同時に出願したＵＳＳＮ 、これら
の両者は本発明において準用する）はヒト腺癌細胞系統
からの脈管形成タンパク質を精製した。このアンギオゲ
ニンとして知られる精製タンパク質は化学的に特徴付け
られ、及びそのアミノ酸配列が決定された。
脈管形成因子は傷の治瘉において重要な役割を果し〔レ
チユラ等（Rettura et al.）ＦＡＳＥＢ abstract ＃
４３０９、第６１回Annual Meeting、シカゴ１９７７
年〕、又、悪性のスクリーニング試験の開発において応
用を有するので〔クラグスバーン等（Klagsburv et a
l.）、Cancer Res.３６：１１０−１１４、１９７６
年；及びブレム等（Brem et al.）、Science１９５：８
８０−８８１、１９７７年〕、脈管形成タンパク質をそ
れらの治療及び診断における応用を可能にするのに十分
な量を製造することは明らかに有利である。遺伝子工学
の技術はこれらのタンパク質の製造水準を増大するのに
理想的に適したものである。脈管形成タンパク質をコー
ド化する遺伝子のクローニングがその様な大規模製造の
必要な第一段階である。
チユラ等（Rettura et al.）ＦＡＳＥＢ abstract ＃
４３０９、第６１回Annual Meeting、シカゴ１９７７
年〕、又、悪性のスクリーニング試験の開発において応
用を有するので〔クラグスバーン等（Klagsburv et a
l.）、Cancer Res.３６：１１０−１１４、１９７６
年；及びブレム等（Brem et al.）、Science１９５：８
８０−８８１、１９７７年〕、脈管形成タンパク質をそ
れらの治療及び診断における応用を可能にするのに十分
な量を製造することは明らかに有利である。遺伝子工学
の技術はこれらのタンパク質の製造水準を増大するのに
理想的に適したものである。脈管形成タンパク質をコー
ド化する遺伝子のクローニングがその様な大規模製造の
必要な第一段階である。
更に、ある種の腫瘍生成物による汚染が受入れられない
場合であるヒトの治療の場合などのように、これらのタ
ンパク質を非−腫瘍細胞から得ることが望ましい場合が
ある。本発明は従つて組換えＤＮＡ技術を用いて非−腫
瘍細胞において脈管形成タンパク質の製造を提供するも
のである。
場合であるヒトの治療の場合などのように、これらのタ
ンパク質を非−腫瘍細胞から得ることが望ましい場合が
ある。本発明は従つて組換えＤＮＡ技術を用いて非−腫
瘍細胞において脈管形成タンパク質の製造を提供するも
のである。
発明の開示 簡単に述べると、本発明は脈管形成活性を有するタンパ
ク質をコード化するＤＮＡ配列を開示する。アンギオゲ
ニンをコード化するＤＮＡ配列、又はアンギオゲニンと
実質的に同一な活性を有するタンパク質も又開示され
る。このＤＮＡ配列はｃＤＮＡ或いはゲノムＤＮＡから
得られ、或いはＤＮＡ合成技術により調製される。
ク質をコード化するＤＮＡ配列を開示する。アンギオゲ
ニンをコード化するＤＮＡ配列、又はアンギオゲニンと
実質的に同一な活性を有するタンパク質も又開示され
る。このＤＮＡ配列はｃＤＮＡ或いはゲノムＤＮＡから
得られ、或いはＤＮＡ合成技術により調製される。
本発明は更に脈管形成活性を有するタンパク質をコード
化するＤＮＡ配列を含んでなるベクターを開示する。ア
ンギオゲニンと実質的に同一な生物活性を有するタンパ
ク質をコード化するＤＮＡ配列を含んでなるベクターも
又開示される。これ等のベクターは更にそのＤＮＡ配列
の上流に且つ操作可能に連結されたプロモータ配列を含
んでなる。一般的に、これらのベクターは選択的マーカ
ーも又含み、且つ用いられる宿主細胞に応じて制御配
列、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー及びＲＮＡ
スプライス部位などの要素を含んでよい。
化するＤＮＡ配列を含んでなるベクターを開示する。ア
ンギオゲニンと実質的に同一な生物活性を有するタンパ
ク質をコード化するＤＮＡ配列を含んでなるベクターも
又開示される。これ等のベクターは更にそのＤＮＡ配列
の上流に且つ操作可能に連結されたプロモータ配列を含
んでなる。一般的に、これらのベクターは選択的マーカ
ーも又含み、且つ用いられる宿主細胞に応じて制御配
列、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー及びＲＮＡ
スプライス部位などの要素を含んでよい。
本発明の付加的側面は脈管形成活性を有するタンパク質
を産生するようにトランスフェクト又は形質転換された
細胞を開示する。アンギオゲニンと実質的に同一の生物
学的活性を有するタンパク質を産生するようにトランス
フェクト又は形質転換された細胞も又開示される。これ
らの細胞は脈管形成活性を有するタンパク質をコード化
するＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクターを含有するよ
うにトランスフェクト又は形質転換される。
を産生するようにトランスフェクト又は形質転換された
細胞を開示する。アンギオゲニンと実質的に同一の生物
学的活性を有するタンパク質を産生するようにトランス
フェクト又は形質転換された細胞も又開示される。これ
らの細胞は脈管形成活性を有するタンパク質をコード化
するＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクターを含有するよ
うにトランスフェクト又は形質転換される。
本発明の更にもう一つの側面は脈管形成活性を有するタ
ンパク質の製造方法を開示する。この方法は(a)宿主細
胞中に脈管形成活性を有するタンパク質をコード化する
ＤＮＡ配列を含んでなるベクターを導入し、(b)この宿
主細胞を適当な培地中で増殖させ、及び(c)このＤＮＡ
配列によりコード化され及びこの宿主細胞により産生さ
れたタンパク質生成物を単離することを含んでなる。ア
ンギオゲニンと実質的に同一な生物学的活性を有するタ
ンパク質の製造方法も又開示される。これらの方法によ
り製造されるタンパク質も又開示される。
ンパク質の製造方法を開示する。この方法は(a)宿主細
胞中に脈管形成活性を有するタンパク質をコード化する
ＤＮＡ配列を含んでなるベクターを導入し、(b)この宿
主細胞を適当な培地中で増殖させ、及び(c)このＤＮＡ
配列によりコード化され及びこの宿主細胞により産生さ
れたタンパク質生成物を単離することを含んでなる。ア
ンギオゲニンと実質的に同一な生物学的活性を有するタ
ンパク質の製造方法も又開示される。これらの方法によ
り製造されるタンパク質も又開示される。
本発明のその他の側面は詳細な説明及び図面を参照して
明らかとなるであろう。
明らかとなるであろう。
図面の簡単な説明 第１図はヒト腺癌ＨＴ−２９細胞から精製されたアンギ
オゲニンのアミノ酸配列を図示する。
オゲニンのアミノ酸配列を図示する。
第２図はアンギオゲニンｃＤＮＡ及びゲノムクローンの
配列決定のために用いられる計画を図示するものであ
る。頂部部分はｃＤＮＡを指し、及び底部部分はゲノム
ＤＮＡを指す。実線の棒はコード化領域を示し、矢印は
配列決定された断片を示す。三つのＡｌｕ配列の位置及
び方向は大きな斜線を付した矢印により示される。
配列決定のために用いられる計画を図示するものであ
る。頂部部分はｃＤＮＡを指し、及び底部部分はゲノム
ＤＮＡを指す。実線の棒はコード化領域を示し、矢印は
配列決定された断片を示す。三つのＡｌｕ配列の位置及
び方向は大きな斜線を付した矢印により示される。
第３図はλＨＡＧＩにおけるゲノムＤＮＡインサートの
配列の一部を図示する。ｐＨＡＧ１のｃＤＮＡインサー
トはヌクレオチド２５２において置換を有するゲノムＤ
ＮＡのヌクレオチド１０６〜７３１に対応する。
配列の一部を図示する。ｐＨＡＧ１のｃＤＮＡインサー
トはヌクレオチド２５２において置換を有するゲノムＤ
ＮＡのヌクレオチド１０６〜７３１に対応する。
第４図は哺乳動物細胞発現ベクターｐＨＡＧＦ−ＭＴ−
ＤＨＦＲの造成を図示する。
ＤＨＦＲの造成を図示する。
第５図及び第６図は酵母発現ベクターｐＹＡＧＦの造成
を図示する。
を図示する。
発明を実施するための最良の態様 発明を提示する前に、以下に用いる幾つかの用語を定義
する。
する。
生物学的活性とは生物学的関係において（即ち生物体に
おいて或いはin vitroの複製において）分子により行わ
れるある機能或いは機能の組である。アンギオゲニンに
ついては、生物学的活性はその脈管形成活性により特徴
付けられる。
おいて或いはin vitroの複製において）分子により行わ
れるある機能或いは機能の組である。アンギオゲニンに
ついては、生物学的活性はその脈管形成活性により特徴
付けられる。
脈管形成活性は、組織における血管発達の化学的刺戟で
ある。それは一般的に各種細胞タイプにより産生される
拡散性物質と相関する。脈管形成活性はヒヨコ胚漿尿膜
アツセイ〔ナイトン等（Knighton et al.）、Br.J.Canc
er３５：３４７−３５６、１９７７年〕及び／又はウサ
ギ角膜移植アツセイ〔ランガー及びフオークマン（Lang
er and Folkman）、Nature２６３：７９７−８００、１
９７６年〕における陽性応答により特徴付けられる。
ある。それは一般的に各種細胞タイプにより産生される
拡散性物質と相関する。脈管形成活性はヒヨコ胚漿尿膜
アツセイ〔ナイトン等（Knighton et al.）、Br.J.Canc
er３５：３４７−３５６、１９７７年〕及び／又はウサ
ギ角膜移植アツセイ〔ランガー及びフオークマン（Lang
er and Folkman）、Nature２６３：７９７−８００、１
９７６年〕における陽性応答により特徴付けられる。
ＤＮＡ造成物（DNA construct）はヒトの介入によりさ
もなくば自然においては存在しないように組合わされ及
び配列されたＤＮＡのセグメントを含有するように改変
されたＤＮＡ分子或いはその様な分子のクローンであ
る。
もなくば自然においては存在しないように組合わされ及
び配列されたＤＮＡのセグメントを含有するように改変
されたＤＮＡ分子或いはその様な分子のクローンであ
る。
脈管形成タンパク質は腫瘍細胞及び網膜細胞を含む各種
細胞タイプにより産生される。最近迄、これらのタンパ
ク質はそれらの化学的及び物理的特徴付けを可能にする
のに十分な純度で得られていなかつた。新規多段−精製
方法の応用により、以後アンギオゲニンと称する脈管形
成タンパク質の具体例がヒト腫瘍細胞系統の培養培地か
ら精製された。タンパク質配列の決定は対応するＤＮＡ
配列の単離及びこれらの配列の組換えＤＮＡ技術による
発現を可能にした。
細胞タイプにより産生される。最近迄、これらのタンパ
ク質はそれらの化学的及び物理的特徴付けを可能にする
のに十分な純度で得られていなかつた。新規多段−精製
方法の応用により、以後アンギオゲニンと称する脈管形
成タンパク質の具体例がヒト腫瘍細胞系統の培養培地か
ら精製された。タンパク質配列の決定は対応するＤＮＡ
配列の単離及びこれらの配列の組換えＤＮＡ技術による
発現を可能にした。
脈管形成タンパク質の単離はイオン変換クロマトグラフ
イによる調整細胞培地の分別に引続く高性能液体クロマ
トグラフイに基づくものである。
イによる調整細胞培地の分別に引続く高性能液体クロマ
トグラフイに基づくものである。
腫瘍細胞が本発明による脈管形成タンパク質の好ましい
源であるが、その他のタイプの細胞、特に網膜細胞は脈
管形成因子を産生することが知られている。特に好まし
い細胞系統はヒト腺癌細胞系統ＨＴ−２９〔フオグ及び
トレンプ（Fogh and Trempe）、Fogh編Human Tumor Ce
lls in Vitro、１１５−１６０、Plemun．ニユーヨーク
１９７５年〕である。ＨＴ−２９単離体は受入番号ＨＴ
Ｂ３８及びＣＲＬ８９０５の下にアメリカンタイプ カ
ルチヤー コレクシヨン（American Type Culture Coll
eotion）に寄託されている。これらの細胞は公知の方法
に従つて、例えばダルベツコーの改変イーグル培地或い
はその他の適当な培地内の単層培養として培養される。
好ましい培地は２mM Ｌ−グルタミン及び５％熱不活性
化ウシ胎児血清（ＤＭＥ／５）を補給されたダルベツコ
ーの改変イーグル培地である。この培地は定期的に更新
され、及び細胞は公知の操作に従つて継代培養される。
源であるが、その他のタイプの細胞、特に網膜細胞は脈
管形成因子を産生することが知られている。特に好まし
い細胞系統はヒト腺癌細胞系統ＨＴ−２９〔フオグ及び
トレンプ（Fogh and Trempe）、Fogh編Human Tumor Ce
lls in Vitro、１１５−１６０、Plemun．ニユーヨーク
１９７５年〕である。ＨＴ−２９単離体は受入番号ＨＴ
Ｂ３８及びＣＲＬ８９０５の下にアメリカンタイプ カ
ルチヤー コレクシヨン（American Type Culture Coll
eotion）に寄託されている。これらの細胞は公知の方法
に従つて、例えばダルベツコーの改変イーグル培地或い
はその他の適当な培地内の単層培養として培養される。
好ましい培地は２mM Ｌ−グルタミン及び５％熱不活性
化ウシ胎児血清（ＤＭＥ／５）を補給されたダルベツコ
ーの改変イーグル培地である。この培地は定期的に更新
され、及び細胞は公知の操作に従つて継代培養される。
細胞培地から脈管形成タンパク質の単離を容易にするた
めに、細胞をそれらが一度集密的成長に達したならば、
血清のない維持培地を移すのが好ましい。好ましい維持
培地は血清のない、がしかしＬ−グルタミンを５mMの濃
度で含有するＤＭＥ／５である。
めに、細胞をそれらが一度集密的成長に達したならば、
血清のない維持培地を移すのが好ましい。好ましい維持
培地は血清のない、がしかしＬ−グルタミンを５mMの濃
度で含有するＤＭＥ／５である。
細胞が培養され、維持された調整培地として知られる培
地を次いで細胞から取出し、及び好ましくは過して細
胞残滓を除去し、次いで処理して高分子量タンパク質を
除去する。好ましい処理方法は酸性化、例えば氷酢酸を
５％（ｖ／ｖ）の濃度に添加した後、遠心分離を行う方
法である。又、過し酸性化された培地を更に精製工程
にかける前に濃縮することも望ましい。
地を次いで細胞から取出し、及び好ましくは過して細
胞残滓を除去し、次いで処理して高分子量タンパク質を
除去する。好ましい処理方法は酸性化、例えば氷酢酸を
５％（ｖ／ｖ）の濃度に添加した後、遠心分離を行う方
法である。又、過し酸性化された培地を更に精製工程
にかける前に濃縮することも望ましい。
過され、処理された培地を次いでカルボキシメチルセ
ルロース（ＣＭセルロース）などのカチオン交換マトリ
ツクス上でクロマトグラフイにかける。この処理された
調整培地を凍結乾燥し、0.1Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ6.6中で戻してマトリツクスにかけるのが好まし
い。その様な条件下において、脈管形成因子はマトリツ
クスに結合し、１ＭＮａＣｌを含有する同一緩衝液で溶
出される。
ルロース（ＣＭセルロース）などのカチオン交換マトリ
ツクス上でクロマトグラフイにかける。この処理された
調整培地を凍結乾燥し、0.1Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ6.6中で戻してマトリツクスにかけるのが好まし
い。その様な条件下において、脈管形成因子はマトリツ
クスに結合し、１ＭＮａＣｌを含有する同一緩衝液で溶
出される。
カチオン交換マトリツクスからの溶出液は更に逆相高性
能液体クロマトグラフイにより分別される。この溶出液
を凍結乾燥し、適当な溶媒例えば水中0.1％トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）などの溶媒中で戻し、及び第二の溶媒
の勾配をカラムにかけることにより溶出される。0.08％
ＴＦＡを含有するイソプロパノール／アセトニトリル／
水（５：５：４ｖ／ｖ／ｖ）の線形勾配が好ましい。Ｈ
ＰＬＣカラムから溶出された物質を次いで透析して溶媒
を除去し、凍結乾燥し、又戻す。
能液体クロマトグラフイにより分別される。この溶出液
を凍結乾燥し、適当な溶媒例えば水中0.1％トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）などの溶媒中で戻し、及び第二の溶媒
の勾配をカラムにかけることにより溶出される。0.08％
ＴＦＡを含有するイソプロパノール／アセトニトリル／
水（５：５：４ｖ／ｖ／ｖ）の線形勾配が好ましい。Ｈ
ＰＬＣカラムから溶出された物質を次いで透析して溶媒
を除去し、凍結乾燥し、又戻す。
戻されたＨＰＬＣカラム溶出液を次いで脈管形成活性の
アツセイを行い、活性画分を同定する。脈管形成活性に
対する幾つかのアツセイは良く知られており、ヒヨコ胚
漿尿膜アツセイ〔ナイトン等（Knighton et al.）Br.J.
Cancer ３５：３４７−３５６、１９７７年〕及び角膜
移植アツセイ〔ランガー及びフオークマン（Langer and
Folkman）、Nature ２６３：７９７−８００、１９７
６年〕などが挙げられる。
アツセイを行い、活性画分を同定する。脈管形成活性に
対する幾つかのアツセイは良く知られており、ヒヨコ胚
漿尿膜アツセイ〔ナイトン等（Knighton et al.）Br.J.
Cancer ３５：３４７−３５６、１９７７年〕及び角膜
移植アツセイ〔ランガー及びフオークマン（Langer and
Folkman）、Nature ２６３：７９７−８００、１９７
６年〕などが挙げられる。
ＨＴ−２９細胞が出発物質として用いられる場合には、
二つの活性画分がＨＰＬＣカラムから得られる。一つの
画分はMr約１６０００の主たるタンパク質成分とより少
量のMr約１４，０００種を含有する。第二の画分はアン
ギオゲニンと命名されたMr約１４，０００の単一タンパ
ク種を含有する。更に分析すると、アンギオゲニンは9.
5より大きい等電点及びアミノ酸配列分析により約１
４，１９３ダルトンの分子量を有することが判明した。
驚くべきことに、殆んどの前記脈管形成因子と対照的
に、アンギオゲニンは通常のアツセイにおいては有糸分
裂誘発性ではなかった。アンギオゲニンのアミノ酸配列
は膵臓リボヌクレアーゼに３５％相同であることが判明
した。
二つの活性画分がＨＰＬＣカラムから得られる。一つの
画分はMr約１６０００の主たるタンパク質成分とより少
量のMr約１４，０００種を含有する。第二の画分はアン
ギオゲニンと命名されたMr約１４，０００の単一タンパ
ク種を含有する。更に分析すると、アンギオゲニンは9.
5より大きい等電点及びアミノ酸配列分析により約１
４，１９３ダルトンの分子量を有することが判明した。
驚くべきことに、殆んどの前記脈管形成因子と対照的
に、アンギオゲニンは通常のアツセイにおいては有糸分
裂誘発性ではなかった。アンギオゲニンのアミノ酸配列
は膵臓リボヌクレアーゼに３５％相同であることが判明
した。
脈管形成タンパク質が実質的に純粋な形態で得られた場
合に、そのアミノ酸配列は公知の方法、例えばエドマン
分解〔エドマン及びベツグ（Edman及びBegg）、Eur.J.B
iochem、１：８０−９１、１９６７年〕により決定され
た。全アミノ酸配列を決定する必要はない。好ましく
は、少なくとも５〜１０個のアミノ酸の配列が決定され
る。
合に、そのアミノ酸配列は公知の方法、例えばエドマン
分解〔エドマン及びベツグ（Edman及びBegg）、Eur.J.B
iochem、１：８０−９１、１９６７年〕により決定され
た。全アミノ酸配列を決定する必要はない。好ましく
は、少なくとも５〜１０個のアミノ酸の配列が決定され
る。
このアミノ酸配列から、ＤＮＡプローブが設計される。
一般的には、このアミノ酸配列をコード化する全ての可
能性あるＤＮＡ配列に対応するプローブの族を設計する
必要がある。その様なプローブはＤＮＡクローンをスク
リーニングする際に偽の陽性シグナルを最少にするため
に少なくとも１４個のヌクレオチドの長さであるのが好
ましい。適当なプローブは公知の方法により合成される
か〔総説としてイタクラ（Itakura）、Trends in Bioch
emical Science、Elsevier Biochemical Press、１９８
２年参照〕或いは商業上の供給者から購入される。
一般的には、このアミノ酸配列をコード化する全ての可
能性あるＤＮＡ配列に対応するプローブの族を設計する
必要がある。その様なプローブはＤＮＡクローンをスク
リーニングする際に偽の陽性シグナルを最少にするため
に少なくとも１４個のヌクレオチドの長さであるのが好
ましい。適当なプローブは公知の方法により合成される
か〔総説としてイタクラ（Itakura）、Trends in Bioch
emical Science、Elsevier Biochemical Press、１９８
２年参照〕或いは商業上の供給者から購入される。
ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）及び／又はゲノムＤＮＡライ
ブラリーを次いで調製し、及び通常のハイブリダイゼー
シヨン技術を用いてブローブを用いてスクリーニングす
る。その様なライブラリーの調製技術は良く知られてい
る〔例えば、ローン等（Lawn et al.）Cell １５：１
１５７−１１７４、１９７８年；及びマイケルソン等
（Michelson et al.)Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ８０：
４７２−４７６、１９８３年参照〕。プローブにハイブ
リダイズするクローンを次いで選択し、配列決定する。
ブラリーを次いで調製し、及び通常のハイブリダイゼー
シヨン技術を用いてブローブを用いてスクリーニングす
る。その様なライブラリーの調製技術は良く知られてい
る〔例えば、ローン等（Lawn et al.）Cell １５：１
１５７−１１７４、１９７８年；及びマイケルソン等
（Michelson et al.)Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ８０：
４７２−４７６、１９８３年参照〕。プローブにハイブ
リダイズするクローンを次いで選択し、配列決定する。
或いは又、十分な量の純粋な脈管形成タンパク質が得ら
れるならば、それを用いて抗体を調製し、この抗体を次
いで用いて発現ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
してよい〔ヤング及びデービス（Young and Davis）、P
roc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ８０：１１９４−１１９８、
１９８３年〕。
れるならば、それを用いて抗体を調製し、この抗体を次
いで用いて発現ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
してよい〔ヤング及びデービス（Young and Davis）、P
roc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ８０：１１９４−１１９８、
１９８３年〕。
全長のｃＤＮＡクローンが得られるならば、それを脈管
形成タンパク質を製造するのに使用するために直接に発
現ベクターに挿入してよい。全長のｃＤＮＡクローンが
欠ける場合には、残りのコード化配列は幾つかの方法に
より得られ、及び全長のコード化配列が次いで造成され
る。ｃＤＮＡクローンは追加のｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングするために或いはゲノムＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングするためのプローブとして使用さ
れてよい。タンパク質のアミノ酸配列が知られているな
らば、欠けている物質を合成し、そのｃＤＮＡ及び／又
はゲノムＤＮＡ断片に連結して完全なコード化配列が造
成される。幾つかの状況下においては、コード化配列は
適当な操作及び本発明により製造される脈管形成タンパ
ク質の分泌を容易にするために更にリーダーペプチドを
コード化するのが好ましい。リーダーペプチドは脈管形
成ペプチド自身のそれであつても或いは特別の宿主細胞
において機能する異種リーダーペプチドであつてよい。
形成タンパク質を製造するのに使用するために直接に発
現ベクターに挿入してよい。全長のｃＤＮＡクローンが
欠ける場合には、残りのコード化配列は幾つかの方法に
より得られ、及び全長のコード化配列が次いで造成され
る。ｃＤＮＡクローンは追加のｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングするために或いはゲノムＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングするためのプローブとして使用さ
れてよい。タンパク質のアミノ酸配列が知られているな
らば、欠けている物質を合成し、そのｃＤＮＡ及び／又
はゲノムＤＮＡ断片に連結して完全なコード化配列が造
成される。幾つかの状況下においては、コード化配列は
適当な操作及び本発明により製造される脈管形成タンパ
ク質の分泌を容易にするために更にリーダーペプチドを
コード化するのが好ましい。リーダーペプチドは脈管形
成ペプチド自身のそれであつても或いは特別の宿主細胞
において機能する異種リーダーペプチドであつてよい。
脈管形成タンパク質をコード化する全長のＤＮＡ配列が
得られた場合には、それは次いで適当な発現ベクター中
に挿入される。本発明を実施するのに使用される発現ベ
クターは更に脈管形成タンパク質をコード化するＤＮＡ
配列に操作可能に連結されたプロモータを含んでなる。
ある場合においては発現ベクターは更に選択される宿主
細胞に応じて複製の原点並びに発現レベルを制御及び／
又は高める配列を含んでなるのが好ましい。適当な発現
ベクターはプラスミド類或いはウイルス類から得られ、
或いは両者の要素を含んでよい。
得られた場合には、それは次いで適当な発現ベクター中
に挿入される。本発明を実施するのに使用される発現ベ
クターは更に脈管形成タンパク質をコード化するＤＮＡ
配列に操作可能に連結されたプロモータを含んでなる。
ある場合においては発現ベクターは更に選択される宿主
細胞に応じて複製の原点並びに発現レベルを制御及び／
又は高める配列を含んでなるのが好ましい。適当な発現
ベクターはプラスミド類或いはウイルス類から得られ、
或いは両者の要素を含んでよい。
本発明を実施するのに用いられる好ましい原核宿主は細
菌エツシエリシア・コリ（Eschericia coli）の菌株で
あるが、しかし、バチルス（Bacillus）その他の属も又
有用である。これらの宿主を形質転換し、それらにクロ
ーン化された外来遺伝子を発現するための技術は良く知
られている〔例えばマニアテイス等（Maniatis et a
l.）、Molecular Cloning:A Laboratory Monual、Cold S
pring Horbor Laboratory、１９８２年参照〕。細菌宿
主中で外来遺伝子を発現するために用いられるベクター
は一般的に抗生物質耐性のための遺伝子などの選択可能
なマーカー及び宿主細胞内で機能するプロモータを含有
する。適当なプロモータとしては、trp〔ニコルス及び
ヤノフスキー（Nichols and Yanofsky)Meth、in Enzymol
ogy１０１：１５５、１９８３年〕lac〔カサダバン等
（Casadaban et al.)、J.Bact、１４３：９７１−９８
０、１９８０年〕及びλファージプロモータ系などが挙
げられる。細菌を形質転換するために必要なプラスミド
類としては、ｐＢＲ３２２〔ポリバー等（Bolivar et a
l.)Gene２：９５−１１３、１９７７年〕、ｐＵＣプラ
スミド類〔メツシング（Messing）、Meth.in Enzymolog
y１０１：２０−７７、１９８３年；及びビエイラ及び
メツシング（Vieira and Messing）、Gene１９：２５９
−２６８、１９８２年〕、ｐＣＱＶ２〔クイーン（Quee
n）、Ｊ．Mol.Appl.Genet、２：１−１０、１９８３
年〕及びそれらの誘導体などが挙げられる。
菌エツシエリシア・コリ（Eschericia coli）の菌株で
あるが、しかし、バチルス（Bacillus）その他の属も又
有用である。これらの宿主を形質転換し、それらにクロ
ーン化された外来遺伝子を発現するための技術は良く知
られている〔例えばマニアテイス等（Maniatis et a
l.）、Molecular Cloning:A Laboratory Monual、Cold S
pring Horbor Laboratory、１９８２年参照〕。細菌宿
主中で外来遺伝子を発現するために用いられるベクター
は一般的に抗生物質耐性のための遺伝子などの選択可能
なマーカー及び宿主細胞内で機能するプロモータを含有
する。適当なプロモータとしては、trp〔ニコルス及び
ヤノフスキー（Nichols and Yanofsky)Meth、in Enzymol
ogy１０１：１５５、１９８３年〕lac〔カサダバン等
（Casadaban et al.)、J.Bact、１４３：９７１−９８
０、１９８０年〕及びλファージプロモータ系などが挙
げられる。細菌を形質転換するために必要なプラスミド
類としては、ｐＢＲ３２２〔ポリバー等（Bolivar et a
l.)Gene２：９５−１１３、１９７７年〕、ｐＵＣプラ
スミド類〔メツシング（Messing）、Meth.in Enzymolog
y１０１：２０−７７、１９８３年；及びビエイラ及び
メツシング（Vieira and Messing）、Gene１９：２５９
−２６８、１９８２年〕、ｐＣＱＶ２〔クイーン（Quee
n）、Ｊ．Mol.Appl.Genet、２：１−１０、１９８３
年〕及びそれらの誘導体などが挙げられる。
酵母サツカロミセス・セレビジアエ（Saccharomyces ce
revisae）などの真核微生物も又宿主細胞として使用さ
れる。酵母を形質転換するための技術はベツグス（Begg
s）により説明されている（Nature２７５：１０４−１
０８、１９７８年）。酵母内に使用する発現ベクターと
してはＹＲｐ７〔ストルール等（Struhl et al.）、Pro
c.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ７６：１０３５−１０３９、１
９７９年〕、ＹＥｐ１３〔ブローチ等（Broach et a
l.）、Gene８：１２１−１３３、１９７９年〕、ｐＪＤ
Ｂ２４８及びｐＪＤＢ２１９〔前記ベツグス（Begg
s）〕及びそれらの誘導体などが挙げられる。その様な
ベクターは一般的にtrpl変異を有する宿主株内における
選択を可能にする栄養マーカーＴＲＰなどの選択可能な
マーカーを含んでなる。酵母発現ベクター内に用いるの
に好ましいプロモータとしては、酵母糖分解遺伝子から
のプロモータ〔リツツマン等（Ritzeman et al.)J.Bio
l.Chem、２５５：１２０７３−１２０８０、１９８０
年；アルバー及びカワサキ（Alber and Kawasaki）、
Ｊ．Mol.Appl.Genet.１：４１９−４３４、１９８２
年〕或いは〔Young et al.）Genetic Engineering of M
icroorganisms for Chemicals、ホランダー等（Hollaen
der et al.）編、ｐ．３３５、Plenum、ニユーヨーク、
１９８２年；及びアンマラー（Ammerer）、Meth.in Enz
ymology１０１：１９２−２０１、１９８３年〕などが
挙げられる。酵母形質転換体において産生された脈管形
成タンパク質の精製を容易にし、及び適当なジスルフイ
ド結合形成を得るために、シグナル配列、好ましくは分
泌タンパク質をコード化する酵母遺伝子からのものを脈
管形成タンパク質のためのコード化配列に連結してよ
い。特に好ましいシグナル配列はＭＦα１遺伝子のプレ
ープロ領域である〔カージヤン及びヘルスコビツツ（Ku
rjan and Herskowitz）、Cell３０：９３３−９４３、
１９８２年〕。
revisae）などの真核微生物も又宿主細胞として使用さ
れる。酵母を形質転換するための技術はベツグス（Begg
s）により説明されている（Nature２７５：１０４−１
０８、１９７８年）。酵母内に使用する発現ベクターと
してはＹＲｐ７〔ストルール等（Struhl et al.）、Pro
c.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ７６：１０３５−１０３９、１
９７９年〕、ＹＥｐ１３〔ブローチ等（Broach et a
l.）、Gene８：１２１−１３３、１９７９年〕、ｐＪＤ
Ｂ２４８及びｐＪＤＢ２１９〔前記ベツグス（Begg
s）〕及びそれらの誘導体などが挙げられる。その様な
ベクターは一般的にtrpl変異を有する宿主株内における
選択を可能にする栄養マーカーＴＲＰなどの選択可能な
マーカーを含んでなる。酵母発現ベクター内に用いるの
に好ましいプロモータとしては、酵母糖分解遺伝子から
のプロモータ〔リツツマン等（Ritzeman et al.)J.Bio
l.Chem、２５５：１２０７３−１２０８０、１９８０
年；アルバー及びカワサキ（Alber and Kawasaki）、
Ｊ．Mol.Appl.Genet.１：４１９−４３４、１９８２
年〕或いは〔Young et al.）Genetic Engineering of M
icroorganisms for Chemicals、ホランダー等（Hollaen
der et al.）編、ｐ．３３５、Plenum、ニユーヨーク、
１９８２年；及びアンマラー（Ammerer）、Meth.in Enz
ymology１０１：１９２−２０１、１９８３年〕などが
挙げられる。酵母形質転換体において産生された脈管形
成タンパク質の精製を容易にし、及び適当なジスルフイ
ド結合形成を得るために、シグナル配列、好ましくは分
泌タンパク質をコード化する酵母遺伝子からのものを脈
管形成タンパク質のためのコード化配列に連結してよ
い。特に好ましいシグナル配列はＭＦα１遺伝子のプレ
ープロ領域である〔カージヤン及びヘルスコビツツ（Ku
rjan and Herskowitz）、Cell３０：９３３−９４３、
１９８２年〕。
より高等な真核細胞も又本発明を実施する際の宿主細胞
として役立つ。培養された哺乳動物細胞が好ましい。哺
乳動物細胞に用いるための発現ベクターは哺乳動物細胞
に導入された外来遺伝子の転写を指示することのできる
プロモータを含んでなる。特に好ましいプロモータはマ
ウスメタロチオネイン−１（ＭＴ−１）プロモータであ
る〔パルミター等（Palmiter et al.）Science２２２：
８０９−８１４、１９８３年〕。この発現ベクター内に
は又挿入部位の下流に位置したポリアデニル化シグナル
が含有されている。このポリアデニル化シグナルはクロ
ーン化された脈管形成タンパク質遺伝子のそれであるか
或いは異種遺伝子から誘導されてよい。
として役立つ。培養された哺乳動物細胞が好ましい。哺
乳動物細胞に用いるための発現ベクターは哺乳動物細胞
に導入された外来遺伝子の転写を指示することのできる
プロモータを含んでなる。特に好ましいプロモータはマ
ウスメタロチオネイン−１（ＭＴ−１）プロモータであ
る〔パルミター等（Palmiter et al.）Science２２２：
８０９−８１４、１９８３年〕。この発現ベクター内に
は又挿入部位の下流に位置したポリアデニル化シグナル
が含有されている。このポリアデニル化シグナルはクロ
ーン化された脈管形成タンパク質遺伝子のそれであるか
或いは異種遺伝子から誘導されてよい。
クローン化された遺伝子配列は次いで例えばリン酸カル
シウム−媒介トランスフエクシヨン〔ウイグラー等（Wi
gler et al.）、Cell：７２５、１９７８年；コラロ及
びピアソン（Coraro and Pearson）、Somatic Cell Gen
etics７：６０３、１９８１年；グラハム及びフアン・
デル・エブ（Graham and Van der Eb）、Virology５
２：４５６、１９７３年〕により培養された哺乳動物細
胞中に導入される。ＤＮＡ及びリン酸カルシウムよりな
る沈殿が形成され、この沈殿を細胞に適用する。細胞の
幾つかはＤＮＡを吸収し、それを細胞内部に数日間維持
する。これらの細胞の小部分（典型的に１０-4）がこの
ＤＮＡをゲノム中に組み込む。これらの組込み物を同定
するために、選択可能な表現型（選択可能なマーカー）
を与える遺伝子が一般的に対象遺伝子と共に細胞中に導
入される。好ましい選択可能なマーカーとしては、ネオ
マイシン、ハイグロマイシン、及びメトトレキセートな
どの薬品に耐性を付与する遺伝子が挙げられる。選択可
能なマーカーは別個のプラスミドで対象遺伝子と同時に
細胞中に導入されるか、或いはそれらは同一のプラスミ
ドで導入されてよい。
シウム−媒介トランスフエクシヨン〔ウイグラー等（Wi
gler et al.）、Cell：７２５、１９７８年；コラロ及
びピアソン（Coraro and Pearson）、Somatic Cell Gen
etics７：６０３、１９８１年；グラハム及びフアン・
デル・エブ（Graham and Van der Eb）、Virology５
２：４５６、１９７３年〕により培養された哺乳動物細
胞中に導入される。ＤＮＡ及びリン酸カルシウムよりな
る沈殿が形成され、この沈殿を細胞に適用する。細胞の
幾つかはＤＮＡを吸収し、それを細胞内部に数日間維持
する。これらの細胞の小部分（典型的に１０-4）がこの
ＤＮＡをゲノム中に組み込む。これらの組込み物を同定
するために、選択可能な表現型（選択可能なマーカー）
を与える遺伝子が一般的に対象遺伝子と共に細胞中に導
入される。好ましい選択可能なマーカーとしては、ネオ
マイシン、ハイグロマイシン、及びメトトレキセートな
どの薬品に耐性を付与する遺伝子が挙げられる。選択可
能なマーカーは別個のプラスミドで対象遺伝子と同時に
細胞中に導入されるか、或いはそれらは同一のプラスミ
ドで導入されてよい。
組み込まれた遺伝子配列のコピー数はある種の選択可能
なマーカー（例、メトトレキセートに耐性を付与するジ
ハイドロホレートレダクターゼ）を用いる増幅により増
大される。この選択可能なマーカーは対象遺伝子と共に
細胞中に導入され、及び薬物選択が適用される。薬物濃
度を次いで各工程において耐性細胞を選択しながら段階
的に増大する。増大したコピー数のクローン化配列につ
いて選択することにより、発現レベルが実質的に増大さ
れる。
なマーカー（例、メトトレキセートに耐性を付与するジ
ハイドロホレートレダクターゼ）を用いる増幅により増
大される。この選択可能なマーカーは対象遺伝子と共に
細胞中に導入され、及び薬物選択が適用される。薬物濃
度を次いで各工程において耐性細胞を選択しながら段階
的に増大する。増大したコピー数のクローン化配列につ
いて選択することにより、発現レベルが実質的に増大さ
れる。
本発明により製造された脈管形成タンパク質は前記の如
く宿主細胞或いは細胞培地からカチオン交換クロマトグ
ラフイ及び高性能液体クロマトグラフイにより精製され
る。
く宿主細胞或いは細胞培地からカチオン交換クロマトグ
ラフイ及び高性能液体クロマトグラフイにより精製され
る。
その他の脈管形成タンパク質が上記方法により単離され
る。異つた細胞系統は異つた物性を有する脈管形成タン
パク質を産生することが期待される。加えて、遺伝的多
型性或いはタンパク質若しくはそれらの前駆体の細胞−
媒介修飾（cell-mediated modification）による変化物
が存在することがある。更に、ある脈管形成タンパク質
のアミノ酸配列は変更された生物学的活性を有するタン
パク質を製造するために遺伝子技術により改変される。
例えば、アンギオゲニンとリボヌクレアーゼの間の相同
性に基き、位置２６、３９、５７、８１、９２及び１０
７におけるcys残基、位置１３及び１４におけるヒスチ
ジン、及び位置４０におけるリジンは部位特異性突然変
異誘発による他のアミノ酸による置換に好ましい部位で
ある〔ゾラー等（Zoller et al）Manual for Advanced
Technique in Molecular Cloning Course、Cold Spring
Harbor Laboratories、１９８３年〕。得られたＤＮＡ
配列はアンギオゲニンと実質的に同一のアミノ酸配列を
有するが、しかし、より高い或いはより低いレベルの脈
管形成活性を示すタンパク質をコード化するものであ
る。生物学的活性の増大はより低い投与量レベルの使用
を許容することを可能にする。減少された脈管形成活性
を有するか或いは全く脈管形成活性を有さないが、しか
しある種の構造的特徴を保持する分子は内皮その他の細
胞上のレセプターになお結合することが可能であり、及
び、作用部位を閉塞することにより天然タンパク質の作
用に対する拮抗剤を形成し、その結果、脈管形成−関連
病態の治療への接近を与える。その様なタンパク質は本
発明の範囲内のものである。
る。異つた細胞系統は異つた物性を有する脈管形成タン
パク質を産生することが期待される。加えて、遺伝的多
型性或いはタンパク質若しくはそれらの前駆体の細胞−
媒介修飾（cell-mediated modification）による変化物
が存在することがある。更に、ある脈管形成タンパク質
のアミノ酸配列は変更された生物学的活性を有するタン
パク質を製造するために遺伝子技術により改変される。
例えば、アンギオゲニンとリボヌクレアーゼの間の相同
性に基き、位置２６、３９、５７、８１、９２及び１０
７におけるcys残基、位置１３及び１４におけるヒスチ
ジン、及び位置４０におけるリジンは部位特異性突然変
異誘発による他のアミノ酸による置換に好ましい部位で
ある〔ゾラー等（Zoller et al）Manual for Advanced
Technique in Molecular Cloning Course、Cold Spring
Harbor Laboratories、１９８３年〕。得られたＤＮＡ
配列はアンギオゲニンと実質的に同一のアミノ酸配列を
有するが、しかし、より高い或いはより低いレベルの脈
管形成活性を示すタンパク質をコード化するものであ
る。生物学的活性の増大はより低い投与量レベルの使用
を許容することを可能にする。減少された脈管形成活性
を有するか或いは全く脈管形成活性を有さないが、しか
しある種の構造的特徴を保持する分子は内皮その他の細
胞上のレセプターになお結合することが可能であり、及
び、作用部位を閉塞することにより天然タンパク質の作
用に対する拮抗剤を形成し、その結果、脈管形成−関連
病態の治療への接近を与える。その様なタンパク質は本
発明の範囲内のものである。
本発明に従つて製造された脈管形成タンパク質を用い
て、それらを適当な担体と組合わせることにより治療或
いは診断組成物が製造される。これらの治療組成物を用
いて哺乳動物における血管網目の発達が促進され、例え
ば心臓発作に引続く副行循環を誘発するか或いは例えば
関節その他の位置における傷の治癒は促進する。好まし
くは、本発明による治療組成物は静脈内に投与するか或
いは傷の部位に直接局所適用により投与される。例え
ば、良くスポーツに関連した傷或いは変形性関節症にお
いて起こるようにひざ或いは肩の半月に傷が生ずる場合
には、傷の箇所における脈管形成タンパク質の注射が引
裂かれた或いは外傷を受けた繊維軟骨物質の治癒を促進
する。有効投与量は病態の重さ及び標的組織に応じて異
る。更に、脈管形成タンパク質は抗体の存在を測定する
ために或いは免疫診断試薬として用いるための抗体を産
生するためにこのタンパク質を利用することにより悪性
の存在のスクリーニングにおける診断用途を有する。こ
のタンパク質を含有する診断組成物は抗原−抗体複合体
の形成に適した条件下において生物学的試料とインキユ
ベートされる。複合体の形成（即ち試料中における抗体
の存在）が次いで検出される。その様なアツセイの技術
は良く知られており、例えば酵素結合免疫吸着剤アツセ
イ〔ホラー等（Voller et al.）、The Enzyme Linked I
mmunosorbent Assay、Dynatech Laboratories Inc.１９
７９年〕或いはウエスタンブロツトアツセイ〔例えば、
タウビン等（Towbin et al.）、Proc.Natl Acad、Sci．
ＵＳＡ７６：４３５０、１９７９年〕などがある。同様
に、ある脈管形成タンパク質に対する抗体を含んでなる
診断組成物を用いて生物学的試料内におけるそのタンパ
ク質の存在を測定することができる。これらの脈管形成
タンパク質は又脈管形成に関連する障害の治療に有用で
ある脈管形成阻害剤を開発するために用いられてもよ
い。組換えＤＮＡはこれらの用途に必要とされる量でこ
れらのタンパク質を製造するための優れた方法を提供す
る。
て、それらを適当な担体と組合わせることにより治療或
いは診断組成物が製造される。これらの治療組成物を用
いて哺乳動物における血管網目の発達が促進され、例え
ば心臓発作に引続く副行循環を誘発するか或いは例えば
関節その他の位置における傷の治癒は促進する。好まし
くは、本発明による治療組成物は静脈内に投与するか或
いは傷の部位に直接局所適用により投与される。例え
ば、良くスポーツに関連した傷或いは変形性関節症にお
いて起こるようにひざ或いは肩の半月に傷が生ずる場合
には、傷の箇所における脈管形成タンパク質の注射が引
裂かれた或いは外傷を受けた繊維軟骨物質の治癒を促進
する。有効投与量は病態の重さ及び標的組織に応じて異
る。更に、脈管形成タンパク質は抗体の存在を測定する
ために或いは免疫診断試薬として用いるための抗体を産
生するためにこのタンパク質を利用することにより悪性
の存在のスクリーニングにおける診断用途を有する。こ
のタンパク質を含有する診断組成物は抗原−抗体複合体
の形成に適した条件下において生物学的試料とインキユ
ベートされる。複合体の形成（即ち試料中における抗体
の存在）が次いで検出される。その様なアツセイの技術
は良く知られており、例えば酵素結合免疫吸着剤アツセ
イ〔ホラー等（Voller et al.）、The Enzyme Linked I
mmunosorbent Assay、Dynatech Laboratories Inc.１９
７９年〕或いはウエスタンブロツトアツセイ〔例えば、
タウビン等（Towbin et al.）、Proc.Natl Acad、Sci．
ＵＳＡ７６：４３５０、１９７９年〕などがある。同様
に、ある脈管形成タンパク質に対する抗体を含んでなる
診断組成物を用いて生物学的試料内におけるそのタンパ
ク質の存在を測定することができる。これらの脈管形成
タンパク質は又脈管形成に関連する障害の治療に有用で
ある脈管形成阻害剤を開発するために用いられてもよ
い。組換えＤＮＡはこれらの用途に必要とされる量でこ
れらのタンパク質を製造するための優れた方法を提供す
る。
実 験 材料及び方法 制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４キナーゼ、アルカ
リホスフアーゼ、エンドヌクレアーゼBal３１及びＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（Ｅ．コリ）のクレノウ断片はBethes
da Research Loboratories或いはNew England Biolabs
から購入した。逆転写酵素（鳥骨随腫ウイルス）はSeik
agakuＵ．Ｓ．Ａ．Inc.から得た。ジデオキシヌクレオ
チドトリホスフエート、デオキシヌクレオシドトリホス
フエート。ｐＢＲ３２２及びｐＵＣ１３はＰ−Ｌ Bioc
hemicalsから購入した。ジデオキシ配列決定のための万
能プライマー（ヘプタデカマー）はNew England Biolab
sから購入し、及び〔α−32Ｐ〕ｄＡＴＰ、〔γ−
32Ｐ〕ＡＴＰ及び〔35Ｓ〕ｄＡＴＰαＳはAmershamから
得られた。
リホスフアーゼ、エンドヌクレアーゼBal３１及びＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（Ｅ．コリ）のクレノウ断片はBethes
da Research Loboratories或いはNew England Biolabs
から購入した。逆転写酵素（鳥骨随腫ウイルス）はSeik
agakuＵ．Ｓ．Ａ．Inc.から得た。ジデオキシヌクレオ
チドトリホスフエート、デオキシヌクレオシドトリホス
フエート。ｐＢＲ３２２及びｐＵＣ１３はＰ−Ｌ Bioc
hemicalsから購入した。ジデオキシ配列決定のための万
能プライマー（ヘプタデカマー）はNew England Biolab
sから購入し、及び〔α−32Ｐ〕ｄＡＴＰ、〔γ−
32Ｐ〕ＡＴＰ及び〔35Ｓ〕ｄＡＴＰαＳはAmershamから
得られた。
実施例１：アンギオゲニンをコード化するｃＤＮＡ及び
ゲノム配列の単離 ヒトｃＤＮＡライブラリーはプラスミドｐＵＣ１３をク
ローニングベクター（前記マニアテイス等）を用いてヒ
ト肝臓ポリ（Ａ）−ｍＲＮＡから調製した。このプラス
ミドは予めそろPstＩ部位においてＧで尾部を付された
ものであつた。〔マイケルソン及びオーキン（Michelso
n & Orkin）１９８２年〕。２６個の合成オリゴヌクレ
オチド類〔ＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＴＡＧＣ（Ａ／Ｇ）Ｔ
Ｃ（Ａ／Ｇ）ＴＡ（Ａ／Ｇ）ＴＧ（Ｃ／Ｔ）ＴＧ〕の混
合物はＰ−Ｌ Biochemicalsから購入し、ハイブリダイ
ゼーシヨンプローブとして用いた。このヌクレオチド混
合物はGln-His-Tyr-Asp-Ala-Lys-Pro-Gln-Glyをコード
化するヌクレオチド配列と相補的である。この配列は大
腸腺癌細胞系統ＨＴ−２９から単離されたヒトアンギオ
ゲニンのアミノ−末端領域に存在する（第１図参照）。
このヌクレオチド混合物をＴ４キナーゼ及び〔32Ｐ〕Ａ
ＴＰで約３×１０８cpm／μｇの比活性に放射標識化
し、ワラス等（Wallace et al.）の方法（Nucleic Acid
s Res.９：８７９−８９４、１９８１年）による肝臓ラ
イブラリーからの３５０，０００個の形質転換体子のス
クリーニングに用いた。プローブと強くハイブリダイズ
した７個の組換えプラスミドを単離し、セシウムクロラ
イド勾配遠心分離により精製した。陽性クローンの各々
のＤＮＡインサートを各種制限酵素で消化し、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により分析した。それらの配列
はマクサム及びギルバート（Maxam & Gilbert）の化学
分解法（Meth.in Enzymology ６５：４９９−５６０、
１９８０年）により決定した。各配列は２回以上決定さ
れ、８５％を越える配列が両方の鎖について決定され
た。
ゲノム配列の単離 ヒトｃＤＮＡライブラリーはプラスミドｐＵＣ１３をク
ローニングベクター（前記マニアテイス等）を用いてヒ
ト肝臓ポリ（Ａ）−ｍＲＮＡから調製した。このプラス
ミドは予めそろPstＩ部位においてＧで尾部を付された
ものであつた。〔マイケルソン及びオーキン（Michelso
n & Orkin）１９８２年〕。２６個の合成オリゴヌクレ
オチド類〔ＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＴＡＧＣ（Ａ／Ｇ）Ｔ
Ｃ（Ａ／Ｇ）ＴＡ（Ａ／Ｇ）ＴＧ（Ｃ／Ｔ）ＴＧ〕の混
合物はＰ−Ｌ Biochemicalsから購入し、ハイブリダイ
ゼーシヨンプローブとして用いた。このヌクレオチド混
合物はGln-His-Tyr-Asp-Ala-Lys-Pro-Gln-Glyをコード
化するヌクレオチド配列と相補的である。この配列は大
腸腺癌細胞系統ＨＴ−２９から単離されたヒトアンギオ
ゲニンのアミノ−末端領域に存在する（第１図参照）。
このヌクレオチド混合物をＴ４キナーゼ及び〔32Ｐ〕Ａ
ＴＰで約３×１０８cpm／μｇの比活性に放射標識化
し、ワラス等（Wallace et al.）の方法（Nucleic Acid
s Res.９：８７９−８９４、１９８１年）による肝臓ラ
イブラリーからの３５０，０００個の形質転換体子のス
クリーニングに用いた。プローブと強くハイブリダイズ
した７個の組換えプラスミドを単離し、セシウムクロラ
イド勾配遠心分離により精製した。陽性クローンの各々
のＤＮＡインサートを各種制限酵素で消化し、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により分析した。それらの配列
はマクサム及びギルバート（Maxam & Gilbert）の化学
分解法（Meth.in Enzymology ６５：４９９−５６０、
１９８０年）により決定した。各配列は２回以上決定さ
れ、８５％を越える配列が両方の鎖について決定され
た。
最も大きいｃＤＮＡインサートを含有するプラスミド
（ｐＨａＧ１）を次いで第２図の頂部に示される計画に
従つてマクサム及びギルバートの方法（前記）に従つて
配列決定した。このｃＤＮＡインサートは６９７個のヌ
クレオチドを含有し、及び５′末端に１２個のＧ、短い
非コード化配列、２４個（或いは２２個）のアミノ酸の
シグナルペプチドをコード化するリーダー配列、１２３
個のアミノ酸の成熟タンパク質をコード化する３６９個
のヌクレオチド、停止コドン、３′非コード化配列の１
７５個のヌクレオチド、３６個のヌクレオチドのポリ
（Ａ）テール、及び３′末端上の２３個のＣを含むもの
であつた。このｃＤＮＡインサートはヌクレオチド２５
２の置換を有する（残基２３においてGlyをコード化す
る）第３図に示したゲノムＤＮＡ配列のヌクレオチド１
０６〜７３１に対応する。プラスミドｐＨＡＧ１は受入
れ番号４０１９２としてアメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨン（American Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅCollection）に寄託されている。
（ｐＨａＧ１）を次いで第２図の頂部に示される計画に
従つてマクサム及びギルバートの方法（前記）に従つて
配列決定した。このｃＤＮＡインサートは６９７個のヌ
クレオチドを含有し、及び５′末端に１２個のＧ、短い
非コード化配列、２４個（或いは２２個）のアミノ酸の
シグナルペプチドをコード化するリーダー配列、１２３
個のアミノ酸の成熟タンパク質をコード化する３６９個
のヌクレオチド、停止コドン、３′非コード化配列の１
７５個のヌクレオチド、３６個のヌクレオチドのポリ
（Ａ）テール、及び３′末端上の２３個のＣを含むもの
であつた。このｃＤＮＡインサートはヌクレオチド２５
２の置換を有する（残基２３においてGlyをコード化す
る）第３図に示したゲノムＤＮＡ配列のヌクレオチド１
０６〜７３１に対応する。プラスミドｐＨＡＧ１は受入
れ番号４０１９２としてアメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨン（American Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅCollection）に寄託されている。
約３×１０６個のλCharon４Ａバクテリオフアージより
なるヒトゲノムライブラリー〔マニアテイス等（Maniat
is et al.）、Cell１５：６８７−７０２、１９７８
年〕をニツクトランスレーシヨンにより放射標識化され
たクローンｐＨＡＧ１のｃＤＮＡ挿入でスクリーニング
を行つた〔リグビー等（Rigby et al.）、Ｊ．Mol.Bio
l.１１３：２３７−２５１、１９７７年〕。ベントン及
びデービス（Benton & Davis）の方法（Science１９
６：１８１−１８２、１９７７年）により同定されたλ
ＨＡＧ１と称される一つの強くハイブリダイズするフア
ージクローンをプラーク精製し、このフアージＤＮＡを
プレートリシス（platelysis）法（マニアテイス等、１
９８２年、前記）により単離した。このゲノムインサー
トは各種制限酵素で消化して分析した。このインサート
をPvuIIで消化して生成したＤＮＡ断片は大きさが約５
キロ塩基であり、ｃＤＮＡプローブに強くハイブリダイ
ズした。この断片をプラスミドｐＢＲ３２２中にサブク
ローニングし、Amershamのクローニング及び配列決定マ
ニユアルに説明されているような〔35S〕ｄＡＴＰαＳ
を用いてジデオキシ法によりＤＮＡ配列決定に付した
〔メツシング等（Messing et al.）、Nucleic Acids Re
s.９：３０９−３２１、１９８１年；ノランダー等（No
rrander et al.）、Gene２６：１０１−１０６、１９８
３年〕。このフアージゲノムインサートをKpnＩで消化
することにより生成したプローブに強くハイブリダイズ
した約３kbのＤＮＡ断片をＭ１３mp１８フアージベクタ
ー中にサブクローニングし、合成オリゴヌクレオチドプ
ローブをプライマーとして用いてＤＮＡ配列決定に付し
た。ゲノムＤＮＡのエンドヌクレアーゼBal３１による
系統的削除はポンツ等（Poncz et al.）（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.ＵＳＡ７９：４２９８−４３０２、１９８２
年）、グオ及びウ−（Guo & Wu）（Meth.in Enzymology
１００：６０−９６、１９８３年）により説明されてい
るのと実質的に同様にして行つた。約９５％のゲノムＤ
ＮＡ配列は２回以上決定され、５０％を越えるゲノム配
列は両方の鎖について決定された。この配列の一部はア
ンギオゲニンのコード化配列に対応した。ベクターλＨ
ＡＧ１は受入番号４０１９３としてアメリカン・タイプ
・カルチヤー・コレクシヨンに寄託されている。
なるヒトゲノムライブラリー〔マニアテイス等（Maniat
is et al.）、Cell１５：６８７−７０２、１９７８
年〕をニツクトランスレーシヨンにより放射標識化され
たクローンｐＨＡＧ１のｃＤＮＡ挿入でスクリーニング
を行つた〔リグビー等（Rigby et al.）、Ｊ．Mol.Bio
l.１１３：２３７−２５１、１９７７年〕。ベントン及
びデービス（Benton & Davis）の方法（Science１９
６：１８１−１８２、１９７７年）により同定されたλ
ＨＡＧ１と称される一つの強くハイブリダイズするフア
ージクローンをプラーク精製し、このフアージＤＮＡを
プレートリシス（platelysis）法（マニアテイス等、１
９８２年、前記）により単離した。このゲノムインサー
トは各種制限酵素で消化して分析した。このインサート
をPvuIIで消化して生成したＤＮＡ断片は大きさが約５
キロ塩基であり、ｃＤＮＡプローブに強くハイブリダイ
ズした。この断片をプラスミドｐＢＲ３２２中にサブク
ローニングし、Amershamのクローニング及び配列決定マ
ニユアルに説明されているような〔35S〕ｄＡＴＰαＳ
を用いてジデオキシ法によりＤＮＡ配列決定に付した
〔メツシング等（Messing et al.）、Nucleic Acids Re
s.９：３０９−３２１、１９８１年；ノランダー等（No
rrander et al.）、Gene２６：１０１−１０６、１９８
３年〕。このフアージゲノムインサートをKpnＩで消化
することにより生成したプローブに強くハイブリダイズ
した約３kbのＤＮＡ断片をＭ１３mp１８フアージベクタ
ー中にサブクローニングし、合成オリゴヌクレオチドプ
ローブをプライマーとして用いてＤＮＡ配列決定に付し
た。ゲノムＤＮＡのエンドヌクレアーゼBal３１による
系統的削除はポンツ等（Poncz et al.）（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.ＵＳＡ７９：４２９８−４３０２、１９８２
年）、グオ及びウ−（Guo & Wu）（Meth.in Enzymology
１００：６０−９６、１９８３年）により説明されてい
るのと実質的に同様にして行つた。約９５％のゲノムＤ
ＮＡ配列は２回以上決定され、５０％を越えるゲノム配
列は両方の鎖について決定された。この配列の一部はア
ンギオゲニンのコード化配列に対応した。ベクターλＨ
ＡＧ１は受入番号４０１９３としてアメリカン・タイプ
・カルチヤー・コレクシヨンに寄託されている。
アンギオゲニンに対する遺伝子は又λＨＡＧ１をPvuII
で消化することにより生成した約５キロベースのＤＮＡ
断片中にも見出された。このＤＮＡ断片はｐＢＲ３２２
中にサブクローニングされ、第２図の底部に示される計
画を用いてジデオキシ鎖停止方法によりＤＮＡ配列決定
に付された。ヒトアンギオゲニンに対する完全な遺伝子
の配列（第３図）はこの遺伝子が約８００個のヌクレオ
チドを含有し、遺伝子のコード化及び３′非コード化領
域において介在配列がないことを示した。しかしなが
ら、５′側面配置領域（flanking region）におけるイ
ントロンの可能性は最も大きいｃＤＮＡさえこの領域に
達しなかったので排除することはできない。
で消化することにより生成した約５キロベースのＤＮＡ
断片中にも見出された。このＤＮＡ断片はｐＢＲ３２２
中にサブクローニングされ、第２図の底部に示される計
画を用いてジデオキシ鎖停止方法によりＤＮＡ配列決定
に付された。ヒトアンギオゲニンに対する完全な遺伝子
の配列（第３図）はこの遺伝子が約８００個のヌクレオ
チドを含有し、遺伝子のコード化及び３′非コード化領
域において介在配列がないことを示した。しかしなが
ら、５′側面配置領域（flanking region）におけるイ
ントロンの可能性は最も大きいｃＤＮＡさえこの領域に
達しなかったので排除することはできない。
アンギオゲニンに対する遺伝子はその側面配置領域にお
いて、３個のＡｌｕ繰返し配列〔シユミツト及びジエリ
ネツク（Schmid & Jelinek）、Science ２１６：１０
６５−１０７０、１９８２年〕を含有する（第２図及び
第３図）。第一番目のＡｌｕ繰返しは遺伝子の隣接５′
側面配置領域に位置しているのに対し、第二番目は隣接
３′側面配置領域に存在した。これらの二つのＡｌｕ繰
返しは同一の反転配向にあつた。第三番目のＡｌｕ繰返
しは遺伝子の３′側面配置領域において第二のＡｌｕ配
列から約５００個のヌクレオチドの下流に位置し、３０
０個のヌクレオチド配列の３′末端上においてポリ
（Ａ）を有する典型的な配向状態にあつた。更に、各Ａ
ｌｕ繰返しは一対の短い直接繰返し配列が側面配置され
ていた。これらの３個のＡｌｕ繰返しに対するヌクレオ
チド配列はシユミツト及びジユリネツク（前記）のコン
センサスＡｌｕ配列に約８７％相同であつた。
いて、３個のＡｌｕ繰返し配列〔シユミツト及びジエリ
ネツク（Schmid & Jelinek）、Science ２１６：１０
６５−１０７０、１９８２年〕を含有する（第２図及び
第３図）。第一番目のＡｌｕ繰返しは遺伝子の隣接５′
側面配置領域に位置しているのに対し、第二番目は隣接
３′側面配置領域に存在した。これらの二つのＡｌｕ繰
返しは同一の反転配向にあつた。第三番目のＡｌｕ繰返
しは遺伝子の３′側面配置領域において第二のＡｌｕ配
列から約５００個のヌクレオチドの下流に位置し、３０
０個のヌクレオチド配列の３′末端上においてポリ
（Ａ）を有する典型的な配向状態にあつた。更に、各Ａ
ｌｕ繰返しは一対の短い直接繰返し配列が側面配置され
ていた。これらの３個のＡｌｕ繰返しに対するヌクレオ
チド配列はシユミツト及びジユリネツク（前記）のコン
センサスＡｌｕ配列に約８７％相同であつた。
仮のＴＡＴＡボツクス〔ゴールドバーグ、Ｍ．Ｌ．（Go
ld-berg、Ｍ．Ｌ．）、博士論文、スタンフオード大
学、１９７９年〕及び転写開始部位はそれぞれ−３２及
び＋１のヌクレオチドにおいて同定されたが、しかし、
隣接部においては潜在的ＣＡＡＴボツクスは見出されな
かつた。しかしながら、ＴＣＡＡＴの配列は提案された
ＴＡＴＡボツクスから約１９０ｂｐ上流であるヌクレオ
チド−２２５において同定された。３′末端におけるポ
リアデニル化即ちメツセンジヤーＲＮＡのプロセッシン
グに含まれる２個のＡＡＴＡＡＡ配列〔プラウドフツト
及びブラウンリー（Proudfoot & Brownlee)Nature ２
６３：２１１−２１４、１９７６年〕はヌクレオチド７
０５及び７０７において同定された。ｍＲＮＡのポリア
デニル化は第二のＡＡＴＡＡＡ配列の末端から２０ヌク
レオチド下流であるヌクレオチド７３１において生ず
る。３′末端におけるｍＲＮＡのポリアデニル化或いは
切断にも含まれる〔バーゲツト（Berget)Nature ３０
９：１７９−１８２、１９８４年〕ＣＡＣＴＧのコンセ
ンサス配列はヌクレオチド７４７から出発して存在し
た。交互のプリン及びピリミジンを有する３２個のヌク
レオチドの伸長はヌクレオチド１４１６から出発して見
出された。この配列は遺伝子における左手方向へリツク
ス構造即ちＺ−ＤＮＡに対する潜在的領域を与える〔リ
ツチ等（Rich et al.）Ann.Rev.Biochem.５３：７９１
−８４６、１９８４年〕。アンギオゲニンに対する遺伝
子の側面配置領域並びに相補的領域におけるコンピユー
タサーチは開放読取りフレームを示さなかつた。
ld-berg、Ｍ．Ｌ．）、博士論文、スタンフオード大
学、１９７９年〕及び転写開始部位はそれぞれ−３２及
び＋１のヌクレオチドにおいて同定されたが、しかし、
隣接部においては潜在的ＣＡＡＴボツクスは見出されな
かつた。しかしながら、ＴＣＡＡＴの配列は提案された
ＴＡＴＡボツクスから約１９０ｂｐ上流であるヌクレオ
チド−２２５において同定された。３′末端におけるポ
リアデニル化即ちメツセンジヤーＲＮＡのプロセッシン
グに含まれる２個のＡＡＴＡＡＡ配列〔プラウドフツト
及びブラウンリー（Proudfoot & Brownlee)Nature ２
６３：２１１−２１４、１９７６年〕はヌクレオチド７
０５及び７０７において同定された。ｍＲＮＡのポリア
デニル化は第二のＡＡＴＡＡＡ配列の末端から２０ヌク
レオチド下流であるヌクレオチド７３１において生ず
る。３′末端におけるｍＲＮＡのポリアデニル化或いは
切断にも含まれる〔バーゲツト（Berget)Nature ３０
９：１７９−１８２、１９８４年〕ＣＡＣＴＧのコンセ
ンサス配列はヌクレオチド７４７から出発して存在し
た。交互のプリン及びピリミジンを有する３２個のヌク
レオチドの伸長はヌクレオチド１４１６から出発して見
出された。この配列は遺伝子における左手方向へリツク
ス構造即ちＺ−ＤＮＡに対する潜在的領域を与える〔リ
ツチ等（Rich et al.）Ann.Rev.Biochem.５３：７９１
−８４６、１９８４年〕。アンギオゲニンに対する遺伝
子の側面配置領域並びに相補的領域におけるコンピユー
タサーチは開放読取りフレームを示さなかつた。
ヒトアンギオゲニンのアミノ酸配列はヒトリボヌクレア
ーゼと約３５％相同である。これらの二つのタンパク質
の構造は第４図において比較され、そこで共通残基は丸
で囲んである。直接タンパク質配列分析により決定され
たジスルフイド結合の位置は更にリボヌクレアーゼとの
相同性を強調する。
ーゼと約３５％相同である。これらの二つのタンパク質
の構造は第４図において比較され、そこで共通残基は丸
で囲んである。直接タンパク質配列分析により決定され
たジスルフイド結合の位置は更にリボヌクレアーゼとの
相同性を強調する。
実施例２：トランスフエクシヨンされた哺乳動物細胞に
おけるアンギオゲニンの製造 トランスフエクシヨンされた哺乳動物細胞において、ア
ンギオゲニンを発現するためにアンギオゲニンゲノムコ
ード化配列（ＨＡＧＦ）、マウスメタロチオネイン−１
（ＭＴ−１）プロモータ、及びＳＶ４０プロモータに連
結したＤＨＦＲ選択可能マーカーを含んでなる発現ベク
ターｐＨＡＧＦ−ＭＴ−ＤＨＦＲを造成した。
おけるアンギオゲニンの製造 トランスフエクシヨンされた哺乳動物細胞において、ア
ンギオゲニンを発現するためにアンギオゲニンゲノムコ
ード化配列（ＨＡＧＦ）、マウスメタロチオネイン−１
（ＭＴ−１）プロモータ、及びＳＶ４０プロモータに連
結したＤＨＦＲ選択可能マーカーを含んでなる発現ベク
ターｐＨＡＧＦ−ＭＴ−ＤＨＦＲを造成した。
第４図に示す如く、ＨＡＧＦインサートはPvuII断片と
してλＨＡＧ１から単離され、SmaIと線形化されたｐＢ
Ｒ３２２中に挿入された。得られたプラスミドを次いで
ＨＡＧＦ配列の５′未翻訳領域において切断するBglII
で消化した。このＤＮＡを次いでBal３１で消化して、
転写開始部位らヌクレオチド＋７における５′末端を有
するＨＡＧＦ配列を生成した。このＤＮＡを次いでBam
ＨＩで消化した。得られた断片末端をＤＮＡポリメラー
ゼＩ（クレノウ断片）を用いて平滑化し、ｐＢＲ３２２
及びＨＡＧＦコード化配列よりなる断片を0.7％アガロ
ースゲル上の電気泳動により精製した。このＤＮＡをゲ
ルから抽出し、再四形化した。得られたｐＢＲ３２２−
ＨＡＧＦと称されるプラスミドをＢａｍＨＩ及びＥｃｏ
ＲＩで消化し、アンギオゲニン配列よりなる−３ｋｂ断
片を0.7％アガロースゲル上で電気泳動により精製し
た。
してλＨＡＧ１から単離され、SmaIと線形化されたｐＢ
Ｒ３２２中に挿入された。得られたプラスミドを次いで
ＨＡＧＦ配列の５′未翻訳領域において切断するBglII
で消化した。このＤＮＡを次いでBal３１で消化して、
転写開始部位らヌクレオチド＋７における５′末端を有
するＨＡＧＦ配列を生成した。このＤＮＡを次いでBam
ＨＩで消化した。得られた断片末端をＤＮＡポリメラー
ゼＩ（クレノウ断片）を用いて平滑化し、ｐＢＲ３２２
及びＨＡＧＦコード化配列よりなる断片を0.7％アガロ
ースゲル上の電気泳動により精製した。このＤＮＡをゲ
ルから抽出し、再四形化した。得られたｐＢＲ３２２−
ＨＡＧＦと称されるプラスミドをＢａｍＨＩ及びＥｃｏ
ＲＩで消化し、アンギオゲニン配列よりなる−３ｋｂ断
片を0.7％アガロースゲル上で電気泳動により精製し
た。
最終発現ベクターを次いで次の様にして造成した。マウ
スメタロチオネイン（ＭＴ−１）プロモータ、ヒト第IX
因子コード化配列、ＳＶ４０プロモータ、及び修飾ＤＨ
ＦＲ遺伝子〔レビンソン等（Levinson et al.）、ヨー
ロツパ特許公開公報１１７，０６０号〕を含んでなるｐ
ＭＴＦIX〔クラチ及びパルミター（Kurachi and Polmit
er）、Thrombosis and Hemostasis ５４：２８２、１
９８５年〕をBam ＨＩ及びEco ＲＩで消化した（第４
図）。ｐＣＵ１３配列及びＳＶ４０−ＤＨＦＲ発現単位
を含んでなる断片をゲル精製した。この断片を次いでBa
m ＨＩ−Eco ＲＩ ＨＡＧＦ断片に連結した。得られ
たベクターをｐＨＡＧＦ−ＭＴ−ＤＨＦＲと命名した
（第４図）。
スメタロチオネイン（ＭＴ−１）プロモータ、ヒト第IX
因子コード化配列、ＳＶ４０プロモータ、及び修飾ＤＨ
ＦＲ遺伝子〔レビンソン等（Levinson et al.）、ヨー
ロツパ特許公開公報１１７，０６０号〕を含んでなるｐ
ＭＴＦIX〔クラチ及びパルミター（Kurachi and Polmit
er）、Thrombosis and Hemostasis ５４：２８２、１
９８５年〕をBam ＨＩ及びEco ＲＩで消化した（第４
図）。ｐＣＵ１３配列及びＳＶ４０−ＤＨＦＲ発現単位
を含んでなる断片をゲル精製した。この断片を次いでBa
m ＨＩ−Eco ＲＩ ＨＡＧＦ断片に連結した。得られ
たベクターをｐＨＡＧＦ−ＭＴ−ＤＨＦＲと命名した
（第４図）。
プラスミドｐＨＡＧＦ−ＭＴ−ＤＨＦＲを次いで赤子の
ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞中に標準的リン酸カルシ
ウム−媒介トランスフエクシヨン操作により移した。ベ
クターを含有する細胞を3.7ｇ／ ＮａＨＣＯ３、１
０％熱不活性化ウシ胎児血清及び抗生物質を補給したグ
ルコース及びグルタミンを含有するダルベツコーに変成
イーグル培地（Gibco）中において５％ＣＯ２中で３７
℃において増殖させた。プラスミドを含有する細胞を次
いで培養培地内においてＭＴＸの濃度を逐次増大させる
ことによりメトトレキセート（ＭＴＸ）耐性について選
択した。用いられたＭＴＸ濃度は１μＭ、１０μＭ、１
００μＭ及び１ｍＭであつた。１ｍＭ ＭＴＸの存在下
において生残つた細胞を次いで８０μＭＺｎＳＯ４ 、
２μＭ ＣｄＳＯ４、或いはこれらの二つの塩の混合物
を培養培地に添加することにより誘導した。
ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞中に標準的リン酸カルシ
ウム−媒介トランスフエクシヨン操作により移した。ベ
クターを含有する細胞を3.7ｇ／ ＮａＨＣＯ３、１
０％熱不活性化ウシ胎児血清及び抗生物質を補給したグ
ルコース及びグルタミンを含有するダルベツコーに変成
イーグル培地（Gibco）中において５％ＣＯ２中で３７
℃において増殖させた。プラスミドを含有する細胞を次
いで培養培地内においてＭＴＸの濃度を逐次増大させる
ことによりメトトレキセート（ＭＴＸ）耐性について選
択した。用いられたＭＴＸ濃度は１μＭ、１０μＭ、１
００μＭ及び１ｍＭであつた。１ｍＭ ＭＴＸの存在下
において生残つた細胞を次いで８０μＭＺｎＳＯ４ 、
２μＭ ＣｄＳＯ４、或いはこれらの二つの塩の混合物
を培養培地に添加することにより誘導した。
アンギオゲニンｍＲＮＡはダーナム及びパルミター（Du
rnam and Palmiter）により説明されたのと実質的に同
様にしてアツセイを行つた（Analyt.Biochem.１３１：
３８５−３９３、１９８３年）。約2.9kbインサート中
の全アンギオゲニン遺伝子を含有するＭ１３ｍｐ１８ク
ローンからのセンス鎖ＤＮＡを用いて標準曲線を作成し
た。アンギオゲニンのアミノ酸３５〜４１に対するコー
ド化配列に相補的なドデカオリゴヌクレオチドをその
５′末端において32Pで標識化し、溶液ハイブリダイゼ
ーシヨンにおけるプローブとして用いた。
rnam and Palmiter）により説明されたのと実質的に同
様にしてアツセイを行つた（Analyt.Biochem.１３１：
３８５−３９３、１９８３年）。約2.9kbインサート中
の全アンギオゲニン遺伝子を含有するＭ１３ｍｐ１８ク
ローンからのセンス鎖ＤＮＡを用いて標準曲線を作成し
た。アンギオゲニンのアミノ酸３５〜４１に対するコー
ド化配列に相補的なドデカオリゴヌクレオチドをその
５′末端において32Pで標識化し、溶液ハイブリダイゼ
ーシヨンにおけるプローブとして用いた。
メツセンジヤーＲＮＡレベルはＣｄ++誘導を用いると２
０倍を越えて上昇し、及びＺｎ++誘導に対しては１５倍
を越えた。
０倍を越えて上昇し、及びＺｎ++誘導に対しては１５倍
を越えた。
アンギオゲニンの存在を測定するために、誘導され、調
整された培地を酸性化し、凍結及び解凍し、遠心分離
し、及び上澄液を水に対して透析して凍結乾燥した。凍
結乾燥された物質を次いで0.1Ｍナトリウムリン酸緩衝
液ｐＨ6.6中に溶解し、及びそれに対して透析し、担体
としてリゾチームを補給した。透析された試料をＣＭ−
５２セルロースカラムにかけ、部分的に精製されたアン
ギオゲニンを１Ｍ ＮａＣｌを含有する同一緩衝液で溶
出した。溶出液をＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムにかけ、上
記と同様にして分別した。腫瘍−由来アンギオゲニンの
クロマトグラフイ及び電気泳動特性を有するタンパク質
が得られた。
整された培地を酸性化し、凍結及び解凍し、遠心分離
し、及び上澄液を水に対して透析して凍結乾燥した。凍
結乾燥された物質を次いで0.1Ｍナトリウムリン酸緩衝
液ｐＨ6.6中に溶解し、及びそれに対して透析し、担体
としてリゾチームを補給した。透析された試料をＣＭ−
５２セルロースカラムにかけ、部分的に精製されたアン
ギオゲニンを１Ｍ ＮａＣｌを含有する同一緩衝液で溶
出した。溶出液をＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムにかけ、上
記と同様にして分別した。腫瘍−由来アンギオゲニンの
クロマトグラフイ及び電気泳動特性を有するタンパク質
が得られた。
得られたタンパク質について、刊行された操作を用いて
ＣＡＭ法により脈管形成活性を測定した。
ＣＡＭ法により脈管形成活性を測定した。
実施例３：酵母におけるアンギオゲニンの製造 形質転換された酵母内でアンギオゲニンを発現するベク
ターは第６図に図示される。それは、酵母ＡＤＨIIプロ
モータ〔ヤング等（Young et al.）Genetic Engineerin
g of Microorganisms for Chemicals、Hollaeneler等編
ｐ．３３５、Plenum、ニユーヨーク、１９８２年〕、Ｍ
Ｆα１プレ−プロ配列の部分〔カージヤン及びヘルスコ
ビツツ（Kurjan and Herskowitz）、Cell ３０：９３
３−９４３、１９８２年〕、及びＨＡＧＦ配列よりなる
発現単位を含有する。
ターは第６図に図示される。それは、酵母ＡＤＨIIプロ
モータ〔ヤング等（Young et al.）Genetic Engineerin
g of Microorganisms for Chemicals、Hollaeneler等編
ｐ．３３５、Plenum、ニユーヨーク、１９８２年〕、Ｍ
Ｆα１プレ−プロ配列の部分〔カージヤン及びヘルスコ
ビツツ（Kurjan and Herskowitz）、Cell ３０：９３
３−９４３、１９８２年〕、及びＨＡＧＦ配列よりなる
発現単位を含有する。
ＡＤＨII遺伝子の一部は約１５３０ｂｐのSph I断片と
してプラスミドｐＡＤＲ２から得られる〔バイヤー及び
ヤング（Beier and Young）、Nature ３００：７２４
−７２８、１９８２年〕。この断面をＭ１３フアージベ
クター中にサブクローニングし、配列ＧＴＡ ＡＴＡ
ＣＡＣ ＡＧＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ＴＣＣ ＡＧＡ Ａ
Ａを有する突然変異誘発性プライマーを用いてゾラー等
（Zoller et al.）（Manual for Advanced Technigues
in Molecular Cloning Course、Cold Spring Harbor Lab
oratories、１９８３年）により説明されるのと実質的
に同様して突然変異誘発を行つた。突然変異誘発フアー
ジの複製形態はSphＩ及びEcoＲＩで消化し、及び約１７
６ｂｐの部分的ＡＤＨIIにプロモータ断片を精製した。
プロモータの上流部分を次いで約１７６ｂｐ断片、ＡＤ
ＨII（ｐＡＤＲ２から）の約１kb Bam ＨＩ−SphＩ断
片及びBamＨＩ＋EcoＲＩ切断ｐＵＣ１３を連結すること
により修復した。得られたプラスミドをｐＵＣＡＤＨ２
と命名した（第６図）。
してプラスミドｐＡＤＲ２から得られる〔バイヤー及び
ヤング（Beier and Young）、Nature ３００：７２４
−７２８、１９８２年〕。この断面をＭ１３フアージベ
クター中にサブクローニングし、配列ＧＴＡ ＡＴＡ
ＣＡＣ ＡＧＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ＴＣＣ ＡＧＡ Ａ
Ａを有する突然変異誘発性プライマーを用いてゾラー等
（Zoller et al.）（Manual for Advanced Technigues
in Molecular Cloning Course、Cold Spring Harbor Lab
oratories、１９８３年）により説明されるのと実質的
に同様して突然変異誘発を行つた。突然変異誘発フアー
ジの複製形態はSphＩ及びEcoＲＩで消化し、及び約１７
６ｂｐの部分的ＡＤＨIIにプロモータ断片を精製した。
プロモータの上流部分を次いで約１７６ｂｐ断片、ＡＤ
ＨII（ｐＡＤＲ２から）の約１kb Bam ＨＩ−SphＩ断
片及びBamＨＩ＋EcoＲＩ切断ｐＵＣ１３を連結すること
により修復した。得られたプラスミドをｐＵＣＡＤＨ２
と命名した（第６図）。
第５図を参照すると、ＭＦα１遺伝子をＹＥｐ１３〔ナ
スミス及びタツチエル（Nasmyth and Tatchell）Cell
１９：７５３−７６４、１９８０年〕のBamＨＩ部位に
クローン化され、matα２突然変異の相補により同定さ
れた部分的Sau３Ａ断片の酵母ゲノムライブラリーから
得られた。一つのその様なクローンをｐＺＡ２と命名す
る。ＭＦα′配列を−７１の位置においてHinfＩで切断
し、末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）を用
いて充填し、EcoＲＩリンカーを付加する。
スミス及びタツチエル（Nasmyth and Tatchell）Cell
１９：７５３−７６４、１９８０年〕のBamＨＩ部位に
クローン化され、matα２突然変異の相補により同定さ
れた部分的Sau３Ａ断片の酵母ゲノムライブラリーから
得られた。一つのその様なクローンをｐＺＡ２と命名す
る。ＭＦα′配列を−７１の位置においてHinfＩで切断
し、末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）を用
いて充填し、EcoＲＩリンカーを付加する。
シグナル配列を次いでEcoＲＩ-HindIII断片として単離
し、ｐＵＣ１２中にサブクローニングしてプラスミドｐ
ＵＣＰＰαＦを造成する。
し、ｐＵＣ１２中にサブクローニングしてプラスミドｐ
ＵＣＰＰαＦを造成する。
ＨＡＧＦコード化配列をλＨＡＧ１から１１１５ｂｐＡ
ｃｃＩ断片として単離する。この断片末端をＤＮＡポリ
メラーゼＩ（クレノウ断片）を用いて平滑化し、Hind I
IIリンカーを末端に付加する。得られた断片をHind III
及びEcoＲＶで消化し、約６６６ｂｐ断片をゲル精製す
る。SalＩリンカーをEcoＲＶ末端に連結し、断片するSa
lＩにより切断し、約６７４ｂｐの断片をゲル精製す
る。
ｃｃＩ断片として単離する。この断片末端をＤＮＡポリ
メラーゼＩ（クレノウ断片）を用いて平滑化し、Hind I
IIリンカーを末端に付加する。得られた断片をHind III
及びEcoＲＶで消化し、約６６６ｂｐ断片をゲル精製す
る。SalＩリンカーをEcoＲＶ末端に連結し、断片するSa
lＩにより切断し、約６７４ｂｐの断片をゲル精製す
る。
このＨＡＧＦ配列を次いでＭＦα１シグナル配列の一部
に連結する。プラスミドｐＵＣＰＰαＦをPstＩ及びＨ
ｉｎｄIIIで消化し、２３７ｂｐ断片を単離する。この
約６７４ｂｐ ＨＡＧＦ断片及び２３７ｂｐ ＭＦα１
断片をPstＩ＋SalＩ切断ｐＵＣ１３に連結する。得られ
た組換えプラスミドをPstＩ及びSalＩで消化し、約９１
１ｂｐ ＭＦα１−ＨＡＧＦ断片をゲル精製し、PstＩ
＋SalＩ切断Ｍ１３ｍｐ１０に挿入する（複製形態）。
ＭＦα１のLys-Argプロセス部位とアンギオゲニンの第
１アミノ酸の間の正確な連結は突然変異誘発性プライマ
ーＴＧＧ ＡＴＡ ＡＡＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＡＴＡ
ＡＣＴＣを用いて得られた組換えフアージのin vitroの
突然変異誘発により達成される。突然変異誘発フアージ
の複製形態はPstＩ及びSalＩで切断され約８８０ｂｐの
ＭＦα１−ＨＡＧＦ断片をゲル精製する。
に連結する。プラスミドｐＵＣＰＰαＦをPstＩ及びＨ
ｉｎｄIIIで消化し、２３７ｂｐ断片を単離する。この
約６７４ｂｐ ＨＡＧＦ断片及び２３７ｂｐ ＭＦα１
断片をPstＩ＋SalＩ切断ｐＵＣ１３に連結する。得られ
た組換えプラスミドをPstＩ及びSalＩで消化し、約９１
１ｂｐ ＭＦα１−ＨＡＧＦ断片をゲル精製し、PstＩ
＋SalＩ切断Ｍ１３ｍｐ１０に挿入する（複製形態）。
ＭＦα１のLys-Argプロセス部位とアンギオゲニンの第
１アミノ酸の間の正確な連結は突然変異誘発性プライマ
ーＴＧＧ ＡＴＡ ＡＡＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＡＴＡ
ＡＣＴＣを用いて得られた組換えフアージのin vitroの
突然変異誘発により達成される。突然変異誘発フアージ
の複製形態はPstＩ及びSalＩで切断され約８８０ｂｐの
ＭＦα１−ＨＡＧＦ断片をゲル精製する。
第６図を参照すると、ＡＤＨII−ＭＦα１−ＨＡＧＦ発
現単位が次いで組立てられる。プラスミドｐＵＣＡＤＨ
２をBamＨＩ及びEcoＲＩで切断し、約１２００ｂｐのＡ
ＤＨII断片がゲル精製される。プラスミドｐＵＣＰＰα
ＦをEcoＲＩ及びHind IIIで切断し、約３４０ｂｄＭＦ
α１断片をゲル精製する。これらの二つの断片をBamＨ
Ｉ＋Hind III切断ｐＵＣ１２に連結してｐＵＣＡＤＨＰ
Ｐを造成する。このプラスミドをBamＨＩ及びPstＩで消
化し、約１３００ｂｐＡＤＨII−ＭＦα１断片を精製す
る。この断片及び約８８０ｂｐのＭＦα１−ＨＡＧＦ断
片を次いで三重連結でBamＨＩ＋SalＩ切断ｐＵＣ１２に
連結する。得られたプラスミドをｐＵＣＡＭＡと命名す
る。
現単位が次いで組立てられる。プラスミドｐＵＣＡＤＨ
２をBamＨＩ及びEcoＲＩで切断し、約１２００ｂｐのＡ
ＤＨII断片がゲル精製される。プラスミドｐＵＣＰＰα
ＦをEcoＲＩ及びHind IIIで切断し、約３４０ｂｄＭＦ
α１断片をゲル精製する。これらの二つの断片をBamＨ
Ｉ＋Hind III切断ｐＵＣ１２に連結してｐＵＣＡＤＨＰ
Ｐを造成する。このプラスミドをBamＨＩ及びPstＩで消
化し、約１３００ｂｐＡＤＨII−ＭＦα１断片を精製す
る。この断片及び約８８０ｂｐのＭＦα１−ＨＡＧＦ断
片を次いで三重連結でBamＨＩ＋SalＩ切断ｐＵＣ１２に
連結する。得られたプラスミドをｐＵＣＡＭＡと命名す
る。
この酵母発現ベクターｐＹＡＧＦはｐＵＣＡＭＡからの
BamＨＩ−Hind III発現単位断片をBamＨＩ＋Hind III消
化ＹＥｐ１３に連結することにより造成した。
BamＨＩ−Hind III発現単位断片をBamＨＩ＋Hind III消
化ＹＥｐ１３に連結することにより造成した。
酵母細胞はｐＹＡＧＦにより形質転換され、常法により
培養された。アンギオゲニンは実質的に上記と同様にし
て細胞抽出物或いは培養培地から精製した。
培養された。アンギオゲニンは実質的に上記と同様にし
て細胞抽出物或いは培養培地から精製した。
以上の説明から、本発明の特別の実施態様が例示を目的
として説明されたが、各種修正が本発明の趣旨及び範囲
から離れることなくなされることが了解されるであろ
う。従つて、本発明は請求の範囲以外には限定されるも
のではない。
として説明されたが、各種修正が本発明の趣旨及び範囲
から離れることなくなされることが了解されるであろ
う。従つて、本発明は請求の範囲以外には限定されるも
のではない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (6)
- 【請求項１】脈管形成活性或はアンギオゲニンと実質的
に同一の生物学的活性を有するタンパク質をコード化す
る、下記に示すアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ： Gln1−Asp−Asn−Ser−Arg−Tyr−Thr−His−Phe−Leu
−Thr−Gln−His−Tyr−Asp15−Ala−Lys−Pro−Gln−G
ly−Arg−Asp−Asp−Arg−Tyr−Cys−Glu−Ser−Ile−M
et30−Arg−Arg−Arg−Gly−Leu−Thr−Ser−Pro−Cys
−Lys−Asp−Ile−Asn−Thr−Phe45−Ile−His−Gly−A
sn−Lys−Arg−Ser−Ile−Lys−Ala−Ile−Cys−Glu−A
sn−Lys60−Asn−Gly−Asn−Pro−His−Arg−Glu−Asn
−Leu−Arg−Ile−Ser−Lys−Ser−Ser75−Phe−Gln−V
al−Thr−Thr−Cys−Lys−Leu−His−Gly−Gly−Ser−P
ro−Trp−Pro90−Pro−Cys−Gln−Tyr−Arg−Ala−Thr
−Ala−Gly−Phe−Arg−Asn−Val−Val−Val105−Ala−
Cys−Glu−Asn−Gly−Leu−Pro−Val−His−Leu−Asp−
Gln−Ser−Ile−Phe120−Arg−Arg−Pro123−OH。 - 【請求項２】該配列をコード化するＤＮＡがｃＤＮＡで
ある請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】該配列をコード化するＤＮＡがゲノムＤＮ
Ａの断片である請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。 - 【請求項４】該タンパク質がそのアミノ末端にシグナル
ペプチドを包含する請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】ＴＡＴＡボックス配列及び転写開始部位を
包含する５′非−コード化領域を含む請求の範囲第１項
記載のＤＮＡ。 - 【請求項６】ポリアデニル化シグナルを包含する３′非
−コード化領域を含む請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US77065785A | 1985-08-28 | 1985-08-28 | |
| US06/778,547 US4721672A (en) | 1985-08-28 | 1985-09-20 | CDNA and gene for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression |
| US778547 | 1985-09-20 | ||
| PCT/US1986/000809 WO1987001372A1 (en) | 1985-08-28 | 1986-04-16 | cDNA AND GENE FOR HUMAN ANGIOGENIN (ANGIOGENESIS FACTOR) AND METHODS OF EXPRESSION |
| US778657 | 1997-01-03 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5098330A Division JPH0755156B2 (ja) | 1985-08-28 | 1993-04-02 | ヒトアンギオゲニン（脈管形成因子）のためのｃＤＮＡ及び遺伝子及び発現方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63501052A JPS63501052A (ja) | 1988-04-21 |
| JPH0638749B2 true JPH0638749B2 (ja) | 1994-05-25 |
Family
ID=27118341
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50244786A Expired - Lifetime JPH0638749B2 (ja) | 1985-08-28 | 1986-04-16 | ヒトアンギオゲニン（脈管形成因子）のためのｃｄｎａ及び遺伝子及び発現方法 |
| JP5098330A Expired - Lifetime JPH0755156B2 (ja) | 1985-08-28 | 1993-04-02 | ヒトアンギオゲニン（脈管形成因子）のためのｃＤＮＡ及び遺伝子及び発現方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5098330A Expired - Lifetime JPH0755156B2 (ja) | 1985-08-28 | 1993-04-02 | ヒトアンギオゲニン（脈管形成因子）のためのｃＤＮＡ及び遺伝子及び発現方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4721672A (ja) |
| EP (1) | EP0235162B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0638749B2 (ja) |
| AT (1) | ATE71632T1 (ja) |
| CA (1) | CA1316132C (ja) |
| DE (1) | DE3683482D1 (ja) |
| DK (1) | DK215287A (ja) |
| WO (1) | WO1987001372A1 (ja) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4721672A (en) * | 1985-08-28 | 1988-01-26 | President And Fellows Of Harvard College | CDNA and gene for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression |
| US4966849A (en) * | 1985-09-20 | 1990-10-30 | President And Fellows Of Harvard College | CDNA and genes for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression |
| FR2610324A1 (fr) * | 1987-01-29 | 1988-08-05 | Genetica Sa | Preparation par voie microbiologique de l'angiogenine humaine et conversion de l'enzyme ainsi obtenue en sa forme active |
| US4808402A (en) * | 1987-05-29 | 1989-02-28 | Northwestern University | Method and compositions for modulating neovascularization |
| US5008196A (en) * | 1987-08-21 | 1991-04-16 | Monsanto Company | Stimulation of endothelial cell growth |
| FR2623509B1 (fr) * | 1987-11-19 | 1990-04-20 | Centre Nat Rech Scient | Proteine de 17 kd a action angiogenique, son procede d'isolement a partir de lait de mammiferes, compositions therapeutiques la contenant, procede de detection et/ou de dosage et reactifs immunologiques de detection et de dosage des angiogenines de mammiferes, de leurs homologues et de leurs fragments |
| US4900673A (en) * | 1988-03-28 | 1990-02-13 | President And Fellows Of Harvard College | Mutant human angiogenin (angiogenesis factor with superior angiogenin activity) genes therefor and methods of expression |
| AU3863689A (en) * | 1988-06-22 | 1990-01-12 | Synergen, Inc. | Angiogenic potentiating peptides which potentiate angiogenic factors |
| US6899882B1 (en) | 1989-03-24 | 2005-05-31 | The Regents Of The University Of California | Endothelial cell growth factor methods of isolation and expression |
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