JPH10506276A

JPH10506276A - ヒト転写因子ｉｉａ

Info

Publication number: JPH10506276A
Application number: JP8510834A
Authority: JP
Inventors: ムーア，ポール・エイ; ローゼン，クレイグ・エイ
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-09-20
Filing date: 1994-09-20
Publication date: 1998-06-23
Also published as: WO1996009311A1; EP0783509A1; EP0783509A4; AU8071494A

Abstract

(57)【要約】ヒト転写因子IIＡの小さな(γ)サブユニット、およびそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ(ＲＮＡ)、およびそのようなポリペプチドを組換え技術により製造する方法。そのようなポリペプチドを、遺伝子に特異的な、および全体的な転写を調節するために利用する方法もまた開示する。そのようなポリペプチドに対するアンタゴニスト、および転写を阻害するための、それらの使用もまた開示する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト転写因子IIＡ本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関する。とりわけ、本発明のポリペプチドは、時として以下で、「小さなサブユニット」と呼ぶ、ヒト転写因子IIＡの小さな(γ)サブユニットである。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害することにも関する。原核生物では、精製ＲＮＡポリメラーゼ、プロモーターを有するテンプレート、ヌクレオシドトリフォスフェート、並びに適当な緩衝液および塩を単に混合するだけで、正しい部位で開始される、インビトロにおける特異的遺伝子転写を得るのに十分である。しかし、真核生物から得られる精製ＲＮＡポリメラーゼは、全く不十分に、また実質的には、アトランダムに転写を開始する。従って、真核生物での正確な転写の開始には、補助因子が必要とされる。これらの転写因子の中には、全てのプロモーターでの開始に必要とされる一般因子もあれば、遺伝子に特異的であって、あるプロモーターにのみ必要とされるものもある。一般因子のうち、転写因子IIＤ「ＴＦIIＤ」と呼ばれるタンパク質は、プロモーターにおけるＴＡＴＡ配列（ここで、Ｔはチミジンを示し、またＡはアデノシンを示す）に結合する。他の一般因子もまた、プロモーターでの多成分タンパク質複合体の構築に関与する。一般には、転写因子は２つの機能ドメインを含み、１つはＤＮＡ結合のための機能ドメインであり、１つは転写活性化のための機能ドメインであることが見い出されている。これらの機能は、それらの天然の環境(natural context)から除去された場合でも、それらの機能を保持する制限された構造ドメイン内に存することが多い。転写因子のＤＮＡ結合ドメインは、それらの一次アミノ酸配列に基づいて、幾つかの構造ファミリーに分かれる。遺伝子発現を制御する特異的ヌクレオチドを同定するために、コード領域に隣接する遺伝子の領域を配列決定し得る。これらの配列の比較により、様々な遺伝子の５'および３'末端付近に共通パターンが明らかになる。これらは、ＲＮＡポリメラーゼによる適切な転写に重要であると予想される。最も一般的なモチーフは、転写開始部位から約３０bp辺りのＴＡＴＡ配列である。他の保存配列は、転写開始部位の約５０〜１００bp上流に見い出されている。真核生物の転写活性化は、一般転写因子およびコアクチベーターと呼ばれる、幾つかのマルチプロテイン複合体の特徴付けを必要とする^1.2。異側性の(hetero meric)一般転写因子ＴＦIIＡは、ＴＡＴＡ結合タンパク質(ＴＢＰ)に直接結合し^3.4 、また転写活性化の過程に関係している^5-8。ＴＦIIＡのγサブユニットは、ＴＡＴＡ結合タンパク質に弱く結合するが、ＴＦIIＡの大きなサブユニット(α β)のＴＢＰへの結合を強く安定化する。組換えヒトＴＦIIＡは、少なくとも３つの異なったアクチベーターにより媒介される転写活性化に機能的である。αβ およびγサブユニットは両方とも、プロモーターＤＮＡへ結合することによるＴＦIIＤのアクチベーター依存性刺激に必須であり、従って、複合体形成開始前の第一段階を促進する。このことは、ＴＦIIＡが、アクチベーターにより調節される転写に重要な、進化的に保存された一般転写因子であることを実証する。ＴＦIIＡの一般転写因子IIＤ(ＴＦIIＤ)との相互作用は、転写活性化過程における律速段階であることが示されている⁵。ＴＦIIＡは、ＴＢＰ^3.4、マルチプロテインＴＦIIＤ複合体のＤＮＡ結合サブユニット¹²に直接結合する。転写の活性化に必須であるＴＢＰ関連因子(ＴＡＦ)^12-14もまた、ＴＦIIＡ−ＴＦIIＤ−プロモーター複合体のアクチベーター依存性刺激に必要とされる⁶。ＴＦIIＡは、調節されていない基礎転写において未知の機能を有するが¹⁵、ＴＦIIＡは、ＴＦ IIＤのインヒビターが転写を妨げないようにするという役割を担うと仮定されている^16-19。ＴＦIIＡ同族体は、酵母において同定されており^9.10、また２つのサブユニットをコードする遺伝子は、生存能力に必須である¹¹。ヒトＴＦIIＡは、３つのポリペプチド(α、β、γ)からなるが、２つの最も大きなサブユニットは、酵母ＴＦIIＡの大きなサブユニットに対して相同性を共有する単一遺伝子から得られる^7.20.21 。ヒトおよび酵母タンパク質は両方とも、ＴＢＰの進化的に保存されたドメインに結合して²²、ＴＦIIＤで再構築された転写を刺激するが、ＴＢＰで再構築された転写は刺激しない^17.19。本発明のポリペプチドは、ＴＦIIＡのγサブユニットとして推定的に同定された。この同定は、アミノ酸配列の相同性の結果として為された。本発明の一態様により、ＴＦIIＡの小さなサブユニットである新規成熟ポリペプチド、さらにはまた、そのフラグメント、アナログおよび誘導体を提供する。本発明のポリペプチドは、ヒト起源である。本発明の別の態様により、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)を提供する。本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチドを組換え技術により製造する方法を提供する。本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、治療目的に、例えば、遺伝子に特異的な、または全体的な転写を調節するために、またＴＦIIＤ複合体のリプレッサーを妨害するために利用する方法を提供する。本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提供する。本発明のまた別の態様により、そのようなポリペプチドの作用を阻害するために、例えば、望ましくない細胞の転写、例えば、悪性腫瘍を阻害するために使用することができる、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニストを提供する。本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。以下の図面は、本発明の態様を説明するものであって、請求の範囲により包含される本発明の範囲を限定しようとするものではない。第１(Ａ)図は、ヒトＴＦIIＡの小さなサブユニットのcＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。示した小さなサブユニットのポリペプチドは、成熟型のポリペプチドである。アミノ酸に関する標準的な１文字略号を使用する。第１(Ｂ)図は、ヒトＴＦIIＡの小さなサブユニットおよび酵母(ＴＯＡ２)ＴＦ IIＡの小さなサブユニットのアミノ酸組成の比較を説明する。第１(Ｃ)図は、ヒトＴＦIIＡサブユニットを示す模式図である。ＴＦIIＡは、２つの遺伝子、αβおよびγによりコードされる。αβタンパク質は、翻訳後にプロセッシングされて、各々、約３５および１９kＤaの２つのポリペプチド(α およびβ)となる。組換えαおよびβポリペプチドは、アミノ酸残基２５１に切断点をもって設計されたが、これは、天然に存在するタンパク質切断部位に正確には対応しないかもしれない。第２図は、組換えヒト、酵母およびヘテロロガスな(heterologous)ＴＦIIＡの機能活性を説明する。第２(Ａ)図は、ポリアクリルアミドゲルＥＭＳＡ(電気泳動移動度シフトアッセイ)により検出された、ＤＮＡに結合したＤ−Ａ複合体(ＴＦIIＡの小さなサブユニットのＴＢＰへの添加の結果として生ずる)の形成を説明する。各々のレーンの上に示したように、酵母ＴＢＰ１０ngの不存在下(−)または存在下(＋)、アデノウイルスＥ１ＢＴＡＴＡ因子を含む、２９bpのオリゴヌクレオチドプローブを、ＴＦIIＡの様々な調製物と共にインキュベートした。各々の反応において、組換えＴＦIIＡ約５０ngをインキュベートした。部分的に精製されたヒトＴＦIIＡ(hIIＡ、レーン３、４)、組換えヒトサブユニットの組合せ(αβ、α、β、γ、レーン６−１６)、酵母γをもつ組換え酵母αβ(hαβ ／yγ、レーン１９、２０)を各々のレーンの上に示す。第２(Ｂ)図は、エプスタイン−バールウイルスによりコードされるアクチベーター、Ｚta転写アクチベーターによる転写活性化の再構築におけるＴＦIIＡ活性の必要条件を説明する。転写反応物を、免疫親和性により精製されたＴＦIIＤ、組換えＴＦIIＢ、部分的に精製されたＲＮＡポリメラーゼII、ＴＦIIＥ、ＴＦII Ｆ、およびＺtaを含む(＋)、または含まない(−)ＵＳＡで再構築した。各々のレーンの上に示したように、様々なＴＦIIＡ調製物を反応物に加えた。左側の矢印は、正しく開始された転写を示す。第３(Ａ)図は、ＴＦIIＡサブユニットのＴＢＰとの相互作用を説明する。各々のレーンの上に示したように、³⁵Ｓで標識化されたＴＦIIＡ γ(レーン１−３ )、αβ(レーン４−６)、αβ＋γ(レーン７−９)、またはＴ３ルシフェラーゼ対照(レーン１０−１２)タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ上に固定化されたＧＳＴ(レーン２、５、８、１１)またはＧＳＴ−ＴＢＰ(レーン３、６、９、１２)と共にインキュベートした。インプットと記されたレーン（レーン１、４、７、１０)は、約２.５％の反応インプットを示す。第３(Ｂ)図は、ＴＦIIＡサブユニットの相互作用により、ＴＦIIＡ γの強い同型(homotypic)結合が明らかになることを説明する。³⁵Ｓで標識化されたＴＦI IＡ γ(レーン１−４)、αβ(レーン５−８)、ＴＢＰ(レーン９−１２)、またはＴ３ルシフェラーゼ(レーン１３−１６)を、グルタチオンセファロースビーズ上に固定されたＧＳＴ(レーン２、６、１０、１４)、ＧＳＴ−αβ(レーン３、７、１１、１５)、またはＧＳＴ−γ(レーン４、８、１２、１６)と共にインキュベートした。第４(Ａ)図は、組換えＴＦIIＡが、ＴＦIIＡが減損した(depleted)核抽出物において、３つの異なった活性化ドメインが機能する能力を回復させることを説明する。インビトロにおける転写反応において、転写アクチベータータンパク質Ｚ ta(レーン２、４、６、７、８、９)、ＧＡＬ４−ＡＨ(レーン１０、１２、１４)、またはＶＰ１６(レーン１６、１８、２０)を、未処理のヒーラー細胞核抽出物(レーン１、２、９、１０、１５、１６)と共に、またはＴＦIIＡが減損したヒーラー細胞核抽出物(レーン３−９、１１−１４、１７−２０）と共にインキュベートした。組換えＴＦIIＡ αβ＋γ(レーン５、６、１３、１４、１９、２０)、ＴＦIIＡ αβ(レーン７)、またはＴＦIIＡ γ(レーン８)５０ngを、減損した抽出物に補った。ＺtaおよびＧＡＬ４テンプレートに関して正しく開始されたプライマー伸長産物を各々、左側および右側の矢印で示す。第４(Ｂ)図は、部分的に精製された一般転写因子をもつ酸性アクチベーターによる転写活性化の再構築におけるＴＦIIＡの必要条件を説明する。転写反応物は、ＧＡＬ−ＡＨアクチベーターおよびＧ₅Ｅ１ＢＴＣＡＴテンプレートを使用したことを除き、実質的には、第２(Ｂ)図に記載した転写反応物と同じであった。第４(Ｃ)図は、組換えＴＦIIＡが、アクチベーターおよびＴＡＦ依存性ＴＦII Ｄプロモーター複合体を促進することを示す。免疫精製されたＴＦIIＤ(レーン３−１２)、Ｚta(偶数のレーン、および１３)、およびＺ７Ｅ４ＴＣＡＴプロモーターから得られる２５０bpのプローブをもつＤＮＡ結合反応物のＭgアガロースゲルＥＭＳＡ。Ｚta(２０ng)、組換えＴＦIIＡ(５０ng)、および０.１フットプリント法単位のＴＦIIＤを、約１fmoleの放射能標識化されたプロモーターＤＮＡと共に室温で１５分間インキュベートした。配列決定の不正確さが、ポリヌクレオチド配列を決定しようとする場合の共通の問題である。従って、第１Ａ図の配列は、幾つかの配列決定実験に基づいており、また配列決定の正確さは、少なくとも９７％であると考えられる。本発明の一態様により、第１Ａ図の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または１９９４年６月１０日にＡＴＣＣ寄託番号第７５８０９号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする、単離された核酸(ポリヌクレオチド)を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、Ｔ細胞ライブラリー中で発見された。それは、構造上、酵母(ＴＯＡ２)の小さなサブユニットに関係がある。それは、１０９個のアミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。そのタンパク質は、酵母ＴＯＡ２に対し、アミノ酸範囲(stretch)全体にわたり、４０％の同一性および５０％の類似性をもって、最も高い程度の相同性を示す。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖であるなら、コード鎖または非コード(アンチ−センス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、第１Ａ図に示すコード配列または寄託されたクローンのコード配列と同じであってよく、あるいは遺伝コードの重複または縮重の結果として、第１Ａ図のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なったコード配列であってもよい。第１Ａ図の成熟ポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、該ポリペプチドが細胞の外側に排出されない核タンパク質であることから、成熟ポリペプチドのコード配列のみが含まれる。従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付加的コードおよび／または非コード配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、第１Ａ図の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であり得る。従って、本発明には、第１Ａ図に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、第１Ａ図のポリペプチドまたは寄託されたクローンのc ＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体並びに付加および挿入変異体が含まれる。先に示したように、該ポリヌクレオチドは、第１Ａ図に示すコード配列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクローンのコード配列の天然に存在するアレル変異体であるコード配列を有し得る。当業界で知られているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コードされるポリペプチドの機能を実質的には変えない。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合には、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベクターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であってよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する( Ｗilson,Ｉ.ら、Ｃell、３７：７６７（１９８４）)。本発明はさらに、配列間に少なくとも５０％、また好ましくは７０％の同一性がある場合に、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、第１Ａ図のcＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードする。本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者への便宜として与えられるものであって、寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２下に要求されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際はいつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、または販売するには、実施許諾が必要であり、またそのような実施許諾は、ここでは付与されない。本発明はさらに、第１Ａ図の推定アミノ酸配列を有する、または寄託されたc ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する、ＴＦIIＡポリペプチドの小さなサブユニット、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。第１Ａ図のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」という用語は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、アナログには、プロプロテイン部分を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することができるプロプロテインが含まれる。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであってよく、好ましくは組換ポリペプチドである。第１Ａ図のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましくは、同型アミノ酸残基) で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものであってもよく、またはコードされたものでなくてもよいもの、(ii) １つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他の化合物と融合しているもの、または（iv）成熟ポリペプチドの精製に使用される、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。「単離された」という用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然に存在するなら、天然の環境)から除去されていることを意味する。例えば、生きている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分となり得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の部分ではないという点で、なお単離されている。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術による製造にも関する。宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトランスフォームされ、またはトランスフェクトされる)。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはＴＦIIＡ遺伝子を増幅するのに適するよう改変された従来の栄養培地で培養することができる。温度、pＨ等といったような培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを組換え技術により製造するのに使用することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含ませることができる。そのようなベクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベクターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思われる。発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現制御配列(プロモーター)に作動可能に結合し、mＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ.coli. lacまたはtrp、ファージラムダＰ_Lプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマイシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、トランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むのが好ましい。上記のような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを、適当な宿主をトランスフォームするために使用して、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる：Ｅ.coli、Ｓtreptomyc es 、Ｓalmonella typhimuriumといったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；ＤrosophilaおよびＳf９といったような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢow esメラノーマといったような動物細胞；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクターを含んでなる。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含んでなる。適当なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されている。以下のベクターを例として挙げる。細菌用：pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ− ９(Ｑiagen)、pbs、pＤ１０、ファージスクリプト(phagescript)、psiＸ１７４、pbluescript ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、pＮＨ４６Ａ(Ｓtratagene)；ptrc９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(Ｐharmacia)。真核生物用：pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ( Ｐharma cia)。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびtrpが含まれる。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン− Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲内である。さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行うことができる。（Ｄavis,Ｌ.、Ｄibner,Ｍ.、Ｂattey,Ｌ.、Ｂasic Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology（１９８６））。宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造するために、無細胞翻訳系もまた使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaborato ry Ｍanual，第２版、Ｃold Ｓpring Ｈarbor、ニューヨーク、（１９８９）により記載されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。例には、bp１００〜２７０の、複製開始点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。通例、組換え発現ベクターには、複製開始点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝子、並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガスな構造配列は、翻訳開始および終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリーダー配列と共に、適当な相(phase)で構築される。場合により、そのヘテロロガスな配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすることができる。細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。そのベクターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなるであろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主には、Ｅ.coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typhimurium、並びにＰseudomonas属、Ｓtreptomyces属、およびＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が含まれるが、他のものもまた、選択物質として使用することができる。代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニングベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ３７０１７)の遺伝要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、スウエーデン)およびＧＥＭ１(Ｐromega Ｂiotec、Ｍadison、ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。適当な宿主株をトランスフォーメーションして、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シフトまたは化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保持する。タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３：１７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeLaおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることができる。ＴＦIIＡの小さなサブユニットのポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製することができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成するのに使用することができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用することができる。本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、または原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって)組換え技術により製造することができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。出願人は、本発明における科学的推論を、いずれかの特定の理論に限定することを欲しないが、以下の手順は、全体としてのＴＦIIＡ、または特に小さな(γ) サブユニットの機能的態様の説明である。ＴＦIIＡ活性を、ポリアクリルアミドゲルＥＭＳＡで、ＴＡＴＡボックスを含むオリゴヌクレオチドプローブへのＴＢＰ結合の安定化に関して最初にアッセイした(第２Ａ図)。ＴＦIIＡの不存在下では、酵母ＴＢＰは、ＴＡＴＡボックスを含むオリゴヌクレオチドと安定な複合体を形成しない(レーン２)。部分的に精製されたヒトＴＦIIＡ(hIIＡ)のＴＢＰへの添加は、安定な複合体(Ｄ−Ａ)の形成を引き起こした(レーン４)。組換えαβ＋γもまた、安定なＤ−Ａ複合体を産生した(レーン６)。αβまたはγサブユニットが個別に添加される場合、ＴＢＰは、安定なＤ−Ａ複合体を形成しなかった(レーン８および１０)。天然のＴＦIIＡは、３つのポリペプチドとして存在することから、αβタンパク質は、２つの独立したサブユニットとして発現した(第１Ｃ図)。ＴＢＰ結合に関して、 α＋γには効果がなかった(レーン１２)が、β＋γには僅かに効果があった(レーン１４)。対照的に、α、βおよびγサブユニットの組合せ(αβ＋γ)は、ＴＢＰ結合の強い刺激を引き起こしたが、電気泳動移動度は、天然のヒトＴＦIIＡタンパク質と非常によく似ていた(レーン１６)。さらに、酵母γサブユニットもまた、ヒトαβサブユニットと混合した場合に、安定なＤ−Ａ複合体を形成することができたが、このことは、αβおよびγサブユニットの間の相互作用が進化的に保存されていることを示している(レーン２０)。Ｄ−Ａ複合体の電気泳動移動度は、ＴＦIIＡの様々なαβγ型により影響を受けたが、このことは、ＴＦIIＡが、結合した複合体において保持されていることを示唆している。様々なＴＦIIＡ複合体を、部分的に精製された一般転写因子、コアクチベーターＵＳＡ²⁵、およびエプスタイン−バールウイルスによりコードされるアクチベーター、Ｚta⁶で再構築された反応物における転写活性を支持する、それらの能力に関して分析した。γサブユニットは転写活性化に必須であり、またαおよび βサブユニットを、単一αβポリペプチドとして、または２つの異なったポリペプチド(α＋β)として補うことができた(第２Ｂ図)。全ての場合において、ＥＭＳＡにおけるＤ−Ａ複合体の形成は、Ｚtaによる転写活性化を支持するＴＦIIＡの能力と関連があった。放射能標識化されたαβ、γ、またはαβ＋γタンパク質を、グルタチオンアガロース上に固定化されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)またはＧＳＴ−ＴＢＰ融合タンパク質と相互作用する、それらの能力に関して試験した(第３Ａ図)。γサブユニットは、αβサブユニットがそうであったように(レーン６)、ＧＳＴ−ＴＢＰに弱くだが、特異的に結合した(レーン３)。重要なことには、αβ＋γサブユニットの組合せが、ＧＳＴ−ＴＢＰへの結合を著しく増大させた(レーン９)。ＧＳＴ−γおよびＧＳＴ−αβに結合する、放射能標識化されたＴＢＰの能力もまた試験した(第３Ｂ図)。ＴＢＰは、ＧＳＴ−αβタンパク質に結合したが、ＧＳＴ−γタンパク質とは相互作用しなかった(第３Ｂ図、レーン１１および１２)。γのＴＢＰへの結合に関する矛盾は、γのアミノ末端に融合したＧＳＴの立体障害の部分的結果であり得る。αβおよびγは両方とも、ＴＢＰと直接接触することが可能であるが、ヘテロダイマーは、明らかに、より高い親和性で結合する。 γのαβポリペプチドとの相互作用もまた、ＧＳＴ融合タンパク質結合アッセイにより試験した。放射能標識化されたγ、αβ、またはＴ３対照を、ＧＳＴ− γ、ＧＳＴ−αβ、またはＧＳＴ単独と共にインキュベートした(第３Ｂ図)。予期されるように、αβサブユニットはＧＳＴ−γに結合し、またγサブユニットはＧＳＴ−αβに結合した。γサブユニットはまた、ＧＳＴ−γにも強く結合したが、αβはＧＳＴ−αβを結合せず、このことは、γサブユニットの同型会合 (association)がＴＦIIＡのオリゴマー化状態の原因となることを示唆している。Ｔ３対照タンパク質は、試験した、いずれのＧＳＴタンパク質とも相互作用しなかった。ＴＦIIＡが、Ｚtaとは異なるアクチベーターによる転写活性化に必要とされるかどうかを決定するために、酸性アクチベーターＧＡＬ４−ＡＨ²⁶およびヘルペスウイルスから得られるアクチベーターＧＡＬ４−ＶＰ１６²⁷によるＴＦIIＡの必要性を試験した。Ｚtaは、ＡＨと同様、酸性アクチベーターではなく、またＶＰ１６活性化モジュールに対する明らかな相同性は共有していない。ＴＦIIＡが減損したヒーラー細胞核抽出物を、ＴＦIIＡのαβサブユニットに特異的に結合するニッケルアガロースで連続的に通すことにより調製した^7.20。Ｚtaの、減損した抽出物への添加は、有意な転写レベルをもたらさなかった(第３Ａ図、レーン４)。ＴＦIIＡ αβ＋γサブユニットの添加は、減損した抽出物の活性化を、減損していない抽出物において観察されるレベルまで回復させた(レーン２および６を比較する)。αβまたはγサブユニット単独では、これらの減損した抽出物におけるＺta活性化を回復させることができなかったが、このことは、両方のサブユニットがニッケルアガロースにより等しく減損されたことを示している。同様に、ＧＡＬ４−ＡＨ(レーン９−１４)およびＧＡＬ４−ＶＰ１６(レーン１５−２０)は、ＴＦIIＡが減損した抽出物において機能しなかった。組換えα β＋γサブユニットの添加は、全ての３つの異なったアクチベーターについてアクチベーター依存性転写を回復させた。ＧＡＬ４−ＡＨはまた、Ｚtaがそうであったように(第２Ｂ図)、再構築された転写アッセイにおいて、ＴＦIIＡを必要とすることも示した(第４Ｂ図)。これらの結果は、両方の粗製の核抽出物において、さらにはまた、より精製された再構築システムにおいて、異なった活性化ドメインが転写の活性化にＴＦIIＡを必要とすることを示す。部分的に精製されたＴＦIIＡは、プロモーターＤＮＡに結合するＴＦIIＤの活性化ドメイン刺激に必要とされる⁶。ＭgアガロースゲルＥＭＳＡを利用することにより、この機能において、組換えＴＦIIＡが、部分的に精製されたＴＦIIＡの代わりをすることが見い出された(第４Ｃ図)。ＴＦIIＡの不存在下では、Ｚtaは、ＴＦIIＤ−ＤＮＡ複合体の形成を刺激しない(第４Ｃ図、レーン４)。しかし、部分的に精製されたＴＦIIＡ(レーン６)、またはαβ＋γ(レーン１２)の添加であって、αβもしくはγ単独(レーン７−１０)ではない添加は、プロモータ −ＤＮＡに結合するＴＦIIＤのＺta刺激を可能とする。これらの結果は、ＴＦII ＡがアクチベーターおよびＴＦIIＤの間の相互作用を媒介し、このことが、プロモーターＤＮＡに対するＴＦIIＤの親和性の増大を引き起こすことを実証する。ヒトＴＦIIＡのγサブユニットの単離は、インビトロにおける転写の活性化の再構築での、高度に精製されたＴＦIIＡの必要条件に関して試験すること可能とした。幾つかの異なった活性化ドメインは、それらの能力が機能するために、ＴＦIIＡを必要とする。組換えヒトγサブユニットはまた、インビトロにおける転写およびＴＢＰ結合アッセイで、機能上、相互交換できることも示された。ＴＦIIＡの小さなサブユニットのポリペプチドは、ＴＦIIＤのインヒビターが転写を妨げないようにするのに使用することができ、このことは、ある特定の遺伝子産物が望ましく、またＴＦIIＤ複合体の阻害により所望のレベルで産生されることのない場合に有用である。最も重要なことには、ＴＦIIＡの小さなサブユニットのポリペプチドは、所望の濃度の特定のタンパク質を得るために、転写を全体的に、または遺伝子に特異的な方法で調節するのに使用することができる。例えば、悪性腫瘍の場合には、ＴＦIIＡの小さなサブユニットを抑制して転写を防いでもよく、またタンパク質、例えば、成長ホルモンが望ましい場合には、ＴＦIIＡの小さなサブユニットは、遺伝子産物の転写および産生を高めることができる。本発明のポリペプチドはまた、同様の生物学的活性を有する他の分子を同定するのにも有用である。このことに関するスクリーニングの例は、既知のＤＮＡ配列を使用してオリゴヌクレオチドプローブを合成することにより、ＴＦIIＡ遺伝子の小さなサブユニットのコード領域を単離することである。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを、ヒトのcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはmＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするために使用して、ライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定する。本発明は、ＴＦIIＡの小さなサブユニットの、ＴＦIIＤとの相互作用を高める (アゴニスト)、またはブロックする(アンタゴニスト)化合物を同定するために、化合物をスクリーニングする方法を提供する。アゴニストは、ＴＦIIＡの小さなサブユニットの天然の生物学的機能を増大させる化合物であり、一方、アンタゴニストは、そのような機能を排除する。例として、転写が通常行われるであろう条件の下、精製ＲＮＡポリメラーゼ、プロモーターを有するテンプレート、ヌクレオシドトリフォスフェート、並びに適当な緩衝液および塩を、該化合物の存在下に、ＴＦIIＡおよびＴＦIIＤと混合することができる。次いで、ＴＦIIＡのテンプレートＤＮＡへの結合を高める、またはブロックする、その化合物の能力は、転写産物のレベルを測定することにより決定することができるであろう。あるいはまた、そのアッセイは、ＴＦIIＡ誘導性プロモーターがマーカー遺伝子の発現を駆動する、細胞に基づいたアッセイであり得る。次いで、ＴＦIIＡおよびスクリーニングすべき化合物を加えて、マーカー遺伝子の産生レベルを測定する。さらに、この細胞に基づいたアッセイは、転写に対する作用がＴＦIIＡアゴニズムまたはアンタゴニズムに特異的であるかどうかを決定するために、結合アッセイと並行して使用することができる。可能性のあるアンタゴニストには、抗体、また幾つかの場合には、ＴＦIIＡの小さなサブユニットに結合するオリゴヌクレオチドが含まれる。あるいはまた、可能性のあるアンタゴニストは、ＴＦIIＤ複合体のＴＢＰタンパク質に結合するが、転写は開始しない、密接に関係するタンパク質であり得る。そのような密接に関係するタンパク質の一例は、ＴＦIIＡの２つのサブユニットが突然変異して、機能を保持していない、負の(negative)優性突然変異体である。しかし、その負の優性突然変異体は、それでもなお基質を認識するが、転写は開始しない。別の可能性のあるアンタゴニストは、アンチセンス技術を利用して製造されたアンチセンス構築物である。アンチセンス技術を利用して、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の５’ コード部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるよう設計し(三重らせん−Ｌeeら、Ｎucl.Ａcids Ｒes. 、６：３０７３（１９７９）；Ｃooneyら、Ｓcience、２４１：４５６（１９８８）；およびＤervanら、Ｓcience、２５１：１３６０（１９９１）を参照)、そのことによって、転写およびＴＦIIＡの小さなサブユニットの産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてmＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮＡ分子の、ＴＦIIＡの小さなサブユニットへの翻訳をブロックする(アンチセンス−Ｏkano、Ｊ.Ｎeurochem.、５６：５６０（１９９１）；Ｏligodeoxynucleotides as Ａntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxpression、ＣＲＣＰress、Ｂoca Ｒaton、ＦＬ（１９８８）)。上記のオリゴヌクレオチドを細胞に送り込んで、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボにおいて発現させて、ＴＦIIＡの小さなサブユニットの産生を阻害することもできる。可能性のあるアンタゴニストには、ポリペプチドの活性部位に結合して占有し、そのため、ＴＦIIＡがＴＦIIＤを活性化して転写を開始することができない小さな分子が含まれる。小さな分子の例には、これらに限定されるものではないが、小さなペプチドまたはペプチド様分子が含まれる。該アンタゴニストは、望ましくないポリペプチドの転写を阻害するのに使用することができる。例えば、ある特定のポリペプチドが、ある望ましくない状態をもたらす場合には、上述のアンタゴニストを使用して、そのポリペプチドの転写を妨げることができる。この一例は、癌細胞の転写および分化である。該アンタゴニストはまた、薬学上許容され得る担体、例えば、以下に記載するような担体と共に、組成物中で使用することもできる。本発明のポリペプチドは、適当な薬学的担体と組み合わせて使用することができる。そのような組成物は、治療上有効な量のポリペプチド、および薬学上許容され得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体には、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適合すべきである。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療化合物と共に使用することができる。該医薬組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったような、便利な方法で投与することができる。該医薬組成物は、具体的な徴候を治療および／または予防するのに有効な量で投与される。一般に、それらは、少なくとも約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場合、それらは、１日当り約８mg／kg(体重)を超えない量で投与されるであろう。最も多くの場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０μg／k g〜約１mg／kg(体重)である。ＴＦIIＡの小さなサブユニットのポリペプチド、並びにポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストはまた、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリペプチドのインビボにおける発現により、本発明に従って使用することもできる。従って、例えば、患者由来の細胞を、エクスビボにおいて、あるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当業界で周知である。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用によって、細胞を当業界で既知の方法により操作することができる。同様に、例えば、当業界で既知の方法により、ポリペプチドのインビボにおける発現のために、細胞をインビボにおいて操作することができる。当業界で知られているように、細胞をインビボにおいて処理して、ポリペプチドをインビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投与することができる。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために使用することができるアデノウイルスであってもよい。完全な長さのＴＦIIＡの小さなサブユニット遺伝子のフラグメントは、完全な長さのＴＦIIＡの小さなサブユニット遺伝子を単離するために、またその遺伝子に対して高い配列類似性を有する他の遺伝子を単離するために、cＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。この種類のプローブは、例えば、３０、４０、５０、７５、９０、１００、または１５０塩基であり得る。しかし、好ましくは、該プローブは、３０〜５０の間の塩基対を有する。該プローブはまた、完全な長さの転写物に対応するcＤＮＡクローン、並びに調節およびプロモーター領域、エキソン、およびイントロンが含まれる完全な遺伝子を含むゲノムクローンを同定するのに使用することもできる。該プローブは、ハイブリダイゼーションの同定を容易にするために、例えば、放射能により標識化するのがよい。本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせることができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気と関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー(好ましくは、１５−２５bp) を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。cＤＮＡのコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上のエクソンをスパン(s pan)しないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものとする。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、それらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるであろう。体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いての本発明を利用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプール由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達成することができる。その染色体へマップするのに同様に利用することができる他のマッピング方法には、in situ ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションが含まれる。 cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができる。この技術は、５００または６００塩基という短いcＤＮＡで利用することができる；しかし、２,０００bpより大きいクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度を有する独自の染色体位置へ結合する可能性が高い。ＦＩＳＨは、ＥＳＴが得られるクローンの使用を必要とし、また長ければ長いほどよい。例えば、２,０００bpが良好であり、４,０００はより良好であって、４,０００以上は、恐らく、良好な結果を妥当な時間割合で得るのに必要ない。この技術の復習には、Ｖermaら、Ｈuman Ｃhromosomes：a Ｍanual of Ｂasic Ｔechniques、Ｐerga mon Ｐress、ニューヨーク（１９８８）を参照。ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例えば、Ｖ.ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan(Ｊohns Ｈopkins Ｕniv ersity Ｗelch Ｍedical Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出される。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を結合分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。次に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまたは全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、その変異は疾患の原因となるものであるらしい。現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピングの分析から、疾患と関連する染色体領域に正確に局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子を仮定する）。ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫源として使用して、それらに対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造に使用することができる。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒトでない動物に投与することにより得ることができる。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用することができる。次いで、そのような抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離することができる。モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術(Ｋo hlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５６:４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmmun ology Ｔoday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃoleら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃ ancer Ｔherapy、Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.、７７−９６頁において)が含まれる。単鎖抗体の産生に関して記載されている技術(米国特許第４,９４６,７７８号) は、本発明の免疫原性ポリペプチド産生物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し得る。本発明をさらに、以下の実施例に関して記載する；しかし、本発明は、そのような実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にことわらない限り、重量単位である。以下の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および／または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されていて、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入手可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラスミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろう。ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているように使用した。分析目的には、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮＡ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変えることができる。消化後、Ｓambrookら、Ｍolecular Ｃloning：Ａ laboratory Ｍan ual、第２版、Ｃold Ｓpring Ｈarbor、ニューヨーク（１９８９）に記載されているように、その反応物をポリアクリルアミドゲル(またはアガロースゲル)で直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離する。「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す。そのような合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートするであろう。「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過程をいう(Ｍaniatis,Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０．５μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。特にことわらない限り、トランスフォーメーションは、Ｇraham,Ｆ.およびＶa n der Ｅb,Ａ.、Ｖirology、５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載されているようにして行った。実施例１小さなＴＦIIＡのサブユニットの細菌発現および精製最初に、小さなＴＦIIＡのサブユニットをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第７５８０９号を、プロセシングされたＴＦIIＡのサブユニットタンパク質の５' および配列、並びにＴＦIIＡ遺伝子の小さなサブユニットの３'側のベクター配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅する。ＴＦII Ａの小さなサブユニットに対応する付加的ヌクレオチドを各々、５'および３'配列に付加した。γサブユニットの場合、５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列：を有し、ＢamＨＩ制限酵素部位、続いて、プロセシングされたタンパク質コドンの推定される末端アミノ酸から始まる１８ヌクレオチドのＴＦIIＡ(下線部)コード配列の小さなサブユニットを含む。３'配列：は、ＨindIII部位に対する相補的配列、続いて、１３ヌクレオチドのＴＦIIＡ( 下線部)の小さなサブユニットを含む。その制限酵素部位は、細菌発現ベクターp ＱＥ−９(Ｑiagen,Ｉnc．９２５９Ｅton Ａve.、Ｃhatsworth、ＣＡ９１３１１)上の制限酵素部位に対応する。pＱＥ−９は、抗生物質耐性(Ａmp^r)、細菌の複製開始点(ori)、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーターオペレーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵素部位をコードする。次いで、pＱＥ−９をＢamＨＩおよびＨindIIIで消化した。増幅された配列をpＱＥ−９にライゲートして、アミノ末端に融合した６つのＨis残基と共に枠内に挿入した。次いで、そのライゲーション混合物を使用して、Ｓambrook,Ｊ.ら、Ｍo lecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐre ss（１９８９）に記載されている手順により、Ｑiagenから商標Ｍ１５／rep４で入手可能なＥ.coli.株をトランスフォームした。Ｍ１５／rep４はプラスミドp ＲＥＰ４の多重コピーを含み、これは、lacＩリプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性(Ｋan^r)も与える。トランスフォーマントを、それらがＬＢプレートで増殖する能力により同定して、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離して、制限分析により確認した。所望の構築物を含むコロニーを、Ａmp(１００ug／ml)とＫan(２５ug／ml)の両方を補ったＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させた(Ｏ／Ｎ)。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物を１：１００〜１：２５０の割合で播種した。細胞が、０.４〜０.６の光学密度６００(Ｏ.Ｄ.⁶⁰⁰)まで増殖した。次いで、ＩＰＴＧ(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」)を、最終濃度が１mＭとなるまで加えた。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性化することにより、Ｐ／Ｏのクリアリングを誘導し、遺伝子発現を増加させる。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により収集した。細胞ペレットをカオトロピック剤である６モルのグアニジンＨＣl中で可溶化した。清澄後、この溶液から、６−ヒスチジンタグを含むタンパク質による強固な結合を可能にする条件下、ニッケル−アガロースカラムでのクロマトグラフィーにより、可溶化したＴＦIIＡのサブユニットを精製した(Ｈochuli,Ｅ.ら、Ｊ.Ｃhromatography ４１１：１７７−１８４（１９８４）)。６モルのグアニジンＨＣl(pＨ５.０)中、ＴＦIIＡの小さなサブユニット(純度９５％)をカラムから溶出させ、指定されたタンパク質と化学量論的に組合せて、それら自体により再生すること可能にした(第２図参照)。図に示すように、ゲル移動度シフトアッセイを利用して、転写産物を分離した。実施例２ＴＦIIＡの小さなサブユニットの、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはＧＳＴ−ＴＢＰ融合タンパク質との相互作用ＧＳＴまたはＧＳＴ融合タンパク質の細菌抽出物を、グルタチオンセファロース−４Ｂビーズ(ＧＳＴ融合タンパク質６−９μg／ビーズ２０μl)と共に振盪しながら４℃でインキュベートした。２時間後、そのビーズを冷緩衝液Ａ(２０mＭＮaＨ₂ＰＯ₄(pＨ７.０)、１５０mＭＮaＣl、１mＭＤＴＴ、１mＭＰＭＳＦ) ５０カラム体積で洗浄した。次いで、洗浄したビーズ(２０μl)を、タンパク質結合緩衝液(ＰＢＢ)３００μl中、２×１０⁴cpmの³⁵Ｓで標識化されたタンパク質を含む網状赤血球ライゼートと共に室温で１時間インキュベートした。ＰＢＢは、２０mＭＨepes(pＨ７.９)、２０％グリセロール、０.５mＭＥＤＴＡ、６０mＭＫＣl、５mＭＭgＣl₂、０.１％ＮＰ４０、および５mＭ β−メルカプトエタノールを含んでいた。続いて、そのビーズをＰＢＢ中で４回洗浄して、標識化タンパク質を１ＭＫＣlで溶出させた。試料を１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、サリチル酸ナトリウムで高めて(enhanced)、オートラジオグラフィーにより視覚化した。実施例３ＴＦIIＡを利用する転写反応転写反応物は、最終反応体積５０μl中、Ｚ７Ｅ４ＴＣＡＴ²⁹またはＧ５Ｅ１ＢＴＣＡＴ²⁶テンプレート１００ng、アクチベータータンパク質約２００ng、および核抽出物４０μgを含んでいた。５００mＭＫＣlを含む、２０mＭＨepes(p Ｈ７.９)、２０％グリセロール、５mＭ β−メルカプトエタノール、１mＭＰＭＳＦ中の緩衝液Ｄ中、ヒーラー細胞核抽出物を透析した後、ニッケルアガロースビーズ(充填ビーズ１５０ul／核抽出物１mg)と共に２回続けてインキュベーションすることにより、ＴＦIIＡが減損した核抽出物を調製した。減損した抽出物を、１００mＭＫＣlを含むＤ緩衝液中に透析した。再構築された転写反応物およびＭgアガロースＥＭＳＡは、先に記載した。先の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、後記する請求の範囲内で、特に記載した以外の方法で、本発明を行うことができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年４月１１日【補正内容】のレーンの上に示したように、³⁵Ｓで標識化されたＴＦIIＡ γ(レーン１−３) 、αβ(レーン４−６)、αβ＋γ(レーン７−９)、またはＴ３ルシフェラーゼ対照(レーン１０−１２)タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ上に固定化されたＧＳＴ(レーン２、５、８、１１)またはＧＳＴ−ＴＢＰ(レーン３、６、９、１２)と共にインキュベートした。インプットと記されたレーン( レーン１、４、７、１０)は、約２.５％の反応インプットを示す。第３(Ｂ)図は、ＴＦIIＡサブユニットが活性化ドメインに依存的な方法でＺta に結合することを説明する。Ｚta、ΔＺta、ＴＦIIＡ αβまたはγの精製ＧＳＴ融合タンパク質(先に示した)を、インビトロにおいて翻訳された、³⁵Ｓで標識化されたγ(上段のパネル)、αβ(中段のパネル)、またはルシフェラーゼ対照( Ｌuc；下段のパネル)と共にインキュベートした。(レーン１)５％のインプットされた標識化タンパク質。第４(Ａ)図は、組換えＴＦIIＡが、ＴＦIIＡが減損した(depleted)核抽出物において、転写の活性化を回復させることを説明する。インビボにおける転写反応において、アクチベータ−タンパク質ＧＡＬ４−ＡＨ、ＧＡＬ４−ＶＰ１６、ＧＡＬ４−ＣＴＦ、およびＺtaを、(＋)で示したように、未処理のヒーラー細胞核抽出物(４０ug；レーン１、２)と共に、またはＴＦIIＡが減損したヒーラー細胞核抽出物(４０ug；レーン３−１０)と共にインキュベートした。最終濃度の０.２umの組換えαβ＋γ(レーン５、６)、αβ(レーン７)、γ(レーン８)、または２.４ugの部分的に精製されたhIIＡ(ＤＥ−IIＡ)(レーン９、１０)を、減損した抽出物に補った。プライマー伸長産物に対するアクチベーターを、各々のパネルの左側に示す。第４(Ｂ)図は、部分的に精製された一般転写因子をもつ酸性アクチベーターによる転写活性化の再構築におけるＴＦIIＡの必要条件を説明する。転写反応物は、ＧＡＬ−ＡＨアクチベーターおよびＧ₅Ｅ１ＢＴＣＡＴテンプレートを使用したことを除き、実質的には、第２(Ｂ)図に記載した転写反応物と同じであった。イにより試験した。放射能標識化されたγ、αβ、またはＴ３対照を、ＧＳＴ− γ、ＧＳＴ−αβ、またはＧＳＴ単独と共にインキュベートした(第３Ｂ図)。予期されるように、αβサブユニットはＧＳＴ−γに結合し、またγサブユニットはＧＳＴ−αβに結合した。γサブユニットはまた、ＧＳＴ−γにも強く結合したが、αβはＧＳＴ−αβを結合せず、このことは、γサブユニットの同型会合 (association)がＴＦIIＡのオリゴマー化状態の原因となることを示唆している。Ｔ３対照タンパク質は、試験した、いずれのＧＳＴタンパク質とも相互作用しなかった。ＴＦIIＡが、Ｚtaとは異なるアクチベーターによる転写活性化に必要とされるかどうかを決定するために、酸性アクチベーターＧＡＬ４−ＡＨ²⁶およびヘルペスウイルスから得られるアクチベーターＧＡＬ４−ＶＰ１６²⁷によるＴＦII Ａの必要性を試験した。Ｚtaは、ＡＨと同様、酸性アクチベーターではなく、またＶＰ１６活性化モジュールに対する明らかな相同性は共有していない。ＴＦII Ａが減損したヒーラー細胞核抽出物を、ＴＦIIＡのαβサブユニットに特異的に結合するニッケルアガロースで連続的に通すことより調製した^7.20。ＧＡＬ４− ＡＨ、ＧＡＬ４−ＶＰ１６、ＧＡＬ４−ＣＴＦまたはＺtaの、減損した抽出物への添加は、有意な転写レベルをもたらさなかった(第４Ａ図、各々のアクチベーターに関する各々のパネルのレーン４)。αβまたはγサブユニット単独では、これらの減損した抽出物についてのＧＡＬ４−ＡＨまたはＧＡＬ４−ＶＰ１６活性化を回復させることができなかったが、このことは、両方のサブユニットがニッケルアガロースにより等しく減損されたことを示している。しかし、両方の組換えサブユニットの添加は、全ての４つの異なったアクチベーターについてのアクチベーター依存性転写を回復させた(第４Ａ図、各々のアクチベーターに関するレーン６)。組換えαβ＋γサブユニットの添加は、全ての３つの異なったアクチベーターについてのアクチベーター依存性転写を回復させた。ＧＡＬ４−ＡＨはまた、Ｚtaがそうであったように(第２Ｂ図)、再構築された転写アッセイにおいて、ＴＦIIＡを必要とすることも示した(第４Ｂ図)。これらの結果は、両方の粗製の核抽出物において、さらにはまた、より精製された再構築システムにおいて、異なった活性化【図３】【図４】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＤＵＣ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＤ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）第１Ａ図の推定アミノ酸配列を有する小さなサブユニットのポリペプチド、または該ポリペプチドのフラグメント、アナログもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド；および（ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５８０９号に含まれるcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する小さなサブユニットのポリペプチド、または該ポリペプチドのフラグメント、アナログもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド；よりなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチド。２．ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．該ポリヌクレオチドが、第１Ａ図の推定アミノ酸配列を有する小さなサブユニットをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。６．該ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ寄託番号第７５８０９号のcＤＮＡによりコードされる小さなサブユニットのポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。７．第１Ａ図に示す小さなサブユニットのコード配列を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。８．ＡＴＣＣ寄託番号第７５８０９号として寄託された小さなサブユニットのコード配列を有する、請求項２に記載のポリヌクレオチド。９．請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。１０．請求項９に記載のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞。１１．ポリペプチドを製造する方法であって、該ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを請求項１０に記載の宿主細胞から発現させることを含んでなる方法。１２．ポリペプチドを発現させることができる細胞を製造する方法であって、細胞を請求項９に記載のベクターで遺伝的に操作することを含んでなる方法。１３．請求項２に記載のＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であって、小さなサブユニットの活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたＤＮＡ。１４．（ｉ）第１Ａ図の推定アミノ酸配列を有する小さなサブユニットのポリペプチド、並びにそのフラグメント、アナログおよび誘導体；および（ii）ＡＴＣＣ寄託番号第７５８０９号のcＤＮＡによりコードされる小さなサブユニットのポリペプチド、並びに該ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体；よりなる群から選択されるポリペプチド。１５．ポリペプチドが、第１Ａ図の推定アミノ酸配列を有する小さなサブユニットである、請求項１４に記載のポリペプチド。１６．請求項１４に記載のポリペプチドに対する抗体。１７．請求項１４に記載のポリペプチドのアゴニスト。１８．請求項１４に記載のポリペプチドに対するアンタゴニスト。１９．高レベルの転写が必要である患者を治療する方法であって、治療上有効な量の、請求項１４に記載のポリペプチドを患者に投与することからなる方法。２０．高レベルの転写が必要である患者を治療する方法であって、治療上有効な量の、請求項１７に記載のアゴニストを患者に投与することからなる方法。２１．転写を阻害する必要がある患者を治療する方法であって、治療上有効な量の、請求項１８に記載のアンタゴニストを患者に投与することからなる方法。２２．該ポリペプチドをコードするＤＮＡを患者に与えて、該ポリペプチドをインビボにおいて発現させることにより、治療上有効な量の該ポリペプチドを投与する、請求項１９に記載の方法。２３．小さなサブユニットのポリペプチドに特異的なアンタゴニストおよびアゴニストを同定する方法であって、マーカー遺伝子の発現を駆動するＴＦIIＡ誘導性プロモーターを有する細胞を調製し；その細胞をＴＦIIＡおよびスクリーニングすべき化合物と接触させ；およびマーカー遺伝子の発現レベルを測定することからなる方法。