JPH10501985A

JPH10501985A - インターロイキン−１β変換酵素様アポトーシスプロテアーゼ−１および２

Info

Publication number: JPH10501985A
Application number: JP8503077A
Authority: JP
Inventors: ウェイ−ウヒー，; クレイグエイ．ローゼン，; グレッグエイ．ハスティングス，; ピーターエル．ハドソン，; エウェンエフ．カークネス，
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-06-23
Filing date: 1994-06-23
Publication date: 1998-02-24
Also published as: WO1996000297A1; EP0770141A1; AU7250494A; EP0770141A4

Abstract

(57)【要約】ヒトインターロイキン-1β変換酵素様アポトーシスプロテアーゼ-1および-2、ならびにこれらのポリペプチドをコードするDNA(RNA)を、開示する。また、組換え技術によるこのようなポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドに対する抗体およびアンタゴニスト／インヒビターを生成するための手順が提供される。また、例えば、抗腫瘍剤および抗ウイルス剤としてのポリペプチド、ならびに例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、および頭部外傷の治療のための、このようなポリペプチドに対する抗体およびアンタゴニスト／インヒビターの使用方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】インターロイキン-１β変換酵素様アポトーシスプロテアーゼ-１および２本発明は、新たに同定したポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に関する。より特定すると、本発明のポリペプチドは、インターロイキン−１β変換酵素様アポトーシスプロテアーゼ−１およびインターロイキン−１β変換酵素様アポトーシスプロテアーゼ−２であり、本明細書中以後、しばしば集合的に「IC E-LAP-1および2」と呼ばれる。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。インターロイキン−１β変換酵素(ICE)は、pro-IL-1βを、成熟かつ活性型のI L-1βへ切断することに関与し、そしてまた生物体が望まない細胞を除去するプロセスであるプログラムされた細胞死(またはアポトーシス)に関与することが最近発見された。本発明は、構造的にICEと関係のあるICE-LAP-1および2に関する。線虫caenorhabditis elegans において、プログラムされた細胞死の遺伝的経路が確認された(Ellis、R.E.ら、Annu.Rev.Cell Biol.、7:663-698(1991))。２個の遺伝子(ced-3およびced-4)は、C.elegansにおいてプログラムされた細胞死を経る細胞にとって不可欠なものである。(Ellis,H.M.、およびHorvitz,H.R.、C ell、44:817-829(1986))。これらの２個の遺伝子の機能を除去する劣性変異体は、C.elegansの発生の間、正常なプログラムされた細胞死を妨げる。ced-3タンパク質に対する公知の脊椎動物の対応物は、ICEである。ced-3とICEとの間の全体にわたるアミノ酸の同一性は、28％であり、115個のアミノ酸の領域(ced-3の残基246-360およびICEの残基164-278)で最も高い同一性(43％)を示す。この領域は、保存されたペンタペプチドQACRG(ced-3の残基356-360)を含み、このペプチドはICE機能にとって不可欠であると知られているシステインを含む。本発明のICE -LAP-1および2ポリペプチドはまた、同じ保存されたペンタペプチドおよびICE機能にとって不可欠なシステイン残基を有する。 ced-3とICEとの間の類似性は、ced-3がシステインプロテアーゼとして機能し得ることだけでなく、ICEが脊椎動物のプログラムされた細胞死の遺伝子として作用し得ることも示唆する。ced-3および脊椎動物の対応物（ICE）は、胚発生の間、プログラムされた細胞死を制御する(Gagliarnini、V.ら、Science、263:826 :828(1994)。 ICE mRNAは種々の組織で検出され、そのような組織として、末梢血液単球、末梢血液リンパ球、末梢血液好中球、休止または活性化された末梢血液Ｔリンパ球、胎盤、Ｂリンパ芽球株CB23、および単球白血病細胞株THP-1細胞(Cerreti、D.P .、ら、Science、256:97-100(1992))が挙げられる。このことは、ICEがpro-IL-1 βに加えてさらなる基質を有し得ることを示唆する。ICEが作用し、細胞死を起こす基質は、現在未知である。一つの可能性は、それが、C.elegansの細胞死遺伝子ced-4の脊椎動物ホモログであり得ることである。あるいは、ICEは、細胞生存に不可欠なタンパク質をタンパク質分解的に切断することにより、直接的に細胞死を起こし得る。哺乳動物遺伝子bcl-2により、細胞自己不活化からリンパ球と呼ばれる免疫細胞を保護することが発見された。また、crmA(牛痘ウイルス遺伝子産生物)は、IC Eのタンパク質分割能を阻害する。本発明の１局面によれば、ICE-LAP-1および2、ならびにそのフラグメント、アナログ、およびそれらの誘導体である新規の成熟ポリペプチドが提供される。本発明のポリペプチドは、ヒト起源のものである。本発明の別の局面によれば、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）が提供される。本発明のさらなる局面によれば、このようなポリペプチドを組換え技術により生成するためのプロセスが提供される。本発明のさらなる局面によれば、このようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、治療目的（例えば、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、ならびに胚発生および組織恒常性(homeostasis)を調節することとして）のために利用するためのプロセスが提供される。本発明のさらなる局面によれば、このようなポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明のさらに他の局面によれば、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、敗血症性ショックおよび頭部傷害の処置において、このようなポリペプチドの作用を阻害するために用いられ得るこのようなポリペプチドに対するアンタゴニスト／インヒビターが提供される。本発明のこれらの局面および他の局面は、本明細書中の教示から当業者には明らかであるべきである。以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、請求の範囲に含まれる本発明の範囲を限定することを意図しない。図１は、ICE-LAP-1のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。示されるアミノ酸配列によりコードされるポリペプチドは、ポリペプチドの推定の成熟形態(最初のメチオニン残基を除く)であり、そしてアミノ酸に対して、標準的な１文字略記が用いられる。図２は、ICE-LAP-2のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。示されるアミノ酸配列によりコードされるポリペプチドは、ポリペプチドの推定の成熟形態(最初のメチオニン残基を除く)である。図３は、ICE-LAP-1とICEとのアミノ酸配列の比較を示す。図４は、種々のヒト組織における濃度を示すICE-LAP-1のノーザンブロット分析を行った後のゲルを図示する。本発明の局面によれば、図１および図２の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドをコードし、またはATCC寄託番号75772および75819として寄託されたクローンのcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドの単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。ATCC寄託番号75772は、ICE-LAP-1についてコードする cDNAを包含し、およびATCC寄託番号75819は、ICE-LAP-2についてコードするcDNA を包含する。 ICE-LAP-1をコードするポリヌクレオチドが、ヒト胎児肝臓由来のcDNAライブラリーにおいて発見された。このことは、インターロイキン−１β変換酵素ファミリーに、構造的に関係する。これは、約377個のアミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、ヒトインターロイキン−1β変換酵素に、アミノ酸配列全体にわたって68％の類似性および53％の同一性で最も高い程度の相同性を示す。ペンタペプチドQACRGが、保存され、アミノ酸位256-260に位置することを示す。 ICE-LAP-2をコードするポリヌクレオチドが、ヒトJurkat細胞由来のcDNAライブラリーにおいて発見された。このことは、ICEファミリーに構造的に関係する。これは、約435個のアミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、マウスNedd-2タンパク質に、128個のアミノ酸の範囲にわたって91％の同一性および94％の類似性で最も高い程度の相同性を示す。タンパク質全体は、C.elegansの細胞死タンパク質ced-3に、400個のアミノ酸残基にわたって約40％の同一性および60％の類似性で最も高い程度の相同性を示す。ペンタペプチドQACRGは、保存され、アミノ位301-305に位置することもまた重要てある。本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態、または、DNAの形態であり得る。DN Aの形態は、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを包含する。DNAは二本鎖または一本鎖であり得る。そして、一本鎖の場合、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１および図２に示すコード配列と同一であり得るか、寄託したクローンのコード配列と同一であり得る。あるいは、コード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列、ならびに図１および図２のDNAまたは寄託したcDNAとして、その誘導体であり得る。図１および図２の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは；成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列および付加的なコード配列（例えば、リーダー配列もしくは分泌配列またはプロタンパク質配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要に応じて付加的なコード配列）および非コード配列（例えば、イントロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の５’および／または３’ の非コード配列）を包含し得る。従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドならびにさらなるコード配列および /または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、図１または図２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドの、フラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変異体またはポリヌクレオチドの非天然に存在する変異体であり得る。従って、本発明は、図１または図２に示すものと同じ成熟ポリペプチドまたはその寄託したクローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドの変異体を包含する。これらの変異体は、図１および図２のポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体、および付加または挿入変異体を包含する。本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１または図２に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知であるように、対立遺伝子変異体は、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的には変化させない。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質およびさらなる5'アミノ酸残基であるプロタンパク質をコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質はプロタンパク質であり、そしてそれは不活性型のタンパク質である。一旦プロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質が残る。従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパク質もしくはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両方を有するタンパク質をコードし得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は、細菌宿主の場合にマーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製に備えるpQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。または、例えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用される場合、ヘマグルチニン（HA）タグであり得る。HAタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する（Wilson，I.ら、Cell、37:767(1984)）。本発明はさらに、配列間に少なくとも50％および好ましくは70％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも95％および好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場合のみに生じることをいう。好ましい実施態様において本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１および図２のcDNAまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または生物学的活性を保持するポリペプチドをコードする。本明細書中でいう寄託物（１つまたは複数）は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項下に維持される。これらの寄託物は、当業者に便宜上のみ提供され、そして米国特許法第112条の下で寄託が必要とされることを容認するものではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用されており、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる矛盾の場合も制御されている。寄託物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてこのような実施許諾はこれによって与えられるわけではない。本発明はさらに、図１および図２の推定アミノ酸配列を有する、または寄託したcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するICE-LAP-1およびICE-LAP-2ポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１および図２のポリペプチド、または寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドをいう場合は、このようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または生物学的活性を保持するポリペプチドを意味する。そして、この場合、誘導体は増強したまた低減した生物学的機能を有するポリペプチドを包含する。アナログは、プロタンパク質部分の切断により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成し得るプロタンパク質を包含する。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。図１および図２のポリペプチド、または寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログは、(i)その中で１以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換されるアミノ酸残基が、遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基であり得るかまたはあり得ないフラグメント、誘導体、またはアナログ、または(ii)その中で１以上のアミノ酸残基が置換基を含有するフラグメント、誘導体、またはアナログ、または(iii)その中で成熟ポリペプチドがポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物に融合されているフラグメント、誘導体、またはアナログ、または(iv)その中でリーダー配列または分泌配列あるいは成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製に用いられる配列のようなさらなるアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されるフラグメント、誘導体、またはアナログであり得る。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ましくは均質に精製される。用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然系において共存する物質の幾らかまたは全部から分離された同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてさらにこのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないため単離され得る。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術によって本発明のポリペプチドを生成することに関する。宿主細胞は、本発明のベクター（これは例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作（形質導入または形質転換またはトランスフェクト）される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、またはICE-LAP-1遺伝子を増幅するために適切に改変された従来の栄養培地中で培養され得る。培養条件（例えば、温度、pHなど）は、発現のために選択される宿主細胞で以前に使用された条件であり、そして当業者には明らかである。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを生成するために用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターのいずれか１つ内に含まれ得る。このようなベクターは、染色体、非染色体、および合成DNA配列を包含し、例えば、SV40の誘導体；細菌性プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のようなウイルスDNAである。しかし、宿主において複製可能で、そして存続可能である限り、任意の他のベクターが使用され得る。適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者に公知の範囲内であると考えられる。発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列（１つまたは複数）（プロモーター）に作動可能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：レトロウイルス(例えば、RSV 、HIV、HTLVI、CMV、またはSV40プロモーター)由来のLTR、E.coli lacまたはtrp 、 λファージP_Lプロモーター、および原核細胞または真核細胞あるいはそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが公知である他のプロモーター。しかし、細胞シグナル（例えばヒト-β-アクチンプロモーター）もまた、用いられ得る。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有し得る。ベクターはまた、遺伝子のコピー数を増幅するための適切な配列を含み得る。さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、またはE ．coliにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発現させるために用いられ得る。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E ．coli 、Bacillus subtilis 、Streptomyces、Salmonella typhimurium）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細胞（例えば、DrosophilaおよびSf9）；動物細胞（例えば、CHO、COS、HEK 293またはBowes黒色腫）；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの中には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを包含する）を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして購入可能である。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQ E70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8a、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3 、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pX T1、pSG(Stratagene)；pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、宿主において複製可能で、そして存続可能である限り、任意の他のプラスミドまたはベクターも使用され得る。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、pKK232-8およびpCM7である。特によく知られた細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、-gpt、λP_R、P_L、およびtrpを含む。真核プロモーターは、CMV即時初期型、HSVチミジンキナーゼ、初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネインＩを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内にある。さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションにより達成され得る(Davis，L.、Dibner，M.、Battey,I .、Basic Methods in Molecular Biology、1986)。宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に生成され得る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、このようなタンパク質を生成するために、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して用いられ得る。原核宿主および真核宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版（ Cold Spring Harbor、N.Y.、1989）（この開示は、本明細書中に参考として援用されている）に記載されている。本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAのシス作用因子であり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーターに作用してその転写を増大させる。例としては、複製起点bp100〜270の後期側のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含する。一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー（例えば、E ．coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS ．cerevi siae のTRP1遺伝子）および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子に由来するプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、特に解糖酵素（例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質など）をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質を細胞周辺腔または細胞外培地へ分泌することを指示し得るリーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読みとり相で、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することにより構築される。ベクターは、１以上の表現型選択マーカー、ならびに、ベクターの維持を保証するため、および所望により宿主内での増幅を提供するために複製起点を含有する。形質転換のために適切な原核宿主は、E ．coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimuri um 、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。代表的な、しかし限定しない例として、細菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322（ATCC 37017）の遺伝エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌の複製起点を含有し得る。このような市販のベクターは、例えば、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals、Upps ala、Sweden）およびGEM1(Promega Biotec、Madison、WI、USA)を包含する。これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。適切な宿主系統の形質転換および適切な細胞密度への宿主系統の増殖に続いて、選択されたプロモーターは、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段により破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法により破砕され得、このような方法は、当業者に周知である。種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物発現系の例は、Gluzman、Cell、23: 175(1981)に記載されているサル腎臓繊維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）を包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ポリアデニル化部位、、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終止配列、および５’フランキング非転写配列を含有し得る。SV40スプライスおよびポリアデニル化部位に由来するDNA配列は、必要な非転写遺伝エレメントを提供するために使用され得る。 ICE-LAP-1およびICE-LAP-2ポリペプチドは、以下に挙げる方法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。これらの方法には、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが包含される。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（refolding）工程が、成熟タンパク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用いられ得る。本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物であり得るか、あるいは原核宿主または真核宿主（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞により）から組換え技術により生成され得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、あるいはグリコシル化され得ない。本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含み得る。 ICE-LAP-1およびICE-LAP-2ポリペプチドは、異常に制御されたプログラム細胞死を処置するために用いられ得る。異常に制御されたプログラム細胞死は、細胞成長の異常な量によるガンの基礎的な原因であり得る。それゆえ、ICE-LAP遺伝子は、プログラムされた細胞死に関係するので、望まれない細胞(例えば、ガン細胞)を標的するのに用いられ得る。ICE-LAP-1およびICE-LAP-2はまた、脊椎動物の成長および組織の恒常性(そのアポトーシス能による)を制御するのに用いられる。また、プログラム細胞死は、細胞の主要な抗ウイルス防衛メカニズムの一つであり得るので、ICE-LAP-1およびICE-LAP-2ポリペプチドは、抑制されたプログラム細胞死に打ち勝つことで、多くのウイルス感染に打ち勝つために用いられ得る。 ICE-LAP-1およびICE-LAP-2はまた、細胞死に対するウイルス感染細胞を標的することにより免疫抑制に関連する異常(例えば、AIDS)を処置するのに用いられ得る。本発明のポリペプチドはまた、同様の生物学的活性を有する他の分子を同定するために用いられ得る。これに対するスクリーニングの例は、オリゴヌクレオチドプロープを合成するために公知のDNA配列を用いることによる、ICE-LAP遺伝子のコード領域の単離を包含する。本発明の遺伝子との配列相補を有する標識オリゴヌクレオチドは、ヒトcDNA、ゲノムDNA、またはmRNAのライブラリーのスクリーニングに用いられ、ライブラリーの内のどのメンバーとプロープがハイブリダイズするかを決定する。このポリペプチドはまた、本発明に従って、インビボでのこのようなポリペプチドの発現により使用され得る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNA を含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作され得る。同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には明らかである。例えば、細胞を操作するための発現ベヒクル(vehicle)は、レトロウイルス以外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。これは、適切な送達ベヒクルと組み合わせた後インビボで細胞を操作するために使用され得る。本発明のポリペプチドは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を包含する。このようなキャリアとしては、生理食塩液、緩衝化生理食塩液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与の態様に合わせるべきである。本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含有する薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器は、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された形式の通知と関連し得、この通知はヒトへの投与についての製造、使用、または販売における政府機関による認可を反映する。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療用化合物と併用して用いられ得る。薬学的組成物は、静脈内、腹腔内、筋内、皮下、鼻腔内または皮内経路によるような、都合の良い方法で投与され得る。ICE-LAP-1およびICE-LAP-2は、特異的な症候の処置および／または予防に対して有効である量で投与される。一般に、 ICE-LAP-1およびICE-LAP-2は、例えば少なくとも約10μg/kg体重の量で投与され、そしてほとんどの場合、１日当たり８mg/kg体重を超過しない量で投与される。ほとんどの場合、投与経路、症状などを考慮して、用量は毎日約10μg/kg体重〜約１mg/kg体重である。本発明の配列はまた、染色体の同定に有益であり得る。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダイズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試薬はほとんどない。本発明によるDNAの染色体へのDNAのマッピングは、これらの配列と疾患に関する遺伝子との相関において重要な、第１歩である。簡略に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を調製することにより染色体にマップされ得る。cDNAのコンピューター解析が、ゲノムDNA内で１つより多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当てるための迅速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローンのプールを用いて部分的位置決め(sublocalization)が達成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピング戦略は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識したフローサイトメトリーで選別した（flow-sorted）染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的cDNA ライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ選択を包含する。 cDNAクローンの中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、500または600塩基ほどの短いcDNAで使用され得る；しかし、2,000bpよりも大きいクローンの方が、簡便な検出に十分なシグナル強度で独特の染色体位置に結合しやすい。FISHは、ESTが由来するクローンの使用を必要とし、そしてこのクローンは長いほど好ましい。例えば、2,000bpが良好であり、4,000bpはより良好であり、そして4,000bpを超える長さは、合理的な割合の時間で（a resonab le percentage of the time）良好な結果を得るためにおそらく必ずしも必要でない。この技術の総説としては、Vermaら、Human Chromosomes: ａ Manual of B asic Techniques，Pergamon Press、New York(1988)を参照のこと。一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、染色体上での配列の物理的な位置を遺伝的地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、V．M cKusick、Mendelian Inheritance in Man に見出される(Johns Hopkins Univers ity Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である)。次いで、同一の染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であると思われる。物理的マッピングおよび遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩基のマッピング解像度で、そして20 kbあたり１遺伝子と仮定する。）このポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を生成させるための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメントの生成のために使用され得る。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ得る。この動物は、好ましくはヒトではない。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織からそのポリペプチドを単離するために使用され得る。モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術（Ko hlerおよびMilstein、1975、Nature、256: 495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、1983、Immunology Today 4:72）、およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのEBVハイブリドーマ技術（Coleら、198 5、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R．Liss，Inc.、77-96頁）が挙げられる。単鎖抗体を生成するために記載された技術（米国特許第4,946,778号）を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る。本発明はまた、宿主から得られたサンプル（例えば、血液、尿、または血清サンプル）中の、ICE-LAP-1およびICE-LAP-2のレベルを検出する診断アッセイに関する。ICE-LAP-1およびICE-LAP-2のレベルは、例えば、当該分野で公知の手順によるイムノアッセイ技術により検出され得る。このようなアッセイの例は、ICE- LAP-1およびICE-LAP-2抗原に特異の二つの抗体、好ましくは、抗体の一つが、標識される（例えば、指示酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）のような適切な標識を結合させることにより）モノクローナル抗体を利用するサンドイッチアッセイであり、非標識抗体は、好ましくは固体支持体上にある。抗原が存在する場合、抗原は、両方の抗体に結合する。ペルオキシダーゼ結合抗体の抗原への結合の後、ペルオキシダーゼは、測定可能で、その濃度がサンプル中の抗原の量に関係する着色産生物を生成させるために用いられ得る。酵素の触媒性質により、系はシグナルを非常に増幅する。ICE-LAP-1およびICE-LAP-2の変化したレベルは、上記の特定の疾患を指示する。本発明はまた、本発明のポリペプチドのアンタゴニスト/インヒビターに関する。アンタゴニスト/インヒビターは、ポリペプチドの機能を減少または排除するために使用され得る。アンタゴニストの例は、抗体であり、またはいくつかの場合では、ICE-LAP-1 およびICE-LAP-2ポリペプチドに結合するオリゴヌクレオチドである。インヒビターの例は小分子であり、この小分子は、ポリペプチドの触媒部位に結合してこれを塞ぎ、それにより触媒部位を基質に接近不能にし、その結果正常な生物学的活性が妨害される。小分子の例は、小ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、それらに限定されない。インビボでの、ICE-LAP-1およびICE-LAP-2のレベルは、アンチセンス技術の使用による、インビボでのICE-LAP-1およびICE-LAP-2の産生を阻害するアンチセンス構築物の投与により減少し得る。アンチセンス技術は、３重ヘリックスの形成あるいはアンチセンスDNAまたはアンチセンスRNAを介して遺伝子発現を制御するために使用され得る。これらの方法は両方とも、DNAまたはRNAへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５'コード部分が、約10塩基対〜40塩基対の長さのアンチセンスR NAオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関わる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（３重ヘリックス− Leeら、Nucl．Acids Res.、6:3073(1979)；Cooneyら、Science、241:456(1988) ；およびDervanら、Science、251:1360(1991)を参照のこと）、その結果ICE-LAP -1およびICE-LAP-2ポリペプチドの転写および生成を防ぐ。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボでmRNAにハイブリダイズし、そしてICE-LAP-1およびICE-LAP-2ポリペプチドへのmRNA分子の翻訳をブロックする（アンチセンス−O kano、J．Neurochem.、56:560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense In hibitors of Gene Expression、CRC Press、Boca Raton、FL(1988)を参照のこと）。アンタゴニスト／インヒビターは、心血管症、卒中、外傷、および他の退行性疾患（ICE-LAP-1およびICE-LAP-2の異常な調制が、病理的細胞死、例えば、免疫抑制関係疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、慢性関節リウマチを起こし得る場合）に関係する非プログラム壊死性細胞死を処置するのに用いられ得る。アンタゴニスト／インヒビターはまた、肺および気管、中枢神経系、目および耳、関節、骨、心血管系、ならびに胃腸系および泌尿系の免疫に基づく疾患を処置するのに用いられ得る。アンタゴニスト／インヒビターは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、本明細書中上記）との組成物において用いられ得る。本発明は、さらに、本発明のICE-LAP-1およびICE-LAP-2ポリペプチドのアンタゴニスト／インヒビターまたはアゴニストを同定するための分子をスクリーニングするプロセスに関する。アゴニストは、ICE-LAP-1およびICE-LAP-2の本来の生物学的機能を増加させるが、一方、アンタゴニストは、このような機能を減少させまた除去する。このようなアッセイの例は、基質への作用を可能にし、そしてこれらの化合物が、ICE-LAP-1およびICE-LAP-2が基質を切断することを妨げるか、または切断を促進するかどうかを決定する条件下で、ICE-LAP-1およびICE-LAP -2、ならびに潜在的なアンタゴニスト化合物またはアゴニスト化合物とそれらの自然基質との組み合わせを包含する。本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定されないことを理解されたい。すべての部または量は、他に明記しない限り重量基準である。以下の実施例の理解を容易にするために、現れる頻度の高い特定の方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、小文字のｐの前および／または後の大文字および／または数字により示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であるか、制限基準なく公的に入手可能であるか、または公表された手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプラスミドと等価なプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。 DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μgのプラスミドまたはDNAフラグメントを、約２単位の酵素とともに約20μlの緩衝溶液中で使用する。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的のために、代表的には５〜50μgのDNAを20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化する。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37℃ での約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、これは供給者の説明書に従って変化し得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。切断されたフラグメントのサイズ分離は、Goeddel，D.ら、Nucleic Acids Res .、8:4057(1980)により記載された８％ポリアクリルアミドゲル、またはアガロースゲル（0.5〜1.5％）を使用して行われる。「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５'リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう(Maniatis，T.ら、前出、146頁)。他に提供しない限り、連結は、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラグメント0.5μgあたり10単位のT 4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）とともに、公知の緩衝液および条件を用いて達成され得る。他に記載しない限り、形質転換はGraham，F.およびVan der Eb，A.、Virology 、52:456-457(1973)の方法に記載されるように行った。実施例１ COS 細胞における組み換えICE-LAP-1の発現発現プラスミド（ICE-LAP-1 HA）は、以下を含むベクターpcDNAI/Amp（Invitr ogen）に由来する：１)SV40複製開始点、２)アンピシリン耐性遺伝子、３)E.col i複製開始点、４)CMVプロモーター、それに続くポリリンカー領域、SV40イントロンおよびポリアデニル化部位。全ICE-LAP-1前駆体およびその３'末端にインフレームに融合したHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。従って、組み換えタンパク質発現は、CMVプロモーター下の支配を受ける。HAタグは、前記のインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する（I．Wilson、H．Niman、R．Heighten、A．Che renson、M．Connolly、およびR．Lerner、1984、Cell 37、767）。本発明者の標的タンパク質に対するHAタグの融合は、HAエピトープを認識する抗体と共に、組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。プラスミド構成方法は、以下の通りである： ICE-LAP-1（ATCC # 75772）をコードするDNA配列を２つのプライマーを用いて、全長のICE-LAP-1上のPCRにより構築した：５'プライマ-配列（5'-GTTCACTATGG CAGAAGGCAAGGACAG-3'）は、ICE-LAP-1翻訳開始部位ATG、続いて開始コドンから始まるICE-LAP-1コード配列の17ヌクレオチドを含有する；３'配列5'-AATCAAGCG TAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAATTGCCAGGAAAGAGGTAGAAA-3'は、翻訳停止コドン、HAタグおよびICE-LAP-1コード配列の最後の28ヌクレオチド（停止コドンを含まない）を含有する。従って、PCR産物は、インフレームに融合したHAタグを伴うICE-L AP-1コード配列、およびHAタグに隣接する翻訳終了停止コドンを含有する。PCR 増幅DNAフラグメントを、平滑端連結によりpcDNAI/Ampと連結した。連結混合物を、E.coli株SURE（Stratagene Cloning Systems、11099 North Torrey Pines R oad、La Jolla、CA 92037から入手可能）に形質転換した。形質転換培養物をアンピシリン培地プレート上に塗布して、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを、形質転換体から単離し、そして正しいフラグメントの存在に対する制限分析により試験した。組換えICE-LAP-1の発現のために、COS細胞を、DEAEデキストラン法により発現ベクターを用いてトランスフェクトした（J．Sambrook 、E．Fritsch、T．Maniatis、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Laboratory Press、(1988)）。ICE-LAP-1 HAタンパク質の発現を、放射性標識法および免疫沈降法により検出した（E．Harlow、D．Lane、Antibodies： A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、(1989)）。細胞質を、トランスフェクションの２日後に³⁵S-システインで８時間標識した。次いで培養培地を採集し、そして細胞を界面活性剤で溶解した（RIPA緩衝液（150mM NaCl、１％ NP-40、0.1％ SDS、１％ NP-40、0.5％ DOC、50mM Tris、pH 7.5））。（Wilson,I.ら、前出37：767(1984)）。細胞溶解産物および培養培地の両方を、 HA特異的モノクローナル抗体で沈澱させた。沈澱したタンパク質を、15％SDS-PA GEゲルで分析した。実施例２ COS 細胞における組み換えICE-LAP-2の発現発現プラスミド（ICE-LAP-2 HA）は、以下を含むベクターpcDNAI/Amp（Invitr ogen）に由来する：１)SV40複製開始点、２)アンピシリン耐性遺伝子、３)E.col i複製開始点、４)CMVプロモーター、それに続くポリリンカー領域、SV40イントロンおよびポリアデニル化部位。全ICE-LAP-2前駆体およびその３'末端にインフレームに融合したHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。従って、組み換えタンパク質発現は、CMVプロモーター下の支配を受ける。HAタグは、前記のインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する（I．Wilson、H．Niman、R．Heighten、A．Che renson、M．Connolly、およびR．Lerner、1984、Cell 37、767）。本発明者の標的タンパク質に対するHAタグの融合は、HAエピトープを認識する抗体と共に、組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。プラスミド構成方法は、以下の通りである： ICE-LAP-2(ATCC # 75819)をコードするDNA配列を、２つのプライマーを用いて、全長のICE-LAP-2上のPCRにより構築した：５'プライマー（5'-AGCTGATGGCCGCT GACAGGGG-3'）は、ICE-LAP-2翻訳開始部位(ATG)、続いて開始コドンから始まるI CE-LAP-2コード配列の14ヌクレオチドを含有する；３'配列（5’AATCAAGCGTAGTC TGGGACGTCGTATGGGTATGTGGGAGGGTGTCCTGGGA 3'）は、翻訳停止コドン、HAタグおよびICE-LAP-2コード配列の最後の20ヌクレオチド（停止コドンを含まない）を含有する。従って、PCR産物は、インフレームに融合したHAタグを伴うICE-LAP-2 コード配列、HAタグに隣接する翻訳終了停止コドンを含有する。PCR増幅DNAフラグメントを、平滑端連結によるpcDNAI/Ampと連結した。連結混合物を、E.coli株 SURE（Stratagene Cloning Systems、11099 North Torrey Pines Road、La Joll a、CA 92037から入手可能）に形質転換した。形質転換培養物をアンピシリン培地プレート上に塗布し、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを、形質転換体から単離し、そして正しいフラグメントの存在に対する制限分析により試験した。組換えICE-LAP-2の発現のために、COS細胞を、DEAEデキストラン法により発現ベクターを用いてトランスフェクトした（J．Sambrook、E．Fritsch、T．Ma niatis、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Laboratory P ress、(1989)）。ICE-LAP-2 HAタンパク質の発現を、放財性標識法および免疫沈降法により検出した（E．Harlow、D．Lane、Antibodies：A Laboratory Manual 、Cold Spring Harbor Laboratory Press、(1988)）。細胞を、トランスフェクションの２日後に³⁵S-システインで８時間標識した。次いで培養培地を採集し、そして細胞を界面活性剤で溶解した（RIPA緩衝液（150mM NaCl、１％ NP-40、0. 1％ SDS、１％ NP-40、0.5％ DOC、50mM Tris、pH 7.5））。(Wilson,I.ら、前出 37：767(1984)）。細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体で沈澱させた。沈澱したタンパク質を、15％SDS-PAGEゲルで分析した。実施例３ヒト組織におけるICE-LAP-1の発現パターンノーザンブロット分析を行い、ヒト組織におけるICE-LAP-1の発現レベルを試験した。細胞の全RNAサンプルを、RNAzol^TMBシステム（Biotecx Laboratories,I nc.6023 South Loop East、Houston、TX 77033）で単離した。指示された各ヒト組織から単離された、約10μgの全RNAを１％アガロースゲルで分離し、そしてナイロンフィルター上でブロットした。（Sambrook、Fritsch、およびManiatis、M olecular Cloning、Cold Spring Harbor Press、(1989)）。標識反応を、50ngの DNAフラグメントを用いてStratagene Prime-Itキットに従って行った。標識されたDNAを、Select-G-50カラムで精製した。（5Prime−3Prime,Inc．5603 Arapaho e Road、Boulder、CO 80303）。次いで、フィルターを、放射能標識された全長のICE-LAP-1遺伝子を用いて、0.5M NaPO₄(pH7.4)および７％SDS中、1,000,000cp m/mlで一晩65℃で、ハイブリダイズした。0.5×SSCで、0.1％SDSを用いて、室温で２回、そして60℃で２回洗浄した後、次いでフィルターを、-70℃で増強スクリーン(intensifying screen)とともに一晩曝した。ICE-LAP-1に対するメッセージRNAは、肝臓において多量である。（図５）。実施例４ヒト組織におけるICE-LAP-2の発現パターンノーザンブロット分析を行い、ヒト組織におけるICE-LAP-2の発現レベルを試験した。細胞の全RNAサンプルを、RNAzol^TMBシステム（Biotecx Laboratories,I nc.6023 South Loop EaSt、Houston、TX 77033）で単離した。指示された各ヒト組織から単離された、約10μgの全RNAを１％アガロースゲルで分離し、そしてナイロンフィルター上でブロットした。（Sambrook、Fritsch、およびManiatis、M olecular Cloning、Cold Spring Harbor Press、(1989)）。標識反応を、50ngの DNAフラグメントを用いてStratagene Prime-Itキットに従って行った。標識されたDNAを、Select-G-50カラムで精製した。（5Prime−3Prime,Inc．5603 Arapaho e Road、Boulder、CO 80303）。次いで、フィルターを、放射能標識された全長のICE-LAP-2遺伝子を用いて、0.5M NaPO₄(pH7.4)および７％SDS中、1,000,000cp m/mlで一晩65℃で、ハイブリダイズした。0.5×SSCで、0.1％SDSを用いて、室温で２回、そして60℃で２回洗浄した後、次いでフィルターを、-70℃で増強スクリーンとともに一晩曝した。本発明の多くの改変および変化は、上記の教示に照らして、可能であり、従って、添付の請求の範囲内で、本発明は、具体的に記載される以外にも実施し得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/08 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 9735−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ローゼン，クレイグエイ. アメリカ合衆国メリーランド 20882, レイトンズビル，ローリングヒルロード 22400 (72)発明者ハスティングス，グレッグエイ. アメリカ合衆国メリーランド 20850, ロックビル，ゲイブルリッジテラス 9913，アパートメントエイチ (72)発明者ハドソン，ピーターエル. アメリカ合衆国メリーランド 20874, ジャーマンタウン，ハイストリームドライブ 19041 (72)発明者カークネス，エウェンエフ. アメリカ合衆国ワシントンディーシー 20008，キャセドラルアベニュー 2301，アパートメント 406

Claims

【特許請求の範囲】１．単離されたポリヌクレオチドであって： (a)図１の推定アミノ酸配列を有するICE-LAP-1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、もしくは誘導体 ; (b)図２の推定アミノ酸配列を有するICE-LAP-2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、もしくは誘導体; (c)ATCC寄託番号75772に含まれるcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する ICE-LAP-1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、もしくは誘導体；および (d)ATCC寄託番号75819に含まれるcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する ICE-LAP-2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、もしくは誘導体からなる群より選択される、ポリヌクレオチド。２．前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．前記ポリヌクレオチドがRNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．前記ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．前記ポリヌクレオチドが、図１の推定アミノ酸配列を有するICE-LAP-1をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。６．前記ポリヌクレオチドが、図２の推定アミノ酸配列を有するICE-LAP-2をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。７．前記ポリヌクレオチドが、ATCC寄託番号75772のcDNAによりコードされるI CE-LAP-1ポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。８．前記ポリヌクレオチドが、ATCC寄託番号75819のcDNAによりコードされるI CE-LAP-2ポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。９．図１に示されるICE-LAP-1のコード配列を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。１０．図２に示されるICE-LAP-2のコード配列を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。１１．ATCC寄託番号75772として寄託されたICE-LAP-1のコード配列を有する、請求項２に記載のポリヌクレオチド。１２．ATCC寄託番号75819として寄託されたICE-LAP-2のコード配列を有する、請求項２に記載のポリヌクレオチド。１３．請求項２に記載のDNAを含有するベクター。１４．請求項１３に記載のベクターで遺伝操作された宿主細胞。１５．前記DNAによりコードされたポリペプチドを請求項１４に記載の宿主細胞から発現する工程、を包含する、ポリペプチドを産生する方法。１６．請求項１３に記載のベクターを用いて細胞を遺伝操作する工程を包含する、ポリペプチドを発現し得る細胞を産生するプロセス。１７．請求項２に記載のDNAに対してハイブリダイズし得、かつICE-LAP-1活性を有するポリペプチドをコードする単離されたDNA。１８．請求項２に記載のDNA対してハイブリダイズし得、かつICE-LAP-2活性を有するポリペプチドをコードする単離されたDNA。１９．ポリペプチドであって：(i)図１の推定アミノ酸配列を有するICE-LAP-1 ポリペプチド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導体；(ii)図２の推定アミノ酸配列を有するICE-LAP-2ポリペプチド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導体；(iii)ATCC寄託番号75772のcDNAによりコードされるICE-LAP-1ポリペプチド、ならびに該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体;および(iv)ATCC寄託番号75819のcDNAによりコードされるICE-LA P-2ポリペプチド、ならびに該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体、からなる群から選択される、ポリペプチド。２０．前記ポリペプチドが図１の推定アミノ酸配列を有するICE-LAP-1である、請求項１９に記載のポリペプチド。２１．前記ポリペプチドが図２の推定アミノ酸配列を有するICE-LAP-2である、請求項１９に記載のポリペプチド。２２．請求項１９に記載のポリペプチドに対する抗体。２３．請求項１９に記載のポリペプチドに対するアンタゴニスト／インヒビター。２４．請求項１９に記載のポリペプチドの治療的有効量を患者に投与する工程を包含する、ICE-LAP-1を必要とする患者を処置する方法。２５．請求項１９に記載のポリペプチドの治療的有効量を患者に投与する工程を包含する、ICE-LAP-2を必要とする患者を処置する方法。２６．請求項２３に記載のアンタゴニスト／インヒビターの治療的有効量を患者に投与する工程を包含する、ICE-LAP-1の阻害を必要とする患者を処置する方法。２７．請求項２３に記載のアンタゴニスト／インヒビターの治療的有効量を患者に投与する工程を包含する、ICE-LAP-2の阻害を必要とする患者を処置する方法。２８．前記ポリペプチドの前記治療的有効量が、該ポリペプチドをコードしかつインビボで該ポリペプチドを発現するDNAを前記患者に提供することにより投与される、請求項２４に記載の方法。２９．前記ポリペプチドの前記治療的有効量が、該ポリペプチドをコードしかつインビボで該ポリペプチドを発現するDNAを前記患者に提供することにより投与される、請求項２５に記載の方法。