JP2002017379A - 神経伝達物質輸送体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 神経伝達物質輸送体タンパク質およびこのタ
ンパク質をコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）を提供するこ
と。 【解決手段】 単離されたポリヌクレオチドであって、 （ａ）ヒト由来の特定アミノ酸配列を有するＮＴＴポリ
ペプチドまたは該ポリペプチドのフラグメント、アナロ
グまたは誘導体をコードするポリヌクレオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ寄託物第７５７１３号に含まれるｃＤＮ
Ａによりコードされるアミノ酸配列を有するＮＴＴポリ
ペプチドまたは該ポリペプチドのフラグメント、アナロ
グまたは誘導体をコードするポリヌクレオチド；からな
る群から選択される、ポリヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用、およびこのようなポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より詳
細には、本発明のポリペプチドは、神経伝達物質輸送体
であり、そして本発明のポリペプチドは、本明細書中で
は時々「ＮＴＴ」という。本発明はまた、このようなポ
リペプチドの作用を阻害することに関する。

【０００２】

【従来の技術】シナプス伝達の本質的な特性は、神経伝
達物質放出後の作用の迅速な終了である。カテコールア
ミン、セロトニン、および特定のアミノ酸（例えば、γ
−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、グルタミン酸、およびグリ
シン）を包含する多くの神経伝達物質については、神経
伝達物質輸送体によるシナプス前終末および周辺のグリ
ア細胞の中への伝達物質の取り込みによりシナプス作用
の迅速な終了が達成される（Ｂｅｎｎｅｔｔら，Ｌｉｆ
ｅ Ｓｃｉ．１５：１０４５−１０５６（１９７
４））。神経伝達物質の取り込みの阻害または刺激は、
内因性伝達物質の利用可能なレベルを調節することによ
り、シナプス作用の強度を調整する手段を提供する。神
経伝達物質輸送体は、神経伝達物質がシナプス間隙を横
切りそしてシナプス後ニューロンに作用した後に、シナ
プス前ニューロンの中に神経伝達物質を取り込む膜結合
ポリペプチドである。神経伝達物質は、グルタミン酸の
ように興奮性、またはＧＡＢＡのように抑制性であり得
る。

【０００３】親和性神経伝達物質輸送は、シナプス伝達
の全プロセスを終了させると考えられている（Ｉｖｅｒ
ｓｅｎ，Ｌ．Ｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４
１：５７１−５９１（１９７１））。近年、１０を超え
る異なる神経伝達物質輸送体をコードするｃＤＮＡがク
ローン化され、そして配列決定されている。これらの遺
伝子のファミリーを、３つのサブファミリーに分割し
得、これらは、ＧＡＢＡおよびタウリン輸送体（Ｌｉ
ｕ，Ｑ．Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（印刷中），（１９９２））、アミノ酸（グ
リシンおよびプロリン）輸送体（Ｆｒｅｍｅａｕ，Ｊ
ｒ．，Ｒ．Ｔ．ら，Ｎｅｕｒｏｎ，８：９１５−９２６
（１９９２））、およびカテコールアミン輸送体（Ｐａ
ｃｈｏｌｃｚｙｋ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：３
５０−３５４（１９９１））を包含する。これら全ての
遺伝子産物の一般構造は、非常に似ている。これらは、
１２個の潜在的な膜貫通ヘリックスおよび膜セグメント
３と４との間に３〜４個のグリコシル化部位を有する広
範な外側のループを含有する。輸送体の計算分子量は約
７０ｋＤａであり、そしてこれらのＣ末端周辺ペプチド
およびＮ末端周辺ペプチドの両方が、約４０アミノ酸を
含有し、そして膜の細胞質側に位置し得る。ＧＡＢＡお
よびカテコールアミンの輸送体サブファミリーでは、各
メンバーのアミノ酸配列はサブファミリー内の他のメン
バーに対して６０〜８０％同一であり、そして２つのサ
ブファミリー間のメンバーで約４０％同一である（Ｌｉ
ｕ，Ｑ．Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８９：６６３９−６６４３（１９９
２））。アミノ酸輸送体（例えば、グリシン輸送体およ
びプロリン輸送体）は、神経伝達物質輸送体スーパーフ
ァミリーの全てのメンバーと約４０〜４５％の相同性を
共有する。神経伝達物質輸送体ファミリーのメンバー間
の配列相同性は、これらが共通の祖先遺伝子から進化し
たという明らかな徴候を与える。さらに、いくつかの神
経伝達物質輸送体の部分的なゲノムクローニングは、こ
れらの全てにおいて、リーディングフレーム内の第１イ
ントロンが同一の部位に位置すること（前出）を明らか
にする。

【０００４】ＧＡＢＡ_A輸送体は、クローン化および発
現された最初の神経伝達物質系であった（Ｇｕａｓｔｅ
ｌｌａ，Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１３０３−
１３０６（１９９０））。そして、ＧＡＢＡ_A輸送体
は、昨年の内にクローン化された神経伝達物質輸送体の
ファミリーの１つである。近年、セロトニン輸送体ｃＤ
ＮＡが、ＰＣＴ ＷＯ ９３／０８２６１に開示されて
いる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、神経伝達物
質輸送体タンパク質およびこのタンパク質をコードする
ＤＮＡ（ＲＮＡ）を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】神経伝達物質輸送体タン
パク質およびこのタンパク質をコードするＤＮＡ（ＲＮ
Ａ）が開示される。組換え技術によるこのポリペプチド
を産生するための手順も提供される。このポリペプチド
に対するアンタゴニスト／インヒビターを産生するため
の手順も提供される。このアンタゴニスト／インヒビタ
ーは、鬱病、不安または癲癇の処置のために、神経伝達
物質輸送体タンパク質の作用を阻害するために使用され
得る。

【０００７】本発明の単離されたポリヌクレオチドは、
（ａ）図１（図１Ａ〜図１Ｅ）の推定アミノ酸配列を有
するＮＴＴポリペプチドまたは該ポリペプチドのフラグ
メント、アナログまたは誘導体をコードするポリヌクレ
オチド；（ｂ）ＡＴＣＣ寄託物第７５７１３号に含まれ
るｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＮ
ＴＴポリペプチドまたは該ポリペプチドのフラグメン
ト、アナログまたは誘導体をコードするポリヌクレオチ
ド；からなる群から選択される。

【０００８】１つの実施形態では、上記ポリヌクレオチ
ドはＤＮＡであり得る。

【０００９】１つの実施形態では、上記ポリヌクレオチ
ドはＲＮＡであり得る。

【００１０】１つの実施形態では、上記ポリヌクレオチ
ドはゲノムＤＮＡであり得る。

【００１１】１つの実施形態では、上記ポリヌクレオチ
ドは図１の推定アミノ酸配列を有するＮＴＴをコードし
得る。

【００１２】１つの実施形態では、上記ポリヌクレオチ
ドはＡＴＣＣ寄託物第７５７１３号のｃＤＮＡによりコ
ードされるＮＴＴポリペプチドをコードし得る。

【００１３】１つの実施形態では、上記ポリヌクレオチ
ドは、図１に示されるＮＴＴのコード配列を有し得る。

【００１４】１つの実施形態では、上記ポリヌクレオチ
ドは、ＡＴＣＣ寄託物第７５７１３号として寄託される
ＮＴＴのコード配列を有し得る。

【００１５】本発明のベクターは、上記のＤＮＡを含
む。

【００１６】本発明の宿主細胞は、上記のベクターを用
いて遺伝子操作された宿主細胞である。

【００１７】本発明のプロセスは、上記の宿主細胞から
上記ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現させ
る工程を包含する、該ポリペプチドを産生するためのプ
ロセスである。

【００１８】本発明のプロセスは、上記のベクターを用
いて細胞を遺伝子操作する工程を包含する、ポリペプチ
ドを発現し得る細胞を産生するためのプロセスである。

【００１９】本発明の単離されたＤＮＡは、上記のＤＮ
Ａにハイブリダイズ可能でありかつＮＴＴ活性を有する
ポリペプチドをコードする。

【００２０】本発明のポリペプチドは、（ｉ）図１の推
定アミノ酸配列を有するＮＴＴポリペプチドならびにそ
のフラグメント、アナログおよび誘導体、および（ｉ
ｉ）ＡＴＣＣ寄託物第７５７１３号のｃＤＮＡによりコ
ードされるＮＴＴポリペプチドならびに該ポリペプチド
のフラグメント、アナログおよび誘導体、からなる群か
ら選択される。

【００２１】１つの実施形態では、上記ポリペプチド
は、図１の推定アミノ酸配列を有するＮＴＴであり得
る。

【００２２】本発明の抗体は、上記のポリペプチドに対
する抗体である。

【００２３】本発明のアンタゴニスト／インヒビター
は、上記のポリペプチドに対するアンタゴニスト／イン
ヒビターである。

【００２４】本発明のアゴニストは、上記のポリペプチ
ドに対するアゴニストである。

【００２５】本発明の方法は、ＮＴＴに対するアゴニス
トを必要とする患者の処置方法であって、該患者に治療
有効量の上記のアゴニストを投与する工程を包含する。

【００２６】本発明の方法は、ＮＴＴを阻害する必要を
有する患者の処置方法であって、該患者に治療有効量の
上記のアンタゴニスト／インヒビターを投与する工程を
包含する。

【００２７】本発明の薬学的組成物は、上記のポリペプ
チドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する。

【００２８】本発明の方法は、治療有効量のＮＴＴポリ
ペプチドを投与する方法であって、患者に該ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡを提供する工程、および該ポリペ
プチドをインビボで発現させる工程を包含する。

【００２９】本発明の方法は、化合物をスクリーニング
してＮＴＴと相互作用する化合物を同定する方法であっ
て、哺乳動物細胞を、ＮＴＴをコードするポリヌクレオ
チドを含有するベクターで形質転換する工程；ＮＴＴの
天然の神経伝達物質を標識する工程；該細胞、該標識さ
れた神経伝達物質、および化合物をインキュベートする
工程；ＮＴＴによる該細胞内への該神経伝達物質の移動
の有効性を決定する工程；および該化合物がＮＴＴに対
するアンタゴニストまたはアゴニストのいずれかである
と同定する工程；を包含する。

【００３０】

【発明の実施の形態】本発明の１つの局面によれば、本
明細書中でＮＴＴと呼ぶ新規な成熟ポリペプチド、なら
びにそのフラグメント、アナログおよび誘導体が提供さ
れる。本発明のポリペプチドは、ヒト起源である。

【００３１】本発明の別の局面によれば、このようなポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまた
はＲＮＡ）が提供される。

【００３２】本発明のまたさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチドを組換え技術により産生するための
プロセスが提供される。

【００３３】本発明のまたさらなる局面によれば、ＮＴ
Ｔのその基質への親和性を増大させるアゴニストが提供
され、そしてこれは、筋萎縮性側索硬化症、疼痛、およ
び脳卒中を処置するために使用され得る。

【００３４】本発明の別の局面によれば、このようなＮ
ＴＴポリペプチドに対する抗体が提供される。

【００３５】本発明のまた別の局面によれば、ＮＴＴに
よる神経伝達物質の取り込みを妨げるために使用され得
るアンタゴニスト／インヒビターが提供される。これ
は、治療的に（例えば、鬱病、不安、および癲癇、なら
びに他の神経学的疾患または精神疾患の処置に）使用さ
れ得る。

【００３６】本発明のこれらおよび他の局面は、本明細
書中の教示から当業者に明らかであるはずである。

【００３７】以下の図面は、本発明の実施態様の例示で
あり、そして請求の範囲により包含される本発明の範囲
を限定することを意味しない。

【００３８】本発明の１つの局面によれば、図１（図１
Ａ〜図１Ｅ）の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプ
チドまたは１９９４年３月１８日にＡＴＣＣ寄託物第７
５７１３号として寄託されたクローンのｃＤＮＡにコー
ドされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸
（ポリヌクレオチド）が提供される。

【００３９】本発明のポリヌクレオチドは、ヒト胎児脳
に由来するｃＤＮＡライブラリーにおいて発見された。
本発明のポリヌクレオチドは、構造的に神経伝達物質輸
送体ファミリーに関係する。本発明のポリヌクレオチド
は、約７２７アミノ酸残基のタンパク質をコードするオ
ープンリーディングフレームを含有する。このタンパク
質は、ラット神経伝達物質輸送体（ＮＴ７４）とアミノ
酸配列全体で９４％同一かつ９６％類似という高度の相
同性を示す。

【００４０】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
態またはＤＮＡ（このＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａ、および合成ＤＮＡを包含する）の形態であり得る。
ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖で
ある場合、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖
であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列
は、図１に示すコード配列または寄託したクローンのコ
ード配列と同一であり得、あるいはそのコード配列が、
遺伝コードの重複性または縮重の結果として、図１のＤ
ＮＡまたは寄託したｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドを
コードする異なるコード配列であり得る。

【００４１】図１の成熟ポリペプチドまたは寄託したｃ
ＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドは以下を包含し得る：成熟ポリペプ
チドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列
およびさらなるコード配列（例えば、リーダー配列また
は分泌配列、またはプロタンパク質配列）；成熟ポリペ
プチドのコード配列（および必要に応じてさらなるコー
ド配列）および非コード配列（例えば、イントロンまた
は成熟ポリペプチドのコード配列の５'側’および／ま
たは３’側の非コード配列）。従って、用語「ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチド
のコード配列のみを含むポリヌクレオチド、およびさら
なるコード配列および／または非コード配列を含むポリ
ヌクレオチドを包含する。

【００４２】本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列
を有するポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮ
Ａによりコードされるポリペプチドのフラグメント、ア
ナログおよび誘導体をコードする本明細書中上記のポリ
ヌクレオチドの改変体に関する。ポリヌクレオチドの改
変体は、ポリヌクレオチドの天然の対立遺伝子改変体ま
たはポリヌクレオチドの非天然の改変体であり得る。

【００４３】従って、本発明は、図１に示すものと同じ
成熟ポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮＡに
よりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドの
改変体を包含する。この改変体は、図１のポリペプチド
または寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードされる
ポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログを
コードする。このようなヌクレオチド改変体は、欠失改
変体、置換改変体および付加または挿入改変体を包含す
る。

【００４４】本明細書中上記で示したように、ポリヌク
レオチドは、図１に示すコード配列または寄託したクロ
ーンのコード配列の天然の対立遺伝子改変体であるコー
ド配列を有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝
子改変体は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失または
付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であ
り、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的に
変化させない。

【００４５】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列に同じ
リーディングフレームで融合したコード配列を有し得
る。マーカー配列は、細菌宿主の場合、マーカーに融合
した成熟ポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ−９ベ
クターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得
る。また、例えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主（例
えば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、血球凝集
素（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエン
ザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応す
る（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７
（１９８４））。

【００４６】本発明はさらに、配列間に少なくとも５０
％そして好ましくは７０％の同一性が存在する場合、本
明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオ
チドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌ
クレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いら
れる用語「ストリンジェントな条件」は、配列間に少な
くとも９５％そして好ましくは少なくとも９７％の同一
性が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが生じ
ることを意味する。好ましい実施態様において、本明細
書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドは、図１のｃＤＮＡまたは寄託したｃＤＮ
Ａによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ
生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコー
ドする。

【００４７】本明細書中でいう寄託物は、特許手続き上
の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の
下に維持される。これらの寄託物は、当業者に対する便
宜のためだけに提供され、そして米国特許法第１１２条
の下で寄託が必要とされることを認めたわけではない。
寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそ
れによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、
本明細書中に参考として援用されており、そして本明細
書中の配列の記載とのいかなる矛盾も抑えている。寄託
物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾
が必要とされ得、そしてそのような実施許諾はこれによ
って与えられるわけではない。

【００４８】本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列
を有するかまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされる
アミノ酸配列を有するＮＴＴポリペプチド、およびその
ようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘
導体に関する。

【００４９】用語「フラグメント」、「誘導体」および
「アナログ」は、図１のポリペプチドまたは寄託したｃ
ＤＮＡにコードされるポリペプチドをいう場合は、その
ようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または
活性を保持するポリペプチドを意味する。従ってアナロ
グは、プロタンパク質部分の切断により活性化されて活
性な成熟ポリペプチドを生じ得るプロタンパク質を包含
する。

【００５０】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであ
り得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。

【００５１】図１のポリペプチドまたは寄託したｃＤＮ
Ａによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘
導体またはアナログは、（ｉ）１以上のアミノ酸残基が
保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ
酸残基）で置換され、そしてこのような置換されるアミ
ノ酸残基がこの遺伝コードによりコードされるアミノ酸
残基であり得るかあり得ないアミノ酸残基である、また
は（ｉｉ）１以上のアミノ酸残基が置換基を含有する、
または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドがこのポリペプチド
の半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレング
リコール）のような別の化合物に融合されている、また
は（ｉｖ）リーダー配列または分泌配列、もしくは成熟
ポリペプチドの精製に用いられる配列またはプロタンパ
ク質配列のようなさらなるアミノ酸が成熟ポリペプチド
に融合される、フラグメント、誘導体またはアナログで
あり得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナ
ログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にある
と考えられる。

【００５２】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして
好ましくは均質に精製される。

【００５３】用語「単離された」は、物質がその本来の
環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）か
ら取り出されていることを意味する。例えば、生きてい
る動物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドは、単離されていないが、天然の系において共存
する幾つかまたは全部の物質から分離されている同じポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されてい
る。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であ
り得、そして／またはこのようなポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは、組成物の一部であり得るが、それに
もかかわらずそのようなベクターまたは組成物はその天
然の環境の一部ではないため単離されている。

【００５４】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作
される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリ
ペプチドの産生に関する。

【００５５】宿主細胞は、本発明のベクター（これは例
えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり
得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入されるかま
たは形質転換されるかまたはトランスフェクトされ
る）。ベクターは例えば、プラスミド、ウイルス粒子、
ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞
は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、ま
たはＮＴＴ遺伝子を増幅するために適切に改変した従来
の栄養培地中において培養され得る。培養条件（例え
ば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選択される宿主
細胞に以前使用された条件であり、そして当業者には明
らかである。

【００５６】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従
って例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現
するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含まれ
得る。このようなベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非染
色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を包含する。こ
のようなベクターは、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌
性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵
母プラスミド；プラスミドと、ファージＤＮＡおよびウ
イルスＤＮＡ（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウ
イルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病）の組み合わ
せに由来するベクターである。しかし、宿主において複
製可能で、そして存続可能である限り、他の任意のベク
ターも使用され得る。

【００５７】適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベ
クターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は当該分野
で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位
に挿入される。このような手順および他の手順は、当業
者に公知の範囲内であると考えられる。

【００５８】発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発
現制御配列（プロモーター）に作動可能に連結され、ｍ
ＲＮＡの合成を指示する。このようなプロモーターの代
表的な例としては、以下が挙げられ得る：ＬＴＲまたは
ＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔ
ｒｐ、λファージＰ_Lプロモーター、および原核細胞ま
たは真核細胞あるいはそのウイルス内で遺伝子の発現を
制御することが知られている他のプロモーター。発現ベ
クターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位お
よび転写ターミネーターを含有する。ベクターはまた、
発現を増幅するための適切な配列を含有し得る。

【００５９】さらに、発現ベクターは、好ましくは、形
質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例え
ば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクター
ゼまたはネオマイシン耐性、またはＥ．ｃｏｌｉにおけ
るテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提
供する１またはそれ以上の選択マーカー遺伝子を含有す
る。

【００６０】上記のような適切なＤＮＡ配列ならびに適
切なプロモーター配列または制御配列を含有するベクタ
ーは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発
現させるために用いられ得る。

【００６１】適切な宿主の代表的な例としては、以下が
挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細
胞（例えば、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＳｆ９）；動
物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳまたは
Ｂｏｗｅｓ黒色腫）；植物細胞など。適切な宿主の選択
は、本明細書の教示により当業者に公知の範囲内である
と考えられる。

【００６２】さらに詳細には、本発明はまた、上で広範
に記載したように１以上の配列を含む組換え構築物を包
含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベク
ターまたはウイルスベクター）を包含し、このベクター
の中には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入され
ている。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物
はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例え
ば、プロモーターを包含する）を含む。多数の適切なベ
クターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そ
して購入可能である。以下のベクターが例として提供さ
れる。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９
（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃ
ｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ
１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔ
ｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐ
ＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核
性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸ
Ｔ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、
ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）。しかし、それらが宿主において複製可能で、そし
て存続可能である限り、他の任意のプラスミドまたはベ
クターも使用され得る。

【００６３】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐ
ＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特によく知られ
た細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ
７、ｇｐｔ、λＰ_R、Ｐ_Lおよびｔｒｐを包含する。真核
プロモーターは、ＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミジンキナー
ゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レトロウイルス
由来のＬＴＲ、およびマウスＩ型メタロチオネインを包
含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、
十分に当業者のレベル範囲内である。

【００６４】さらなる実施態様では、本発明は上記の構
築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真
核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核細胞
（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は
原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿
主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウムトランス
フェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフ
ェクション、またはエレクトロポレーションにより達成
され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．，Ｂ
ａｔｔｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８６）。

【００６５】宿主細胞中の構築物は、組換え配列により
コードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法
において使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチ
ドは、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得
る。

【００６６】成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、
細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下
で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、このようなタン
パク質を産生するために、本発明のＤＮＡ構築物に由来
するＲＮＡを使用して用いられ得る。原核宿主および真
核宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび
発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）（この開示は、本明細書
中に参考として援用されている）に記載されている。

【００６７】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー
配列を挿入することにより増大される。エンハンサーは
ＤＮＡのシス作用性因子であり、通常は約１０〜約３０
０ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその転写
を増大させる。例は、複製起点ｂｐ１００〜２７０の後
期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの
初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポ
リオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハン
サーを包含する。

【００６８】一般に、組換え発現ベクターは、複製起点
および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー
（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およ
びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）および
下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来プロ
モーターを含有する。このようなプロモーターは、特に
解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ
（ＰＧＫ）、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱シ
ョックタンパク質）をコードするオペロンに由来し得
る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配
列、および好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞周辺
腔または細胞外培地への分泌を指示し得るリーダー配列
と適切な相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列
は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定
化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペプチ
ドを含む融合タンパク質をコードし得る。

【００６９】細菌での使用に有用な発現ベクターは、機
能的なプロモーターと作動可能な読みとり相で、所望の
タンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を適切な翻訳開
始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入すること
により構築される。ベクターは、１以上の表現的な選択
マーカー、およびベクターの維持を保証するため、そし
て所望の場合には、宿主内での増幅を提供するために複
製起点を含有する。形質転換のために適切な原核宿主
は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、
およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の
種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象に用いら
れ得る。

【００７０】代表的な、しかし限定しない例として、細
菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニン
グベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺
伝エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マ
ーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このよう
な市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｕ
ｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｕ
ＳＡ）を包含する。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分
は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列
と組み合わされる。

【００７１】適切な宿主系統の形質転換および適切な細
胞密度への宿主系統の増殖に続いて、選択されたプロモ
ーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的
誘導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養
される。

【００７２】細胞は、代表的には遠心分離により収集さ
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞
は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、また
は細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法により
破砕され得、このような方法は、当業者には周知であ
る。

【００７３】種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換
えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物
発現系の例は、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１７
５（１９８１）に記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯ
Ｓ−７株、および適合性のベクターを発現し得る他の細
胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９
３、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株）を包含する。哺乳
動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターお
よびエンハンサー、および任意の必要なリボソーム結合
部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およ
びスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および
５’側に隣接する非転写配列をも含有する。ＳＶ４０の
スプライス部位およびポリアデニル化部位に由来するＤ
ＮＡ配列は、必要な非転写遺伝エレメントを提供するた
めに使用され得る。

【００７４】ＮＴＴポリペプチドは、以下の方法により
組換え細胞培養物から回収され得、そして精製され得
る。これらの方法には、硫安沈殿またはエタノール沈
殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラ
フィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水的
相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ー、およびレクチンクロマトグラフィーが包含される。
必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（ｒｅｆｏｌ
ｄｉｎｇ）工程が、成熟タンパク質の形状を完全にする
際に使用され得る。最終的に、高性能液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）が、最終的な精製工程に用いられ得
る。

【００７５】本発明のポリペプチドは、天然の精製され
た産物または化学合成手順の産物であり得るか、または
原核宿主または真核宿主（例えば、培養中の細菌、酵
母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から組換え
技術により産生され得る。組換え産生手順に用いられる
宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル
化され得るか、またはグリコシル化され得ない。本発明
のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を
含有し得る。

【００７６】本発明はまた、本発明のＮＴＴポリペプチ
ドと相互作用する神経伝達物質を同定する方法を提供す
る。神経伝達物質がＮＴＴによりシナプス間隙からシナ
プス前ニューロンに移動されるかどうか決定する方法
は、細胞が今やＮＴＴを発現するように、細胞集団をＮ
ＴＴを発現する適切なベクターでトランスフェクトする
工程を包含する。次いで、種々の神経伝達物質を、放射
標識（例えば、トリチウム化）し、そしてトランスフェ
クト細胞とともにインキュベートしてどの神経伝達物質
が細胞内に輸送されるかを同定する。

【００７７】一旦、神経伝達物質が同定されると、化合
物は、ＮＴＴと特異的に相互作用し、そしてその神経伝
達物質を取り込むためのＮＴＴの親和性を増加させるも
の（例えば、アゴニスト）か、または神経伝達物質を取
り込むその能力を減少させるもの（例えば、アンタゴニ
スト／インヒビター）かのいずれであるかを同定するた
めにスクリーニングされ得る。この方法は、ＮＴＴポリ
ペプチドを宿主細胞において発現させるために宿主細胞
を本発明のベクターで形質転換する工程、宿主細胞を、
検出可能なマーカー配列（例えば、放射標識またはビオ
チンのような非放射性標識）により標識されているＮＴ
Ｔの天然の神経伝達物質および潜在的な化合物とともに
インキュベートする工程、および細胞内への神経伝達物
質の移動が阻害されるかまたは増加するかを決定する工
程を包含する。細胞内の神経伝達物質の量を測定するこ
とにより、当業者は、化合物が有効なアゴニストまたは
アンタゴニストであるかどうかを決定し得る。

【００７８】興奮性または抑制性神経伝達物質の存在
は、重要な臨床的意義を有する。例えば、グルタミン酸
は、興奮性の神経伝達物質であり、シナプス間隙内のそ
の存在は、ニューロンにとって有毒であり得る。このニ
ューロン毒性は、筋萎縮性側索硬化症、つまり「ＡＬ
Ｓ」において重大な役割を果たすことが見出されてい
る。さらに、脳卒中の間に、過剰濃度のグルタミン酸が
シナプス間隙中に放出され、そしてニューロン細胞に有
害である。さらに、一般的な疼痛の原因は未知である
が、疼痛は脳のシナプス間隙中への神経伝達物質の放出
により特徴付けられると考えられている。従って、ＮＴ
Ｔのアゴニストは、神経伝達物質の取り込みを刺激する
ために用いられ得、その結果、上記の状態を軽減する。

【００７９】本発明のＮＴＴポリペプチドはまた、イン
ビボでのこのようなポリペプチドの発現により投与され
得、これはしばしば、「遺伝子治療」といわれる。遺伝
子治療は、ＮＴＴアゴニストの適用と同様であるが、し
かし、遺伝子治療においては、本発明のポリヌクレオチ
ドは、宿主の細胞機構が本発明のＮＴＴを発現して、例
えば、ＡＬＳ、脳卒中、および一般的疼痛において所望
される神経伝達物質の取り込みを促進するように投与さ
れる。

【００８０】例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）
を用いてエクソビボで操作され得、次いで、操作された
細胞は、ＮＴＴの発現および神経伝達物質の移動が望ま
れる患者の神経細胞に標的づけられる。このような方法
は当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポ
リペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイル
ス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操
作され得る。

【００８１】同様に、細胞は、インビボでのポリペプチ
ドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によ
りインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、
本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレ
トロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビ
ボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチ
ドの発現のために患者に投与され得る。このような方法
により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの
方法または他の方法は、本発明の教示により当業者には
明らかである。例えば、細胞を操作するための発現媒体
は、レトロウイルス以外のもの（例えば、アデノウイル
ス）であり得る。アデノウイルスは、適切な送達媒体と
組み合わせた後インビボで細胞を操作するために使用さ
れ得る。

【００８２】本発明はまた、本発明のポリペプチドのア
ンタゴニスト／インヒビター、さらには上記のスクリー
ニング法を利用することにより同定されるアンタゴニス
ト／インヒビターに関する。アンタゴニストは、ＮＴＴ
ポリペプチドに対する抗体、または、場合によっては、
ＮＴＴに結合して天然の神経伝達物質に近づき難くし
て、シナプス間隙中の神経伝達物質の濃度を増大させる
オリゴヌクレオチドを包含する。

【００８３】インヒビターは、アンチセンス技術を用い
て調製されたアンチセンス構築物を包含する。アンチセ
ンス技術は、３重ヘリックスの形成あるいはアンチセン
スＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡにより遺伝子発現を
制御するために使用され得る。これらの方法は両方と
も、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に
基づく。例えば、ポリヌクレオチド配列（これは、本発
明の成熟ポリペプチドをコードする）の５’コード部分
が、長さ約１０塩基対〜４０塩基対のアンチセンスＲＮ
Ａオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。Ｄ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関わる遺伝子の領域
に相補的であるように設計され（３重ヘリックス−Ｌｅ
ｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，６：３０７３
（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４
１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）を参照のこ
と）、その結果、転写およびＮＴＴの産生を妨げる。ア
ンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍ
ＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＮＴ
Ｔへの翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎ
ｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９
１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏ
ｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）を参照
のこと）。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセ
ンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡがインビボで発現
されてＮＴＴの産生を阻害し得るように、細胞に送達さ
れ得る。

【００８４】これらの方法において、アンタゴニスト／
インヒビターは、鬱病、不安、癲癇、および他の神経学
的障害および精神障害を処置するために使用され得る。
神経伝達物質輸送系の欠損は、シナプス間隙における神
経伝達物質の濃度の増大または減少を生じ、レセプター
の不適切な刺激を生じる。例えば、鬱病は、脳における
ノルエピネフリンおよび／またはセロトニンの放出の減
少と関連する、と仮定されている。従って、ＮＴＴによ
るシナプス前ニューロン中へのその神経伝達物質の移動
を阻害することにより、これらの神経伝達物質が、それ
らのレセプターとより頻繁に相互作用することを可能に
する。従って、アンタゴニスト／インヒビターの投与
は、上記の状態を軽減するために用いられ得る。アンタ
ゴニスト／インヒビターは、薬学的に受容可能なキャリ
アとともに組成物中に用いられ得る。

【００８５】本発明はまた、潜在的なＮＴＴ特異的アン
タゴニスト／インヒビターを同定するためのアッセイに
関する。このようなアッセイの例は、哺乳動物の視床下
部からシナプトソーム調製物を調製する工程を包含す
る。このような調製物は、ニューロンの末端が摘み取ら
れた「シール」したニューロンである。次いで、シナプ
トソーム調製物は、トリチウム化神経伝達物質および潜
在的なアンタゴニストとともにインキュベートされる。
次いで、神経伝達物質の取り込み程度を測定してアンタ
ゴニストが有効であるかどうかを決定する。

【００８６】本発明の化合物（例えば、アゴニストまた
はアンタゴニスト／インヒビター化合物）は、適切な薬
学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような
組成物は、治療上有効な量のポリペプチド、および薬学
的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含有する。この
ようなキャリアは、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デ
キストロース、水、グリセロール、エタノール、および
それらの組合せを包含するが、これらに限定されない。
処方物は、投与の様式に好適であるべきである。

【００８７】本発明はまた、１以上の本発明の薬学的組
成物の成分で満たされた１以上の容器を含有する薬学的
パックまたはキットを提供する。このような容器は、薬
剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制
する政府機関により規定された形式の通知を伴い得、こ
の通知はヒトへの投与についての製造、使用、または販
売の機関による認可を反映する。さらに、本発明のポリ
ペプチドは、他の治療的化合物と併用して用いられ得
る。

【００８８】薬学的組成物は、その神経伝達物質に対す
るＮＴＴの親和性を有効に増大させるか、またはＮＴＴ
がその神経伝達物質を移動させるのを有効に阻害するの
に有効な量で投与され得、そしてその結果、シナプス間
隙における神経伝達物質の過剰な濃度、または場合によ
り神経伝達物質の低すぎる濃度に関連する異常な状態を
軽減し得る。

【００８９】本発明の配列はまた、染色体の同定に有益
であり得る。配列は、個々のヒト染色体の特定の位置に
特異的に標的付けられ、そしてその位置とハイブリダイ
ズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定
する必要がある。現在、染色体位置のマーキングに利用
可能な実際の配列データ（反復多型性）に基づいた染色
体マーキング試薬はほとんどない。本発明によるＤＮＡ
の染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関連
する遺伝子とを相関させることにおける重要な第１段階
である。

【００９０】簡略に述べれば、配列は、ｃＤＮＡからＰ
ＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製す
ることにより染色体にマップされ得る。ｃＤＮＡのコン
ピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１より多いエキソ
ンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑化しないプ
ライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、
これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体
細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用され
る。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブ
リッドのみが増幅フラグメントを生じる。

【００９１】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅
速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプラ
イマーと共に使用して、類似の方法で特定の染色体由来
のフラグメントのパネルまたは大きなゲノムクローンの
プールを用いて下位位置決め（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａ
ｔｉｏｎ）が達成され得る。染色体にマップするために
同様に使用され得る他のマッピングストラテジーは、染
色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するための、イ
ンサイチュハイブリダイゼーション、標識したフローサ
イトメトリーで選別した染色体でのプレスクリーニン
グ、およびハイブリダイゼーションによる前選択を包含
する。

【００９２】ｃＤＮＡクローンの中期染色体展開物への
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用さ
れ得る。この技術は、５００または６００塩基程度の短
いｃＤＮＡで使用され得る；しかし、２，０００ｂｐよ
りも長いクローンの方が、簡便な検出に充分なシグナル
強度でユニークな染色体位置に結合しやすい。ＦＩＳＨ
は、ＥＳＴが由来するクローンの使用を必要とし、そし
てこのクローンはより長いことが好ましい。例えば、
２，０００ｂｐが良好であり、４，０００ｂｐはより良
好であり、そして４，０００ｂｐを超える長さは、良好
な結果に時間の合理的な割合を得るためにおそらく必要
でない。この技術の総説としては、Ｖｅｒｍａら，Ｈｕ
ｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａ
ｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を
参照のこと。

【００９３】一旦配列が正確な染色体位置にマップされ
ると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝的地図の
データと相関させ得る。（このようなデータは、例え
ば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎ
ｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎに見出される（Ｊｏ
ｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅ
ｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンライ
ンで入手可能である））。次いで、同一の染色体領域に
マップされる遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理
的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。

【００９４】次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤ
ＮＡまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変
異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正
常な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因
因子であると思われる。

【００９５】物理的マッピング技術および遺伝的マッピ
ング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領
域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００と
の間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、
１メガ塩基のマッピング解像度で、そして２０ｋｂあた
り１遺伝子と仮定する。） 罹患個体と非罹患個体との比較は、一般に、まず染色体
の構造変化（例えば、染色体展開物で目視できるか、あ
るいはそのｃＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを使用して検出
可能な欠失または転座）を探す工程を包含する。最終的
には、変異の存在を確認し、そして変異を多型性から区
別するために、数個体由来の遺伝子の完全な配列決定が
必要とされる。

【００９６】このポリペプチド、そのフラグメントまた
は他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれ
らを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させる
ための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例
えば、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体
であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およ
びヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦ
ａｂ発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で公
知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメント
の産生のために使用され得る。

【００９７】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射により、または動物へのポリペプチドの投与により得
られ得る。この動物は、好ましくは非ヒトである。次い
で、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体
に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメ
ントのみをコードする配列でさえも、ネイティブなポリ
ペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され
得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを
発現する組織からポリペプチドを単離するために使用さ
れ得る。

【００９８】モノクローナル抗体の調製のために、細胞
株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技
術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術
（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎ
ａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ
（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術
（Ｋｏｚｂｏｒら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
Ｔｏｄａｙ ４：７２）、およびヒトモノクローナル抗
体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌ
ｅら，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ ａｎｄＣａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌ
ａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）が挙げ
られる。

【００９９】単鎖抗体を産生するために記載された技術
（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するため
に適合させ得る。

【０１００】本発明を以下の実施例を参照にしてさらに
記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定さ
れないことを理解されたい。すべての部または量は、他
に明記しない限り重量基準である。

【０１０１】以下の実施例の理解を容易にするために、
現れる頻度の高い所定の方法および／または用語を記載
する。

【０１０２】「プラスミド」は、小文字のｐの前および
／または後に大文字および／または数字を示すことによ
り命名される。本明細書中の出発プラスミドは、市販で
あり、制限無く公的に入手可能であるか、または公開さ
れた手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得
る。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミド
が当該分野で公知であり、そして当業者には明らかであ
る。

【０１０３】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の所定の配
列でのみ作用する制限酵素でそのＤＮＡを触媒反応的に
切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制
限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、
補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使
用された。分析目的には、代表的には１μｇのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントが約２単位の酵素とともに
約２０μｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築
のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、代表
的には５〜５０μｇのＤＮＡが２０〜２５０単位の酵素
で、より大きな容量中で消化される。特定の制限酵素の
ための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定
される。３７℃にての約１時間のインキュベーション時
間が通常使用されるが、しかしこれは供給者の説明書に
従って変動し得る。消化後、反応物をポリアクリルアミ
ドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離す
る。

【０１０４】切断フラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ，Ｄ．ら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，８：４０５７（１９８０）により記載された８％
ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。

【０１０５】「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデ
オキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合
成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、
５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でＡＴＰ
を用いてリン酸を添加しなければ別のオリゴヌクレオチ
ドと連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸
化されていないフラグメントに連結する。

【０１０６】「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメン
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら、前出、１４６頁）。他に
規定されていなければ、連結は公知の緩衝液および条件
で、大体等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメント
０．５μｇあたり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。

【０１０７】他の記載がない限り、形質転換はＧｒａｈ
ａｍ，Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒＥｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に
記載のように実施した。

【０１０８】本発明の多くの改変および変形が、上記の
教示に照らしてみると可能であり、従って、請求の範囲
の範囲内で、本発明は特に記載した以外にも実施され得
る。

【０１０９】

【実施例】（実施例１：ＮＴＴの細菌性の発現および精
製）ＮＴＴをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ＃７５７
１３を、プロセスされたＮＴＴタンパク質配列（シグナ
ルペプチド配列を引く）の５’側とＮＴＴ遺伝子の３’
側のベクター配列とに対応するＰＣＲオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いて最初に増幅した。ＮＴＴに対応す
るさらなるヌクレオチドを、５’および３’配列にそれ
ぞれに加えた。５’オリゴヌクレオチドプライマーは、
ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位とそれに続くＮＴＴコード
配列の１８ヌクレオチドを含有する配列ＧＡＣＴＡＡＡ
ＧＣＴＴＧＧＣＡＴＣＡＡＴＧＣＣＧＡＡＧＡＡＣを有
する。３’配列ＧＡＡＣＴＴＣＴＡＧＡＧＣＡＧＴＧＧ
ＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧは、ＸｂａＩ部位に相補的な配
列を含有し、これにＮＴＴ配列の１８ヌクレオチドが続
く。制限酵素部位は、細菌性発現ベクターｐＱＥ−９
（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅ
ｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）の
制限酵素部位に対応する。ｐＱＥ−９は、抗生物質耐性
（Ａｍｐ^r）、細菌性複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ−
調節性プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソー
ム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグ、および制限酵
素部位をコードする。次いで、ｐＱＥ−９をＨｉｎｄＩ
ＩＩおよびＸｂａＩで消化した。増幅配列をｐＱＥ−９
に連結し、そしてヒスチジンタグおよびＲＢＳをコード
する配列とインフレームで挿入した。次いで、連結混合
物を用いて、ＱｉａｇｅｎからＭ１５／ｒｅｐ ４の商
標で入手可能であるＥ．ｃｏｌｉ Ｍ１５／ｒｅｐ ４
株を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記載の手順により形質転
換した。Ｍ１５／ｒｅｐ ４は、多コピーのプラスミド
ｐＲＥＰ４を含有し、これはｌａｃＩリプレッサーを発
現し、そしてまたカナマイシン耐性（Ｋａｎ^r）を与え
る。形質転換体は、ＬＢプレート上で増殖するそれらの
能力により同定され、そしてアンピシリン／カナマイシ
ン耐性コロニーが選択された。プラスミドＤＮＡを単離
し、制限分析により確認した。所望の構築物を含有する
クローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ
（２５μｇ／ｍｌ）の両方を添加したＬＢ培地中で一晩
（Ｏ／Ｎ）、液体培養で増殖させた。Ｏ／Ｎ増殖物を用
いて大量の培養物に１：１００〜１：２５０の比で植え
付ける。細胞を、０．４〜０．６の間の光学密度６００
（Ｏ．Ｄ．⁶⁰⁰）まで増殖させた。次いで、ＩＰＴＧ
（「イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド」）を１ｍＭの最終濃度まで添加した。ＩＰＴＧは、
ｌａｃＩリプレッサーを不活化し、遺伝子発現の増大を
導くＰ／Ｏをクリアーにする。細胞をさらに３〜４時間
増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により採集した。
細胞ペレットをカオトロピック剤である６モル グアニ
ジンＨＣｌ中で可溶化した。清澄化後、可溶化ＮＴＴ
を、６−Ｈｉｓタグを含有するタンパク質による強固な
結合を可能にする条件下のニッケルキレートカラムでの
クロマトグラフィーによりこの溶液から精製した。Ｈｏ
ｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ ４１１：１７７−１８４（１９８４）。ＮＴＴを６
モルグアニジンＨＣｌ（ｐＨ５．０）中でカラムから溶
出し、そして再生の目的で３モルグアニジンＨＣｌ、１
００ｍＭ リン酸ナトリウム、１０ミリモルグルタチオ
ン（還元型）、および２ミリモル グルタチオン（酸化
型）に調整した。この溶液で１２時間インキュベーショ
ンした後、タンパク質を１０ミリモルリン酸ナトリウム
に対して透析した。

【０１１０】（実施例２：ＣＯＳ細胞における組換えＮ
ＴＴの発現）ＮＴＴ ＨＡ発現プラスミドは、以下を含
むベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）に由来する：１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシ
リン抵抗性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、４）Ｃ
ＭＶプロモーター、それに続くポリリンカー領域、ＳＶ
４０イントロンおよびポリアデニル化部位。完全なＮＴ
Ｔ前駆体とその３’末端にインフレームで融合したＨＡ
タグとをコードするＤＮＡフラグメントを、ベクターの
ポリリンカー領域にクローン化した。従って、組換えタ
ンパク質の発現は、ＣＭＶプロモーターの支配を受け
る。ＨＡタグは、以前に記載した（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ，
Ｈ．Ｎｉｍａｎ，Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ，Ａ Ｃｈｅｒ
ｅｎｓｏｎ，Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，およびＲ．Ｌｅｒ
ｎｅｒ，１９８４，Ｃｅｌｌ３７：７６７）インフルエ
ンザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応す
る。本発明者の標的タンパク質に対するＨＡタグの融合
は、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いる組換えタン
パク質の容易な検出を可能にする。

【０１１１】プラスミド構築ストラテジーを以下に記
す：ＮＴＴをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ ＃ ７
５７１３を、２つのプライマーを用いて、クローン化さ
れた元のＥＳＴに対するＰＣＲにより構築した：５’プ
ライマー配列（ＧＡＣＴＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡ
ＴＧＣＣＧＡＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧ）は、Ｂｇ
ｌＩＩ部位およびその後に開始コドンから始まるＮＴＴ
コード配列の２１ヌクレオチドを含有する；３’配列
（ＧＡＡＣＴＧＡＴＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＣＡＧ
ＣＴＣＡＧ）は、ＥｃｏＲＶ部位、翻訳ストップコド
ン、およびＮＴＴコード配列の最後の１８ヌクレオチド
に対して相補的な配列を含有する。従って、ＰＣＲ産物
は、ＢｇｌＩＩ部位、ＮＴＴコード配列、それに続く翻
訳停止ストップコドン、およびＥｃｏＲＶ部位を含有す
る。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントおよびベクター（ｐ
ｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ）を、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＶ
で消化した。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ，１１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎ
ｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７
から入手可能）に形質転換し、形質転換培養物をアンピ
シリン培地プレート上にプレートし、そして抵抗性コロ
ニーを選択した。プラスミドＤＮＡを、形質転換体から
単離して、正しいフラグメントの存在に対する制限分析
により試験した。組換えＮＴＴの発現のために、ＣＯＳ
細胞を、ＤＥＡＥデキストラン法により発現ベクターで
トランスフェクトした（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ
ｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９８９））。ＮＴＴ ＨＡタン
パク質の発現を、放射性標識法および免疫沈降法により
検出した。（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ、Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９８８））。細胞
を、トランスフェクションの２日後に³⁵Ｓ−システイン
で８時間標識した。次いで培養培地を採集し、そして細
胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４
０、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．
５））で溶解した。（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、前出３
７：７６７（１９８４））。細胞溶解物および培養培地
の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈澱させ
た。沈澱したタンパク質を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルで分析した。

【０１１２】（実施例３：ヒト組織におけるＮＴＴの発
現パターン）ヒト組織におけるＮＴＴの発現レベルを調
べるために、ノーザンブロット分析を行った。細胞の総
ＲＮＡサンプルを、ＲＮＡｚｏｌ^TMＢシステム（Ｂｉｏ
ｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、６
０２３ Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｏｐ Ｅａｓｔ、Ｈｏｕｓｔ
ｏｎ、ＴＸ ７７０３３）を用いて単離した。ヒトの特
定化した各組織から単離された約１０μｇの総ＲＮＡ
を、１％アガロースゲルで分離し、そしてナイロンフィ
ルター上にブロットした（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔ
ｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｐｒｅｓｓ、（１９８９））。標識反応を、Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキットに従って、
５０ｎｇのＤＮＡフラグメントを用いて行った。標識Ｄ
ＮＡを、Ｓｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラムで精製した。
（５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．５６０３ Ａ
ｒａｐａｈｏｅ Ｒｏａｄ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ ８
０３０３）。次いでフィルターを、０．５Ｍ ＮａＰＯ
₄（ｐＨ７．４）および７％ＳＤＳ中１，０００，００
０ｃｐｍ／ｍｌで放射性標識した完全長のＭＩＰ−２遺
伝子と、一晩、６５℃でハイブリダイズさせた。０．５
×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いる、室温で２回、そし
て６０℃で２回の洗浄後、次いでフィルターを増感スク
リーンを用いて−７０℃で一晩感光させた。ＮＴＴに対
するメッセージＲＮＡは、脳に豊富であった。

【０１１３】

【発明の効果】本発明により、神経伝達物質輸送体タン
パク質およびこのタンパク質をコードするＤＮＡ（ＲＮ
Ａ）が提供される。

【０１１４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Human Genome Sciences, Inc. <120> Neurotransmitter Transporter <130> F1-01648B03 <150> JP P1995-529590 <151> 1994-05-16 <160> 2 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 2486 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (267)..(2447) <400> 1 cggaggcagg gagtgaggag cgagcggagt cgcgtgcgcc ggcgcgagct ccgggtcgcc 60 ccagccccag ccgggggcct gtggcggggg aggagctgtg cgtccgcgac ccgtcgggga 120 tcgcagctgc tcggccggag tgcacgggcc gagtctgcgc gactacccac gcgtgacagg 180 tccctgaatg agaaggagct gacagcagct gaattccatc ttctctgtgt gctggggagc 240 agggctacac ggcccaggtg gcatca atg ccg aag aac agc aaa gtg acc cag 293 Met Pro Lys Asn Ser Lys Val Thr Gln 1 5 cgt gag cac agc agt gag cat gtc act gag tcc gtg gcc gac ctg ctg 341 Arg Glu His Ser Ser Glu His Val Thr Glu Ser Val Ala Asp Leu Leu 10 15 20 25 gcc ctc gag gag cct gtg gac tat aag cag agt gta ctg aat gtg gct 389 Ala Leu Glu Glu Pro Val Asp Tyr Lys Gln Ser Val Leu Asn Val Ala 30 35 40 ggt gag gca ggc ggc aag cag aag gcg gtg gag gag gag ctg gat gca 437 Gly Glu Ala Gly Gly Lys Gln Lys Ala Val Glu Glu Glu Leu Asp Ala 45 50 55 gag gac cgg ccg gcc tgg aac agt aag ctg cag tac atc ctg gcc cag 485 Glu Asp Arg Pro Ala Trp Asn Ser Lys Leu Gln Tyr Ile Leu Ala Gln 60 65 70 att ggc ttc tct gtg ggc ctc ggc aac atc tgg agg ttc ccc tac ctg 533 Ile Gly Phe Ser Val Gly Leu Gly Asn Ile Trp Arg Phe Pro Tyr Leu 75 80 85 tgc cag aaa aat gga gga ggt gct tac ctg gtg ccc tac ctg gtg ctg 581 Cys Gln Lys Asn Gly Gly Gly Ala Tyr Leu Val Pro Tyr Leu Val Leu 90 95 100 105 ctg atc atc atc ggg atc ccc ctc ttc ttc ctg gag ctg gct gtg ggt 629 Leu Ile Ile Ile Gly Ile Pro Leu Phe Phe Leu Glu Leu Ala Val Gly 110 115 120 cag agg atc cgc cgc gga agc atc ggt gtg tgg cac tat ata tgt ccc 677 Gln Arg Ile Arg Arg Gly Ser Ile Gly Val Trp His Tyr Ile Cys Pro 125 130 135 cgc ctg ggg ggg atc ggc ttc tcc agc tgc ata gtc tgt ctc ttt gtg 725 Arg Leu Gly Gly Ile Gly Phe Ser Ser Cys Ile Val Cys Leu Phe Val 140 145 150 ggg ctg tat tat aat gtg atc atc ggg tgg agc atc ttc tat ttc ttc 773 Gly Leu Tyr Tyr Asn Val Ile Ile Gly Trp Ser Ile Phe Tyr Phe Phe 155 160 165 aag tcc ttc cag tac ccg ctg ccc tgg agt gaa tgt cct gtc gtc agg 821 Lys Ser Phe Gln Tyr Pro Leu Pro Trp Ser Glu Cys Pro Val Val Arg 170 175 180 185 aat ggg agc gtc gca gtg gtg gag gca gag tgt gaa aag agc tca gcc 869 Asn Gly Ser Val Ala Val Val Glu Ala Glu Cys Glu Lys Ser Ser Ala 190 195 200 act acc tac ttc tgg tac cga gag gct ttg gac atc tct gac tcc atc 917 Thr Thr Tyr Phe Trp Tyr Arg Glu Ala Leu Asp Ile Ser Asp Ser Ile 205 210 215 tcg gag agt ggg ggc ctc aac tgg aag atg acc ctg tgc ctc ctc gtg 965 Ser Glu Ser Gly Gly Leu Asn Trp Lys Met Thr Leu Cys Leu Leu Val 220 225 230 gtc tgg agc atc ggg ggg atg gct gtc ggt aag ggc atc cag tcc tcg 1013 Val Trp Ser Ile Gly Gly Met Ala Val Gly Lys Gly Ile Gln Ser Ser 235 240 245 ggg aag gtg atg tat ttc agc tcc ctc ttc ccc tac gtg gtg ctg gcc 1061 Gly Lys Val Met Tyr Phe Ser Ser Leu Phe Pro Tyr Val Val Leu Ala 250 255 260 265 tgc ttc ctg gtc cgg ggg ttg ttg ttg cga ggg gca gtt gat ggc atc 1109 Cys Phe Leu Val Arg Gly Leu Leu Leu Arg Gly Ala Val Asp Gly Ile 270 275 280 cta cac atg ttc act ccc aag ctg gtc aag atg ctg gac ccc cag gtg 1157 Leu His Met Phe Thr Pro Lys Leu Val Lys Met Leu Asp Pro Gln Val 285 290 295 tgg cgg gag gta gct acc cag gtc ttc ttt ggc ttg ggt ctg ggc ttt 1205 Trp Arg Glu Val Ala Thr Gln Val Phe Phe Gly Leu Gly Leu Gly Phe 300 305 310 ggt ggt gtc att gtc ttc tcc agt tac aat aag cag gac aac aac tgc 1253 Gly Gly Val Ile Val Phe Ser Ser Tyr Asn Lys Gln Asp Asn Asn Cys 315 320 325 cac ttc gat ggc gcc ctg gtg tcc ttc atc aac ttc ttc acg tca gtg 1301 His Phe Asp Gly Ala Leu Val Ser Phe Ile Asn Phe Phe Thr Ser Val 330 335 340 345 ttg gcc acc ctc gtg gtg ttt gtt gtt ttg ggc ttc aag gcc aac atc 1349 Leu Ala Thr Leu Val Val Phe Val Val Leu Gly Phe Lys Ala Asn Ile 350 355 360 atg aat gag aag tgt gtg gtc gag aat gct gag aaa atc cta ggg tac 1397 Met Asn Glu Lys Cys Val Val Glu Asn Ala Glu Lys Ile Leu Gly Tyr 365 370 375 ctt aac acc aac gtc ctg agc cgg gac ctc atc cca ccc cac gtc aac 1445 Leu Asn Thr Asn Val Leu Ser Arg Asp Leu Ile Pro Pro His Val Asn 380 385 390 ttc tcc cac ctg acc aca aag gac tac atg gag atg gac aat gtc atc 1493 Phe Ser His Leu Thr Thr Lys Asp Tyr Met Glu Met Asp Asn Val Ile 395 400 405 atg acc gtg aag gag gac cag ttc tca gcc ctg ggc ctt gac ccc tgc 1541 Met Thr Val Lys Glu Asp Gln Phe Ser Ala Leu Gly Leu Asp Pro Cys 410 415 420 425 ctt ctg gag gac gag ctg gac aag tcc gtg cag ggc aca ggc ctg gcc 1589 Leu Leu Glu Asp Glu Leu Asp Lys Ser Val Gln Gly Thr Gly Leu Ala 430 435 440 ttc atc gcc ttc act gag gcc atg acg cac ttc ccc acc tcc ccg ttc 1637 Phe Ile Ala Phe Thr Glu Ala Met Thr His Phe Pro Thr Ser Pro Phe 445 450 455 tgg tcc gtc atg ttc ttc ttg atg ctt atc aac ctg ggc ctg ggc agc 1685 Trp Ser Val Met Phe Phe Leu Met Leu Ile Asn Leu Gly Leu Gly Ser 460 465 470 atg atc ggg acc atg gca ggc atc acc acg ccc atc atc gac acc tcc 1733 Met Ile Gly Thr Met Ala Gly Ile Thr Thr Pro Ile Ile Asp Thr Ser 475 480 485 aag gtg ccc aag gag atg ttc aca gtg ggc tgc tgt gtc ttt aca ttc 1781 Lys Val Pro Lys Glu Met Phe Thr Val Gly Cys Cys Val Phe Thr Phe 490 495 500 505 ctc gtg gga ctg ttg ttc gtc cag cgc tcc gga aac tac ttt gtc acc 1829 Leu Val Gly Leu Leu Phe Val Gln Arg Ser Gly Asn Tyr Phe Val Thr 510 515 520 atg ttc gat gac tac tca gcc acg ctg cca ctc act ctc atc gtc atc 1877 Met Phe Asp Asp Tyr Ser Ala Thr Leu Pro Leu Thr Leu Ile Val Ile 525 530 535 ctt gag aac atc gct gtg gcc tgg att tat gga ccc aag aag ttc atg 1925 Leu Glu Asn Ile Ala Val Ala Trp Ile Tyr Gly Pro Lys Lys Phe Met 540 545 550 cag gag ctg acg gag atg ctg ggc ttc cgc ccc tac cgc ttc tat ttc 1973 Gln Glu Leu Thr Glu Met Leu Gly Phe Arg Pro Tyr Arg Phe Tyr Phe 555 560 565 tac atg tgg aag ttc gtg tct cca cta tgc atg gct gtg ctc acc aca 2021 Tyr Met Trp Lys Phe Val Ser Pro Leu Cys Met Ala Val Leu Thr Thr 570 575 580 585 gcc agc atc atc cag ctg ggg gtc acg ccc ccg gcc tac agc gcc tgg 2069 Ala Ser Ile Ile Gln Leu Gly Val Thr Pro Pro Ala Tyr Ser Ala Trp 590 595 600 atc aag gag gag gct gcc gag cgc tac ctg tat ttc ccc aac tgg ccc 2117 Ile Lys Glu Glu Ala Ala Glu Arg Tyr Leu Tyr Phe Pro Asn Trp Pro 605 610 615 atg gca ctc ctg atc acc ctc atc gtc gtg gcg acg ctg ccc atc cct 2165 Met Ala Leu Leu Ile Thr Leu Ile Val Val Ala Thr Leu Pro Ile Pro 620 625 630 gtg gtg ttc gtc ctg cgg cac ttc cac ctg ctc tct gat ggc tcc aac 2213 Val Val Phe Val Leu Arg His Phe His Leu Leu Ser Asp Gly Ser Asn 635 640 645 acc ctc tcc gtg tcc tac aag aag gcc cgc atg atg aag gac atc tcc 2261 Thr Leu Ser Val Ser Tyr Lys Lys Ala Arg Met Met Lys Asp Ile Ser 650 655 660 665 aac ctg gag gag aac gat gag acc cgc ttc atc ctc agc aag gtg ccc 2309 Asn Leu Glu Glu Asn Asp Glu Thr Arg Phe Ile Leu Ser Lys Val Pro 670 675 680 agt gag gca cct tcc ccc atg ccc act cac cgt tcc tat ctg ggg ccc 2357 Ser Glu Ala Pro Ser Pro Met Pro Thr His Arg Ser Tyr Leu Gly Pro 685 690 695 ggc agc aca tca ccc ctg gag acc agc tgg aac ccc aat gga ccc tat 2405 Gly Ser Thr Ser Pro Leu Glu Thr Ser Trp Asn Pro Asn Gly Pro Tyr 700 705 710 ggg cgc ggc tac ctg ctg gcc agc acc cct gag tct gag ctg 2447 Gly Arg Gly Tyr Leu Leu Ala Ser Thr Pro Glu Ser Glu Leu 715 720 725 tgaccactgc ccaagcccat gcccgctctc cccccaccg 2486 <210> 2 <211> 727 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Lys Asn Ser Lys Val Thr Gln Arg Glu His Ser Ser Glu His 1 5 10 15 Val Thr Glu Ser Val Ala Asp Leu Leu Ala Leu Glu Glu Pro Val Asp 20 25 30 Tyr Lys Gln Ser Val Leu Asn Val Ala Gly Glu Ala Gly Gly Lys Gln 35 40 45 Lys Ala Val Glu Glu Glu Leu Asp Ala Glu Asp Arg Pro Ala Trp Asn 50 55 60 Ser Lys Leu Gln Tyr Ile Leu Ala Gln Ile Gly Phe Ser Val Gly Leu 65 70 75 80 Gly Asn Ile Trp Arg Phe Pro Tyr Leu Cys Gln Lys Asn Gly Gly Gly 85 90 95 Ala Tyr Leu Val Pro Tyr Leu Val Leu Leu Ile Ile Ile Gly Ile Pro 100 105 110 Leu Phe Phe Leu Glu Leu Ala Val Gly Gln Arg Ile Arg Arg Gly Ser 115 120 125 Ile Gly Val Trp His Tyr Ile Cys Pro Arg Leu Gly Gly Ile Gly Phe 130 135 140 Ser Ser Cys Ile Val Cys Leu Phe Val Gly Leu Tyr Tyr Asn Val Ile 145 150 155 160 Ile Gly Trp Ser Ile Phe Tyr Phe Phe Lys Ser Phe Gln Tyr Pro Leu 165 170 175 Pro Trp Ser Glu Cys Pro Val Val Arg Asn Gly Ser Val Ala Val Val 180 185 190 Glu Ala Glu Cys Glu Lys Ser Ser Ala Thr Thr Tyr Phe Trp Tyr Arg 195 200 205 Glu Ala Leu Asp Ile Ser Asp Ser Ile Ser Glu Ser Gly Gly Leu Asn 210 215 220 Trp Lys Met Thr Leu Cys Leu Leu Val Val Trp Ser Ile Gly Gly Met 225 230 235 240 Ala Val Gly Lys Gly Ile Gln Ser Ser Gly Lys Val Met Tyr Phe Ser 245 250 255 Ser Leu Phe Pro Tyr Val Val Leu Ala Cys Phe Leu Val Arg Gly Leu 260 265 270 Leu Leu Arg Gly Ala Val Asp Gly Ile Leu His Met Phe Thr Pro Lys 275 280 285 Leu Val Lys Met Leu Asp Pro Gln Val Trp Arg Glu Val Ala Thr Gln 290 295 300 Val Phe Phe Gly Leu Gly Leu Gly Phe Gly Gly Val Ile Val Phe Ser 305 310 315 320 Ser Tyr Asn Lys Gln Asp Asn Asn Cys His Phe Asp Gly Ala Leu Val 325 330 335 Ser Phe Ile Asn Phe Phe Thr Ser Val Leu Ala Thr Leu Val Val Phe 340 345 350 Val Val Leu Gly Phe Lys Ala Asn Ile Met Asn Glu Lys Cys Val Val 355 360 365 Glu Asn Ala Glu Lys Ile Leu Gly Tyr Leu Asn Thr Asn Val Leu Ser 370 375 380 Arg Asp Leu Ile Pro Pro His Val Asn Phe Ser His Leu Thr Thr Lys 385 390 395 400 Asp Tyr Met Glu Met Asp Asn Val Ile Met Thr Val Lys Glu Asp Gln 405 410 415 Phe Ser Ala Leu Gly Leu Asp Pro Cys Leu Leu Glu Asp Glu Leu Asp 420 425 430 Lys Ser Val Gln Gly Thr Gly Leu Ala Phe Ile Ala Phe Thr Glu Ala 435 440 445 Met Thr His Phe Pro Thr Ser Pro Phe Trp Ser Val Met Phe Phe Leu 450 455 460 Met Leu Ile Asn Leu Gly Leu Gly Ser Met Ile Gly Thr Met Ala Gly 465 470 475 480 Ile Thr Thr Pro Ile Ile Asp Thr Ser Lys Val Pro Lys Glu Met Phe 485 490 495 Thr Val Gly Cys Cys Val Phe Thr Phe Leu Val Gly Leu Leu Phe Val 500 505 510 Gln Arg Ser Gly Asn Tyr Phe Val Thr Met Phe Asp Asp Tyr Ser Ala 515 520 525 Thr Leu Pro Leu Thr Leu Ile Val Ile Leu Glu Asn Ile Ala Val Ala 530 535 540 Trp Ile Tyr Gly Pro Lys Lys Phe Met Gln Glu Leu Thr Glu Met Leu 545 550 555 560 Gly Phe Arg Pro Tyr Arg Phe Tyr Phe Tyr Met Trp Lys Phe Val Ser 565 570 575 Pro Leu Cys Met Ala Val Leu Thr Thr Ala Ser Ile Ile Gln Leu Gly 580 585 590 Val Thr Pro Pro Ala Tyr Ser Ala Trp Ile Lys Glu Glu Ala Ala Glu 595 600 605 Arg Tyr Leu Tyr Phe Pro Asn Trp Pro Met Ala Leu Leu Ile Thr Leu 610 615 620 Ile Val Val Ala Thr Leu Pro Ile Pro Val Val Phe Val Leu Arg His 625 630 635 640 Phe His Leu Leu Ser Asp Gly Ser Asn Thr Leu Ser Val Ser Tyr Lys 645 650 655 Lys Ala Arg Met Met Lys Asp Ile Ser Asn Leu Glu Glu Asn Asp Glu 660 665 670 Thr Arg Phe Ile Leu Ser Lys Val Pro Ser Glu Ala Pro Ser Pro Met 675 680 685 Pro Thr His Arg Ser Tyr Leu Gly Pro Gly Ser Thr Ser Pro Leu Glu 690 695 700 Thr Ser Trp Asn Pro Asn Gly Pro Tyr Gly Arg Gly Tyr Leu Leu Ala 705 710 715 720 Ser Thr Pro Glu Ser Glu Leu 725

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１Ａは、成熟ＮＴＴポリペプチドのｃＤＮ
Ａ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す図であ
る。アミノ酸配列では、標準的な１文字略語を使用し
た。

【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａの続きである。

【図１Ｃ】図１Ｃは、図１Ｂの続きである。

【図１Ｄ】図１Ｄは、図１Ｃの続きである。

【図１Ｅ】図１Ｅは、図１Ｄの続きである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 25/04 ４Ｈ０４５ Ａ６１Ｐ 25/00 １０１ 25/08 25/04 25/22 25/08 25/24 25/22 Ｃ０７Ｋ 14/47 25/24 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (71)出願人 597018381 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ, Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 イ リ アメリカ合衆国 メリーランド 20878, ガイザ−スバーグ， ホワード ランデ ィング ドライブ 16125 (72)発明者 ロバート ディー． フレイッシュマン. アメリカ合衆国 ワシントン ディーシー 20008， エヌダブリュー ナンバー 134， ウッドリー ロード 2800 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA07 CA09 DA02 DA06 EA04 GA11 GA27 HA03 HA13 HA14 4B064 AG01 CA02 CA10 CA19 CC01 CC24 CE02 CE03 CE06 CE10 DA01 DA13 4C084 AA02 AA13 AA17 BA01 BA22 CA53 NA14 ZA02 ZA06 ZA08 ZA12 ZA18 ZC41 4C086 AA02 EA16 NA14 ZA01 ZA06 ZA08 ZA12 ZA18 ZC41 4C087 AA02 BC83 NA14 ZA02 ZA06 ZA08 ZA12 ZA18 ZC41 4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 CA40 EA20 EA50 FA74 GA01 GA05 GA15 GA21

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単離されたポリヌクレオチドであって、 （ａ）図１の推定アミノ酸配列を有するＮＴＴポリペプ
   チドまたは該ポリペプチドのフラグメント、アナログま
   たは誘導体をコードするポリヌクレオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ寄託物第７５７１３号に含まれるｃＤＮ
   Ａによりコードされるアミノ酸配列を有するＮＴＴポリ
   ペプチドまたは該ポリペプチドのフラグメント、アナロ
   グまたは誘導体をコードするポリヌクレオチド；からな
   る群から選択される、ポリヌクレオチド。