JP3687974B2 - スタンニウスの小体の蛋白、スタンニオカルシン - Google Patents
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Description
スタンニオカルシン(以前は、テレオカルシンならびにヒポカルシンとして知られていた)は、抗−高カルシウム血症作用のある糖蛋白ホルモンであり、骨の多い魚に特有のスタンニウスの小体という内分泌線により産生される。本発明ポリペプチドは、カルシウムレベルの調節に関与する魚類由来の糖蛋白ホルモンに対してアミノ酸レベルで高い相同性を有する。
ヒト以外のスタンニウスの小体の蛋白は広く研究されている。最近、スタンニウスの小体の蛋白がアングイラ・アウストラリス(Anguilla australis)から精製され、クローン化された。硬骨魚類の腎臓は分泌線、すなわちスタンニウスの小体を含むことがわかった。電子顕微鏡により、該顆粒は蛋白性であり、未知の生理学的および生物学的機能を有するホルモンまたは酵素を生じうることが示されている(バトカス,エイ(Butkus,A.)ら、モレキュラー・アンド・セル・エンドクリノロジー(Mol.Cell Endocrinol.)、第54巻:123〜133頁(1987年))。
また、マスのスタンニウスの小体から糖蛋白が単離され精製され、魚類の主要低カルシウム血症性ホルモンであるヒポカルシンと考えられた。この生成物はいくつかの種(すなわち、ヨーロッパのウナギ、チラピア・ゴールドフィッシュ(tilapia goldfish)およびコイ)のスタンニウスの小体に比較的多量に存在する。典型的には、ヒポカルシンは、実験的に誘導された血中カルシウム濃度の上昇に応答してスタンニウスの小体から放出される。超微細構造の観察により、この処理の後、スタンニウスの小体のヒポカルシン産生細胞タイプがほとんど完全に顆粒化されることが示されている。単離された糖蛋白は見かけの分子量54kdaを有する(ラフェバー エフ・ピー(Lafeber F.P.)ら、ジェネラル・アンド・コンパラティブ・エンドクリノロジー(Gen.Comp.Endocrinol.)、第69巻:19〜30頁(1988年))。
そのうえ、テレオカルシンのいくつかの合成ペプチドフラグメントが若いニジマス(サルモ・ガイルドネリ(Salmo Gairdneri))におけるカルシウム摂取を阻害することが、最近示された。ウナギおよびサケ双方のテレオカルシンのN−末端ペプチド(アミノ酸1〜20)は、高ポイントのカルシウム摂取サイクルにおいてCa45摂取を有意に阻害するが(75%まで)、モル基準の該ペプチドの有効量は無処理分子の20ないし200倍であった。対照的に、ウナギ・テレオカルシンのC−末端フラグメント(アミノ酸202〜231)はカルシウム摂取に対する阻害効果を有しない(ミリケン シー・イー(Milliken C.E.)ら、ジェネラル・アンド・コンパラティブ・エンドクリノロジー、第77巻:416〜422頁(1990年))。
また、2種のサケ・スタンニオカルシンの精製および特徴付け、並びにインビボおよびインビトロ両方のモデルを用いたカルシウムに応答したホルモン分泌の調節に関する記載がある。サケ・CSラムダgt10cDNAライブラリー由来のコホ・サーモン(coho salmon)のスタンニオカルシンのメッセンジャーRNA(mRNA)のクローニングおよびcDNA配列分析が記載されている。サケのスタンニオカルシンmRNAは長さ約2Kdaであり、256個のアミノ酸の最初の翻訳生成物をコードしている。その初めの33個の残基は該ホルモンのプレ蛋白領域からなり、一方、残りの223個の残基は該ホルモンの成熟形態を形成する(ワグナー ジー・エフ(Wagner G.F.)ら、モレキュラー・アンド・セル・エンドクロノロジー、第90巻:7〜15頁(1992年))。
本発明の1の態様によれば、スタンニウスの小体の蛋白である新規成熟ポリペプチド、およびそのフラグメント、アナログならびに誘導体が提供される。本発明のスタンニウスの小体の蛋白はヒト起源である。
本発明のもう1つの態様によれば、かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)が提供される。
本発明のさらにもう1つの態様によれば、組み換え法によるかかるポリペプチドの製造方法が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、治療目的の、例えば、腎臓、骨ならびに心臓の疾患を引き起こす電解質に関する疾患、および増大した骨吸収による疾患、例えば、骨粗鬆症ならびにパジェット病の治療のための、かかるポリペプチド、またはかかるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの使用方法が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、かかるポリペプチドに対する抗体が提供される。かかる抗体を、テタニー、けいれんおよび他の関連疾患を引き起こす低カルシウム血症の治療に用いてもよい。低カルシウム血症は、腎不全、副甲状腺機能亢進症、重症の感染またはカルシウムを細胞間液体からトラップする熱傷、そして膵機能不全を包含する多くの異なる病因から起こる。
本発明のさらなる態様によれば、かかるポリペプチドに対するアンタゴニスト/阻害剤が提供され、それらを、かかるポリペプチドの作用を阻害するために、例えば、低カルシウム血症および骨粗鬆症の治療に使用してもよい。
本発明のこれらのおよび他の態様は、本明細書の教示から統合はに明らかなはずである。
以下の図面は本発明の具体例の説明であって、請求の範囲により画定される本発明の範囲を限定するものではない。
図1は、プロセッシングされたスタンニウスの小体の蛋白のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸配列を標準的な3文字略記コードを用いて下に示す。
図2はヒト・スタンニオカルシン(上の行)ポリペプチド配列とオンコリンクス・キスチ(Oncorhynchus kisutch)から単離されたスタンニオカルシン(下の行)ポリペプチド配列との比較を示す。オンコリンクス・キスチ由来のスタンニオカルシンのアミノ酸204以降は明らかな配列相同性は存在しない。オンコリンクス・キスチから単離されたスタンニオカルシンの全長は256アミノ酸である。
図3は、細菌での発現ならびに精製後のヒト・スタンニオカルシンポリペプチドのバンドのパターンを示す。
本発明の1の態様によれば、図1の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または1994年1月25日にATCC寄託物75652として寄託されたクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドをコードしている単離核酸(ポリヌクレオチド)が提供される。図1のポリヌクレオチド配列は、最初の15個のヌクレオチドからなるプレ配列を含む。該ポリペプチド配列は247個のアミノ酸の翻訳生成物をコードしており、その最初の33個のアミノ酸は当該蛋白のプレプロ領域を示しうる。よって、プレプロ領域の開裂により、214個のアミノ酸の成熟活性ポリペプチドが生じる。
本発明ポリヌクレオチドはヒト・初期段階の肺のcDNAライブラリーから単離された。それは、247個のアミノ酸のプレプロポリペプチドをコーしている読み取り枠を含んでいる。該ポリペプチドは、アングイラ・アウストラリス由来のスタンニオカルシンに対して高度の相同性を有し、195個のアミノ酸のオーバーラップ中119個(61%)の同一アミノ酸がある。さらに、それはオンコリンクス・キスチ由来のスタンニオカルシンに対しても非常に高い相同性を有し、204個のアミノ酸のオーバーラップ中118個(57%)の同一アミノ酸がある。
本発明ポリヌクレオチドはRNAの形態であってもよく、あるいはDNAの形態であってもよい。DNAはcDNA、ゲノムDNA、および合成DNAを包含する。DNAは2本鎖であってもよく、あるいは1本鎖であってもよく、さらに、1本鎖である場合には、コーディング配列であってもよく、あるいは非コーディング(アンチ−センス)鎖であってもよい。成熟ポリペプチドをコードするコーディング配列は、図1に示すコーディング配列と同一であってもよく、また、寄託されたクローンのコーディング配列と同じであってもよく、あるいは遺伝コードの剰余または縮重の結果として図1のDNAまたは寄託cDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードしている別のコーディング配列であってもよい。
図1の成熟ポリペプチドまたは寄託cDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは以下のものを包含する:成熟ポリペプチドに関するコーディング配列のみ;成熟ポリペプチドに関するコーディング配列およびリーダーもしくは分泌配列のごときさらなるコーディング配列またはプロ蛋白配列に関するコーディング配列;成熟ポリペプチドに関するコーディング配列(および所望によりさらなるコーディング配列)およびイントロンのごとき非コーディング配列または成熟ポリペプチドに関するコーディング配列の5'および/または3'非コーディング配列。
よって、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、該ポリペプチドに関するコーディング配列のみを含むポリヌクレオチドならびにさらなるコーディングおよび/または非コーディング配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
さらに本発明は、図1の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする上記ポリヌクレオチドの変種に関する。ポリヌクレオチドの変種は、当該ポリヌクレオチドの天然に存在するアリール変種であってもよく、あるいは当該ポリヌクレオチドの天然に存在しない変種であってもよい。
よって、本発明は、図1に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託クローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびにかかるポリヌクレオチドの変種であって図1のポリペプチドまたは寄託クローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体もしくはアナログをコードする変種を包含する。かかるヌクレオチド変種は欠失変種、置換変種および付加変種または挿入変種を包含する。
上記のごとく、ポリヌクレオチドは、図1に示すコーディング配列または寄託クローンのコーディング配列の天然に存在するアリール変種であるコーディング配列を有していてもよい。当該分野において知られているように、アリール変種とは、1個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失もしくは付加を有していてもよく、コードされるポリペプチドの機能を実質的には変化させないポリヌクレオチド配列の変化した形態である。
また本発明は、成熟ポリペプチドに関するコーディング配列が細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列(例えば、細胞からのポリペプチドの輸送をコントロールするための分泌配列として機能するリーダー配列)に同じ読み取り枠において融合していてもよいポリヌクレオチドを包含する。リーダー配列を有するポリペプチドはプレ蛋白であり、宿主細胞によりそのリーダー配列が開裂されてポリペプチドの成熟形態を形成しうる。該ポリヌクレオチドは、天然蛋白にさらなる5'アミノ酸残基が加わったプロ蛋白をコードしていてもよい。プロ配列を有する成熟蛋白はプロ蛋白であり、いくつかの場合には、蛋白の不活性形態となっている。プロ配列が開裂されると、活性成熟蛋白が残る。
よって、例えば、本発明ポリヌクレオチドは、成熟蛋白、あるいはプロ配列を有する蛋白もしくはプレ配列(リーダー配列)ならびにプロ配列の双方を有する蛋白をコードしていてもよい。
また、本発明ポリヌクレオチドは、本発明ポリペプチドの精製を可能にする、マーカー配列にフレーム中で融合しているコーディング配列を有していてもよい。マーカー配列はpQE−9ベクターにより供給されるヘキサ−ヒスタジンタグであってもよく、細菌宿主の場合には該マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を可能となる。あるいは、例えば、哺乳動物宿主(例えばCOS−7細胞)を用いる場合には、マーカー配列は赤血球凝集素(HA)タグであってもよい。HAタグは、インフルエンザ・赤血球凝集素蛋白由来のエピトープに相当する(ウィルソン,アイ(Wilson,I.)ら、セル(Cell)、第37巻:767頁(1984年))。
さらに本発明は、少なくとも50%、好ましくは70%の配列間同一性がある場合に上記配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、厳密な条件下で上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書の用語「厳密な条件」は、少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%の配列間同一性がある場合にのみハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。好ましい具体例において、上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図1のcDNAまたは寄託cDNAによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持しているポリペプチドをコードする。
本明細書で言及する寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下で維持されるであろう。これらの寄託物は単に便宜上提供されるだけで、寄託物が35 U.S.C.§112の下で要求されるという承認ではない。寄託された材料中の含まれるポリヌクレオチドの配列ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は参照により本明細書中に記載されているものと見なされ、それらは本明細書の配列の記載とのいかなる衝突時においても支配的である。寄託材料の製造、使用または販売にはライセンスが要求されるかもしれないが、その結果、かかるライセンスが認可されることはない。
さらに本発明は、図1の推定アミノ酸配列を有するかまたは寄託cDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するスタンニウスの小体のポリペプチド、およびかかるポリペプチドのフラグメント、アナログならびに誘導体に関する。
用語「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、図1のポリペプチドまたは寄託cDNAによりコードされるポリペプチドをいう場合には、かかるポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能もしくは活性を保持しているポリペプチドを意味する。よって、アナログは、プロ蛋白部分の開裂により活性化されて活性成熟ポリペプチドを生じうるプロ蛋白を包含する。
本発明ポリペプチドは組み換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであってよく、好ましくは、組み換えポリペプチドである。
図1のポリペプチドまたは寄託cDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、(i)1個またはそれ以上のアミノ酸残基が保存的もしくは非保存的アミノ酸残基(好ましくは、保存的アミノ酸残基)で置換されており、かかる置換されたアミノ酸残基は遺伝学的コードによってコードされていてもされていなくてもよいもの、または(ii)1個またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を有するもの、または(iii)成熟ポリペプチドが別の化合物、例えば、ポリペプチドの半減期を延長させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)に融合しているもの、または(iv)さらなるアミノ酸が、リーダーもしくは分泌配列のごとき成熟ポリペプチドまたは成熟ポリペプチドもしくはプロ蛋白配列の精製に使用される配列に融合しているものである。かかるフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の教示から、当業者の範囲内であると考えられる。
好ましくは、本発明ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは単離形態で提供され、好ましくは均一に精製される。
用語「単離された」は、材料がその元の環境(例えば、それが天然に存在するものであれば天然環境)から取り出されていることを意味する。例えば、生きた動物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されないが、天然系において共存する物質のいくつかまたはすべてから分離された同じポリヌクレオチドもしくはDNAまたはポリペプチドは単離されたものである。かかるポリヌクレオチドはベクターの一部であってよく、さらに/あるいはかかるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であってもよく、かかるベクターまたは組成物がその天然環境の一部でないという理由でやはり単離されたものである。
また本発明は、本発明ポリヌクレオチドを含むベクター、本発明ベクターで遺伝学的に処理された宿主細胞および組み換え法による本発明ポリペプチドの製造に関する。
宿主細胞は本発明ベクターで遺伝学的に処理される(トランスデュースされ、形質転換され、またはトランスフェクションされる)。該ベクターは、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであってよい。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態であってよい。プロモーターの活性化、形質転換体の選択またはスタンニウスの小体の遺伝子の増幅に適するように改変された慣用的栄養培地中において、処理された宿主細胞を培養することができる。温度、pH等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に関して従前使用された条件であり、当業者に明らかであろう。
本発明ポリヌクレオチドを、組み換え法によるポリペプチドの製造に用いてもよい。よって、例えば、ポリヌクレオチド配列が、種々の発現ビヒクル、詳細には、ポリペプチド発現用ベクターまたはプラスミドのいずれかに含まれていてもよい。かかるベクターは、染色体、非染色体および合成のDNA配列、例えば、SV40の誘導体;細胞プラスミド;ファージDNA;酵母プラスミド;プラスミドとファージDNAとの組み合わせ由来のベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスならびに偽狂犬病ウイルスのごときウイルスDNAを包含する。しかしながら、宿主中で複製可能で生存可能である限り、他のいずれのプラスミドまたはベクターを用いてもよい。
種々の方法により、適当なDNA配列をベクター中に挿入することができる。一般的には、当該分野において知られた方法により、DNA配列を適当な制限エンドヌクレアーゼ部位中に挿入する。かかる方法および他の方法は当業者の範囲内であると考えられる。
発現ベクター中のDNA配列は、mRNA合成を指令する適当な発現調節配列(プロモーター)に作動可能に結合される。かかるプロモーターの典型的な例として、LTRもしくはSV40プロモーター、イー・コリ(E.coli)のlacもしくはtrp、ラムダファージのPLプロモーターおよび原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子発現を調節することが知られている他のプロモーターが挙げられる。さらに発現ベクターは転写開始のためのリボゾーム結合部位および転写ターミネーターを含んでいる。ベクターは発現の増大に適した配列を含んでいてもよい。
さらに、好ましくは、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型の特徴を与える遺伝子、例えば、真核培養細胞についてはジヒドロ葉酸レダクターゼもしくはネオマイシン耐性遺伝子、またイー・コリにおいてはテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。
上記の適当なDNA配列ならびに適当なプロモーターまたは調節配列を含んでいるベクターを用いて適当な宿主を形質転換して宿主に蛋白発現させることができる。
適当な宿主の典型的な例として、イー・コリ、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonalla typhimurium)のごとき細菌細胞;ストレプトミセス(Streptomyces);酵母のごとき真菌細胞;ドロソフィラ(Drosophila)およびSf9のごとき昆虫細胞;CHO、COSまたはボウズメラノーマ(Bowes melanoma)のごとき動物細胞;植物細胞等が挙げられる。適当な宿主の選択は、本明細書の教示から、当業者の範囲内であると考えられる。
より詳細には、本発明は、上で広く述べた配列の1つまたはそれ以上からなる組み換え構築物も包含する。該構築物は、本発明配列が順方向または逆方向に挿入されたプラスミドまたはウイルスベクターのごときベクターからなる。この具体例の好ましい態様において、さらに該構築物は、該配列に作動可能に結合した、例えばプロモーターを包含する調節配列からなる。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、市販されている。例えば、以下のベクターが提供される。細菌性:pQE70、pQE60、pQE−9(キアジェン(Quiagen))、pBs、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(ストラタジーン(Stratagene));pTrc99A、pKK223−3、pKK233−3、pDR540、pRIT5(ファルマシア(Pharmacia))。真核性:pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG(ストラタジーン)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(ファルマシア)。しかしながら、宿主内で複製可能で生存可能である限り、他のいずれのプラスミドまたはベクターも使用できる。
CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択可能マーカーを有する他のベクターを用い、いずれの所望遺伝子からもプロモーター領域を選択することができる。2種の適当なベクターはpKK232−8およびpCM7である。特別に命名された細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPR、PLおよびtrpを包含する。真核プロモーターは、CMV即時初期、HSVチミジンキナーゼ、初期ならびに後期SV40、レトロウイルス由来のLTRsおよびマウス・メタロチオネイン−Iを包含する。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内である。
さらなる具体例において、本発明は、上記構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は哺乳動物細胞のごとき高等真核細胞であってもよく、または酵母細胞のごとき下等真核細胞であってもよく、あるいは宿主細胞は細菌細胞のごとき原核細胞であってもよい。宿主細胞中への構築物の導入を、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストランによるトランスフェクション、またはエレクトロポレーション(デイビス,エル(Davis,L.)、ダイブナー,エム(Dibner,M.)、バティー,アイ(Battey,I.)、ベイシック・メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Basic Methods in Molecular Biology)、1986年)により行うことができる。
宿主細胞中の構築物を慣用的方法で使用して、組み換え配列によりコードされた遺伝子産物を得ることができる。別法として、慣用的ペプチド合成装置により本発明ポリペプチドを合成的に製造することもできる。
成熟蛋白を、適当なプロモーターの調節下にある哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞において発現させることができる。本発明DNA構築物由来のRNAを用い、無細胞翻訳系を用いてかかる蛋白を製造することもできる。原核および真核宿主とともに用いるのに適するクローニングおよび発現ベクターはサムブルック(Sambrook)ら、モレキュラー・クローニング:ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)第2版(コールド・スプリング・ハーバー(Cold Sprong Harbor)、N.Y.、1989年)により記載されており、該開示を参照により本明細書に記載されているものと見なす。
本発明ポリペプチドをコードしているDNAの高等真核生物による転写を、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増大させる。エンハンサーはDNAのシス作用性エレメントであり、通常は、約10ないし300bpであり、プロモーターに作用してその転写を増大させる。例は、複製開始点の後期側(bp100から270)にあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含する。
一般的には、組み換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製開始点および選択可能マーカー、例えば、イー・コリのアンピシリン耐性遺伝子およびエス・セレビシエのTRP1遺伝子、さらに下流の構造配列の転写を指令する高発現遺伝子由来のプロモーターを含むであろう。かかるプロモーターは、3−ホスホグリセレートキナーゼ(PGK)のごとき糖質分解酵素、α因子、酸ホスファターゼ、または熱ショック蛋白等をコードしているオペロン由来であってもよい。翻訳開始および終結配列、好ましくはペリプラズム空間もしくは細胞外培地中への翻訳蛋白の分泌を指令しうるリーダー配列を伴う適当な相中に異種構造配列を集める。所望により、異種配列は、所望特性(例えば、発現組み換え生成物の安定化またはその精製の簡略化)を付与するN−末端同定ペプチドを含む融合蛋白をコードしていてもよい。
所望蛋白をコードする構造DNA配列を翻訳開始および終結シグナルと一緒にして機能的プロモーターを伴う作動可能なリーディング相(reading phase)中に挿入することにより、細菌に用いる有用な発現ベクターを構築する。ベクターは、1個またはそれ以上の表現型選択可能マーカーおよびベクターの維持を確実にする複製開始点からなり、所望ならば宿主中での増幅を行う。形質転換に適する原核宿主は、イー・コリ、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)、サルモネラ・ティフィムリウムおよびシュードモナス(Paeudomonas)、ストレプトミセスならびにスタフィロコッカス(Staphylococcus)属のさまざまな種を包含するが、他のものも選択の対象となりうる。
典型的であるが非限定的な実施例として、細菌に作用する有用な発現ベクターは、選択可能マーカー、およびよく知られたクローニングベクターpBR322(ATCC37017)の遺伝学的エレメントよりなる市販プラスミド由来の細菌の複製開始点からなっていてよい。かかる市販ベクターは、例えば、PKK223−3(ファルマシア・ファイン・ケミカルズ(Pharmacia Fine Chemicals)、スウェーデンのウプサラ)およびGEM1(プロメガ・バイオテク(Promega Biotech)、米国ウィスコンシン州マジソン)を包含する。これらのpBR322「骨格」部分を適当なプロモーターと組み合わせ、構造配列を発現させる。
適当な宿主株の形質転換および適当な細胞密度に至る宿主株の増殖の後、適当な手段(例えば、温度シフトまたは化学的誘導)により選択されたプロモーターを抑制し、さらなる期間細胞を培養する。
典型的には、遠心分離により細胞を集め、物理的または化学的手段により破壊し、次いで、得られた粗抽出物をさらなる精製のためにとっておく。
蛋白発現に用いる微生物細胞を、凍結−融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を包含するいずれの慣用的方法によっても破壊することができ、かかる方法は当業者によく知られている。
種々の哺乳動物細胞培養系を用いて組み換え蛋白を発現することもできる。哺乳動物発現系の例は、グルツマン(Gluzman)、セル(Cell)、第23巻:175頁(1981年)により記載されたサル・腎臓線維芽細胞のCOS−7系、および適合ベクターを発現しうる他の細胞系、例えばC127、3T3、CHO、HeLaならびにBHK細胞系を包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターならびにエンハンサー、さらに必要なリボゾーム結合部位、ポリアデニレーション部位、スプライスドナーならびにアクセプター部位、転写終結配列、および5'フランキング非転写配列からなるであろう。SV40ウイルスゲノム、例えば、SV40複製開始点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニレーション部位由来のDNA配列を用いて必要な非転写遺伝学的エレメントを得てもよい。
硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを包含する従来から用いられている方法によりスタンニウスの小体の蛋白を組み換え細胞培養物から回収し精製する。精製過程に存在するカルシウムイオン濃度を低くすることが好ましい(約0.1〜5mM)(プライス(Price)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第244巻:917頁(1969年))。成熟蛋白の立体配置を完成させる際に必要に応じて蛋白再生工程を用いることができる。最後に、最終精製工程用に高品質液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いることができる。
本発明ポリペプチドは、高発現細胞系から発現された本来的に精製された生成物、あるいは化学合成生成物、あるいは原核宿主または真核宿主からの(例えば、培養されている細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞による)組み換え法による生成物であってよい。組み換え生産法に用いる宿主によっては、本発明ポリペプチドは哺乳動物もしくは他の真核生物の炭水化物でグリコシレーションされていてもよく、あるいはグリコシレーションされていなくてもよい。本発明ポリペプチドはさらに開始メチオニンアミノ酸残基を含んでいてもよい。
本発明ポリペプチドを、多数の電解質による疾病の治療的処置に使用してもよい。動脈性高血圧の1の病因は、Na−Kポンプの欠損または阻害のよる血管平滑細胞の細胞壁を通過する異常なNa+輸送であり、もう1つの病因は、いくつかの形態のヒトの高血圧において記載されているようなNa+に対する透過性の増加である。正味の結果は細胞内Na+の増加であり、それにより細胞は血管収縮剤に対してより感受性が高くなる。Na+の後にCa++が続くので、交感神経の刺激に対する感受性を増大させる原因であるのは細菌内Ca++蓄積でありNa+自体ではないと仮定される。したがって、スタンニウスの小体の蛋白は低カルシウム血にする薬剤として機能しうるので、それは、この増加した細胞内Ca++を相殺するのに役立ちうる。さらに、高カルシウム血症は心臓不整脈、昏睡および心停止に関与している。したがって、スタンニウスの小体の蛋白は、遊離カルシウム濃度を低下させることにより、これらの疾患の治療に治療的価値を有しうる。
また、高血圧は腎臓疾患に直接関連している。したがって、正常よりも高いまたは低い電解質濃度は腎臓機能不全を引き起こし、他のより重大な疾病を直接引き起こす。例として、カルシウム−リンのバランス不良は筋肉および骨の痛み、骨の鉱物質除去および脳、目、心筋ならびに血管を包含する種々の器官の石灰化を引き起こす可能性がある。したがって、本発明ポリペプチドを用いて、カルシウム−リンのバランス不良による疾病を相殺してもよい。腎不全はそれ自体、異常に高い血中リン酸濃度を引き起こすが、本発明ポリペプチドによって正常濃度に低下させることができる。
また、本発明ポリペプチドはある種の骨の疾病に治療にも有用である。例えば、過剰濃度のカルシウムは罹患した骨における線維状小節の発達を引き起こす。
高カルシウム血症の原因は、上皮小体機能亢進症、ビタミンD過剰症、骨を破壊することにより血清カルシウムレベルを上昇させる腫瘍、サルコイドーシス、甲状腺機能亢進症、副腎機能不全、腎臓疾患に続いて起こる血清アルブミンの損失、過剰なGIカルシウム吸収および血漿蛋白濃度上昇を包含する多数の異なる疾病でもありうる。したがって、スタンニウスの小体の蛋白は、高カルシウム血症およびその関連疾患の軽減において有効である。
また、スタンニウスの小体の蛋白は、正常でない電解質濃度および体液のバランス不良に関連した他の疾患、例えば、偏頭痛の治療にも有用である。
本発明によりポリペプチドをインビボで発現させることによりかかるポリペプチドを使用してもよく、しばしば、「遺伝子治療」と呼ばれる。
よって、例えば、患者由来の細胞を、エクスビボにおいてポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)を用いて処理し、次いで、該ポリペプチドで処理された細胞を患者に提供して治療を行ってもよい。例えば、本発明ポリペプチドをコードしているRNAを含むレトロウイルス粒子を用いることにより、当該分野において知られている方法によって細胞を処理してもよい。
同様に、例えば、当該分野において知られた方法により細胞をインビボで処理してもよい。当該分野において知られているように、インビボでの細胞の処理およびインビボでのポリペプチドの発現のために、本発明ポリペプチドをコードしているRNAを含むレトロウイルス粒子を生産するためのプロデューサー細胞を患者に投与してもよい。かかる方法により本発明ポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から、当業者に明らかであろう。例えば、細胞を処理するための発現ビヒクルはレトロウイルス以外のもの、例えば、アデノウイルスであってもよく、それを用いて適当な送達ビヒクルと結合した後インビボで細胞を処理してもよい。
本発明ポリペプチドを適当な医薬担体と混合して使用してもよい。かかる組成物は、治療上有効量の蛋白、および医薬上許容される担体または賦形剤からなる。かかる担体は、セイライン、緩衝化セイライン、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物を包含するがこれらに限定されない。処方は投与モードに適したものとすべきである。
また、本発明は、本発明医薬組成物の1またはそれ以上の成分を入れた1個またはそれ以上の容器からなる医薬パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府省庁により規定された形式の注意書きであって、ヒトの健康のための製造、使用または販売に関する省庁による承認を反映する注意書きをかかる容器に添付することができる。さらに、本発明ポリペプチドを他の治療化合物と組み合わせて用いることもできる。
経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または経皮のごとき慣用的方法で医薬組成物を投与してよい。対象に対する投与量および投与規則は、投与モード、治療すべき症状の性質、治療される対象の体重および処方箋を書く医師の判断によるであろう。一般的には、例えば、少なくとも約0.1mg/kg体重の治療上有効量で投与され、たいていの場合、約10.0mg/kg体重を超えた量では投与されず、好ましくは、投与経路、徴候等を考慮して1日に約0.1mg/kg体重ないし約1.0mg/kg体重の用量で数日間投与される。
また、本発明配列は染色体の同定に価値を有する。配列は特異的に標的化され、個々のヒト・染色体の特定の位置とハイブリダイズしうる。そのうえ、染色体上の特定部位を同定することの必要性が現在ある。染色体位置のマーキングに利用可能な実際の配列データ(繰り返し多型性のデータ)に基づく染色体マーキング試薬は現在ほとんどない。本発明によるDNAの染色体へのマッピングは、それらの配列を疾病関連遺伝子と関係づけることにおける重要な第1段階である。
簡単に説明すると、cDNAからPCRプライマー(好ましくは、15〜25bp)を調製することにより配列を染色体にマッピングすることができる。
cDNAのコンピューター分析を用いて、ゲノムDNAにおいて1個のエキソンより多くのエキソンにまたがらず、かくして増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択することができる。次いで、これらのプライマーを個々のヒト・染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト・遺伝子を含有するそれらのハイブリッドのみが増幅されたフラグメントを生じるであろう。
体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定のDNAを特定の染色体に帰属するための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーとともに本発明を用いて、同様の方法で特定の染色体または大きなゲノムクローンのプールから得たフラグメントのパネルを用いて下位の位置づけを行うことができる。同様に用いてその染色体にマッピングすることのできる他のマッピング方法は、インシチュ(in situ)ハイブリダイゼーション、標識され流動ソーティングされた染色体を用いるプレスクリーニングおよび染色体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションを包含する。
中期染色体スプレッド(spread)に対するcDNAクローンの蛍光インシチュハイブリダイゼーション(FISH)を用いて1段階で正確な染色体位置を得ることができる。この方法は500または600塩基程度の短いcDNAとともに用いることができるが、2000bpより大きいクローンはユニークな染色体位置に結合して、簡単な検出でも十分なシグナル強度を発する可能性が高い。
FISHには、ESTが由来するクローンが必要であり、それは長いほどよい。例えば、2000bpがよく、4000がもっとよいが、合理的な結果を得るには4000より大きいものはおそらく不要であろう。この方法に関する概説については、バーマ(Verma)ら、ヒューマン・クロモゾームズ:ア・マニュアル・オブ・ベイシック・テクニックス(Human Chromosomes:a Manual of Basic Techniques)ニューヨークのパーガモン・プレス(Pregamon Press)(1988年)参照。
配列を正確な染色体位置にマッピングしたならば、染色体上の該配列の物理的位置を遺伝学的マップのデータと関連づけることができる(かかるデータは、例えば、ブイ・マククシック(V.McKusick)、メンデリアン・インヘリタンス・イン・マン(Mendelian Inheritance in Man)(ジョーンズ・ホプキンス大学のウェルチ・メディカル・ライブラリー(Johns Hopkins University Welch Medical Library)からオンラインで利用できる)に見いだされる)。次いで、遺伝子と同一染色体領域にマッピングされた疾病との間の関係を、連関(物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝)の分析により確認する。
次に、罹患した個体と罹患していない個体との間におけるcDNAまたはゲノム配列の相違を決定する必要がある。罹患した個体のいくつかまたはすべてに変異が観察されるが正常個体には観察されない場合、該変異は該疾病の病因である可能性がある。
現在の物理的マッピングおよび遺伝学的マッピング法の分析を用いると、疾病に関連した染色体領域に正確に位置づけられたcDNAは、50ないし500個の間の可能性のある病因遺伝子のうちの1つである可能性がある(このことは、1メガベースのマッピング分析では20kbあたり1個の遺伝子となる)。
一般的には、罹患個体と罹患していない個体との比較には、まず、染色体スプレッドから見ることができるかまたはそのcDNA配列に基づくPCRを用いて検出可能な欠失またはトランスロケーションのごとき染色体における構造的変化を探すことが必要である。最終的には、変異の存在を確認し、変異を多型性と識別するためにはいくつかの個体からの遺伝子の完全な配列決定が必要である。
さらに本発明は、アンチセンス法を用いることによりインビボ(in vivo)でのスタンニウスの小体の蛋白の阻害に指向される。3重らせん形成またはアンチセンスDNAもしくはRNAにより遺伝子発現をコントロールするためにアンチセンス法を用いることができ、そのいずれの方法もポリヌクレオチドのDNAまたはRNAへの結合に基づいている。例えば、本発明成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5'コーディング部分を用いて10ないし40塩基対の長さのアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計する。転写に関与する遺伝子領域に相補的となるようにDNAオリゴヌクレオチドを設計し(3重らせん−リー(Lee)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nuc.Asids Res.)、第6巻:3073頁(1979年);クーニー(Cooney)ら、サイエンス(Science)、第241巻:456頁(1988年);およびダーバン(Dervan)ら、サイエンス、第251巻:1360頁(1991年)参照)、それにより、転写およびスタンニウスの小体の蛋白の生産を妨害する。
アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAにハイブリダイズし、mRNA分子のカテプシンOへの翻訳をブロックする(アンチセンス−オカノ(Okano)、ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー(J.Neurochem.)、第56巻:560頁(1991年);オリゴデオキシヌクレオチズ・アズ・アンチセンス・インヒビターズ・オブ・ジーン・イクスプレッション(Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression)、CRCプレス(CRC Press)、フロリダ州ボカ・ラトン(Boca Raton)(1988年))。
別法として、当該分野における方法により上記オリゴヌクレオチドを細胞に送達して、アンチセンスRNAまたはDNAをインビボで発現させて上記様式でスタンニウスの小体の蛋白の生産を阻害するようにすることもできる。
したがって、スタンニウスの小体の蛋白のアンチセンス構築物を用いてスタンニウスの小体の蛋白を不活性化させることにより低カルシウム血症を治療することができ、それゆえ、低カルシウム血症の効果を予防することができる。低レベルのカルシウムによる細く脆い骨により特徴づけられる骨粗鬆症を上記アンチセンス構築物により治療することができる。同様の方法で、これらのアンチセンス構築物を用いてパジェット病を治療してもよい。
ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、またはそのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫原として用いてそれらに対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。本発明はさらに、キメラ、CDRを接続した1本鎖、ヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの生成物を包含する。当該分野で知られた種々の方法を、かかる抗体およびフラグメントの製造に用いることができる。
ポリペプチドの動物への直接注射により、またはポリペプチドを動物に投与することにより(好ましくは、非ヒト動物に)、本発明配列に対応するポリペプチドに対して生成された抗体またはそのインビボ受容体を得ることができる。次いで、そのようにして得られた抗体をポリペプチド自体に結合させる。この方法においては、もとのポリペプチド全体に結合する抗体を得るために、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも用いることができる。次いで、かかる抗体を用いて、そのポリペプチドを発現している組織からそのポリペプチドを単離することができる。モノクローナル抗体の調製には、連続細胞系培養により得られる抗体を提供するすべての方法を用いることができる。例は、ハイブリドーマ法(コーラー(Kohler)およびミルステイン(Milstein)、1975年、ネイチャー(Nature)、第256巻:495〜497頁)、トリオーマ法、ヒト・B細胞ハイブリドーマ法(コズボール(Kozbor)ら、1983年、イミュノロジー・トゥデイ(Immunology Today)、第4巻:72頁)、およびヒト・モノクローナル抗体を得るためのEBV−ハイブリドーマ法(モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・キャンサー・セラピー(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)中、コウル(Cole)ら、1985年、アラン・アール・リス,インコーポレイテッド(Alan R.Liss,Inc.)、77〜96頁)を包含する。
1本鎖抗体の製造に関して記載された方法(米国特許第4,946,778号)を適用して本発明の免疫原性ポリペプチド生成物に対する1本鎖抗体を製造することができる。
さらに本発明ポリペプチドに特異的な抗体を用いてポリペプチドの正しい機能を阻害してもよい。この方法で、スタンニオカルシンの蛋白の低カルシウム血にする機能を妨げることにより、該抗体を抗低カルシウム血症剤として用いてもよい。これらの抗体で治療されうる疾病の中には骨粗鬆症がある。
また、本発明は、本発明ポリペプチドに対するアンタゴニスト/阻害剤に指向される。該アンタゴニスト/阻害剤は該ポリペプチドの機能を阻害または除去するものである。
よって、例えば、アンタゴニストは本発明ポリペプチドに結合し、その機能を阻害または除去しうる。例えば、アンタゴニストは、該ポリペプチドに結合するポリペプチドに対する抗体であってよく、いくつかの場合にはオリゴヌクレオチドであってもよい。阻害剤の例は、小型分子阻害剤であって、該阻害剤は触媒部位に結合し、それを占有することによりポリペプチドを不活性化し、そのことにより、触媒部位への基質の近接を不可能にして生物学的活性を妨げる。小型分子阻害剤の例は、小型ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに限定しない。
別法として、通常は本発明ポリペプチドが結合する受容体に結合する、本発明ポリペプチドに対するアンタゴニストを用いてもよい。該アンタゴニストは密接に関連した蛋白であってもよく、その結果、それらは本来の蛋白に対する受容体部位を認識し結合し、そのことにより受容体部位が占領されるのでスタンニウスの小体の蛋白の作用を妨げる。これらのようにして、スタンニウスの小体の蛋白の作用を妨げ、アンタゴニスト/阻害剤を抵抗カルシウム血症剤として用いて骨粗鬆症ならびにカルシウムレベルの増大を必要とする他の疾患を治療してもよい。
アンタゴニスト/阻害剤を上記医薬上許容される担体とともに医薬組成物中に用いてもよい。
さらに本発明は下記実施例を参照して説明されるが、本発明はかかる実施例に限定されないことが理解されるべきである。特記しないかぎり、すべての部または量は重量による。
下記実施例の理解を容易にするために、頻繁に出現する特定の方法および/または用語を説明する。
「プラスミド」は、大文字および/または数の前後に来る小文字pにより示される。本発明の出発プラスミドは、市販のもの、制限の根拠のない公に利用できるものであるか、あるいは公表されている方法に従って利用可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載されたのと等価なプラスミドは当該分野において知られており、当業者に明らかであろう。
DNAの「消化」は、DNAの特定配列においてのみ作用する制限酵素でのDNAの酵素的開裂をいう。本発明に用いる種々の制限酵素は市販されており、それらの反応条件、コファクターおよび他の必要物が、当業者に知られているように用いられる。分析目的には、典型的には1μgのプラスミドまたはDNAフラグメントを約2ユニットの酵素とともに、約20μlの緩衝液中で用いる。プラスミド構築用のDNAフラグメントの単離目的には、典型的には、大きめの体積中で、5ないし50μgのDNAを20ないし250ユニットの酵素で消化する。特定の制限酵素に適するバッファーおよび基質量は製造者により詳述されている。37℃で約1時間のインキュベーション時間が通常用いられるが、供給者の指示に従って変更してもよい。消化後、反応物を直接ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して所望フラグメントを単離する。
ゲデル,ディー(Goeddel,D.)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第8巻:4057頁(1980年)により記載された8パーセントポリアクリルアミドゲルを用いて、開裂されたフラグメントのサイズ分離を行う。
「オリゴヌクレオチド」は、化学合成されていてもよい1本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは2本の相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖をいう。かかる合成オリゴヌクレオチドは5'リン酸を有しないので、キナーゼ存在下でATPを用いてリン酸を付加しない場合には別のオリゴヌクレオチドにライゲーションしない。合成オリゴヌクレオチドは、デホスホリレーションされていないフラグメントにライゲーションするであろう。
「ライゲーション」は、2種の2本鎖核酸フラグメントの間のホスホジエステル結合の形成プロセスをいう(上記マニアティス,ティーら、146頁)。特記しないかぎり、既知バッファーおよび条件を用い、ほぼ等モル量のライゲーションすべきDNAフラグメント0.5μgあたり10ユニットのT4DNAリガーゼを用いてライゲーションを行うことができる。
別に述べない限り、グラハム,エフ(Graham,F.)およびファン・デル・エブ,エイ(Van Der Eb,A.)、ウイロロジー、第52巻:456〜457頁(1973年)の方法において記載されてようにして形質転換を行った。
実施例1
スタンニウスの小体の蛋白の細胞での発現および精製
まず、スタンニウスの小体の蛋白の5'および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスタンニウスの小体の蛋白をコードするDNA配列(ATCC番号75652)を増幅し、SphI制限部位およびBglI制限部位に対応するさらなるヌクレオチドを、それぞれ、5'および3'配列に付加した。5'オリゴヌクレオチドプライマーは配列5'−GACTGCATGCTCCAAAACTCAGCAGTG−3'を有し、SphI制限酵素部位(GCATGC)および開始コドンから始まるスタンニウスの小体の蛋白のコーディング配列の21個のヌクレオチドを含んでいる。3'配列は3'−GACTAGATCTTGCACTCTCATGGGATGTGCG−5'であり、BglII制限部位に対する相補的配列(AGATCT)およびスタンニウスの小体の蛋白のコーディング配列の最後の21個のヌクレオチドを含んでいる。制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE70(キアジェン・インコーポレイテッド(Quiagen Inc.)、カリフォルニア州91311、チャッツワース(Chatsworth)、イートン・アベニュー(Eaton Ave.)9259)上の制限酵素部位に対応している。pQE70は、抗生物質耐性(Ampr)、細菌の複製開始点(ori)、IPTGにより調節されうるプロモーター/オペレーター(P/O)、リボゾーム結合部位(RBS)、6−ヒスチジンタグ(6−His)および制限酵素部位をコードしている。次いで、pQE70ベクターをSphHIおよびBglII制限酵素で消化した。増幅された配列をpQE70中にライゲーションし、ヒスチジンタグおよびRBSをコードしている配列とフレームを合わせて挿入した。次いで、ライゲーション混合物を用いてイー・コリ株m15/rep4(商標m15/rep4としてキアジェンから市販されている)を形質転換した。M15/rep4は、多コピーのプラスミドpREP4を含み、それはlacIリプレッサーを発現し、さらにカナマイシン耐性(Kanr)を付与する。LBプレート上での増殖能により形質転換体を同定し、アンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを単離し、制限分析により確認した。所望構築物を含むクローンを、Amp(100μg/ml)およびKan(25μg/ml)の両方を補足した培地中の液体培養で一晩(O/N)増殖させた。1:100ないし1:250の割合でO/N培養物を用いて大規模培養に接種した。600nmの光学密度(O.D.600)が0.4ないし0.6の間になるまで細胞を増殖させた。次いで、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)を添加して最終濃度1mMとした。IPTGはlacIリプレッサーを不活性化することにより誘導を行って、P/Oを解除して遺伝子発現を増大させる。細胞をさらに3〜4時間増殖させた。次いで、遠心分離(6000xgで20分)により細胞を集めた。カオトロピック剤である6モラーのグアニジン−HCl中に細胞ペレットを可溶化した。清澄化後、6−Hisタグを含む蛋白による固い結合を可能にする条件下でのニッケル−キレートカラムによるクロマトグラフィー(ホチュリ,イー(Hochuli,E.)ら、ジェネティック・エンジニアリング,プリンシプル・アンド・メソッズ(Genetic Engineering,Principle & Methods)、第12巻:87〜98頁、プレナム・プレス、ニューヨーク(Plemun Press,New York)(1990年))により、この溶液から可溶化されたスタンニオカルシンを精製した。GnHClからの蛋白の再生をいくつかのプロトコールにより行うことができる(ジェニッケ,アール(Jaenicke,R.)およびルドルフ,アール(Rudolph,R)、プロテイン・ストラクチャー−ア・プラクテイカル・アプローチ(Protein Structure-A Practical Approach)、IRL プレス(IRL Press)、ニューヨーク(1990年))。まず、段階的透析を用いてGnHClを除去した。別法として、Ni−キレートカラムから単離された精製蛋白を次のカラムに結合させ、直線的GnHClグラジエント(GnHClを減少させる)を行うこともできる。蛋白をカラムに結合している間に蛋白を再生し、次いで、、250mMイミダゾール、150mM NaCl、25mM Tris−HCl(pH7.5)および10%グリセロールを含有するバッファーで溶離する。最後に、5mM重炭酸アンモニウムを含有する貯蔵バッファーに対して可溶性蛋白を透析する。精製蛋白をSDS−PAGEにより分析した。図3参照。
上記教示を考慮すれば、本発明に対して多くの修飾および変更が可能であり、それゆえ、添付した請求の範囲の範囲内において、詳細に記載したものとは別の方法で本発明を実施してもよい。
配列表
(1)一般的情報:
(i)出願人:オルセンら
(ii)発明の名称:スタンニウスの小体の蛋白、スタンニオカルシン
(iii)配列の数:2
(iv)連絡先:
(A)宛て名:カレラ、バイアン、ベイン、ジルフィラン、チェッキ、スチュワート アンド オルステイン
(B)通り名:ベッカー・ファーム・ロード6
(C)都市名:ローズランド
(D)州名:ニュージャージー
(E)国名:アメリカ合衆国
(F)ZIP:07068
(v)コンピューター・リーダブル・フォーム:
(A)メディウム・タイプ:3.5インチ・ディスケット
(B)コンピューター:IBM PS/2
(C)オペレイティング・システム:MS−DOS
(D)ソフトウェア:ワードパークト5.1
(vi)現在の出願データ:
(A)出願番号:08/208,005
(B)出願日:1994年3月8日
(C)分類:
(vii)先の出願データ:
(A)出願番号:
(B)出願日:
(viii)代理人等の情報:
(A)氏名:フェラーロ,グレゴリー・ディー
(B)登録番号:36,134
(C)代理人等における処理番号:325800−139
(viii)テレコミュニケーションの情報:
(A)電話番号:201−994−1700
(B)ファックス番号:201−994−1744
(2)配列番号1に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:771塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:1本
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列の記載:配列番号:1:
(2)配列番号2に関する情報:
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:247アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白
(xi)配列の記載:配列番号:2:
Claims (27)
- スタンニウスの小体のポリペプチドをコードしている単離ポリヌクレオチドであって、
(a)配列番号:2のアミノ酸−33から+214まで、あるいは配列番号:2のアミノ酸+1から214までのアミノ酸配列を有するスタンニウスの小体のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド;および
(b)ATCC寄託物75652中に含まれるcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するスタンニウスの小体のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド。 - DNAである請求項1のポリヌクレオチド。
- RNAである請求項1のポリヌクレオチド。
- ゲノムDNAである請求項1のポリヌクレオチド。
- 配列番号:2のアミノ酸−33から+214まで、あるいは配列番号:2のアミノ酸+1から214までのアミノ酸配列を有するスタンニウスの小体のポリペプチドをコードしている請求項2のポリヌクレオチド。
- ATCC寄託物75652のcDNAによりコードされるスタンニウスの小体のポリペプチドをコードしている請求項2のポリヌクレオチド。
- 配列番号:1のヌクレオチド16から756までのヌクレオチド配列を有する請求項1のポリヌクレオチド。
- ATCC寄託物75652として寄託されたスタンニウスの小体のポリペプチドに関するコーディング配列を有する請求項2のポリヌクレオチド。
- 請求項2のDNAを含むベクター。
- 請求項9のベクターで遺伝学的に処理された宿主細胞。
- 請求項10の宿主細胞から上記DNAによりコードされるポリペプチドを発現させることを特徴とするポリペプチドの製造方法。
- 請求項9のベクターで細胞を遺伝学的に処理することを特徴とする、ポリペプチドを発現しうる細胞の製造方法。
- 厳密な条件下で請求項2のDNAにハイブリダイズ可能で、スタンニウスの小体のポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードしている単離DNA。
- (a)配列番号:2のアミノ酸−33から+214まで、あるいは配列番号:2のアミノ酸+1から214までのアミノ酸配列を有するスタンニウスの小体のポリペプチド、および
(b)ATCC寄託物75652中のcDNAによりコードされるスタンニウスの小体のポリペプチド。 - 配列番号:2のアミノ酸−33から+214まで、あるいは配列番号:2のアミノ酸+1から214までのアミノ酸配列を有するスタンニウスの小体のポリペプチドである請求項14のポリペプチド。
- 請求項14のポリペプチドに対する抗体。
- 異種ポリヌクレオチドと融合した請求項1または2のいずれかのポリヌクレオチド。
- 異種ポリヌクレオチドが異種ポリペプチドをコードしているものである請求項17のポリヌクレオチド。
- 該異種ポリペプチドが該ポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドと融合したものである請求項18のポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドが調節制御配列に作動可能に連結されている請求項9のベクター。
- 該宿主細胞が原核細胞、真核細胞、脊椎動物細胞、COS細胞、CHO細胞、またはE.coli細胞である請求項10の宿主細胞。
- 標識され、修飾され、あるいはポリエチレングリコールと融合した請求項14または15のいずれかのポリペプチド。
- 異種ポリペプチドと融合した請求項14または15のいずれかのポリペプチド。
- N−末端メチオニンを欠く請求項14または15のいずれかのポリペプチド。
- N−末端メチオニンを有する請求項14または15のいずれかのポリペプチド。
- 請求項14または15のいずれかのポリペプチドに特異的に結合する請求項16の抗体。
- ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、1本鎖、1本鎖Fv、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはFabフラグメントである請求項16または26のいずいれかの抗体。
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