PT750626E - Proteina dos corpusculos de stannius, a stanniocalcina - Google Patents
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Description
Descrição “Proteína dos Corpúsculos de Stannius, a stanniocalcina” A presente invenção refere-se a polinucleótidos recentemente identificados, aos poli-peptidos codificados por tais polinucleótidos, à utilização de tais polinucleótidos e polipeptidos e também à produção desses polinucleótidos e polipeptidos. Mais particularmente, o polipeptido da presente invenção é a proteína dos Corpúsculos de Stannius humanos. A invenção também diz respeito à inibição da acção de tal polipeptido. A stanniocalcina (inicialmente conhecida por teleocalcina ou hipocalcina) é uma hormona glicoproteínica anti-hipercalcémica que é produzida pelos Corpúsculos de Stannius que são glândulas endócrinas que estão confinadas aos peixes Osteícteos. O polipeptido da presente invenção possui um elevado grau de homologia, ao nível dos aminoácidos, com a hormona glicoproteínica dos peixes, que está implicada na regulação dos níveis do cálcio. A proteína dos Corpúsculos de Stannius de seres não humanos foi estudada exaustivamente. Nos tempos mais chegados, purificou-se uma proteína dos Corpúsculos de Stannius e clonou-se a partir de Anguilla australis. Descobriu-se que os rins dos peixes teleósteos contêm grânulos secretórios, os Corpúsculos de Stannius. A microscopia electrónica permite comprovar que os grânulos são de natureza proteinácea e podem representar eventualmente hormonas ou enzimas com actividades fisiológica e bioquímica desconhecidas (Butkus, A. et ai, Mol. Cell Endocrinol, 54:123-33 (1987); e WO 88/03949).
Isolou-se e purificou-se também uma glicoproteína dos Corpúsculos de Stannius das trutas, que se admite ser a hipocalcina, que é a hormona hipocalcémica principal dos peixes.
Este produto encontra-se presente em quantidades relativamente grandes nos Corpúsculos de Stannius de diversas espécies (a saber, enguia europeia, tilápia dourada e carpas). A hipocalcina é libertada tipicamente dos Corpúsculos de Stannius em resposta a um aumento, induzido por via experimental, da concentração do cálcio no sangue. Observações ultraestruturais comprovam que, a seguir a este tratamento, as células promotoras de hipocalcina, típicas dos Corpúsculos de Stannius, ficam quase completamente desgranuladas. A glicoproteína isolada possui um peso molecular aparente de 54 kD (Lafeber F.P. et ai, Gen Comp. Éndocrinol, 69:19-30 (1988)).
Além disso, demonstrou-se recentemente que há vários fragmentos peptídicos sintéticos da teleocalcina que inibem a incorporação do cálcio na truta iridescente juvenil {Salmo Gairdneri). Os péptidos do terminal N (aminoácidos 1 a 20) da teleocalcina da enguia e do salmão inibem de forma significativa a incorporação do Ca45 no ponto máximo do ciclo da incorporação do cálcio (até 75%), embora as doses eficazes dos péptidos, numa base molar, fossem 20 a 200 vezes as da molécula intacta. Pelo contrário, o fragmento do terminal C da teleocalina da enguia (aminoácidos 202 a 231) não tiveram nenhum efeito inibitório sobre a incorporação do cálcio (Milliken C. E. et al., Gen. Comp. Éndocrinol, 77:416-22 (1990)). Há também uma descrição respeitante à purificação e à caracterização de duas stanniocalcinas de salmão e respeitante ainda ao estudo da regulação da secrecçao hormonal em resposta ao cálcio, utilizando modelos in vitro e in vivo. Está descrita a clonagem molecular e a análise da sequência do ADNc de um ARN mensageiro (ARNm) coerente da stanniocalcina do salmão, proveniente de um banco de ADNc da λ-gtlO CS do salmão. O ARNm da stanniocalcina do salmão tem um comprimento de aproximadamente 2 kD e codifica um produto de tradução primária de 256 aminoácidos. Os primeiros 33 resíduos compreendem a região pre-proteínica da hormona, ao passo que os restantes 223 resíduos constituem a forma completamente desenvolvida da hormona (Wagner G. F. et ai, Mol. Cell Éndocrinol, 90:7-15 (1992)).
Μ
De acordo com um dos seus aspectos, a presente invenção proporciona um novo poli-peptido perfeitamente desenvolvido que é uma proteína dos Corpúsculos de Stannius, e também os seus fragmentos. A proteína dos Corpúsculos de Stannius da presente invenção é de origem humana.
De acordo com outro dos seus aspectos, a presente invenção proporciona polinucleótidos (ADN ou ARN) que codificam tais polipeptidos.
Ainda de acordo com outro dos seus aspectos, a presente invenção proporciona um processo para a produção de tal polipeptido por meio de técnicas recombinantes.
De acordo com mais um outro dos seus aspectos, a presente invenção proporciona um processo para a utilização de tal polipeptido ou de tal polinucleótido que codifica tal polipeptido, para fins terapêuticos, por exemplo, para o tratamento de doenças de natureza electrolítica que sejam a causa de doenças renais, ósseas e cardíacas, e também doenças provocadas por uma elevada ressorção óssea, v.g. a osteoporose e a doença de Paget.
Ainda de acordo com mais um outro dos seus aspectos, a presente invenção proporciona um anticorpo contra tal polipeptido. Esses anticorpos podem ser utilizados para o tratamento de hipocalcemia de que resulta tetânia, convulsões e outras doenças congéneres. A hipocalcemia pode ter origem em inúmeras causas diferentes, incluindo a insuficiência renal, o hiperpara-tiroidismo, infecções graves ou queimaduras, que capturem o cálcio do fluido intercelular, e ainda pode ser originada por insuficiência pancreática.
De acordo com outro dos seus aspectos, a presente invenção proporciona métodos para identificar agonistas/inibidores de tal polipeptido, os quais podem ser utilizados para inibir a acção desse polipeptido, por exemplo, no tratamento de hipocalcemia e de osteoporose.
Estes e outros aspectos da presente invenção tomar-se-ão evidentes para os especialistas na matéria à luz dos preceitos aqui descritos.
Os desenhos a seguir apresentados têm por objecto ilustrar variantes da invenção e com eles não se pretende limitar a invenção tal como definida pelas reivindicações anexas. A figura 1 mostra a sequência de ADNc e a correspondente sequência deduzida de aminoácidos da proteína dos Corpúsculos de Stannius previamente beneficiada. A sequência de aminoácidos está indicada adiante, tendo sido utilizado para tal o código convencional das abreviaturas de três letras. A figura 2 mostra a comparação da sequência do polipeptido da stanniocalcina humana (linha superior) com a stanniocalcina isolada a partir de Oncorhynchus kisutch (linha inferior). Não há nenhum homologia sequencial aparente para além do aminoácido 204 da stanniocalcina de Oncorhynchus kisutch. O comprimento total da stanniocalcina isolada a partir de Oncorhynchus kisutch é de 256 aminoácidos. A figura 3 mostra o padrão de bandas do polipeptido da stanniocalcina humana a seguir à expressão bacteriana e à purificação.
De acordo com um dos seus aspectos, a presente invenção proporciona um ácido nucleico isolado (um polinucleótido) que codifica o polipeptido perfeitamente desenvolvido que possui a sequência deduzida de aminoácidos da figura 1, ou que codifica o polipeptido perfeitamente desenvolvido codificado pelo ADNc do clone depositado na instituição ATCC com o número de depósito 75652 a 25 de Janeiro de 1994. A sequência polinucleotídica da figura 1 contém uma pré-sequência que é constituída pelos primeiros 15 nucleótidos. A sequência polinucleotídica codifica um produto de tradução de 247 aminoácidos dos quais os primeiros 33 aminoácidos podem representar uma região ‘prepro’ da proteína. Assim, a clivagem da região ‘prepro’ origina um polipeptido activo perfeitamente desenvolvido de 214 aminoácidos. 0 polinucleótido da presente invenção foi isolado a partir de uma banco de ADNc de pulmão humano de fase precoce. Este contém o bloco de leitura ininterrupta que codifica um prepropolipeptido de 247 aminoácidos. O polipeptido possui um grau de elevado de homologia com a stanniocalcina de Angitilla cmtralis, com 119 aminoácidos idênticos (61%) numa sobreposição de 195 aminoácidos. Também possui uma homologia muito elevada com a stanniocalcina de Oncorhynchus kisutch, com 118 aminoácidos idênticos (57%) numa sobreposição de 204 aminoácidos. O polinucleótido da presente invenção pode estar sob a forma de ARN ou sob a forma de ADN, sendo o ADN de tipo ADNc, ADN genómico e ADN sintético. O ADN pode ser de cadeia dupla ou de cadeia simples e se for de cadeia simples, esta pode ser a cadeia codificadora e ou a cadeia não codificadora (anti-sentido). A sequência codificadora que codifica o polipeptido perfeitamente desenvolvido pode ser idêntica à sequência codificadora indicada na figura 1 ou à do clone depositado ou pode ser uma sequência codificadora diferente que codifique, devido à redundância ou à degenerescência do código genético, o mesmo polipeptido perfeitamente desenvolvido que é codificado pelo ADN da figura 1 ou pelo ADNc depositado. O polinucleótido que codifica o polipeptido perfeitamente desenvolvido da figura 1 ou que codifica o polipeptido perfeitamente desenvolvido codificado pelo ADNc depositado pode conter: apenas a sequência codificadora do polipeptido perfeitamente desenvolvido; a sequência codificadora do polipeptido perfeitamente desenvolvido e uma outra sequência codificadora, por exemplo, uma sequência líder ou secretória ou uma sequência proproteínica; a sequência codificadora do polipeptido perfeitamente desenvolvido (e facultativamente outra sequência codificadora) e uma sequência não codificadora, por exemplo, os intrões ou a sequência não codificadora 5’ e/ou 3’ da sequência codificadora do polipeptido perfeitamente desenvolvido.
Assim, a expressão “polinucleótido que codifica um polipeptido” designa um poli-nucleótido que compreende apenas a sequência codificadora do polipeptido e designa também um polinucleótido que compreende outra sequência codificadora e/ou não codificadora. A presente invenção também diz respeito a variantes dos polinucleótidos supramencionados que codificam fragmentos, análogos e derivados do polipeptido que possui a sequência deduzida de aminoácidos da figura 1 ou o polipeptido codificado pelo ADNc do clone depositado. A variante do polinucleótido pode ser uma variante alélica do polinucleótido que ocorra naturalmente ou uma variante do polinucleótido que ocorra de forma não natural.
Assim, a presente invenção compreende polinucleótidos que codificam o mesmo polipeptido perfeitamente desenvolvido ilustrado na figura 1 ou o mesmo polipeptido perfeitamente desenvolvido codificado pelo ADNc do clone depositado e também as variantes de tais polinucleótidos, variantes essas que codificam um fragmento, um derivado ou análogo do polipeptido da figura 1 ou o polipeptido codificado pelo ADNc do clone depositado. Tais variantes nucleotídicas compreendem as variantes por supressão, as variantes por substituição e as variantes por adição ou inserção.
Conforme se disse antes, o polinucleótido pode ter uma sequência codificadora que seja uma variante alélica da sequência codificadora que ocorre naturalmente, ilustrada na figura 1, ou da sequência codificadora do clone depositado. Conforme se sabe na especialidade, uma variante alélica é uma forma alternativa de uma sequência polinucleotídica que pode ter uma substituição, uma supressão ou uma adição de um ou vários nucleótidos, em que nenhum destes actos altera substancialmente a actividade do polipeptido codificado. A presente invenção também diz respeito aos polinucleótidos em que a sequência codificadora do polipeptido perfeitamente desenvolvido pode ser fundida no mesmo bloco de leitura com uma sequência polinucleotídica que sirva de auxiliar à expressão e à secrecção de um polipeptido a partir de uma célula hospedeira, por exemplo, uma sequência líder que funcione como uma sequência secretória para regular o transporte de um polipeptido para fora da célula. O polipeptido que possui uma sequência líder é uma preproproteína e pode ter eventualmente a sequência líder clivada pela célula hospedeira para constituir a forma perfeitamente desenvolvida do polipeptido. Os polinucleótidos também podem codificar uma proproteína que seja a proteína perfeitamente desenvolvida mais os resíduos aminoácidos de 5’. Uma proteína perfeitamente desenvolvida que possua uma pró-sequência é uma proproteína e é uma forma inactiva da proteína. Uma vez clivada a pró-sequência, passa a haver uma proteína activa perfeitamente desenvolvida.
Assim, por exemplo, o polinucleótido da presente invenção pode codificar uma proteína perfeitamente desenvolvida ou pode codificar uma proteína que possua uma pró-sequência ou pode codificar uma proteína que possua simultaneamente uma pró-sequência e uma pré-sequência (sequência líder). Os polinucleótidos da presente invenção também podem possuir a sequência codificadora fundida no bloco de leitura com uma sequência de marcador que permita a purificação do polipeptido da presente invenção. A sequência de marcador pode ser um identificador de hexa-histidina transportado por um vector pQE-9 para permitir a purificação do polipeptido perfeitamente desenvolvido fundido com um marcador no caso de um hospedeiro bacteriano, ou então, por exemplo, a sequência de marcador pode ser um identificador de hemaglutinina (HA) no caso de se utilizar um hospedeiro mamífero, v.g. as células COS-78. O identificador HA corresponde a um epitopo obtido a partir da proteína hemaglutinina da gripe (Wilson, I. Et ai, Cell, 37:767 (1984)). 7½ A presente invenção também diz respeito aos polinucleótidos que hibridem com as sequências anteriormente descritas, de houver pelo menos uma identidade de 70% entre as sequências. A presente invenção diz respeito particulannente aos polinucleótidos que hibridem em condições rigorosas com o s polinucleótidos anteriormente descritos. Tal como aqui utilizada, a expressão “condições rigorosas” refere-se à hibridação que irá ter lugar apenas se houver pelo menos 95% e de preferência pelo menos 97% de identidade entre as sequências.
Os polinucleótidos que hibridam com os polinucleótidos anteriormente descritos, numa variante preferida, codificam polipeptidos que conservam praticamente a mesmas função ou actividade biológica existente no polipeptido perfeitamente desenvolvido codificado pelo ADNc da figura 1 ou pelo ADNc depositado.
Os depósitos aqui referidos serão mantidos ao abrigo do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microrganismos para efeitos processuais sobre patentes de invenção. Estes depósitos são indicados apenas por razões de conveniência e tal facto não significa que seja necessário um depósito ao abrigo do parágrafo 112 do artigo 35 do USC. A sequência dos polinucleótidos contidos nos materiais depositados e também a sequência de aminoácidos dos polipeptidos codificados em conformidade, são aqui incorporadas por referência e servem de contraprova no caso de haver qualquer conflito a propósito da descrição das sequências aqui descritas. Eventualmente será necessário obter uma licença para fazer, utilizar ou comercializar os materiais depositados não conferindo isto tal licença. A presente invenção também diz respeito a um polipeptido dos Corpúsculos de Stannius que possui a sequência deduzida de aminoácidos da figura 1 ou que possui a sequência de aminoácidos codificada pelo ADNc depositado, e bem assim diz respeito aos fragmentos, análogos e derivados de tal polipeptido.
Os termos “fragmento”, “derivado” e “análogo”, quando associados ao polipeptido da figura 1 ou ao codificado pelo ADNc depositado, designam um polipeptido que conserve essencialmente a mesma função ou actividade biológica existente em tal polipeptido. Assim sendo, um análogo compreende uma proproteína que possa ser activada por clivagem da parcela da proproteína para produzir um polipeptido activo perfeitamente desenvolvido. O polipeptido da presente invenção pode ser um polipeptido recombinante, um polipeptido natural ou um polipeptido sintético, sendo de preferência um polipeptido recombinante. O fragmento, o derivado ou o análogo do polipeptido da figura 1 ou aquele que é codificado pelo ADNc depositado por ser (i) um produto em que um ou vários dos resíduos aminoácidos são substituídos com um resíduo aminoácido conservado ou não conservado (de preferência um resíduo aminoácido conservado) e tal resíduo aminoácido substituído pode ser ou não ser um resíduo codificado pelo código genético ou (ii) um produto em que um ou vários dos resíduos aminoácidos possuem um grupo substituinte ou (iii) um produto em que o polipeptido perfeitamente desenvolvido está fundido com outro composto, por exemplo, um composto que faça aumentar o período de semi-vida do polipeptido (por exemplo o polietileno--glicol) ou (iv) um produto em que os aminoácidos adicionais estão fundidos com o polipeptido perfeitamente desenvolvido, por exemplo, uma sequência líder ou secretória ou uma sequência que seja utilizada para a purificação do polipeptido perfeitamente desenvolvido ou uma sequência proproteínica. Pressupõe-se que tais fragmentos, derivados e análogos são matéria do conhecimento dos especialistas, à luz dos preceitos aqui divulgados.
Os polipeptidos e os polinucleótidos da presente invenção são apresentados preferen-cialmente numa forma isolada e de preferência são putrificados até atingirem um estado de homogeneidade.
?$s O termo “isolado” significa que o material em causa é retirado do seu ambiente original {v.g. o ambiente natural onde ocorre normalmente). Por exemplo, um polinucleótido ou um polipeptido de tipo natural, presente num animal vivo, não está isolado, mas o mesmo polinucleótido ou ADN ou polipeptido, qualquer deles separado de uma parte ou da totalidade dos materiais coexistentes no sistema natural, considera-se isolado. Tal polinucleótido pode fazer parte de um vector e/ou tal polinucleótido ou polipeptido pode fazer parte de uma composição e mesmo assim podem ser considerados isolados, na medida em que tal vector ou composição não faça parte do seu ambiente natural. A presente invenção também diz respeito a vectores que contenham polinucleótidos da presente invenção, células hospedeiras que por meio de técnicas da engenharia genética tenham sido associadas aos vectores da invenção e ainda diz respeito à produção de polipeptidos da invenção por meio de técnicas recombinantes.
As células hospedeiras são associadas por meio de técnicas da engenharia genética (traduzidas ou transformadas ou transfectadas) aos vectores da presente invenção que podem ser seleccionados, por exemplo, entre vectores de clonagem e vectores de expressão. Eventualmente o vector pode estar, por exemplo, sob a forma de um plasmídeo, uma partícula virai, um fago, etc.. As células hospedeiras tratadas, por meio de técnicas da engenharia genética, podem ser criadas em cultura num meio nutriente convencional modificado conforme adequado para activar os promotores, seleccionar os transformantes ou amplificar os genes dos Corpúsculos de Stannius. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e outras, são as que foram previamente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para expressão e são óbvias para os especialistas na matéria.
Os polinucleótidos da presente invenção podem ser utilizados para a produção de um polipeptido por meio de técnicas recombinantes. Assim, por exemplo, a sequência poli- nucleotídica pode ser incorporada em qualquer veículo de um conjunto de veículos de expressão, em particular nos vectores ou plasmídeos para a expressão de um polipeptido. Tais vectores compreendem sequências de AJDN cromossómico, monocromossómico e sintético, v.g. os derivados de SV40; plasmídeos bacterianos; ADN de fagos; plasmídeos de leveduras; vectores obtidos a partir de combinações de plasmídeos e de ADN de fagos, ADN virai, tal como o de vacinnia, adenovirus, vírus da varicela e da pseudoidrofobia. No entanto, é possível utilizar qualquer outro plasmídeo ou vector desde que seja replicável e viável no hospedeiro. A sequência de ADN adequada pode ser inserida no vector por meio de vários procedimentos. Em geral, insere-se a sequência de ADN num dos locais adequados da endonuclease de restrição, por meio de procedimentos conhecidos na especialidade. Presume-se que estes e outros procedimentos sejam conhecidos pelos especialistas na matéria. A sequência de ADN no vector de expressão é ligada funcionalmente a uma sequência de controlo da expressão, adequada (promotor) para comandar a síntese do ARNm. Como exemplos representativos de tais promotores é possível referir: o promotor RTL (o mesmo que LTR) ou o promotor SV40, trp ou lac de E. coli, o promotor PL do fago λ e outros promotores sobre os quais se sabe que controlam a expressão de genes em células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus. O vector de expressão também contém um local de ligação ribossómico para o início da tradução e um terminador da transcrição. O vector também pode conter sequências adequadas para amplificar a expressão.
Além disso, os vectores de expressão contêm preferencialmente um gene que confere uma característica fenotípica para selecção de células hospedeiras transformadas, por exemplo, a di-hidrofolato-reductase ou a resistência à neomicina, para a cultura de células eucarióticas, ou então, por exemplo, a resistência à tetraciclina ou à ampicilina em E. coli.
É possível utilizar o vector que contém a sequência de ADN adequada, conforme descrito supra, e também um promotor adequado ou uma sequência de controlo conveniente, para transformar um hospedeiro adequado para permitir que o hospedeiro exprima a proteína.
Como exemplos representativos de hospedeiros adequados é possível referir: células bacterianas, por exemplo, de E. coli, Salmonella typhirrmrium, Streptomyces; células fúngicas, por exemplo, de leveduras; células de insectos, por exemplo, de Drosophila ou SJ9, células de animais, por exemplo, de OCC, células COS ou de melanoma de Bowes; células de plantas, etc.. Pressupõe-se que a selecção de um hospedeiro conveniente está ao alcance dos especialista na matéria, à luz dos preceitos aqui descritos.
Mais particularmente, a presente invenção também diz respeito a arquétipos recombi-nantes que contenham uma ou várias da sequências plenamente descritas supra. Os arquétipos compreendem um vector, tal como um vector plasmídico ou virai, no qual foi inserida uma sequência, da invenção, com uma orientação directa ou inversa. De acordo com um aspecto preferido desta variante, o arquétipo também compreende sequências regulatórias, incluindo, por exemplo, um promotor funcionalmente ligado à sequência. Os especialistas na matéria conhecem inúmeros vectores e promotores adequados que se encontram comercialmente disponíveis. A titulo de exemplo indica-se seguidamente alguns vectores: bacterianos -pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBs, pDIO, fagoscript, PsiX174, Pbluescript SK, Pbsks, pNH8a, pNHlóa, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); eucarióticos - PWLNEO, pSV2cat, pOG44, pXTl, PSG (Stratagene) pSVK3, PBPV, PMSG, PSVL (Pharmacia). No entanto, é possível utilizar qualquer outro plasmídeo ou vector desde que seja replicável e viável no hospedeiro.
As regiões promotoras podem ser seleccionadas a partir de qualquer gene desejado, utilizando vectores de CAT (cloranfenicol-transferase) ou outros vectores com marcadores
seleccionáveis. Há dois vectores adequados que são o pKK232-8 e o pCM7. Como promotores bacterianos designa-se particularmente os seleccionados entre lacl, lacZ, T3, T7, gpt, λ Pr, Pl e trp. Os promotores eucarióticos compreendem aquele cuja expressão ocorre em primeiro lugar no CMV, a timidina-quinase do HVS, aqueles cuja expressão ocorre em primeiro lugar e em último lugar no SV40, os LTR de retrovírus e a metalotioneina I dos murganhos. A selecção do vector e do promotor adequados é matéria da competência dos especialistas na matéria.
De acordo com uma outra variante, a presente invenção diz respeito a células hospedeiras que contenham o arquétipo descrito supra. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica superior, por exemplo, uma célula de mamífero ou uma célula eucariótica inferior, por exemplo, uma célula de levedura, ou então a célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, por exemplo, uma célula bacteriana. A introdução do arquétipo na célula hospedeira pode ser realizada por transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE--dextrano ou por electroporação (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., ‘Basic Methods in Molecular Biology’ (1996)).
Os arquétipos nas células hospedeiras podem ser utilizados de uma forma convencional para produzirem o produto génico codificado pela sequência recombinante. Em alternativa, os polipeptidos da invenção podem ser produzidos por via sintética, utilizando para tal sintetizadores convencionais de péptidos.
As proteínas perfeitamente desenvolvidas podem ser exprimidas em células de mamíferos, de leveduras, de bactérias ou noutro tipo de células, sob o controlo de promotores adequados. Os sistemas de tradução sem células também podem ser utilizados para a produção de tais proteínas, utilizando os ARN derivados dos arquétipos de ADN da presente invenção. Os vectores adequados de clonagem e de expressão utilizáveis com hospedeiros procarióticos e
eucarióticos foram descritos por Sambrook et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), cujo conteúdo se considera aqui incorporado por referência. A transcrição do ADN que codifica o polipeptido da presente invenção por organismos eucarióticos superiores aumenta mediante a inserção de uma sequência intensificadora no vector. Os intensificadores são elementos de ADN activos cis, que possuem normalmente entre cerca de 10 e 300 pb que actuam sobre um promotor para aumentar a sua transcrição. Como exemplos refere-se o intensificador de SV40 do último lado da origem de replicação dos pb 100 a 270, um intensificador do promotor cuja expressão ocorre em primeiro lugar no citomegalovírus, o intensificador do polioma do último lado da origem de replicação e os intensificadores de adenovirus. De um modo geral, os vectores de expressão recombinantes irão conter as origens de replicação e os marcadores seleccionáveis que permitam a transformação da célula hospedeira, v.g., o gene de E. coli e o gene da estirpe TRP1 de S. cerevisiae, que conferem resistência à anticilina, e ainda um promotor derivado de um gene fortemente expresso para dirigir a transcrição de uma sequência estrutural a jusante. Tais promotores podem ser obtidos a partir de operões que codifiquem enzimas glicolíticas, tais como a 3--fosfoglicerato-cinase (PGK), o factor a, a fosfatase ácida ou as proteínas do choque térmico, entre outras. A sequência estrutural heteróloga é agregada, numa fase adequada, À sequência de início e de terminação da tradução e de preferência a uma sequência líder capaz de comandar a secrecção da proteína traduzida dentro do espaço periplásmico ou num meio extracelular. De forma facultativa, a sequência heteróloga pode codificar uma proteína de fusão que possua um péptido de identificação do terminal N que confira características desejadas, v.g., a estabilização ou a purificação simplificada do produto recombinante expresso.
Os vectores de expressão úteis para utilização bacteriana são construídos mediante a inserção de uma sequência de ADN estrutural que codifique uma proteína desejada conjuntamente com os sinais de início e de terminação da tradução em fase de leitura executável com um promotor funcional. O vector deve conter um ou vários marcadores seleccionáveis fenotípicos e uma origem de replicação para assim se garantir a conservação do vector e também, se desejável, para permitir a amplificação dentro do hospedeiro. Como hospedeiros procarióticos adequados, para efeitos de transformação, refere-se os seleccionados entre E. coli, Bacillns subtil is, Salmonella typhimurium e ainda diversas espécies pertencentes aos géneros Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus, embora os critérios de escolha permitam optar por outros.
Como exemplo representativo, mas não limitativo, os vectores de expressão úteis para utilização bacteriana podem conter um marcador seleccionável e uma origem bacteriana de replicação, obtidos a partir de plasmídeos comercialmente disponíveis que contenham elementos genéticos do vector de clonagem pBR322 bem conhecido(ATCC 37017). Tais vectores comerciais, compreendem, por exemplo, o pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia) e o GEMI (Promega Biotec, Madison, Wl, E.U.A). Estas secções “estruturais” de pBR322 são combinadas com um promotor adequado e com a sequência estrutural que se pretende exprimir. A seguir à transformação de uma estiipe hospedeira adequada, e após o desenvolvimento da estirpe hospedeira até atingir uma densidade celular conveniente, induz-se o promotor seleccionado por meios adequados (v.g., por variação de temperatura ou por indução química) e faz-se uma criação das células em cultura durante um período complementar.
As células são colhidas, de forma convencional, por centrifugação, são desmembradas por meios físicos ou químicos e depois o extracto impuro resultante é guardado para posterior purificação.
As células microbianas utilizadas na expressão de proteínas podem ser desmembradas por aplicação de qualquer método conveniente, incluindo ciclos de congelação e descongelação, tratamento com ultra-sons, desmembramento mecânico ou então utilizando agentes que provoquem a citólise, sendo tais métodos bem conhecidos pelos especialistas na matéria.
Também é possível utilizar diversos sistemas de cultura de células de mamíferos para exprimir a proteína recombinante. Como exemplos de sistemas de expressão de mamíferos refere-se as linhagens COS-7 de fibroblastos do rim do macaco, descritas por Gluzman, Cell, 23:175 (1981), e outras linhagens de células capazes de exprimirem um vector compatível, por exemplo, as linhagens de células C127, 3T3, OCC (o mesmo que CHO), HeLa e BHK. Os vectores de expressão de mamíferos vão conter uma origem de replicação, um promotor e um intensificador convenientes e também quaisquer locais necessários de ligação ribossómica, um local de poliadenilação, locais de junção do dador e do aceitador, sequências de terminação transcripcional e sequências não transcritas de flanqueamento em 5’. As sequências de ADN obtidas a partir da junção do S V40 e os locais de poliadenilação podem ser utilizados para proporcionar os elementos genéticos necessários não transcritos. A proteína dos Corpúsculos de Stannius é recuperada e purificada a partir das culturas de células recombinantes por métodos entre os quais se salienta a precipitação com sulfato de amónio ou etanol, a extracção em meio ácido, a cromatografia de permuta aniónica ou catiónica, a cromatografia fosfocelulósica, a cromatografia por interacção hidrofóbica, a cromatografia por afinidade, a cromatografia com hidroxiapatite e a cromatografia com lectina. E preferível que haja fracas concentrações (aproximadamente entre 0,15 e 5 mM) do ião cálcio presente durante a purificação. (Price et ai, ‘J. Biol. Chem.’, 244;:917 (1969)). É possível introduzir passos de desdobramento de proteínas, conforme necessário, ao completar a configuração da proteína perfeitamente desenvolvida. Finalmente, é possível recorrer à cromatografia em líquido de elevado rendimento (CLER) nos passos finais de purificação.
Os polipeptidos da presente invenção podem ser um produto purificado naturalmente ou podem ser um produto resultante de procedimentos de síntese química ou produzido por técnicas recombinantes a partir de hospedeiros procarióticos ou eucarióticos (por exemplo, criando em cultura células de bactérias, leveduras, plantas superiores, insectos e mamíferos). Consoante os hospedeiros utilizados no procedimento de produção recombinante, assim os polipeptidos da presente invenção podem ser glicosilados com hidratos de carbono extraídos de mamíferos ou de outros seres eucarióticos ou podem ser não glicosilados. Os polipeptidos da presente invenção também podem conter um resíduo aminoácido metionina inicial. O polipeptido da presente invenção pode ser utilizado para o tratamento terapêutico de inúmeras doenças relacionadas com os electrólitos. Uma causa da hipertensão arterial é o transporte anormal de Na' através da parede celular das células lisas vasculares, devido a um defeito existente na bomba de Na-K, ou porque ocorra a sua inibição, e outra razão é a maior permeabilidade ao Na', tal como foi já descrito em algumas formas de hipertensão humana. O resultado de tudo isto é um aumento do Nar intracelular, o que faz com que a célula fique mais sensível aos agentes vasoconstritores. Uma vez que o Ca" acompanha o Nar, presume-se que seja a acumulação do Ca+' intracelular e não a do Na+ per si o factor responsável pela maior sensibilidade à estimulação do sistema simpático. Assim sendo, uma vez que a proteína dos Corpúsculos de Stannius pode funcionar como um agente hipocalcémico, pode depois ajudar τχ a compensar esta maior quantidade de Ca'" intracelular e a reduzir ou a evitar a hipertensão. Além disso, a hipercalcemia tem vindo a ser associada a disarritmias cardíacas, estados de coma e paragem cardíaca. Assim sendo, a proteína dos Corpúsculos de Stannius pode ter valor terapêutico para o tratamento de tais doenças, fazendo baixar a concentração do cálcio livre. A hipertensão também está directamente relacionada com as doenças renais. Assim, uma concentração de electrólitos superior ou inferior ao normal pode provocar uma disfunção renal e conduzir directamente a outras doenças mais graves. Como exemplo refere-se o facto de um desequilíbrio entre cálcio e fósforo poder provocar dores musculares e ósseas e a desmineralização dos ossos e a calcificação de diversos órgãos, incluindo o cérebro, os olhos, o miocárdio e os vasos sanguíneos. Posto isto, o polipeptido da presente invenção pode ser utilizado para compensar doenças originadas por um desequilíbrio entre cálcio e fosfatos. Por sua vez, uma insuficiência renal determina uma concentração anoimalmente elevada de fosfatos no sangue que pode ser reposta nas concentrações normais pelo polipeptido da presente invenção. O polipeptido da presente invenção também é útil para o tratamento de determinadas doenças ósseas. Por exemplo, concentrações excessivas de cálcio originam o desenvolvimento de nódulos fibrosos nos ossos afectados.
As causas da hipercalcemia também podem determinar inúmeras doenças de diferente natureza, incluindo o hiperparatiroidismo, a hipervitaminose D, os tumores que fazem aumentar os níveis de cálcio no soro por destruição dos ossos, a sarcoidose, o hipertiroidismo, a insuficiência supra-renal, a perda de albumina sérica associada a doenças renais, absorção excessiva do cálcio GI e uma elevada concentração de proteínas no plasma. Deste modo, a proteína dos Corpúsculos de Stannius é eficaz na redução da hipercalcemia e das doenças com ela relacionadas.
A proteína dos Corpúsculos de Stannius também pode ser útil para o tratamento de outras doenças associadas a concentrações de electrólitos invulgares e ao desequilíbrio de fluidos, por exemplo, as enxaquecas. O polipeptido também pode ser utilizado, de acordo com a presente invenção, mediante a expressão de tal polipeptido in vivo, o que recebe frequentemente a designação de “terapia génica”.
Assim, por exemplo, as células de um paciente podem ser recondicionadas com um polinucleótido (ADN ou ARN) que codifique o polipeptido ex vivo, sendo então essas células recondicionadas administradas a um paciente que se pretenda tratar com o polipeptido. Tais métodos são perfeitamente conhecidos na especialidade. Por exemplo, as células podem ser recondicionadas por meio de procedimentos conhecidos na especialidade, mediante a utilização de uma partícula retroviral que contenha ARN que codifique o polipeptido da presente invenção.
De igual modo, as células podem ser recondicionadas in vivo para expressão do polipeptido in vivo, por exemplo, através de procedimentos conhecidos na especialidade. Conforme é sabido no domínio da técnica, uma célula produtora que produza uma partícula retroviral que contenha ARN que codifique o polipeptido da presente invenção pode ser administrada a um paciente para recondicionar células in vivo e para a expressão do polipeptido in vivo. Estes e outros métodos para administração de um polipeptido da presente invenção, por meio de um tal processo, passam a ser evidentes para os especialistas na matéria a partir dos preceitos divulgados pela presente invenção. Por exemplo, o veículo de expressão para recondicionar células pode não ser um retrovirus, podendo ser, por exemplo, um adenovirus que possa ser utilizado eventualmente para recondicionar células in vivo após a combinação com um veículo de administração adequado.
Os polipeptidos da presente invenção podem ser utilizados em combinação com um veículo farmacêutico conveniente. Tais composições contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína e um veículo ou um excipiente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Um tal veículo pode ser seleccionado, mas sem que isso constitua qualquer limitação, entre solutos salinos* soluções salinas tamponadas, dextrose, água, glicerol, etanol e suas combinações. A formulação deve ser conforme com o modo de administração. A invenção também proporciona uma embalagem ou estojo farmacêutico onde estão contidos um ou vários recipientes que contêm um ou vários dos ingredientes da composição farmacêutica da invenção. Em associação com tais recipientes pode haver informação que obedeça às prescrições de um departamento governamental, que sirva para regular o fabrico, a utilização ou a comercialização de produtos farmacêuticos ou biológicos, reflectindo essa informação a autorização concedida por essa entidade para o fabrico, utilização ou comercialização para efeitos de administração aos seres humanos. Além disso, o polipeptido da presente invenção pode ser utilizado em conjunto com outros compostos terapêuticos.
As composições farmacêuticas podem ser administradas de uma forma conveniente, por exemplo, pelas vias oral, intravenosa, intraperitonial, intramuscular, subcutânea, intranasal ou intradermal. As quantidades e os regimes de dosagem para efeitos de administração a um paciente vão depender de inúmeros factores, tais como o modo de administração, a natureza da doença que se pretenda tratar, a massa corporal do paciente em causa e o diagnóstico do médico assistente. De um modo geral, tais quantidades são administradas, por exemplo, em doses terapeuticamente eficazes não inferiores a cerca de 0,1 mg/kg de massa corporal e na maior parte dos casos não serão administradas em doses superiores a cerca de 10,0 mg/kg de massa corporal e de preferência são administradas em doses compreendidas entre cerca de 0,1 mg/kg de massa corporal e cerca de 1,0 mg/kg de massa corporal, por dia, durante vários dias, tomando em consideração as vias de administração, os sintomas, etc..
As sequências da presente invenção também são valiosas para identificação cro-mossómica. Cada sequência é especificamente encaminhada para um local particular de um cromossoma humano individual com o qual pode hibridar. Além do mais, há permanentemente necessidade de identificar locais particulares nos cromossomas. Presentemente já estão disponíveis alguns reagentes de marcação de cromossomas, com base nos dados das sequências reais (polimorfismos de repetição) para marcar a localização cromossómica. A cartografia dos ADN de cromossomas de acordo com a presente invenção constitui um primeiro passo importante para correlacionar tais sequências com genes associados à doença.
Dito de forma abreviada, as sequências podem ser cartografadas em cromossomas mediante a preparação de iniciadores de RCP (de preferência com 15 a 25 pb) a partir de ADNc. Recorre-se à análise do ADNc, auxiliada por computador, para seleccionar de forma rápida os iniciadores que não abranjam mais de um exão num ADN genómico, complicando pois o processo de amplificação. Estes iniciadores são utilizados depois para pesquisar por RCP os híbridos de células somáticas que contenham os cromossomas humanos individuais. Apenas os híbridos que contenham o gene humano correspondente ao iniciador irão proporcionar um fragmento amplificado. A cartografia por RCP de híbridos de. células somáticas é um procedimento rápido para se concluir se um ADN particular pertence a um cromossoma particular. Utilizando a presente invenção com os mesmos iniciadores oligonucleotídicos, é possível conseguir a sublocalização com painéis de fragmentos provenientes de cromossomas específicos ou de misturas de grandes clones genómicos, de uma forma análoga. Outras estratégias de cartografia que também podem ser igualmente utilizadas para cartografar o seu cromossoma, compreendem a hibridação in silu, a pesquisa prévia com cromossomas marcados e agrupados ordenadamente e a selecção prévia por hibridação para a construção de bancos de dados de ADNc específicos dos cromossomas. É possível recorrer à hibridação fluorescente in situ (HF1S, o mesmo que FISH) de um clone de ADNc para uma dispersão cromossómica metafásica para se conseguir uma localização cromossómica exacta num só passo. Esta técnica pode ser utilizada com um ADNc relativamente curto, da ordem de 500 ou 600 bases; no entanto, para os clones que tenham mais de 2 000 pb é maior a probabilidade de se ligarem a um local cromossómico único, com uma intensidade de sinal suficiente para uma detecção simples. A HFIS exige a utilização do clone a partir do qual se obteve a EST e quanto mais comprido for melhor é. Por exemplo, 2 000 pb é bom, 4 000 é melhor e provavelmente não será necessário um valor superior a 4 000 para se conseguir obter bons resultados num intervalo de tempo razoável. Para estudo desta técnica veja-se Verma et al., ‘Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press’, Nova Iorque (1988).
Logo que uma sequência tenha sido cartografada e atribuída a um local cromossómico exacto, então a posição física da sequência sobre o cromossoma pode ser correlacionada com dados de cartografia genética. Tais dados podem ser encontrados, por exemplo, na obra de V. McKusick, ‘Mendelian Inheritance in Man’ (pode ser obtida por via informática por ligação directa a ‘Johns Hopkins University Welch Medicai Libraiy’). A relação entre doenças e genes que tenham sido cartografados e atribuídos à mesma região cromossómica é então identificada por análise das concatenações (coereditariedade de genes fisicamente adjacentes).
Seguidamente é necessário determinar as diferenças existentes nas sequências de ADNc ou genómicas entre indivíduos afectados e não afectados. Se for observada uma mutação numa parte ou na totalidade dos indivíduos afectados, mas não em nenhum indivíduo normal, então a mutação é muito provavelmente o agente causador da doença.
Com a resolução actualmente permitida pelas técnicas de cartografia física e de cartografia genética, um ADNc localizado exactamente numa região cromossómica associada à doença poderia ser um dos 50 a 500 potenciais genes causadores. (Isto pressupõe uma resolução cartográfica de 1 megabase e um gene por cada 20 kb). A comparação entre indivíduos afectados e não afectados implica geralmente procurar em primeiro lugar alterações estruturais nos cromossomas, tais como supressões e translocações que sejam visíveis nas expansões cromossómicas ou detectáveis utilizando a RCP com base nessa sequência de ADNc. Em última instância é necessária uma sequenciação completa de genes de vários indivíduos para se confirmar a presença de uma mutação e para se distinguir mutações a partir de polimorfismos. A presente invenção também tem por objecto inibir in vivo uma proteína dos Corpúsculos de Stannius mediante a utilização da tecnologia anti-sentido. A tecnologia anti-sentido pode ser utilizada para controlar a expressão dos genes através da formação de uma hélice tripla ou de um ADN ou de um ARN anti-sentido, tendo estes dois métodos por base a ligação de um polinucleótido ao ADN ou ao ARN. Por exemplo, utiliza-se a parte da sequência polinucleotídica codificadora em 5’, a qual codifica o polipeptido perfeitamente desenvolvido da presente invenção, para conceber e projectar um oligonucleótido de ARN anti-sentido com um comprimento compreendido entre cerca de 10 e cerca de 40 pares de bases. Concebe-se e projecta-se um oligonucleótido de ADN de modo a que seja complementar de uma região de um gene implicado na transcrição (hélice tripla - ver Lee et ai, Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science , 241:456 (1988); e Dervan et ai, Science 251:1360 (1991)), assim se evitando a transcrição e a produção da proteína dos Corpúsculos de Stannius.
O oligonucleótido de ARN anti-sentido hibrida com o ARNm in vivo e bloqueia a tradução da molécula de ARNm dentro da proteína dos Corpúsculos de Stannius (anti-sentido--Okano, J. Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression’, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)).
Em alternativa, os oligonucléotidos descritos supra podem ser administrados à células por meio de procedimentos conhecidos na especialidade, de tal modo que o ARN ou o ADN anti-sentido possam ser expressos in vivo para inibirem a produção da proteína dos Corpúsculos de Stannius pela forma anteriormente descrita.
Assim sendo, os arquétipos anti-sentido da proteína dos Corpúsculos de Stannius podem ser utilizados para tratar a hipocalcemia mediante a inactivação da proteína dos Corpúsculos de Stannius, evitando consequentemente um efeito hipocalcémico. E possível tratar a osteoporose, caracterizada por ossos finos e quebradiços devido a um nível exíguo de cálcio, mediante a utilização dos arquétipos anti-sentido descritos supra. De igual forma, estes arquétipos anti-sentido podem ser utilizados para tratar a doença de Paget.
Os polipeptidos, os seus fragmentos ou outros derivados ou os seus análogos, ou as células que os exprimam, podem ser utilizados como imunogéneos para a produção dos anticorpos correspondentes. Estes anticorpos podem ser, por exemplo, anticorpos policlonais ou monoclonais. A presente invenção também compreende anticorpos de cadeia singular enxertados em RDC (o mesmo que CDR) e humanizados e também os fragmentos Fac (o mesmo Fab), ou o produto de uma base de dados de expressão de Fac. É possível utilizar diversos procedimentos conhecidos na especialidade para a produção de tais anticorpos e fragmentos.
Os anticorpos gerados contra o polipeptido correspondente a uma sequência da invenção ou ao seu receptor in vivo podem ser obtidos por injecção directa do polipeptido num animal 25 ou por administração do polipeptido a um animal, de preferência não humano. O anticorpo assim obtido irá depois ligar-se ao próprio polipeptido. Deste modo, é mesmo possível utilizar uma sequência que codifique apenas uma fragmento do polipeptido para gerar anticorpos que se liguem ao polipeptido natural intacto. Tais anticorpos podem ser utilizados depois para isolar o polipeptido a partir de um tecido que exprima esse polipeptido. Para a preparação de anticorpos monoclonais é possível utilizar qualquer técnica que proporcione anticorpos produzidos por culturas contínuas de linhagens celulares. Como exemplos refere--se a técnica do hibridoma (Kohler e Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), a técnica do trioma, a técnica do hibridoma das células B humanas (Kozbor et al, 1983, Immunology Today 4:72) e a técnica do hibridoma de VEB (o mesmo que EBV) para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et ai, 1985, em ‘Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy’, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).
As técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia singular (patente de invenção norte-americana n° 4 946 778) podem ser adaptadas à produção de anticorpos de cadeia singular contra produtos polipeptídicos imunogénicos da presente invenção.
Os anticorpos específicos contra o polipeptido da presente invenção ainda podem ser utilizados para inibir o funcionamento adequado do polipeptido. Deste modo, os anticorpos podem ser utilizados como agentes anti-hipocalcémicos mediante o impedimento da actividade hipocalcémica da proteína stanniocalcina. Entre as doenças que é possível tratar com estes anticorpos está a osteoporose. A presente invenção também tem por objecto proporcionar um método para identificar um antagonista/inibidor dos polipeptidos da presente invenção, método esse que consiste em fazer contactar o polipeptido e um substrato ou um receptor do polipeptido com um antagonista/
/inibidor putativo e em determinar se o inibidor impede a actividade do pobpeptido. O antagonista/inibidor é seleccionado entre aqueles que inibam ou eliminem a actividade do pobpeptido.
Assim, por exemplo, os antagonistas podem Ugar-se a um pobpeptido da presente invenção e inibir ou eliminar a sua actividade. Por exemplo, o antagonista poderia ser um anticorpo contra o pobpeptido que se ligasse ao pobpeptido ou então, em determinados casos, um oligonucleótido. Como exemplo de um inibidor refere-se uma molécula pequena que se ligue ao local catalítico do pobpeptido, fazendo assim com que este fique inacessível ao substrato e impedindo a actividade biológica. Como exemplos de inibidores de moléculas pequenas refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os péptidos pequenos ou as moléculas de tipo peptídico.
Em alternativa é possível utilizar antagonistas dos pobpeptidos da presente invenção que se bguem aos receptores a que o pobpeptido da presente invenção normalmente se bga. Os antagonistas podem ser proteínas estreitamente afins, tais que reconheçam e se bguem aos locais receptoriais da proteína natural, sendo no entanto formas inactivas da proteína natural e evitando consequentemente a acção da proteína dos Corpúsculos de Stannius, uma vez que os locais receptores estão ocupados. Assim sendo, a acção da proteína dos Corpúsculos de Stannius é evitada e o antagonista/inibidor pode ser utilizado como agente anti-hipocalcémico para o tratamento de osteoporose e de outras doenças em que seja desejável aumentar os níveis do cálcio.
Os antagonistas/inibidores podem ser utilizados numa composição com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, v.g. conforme supramencionado. A presente invenção será melhor descrita tomando como referência os exemplos adiante apresentados; no entanto, faz-se observar que a presente invenção não fica limitada a tais exemplos. Todas as partes ou quantidades, salvo quando especificado de outro modo, são expressas em peso.
Para facilitar a compreensão dos exemplos seguintes far-se-á a descrição de alguns termos e/ou métodos mais frequentes.
Os “plasmídeos” são designados por uma letra p minúscula precedida e/ou seguida por letras maiusculas e/ou números. Os plasmídeos de partida aqui utilizados ou estão comercialmente disponíveis, ou podem ser obtidos facilmente sem restrições ou podem ser construídos a partir de plasmídeos disponíveis, em conformidade com procedimentos do domínio público. Além disso, os plasmídeos equivalentes aos descritos são conhecidos na especialidade e estão ao alcance de um vulgar especialista na matéria. O termo “digestão” de ADN designa a clivagem catalítica do ADN com uma enzima de restrição que actue apenas em determinadas sequência no ADN. As diversas enzimas de restrição aqui utilizadas estão comercialmente disponíveis e as condições para a sua reacção, os cofactores e outros parâmetros necessários foram utilizados em conformidade com preceitos conhecidos pelos especialistas na matéria. Para efeitos analíticos utiliza-se tipicamente 1 pg de plasmídeo ou de um fragmento de ADN com cerca de duas unidades de enzima em cerca de 20 pL de solução tampão. Para se isolar os fragmentos de ADN para a construção do plasmídeo faz-se digerir normalmente entre 5 e 50 pg de ADN com 20 a 250 unidades de enzima num volume maior. As soluções tampão adequadas e as quantidades de substrato para enzimas de restrição particulares são especificadas pelos fabricantes. Normalmente trabalha-se durante períodos de incubação de cerca de 1 hora a 37°C, mas isto pode variar em conformidade com as instruções do fornecedor. A seguir à digestão submete-se o produto da reacção a electroforese directamente sobre um gel de poliacrilamida para se isolar o fragmento desejado.
Efectua-se a separação dimensional dos fragmentos clivados, utilizando para tal um gel de poliacrilamida a 8% descrito por Goeddel, D. et ai, ‘Nucleic Acids Res.’, 8:4057 (1980). O termo “oligonucleótidos” designa quer um polidesoxinucleótido de cadeia singular quer duas cadeias polidesoxinucleotídicas complementares que podem ser sintetizadas por via química. Tais oligonucleótidos sintéticos não têm nenhum fosfato em 5’ e por tal motivo não se ligam a outro oligonucleótido sem adição de um fosfato com um ATP na presença de uma cinase. O oligonucleótido sintético ligar-se-á a um fragmento que não tenha sido desfosforilado. O termo “ligação” refere-se ao processo de formação de pontes fosfodiéster entre dois fragmentos de ácido nucleico de cadeia dupla (Maniatis, T. et al., Id., p. 146). Salvo quando explicitado de outro modo, é possível efectuar a ligação utilizando condições e soluções tampão conhecidas, conjuntamente com 10 unidades de ligase do ADN das T4 (“ligase”) por cada 0,5 pg de quantidades aproximadamente equimolares de fragmentos do ADN que se pretenda ligar.
Salvo quando especificado de outro modo, efectuou-se a transformação conforme descrito no método de Graham, F. e Van der Eb, A., Virology, 52:456-457 (1973).
Exemplo 1
Expressão Bacteriana e Purificação da Proteína dos Corpúsculos de Stannius Inicialmente amplificou-se a sequência de ADN que codifica a proteína dos Corpúsculos de Stannius (ATCC # 75652), utilizando iniciadores oligonucleotídicos da RCP correspondentes às sequências de 5’ e 3’ da proteína dos Corpúsculos de Stannius, e juntou-se depois às sequências de 5’ e 3’ outros nucleótidos correspondentes respectivamente ao local de restrição de Sphl e ao BglI. O iniciador oligonucleotídico de 5’ possui a sequência
5’-GACTGCATGCTCCAAAACTCAGCAGTG-3’, contém um local da enzima de restrição de Sphl (GCATGC) e 21 nucleótidos da sequência codificadora da proteína dos Corpúsculos de Stannius que começa no codão de início; a sequência de 3’, que é 3’-GACTAGATCTTGCACTCTCATGGGATGTGCG-5’, contém as sequências complementares para o local de restrição de BglII (AGATCT) e os últimos 21 nucleótidos da sequência codificadora da proteína dos Corpúsculos de Stannius. Os locais da enzima de restrição correspondem aos locais da enzima de restrição no vector pQE70 de expressão bacteriana (Qiagen Inc. 9259 Eton Ave., Chatsworth, CA 91311. O vector pQE70 codifica a resistência aos antibióticos (Amp'), uma origem de replicação bacteriana (ori), um operador do promotor (O/P) regulável por EPTG, um local de ligação ribossómica (LLR, o mesmo que RBS), um identificador 6-His e os locais da enzima de restrição. Depois fez-se digerir o vector pQE70 com as enzimas de restrição Sphl e BglII. As sequências amplificadas foram ligadas dentro do vector pQE70 e foram inseridas concatenadamente com a sequência que codifica o identificador histidina e o LLR. Depois utilizou-se a mistura de ligação para transformar a estirpe M15/rep4 de E. coli, fornecida por Qiagen com a marca comercial M15/rep4. A estirpe M15/rep4 contém cópias múltiplas do plasmídeo pREP4 que exprime o repressor lacl e que também confere resistência à canamicina (kan1). Os transformantes são identificados pela sua capacidade para crescerem em placas de LB, tendo sido seleccionadas as colónias resistentes à ampicilina/canamicina. Isolou-se o ADN plasmídico e confirmou-se por análise de restrição. Os clones que continham os arquétipos desejados cresceram de um dia para o outro (D/O) em cultura em meio líquido em meios LB enriquecidos simultaneamente com Amp (100 pg/mL) e Kan (25 pg/mL). Utilizou-se a cultura obtida D/O para inocular uma cultura grande numa proporção entre 1:100 e 1:250. As células cresceram até ter sido atingida uma densidade óptica 600 (D.O600) compreendida entre 0,4 e 0,6. A seguir juntou-se IPTG
(isopropil-P-D-tiogalacto-piranósido) até uma concentração final e 1 mM. O EPTG induz o repressor lacl por inactivação, depurando o O/P que conduz a uma maior expressão génica. Deixou-se as células crescer durante mais 3 a 4 horas. Depois efectuou-se a colheita das células por centrifugação (20 minutos a 6 000 x g). Solubilizou-se a massa de células no agente caotrópico guanidina»HCl 6 M. Depois de clarificada a solução, purificou-se a stanniocalcina solubilizada, a partir desta solução, por cromatografia numa coluna de Níquel-Quelato em condições que permitiram uma ligação cerrada das proteínas que continham o identificador 6-His. (Hochuli, E et ai, ‘Genetic Engineering, Principies & Methods’, 12: 87-98 (1990). A renaturação das proteínas para fora dos GnHCl pode ser realizada em conformidade com diversos protocolos. (Jaenicke, R e Rudolph, R., ‘Protein Structure - A Praticai Approach’, IRL Press, Nova Iorque (1990)). Inicialmente recorre-se à diálise progressiva para a remoção do GnHCl. Em alternativa, a proteína purificada que foi isolada a partir da coluna de Níquel- -Quelato pode ser ligada a uma segunda coluna sobre a qual se faz correr um gradiente de Gn.HCL linear decrescente. Deixa-se a proteína renaturar enquanto se liga à coluna e subse-quentemente realiza-se a eluição com uma solução tampão que contém imidazol 250 mM, NaCl 150 mM, Tris-HCl 25 mM a pH 7,5 e 10% de glicerol. Finalmente, efectua-se a diálise da proteína solúvel em presença de uma solução de tampão de armazenagem que contém bicarbonato de amónio 5 mM. A proteína purificada foi depois analisada por EGPA-DSS (ver a figura 3). A luz dos preceitos descritos são possíveis inúmeras modificações e variações da presente invenção, pelo que é possível no contexto das reivindicações anexas, praticar a invenção de uma forma diferente daquela que foi aqui particularmente descrita.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE. OLSEN ETAL. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: “Proteína dos Corpúsculos de Stannius, a stanniocalcina” (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: CARELLA, BYRNE, BAIN, GELFILLAN,
CECCHI, STEWART & OLSTEIN
(B) RUA: 6 BECKER FARM ROAD
(C) CIDADE: ROSELAND
(D) ESTADO: NEW JERSEY (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL. 07068 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR:
(A) SUPORTE: DISQUETE DE 3,5 POLEGADAS (B) COMPUTADOR: IBM PS/2
(C) SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: WORD PERFECT 5.1 (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/208 005 (B) DATA DE DEPÓSITO: 8 DE MARÇO DE 1994 (C) CLASSIFICAÇÃO: (vli) DADOS ANTERIORES DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE DEPÓSITO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE O REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: FERRARO, GREGORY D. 32 (B) NÚMERO DO PEDIDO: 36 134 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO PROCESSO: 325800-139 (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 201-994-1700 (B) TELEFAX: 201-994-1744 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:
(A) COMPRIMENTO: 771 PARES DE BASES
(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
(C) TIPO DE CORDÃO: SIMPLES
(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l: GAAACTTCTC AGAGAATGCT CCAAAACICA GCAGTGCTTC TGGTGCTGGT GATCAGTGCT 60 TCTGCAACCC ATGAGGCGGA GCAGAATGAC TCTGTGAGCC CCAGGAAATC CCGAGTGGCG 120 GCCCAAAACT CAGCTGAAGT GGTTCGTTGC CTCAACAGTG CTCTACAGGT CGGCTGCGGG 180 GCTTTTGCAT GCCTGGAAAA CTCCACCTGT GACACAGATG GGATGTATGA CATCTGTAAA 240 TCCTICTTGT ACAGCGCTGC TAAATTTGAC ACTCAGGGAA AAGCATTCGT CAAAGAGAGC 300 TTAAAATGCA TCGCCAACGG GGTCACCTCC AAGGTCITCC TCGCCATTCG GAGGTGCTCC 360 ACTTTCCAAA GGATGATTGC TGAGGTGCAG GAAGAGTGCT ACAGCAAGCT GAATGTGTGC 420 AGCATCGCCA AGCGGAACCC 7GAAGCCATC ACTGAGGTCG TCCAGCTGCC CAATCACTTC 480 TCCAACAGAT ACTATAACAG ACTTGTCCGA AGCCTGCTGG AATGTGATGA AGACACAGTC 540 AGCACAATCA GAGACAGCCT GATGGAGAAA ATIGGGCCTA ACATGGCCAG CCTCTTCCAC 600 ATCCTGCAGA CAGACCACIG TGCCCAAACA CACCCACGAG CIGACTTCAA CAGGAGACGC 660 ACCAATGAGC CGCAGAAGCT GAAAGTCCTC CTCAGGAACC TCCGAGGTGA GGAGGACTCT 720 CCCTCCCACA TCAAACGCAC ATCCCATGAG AGTGCATAAC CAGGGAGAGG T 771 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:
(A) COMPRIMENTO: 247 AMINOÁCIDOS
(B) TIPO: AMINOÁCEDO (C) TIPO DE CORDÃO:
(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:
Met Leu Qn Asn -30 Ser Ser Ala Thr His -15 Ou Lis Ser Aig Vai 1 Ala Leu Asn Ser 15 Ala Leu Ou Asn Ser 30 Thr Cis Ser Phe Leu 45 Tír Ser Phe Vai Lis 60 Ou Ser Lis Vai Phe 75 Leu Ala Ee Ala Ou 90 Vai Qn Ser Ee Ala 105 Lis Aig Leu Pro Asi 120 His Phe Ser Leu Leu 135 Ou Cis Ser Leu Met 150 Ou Lis Ee Leu Qn 165 Thr Asp He Asn Aig 180 Arg Arg Leu Aig Asi 195 Leu Arg Aig Thr
His Ghj Ala Vai Leu Leu -25 Vai Ala Qu Qn Asi -10 Asp Ala Qn Asn 5 Ser Ala Qn Vai GE 20 Cis GE Asp Thr Asp 35 GE Met Ala Ala Lis 50 Phe Asp Leu Lis Cis 65 De Ala De Arg Arg 80 Cis Ser Qu Qu Cis 95 Tír Ser Asn Pro Qu 110 Ala De Ser Asn Aig 125 Tír Tír Asp Qu Asp 140 Thr Vai Ee GE Pro 155 Asn Ma His Cis Ala 170 Qn Thr Thr Asi Qu 185 Pro Gin GE Qu Qu 200 Asp Ser Ser Ala
Ser 210
Leu Vai Ee Ser Ala -20
Ser Vai Ser Pro Aig -5
Ou Vai Vai Arg Cis 10
Ala Phe Ala Cis Leu 25 Tír Asp De Cis lis 40
Thr Qn GE Lis Ala 55
Asn GE Vai Thr Ser 70
Thr Phe Gin Arg Ma 85
Tis Leu Asi Vai Cis 100
Thr Qu Vai Vai Qn 115
Asn Arg Leu Vai Aig 130
Ser Thr De Arg Asp 145
Ala Ser Leu Phe His 160
His Pro Aig Ala Asp 175 T is Leu lis Vai Leu 190
Pro Ser His De lis 205
Lisboa, 7 de?/f' jDezembro de 2000 O Agente Oficial da Propriedade Industria!
JOSÉ DE SAMPAIO A.O.P.L
Rua do SaSiírc, 195, r/c-Drt 125« LISBOA
Claims (21)
- r.Reivindicações 1. Polinucleótido que codifica um polipeptido dos Corpúsculos de Stannius seleccionado entre o conjunto constituído por: (a) polinucleótidos que codifiquem pelo menos a forma plenamente desenvolvida do polipeptido dos Corpúsculos de Stannius que possui a sequência deduzida de aminoácidos representada na figura 1; (b) polinucleótidos que possuam a sequência codificadora ilustrada na figura 1 que codifica pelo menos a forma plenamente desenvolvida do polipeptido dos Corpúsculos de Stannius; (c) polinucleótidos que codifiquem pelo menos a forma plenamente desenvolvida do polipeptido dos Corpúsculos de Stannius que possui a sequência de aminoácidos codificada pelo ADNc existente na instituição ATCC com o número de depósito 75652; (d) polinucleótidos que possuam a sequência codificadora do ADNc existente na instituição ATCC com o número de depósito 75652 que codifica pelo menos a forma plenamente desenvolvida do polipeptido dos Corpúsculos de Stannius; (e) polinucleótidos que codifiquem um fragmento de um polipeptido tal como codificado por um polinucleótido de uma qualquer as alíneas (a) e (d) e que possuam a actividade do polipeptido dos Corpúsculos de Stannius; e (f) polinucleótidos que sejam pelo menos 70% idênticos a um polinucleótido de acordo com um qualquer das alíneas (a) a (e) e que codifiquem um polipeptido que possua actividade do polipeptido dos Corpúsculos de Stannius; ou a cadeia complementar de um tal polinucleótido.2%
- 2. Polinucleótido de acordo com a reivindicações 1, em que o referido polinucleótido da alínea (f) da reivindicação 1 é pelo menos 95% idêntico a um polinucleótido de acordo com uma qualquer das alíneas (a) a (e).
- 3. Polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, o qual é ADN ou ARN.
- 4. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 3, em que o ADN é ADN genómico.
- 5. Vector que contenha o polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4.
- 6. Vector de acordo com a reivindicação 5, em que o polinucleótido está funcionalmente ligado a sequências de controlo da expressão que permitem a expressão em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas.
- 7. Célula hospedeira geneticamente recondicionada com o vector de acordo com uma qualquer das reivindicações 5 ou 6.
- 8. Processo para a produção de um polipeptido dos Corpúsculos de Stannius, o qual consiste em criar em cultura a célula hospedeira da reivindicação 7 e em recuperar a partir da cultura o polipeptido codificado pelo referido polinucleótido.
- 9. Processo para produção de células capazes de exprimirem um polipeptido dos Corpúsculos de Stannius, o qual consiste em recondicionar geneticamente células com o vector de acordo com uma qualquer das reivindicações 5 ou 6. 7Η
- 10. Polipeptido codificado pelo polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4 ou susceptível de ser obtido em conformidade com o processo da reivindicação 8.
- 11. Anticorpo especifico contra o polipeptido da reivindicação 10.
- 12. Método para identificar um antagonista contra o polipeptido da reivindicação 10, o qual compreende os passos seguintes: (a) fazer contactar o polipeptido e o substrato ou um receptor do polipeptido com um antagonista/inibidor putativo; e (b) determinar se o antagonista/inibidor putativo evita a actividade do polipeptido.
- 13. Composição farmacêutica que incorpore o polipeptido da reivindicação 10, o polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, moléculas anti-sentido que hibridem especificamente com produtos da transcrição de tais polinucleótidos, polinucleótidos que codifiquem tais moléculas anti-sentido e/ou um anticorpo de acordo com a reivindicação 11, e ainda um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
- 14. Composição de diagnóstico que contenha um polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4.
- 15. Utilização de um polipeptido de acordo com a reivindicação 10 ou de um polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de doenças ósseas ou de doenças que tenham por base os electrólitos. 4
- 16. Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que a doença que tem por base os electrólitos é seleccionada entre hipertensão, disarritmias cardíacas, coma, paragem cardíaca, disfunções renais, dotes musculares, dores ósseas, desmineralização dos ossos, calcificação de órgãos, hiperparatiroidismo, hipervitaminose D, tumores, sarcoidose, hipertiroidismo, insuficiência supra-renal, perda de albumina do soro, absorção excessiva do cálcio GI, concentração elevada de proteínas no plasma ou enxaquecas.
- 17. Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que a doença óssea é a osteoporose ou a doença de Paget.
- 18. Utilização de um anticorpo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de hipocalcémia e de doenças causadas por ela.
- 19. Utilização de polinucleótidos que codifiquem moléculas anti-sentido que hibridem espe-cifícamente com produtos de transcrição de um polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4 ou de tais moléculas anti-sentido, para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de hipocalcémia e de doenças provocadas por ela.
- 20. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 18 ou 19, em que a doença é a osteoporose ou a doença de Paget.
- 21. Método para a produção de uma composição farmacêutica, o qual compreende os passos do método da reivindicações 12 e (c) a combinação de um antagonista/inibidor identificado no passo (b) com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.1 Resumo “Proteína dos Corpúsculos de Stannius, a stanniocalcina” A invenção descreve um polipeptido stanniocalcina dos Corpúsculos de Stannius e um ADN (ARN) que codifica tal polipeptido. A invenção também proporciona um procedimento para a produção de tal polipeptido por meio de técnicas recombinantes e para a produção de anticorpos e antagonistas/inibidores contra tal polipeptido. De acordo com outro dos seus aspectos, a invenção proporciona uma combinação do polipeptido da presente invenção e de um veículo farmaceuticamente aceitável que vai servir para o tratamento terapêutico de doenças ou para a inibição de tal polipeptido para o tratamento terapêutico de doenças. Lisboa, 7 de Dezembro de 2000 íjfy O Agente Oficial da Propriedade industrialRua do Saiitrc, 195. r/c-Drt. 1250 LISBOA
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