JPH09511648A

JPH09511648A - スーパーオキシドジスムターゼ−４

Info

Publication number: JPH09511648A
Application number: JP7526308A
Authority: JP
Inventors: グォーリャンユ; クレイグエイ．ローゼン，; クレアーエム．フレイザー，; ジャニンディー．ゴーケン，
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-04-11
Filing date: 1994-05-31
Publication date: 1997-11-25
Also published as: CA2187635A1; CN1073154C; EP0775199A4; US6635252B2; EP0775199A1; ATE215599T1; WO1995027781A1; CN1332240A; DE69430326D1; CN1152337A; EP0775199B1; AU7312394A; ES2173919T3; US5871729A; AU683286B2; DE69430326T2; JP2002085082A; DK0775199T3; US20020081288A1; ZA944039B

Abstract

(57)【要約】ポリペプチドSOD-4をコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリペプチド、および該ポリペプチドに対する抗体、ならびに脳の虚血、潰瘍、炎症、不整脈、浮腫、およびパラコート中毒、ならびに慢性関節リウマチ、変形性関節症、および放射線損傷を処置するための治療薬としての該ポリペプチドの使用。

Description

【発明の詳細な説明】スーパーオキシドジスムターゼ-４本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産に関する。より詳細には、本発明のポリペプチドは、スーパーオキシドジスムターゼ-４(SOD-4)である。身体内の酸素と生化学的化合物（例えば、タンパク質、炭水化物、脂質および核酸）との間の反応に対する非常に強力な熱力学駆動力がある。このような反応が完了すると、大量のエネルギーの放出を伴って、水、二酸化炭素、および多数の老廃物が最終産物として形成される。生化学的化合物の酸化は、生きている生物のエネルギー源である。このような反応は、自発的に生じるが、しかし反応障害があるため非常に遅い。これらの障害は、中間代謝における酵素により克服され、そして酸素を伴う最終反応は、ミトコンドリアにおいて起こる。ミトコンドリアでは、中間産物の遊離が全くなく、酸素が４つの電子により還元されて水になる。反応は、チトクロームオキシダーゼ複合体により、電子伝達連鎖において達成され、そしてATPの形成によってエネルギーを拘束する。しかし、酸素の水への４工程の直接還元は独特であり、そして酸素が自発的に反応するか、または酸素が酵素により触媒される場合、同時に１工程で反応することを余儀なくされる。一連の反応性中間体および毒性中間体（すなわち、スーパーオキシドラジカル（Ｏ₂ ^-）、過酸化水素（H₂O₂）、およびヒドロキシルラジカル（OH^-））が形成される。これらのうち２つ、Ｏ₂ ^-およびOH^-は、１個の不対電子を有する。従って、フリーラジカルと呼ばれる。身体中の酸素消費の数％は、毒性の還元中間体の形成を導くと見積もられている。酸素の毒性の影響は、主にこれらの中間体の作用に起因する。酸素はそれ自体、ほとんどの生化学的化合物と緩慢に反応する。毒性の反応は、一般に、酸素ラジカルを生じるプロセスで開始され、酸素ラジカルはこれ自体が生化学的化合物に直接的損害を生じるかまたは酸素が関与する連鎖反応を開始する。いくつかの化合物は、自発的に酸素と反応する。すなわち、これらは自動酸化される。実質上、全ての自動酸化は毒性の酸素還元中間体の形成をもたらす。アドレナリン、ピロガロール、およびいくつかの他の化合物の自動酸化は、スーパーオキシドラジカルの形成を導く。電離放射線が酸素を含む水性溶液を通過する場合、スーパーオキシドラジカルが、最も高濃度で見出されるラジカルである。このように形成される毒性の酸素還元産物は、細胞の殺傷能力のために根本的に重要であるが、しかし、周囲の組織にも損傷を導き得る。過酸化水素は、大抵、不均化(dismutation)反応によってスーパーオキシドが形成される場合に形成される。身体内におけるほとんどのオキシダーゼは、酸素を過酸化水素に直接還元する。酸素の存在下で生存する生物は、毒性酸素還元代謝産物に対する多くの防御機構を進化させることを余儀なくされている。防御因子は、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)を含む。スーパーオキシドジスムターゼは、スーパーオキシドラジカルを不均化し(dismutate)、そして哺乳動物細胞および組織に比較的一定量見出される。これらの酵素のうち最も良く知られるものは、CuZnSODであり、これは、２つの銅原子および２つの亜鉛原子を含む33,000の分子量を有する２量体である。CuZnSODは、細胞質およびミトコンドリアの膜間腔において見出される。MnSODは、４つのMn原子を含む85,000の分子量を有する４量体であり、主にミトコンドリアマトリックスに位置する。最近まで、細胞外液は、SOD活性を欠くとされていた。しかし、米国特許第5,248,603号は、最近、細胞外液（例えば、血漿、リンパ液、滑液、および髄液）中のEC-SODと呼ばれるスーパーオキシドジスムターゼの存在を開示した。組換えヒトCuZnSODの結晶学的構造が、2.5Åの解像度で野生型および計画された熱安定性の２重変異酵素(Cys-6−−−−Ala、Sys-111−−−−Ser)について決定され、精査され、そして分析された。Zn部位とのヘリックス双極子相互作用がある。そして14残基が、活性部位の構成、ループの確立、およびCys-111−−− −Ser変異によりもたらされる安定性の増大に重要であると思われる、側鎖から主鎖への２以上の構造的に保存された水素結合を形成する。Parge,H.E.ら，Proc .Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89:6109-13(1992)。 CuZnSOD遺伝子における変異は、致命的な神経変性疾患である家族性筋萎縮性側索硬化症を患う患者において生じる。CuZnSODコード領域のスクリーニングは、エキソン１におけるAla４からValへの変異が最も多い変異であり、変異はエキソン２、４、および５において同定されたが、エキソン３により形成される活性部位領域では同定されなかったことを明らかにした。従って、CuZnSODの不全は、運動性ニューロンの死に関連し、そして家族性筋萎縮性側索硬化症の理解および可能な処置を示唆している。本発明のポリペプチドSOD-4は、構造的にかつ機能的に、CuZnSODに関連する。日本国特許第4327541号は、遺伝子組換えにより得られるヒトCuZnSODの活性基質を含む、移植後の臓器との免疫反応のための治療的薬を開示している。日本国特許第4312533号は、脳虚血を処置するための組成物を開示する。この組成物は組換えCuZnヒトSODを含み、そして虚血に伴う神経壊死の遅延を阻害する。日本国特許第4248984号は、スーパーオキシドジスムターゼ誘導体を開示している。この誘導体は、SODより長い血中半減期を有し、従って種々の疾患の処置に役立つ。欧州特許第499621号は、組換えCuZnSODを精製するための方法およびこのポリペプチドのＢイソ型のアナログの収量を増加するための方法を開示している。日本国特許第2156884号は、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ特性を有する1 53アミノ酸ポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするDNA配列、核酸配列により発現されるDNA配列、および宿主細胞の培養によるポリペプチドの産生を開示している。日本国特許第63313581号は、SODとアミノ基またはカルボキシル基を含む化合物とを反応させることにより得られる薬理学的に活性な改変されたスーパーオキシドジスムターゼを開示している。日本国特許第63077822号は、ヒトSOD様ポリペプチドを活性な基質として使用する器官の機能を改善するための薬剤を開示している。本発明の１局面によれば、SOD-4、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導体である新規の成熟ポリペプチドが提供される。本発明のポリペプチドは、ヒト由来である。本発明の別の局面によれば、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）が提供される。本発明のさらなる局面によれば、このようなポリペプチドを組換え技術により生成するためのプロセスが提供される。本発明のさらなる局面によれば、このようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、治療目的（例えば、炎症病理学、潰瘍、不整脈、虚血、浮腫、パラコート中毒、慢性関節リウマチ、および変形性関節症を処置するため、再灌流損傷を減少させるため、および血圧を減少させるため）で利用するためのプロセスが提供される。本発明のさらなる局面によれば、このようなポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明のこれらの局面および他の局面は、本明細書中の教示から当業者には明らかであるべきである。以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、請求の範囲に含まれる本発明の範囲を限定することを意図しない。図１は、SOD-4遺伝子のcDNA配列および推定アミノ酸配列を示す。少なくとも２つのインフレームのATG開始コドンがあるので、アミノ酸配列はポリペプチドの１つの成熟形態をコードする。成熟ポリペプチドは、ATGコドンのいずれか１つから開始し得る。アミノ酸の標準的な１文字表記を使用する。図２は、SOD-4と種々の種に由来する11個の他の細胞質ゾルCuZnSODとの間のアミノ酸相同性を示す。銅−亜鉛結合部位（太字）は、６つのHis残基および１つのAsp残基により形成される。Arg(Ｒ)残基は、スーパーオキシドを活性部位に誘導するために必要であると考えられている。同一の残基を−で示し、そして欠失を・で示す。図３は、SDSポリアクリルアミドゲル上で分離後のヒトSOD-4の細菌での発現および精製の結果を示す。図４は、SDSポリアクリルアミドゲル上で分離後の、COS細胞における組換えSO D-4の発現の結果を示す。本発明の局面によれば、図１の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または1994年３月22日にATCC寄託番号75716として寄託されたクローンのcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。本発明のポリヌクレオチドが、初期段階のヒト脳cDNAライブラリーから単離された。これは、255アミノ酸のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。このポリペプチドは、Schistosoma mansoniから単離されたCuZ nSODに151個のアミノ酸の重複部分にわたって51％の同一性および72％の類似性で最も高い程度の相同性を有する。本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNA（このDNAは、cDNA、ゲノムDNA、および合成DNAを包含する）の形態であり得る。DNAは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖はコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列と同一であり得、あるいはそのコード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１のDNAまたは寄託したcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。図１の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下を包含し得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列およびリーダー配列もしくは分泌配列またはプロタンパク質配列のようなさらなるコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要に応じて、さらなるコード配列）および非コード配列（例えば、イントロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の5'および/または3'非コード配列）。従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドならびにさらなるコード配列および /または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドの、フラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然の対立遺伝子変異体またはポリヌクレオチドの非天然の変異体であり得る。従って、本発明は、図１に示すものと同じ成熟ポリペプチドあるいは寄託したクローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドの変異体を包含する。この変異体は、図１のポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体、および付加または挿入変異体を包含する。本明細書中、上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列の天然の対立遺伝子変異体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知であるように、対立遺伝子変異体は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的には変化させない。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は、細菌宿主の場合にマーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する pD10ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。または、例えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主（例えは、COS-7細胞）が使用される場合は、ヘマグルチニン（HA）タグであり得る。HAタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する（Wilson，I.ら、Cell、37:767(198 4)）。本発明はさらに、配列間に少なくとも50％および好ましくは70％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも95％および好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場合のみに生じることをいう。好ましい実施態様において本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１のcDNAまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または生物学的活性を保持するポリペプチドをコードする。本明細書中でいう寄託物（１つまたは複数）は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物は、当業者に便宜上のみ提供され、そして米国特許法第112条の下で寄託が必要とされることを容認するものではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用されており、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる不一致の場合も管理されている。寄託物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてこのような実施許諾はこれによって与えられるわけではない。本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有するまたは寄託したcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するSOD-4ポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１のポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドをいう場合は、このようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または生物学的活性を保持するポリペプチドを意味する。したがって、アナログは、プロタンパク質の部分の切断により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成し得るプロタンパク質を包含する。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。図１のポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログは、(i)その中で１以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換されるアミノ酸残基が、この遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基であり得るかまたはあり得ないフラグメント、誘導体、またはアナログ、または(ii)その中で１以上のアミノ酸残基が置換基を含有するフラグメント、誘導体、またはアナログ、または(iii)その中で成熟ポリペプチドがポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物に融合されているフラグメント、誘導体、またはアナログ、または (iv)その中でリーダー配列または分泌配列あるいは成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製に用いられる配列のような成熟ポリペプチドにさらなるアミノ酸が融合されるフラグメント、誘導体、またはアナログであり得る。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ましくは均質に精製される。用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然系において共存する物質の幾らかまたは全部から分離された同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてさらにこのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないため単離されている。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術によって本発明のポリペプチドを生成することに関する。宿主細胞は、本発明のベクター（これは例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作（形質導入または形質転換またはトランスフェクト）される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、またはSOD-4遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地中で培養され得る。培養条件（例えば、温度、pHなど）は、発現のために選択される宿主細胞で以前に使用された条件であり、そして当業者には明らかである。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを生成するために用いられ得る。したがって、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターは、染色体、非染色体、および合成DNA配列を包含し、例えば、SV40の誘導体；細菌性プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のようなウイルスDNAである。しかし、宿主において複製可能で、そして存続可能である限り、任意の他のベクターも使用され得る。適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（１つまたは複数）に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者に公知の範囲内であると考えられる。発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列（１つまたは複数）（プロモーター）に作動可能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター、E.coli lacまたはtrp、λファージP_Lプロモーター、および原核細胞または真核細胞あるいはそのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが公知である他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し得る。さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、またはE．coliにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供する１以上の選択マーカー遺伝子を含有する。本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発現させるために用いられ得る。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E．coli 、Streptomyces、Salmonella typhimurium）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細胞（例えば、DrosophilaおよびSf9）；動物細胞（例えば、CHO、COS、またはBowes黒色腫）；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示により当業者の範囲内であると考えられる。さらに詳細には、本発明はまた、上で広範に記載した１以上の配列を含む組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの中には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面において、構築物はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを包含する）を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして購入可能である。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQE70 、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK 、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46a（Stratagene）；ptrc99a、pKK223-3 、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pX T1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、宿主において複製可能で、そして存続可能である限り、任意の他のプラスミドまたはベクターも使用され得る。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、PKK232-8およびPCM7である。細菌プロモーターとしては、特に名前を挙げるとlacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_L 、およびtrpが含まれる。真核プロモーターは、CMV即時型、HSVチミジンキナーゼ、初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネインＩを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内にある。さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより達成され得る(Davis，L.、Dibner，M.、Battey，I.、Basic Method s in Molecular Biology、(1986)。宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に生成され得る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、このようなタンパク質を生成するために、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して用いられ得る。原核宿主および真核宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第２版（ Cold Spring Harbor、N.Y.、1989）（この開示は、本明細書中に参考として援用されている）に記載されている。本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAのシス作用因子であり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーターに作用してその転写を増大させる。例としては、複製開始点(bp100〜270)の後期側のSV 40エンハンサー、サイトメガロウイルスの早期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含する。一般に、組換え発現ベクターは、複製開始点および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー（例えば、E．coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS．cere visiae のTRP1遺伝子）および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子に由来するプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、特に解糖酵素（例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質）をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質を細胞周辺腔または細胞外培地へ分泌することを指示し得るリーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。細菌での使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読みとり相で、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することにより構築される。ベクターは、１以上の表現型選択マーカー、ならびに、ベクターの維持を保証するため、および所望により宿主内での増幅を提供するために複製開始点を含有する。形質転換のために適切な原核宿主は、E．coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhi murium 、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。代表的な、しかし限定しない例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322（ATCC 37017）の遺伝エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌の複製開始点を含有し得る。このような市販のベクターは、例えば、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals、 Uppsala、Sweden）およびGEM1（Promega Biotec、Madison、WI、USA）を包含する。これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモーターは、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段により破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法により破砕され得る。このような方法は、当業者に公知である。種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物発現系の例は、Gluzman、Cell、23: 175(1981)に記載されているサル腎臓繊維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、Cl27、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）を包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにまた、任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終止配列、および５’ フランキング非転写配列を含有する。SV40のスプライス部位、およびポリアデニル化部位由来のDNA配列は、必要な非転写遺伝エレメントを提供するために使用され得る。ポリペプチドは、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを包含する方法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製される。精製の間に存在する低濃度（約0.15mM〜約５mM）のカルシウムイオンを有することが好ましい（ Priceら、J．Biol．Chem.、244:917(1969)）。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（refolding）工程が、成熟タンパク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用いられ得る。本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物であり得るか、あるいは原核宿主または真核宿主（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から組換え技術により生成され得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、哺乳動物または他の真核性の糖質でグリコシル化され得るか、あるいはグリコシル化され得ない。本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含み得る。 SOD-4はまた、抗炎症剤として使用され得る。他のSDSタンパク質は、一連の動物モデルの炎症ならびに動物における炎症疾患における抗炎症効果を有することが示されている(Huberら編、Michelsonら、Academic Press、517-549，(1977)) 。SOD-4はまた、リウマチ性関節炎および電離放射線の有害作用を処置するために使用され得る。なぜなら、ヒトにおいて、リウマチ性関節炎および関節炎、ならびに電離線放射を用いる処置の有害作用を処置するためにSODタンパク質を使用して、ポジティブな効果が示されたからである。SOD-4が作用するメカニズムは、組織変性を引き起こす酸化生成物を除去することによる。 SOD-4は、クローン病、ベーチェット病、皮膚炎、潰瘍、潰瘍性大腸炎の処置のために、および放射線療法の有害作用に対して使用され得る。他のSODタンパク質は、これらの病態に対して効果的であることが見出されている(Niwa，Yら、 Free Rad．Res．Comms．1:137-157(1985))。組織に対する血液の供給が断たれた場合、組織は徐々に壊死する。先に虚血した組織における酸素の再出現の結果として形成される酸素ラジカルが、この損傷に関与するようである。従って、SOD-4によるこれらのフリーラジカルの除去は、損傷に対する組織の保護を助ける。SOD-4は、同様のメカニズムにより、不整脈により誘導される虚血および再灌流の発生率を減少させるために使用され得る。なぜなら、SODタンパク質はこれらの病態に影響することが報告されているからである(Woodward，B.ら、J．Mol．Cell．Cardiol．17:485-493(1985))。同じように、SOD-4は大脳虚血および腎臓虚血を処置するために使用され得、SODタンパク質は、腎臓における虚血または酸素欠乏性再灌流モデルの組織を保護することが示されている(Baker，G．L.ら、Am．Surg.,202:628-41(1985))。また、SOD-4は腎移植および皮膚、肺、肝臓および膵臓のような他の器官の移植に関連して使用され得る。 SOD-4は、熱傷を処置するために使用され得る。ラットにおける実験的な軽度の熱傷後の局所水腫は、SODタンパク質の注射によりある程度減少し得る(Bjork およびArtursson、Burns，9:249-256(1983))。非経口投与されたCuZnSOD-4は、乳児性呼吸疾患を患う未熟児の新生児における気管支肺の形成異常を妨げることが報告されている。CuZnSODは、これらの疾患の処置について、最近オーファンドラッグの扱いを受けた。従って、SOD-4はまた、これらの疾患をも処置するために使用され得る(Rosenfeld W.ら、J．Pedi atr．105:781-785(1984))。全身性紅斑性狼瘡、およびリウマチ性関節炎のような種々のタイプの自己免疫疾患において、リンパ球における染色体破損の頻度の増加が示されている。このような患者由来の血漿は、染色体異常誘発因子と呼ばれる染色体破損因子を含有する。血漿中のスーパーオキシドラジカルにより、この因子の形成を生じる。SO D-4は、スーパーオキシドラジカルを除去することにより、この染色体異常誘発活性に対して防御し得る。スーパーオキシドラジカルは、正常な細胞周期を破壊し、そしてガンの基となる細胞の非制御分裂を導く酸化ストレスにより、細胞、DNAおよびタンパク質に損傷を与える傾向がある。従って、SOD-4は、患者の全身からスーパーオキシドラジカルを除去することにより、ガンを防ぐかまたは制御するために使用され得る。酸素ラジカルは、パラクアットおよびアロキサンのような多くの毒性基質の損傷作用に関与する。SOD-4は直接注射によりこれらの毒性基質に対して防御し得る。アロキサンは、糖尿病発生活性を有することが報告されている。SOD-4はインビボでアロキサンのこの糖尿病発生活性に対して防御し得る。膵臓のβ細胞はアロキサンに対して極めて感受性であり、そしてこの感受性はインシュリン依存性真性糖尿病を導き得る。それ故、真性糖尿病の最初の発生時にSOD-4の注入によりβ細胞を保護することが意図され得る。このポリペプチドはまた、本発明に従って、インビボでのこのようなポリペプチドの発現により使用され得る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）を用いてエクソビボで操作され得、次いで、操作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNA を含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作され得る。同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示により当業者には明らかである。例えば、細胞を操作するための発現媒介物(vehicle)は、レトロウイルス粒子以外のもの（例えば、アデノウイルス）があり得る。これは、適切な送達媒介物と組み合わせた後インビボで細胞を操作するために使用され得る。本発明のポリペプチドは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を包含する。このようなキャリアとしては、生理食塩液、緩衝化生理食塩液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与の態様に合わせるべきである。本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含有する薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器は、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された形式の通知と関連し得、この通知はヒトへの投与についての製造、使用、または販売における機関による認可を反映する。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療用化合物と併用して用いられ得る。薬学的組成物は、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋内、皮下、鼻腔内または皮内経路によるような、都合良い方法で投与され得る。被験体に投与されるSOD-4 の量および投与レジメは、投与態様、処置されている病態の性質および担当医の判断のような多くの要因に依存する。一般に、投与経路、症状などを考慮して、例えば少なくとも約10μg/kg体重の治療有効量で与えられ、そしてほとんどの場合、１日当たり約８mg/kg体重を超過しない量で投与され、そして好ましくは、用量は毎日約10μg/kg体重〜約1mg/kg体重である。本発明の配列はまた、染色体の同定に有益であり得る。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダイズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試薬はほとんどない。本発明によるDNAの染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関する遺伝子との相関において重要な、第１歩である。簡略に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を調製することにより染色体にマップされ得る。cDNAのコンピューター解析が、ゲノムDNA内で１つより多いエキソンにまたがらず、したがって増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当てるための迅速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローンのプールを用いて部分的位置決め(sublocalization)が達成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピング戦略は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識したフローサイトメトリーで選別した（flow-sorted）染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的cDNA ライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ選択を包含する。 cDNAクローンの中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、500または600塩基ほどの短いcDNAで使用され得る；しかし、2,000bpよりも大きいクローンの方が、簡便な検出では十分なシグナル強度で独特の染色体位置に結合しやすい。FISHは、ESTが由来するクローンの使用を必要とし、そしてこのクローンは長いほど好ましい。例えば、2,000bpが良好であり、4,000bpはより良好であり、そして4,000bpを超える長さは、当節の適度な割合で（a resonab le percentage of the time）良好な結果を得るためにおそらく必ずしも必要でない。この技術の総説としては、Vermaら、Human Chromosomes: a Manual of Ba sic Techniques，Pergamon Press、New York(1988)を参照のこと。一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、染色体上での配列の物理的な位置を遺伝的地図のデータと相関させ得る。(このようなデータは、例えば、V． McKusick、Mendelian Inheritance in Man に見出される(Johns Hopkins Univer sity Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である))。次いで、同一の染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であると思われる。物理的マッピングおよび遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩基のマッピング解像度で、そして20 kbあたり１遺伝子と仮定する。）罹患個体と非罹患個体との比較は、一般に、まず染色体の構造変化（例えば、染色体展開物から目視可能であるか、あるいはそのcDNA配列に基づくPCRを使用して検出可能である欠失または転座）を探す工程を包含する。最終的には、変異の存在を確認し、そして変異を多型から区別するために、数個体由来の遺伝子を完全に配列決定する工程が必要とされる。このポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を生成させるための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメントの生成のために使用され得る。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ得る。この動物は、好ましくはヒトではない。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織からそのポリペプチドを単離するために使用され得る。モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術（Ko hlerおよびMilstein、1975、Nature、256: 495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、1983、Immunology Today 4:72）、およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのEBVハイブリドーマ技術（Coleら、198 5、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R．Liss，Inc.、77-96頁）が挙げられる。単鎖抗体を生成するために記載された技術（米国特許第4,946,778号）を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る。本発明のさらなる局面について、SOD-4遺伝子産物における変異と直接関連する疾患に対する感受性を決定するためのプロセスを提供する。このような疾患は、筋萎縮性側索硬化症「ALS」およびパーキンソン病を包含するが、限定されない。従って、SOD-4タンパク質における変異はこれらの疾患に対する感受性を示し、そしてSOD-4ポリペプチドをコードする核酸配列は、このような感受性を確認するためのアッセイにおいて使用され得る。従って、例えば、アッセイを用いて、本明細書に記載されるヒトSOD-4タンパク質における変異（例えば、欠失、短縮、挿入、フレームシフトなど）を決定し得る。それは、このような変異が上記の疾患に対する感受性を示すからである。変異は、例えば、DNA配列決定アッセイにより確認され得る。組織サンプル(血液サンプルを含むが、これに限定されない)を患者より得る。サンプルを、当該分野で公知の方法によりプロセスして、RNAを捕獲する。mRNA上に存在するポリアデノシンの広がりに対してハイブリダイズするポリチミジン残基からなるオリゴヌクレオチドプライマーを添加することにより、ファーストストランドcDNAを RNAサンプルより合成する。逆転写酵素およびデオキシヌクレオチドを添加し、ファーストストランドcDNAの合成を行う。プライマー配列は、本発明のSOD-4ポリペプチドのDNA配列に基づいて合成する。プライマー配列は、一般的に、SOD-4 遺伝子の15〜30の連続する塩基、そして好ましくは18〜25の連続する塩基からなる。プライマーをペア（１つの「センス」および１つの「アンチセンス」）で用いて、PCR方法により患者由来のcDNAを増幅する。その結果、患者のcDNAの３つの重複するフラグメントが生成する。次いで重複するフラグメントを、ジデオキシヌクレオチド配列決定に供する。その際、遺伝子を全体で約200塩基対毎の点においてcDNAの塩基対に対応して合成される１組のプライマー配列を用いる。プライマー配列を配列決定に用いて、患者のSOD-4タンパク質における変異がどこであるかを決定する。次いで患者より決定された配列情報を非変異配列と比較して、変異が存在するかどうかを決定する。別の実施態様において、プライマー配列をPCR方法において使用し、変異領域を増幅する。当該領域を配列決定し得、そして診断用具(tool)として使用してそのような変異遺伝子に対する素因を予側し得る。あるいは、SOD-4遺伝子における変異を検出するアッセイを、RNAからcDNAを生成し、そしてcDNAによりコードされるタンパク質をインビトロ転写および翻訳により発現させることにより実施し得る。次いで発現したタンパク質を、SDS、ポリアクリルアミドまたは他のゲル上での電気泳動により分析し得る。「正常」SO D-4遺伝子産物はまた、ゲル上で電気泳動し、そして次いでゲルを乾燥してオートラジオグラフィーに供し、そして予想される変異遺伝子産物および「正常」遺伝子産物を分析し、そしてこのような遺伝子産物のバンドパターンにおける何らかの差異はcDNAにおける変異を示す。遺伝子産物における変異はまた、ウェスタンブロット分析においてSOD-4抗体を用いて検出し得る。従って、本発明の遺伝子における変異を、配列決定により直接的に、または発現タンパク質を試験することにより間接的に決定し得る。本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定されないことを理解されたい。すべての部または量は、他に明記しない限り重量基準である。以下の実施例の理解を容易にするために、現れる頻度の高い特定の方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、小文字のｐの前および／または後の大文字および／または数字により示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であるか、制限基準なく公的に入手可能であるか、または公表された手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプラスミドと等価なプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。 DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μgのプラスミドまたはDNAフラグメントを、約２単位の酵素とともに約20μlの緩衝溶液中で使用する。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的のために、代表的には５〜50μgのDNAを20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化する。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37 ℃での約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、これは供給者の説明書に従って変化し得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。切断されたフラグメントのサイズ分離は、Goeddel，D.ら、Nucleic Acids Res .、8:4057(1980)により記載された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう(Maniatis，T.ら、前出、146頁)。他に提供しない限り、連結は、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラグメント0.5μgあたり10単位のT 4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）とともに、公知の緩衝液および条件を用いて達成され得る。他に記載しない限り、形質転換はGraham，F.およびVan der Eb，A.、Virology 、52:456-457(1973)の方法に記載されるように行った。実施例１ SOD-4の細菌発現および精製 SOD-4（ATCC # 75716）をコードするDNA配列を、プロセスされたSOD-4タンパク質（シグナルペプチド配列を除く）の５'および３'配列に対するオリゴヌクレオチドプライマーならびにSOD-4遺伝子に対して３'ベクター配列に対応するPCR オリゴヌクレオチドプライマーを用いて最初に増幅する。SOD-4に対応する追加のヌクレオチドを、５'および３'配列に対してそれぞれ添加した。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列5'-CGGGATCCATGGGCAGCGGCCAGTTG-3'を有し、そしてBamHI制限酵素部位を含み、その後ろにプロセスされたタンパク質の予想される末端アミノ酸の１つから始まる配列をコードするSOD-4の18ヌクレオチドが続く。３'配列（5'-CGTCTAGAGGTCCTGCTCAAAGGTGGG-3'）は、XbaI制限部位およびSO D-4の最後の21ヌクレオチドに対する相補的配列、ならびにSOD-4の挿入物に対して３'に位置するpD10ベクター配列に対する相補的配列を含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクターpD10（Qiagen，Inc．9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，9 1311）上の制限酵素部位に対応する。pD10は、抗生物質抵抗性（Amp^r）、細菌の複製開始点（ori）、IPTG制御可能なプロモーターオペレーター（P/O）、リボゾーム結合部位（RBS）、6-Hisタグおよび制限酵素部位をコードする。次いで、pD 10を、BamHIおよびXbaIで消化した。増幅した配列をpD10中に連結して、そしてヒスチジンタグをコードする配列およびRBSを用いてインフレームで挿入した。次いで連結混合物を用いて、Sambrook,J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，1989に記載される手順によりE.coli 株M15/rep4（M15/rep4の商標でQiagenより入手可能）を形質転換した。M15/rep4 は多コピーのプラスミドpREP4を含む。pREP4は、lacIリプレッサーを発現し、そしてまたカナマイシン抵抗性（Kan^r）を付与する。形質転換体をLBプレート上で増殖するそれらの能力により同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン抵抗性コロニーを選択した。プラスミドDNAを単離して、制限分析により確認した。所望の構築物を含有するクローンを、Amp（100μg/ml）およびKan（25μg/ml）の両方を補充したLB培地での液体培養で一晩（O/N）増殖させた。O/N培養を用いて、 1:100〜1:250の比で大規模培養に播種する。細胞を、0.4と0.6との間の光学密度 600（O.D.⁶⁰⁰）まで増殖させた。次いでIPTG（「イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド」）を、１mMの最終濃度で添加した。IPTGは、lacIリプレッサーを不活性化し、P/Oの解放（clearing）して遺伝子発現の増大を導く。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。次いで細胞を遠心分離により採集した。細胞ペレットをカオトロピック剤、６M塩酸グアニジン中で可溶化した。澄明化後、可溶化したSOD-4を、6-Hisタグを含有するタンパク質により強固な結合を可能にする条件下でニッケルキレートカラム上でのクロマトグラフィーによりこの溶液から精製した。Hochuli,E.ら、J．Chromatography 411：177-184(1984)。精製の異なる段階からのタンパク質を、12.5％SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、そしてクマシーブルー染料を用いて染色した。Ｍは、分子サイズマーカーを表わす。レーン１および２は、IPTGの非存在下（レーン１）およびIPTGの存在下（レーン２）におけるベクターpD10を含有する細菌からの全抽出物である。レーン３および４は、IPTGの非存在下（レーン３）およびIPTGの存在下（レーン４）におけるベクターpD10-SOD-4を含有する細菌からの全抽出物である。レーン５〜９は、ニッケルキレートカラムからの溶出画分を表わす。レーン５は素通りであり；レーン６および７は、６Ｍ塩酸グアニジン、50mM NaPO₄、pH 8およびPH 6を用いて洗浄した溶出画分を表わし；レーン８および９は、６Ｍ塩酸グアニジン、50mM NaPO₄ 、pH 5およびpH 2を用いて洗浄した溶出画分である。図３を参照のこと。実施例２ COS細胞における組み換えSOD-4の発現発現プラスミド（pSOD-4-HA）は、以下を含むベクターpcDNAI/Amp（Invitroge n）に由来する：１)SV40複製開始点、２)アンピシリン抵抗性遺伝子、３)E.coli 複製開始点、４)CMVプロモーター、それに続くポリリンカー領域、SV40イントロンおよびポリアデニル化部位である。全SOD-4前駆体およびその３'末端にインフレームに融合したHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。従って、組み換えタンパク質発現は、CMVプロモーター下の支配を受ける。HAタグは、前記のインフルエンザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する(I．Wilson、H．Niman、R．Heighten、A．Cherenso n、M．Connolly、およびR．Lerner、1984、Cell 37、767）。本発明者の標的タンパク質に対するHAの融合は、HAエピトープを認識する抗体を用いる組み換えタンパク質の検出を容易にする。プラスミド構築戦略を以下に記す： SOD-4（ATCC # 75716）をコードするDNA配列を２つのプライマーを用いるPCR により構築した：５'プライマー配列は、pBluescriptベクターにおいて5'-AATTA ACCCTCACTAAAGGG-3'であり；3'配列5'-CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGG TAAAGGTGGGCAGGGGGCTG-3は、XbaI制限酵素部位、翻訳ストップコドン、HAタグおよびSOD-4コード領域の最後の18ヌクレオチド（ストップコドンを含まない）に対して相補的な配列を含有する。従って、PCR産物は、pBluescriptベクター由来のBamHI部位、インフレームに融合したHAタグを伴うSOD-4コード配列、HAタグに隣接する翻訳停止ストップコドン、およびXbaI部位を含有する。PCR増幅DNAフラグメントおよびベクター(pBluescript)を、BamHIおよびXbaI制限酵素で消化し、そして連結した。連結混合物を、E.coli株SURE（Stratagene Cloning Systems、 11099 North Torrey Pines Road、La Jolla、CA 92037から入手可能）に形質転換した。形質転換培養物をアンピシリン培地プレート上に塗布して、そして抵抗性コロニーを選択した。プラスミドDNAを、形質転換体から単離して、正しいフラグメントの存在に対する制限分析により試験した。組み換えSOD-4の発現のために、COS細胞を、DEAEデキストラン法により発現ベクターを用いてトランスフェクトした（J．Sambrook、E．Fritsch、T．Maniatis、Molecular Cloning：A L aboratory Manual、Cold Spring Laboratory Press、(1989)）。SOD-4-HAタンパク質の発現を、放射性標識法および免疫沈降法により検出した（E．Harlow、D． Lane、Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Pre ss、(1989)）。タンパク質を、トランスフェクションの２日後に³⁵S-システインで８時間標識した。次いで培養培地を採集し、そして細胞を界面活性剤で溶解した（RIPA緩衝液（150mM NaCl、１％ NP-40、0.1％ SDS、１％ NP-40、0 .5％ DOC、50mM Tris、pH 7.5））。（Wilson,I.ら、前出 37：767(1984)）。CO S細胞溶解物および上清からの³⁵S-システイン標識タンパク質を、HAポリクローナル抗体を用いて免疫沈降し、そして15％SDS-PAGEを用いて分離した。Ｍは分子量マーカーに等しい。レーン１〜４は細胞溶解物である。レーン５〜８は上清である。レーン１および５は、DNAを含まないモック(mock)コントロールである。レーン２および６は、分泌タンパク質についてのMIP-1γである。レーン３および７は細胞溶解物についてのコントロールであり、そしてレーン４および８はSO D-4である。図４を参照のこと。本発明の多くの改変および変形が、上記の教示を考慮すれば可能であり、それゆえ、特に記載がない限り、添付の請求の範囲の範囲内で本発明は実施され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/50 ＡＢＥＣ０７Ｋ 16/40 ＡＢＧＣ１２Ｎ 9/04 ＡＤＳ // Ｃ１２Ｐ 21/08 ＡＣＬ (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ローゼン，クレイグエイ. アメリカ合衆国メリーランド 20882, レイトンズビル，ローリングヒルロード 22400 (72)発明者フレイザー，クレアーエム. アメリカ合衆国メリーランド 20854, クイーンズタウン，ヘムズリードライブ 381 (72)発明者ゴーケン，ジャニンディー. アメリカ合衆国メリーランド 20902, シルバースプリング，ハーモンロード 2715

Claims

【特許請求の範囲】１．SOD-4をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、 (a)図１の推定アミノ酸配列を有するSOD-4ポリペプチド、あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または誘導体をコードするポリヌクレオチド； (b)ATCC寄託番号75716に含まれるcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するSOD-4ポリペプチド、あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または誘導体をコードするポリヌクレオチド；からなる群より選択される、ポリヌクレオチド。２．前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．前記ポリヌクレオチドがRNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．前記ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．前記ポリヌクレオチドが、図１の推定アミノ酸配列を有するSOD-4をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。６．前記ポリヌクレオチドが、ATCC寄託番号75716のcDNAによりコードされるSOD -4ポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。７．図１に示すようなSOD-4のコード配列を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。８．ATCC寄託番号75716として寄託されたSOD-4のコード配列を有する、請求項２に記載のポリヌクレオチド。９．請求項２に記載のDNAを含むベクター。１０．請求項９のベクターで遺伝子操作された宿主細胞。１１．前記DNAによりコードされるポリペプチドを請求項１０に記載の宿主細胞から発現させる工程を包含する、ポリペプチドを生成するためのプロセス。１２．ポリペプチドを発現し得る細胞を生成するためのプロセスであって、請求項９に記載のベクターで細胞を遺伝子操作する工程を含む、プロセス。１３．請求項２に記載のDNAにハイブリダイズし得、そしてSOD-4活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたDNA。１４．以下からなる群より選択されるポリペプチド： (i)図１に記載の推定アミノ酸配列を有するSOD-4ポリペプチド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導体、および (ii)ATCC寄託番号75716のcDNAによりコードされるSOD-4ポリペプチド、ならびに該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体。１５．前記ポリペプチドが、図１の推定アミノ酸配列を有するSOD-4である、請求項１４に記載のポリペプチド。１６．請求項１４に記載のポリペプチドに対する抗体。１７．SOD-4を必要とする患者の処置方法であって、該方法が請求項１４に記載のポリペプチドの治療有効量を患者に投与する工程を含む、方法。１８．請求項１４に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。１９．前記ポリペプチドが、該ポリペプチドをコードするDNAを患者に提供する工程、および該ポリペプチドをインビボで発現させる工程により投与される、請求項１８に記載の方法。２０．請求項１に記載のDNAの変異に関連する疾患を検出するためのプロセスであって、該プロセスが、宿主由来のサンプルにおいて請求項１に記載のDNAの変異の存在を検出する工程を含む、プロセス。