JPH02156884A

JPH02156884A - ポリペプチド及びその製造方法

Info

Publication number: JPH02156884A
Application number: JP63311013A
Authority: JP
Inventors: Hideaki Hagiwara; 秀昭萩原; Yasumasa Takeshima; 康誠竹嶋; Sumio Kanematsu; 金松　澄雄
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-12-10
Filing date: 1988-12-10
Publication date: 1990-06-15

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は新規なヒト・スーパーオキシドディスムターゼ
（以下、ｈ−３ＯＤと略称する）類縁体に関し、されに詳しくは下記式（Ｉ）Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　
Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙｌ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１０ＲＡｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｖａ
ｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　ＧｌｙＡｓｎ　
Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　
Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　ＡｌａＡｓｐ　Ｇｌｙ　
Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　　工１
ｅ　Ａｓｎ　ＰｈｅＧｌｙ　　Ｓｅｒ　Ａｒｑ　　Ｌｅ
ｕ　　Ａｌａ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　　工１ｅ
　　Ｇｌｙ工ｌ＠　　Ａｌａ　　ＧｉｎＧｌｕ　Ｇｉｎ　ＬｙｓＧｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌ
ｙ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　ＬｙｓＶａｌ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　
Ｓｅｒ　　工ｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　
ＧｌｕＧｌｙ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｈ
ｉｓ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　　Ｇｌｕ　ＰｈｅＧｌｙ　Ａｓ
ｐ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ
　Ｓｅｒ　ＡｌａＧｌｙ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ａ
ｇｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　［、ｙｓＨｌ
ｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　Ｇｌ
ｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｈ１ｓＶａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　
Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａ
ｓｐＬｙｓ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　　Ａｌａ　
　Ａｓｐ　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　工１ｅ　　ＧｌｕＡｓ
ｐ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ工１ｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　
Ｈ１ｓＣｙｓ　　Ｉｌｅ　　工１ｅ　Ｇｌｙ　　Ａｒｇ
　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　）Ｉｉｓ式
中、Ｒは水素原子、アセチル基又はＭｅｔを表わす、で示されるポリペプチド（以下、ｈ−５ＯＤＡｌａ’と
いう）に関する。

［従来の技術］ヒト・スーパーオキシドディスムターゼ（ｈ−ＳＯＤ）
は生体内に生じる活性酸素（０２−’Ｏ，、ＯＨ−など
）の濃度を低下させ、生体成分が非特異的に酸化される
のを防ぐ機能をもつと考えられている。そのことから、
ｈ−３ＯＤは炎症など活性酸素が関与する病気（例えば
慢性関節リウマチ、変形性関節関節炎、放射線・紫外線
照射による障害、虚血部分への血液再流に伴う障害など
）に有効な治療薬として注目されている。

ヒト−赤血球Ｃｕ　／　Ｚ　ｎ　−Ｓ　ＯＤについては
そのアミノ酸配列が報告され［Ｊａｂｕｓｃｈ　ｅｔ　
ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　１９　（１９８０）　
２３１０−２３１６、Ｂａｒｒａａｔ　ａｌ、、　ＦＥ
ＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　１２０　（１９８０）　５３
−５５］、また、ダウン症候群患者に由来する樹立細胞
株より分離されたｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡの塩基
配列についても調べられている［Ｓｈｅｒｍａｎ、　Ｌ
。

ａｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８０　（１９８３）５４６５〜５
４６９］。また、ｈ−３ＯＤは遺伝子操作により大腸菌
、酵母での発現も報告されており、［Ｒ，Ａ、　Ｈａｌ
ｌｅｗｅｌｌ　ａｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１３、（６）　（１９８５）　
２０１７〜２０３４、Ｒ，Ａ。

Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ、　５　（１９８７）３６３〜３６６］　
、組換えｈ−３ＯＤの大腸菌、酵母による大量生産も可
能になっている。

ヒト赤血球や胎盤から得た天然ｈ−５ＯＤもしくは遺伝
子組換えにより大腸菌、酵母につくらせたｈ−ＳＯＤを
医薬品としてヒトに投与した場合、血中での活性の半減
時間は１０〜１５分と短かく、期待されるほどの治療効
果を示さない。また、天然型ｈ−５ＯＤのチャージの異
なるアイソマーは２つ存在するのに対し、大腸菌につく
らせたｈ−５ＯＤには４つのチャージアイソマーが生じ
ることが報告されており　［Ｂｉｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ
　３　（１９８６）　１５〜２４、助永義和ら］均一な
医薬品としては問題がある。

これらｈ−５ＯＤの生理的、構造的な不安定性の原因は
不明であるが、一つにはｈ−３ＯＤ中に存在するジスル
ファイド結合に関与しない６番目と１１１番目の２つの
システィン残基に因ることが考えられる。ｈ−５ＯＤを
精製する際にクロロホルム／メタノール処理を用いると
反応性のあるＳＨが出現し、これら反応性のあるＳＨは
１ｎｖｉｖｏでシスティンやグルタチオンのようなＳＨ
化合物と容易に反応し付加化合物をつくることが報告さ
れている［Ｒ，Ｂｒ１ｇｇ５　ａｎｄ　Ｆｅｅ、　Ｊ、
　Ａ。

（１９７８）　Ｂｉｏｃｈｉｍｉ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
　Ａｃｔａ、　５３７、ｌＯＯ〜１０９］。

このようなｈ−３ＯＤの不安定性を改善する方法として
、例えば特開昭６２−１３０６８４号公報には、ｈ−３
ＯＤの６番目と１１１番目の少なくとも一方のシスティ
ン残基を他の中性アミノ酸残基に置き換えることが提案
されている。

［発明が解決すべき課題ｊしかし、上記特許公開公報にはｈ−３ＯＤの６番目のシ
スティン残基がアラニン残基（Ａｌａ）に置き換ったｈ
−３ＯＤ類縁体については何ら具体的に記載されていな
い。

［課題を解決するだめの手段１本発明者らは、ｈ−３ＯＤの類縁体の製造を種々試みた
結果、遺伝子組換え技術によりｈ−ｓ。

Ｄの６番目のシスティン残基がアラニン残基に置き換っ
た前記式（Ｉ）で示されるｈ−３ＯＤ類縁体（ｈ−３Ｏ
Ｄ−Ａ　ｌ　ａ’　）を創生ずるのに成功し、本発明を
完成するに至った。

本発明のｈ−５ＯＤ−Ａ　Ｉ　ａ’は、前記式（１）で
示されるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と複製可
能なベクターから組換えプラスミドを調製し、この組換
えプラスミドで宿主細胞を形質転換し、この形質転換細
胞を培地で培養し、該ポリペプチドを発現せしめ、次い
で産生されたポリペプチドを採取することにより行なう
ことができる。

まず、前記式（１）で示されるポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列はそれ自体既知の遺伝子操作技術によって
容易に合成することができる。下記の文献：（１）　Ｆ３本生化学会編　［統生化学講座ｌ遺伝子研
究法「］　東京化学同人刊（１９８７年）（２）村松正
実編　「医学における遺伝子工学」東京化学同人刊（１
９８７年）等の実験書に記載されている方法によって合成すること
ができる。

このようにして合成されるｈ−３ＯＤ−Ａ　ｌ　ａ’を
コードするＤＮＡ配列の一例を示せば次のとおりである
。

ＣＧＡ　　ＴＧＧＴＴＴＣＧＡＣＡＡＣＧＡＣＡＡＧＡ
　　ＣＴＴＴＣＣＡＧＡＣＧＧＣＣＣＧＧＴＴＣＡＧＧ
ＧＴＡＴＣＡＴ　　ＣＡＡＣＴＴＣＣＴＧＣＣＧＧＧＣ
ＣＡＡＧ　　ＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡ　　ＧＴＴＧＡＡＧ
ＧＡＡ　　ＣＡＧＡＡＡＧＡＡＴ　　ＣＴＡＡＣＧＧＴ
ＣＣＧＧＴＴＡＡＡＣＴＴ　　ＧＴＣＴＴＴＣＴＴＡ　
　ＧＡＴＴＧＣＣＡＧＧ　　ＣＣＡＡＴＴＴＧＴＴ　　
’Ｉ’ＧＧＧＧＴ〒ＣＴＡ　　ＴＣＡＡＡＧＧＣＣＴ　
　ＧＡＣＣＧＡＡＣＡＡ　　ＡＣＣＣＣＡＡＧＡＴ　　
ＡＧＴＴＴＣＣＧＧＡ　　ＣＴＧＧＡＴＴＧＧＴ　　Ｃ
ＴＧＣＡＴＧＧＡＴ　　ＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡ　　ＴＧ
ＡＡＴＴＴＣＣＡ　　ＧＡＣＧＴＡＣＣＴＡ　　ＡＧＧ
ＴＡＣＡＡＧＴ　　ＡＣＴＴＡＡＡＧＧＴ　　ＧＡＣＡ
ＡＣＡＣＴＧ　　ＣＡＧＧＴＴＧＣＡＣＣＴＣＴＧＣＡ
ＣＣＡ　　ＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＧＴＣＣＡＡＣＧＴＧ
　　ＧＡＧＡＣＧＴＧＧＧ　　ＣＣＴＣＡＴＴＴＣＡ　
　ＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＧＣＧＴＡＡＡＣＣＣＧＧＡＧ
ＴＡＡＡＧＴ　　ＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧ　　ＣＧＣＡＴ
ＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＧＣＣＧＡ　　ＡＡＧＡＣＧＡＡ
ＧＡ　　ＡＣＧＴＣＡＴＧＴＡＣＣＡＣＣＣＧＧＣＴ　
　ＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴ　　ＴＧＣＡＧＴＡＧＴＴ　　
ＧＧＴＧＡＣＴＡＧＧ　　ＴＡＡＣＧＴＴＡＣＣＧＣＴ
ＧＡＣＣＡＡ　　ＣＣＡＣＴＧＡＴＣＣＡＴＴＧＣＡＡ
ＴＧＧ　　ＣＧＡＣＴＧＡＡＡＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＣ
ＴＧＡＣＧＴＴＴＣＴ　　ＡＴＣＧＡＡＴＴＴＣＴＧＣ
ＣＡＣＡＧＣＧ　　ＡＣＴＧＣＡＡＡＧＡ　　ＴＡＧＣ
ＴＴＧＡＣＴ　　ＣＴＧＴＴＡＴＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴ
ＧＧＴ　　ＧＡＣＣＡＴＣＴＧＡ　　ＧＡＣＡＡＴＡＧ
ＡＧ　　ＡＧＡＣＡＧＡＣＣＡ　　ＣＴＧＧＴＡＴＧＣ
ＡＴＣＡＴＣＧＧＴＣＧ　　ＴＡＣＴＣＴＧＧＴＴ　　
ＧＴ’ｒＣＡＴＡＣＧＴＡＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡＴＧＡ
ＧＡＣＣＡＡ　　ＣＡＡＧＴＡＧＡＡＡ　ＡＡＧＣＧＧ
ＡＴＧＡ　　ＣＣＴＧＧＧＴＡＡＡ　　ＧＧＴＧＧＴＣ
ＴＴＴ　ＴＴＣＧＣＣ↑ＡＣＴ　ＧＧＡＣＣＣＡＴＴＴ
　ＣＣＡＣＣＡＡＡＣＧＡＧＧＡＡＴＣτＡＣＣＡＡＡ
ＡＣＣＧＧＴ　ＡＡＣＧＣＴＴＴＧＣＴＣＣＴＴＡＧＡ
ＴＧ　ＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡ　ＴＴＧＣＧＡＧＧＴＴ　
ＣＴＣＧＴＣＴＧＧＣＡＴＧＣＧＧＴＧＴＴ　ＡＴＣＧ
ＧＴＣＣＡＡ　ＧＡＧＣＡＧＡＣＣＧ　ＴＡＣＧＣＣＡ
ＣＡＡ　ＴＡＧＣＣＡＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＡＧＴＣなお、上記ＤＮＡ配列の上流側末端には適宜、よい。

上記ＤＮＡ配列はあくまでも一実施態様であり、前記式
（１）のアミノ酸配列をコードするものである限り、Ｄ
ＮＡ配列は変更可能であることはいうまでもない。

このようにして合成されるｈ−５ＯＤ−Ａ　ｌ　ａ’を
コードするＤＮＡ配列は次いで複製可能なベクターに組
み込む。そのために使用しうるベクターとしては、後述
する如き宿主細胞中で複製可能なものであれば特に制限
されるものではなく広範囲の種類のベクターから選ぶこ
とができ、プラスミド及びウィルスから必要に応じて誘
導することができる。ベクターは単コピーベクター又は
低コピーもしくは高コピーベクターのいずれであっても
よく、クローニング及び／又は発現のために機能するも
のであ・る。ベクターに関しては多くの文献が存在し、
また、多くのベクターは商業的に入手可能である。これ
らのベクターは通常、選択を可能にするマーカーを含有
し、このマーカーとしては細胞毒耐性、栄養要求性など
があり、しばしば異なる特性をもたらす多数のマーカー
を１ベクターに使用される。また、発現ベクターの場合
には転写開始および停止の両制御シグナルが存在する。

このような有利に利用できる発現用ベクターとしては、
例えばｐｔａｃ　ＩＩ　（ＡＴＣＣ３７１４５）　、ｐ
ｔａｃ１２　（ＡＴＣＣ３７１３８）　、ｐＫＫ　２２
３−３などのｔａｃプロモーター［１１，Ａ、　ｄｅＢ
ｏｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７８．２１　（１９
８３）］　を含有するベクター；　ｐＡＨ５、ｐＡＨ９
などのＡＤＣ１プロモーターを含有するベクター；プラ
スミドｐｓｖ　２などのＳＶ　４０系ベクター等が挙げ
られる。

大腸菌を宿主として用いる場合、発現に用いることので
きるＤＮＡは後記実施例のｐＫＫ−３ＯＤ−１０プラス
ミドに限定されるものではなく、大腸菌において機能す
るプロモーターがあり、これにより本発明のｈ−３ＯＤ
−Ａ　ｌ　ａ’が翻訳されうるｍＲＮＡが転写されるこ
とが保持されるＤＮＡ配列を含む大腸菌ベクターはいず
れも使用可能である。

大腸菌発現用ベクターはプロモーター、オペレーター、
Ｓ　Ｄ　（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列、翻訳
開始コドン；終止コドン、ターミネータ−がこの順に配
置されていることが必要である。プロモーターは１つで
ある必要はなく、２つのプロモーターを縦列させ用いる
ことも可能である。プロモーターはｔａｃプロモーター
の他、ｌａｃプロモーターｔｒｐプロモーター　λＰＬ
プロモーターなどの既知のプロモーターが挙げられ［Ｍ
、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇａｎｄ　Ｄ、　Ｃｏｕｒｉ　Ａ
ｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　ＧｅｎｅＬ、　１３．３１９（１
９７９）；　Ｕ、　５ｉｅｂｅｎｌｉｓｔ　ｅｔ　ａｌ
、、　Ｃｅ１ｌ　２０．２６９（１９８０）；　　Ｄ、
　　Ｐｒｉｂｎｏｗ、　　Ｊ、　　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏ
ｌ、　　９９．　４１９（１９７５）　］、また、これ
らのプロモーターはＤＮＡカートリッジとしても商業的
に入手可能である。

更に、用いる大腸菌もＪＭ　　１０５株に限定されるも
のではない。全ての大腸菌に属する菌は基本的に用いる
ことができ、それに適するベクターを用いることによっ
て本発明のｈ−３ＯＤ−Ａｌａ’の発現は達成され得る
。

前述のｈ−３ＯＤ−Ａｌａ’をコードするＤＮＡ配列と
複製可能なベクターとからの組換えプラスミドの造成も
また、遺伝子操作における周知の技術を用いて行なうこ
とができ、例えば下記の文献＝（１）　　Ｔ、　Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ　ａｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ　−ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ
ａｌ　−ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ刊、（２）　　Ｌ、　Ｇ、　Ｄａｖｉｓ
　ｅｔ　ａｔ、、　Ｂａ５ｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ刊（３）　　Ｒａｙ　Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

ｌｏｔ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ刊等の実験書
に記載の方法によって造成することができる。

たとえば、自律複製できるベクターに化学合成ｈ−３Ｏ
Ｄ−Ａ　Ｉ　ａ”遺伝子、形質発現調節遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片、合成りＮＡ断片を正しく組込むことにより目
的の組換えＤＮＡが得られる。

その概略を添付第１図に示す。ＤＮＡ断片の連結順序は
最終的に得られる組換えＤＮＡの構造が目的とするもの
である限り特に制限されるものではない。

このようにして造成される組換えプラスミドによって形
質転換しうる宿主細胞としては、例えば細菌、藻類、菌
類のごとき単細胞微生物；ヒト、サル、マウスなどの培
養可能な真核細胞が挙げられ、特に大腸菌、ラン藻、バ
チルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ）　、サツカロマイセス・セレビシェ−（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　、サル
賢細胞由来のＣＯＳ細胞ＣＨＯ（チマイニーズハムスタ
ー卵巣細胞）やヒトリンパ系細胞などが好適である。

得られる組換えＤＮＡによる宿主の形質転換はそれ自体
既知の方法によって行うことができる。

例えば遺伝子操作に関する多数の文献たとえば、（１）
　　高木康敬ら、「遺伝子操作マニュアル」講談社刊、（２）高木康敬ら、「遺伝子操作実験法」講談社刊、（３）　　Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　−ａ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　−ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊、（４）　　
Ｌ、　Ｇ、　Ｄａｖｉｓ　ａｔ　ａｌ、、　Ｂａ５ｉｃ
　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ刊などの実験書に記載の方
法に従って行なうことができる。

例えば、ｈ−３ＯＤ−Ａ　Ｉ　ａ’をコードするＤＮＡ
配列を有するｐＫＫ２２３−３を大腸菌ＪＭ１０５株へ
ＣａＣ１，法で導入し形質転換する。

形質転換体はアンピシリン耐性などにより選抜した後、
常法に従ってプラスミドを分離し、制限酵素地図の解析
によって第２次のスクリーニングを行うことにより、初
期の形質転換体が得られていることを確認することがで
きる。

このようにして調製される形質転換体は、宿主細胞の増
殖に通じたそれ自体既知の培地で培養することによりｈ
−３ＯＤ−Ａ　１　ａ’の発現を行わせる。培地は適当
量の銅及び／又は亜鉛イオンを含むことが好ましい。

大腸菌の場合、培地としてはＬＢ培地、２×ＹＴ培地な
どが適しており、また培養条件として、培養温度は一般
に３０〜４２℃、好ましくは３７０Ｃ付近が適しており
、またｐＨは通常７〜８の範囲が適している。このよう
な条件下に培養は３〜２４時間程度行なうことができる
。また、培養は通気撹拌下に行なうのが好都合であり、
対数増殖期初期に１〜２ｍＭのイソプロピル−β−〇−
チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することに
より誘発合成を行なってもよい。

培養後の培養物からの産生されたｈ−３ＯＤ−Ａｌａ’
の採取はそれ自体既知の方法で行なうこ集め、破砕した
のち、通常知られている方法、例えば塩析、秀析、イオ
ン交換クロマトグラフィーゲルろ過クロマトグラフィー
、クロマトフオー力ツシング、ハイドロフォービックイ
ンターラクションクロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー、電気泳動などの操作を適宜組合せ
ることによりｈ−３ＯＤ−Ａ　Ｉ　ａ’を分離回収する
ことができる。

次に述べた方法によって製造される本発明のｈＳＯＤ−
Ａｌａ’は、ｈ−５ＯＤと同様のスーパーオキシドディ
スムターゼ活性を有しており、しかもｈ−３ＯＤに比べ
て均質性、安定性に優れている。

従って、本発明のｈ−３ＯＤ−Ａ　ｌ　ａ’はｈ−３Ｏ
Ｄと同様に、活性酸素が関与する病気、例えば慢性関節
リウマチ、変形性関節炎、放射線・紫外線照射による障
害、血行障害等の治療、処置、予防のための医薬や化粧
料等に利用することができる。

次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

［実施例］［１］　　ｈ−５ＯＤ−Ａ　１　ａ’遺伝子の化学合成
（Ｉ　−１）　　オリゴヌクレオチドの合成および精製
完全鎖長（４７５ｂｐ）の遺伝子を作製するために１７
の断片に分け（第２図参照）、１７のオリゴヌクレオチ
ド（３５ｂ〜６１ｂ）をＤＮＡシンセサイザー３８０Ａ
（アプライド・バイオシステムズ・ジャパン社製）を用
いてホスホアミダイド法により合成を行った。合成が終
了したシリカゲルカラムに０．６ｍ１２のチオフェノー
ル溶液（１９，５％チオフェノール−４０％ジオキサン
、４０％トリエチルアミン）を加え室温で８時間以上放
置し、リン酸の保護基（メチル基）をはずした。処理後
、チオフェノールを除去するために５ｍＱのメタノール
をカラムに４〜５回通し洗浄した。

次にカラムに２ｍＱのアンモニア水（２７％以上）を０
．４ｍＱずつ１５分おきに加え、オリゴヌクレオチドを
シリカ支持体より切り出しバイアルに捕集した。このバ
イアルにさらに１ｍＱのアンモニア水（２７％以上）を
加え、キャップ及びパラフィルム等によりシールしてか
ら５５°Ｃで８時間以上加温し、塩基部分の保護基（ア
シル基）をはずした。恒温槽よりバイアルを取り出し室
温に戻した後、キャップをはずし、減圧下で濃縮乾固し
た。

乾固後、残渣を２００μＱの０．０１）Ｊ）リエチルア
ミン酢酸溶液（ＴＥＡＡ、Ｉ）Ｈ７，５）に溶解し、Ａ
Ｍ−３１３−ＯＤＳ　（山村化学研究新製）カラムを用
いたＨＰＬＣでアセトニトリル−〇、１ＭＴＥＡＡの濃
度こう配溶出を行いメインビークを分取した。分取した
メチンピークを減圧下で濃縮乾固した後、８０％酢酸（
アセトニトリル溶液）１００μＱ加え、混合して室温に
３０分間放置することにより、５′末端のジメチルトリ
チル基（ＤＭＴｒ）をはずし、ＯＨ基に変換した。３０
分経過後迅速に乾固し、残渣を０．０１Ｍ　ＴＥＡＡ　
（ｐＨ７，５）　２００μＱに溶解し、等容のジエチル
エーテルを加え、ＤＭＴｒ基を抽出除去した。

この溶液を減圧下で濃縮乾固した後、１１０μαの０．
ＯＬＭ　ＴＥＡＡ　（ｐＨ７，５）に溶解し、再びＨＰ
ＬＣを用いて、分取・精製を行った。分取したオリゴヌ
クレオチドを含む溶液は減圧下で乾固した後、ｌＱｍＭ
トリス塩酸−１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ＴＥ、ｐＨ８，０）
に溶解し、以下の実験に使用した。

Ｃｌ−２）　　合成オリゴヌクレオチドのキナーゼによ
るリン酸化精製したオリゴヌクレオチドは完全鎖長ヒト型ＳＯＤ遺
伝子の５′末端に位置するＮ００１およびＮｏ、１７を
除き５′末端のリン酸化を行った。各オリゴヌクレオチ
ド４μ７を５０ｍ１Ｊトリス塩酸（ｐＨ７−６）ｌ　Ｏ
ｍＭ　ＭｇＣ１２０，１ｍＭＥＤＴＡ　　−５ｍＭジチ
オスレイトール（ＤＴＴ）０　、１　ｍＭスペルミジン
−１，７μＭＡＴＰ溶液１２０μα混合し、Ｔ、ポリヌ
クレオチドキナーゼ　９単位（宝酒造株）を添加し、３
７°Ｃで１５分間インキュベートした。次にＡＴＰを終
濃度１ｍＭになるように加え、再度Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ９単位を添加し、３７°Ｃで２５分間インキ
ユベートした。反応後、９０°０．５分間処理してＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。この溶液に等
量の７エノールを加え撹拌したのち１５０００ｒｐｍ、
　４°Ｃ，３分間の遠心で水層を分取した。この水層に
等量のクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：ｌ
）を加え撹拌、遠心することによりフェノールを抽出除
去した。この水層に尾容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４
，８）および２．５容のエタノールを加え、−２０°Ｃ
で２時間以上放置した。沈殿を１５０００ｒｐｍ１’４
°ｃ、　　１０分間遠心して集め、−２０°Ｃで冷やし
た７０％エタノールで２回洗浄し、減圧下でアルコール
分を除いた。残渣をｌＯμＱのｌＱｍＭトリス塩酸−１
ｍＭＥＤＴＡ溶液（ＴＥＳｐＨ８，０）に溶解し、次に
実験に使用した。

（Ｉ−３）Ｔ、ＤＮＡリガーゼによる合成オリゴヌクレ
オチドの連結（ＤＮＡブロック ■〜■の作製）完全鎖長遺伝子合成のために１７のオリゴヌクレオチド
を５つのブロック（１〜Ｖ）に分け、Ｔ、ＤＮＡリガー
ゼにより連結した（第３図参照）。

各ブロックを構成するオリゴヌクレオチドのうち上下各
ストランドの５′末端に位置するオリゴヌクレオチド１
．５μ９、その他のオリゴヌクレオチド１μ９を５０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，６）−１０ｍＭＭｇＣＩ、溶液
８０ｐＱ中に混合した。

この溶液を９０８０．５分間加熱した後、２時間かけて
４°Ｃまで徐冷し、１００ｍＭジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）と１０ｍＭＡＴＰを１０１２づつ加え、さらにＴ
、ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）２．５単位を添加して４°
Ｃで１５時間インキュベートした。反応液を等量のフェ
ノールで処理し、クロロホルム抽出を２回行いフェノー
ルを除去した。この溶液に３倍容のｎ−ブタノールを加
え、撹拌・遠心して濃縮し、残余のｎ−ブタノールをク
ロロホルムにより抽出除去した。この溶液に尾容の電気
泳動用マーカー（０，２５％ブロモフェノールブルー　
０．２５％キシレンシアツール、３０％グリセロール）
を加え、８％ポリアクリルアミドゲルにのせ、８９ｍＭ
ｈリスホウ酸−２ｍＭＥＤＴＡ　（ＴＢＥ、ｐＨ８，０
）緩衝液で２００Ｖ、４時間電気泳動を行った。泳動後
、ゲルを０．５μり／ｍＱのエチジウムブロマイド溶液
（ＴＢＥ中）に１５分間浸漬し、ＤＮＡの染色を行った
。染色したゲルをトランスイルミネーター上にのせ、紫
外線をあて目的とするＤＮＡバンドを含むゲルを切り出
した。このゲルを１．５ｍＱエッペンドルフチューブに
入れ、滅菌したガラス棒で細かく砕いたのち２０ｍＭト
リス塩酸−１，５ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８，０）５０
０ｐＱを加え３７°ｃ”ｃ’１夜浸漬することにより目
的のＤＮＡを抽出した。抽出液にトリエチルアミンを終
濃度がｌｏｍＭになるように加え、０．１Ｍトリス塩酸
−１０ｍＭトリエチルアミン−１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐ
Ｈ７，７）で平衡化した核酸精製用カートリッジＮｅｎ
５ｏｒｂ　２０　（Ｄｕｐｏｎ　を社製）に通すことに
よりＤＮＡを吸着させた。

カートリッジに３ｎ＋ＱのＯ，１Ｍトリス塩酸−１０ｍ
Ｍトリエチルアミン−１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７，７
）および滅菌水を流して洗浄した後、５０％メタノール
（高速液体クロマトグラフ用）溶液として溶出した。溶
出液を減圧下で濃縮乾固した後、残渣を滅菌水ｌＯμＱ
に溶解し、次の反応に用いた。

（ｔ−４）Ｔ４　ＤＮＡリガーゼによるブロックの連結
一完全鎖長遺伝子の作製前記（Ｉ−３）で連結した５つのＤＮＡブロック（１，
ｎ、■、■、■）を第３図に示すヨウニ２つずつＴ、Ｄ
ＮＡリガーゼにより連結し、完全鎖長のヒト型ＳＯＤ遺
伝子を作製した。

隣合せの２ブロツクをそれぞれ０．５μ９ずっ５ＱｍＭ
）リス塩酸（ｐＨ７，６）　−１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２溶
液４０μＱに混合し、３７°Ｃで３０分間インキュベー
トした後、４°Ｃまで３０分間で除冷した。この溶液に
ｌ　００ｍＭ　ＤＴＴ、　　１０ｍＭ　ＡＴＰをおのお
の５μαずつ加え、さらにＴ、ＤＮＡリガーゼ（宝酒造
）１０単位を添加して４°０，１５時間反応させた。こ
の反応液に等容のフェノール−クロロホルム−イソアミ
ルアルコール（２５：２４　：　１）を加え撹拌・遠心
して水層を得た。これに電気泳動用マーカーを尾容加え
、６％ポリアクリルアミドゲルにのせＴＢＥ緩衝液で２
００Ｖ。

６時間電気泳動を行った。泳動後ゲルをエチジウムブロ
マイド染色した後、トランスイルミネーター上で目的と
するＤＮＡバンドを切り出した。切り出したゲルから（
１−３）と同様にＤＮＡを抽出し、Ｎｅｎ５ｏｒｂ　２
０を用いて精製した。

（Ｔ−５）　　完全鎖長遺伝子のクローニング１）　完
全鎖長ヒト型ＳＯＤ遺伝子の５′末端のリン酸化得られた完全鎖長ヒト型ＳＯＤ遺伝子約１μ９を１２０
．１２の５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，６）−１０ｍＭ
　ＭｇＣ１，−０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ−５ｍＭＤＴＴ−
０，１ｍＭスペルミジン−１，７μＭＡＴＰ溶液と混合
し、Ｔ、ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）９単位を
添加して３７℃、１５分間インキュベートした。次にＡ
ＴＰを終濃度１ｍＭになるように加え、再度Ｔ、ポリヌ
クレオチドキナーゼ９単位を添加し、３７℃で２５分間
インキュベトした。反応後、等量のフェノール：クロロ
ホルム：イソアミルアルコール（２５：　２４　：　ｌ
）を加え撹拌したのち１５０００ｒｐｍ、３分間の遠心
で水層を分取した。この水層に等量のクロロホルム−イ
ソアミルアルコール（２４：１）を加え撹拌・遠心する
ことにより残余のフェノールを抽出除去した。この水層
に尾容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）および２．
５容のエタノールを加え、−２０°Ｃで２時間以上放置
した。沈殿を１５０００ｒｐｍ（４℃）、１０分間遠心
して集め一２０℃に冷やした７０％エタノールで２回洗
浄し、減圧下でアルコール分を除いた。こうして０．８
μ９の遺伝子が得られ、４０μａのＴＥに溶解し、次の
実験に使用した。

２）　完全鎖長ヒト型ＳＯＤ遺伝子のｐＵＣ１３（Ｈｉ
ｎｄ　ｍ　−Ｂａｍ　Ｈｄｉｇｅｓｔ）　ヘ挿入リン酸
化した完全鎖長ヒト型ＳＯＤ遺伝子３０ｎｇおよび制限
酵素Ｈｉｎｄ　ｍ、Ｂａｍ旧で切断したｐＵＣ１３２８
０ｎｇを７．５ｐＱの０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，６
）−５ｍＭ　ＭｇＣ］　ｔに混合し、６０ｐＱのＴａｋ
ａｒａ　ＤＮＡ　Ｉｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ａ液（宝
酒造）を加え、よく撹拌した。この溶液に７．５　ｐＱ
のＴａｋａｒａ　　ＤＮＡ　ＩｉｇａＬｉｏｎ　Ｗｉｔ
　Ｂ液を加えよく撹拌した後、１６℃で３０分間インキ
ュベートした。反応後、この溶液をＥ、　ｃｏｌｉ　Ｊ
Ｍ１０９株の形質転換に使用した。

３）　　Ｅ、ｃｏｌｉＪＭ１０９株の形質転換ヒト型Ｓ
ＯＤ遺伝子を挿入したｐＵＣ１３４ｎｆｌ（１０μ＋２
）に５０ｍＭＣａＣＩｚ処理したＥ。

ｃｏｌｉ　ＪＭ　Ｉ　Ｏ９株の細胞懸濁液２００　ｐＱ
を加え、おだやかに混合した。混合液を氷水中で３０分
間インキュベートした後、さらに４２℃で３分間インキ
ュベートしてＤＮＡを細胞中にとりこませた。

この懸濁液にｌ　ｍＱの２Ｘ　ＹＴｍｅｄｉｕｍ　　（
１６９／αバクトドリプトン、Ｌｏｇ／（ｌ酵母抽出エ
キス、５ｇ／１２　　ＮａＣ１）を加え、振盪せずに３
７℃で１時間インキュベートした。この細胞懸濁液を２
５．５０．１００．２００および４００　ｐＱとり２Ｙ
Ｔ寒天培地（５０μｇ／ｍＱアンピシリン、４０ｍｇ／
α５−ブロモー４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−
チオガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）、２３．８３ｍｇ／Ｑ
イソプロピルーβ−Ｄ−チオガラクトピラノサイド（Ｉ
ＰＴＧ）１．５％寒天を含む）上にプレートした。この
プレートを３７°Ｃで２４時間インキュベートし、得ら
れた白いコロニーを２枚の２ＹＴ寒天培地（アンピシリ
ン、Ｘ−ｇａｌ、　　Ｌ　ＰＴＧ　　ｌ　、５％寒天を
含む）にスポットして３７°Ｃで一晩培養することによ
り白いコロニーを単離した。

単離した白いコロニーを２ｍＱの２ＹＴ液体培地（５０
μｇ／ｍＱアンピシリンを含む）に白金耳で植え付け３
７°Ｃで一晩培養した。培養液を１ｍｆｆ１トリ１．５
ｍｆｆ容エツペンドルフチューブに移し、１５０００ｒ
ｐｍ、３０秒間遠心して細胞を集めた。

集めた細胞を１ｍ（２のＳＥ　Ｔ　ｂｕｆｆｅｒ　　（
２０％ショ糖、５０ｍＭトリス塩酸、５０ｍＭ　ＥＤＴ
ＡＳｐＨ７，６）に懸濁し、１５０００ｒｐｍ、１分間
遠心して洗浄した。この細胞を再び１５０μαの５ＥＴ
ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、５ｐＱのＲＮａｓｅ溶液（１０
ｍｇ／ｍＱリボヌクレアーゼＡ、Ｏ，１Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ４，８）　、０．３ｍＭ　ＥＤＴＡ）を加えポ
ルテックスミキサーで十分混合した。これに３５０μＱ
の溶菌液（１％　ＳＤＳ、０．２Ｎ　Ｎａ○Ｈ）を加え
、チューブを逆さにすることによりおだやかに撹拌し、
完全に溶菌させた。この溶菌液を氷水中で１０分間イン
キュベートした後、２５０μＱの酢酸ナトリウム（ｐＨ
４，８）を加え、十分混合し、さらに氷水中に３０分間
放置した。この混合液を１５００Ｏｒｐｍ、４°Ｃで１
０分間遠心してＳＤＳおよび染色体ＤＮＡを沈殿として
集めた。上溝を別のエツペンドルフチューブに移し、等
量のインプロパツールを加えよく混合し、１５０００ｒ
ｐｍ、４℃で７分間遠心してプラスミドＤＮＡを沈殿と
して集めた。沈殿の滅菌水に溶解し、一部を制限酵素Ｈ
ｉｎｄ　ｍ、Ｂａｍ　Ｈｒ　（宝酒造）処理し、１．２
％ａｇａｒｏｓｅゲル電気泳動を行い４７５ｂｐのＤＮ
Ａ断片がｐｕｃ　１３に挿入されていることを確認した
。

このようにして得られた組換えプラスミドをｐＵＣ１３
−ｈ−３ＯＤ−Ａ　Ｉ　ａ’　と命名する。

［ｎ］　　組換えプラスミドの造成（ＩＩ−１）ｈ−３ＯＤ−Ａｈａ’遺伝子の調製ｐＵＣ
１３−ｈ−ＳＯＤ−Ａ　Ｉ　ａ’　　ＤＮＡを５ＤＳ−
アルカリ法と塩化セシウム−エチジウムブロマイド平衡
密度勾配遠心分離法（Ｂ、　Ｐｅｒｂａｌ、　ＡＰｒａ
ｃｔｉｃａｌ　Ｇａ１ｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１４０−１４４、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌ
ｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ　Ｉｎｃ、刊）により大量に調
製した。大量調製したｐＵｃ１３−ｈ−３ＯＤＡｌ　ａ
’　　ＤＮＡ　８０μ＋２　（４０μｇ）と５×Ｈｉｎ
ｄ　ｍ　切断用バッファー（５０ｍＭｌ−リス−塩酸（
ｐＨ７，５）　、３５ｍＭ　ＭｇＣｌｘ　、３００ｍＭ
ＮａＣ］）３０ｐＱ及びＨｉｎｄ　ｎ［（宝酒造（株）
製）　ｇ　０ｕｎｉｔｓに水を加えて１５０μαとした
エツペンドルフチューブ（１，５ｎ＋１２用）を１０本
用意し、３７°Ｃで３時間反応させた。反応後、フェノ
ール：クロロホルム（１：　１）　、クロロホルム処理
し、尾容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）、２．５
容のエタノールを加え、−２０℃で２時間以上放置した
。生じたＤＮＡの沈殿を１５００゜ｒｐｍ、　４°Ｃで
１０分間遠心し、７０％エタノールで洗浄後減圧下乾固
させた。残渣を５５０μαの滅菌水に溶解し、５つのチ
ューブに１１０μα（約８０μｇＤＮＡ）ずつ分注した
。それぞれのチューブに５　Ｘ　ＥｃｏＲＩ切断用バッ
ファー（２５ＱｍＭトリスー塩酸（ｐＨ７−５）　、３
５ｍＭ　ＭｇＣ１ｘ　、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、３５ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール、０．０５％ウシ血清アル
ブミン）３０ｐＱ及びＥｃｏＲｌ　（宝酒造（株）製）
１００ｕｎｉｔｓに水を加えて１５０μαとし、３７°
Ｃで３時間反応させた。反応後、フェノール：クロロホ
ルム（１：ｌ）Ｍ理、エタノール沈殿してＤＮＡを回収
した。目的とするｈ−３ＯＤ−Ａ　ｌ　ａ’遺伝子（Ｈ
ｉｎｄ　ｍ　−ＥｃｏＲＩ約５００　ｂ　ｐ）を２％ア
ガロースゲルによる電気泳動を行って分離し、核酸精製
用カートリッジＮｅｎ５ｏｒｂ　２０　（Ｄｕｐｏｎｄ
）を用いて精製した。

（ｆｆ−２）　　Ｈｉｎｃ　Ｉ［−旧ｎｄ　ｍ断片の合
成Ｓ　Ｄ　（Ｓｈｉｎｅ　Ｄｅｌｇａｒｎｏ）配列を含
む発現調整領域の合成のために８つのオリゴヌクレオチ
ド（第４図参照）を亜リン酸固相法により化学合成し、
高速液体クロマトグラフィーにより精製した。

５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造（株
）製）とＡＴＰでリン酸化し、下記第１表のような割合
で４つのヌクレオチドを８０μＱの５０ｍＭトリス−塩
酸（ｐＨ７，６）　−１０ｍＭ　Ｍｇｃｈｉ溶液に混合
した。

第１表（単位はμｇ）この溶液を９０°０．５分間加熱した後、２時間かけて
４°Ｃまで徐冷し、１００ｍＭジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）、ｌＯｍＭＡＴＰを１０ｐＱずつ加え、ざらにＴ
、ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）２．５単位を添加
して４°Ｃで１５時間インキュベートした。反応液をフ
ェノール：クロロホルム、クロロホルム処理し、尾容の
３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）　、２．５容エタノ
ールを加え、−２０℃で２時間以上放置した。生じた沈
殿を１５００　Ｏｒｐｍ、　４°Ｃ１で１０分間遠心し
て集め、７０％エタノールで洗浄、減圧乾固させた。残
渣をｌＯμＱの滅菌水に溶解した。

（Ｉ［−３）　　ｈ−３ＯＤ−Ａ’ｌ　ａ’遺伝子（ｌ
ｉｎｄｍ　−ＥｃｏＲＩ）と合成りＮＡ断片（Ｈｉｎｃ　ＩＩ　−Ｈｌｎｄ　Ｉ［）の連結３つの合
成りＮＡ断片（Ｖ１４　、Ｖ＋ｏ　１Ｖｓ）をそれぞれ
０．６ｐｙとｈ−３ＯＤ−Ａ　ｌ　ａ’遺伝子４．１μ
９ずつをそれぞれ５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，６）
　　　１０ｍＭ　ＭｇＣＩ　、、１０ｍＭジチオスレイ
トール（ＤＴＴ）１ｍＭ　ＡＴＰ溶液に混合し、Ｔ、Ｄ
ＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）３ｕｎｉｔｓを添加し
て２０μＱとした。この反応液を１０°Ｃで１５時間イ
ンキュベートした後、６５°Ｃで１０分間熱処理して反
応を止めた。目的のＤＮＡ断片（ＦＳ１４．１０．６、
約５７０〜５８０ｂｐ）を２％アガロースゲル電気泳動
によって分離し、ＤＮＡ精製用キットＧｅｎｅｃ　１ｅ
ａｎ　’（ＢＩＯ１０１社製）を用いて精製した。

（ＩＩ−４）　　大腸菌発現用ベクターｐＫＫ２２３−
３（ファルマシア社より購入）を５ＤＳ−アルカリ法と
塩化セシウム−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心
法より大量に調整した。ｐＫＫ２２３−３　Ｄ　Ｎ　Ａ
溶液３０ｐＱ　　（８０μｇＤＮＡ）　、５ｘ　Ｂａｍ
旧切断用バッファー（５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ８，
０）、３５ｍＭ　ＭｇＣＩａ　、５００ｍＭ　ＮａＣｌ
、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．０５％ウシ
血清アルブミン）４０μＱ及びＢａｍ旧（宝酒造（株）
製）　２４０　ｕｎｉｔｓに水を加えて１００μαとし
てエツベンドルフチューブＩＯ本を用意し、３０°Ｃで
３時間反応させた。反応後、フェノール：クロロホルム
、クロロホルム処理シ、尾容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ４，８）　、２５容のエタノールを加え一２０℃で２
時間以上放置した。

ＤＮＡの沈殿を１５０００ｒｐｍ、４°Ｃ１１０分間遠
心し集めた。目的のＤＮＡ断片（２６９ｂ　ｐ）を２％
アガロースゲル電気泳動により分離し、ゲルからＤＮＡ
を電気溶出し、核酸精製用カートリッジＮｅｎ５ｏｒｂ
　２０（Ｄｕｐｏｎｔ社製）を用いて精製した。精製し
たＤＮＡ断片８μりを５　Ｘ　Ｈｉｎｃ　Ｉ［切断用バ
ッファー（５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８，０）３５ｍ
ＭＭｇＣＩ２．３００ｍ１ＪＮａＣＩ、３５ｍＭ２−メ
ルカプトエタノール）　９ｐＱ　、　Ｈｉｎｃ　Ｉ［（
宝酒造（株）製）　３０ｕｎｉｔｓ　ｌ：Ｈ２Ｏを加え
て４５μＱとして３７°Ｃで２時間反応させた。反応後
６５°Ｃで１０分間熱処理し、２．５％アガロースゲル
電気泳動して、目的のＤＮＡ断片（１９１ｂｐ）を分離
し、Ｎｅｎ５ｏｒｂ　２０を用いて精製した。

（Ｉｆ−５）　　Ｂａｍ旧−旧ｎｃ　１１断片（１９１
ｂ　ｐ）０．５１１９　、Ｈｉｎｃ　Ｉ［−ＥｃｏＲＩ
断片（ＦＳ６、ＦＳＩＯＳＦＳＩ４それぞれ）１．５ｔ
ｔｙを１０ｍＭトリス−塩酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　　
３００ｍＭ　ＮａＣ１溶液９，６８μＱに混合し、タカ
ラライゲーションキット（宝酒造（株）製）Ｂ液９．６
８μＱを加え、２６°Ｃで１時間反応させた。反応後、
ＤＮＡをエタノール沈殿して回収した。得られたＤＮＡ
を２０μＱのＢａｍ旧切断用バッファー（１０ｍＭトリ
ス−塩酸（ｐＨ８，０）　、７ｍ１Ｊ　ＭｇＣｌ２．１
００ｍＭＮａｃ＋、２ｍＭ２−メルカプトエタノール、
０．０１％ウシ血清アルブミン）に混合し、Ｂａｍ　Ｈ
ｌ　　ｌ　２　ｕｎｉｔｓを加え、３０°Ｃで２時間反
応させた。反応後６０°Ｃで１０分間熱処理して反応を
停止させた。

上で得られたαＳＯＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片１ＩＩＱ
　（４ＯＤｇ）、アルカリフォスファターゼ処理したｐ
ＫＫ２２３−３由来のＤＮＡ断片（約４３２０ｂｐ１Ｂ
ａｍ旧−Ｂａｍ　Ｈｌ）　１．４　ｐＱ　　（２８０ｎ
ｇ）に１９．２μＱのＴａｋａｒａライゲーションキッ
ト（宝酒造（株）製）Ａ液と２．４μＱのＢ液を加えて
１６°Ｃで１時間反応させ、連結しｈ−５ＯＤ−Ａｈａ
’発現用ベクターｐＫＫ−５ＯＤ−６、ｐＫＫ−３ＯＤ
−１０、ｐＫＫ−３ＯＤ−１４を得　ｌこ　。

（ＩＩ−６）　　プラスミドのアルカリフォスファター
ゼ処理ｐＫＫ２２３−３をＢａｍ旧処理して得られた約４３２
０ｂｐのＤＮＡ断片ｌＯμ９を１００μαの５０ｍＭト
リス−塩酸に混合し、１０μＱのアルカリフォスファタ
ーゼ溶液（０，５ｕｎｉｔｓアルカリフォスファターゼ
（宝酒造（株）製）、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，
５）、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＺｎ５Ｏ，）を加え、
３７°Ｃで１時間反応させた。

反応後、さらにｌＯμＱのアルカリフォスファターゼ溶
液を加え６５°Ｃで１５分間インキュベートし、２μα
の２５０ｍＭＥＤＴＡを加え反応を停止させた。ＤＮＡ
はエタノール沈殿して集め０゜２μｇ／μＱになるよう
にｌＱｍＭトリス−塩酸−１ｍＭＥＤＴＡに溶解した。

［ＩＩ［］　　形質転換５０ｍＱの２ＹＴ培地（１６ｇバタトトリプトン、１０
ｇバクト酵母抽出液、５ｇＮａＣ＋）で○Ｄ、。。＝０
．３〜０．５まで培養した大腸菌ＪＭ１０５株を、８０
００ｒｐｍ、　４°Ｃで５分間遠心して集め、２５ｍ１
２の１０ｍＭＮａＣｌで洗浄した後、２５ｍＱの冷たい
５０ｍＭＣａＣ＋□に懸濁させた。

この懸濁液を氷水中に２０分間放置し、５０００ｒｐｍ
、　４°Ｃで１０分間遠心した。集めた細胞を再び５ｍ
１２の冷たい５０ｍＭＣａＣＩｚにおだやかに懸濁し、
３０分以上氷冷することによりフンビテント細胞を得た
。

コンピテント細胞懸濁液２００μＱに４ＯＤｇのαｓＯ
Ｄ発現用ベクター（ｐＫＫα５ＯＤ６．１０．１４）を
それぞれ加え０°Ｃで６０分間、ついで４２°Ｃで２分
間熱処理し、ベクターを細胞に取り込ませた。この細胞
液に２ｍＱの２ＹＴ培地を加え、３時間振とう培養した
後、５０μｇ／ｍＱのアンピシリンを含む２ＸＹＴ寒天
培地（１，５％寒天を含む）にブレーティングし３７°
Ｃで一晩培養した。このようにして得られたコロニーか
らプラスミドを調整し、制限酵素地図を解析することに
よって目的のプラスミドを保持していることを確認した
。

［ＩＶ］　　培養１６ｇ１０バクトドリプトン、ｌ　０９１０　ハ’７ト
酵母抽出物、５ｇ／１２Ｎａｃｌ、１ｍＭＺｎ５Ｏａ　
Ｎ　ＩｍＭ　　Ｃｕ　３０４及び７５ｐｇ／ｍＱアンピ
シリンを含む１．６Ｑの培地に形質転換した大腸菌を接
種し、３７°Ｃで３０分間振とう（１２５ｒｐｍ）培養
した。この培養液に１Ｍイソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭになるよ
うに加え、再び３７℃で１５時間振とう（１２５ｒｐｎ
ｌ）培養を行った。細胞を８０Ｑ　Ｑ　ｒｐｍ、４°Ｃ
で５分間遠心して集め、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７，８）　−０，５ｍＭ　ＥＤＴＡに再懸濁し、
遠心することによって洗浄した。

洗浄後、細胞はＳＯＤ抽出時まで一２０°Ｃで保存し　
ｔこ　。

［Ｖ］　　ｈ−５ＯＤ−Ａ　ｌ　ａ’の精製培養後、洗
浄し、−２０°Ｃで保存しておいた菌体９ｇを１４０ｍ
（２の抽出用緩衝液［５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７
，８）　、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ及び１ｍＭフッ化フェ
ニルメチルスルホニル１に懸濁し、セルデイスラピュタ
−Ｗ　−２２０（Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ−ＵＩＬｒ
ａｓｏｎｉｃ、　Ｉｎｃ、製）で１５分間（５ｍｉｎｘ
３）超音波処理を行って細胞を破砕した。破砕液を８０
００ｒｐｍ、　４°Ｃで５分間遠心し、未破砕の細胞を
除去した。得られた上溝に５６ｍＱ、のクロロホルム−
エタノール混液（３：５、−２０℃）を加え、氷冷しな
がら１５分間撹拌した後、１４ｍＱの蒸留水で希釈し、
８０００ｒｐｍ、　４°Ｃで１０分間遠心した。得られ
た淡黄色の上清（１８４ｍＩ２）を室温にもどし、これ
に固形のに２ＨＰ０．５５．２ｇ　（３００ｇ／（２）
を加えて撹拌し、ｌ　００００ｒｐｍで１０分間遠心す
ることにより２層に分離させた。上清４６ｍｆｆを４°
Ｃに冷却した後、これに３４．５ｍ（２の冷アセトンを
加え、撹拌し、生じた沈殿を１５０００ｒｐｍ、４°Ｃ
で１０分間遠心して集めた。この沈殿を５０ｍＭリン酸
カリウム（ｐＨ７，８）　、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液
に溶解し、同緩衝液に対して透析を行った。この溶液３
３ｍ１２を硫酸アンモニウムによる塩析によって分画（
４０〜８０％硫安分画）し、得られた沈殿を１５０００
ｒｐｍ、　４℃で２０分間遠心して集めた。沈殿をｌＱ
ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７，８）　　　Ｏ，１ｍＭ　
ＥＤＴＡ溶液に溶解し、同緩衝液に対して透析した。

この溶液を１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７，８）−０
，１ｍＭＥＤＴＡ溶液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ　ＣＬ　−６Ｂカラム（セパコール・ミニｐ
ｐカラム、生化学工業社製）に通し、ｈ−ｓ。

Ｄ−Ａｌａ’を吸着させた。このカラムを１０ｍＭリン
酸カリウム（ｐＨ７，８）−０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液
で洗浄後、０〜２００ｍＭＮａＣ１の濃度勾配によって
ｈ−ＳＯＤ−Ａ　Ｉ　ａ’を溶出させた。

ＳＯＤ活性を有する画分を集め、ＰＭＩＯフィルター（
Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いた限外ろ過によって１ｍｌ＋
まで濃縮した。この濃縮液を１０ｍＭリン酸カリウム（
ｐＨ７，８）　　Ｏ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液で平衡化し
た５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−１００（ファルマシア社製
）カラム（１，０°Ｘ　５　Ｑ　ａｍ）にかけ、ＳＯＤ
活性を有する画分を得た。この両分を、２５ｍＭイミダ
ゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）に対して透析後、同
緩衝液で平衡化されたＰｏ１ｙｂｕｆｆｅｒ交換体ＰＢ
Ｅ９４　（ファルマシア社製）カラム（１，０”Ｘ１２
ｃｍ）に添加し、ｌｏｏｍＱのＰｏ１ｙｂｕｆｆｅｒ　
７４　（ｐＨ４，０）によって溶出した。ＳＯＤ活性を
有する画分をＹＭ５フィルター（Ａｍｌｃｏｎ社製）を
用いた限外ろ過によって濃縮および１０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７，８）へのバッファー交換を行った
。この溶液に硫酸アンモニウムを終濃度４０％（Ｗ／ｖ
）になるように加え、４０％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウ
ム−１０ｍＭリン酸カリウム溶液（ｐＨ７，８）で平衡
化したＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂ
　（ファルマシア社製）カラム（２ｍＱ、セパコール・
ミニ・ｐｐ・カラム、生化学工業社製）に通し、ｈ−５
ＯＤ−Ａ　ｌ　ａ’を吸着させた。この方ラムを４０％
（Ｗ／Ｖ）ＩｔＥＭアンモニウム−１０ｍＭリン酸カリ
ウム（ｐＨ７，８）で洗浄後、４０〜０％硫酸アンモニ
ウムおよび０〜３５％エチレングリコールの濃度勾配に
よって溶出した。ＳＯＤ活性を有する画分を、１０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，８）に透析後、ＹＭ５
フィルター（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いた限外ろ過によ
って１．２ｍＱに濃縮した。この酵素を液ｈ−５ＯＤ−
Ａｌａ’標準試料として下記の実験に用い　ｔこ　。

［ＶＩ］　　活性の測定光学セルＣｌ　ｍＱ用）に５０ｍＭリン酸カリウム（ｐ
）＋　７．８）−０，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　０−１ｍ
１２゜０．１ｍＭＸａｎｔｉｎｅ　ｏ、２ｍＱｓ　　ｌ
　ＯμＭチトクローム（ウマ心臓、Ｓｉｇｍａ　Ｔｙｐ
ｅ　Ｉ［［）　、サンプルおよび蒸留水を加え、全容を
０．９８ｍ４とした。これにキサンチン酸化酵素を０．
０２ｍ４加え、反応を開始し、チトクロームＣ還元速度
５５０ｎｍの吸光度増加の初速（３０〜６０秒）から求
め、この値をＶとした。ＳＯＤサンプルを加えないとき
のチトクロームＣ還元速度をＶとした。この条件下での
チトクロームＣ還元を５０％阻害するＳＯＤを３Ａ　ｕ
ｎｉｔとし、（Ｖ／ｖ−１）からサンプル中のｕｎｉｔ
数を求めた（植物酵素・蛋白質研究法ｐ３７３　浅田浩
二、共立出版）。

実験Ｉ：　ポリペプチドのアミノ酸配列の特定精製した
ｈ−５ＯＤ−Ａ　Ｉ　ａ’のＮ−末端の最初の１４アミ
ノ酸を４７７Ａプロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ　ＢｉｏｓｙｓＬｅｍｓ社製）を用いた自動エドマ
ン分解法により決定した。検出されたアミノ酸配列を次
に示す。

Ａｌａ　−（Ｔｈｒ）　−（Ｌｙｓ）　−Ａｌａ　−Ｖ
ａｌ　−Ａｌａ　−Ｖａｔ　−Ｌｅｕ−（Ｌｙｓ）　−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｔ検出された第
１アミノ酸、Ａｌａは、分析に用いたペプチドの濃度と
およそ等モルの濃度であり、アセチル化などのブロック
されたアミノ末端が存在しないことが示された。使用し
たアミノ酸分析法によってはＴｈｒ”、　Ｌｙｓ’、Ｌ
ｙｓ”残基は検出されなかった。この存在はジデオキシ
法によるヌクレオチド配列の確認分析から推定された。

実験２二　精製ｈ−５ＯＤ−Ａ　１　ａ’の電気泳動立
置（１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動５ＤＳ
−ＰＡＧプレートｔｏ／２０（第一化学薬品（株）製）
を用いて、Ｌａｅｍｍｌｉら（Ｎａｔｕｒｅ。

２３７．６８０　（１９７０））の条件下、還元状態で
５ＤＳ−電気泳動を行い、ウマシーブルーにより染色し
、ｈ−５ＯＤ−Ａ　Ｉ　ａ’を検出した。その結果、ｈ
−５ＯＤ−Ａｌａ’は単一のバンドとして検出され、天
然ｈ−５ＯＤとほぼ同じ移動度を示した（第５図）。

（２）ポリアクリルアミドゲル電気泳動リボフラビンを
加えた光重合法（蛋白質核酸酵素、１１．７４４　（１
９６６））で作成したボリアクリルアミドゲルを用い、
電気泳動を行った。

泳動後、ゲルを５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７゜８）
　　０　５ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡで２〜３回（５分）洗浄し
、ニトロブルーテトラゾリウム（Ｎ　Ｂ　Ｔ）溶液（２
，５ｍＭ　ＮＢＴ、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７，
８）　、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ）に７分間浸した。

次にリボフラビン溶液（１００μＭリボフラビン、３０
ｍＭテトラメチルエチレンジアミン、５０ｍＭリン酸カ
リウム（ｐＨ７，８）　、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ）に５
分間浸した後、水切りし、ゲル中のコントラストが表わ
れるまで白色光中で発色させた。その結果を第６図に示
す。この図においてＳＯＤ活性のある部分は発色せず、
他の部分は紫となるが、これかられかるように、ｈ−５
ＯＤ−Ａ　ｌ　ａ’は単一のバンドとして検出されたが
、その移動度は天然ｈ−３ＯＤよりもわずかに小さかっ
た。

（３）等電点電気泳動ｌ５ｏＧｅｌ”　Ｐｌａｔｅ　　（Ｆ　ＭＣＢｉｏ　Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いｐＨ３〜１０の範囲で等電
点電気泳動を行い、クマシーブルーで染色することによ
ってｈＳＯＤ−Ａｌａ’の等電点（ｐ　Ｉ）を求めた。

その結果、ｈ−３ＯＤ−Ａ　ｌ　ａ″は、天然ｈ−５Ｏ
Ｄ（ｐ！＝４．７と４．６２）より高い等電点（ｐｉ−
５，１）を示すとともに、天然ｈ−３ＯＤで見られるチ
ャージの異なるアイソマーは検出されなかった（第７図
）。

以上の電気泳動分析から、精製されたｈ−５ＯＤ−’Ａ
ｌａ’は、そのＮ末端のＡｌａ残基がアセチル化されて
おらず、Ｎ末端から６番目のアミノ酸残基のＣｙｓから
Ａｌａへの置換によってアイソマーが生じにくくなって
いることが示唆され　ｔこ　。

実験３：　　ｈ−ＳＯＤ−Ａｌａ’の比活性および熱安
定性（１）　　ｈ−５ＯＤ−Ａ　ｌ　ａ’の比活性（ｕｎｉ
ｔｓ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）精製ｈ−３ＯＤ−Ａ　ｌ　ａ’の活性（ｕｎｉｔｓ／ｍ
ｆｆ）を上お記載のＸａｎｔｉｎｅ　ｏｘｉｄａｓｅ−
ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ法によって求め、また、タン
パク質量はＬｏｗｒｙ法（０，Ｈ，Ｌｏｗｒｙ　ｅｔ　
ａｔ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　１３９．
２６５　（１９５１））により、牛血清アルブミンを標
準タンパク質に用いて測定した。その結果、ｈ−ｓ。

Ｄ−Ａｌａ６の比活性は９９０　、　Ｏｕｎｉｔｓ／　
ｍｇ　テあり、天然ｈ−３ＯＤで知られる比活性（３０
０Ｑ　　ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）よりも低い値であった。

（２）熱安定性試験天然ｈ　−Ｓ　ＯＤ　（Ｓｉｇｍａ社製）および精製ｈ
−３ＯＤ−Ａｌａ’　を各２０μＱ（約２００　　ｕｎ
ｉｔｓ／ｍ＋２）ずつをエツペンドルフチューブに分注
し、４０〜１００°Ｃの各温度で１０分間インキュベー
トした。１０分後、直ちに氷冷し、ＳＯＤ活性をＸａｎ
ｔｉｎｅ　ｏｘｉｄａｓｅ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ
法によって測定した。その結果を、４０°ＣでのＳＯＤ
活性を１００％としたときの相対活性として第８図に示
した。

これかられかるように、天然ｈ−３ＯＤは８０°０１１
０分間の熱処理で失活したのに対してｈ−ｓ。

Ｄ−Ａｌａ’は６０−９０°Ｃ，１０分間の熱処理でも
安定であるとともに、相対活性の上昇が見られ　ｌこ　
。

【図面の簡単な説明】

第１図は組換プラスミドの調製のだめの製造工程図であ
り、第２図はｈ−３ＯＤ−Ａ　ｌ　ａ’遺伝子の化学合成に
おける該遺伝子のＤＮＡ断片の塩基配列図であり、第３図はｈ−５ＯＤ−Ａ　ｌ　ａ’遺伝子の作製方法を
示す工程図であり、第４図は発現調節領域の合成のための工程図であり、第５〜７図はそれぞれ電気泳動図であり、第８図は天然
ｈ−３ＯＤ及びｈ−５ＯＤ−Ａｌａ６の熱安定性試験を
示すグラフである。矛５図第６図第７図５ＯＳ−、＋？リアフリルアミド′ケルＮａＴｉｖｅ−
ポソアフ１ツノげミド゛ゲル博電点電気シ永動１　天ｆ、ｆｉ−５ＯＤ２：ｈ−ｓｏｏ−△１゜１：　ｈ−５ＯＤ−１ａ２＝天パｈ−ｓｏ。天グ、ｈ−ｓｏ。２’　　ｈ−３ＯＤ−△１゜

Claims

【特許請求の範囲】１、下記式【遺伝子配列があります】式中、Ｒは水素原子、アセチル基又はＭｅｔを表わす、で示されるポリペプチド。２、特許請求の範囲第１項記載のポリペプチドをコード
するＤＮＡ配列。３、式【遺伝子配列があります】で示されるＤＮＡ配列を有する特許請求の範囲第２項記
載のＤＮＡ配列。４、特許請求の範囲第１項記載のポリペプチドをコード
するＤＮＡ配列が導入された組換えプラスミドで形質転
換された宿主細胞を培地で培養し、該ポリペプチドを発
現せしめ、次いで産生されたポリペプチドを採取するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のポリペプチ
ドの製造方法。