JP2533641B2 - 変異型ヒトリゾチ―ム - Google Patents
変異型ヒトリゾチ―ムInfo
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- JP2533641B2 JP2533641B2 JP7752689A JP7752689A JP2533641B2 JP 2533641 B2 JP2533641 B2 JP 2533641B2 JP 7752689 A JP7752689 A JP 7752689A JP 7752689 A JP7752689 A JP 7752689A JP 2533641 B2 JP2533641 B2 JP 2533641B2
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- Japan
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- human lysozyme
- lysozyme
- mutant
- dna
- mutant human
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、組み換えDNA技術による変異型ヒトリゾチ
ームおよびその製造に関するものである。さらに詳しく
は、天然型ヒトリゾチーム（以下、単にヒトリゾチーム
ともいう）のアミノ酸配列の第86位のグルタミンおよび
第92位のアラニンがアスパラギン酸で置き換えられた変
異型ヒトリゾチームをコードしている変異ヒトリゾチー
ム遺伝子を、シグナルペプチドをコードしているヌクレ
オチド配列と共に含有してなる変異型ヒトリゾチーム発
現ベクター、該発現ベクターを用いてヒトリゾチーム活
性を有するタンパク質を製造する方法、該発現ベクター
で形質転換された形質転換体、並びに該形質転換体によ
り生産された変異型ヒトリゾチームに関するものであ
る。
ームおよびその製造に関するものである。さらに詳しく
は、天然型ヒトリゾチーム（以下、単にヒトリゾチーム
ともいう）のアミノ酸配列の第86位のグルタミンおよび
第92位のアラニンがアスパラギン酸で置き換えられた変
異型ヒトリゾチームをコードしている変異ヒトリゾチー
ム遺伝子を、シグナルペプチドをコードしているヌクレ
オチド配列と共に含有してなる変異型ヒトリゾチーム発
現ベクター、該発現ベクターを用いてヒトリゾチーム活
性を有するタンパク質を製造する方法、該発現ベクター
で形質転換された形質転換体、並びに該形質転換体によ
り生産された変異型ヒトリゾチームに関するものであ
る。
従来技術とその問題点 リゾチームは細菌細胞壁のペプチドグルカンに作用し
てＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミン
のβ−1,4−結合を加水分解する酵素である。該酵素を
細菌に作用させると溶菌を引き起こし、その反応生成物
である少糖を同定することによって細胞壁の化学構造の
研究における手懸かりを得ることができる。従って、リ
ゾチームは、細菌学、蛋白質化学、生化学等、様々な研
究分野において有用な酵素である。リゾチームは、ヒト
をも含めた動物の各種組織、分泌液、卵白等に広く分布
しており、一部の植物にも見出されている。
てＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミン
のβ−1,4−結合を加水分解する酵素である。該酵素を
細菌に作用させると溶菌を引き起こし、その反応生成物
である少糖を同定することによって細胞壁の化学構造の
研究における手懸かりを得ることができる。従って、リ
ゾチームは、細菌学、蛋白質化学、生化学等、様々な研
究分野において有用な酵素である。リゾチームは、ヒト
をも含めた動物の各種組織、分泌液、卵白等に広く分布
しており、一部の植物にも見出されている。
卵白からは比較的容易に純度の高いリゾチームが単離
できるため、この酵素は食品保存の目的で、チーズ、ソ
ーセージ、水産食品などに添加されたり、あるいはま
た、牛乳のヒト母乳化の目的で使用されている［林勝
哉、井本泰治、リゾチーム、南江堂（1974）］。リゾチ
ームはまた、止血、抗炎症、組織再生、抗腫瘍活性など
の薬理活性を有することも知られており（例えば“最近
の新薬34集"107頁、薬事日報社、東京、1983）、消炎酵
素剤として市販されている。
できるため、この酵素は食品保存の目的で、チーズ、ソ
ーセージ、水産食品などに添加されたり、あるいはま
た、牛乳のヒト母乳化の目的で使用されている［林勝
哉、井本泰治、リゾチーム、南江堂（1974）］。リゾチ
ームはまた、止血、抗炎症、組織再生、抗腫瘍活性など
の薬理活性を有することも知られており（例えば“最近
の新薬34集"107頁、薬事日報社、東京、1983）、消炎酵
素剤として市販されている。
これらニワトリ卵白由来のリゾチームを医薬目的で使
用する場合には、しばしば発疹、発赤などの過敏症状の
現れることがあり、これらは異種蛋白による免疫応答に
よる副作用であると考えられている。従って、特に医薬
用途に用いる場合には、ヒトリゾチームを使用すること
が好ましい。
用する場合には、しばしば発疹、発赤などの過敏症状の
現れることがあり、これらは異種蛋白による免疫応答に
よる副作用であると考えられている。従って、特に医薬
用途に用いる場合には、ヒトリゾチームを使用すること
が好ましい。
ヒトリゾチームのアミノ酸配列は公知であり（第１
図）、130個のアミノ酸からなる［日本生化学会編：生
化学データブック巻1.189頁（1979）］。またこのアミ
ノ酸配列に基づき、ヒトリゾチームをコードするDNAが
化学合成されている［I kehara,M.ら、ケミカル・アン
ド・ファーマシューティカル・ブリテン（Chem.Pharm.B
ull.）34、2202（1986）］。
図）、130個のアミノ酸からなる［日本生化学会編：生
化学データブック巻1.189頁（1979）］。またこのアミ
ノ酸配列に基づき、ヒトリゾチームをコードするDNAが
化学合成されている［I kehara,M.ら、ケミカル・アン
ド・ファーマシューティカル・ブリテン（Chem.Pharm.B
ull.）34、2202（1986）］。
ヒトリゾチームの生産については、組み換えDNA法を
用いてムラキ（Muraki）らが大腸菌での発現を試みた
が、この発現系では活性のあるヒトリゾチームが得られ
ていない［Muraki,M.ら、アグリカルチュラル・アンド
・バイオロジカル・ケミストリー（Agric.Biol.Chem）5
0、713（1986）］。一方、酵母を用いて培地中にリゾチ
ームを分泌させる分泌生産では、活性のあるヒトリゾチ
ームが得られることが明らかにされたが［Jigami,Y.
ら、ジーン（Gene）43、273（1986）］、その生産量
（菌体内外の総和）は十分なものではなく、かつ、生産
量に対する分泌量も55〜65％と十分なものではない。
用いてムラキ（Muraki）らが大腸菌での発現を試みた
が、この発現系では活性のあるヒトリゾチームが得られ
ていない［Muraki,M.ら、アグリカルチュラル・アンド
・バイオロジカル・ケミストリー（Agric.Biol.Chem）5
0、713（1986）］。一方、酵母を用いて培地中にリゾチ
ームを分泌させる分泌生産では、活性のあるヒトリゾチ
ームが得られることが明らかにされたが［Jigami,Y.
ら、ジーン（Gene）43、273（1986）］、その生産量
（菌体内外の総和）は十分なものではなく、かつ、生産
量に対する分泌量も55〜65％と十分なものではない。
本発明者らは、ヒトリゾチーム活性を有するタンパク
質を効率良く生産することを目的として、卵白リゾチー
ムのシグナルペプチドに修飾を施し、形質転換された酵
母宿主内で発現された該タンパク質を効率よく分泌させ
るリーダー配列を得た（特願昭62−069764号および特願
昭62−69765号）。次いで、本発明者らは、天然型ヒト
リゾチームのアミノ酸配列に修飾を施し、第77位と第95
位のシステインをアラニンで置き換えることにより、分
泌効率が高く、生産性の増大された変異型ヒトリゾチー
ムを得るに成功した（特願昭62−245284号）。更に本発
明者らは、より高いヒトリゾチーム活性を有しかつその
構造が安定なヒトリゾチームを得るために継続して検討
を重ねてきた。本発明はかかる検討の結果得られた知見
を基に完成されたものである。
質を効率良く生産することを目的として、卵白リゾチー
ムのシグナルペプチドに修飾を施し、形質転換された酵
母宿主内で発現された該タンパク質を効率よく分泌させ
るリーダー配列を得た（特願昭62−069764号および特願
昭62−69765号）。次いで、本発明者らは、天然型ヒト
リゾチームのアミノ酸配列に修飾を施し、第77位と第95
位のシステインをアラニンで置き換えることにより、分
泌効率が高く、生産性の増大された変異型ヒトリゾチー
ムを得るに成功した（特願昭62−245284号）。更に本発
明者らは、より高いヒトリゾチーム活性を有しかつその
構造が安定なヒトリゾチームを得るために継続して検討
を重ねてきた。本発明はかかる検討の結果得られた知見
を基に完成されたものである。
多くの金属含有タンパク質において、金属がタンパク
質の立体構造の保持に重要な役割をしていることが知ら
れている。金属結合タンパク質であるα−ラクトアルブ
ミンとヒトリゾチームの一次構造の比較から、ヒトリゾ
チームのGln−86とAla−92をアスパラギン酸に置換すれ
ば、α−ラクトアルブミンと同様の金属結合部位が形成
され、ヒトリゾチームの安定性が向上すると考えられ
る。この様にしてもし高活性でより安定なヒトリゾチー
ムが得られれば、医療分野はもとより該酵素の生理学的
役割の研究等様々な分野に大いに貢献しうると考えられ
る。
質の立体構造の保持に重要な役割をしていることが知ら
れている。金属結合タンパク質であるα−ラクトアルブ
ミンとヒトリゾチームの一次構造の比較から、ヒトリゾ
チームのGln−86とAla−92をアスパラギン酸に置換すれ
ば、α−ラクトアルブミンと同様の金属結合部位が形成
され、ヒトリゾチームの安定性が向上すると考えられ
る。この様にしてもし高活性でより安定なヒトリゾチー
ムが得られれば、医療分野はもとより該酵素の生理学的
役割の研究等様々な分野に大いに貢献しうると考えられ
る。
課題を解決するための手段 本発明者らは、上記の観点から、より安定な変異型ヒ
トリゾチームを得ることを目的として、天然型ヒトリゾ
チームのアミノ酸配列の第86位のグルタミンおよび第92
位のアラニンがアスパラギン酸に置き換えられた変異型
ヒトリゾチームをコードする変異遺伝子を得、該変異遺
伝子を適当な発現ベクターに組込んで組換え発現ベクタ
ーを構築し、この発現ベクターで酵母宿主を形質転換し
て得られた形質転換体を培養することにより、培養物中
に高活性でかつ安定性の高いヒトリゾチーム活性を有す
るタンパク質を分泌させることに成功した。
トリゾチームを得ることを目的として、天然型ヒトリゾ
チームのアミノ酸配列の第86位のグルタミンおよび第92
位のアラニンがアスパラギン酸に置き換えられた変異型
ヒトリゾチームをコードする変異遺伝子を得、該変異遺
伝子を適当な発現ベクターに組込んで組換え発現ベクタ
ーを構築し、この発現ベクターで酵母宿主を形質転換し
て得られた形質転換体を培養することにより、培養物中
に高活性でかつ安定性の高いヒトリゾチーム活性を有す
るタンパク質を分泌させることに成功した。
即ち、本発明は、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配
列の第86位のグルタミンおよび第92位のアラニンがアス
パラギン酸で置き換えられたポリペプチドをコードして
いる変異ヒトリゾチーム遺伝子を提供するものである。
列の第86位のグルタミンおよび第92位のアラニンがアス
パラギン酸で置き換えられたポリペプチドをコードして
いる変異ヒトリゾチーム遺伝子を提供するものである。
更に、本発明は、該遺伝子を、シグナルペプチドをコ
ードしているヌクレオチド配列と共に含有している変異
型ヒトリゾチーム発現ベクターを提供するものである。
ードしているヌクレオチド配列と共に含有している変異
型ヒトリゾチーム発現ベクターを提供するものである。
また本発明は、上記発現ベクターを用いて酵母宿主を
形質転換し、得られた形質転換体を培養し、培養液中に
分泌されたヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を分
離することからなる変異型ヒトリゾチームの製造方法、
およびこの様にして製造された変異型ヒトリゾチームを
提供するものである。
形質転換し、得られた形質転換体を培養し、培養液中に
分泌されたヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を分
離することからなる変異型ヒトリゾチームの製造方法、
およびこの様にして製造された変異型ヒトリゾチームを
提供するものである。
本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子は、後述の実施例
に記載の如く、当業者既知の方法で調製された。
に記載の如く、当業者既知の方法で調製された。
天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列およびそれをコ
ードしている化学合成したDNAのヌクレオチド配列を第
６図に示す。
ードしている化学合成したDNAのヌクレオチド配列を第
６図に示す。
本発明の変異型ヒトリゾチーム発現ベクター、即ちプ
ラスミドpERI 8811の構築における出発プラスミドとし
て、天然のヒトリゾチームアミノ酸配列をコードしてい
る合成遺伝子を含有する公知のプラスミドpGEL125［ヨ
シムラ（K.Yoshimura）バイオケミカル・バイオフィジ
カル・リサーチ・コミュニケーション（Biochem.Biophy
s.Res.Commun.）145、712（1987）］から、シグナルペ
プチドの上流にのみXho I制御部位を有するプラスミドp
ERI 8602が得られる。
ラスミドpERI 8811の構築における出発プラスミドとし
て、天然のヒトリゾチームアミノ酸配列をコードしてい
る合成遺伝子を含有する公知のプラスミドpGEL125［ヨ
シムラ（K.Yoshimura）バイオケミカル・バイオフィジ
カル・リサーチ・コミュニケーション（Biochem.Biophy
s.Res.Commun.）145、712（1987）］から、シグナルペ
プチドの上流にのみXho I制御部位を有するプラスミドp
ERI 8602が得られる。
天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第86位のグル
タミンおよび第92位のアラニンがアスパラギン酸で置換
された変異型ヒトリゾチームをコードしているヌクレオ
チド配列を得るために、プラスミドpERI 8602から、シ
グナルペプチドとヒトリゾチームとをコードしているヌ
クレオチド配列を含んだXho I−Sma I制限断片を切り出
し、これを、M13mp19RF［M13mpファージDNAの複製型（R
F）］にXho I制限部位を挿入したファージDNAの大きい
方のXho I−Sma I制限断片と結合（ライゲート）させる
ことにより、シグナルペプチドとヒトリゾチームとをコ
ードしている一本鎖ファージDNA、M13mp19XhLZMを得
る。M13mp19XhLZMの組立て模式図を第２図に示す。
タミンおよび第92位のアラニンがアスパラギン酸で置換
された変異型ヒトリゾチームをコードしているヌクレオ
チド配列を得るために、プラスミドpERI 8602から、シ
グナルペプチドとヒトリゾチームとをコードしているヌ
クレオチド配列を含んだXho I−Sma I制限断片を切り出
し、これを、M13mp19RF［M13mpファージDNAの複製型（R
F）］にXho I制限部位を挿入したファージDNAの大きい
方のXho I−Sma I制限断片と結合（ライゲート）させる
ことにより、シグナルペプチドとヒトリゾチームとをコ
ードしている一本鎖ファージDNA、M13mp19XhLZMを得
る。M13mp19XhLZMの組立て模式図を第２図に示す。
一方、アミノ酸配列の第86位のグルタミンおよび第92
位のアラニンがアスパラギン酸で置換された短いアミノ
酸配列をコードしている２本のオリゴヌクレオチドを合
成し、これら、変異を含んだオリゴマーの５′末端をり
ん酸化し、M13mp19XhLZMを含む一本鎖DNAと混合し、常
法に従い、アニーリングおよびライゲーションに付す。
次いで、変異していないDANを除去した後、得られた変
異ヒトリゾチームDNAを含有する混合物を用い、大腸
菌、E.coli TG1をトランスフェクション（感染）した。
プラークを形成させた後、さらにこのプラークをE.coli
TG1に感染させ、その形質転換体を培養し、その培養上
清からPEG/NaCl沈澱、フェノール抽出、エタノール沈澱
により単鎖DNAを分離し、ジデオキシヌクレオチド合成
鎖停止法による塩基配列決定に付し、所望の変異DNAの
生成を確認する。
位のアラニンがアスパラギン酸で置換された短いアミノ
酸配列をコードしている２本のオリゴヌクレオチドを合
成し、これら、変異を含んだオリゴマーの５′末端をり
ん酸化し、M13mp19XhLZMを含む一本鎖DNAと混合し、常
法に従い、アニーリングおよびライゲーションに付す。
次いで、変異していないDANを除去した後、得られた変
異ヒトリゾチームDNAを含有する混合物を用い、大腸
菌、E.coli TG1をトランスフェクション（感染）した。
プラークを形成させた後、さらにこのプラークをE.coli
TG1に感染させ、その形質転換体を培養し、その培養上
清からPEG/NaCl沈澱、フェノール抽出、エタノール沈澱
により単鎖DNAを分離し、ジデオキシヌクレオチド合成
鎖停止法による塩基配列決定に付し、所望の変異DNAの
生成を確認する。
次いで、常法に従い、一本鎖DNAをE.coli TG1に導入
して２本鎖DNAを得、このDNAからシグナルペプチドと変
異型ヒトリゾチームをコードしているXho I−Sma I制限
断片を切り出し、上記プラスミドpERI 8602の9.5kb Xho
I−Sma I制限断片とのライゲーション反応に付す。得
られた混合物を用いてE.coli DH1を形質転換し、形質転
換体から所望の変異型ヒトリゾチーム発現ベクター、プ
ラスミドpERI 8811を単離する。プラスミドpERI 8811の
組立て模式図、並びに制限酵素切断地図を第４図に示
す。
して２本鎖DNAを得、このDNAからシグナルペプチドと変
異型ヒトリゾチームをコードしているXho I−Sma I制限
断片を切り出し、上記プラスミドpERI 8602の9.5kb Xho
I−Sma I制限断片とのライゲーション反応に付す。得
られた混合物を用いてE.coli DH1を形質転換し、形質転
換体から所望の変異型ヒトリゾチーム発現ベクター、プ
ラスミドpERI 8811を単離する。プラスミドpERI 8811の
組立て模式図、並びに制限酵素切断地図を第４図に示
す。
以上の一連の操作における個々の操作は当業者によく
知られており、例えば、大腸菌の形質転換は、コーエン
（Cohen）らの方法［Cohen,S.N.ら、プロシージング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）69、2110（1972）］によっ
て行うことができる。宿主としてはE.coli294、E.coliD
H1、E.coliW3110、E.coliC600などを用いることができ
る。
知られており、例えば、大腸菌の形質転換は、コーエン
（Cohen）らの方法［Cohen,S.N.ら、プロシージング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）69、2110（1972）］によっ
て行うことができる。宿主としてはE.coli294、E.coliD
H1、E.coliW3110、E.coliC600などを用いることができ
る。
また、形質転換体から、所望の遺伝子が挿入されたプ
ラスミドDNAを単離するには、アルカリ抽出法［Birnboi
m,H.C.およびDoly,J.、ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ（Nucleic Acids Res.）７、1513（1979）］等を利
用することができる。次いで、プラスミドDNAを適当な
制限酵素で処理することによって、挿入された該遺伝子
を切り出し、たとえばアガロースゲル電気泳動あるいは
ポリアクリルアミド電気泳動によってこれを単離する。
これらの一連の操作は公知であり、文献、例えば「モレ
キュラー・クローニング（Molecular Cloning）（198
2）,Cold Spring Harbor Laboratory」に詳しく記載さ
れている。
ラスミドDNAを単離するには、アルカリ抽出法［Birnboi
m,H.C.およびDoly,J.、ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ（Nucleic Acids Res.）７、1513（1979）］等を利
用することができる。次いで、プラスミドDNAを適当な
制限酵素で処理することによって、挿入された該遺伝子
を切り出し、たとえばアガロースゲル電気泳動あるいは
ポリアクリルアミド電気泳動によってこれを単離する。
これらの一連の操作は公知であり、文献、例えば「モレ
キュラー・クローニング（Molecular Cloning）（198
2）,Cold Spring Harbor Laboratory」に詳しく記載さ
れている。
またDNAの化学合成は、たとえばCreaらの方法［Crea,
R.ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）7
5、765（1978）］などに従って行うことができる。
R.ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）7
5、765（1978）］などに従って行うことができる。
またDNAの所望の部位に、特異的に変異を起こさせる
ためには、市販のキット（例えばアマーシャム社製キッ
トなど）が用いられ、その配列の確認には、ジデオキシ
ヌクレオチド合成鎖停止法［Sanger,F.ら、プロシージ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA,74、5463（197
7）］が用いられる。
ためには、市販のキット（例えばアマーシャム社製キッ
トなど）が用いられ、その配列の確認には、ジデオキシ
ヌクレオチド合成鎖停止法［Sanger,F.ら、プロシージ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA,74、5463（197
7）］が用いられる。
発現プラスミドは、真核細胞内で自律的に複製可能な
発現ベクター群の内から選択されたベクターのプロモー
ターの下流に、シグナルペプチドをコードしている遺伝
子と変異ヒトリゾチーム遺伝子を連結させて挿入するこ
とにより組立てられる。本明細書中では、GLDプロモー
ターを用いて天然型のヒトリゾチームをコードしている
発現プラスミドpERI 8602の構築を用いて例示したが、
その他、プラスミドpPHO17、pcDX［Okayama,H.およびBe
rg,P.、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジ
ー（Mol.Cell.Biol.）３、280（1983）］、pKSV−10
（ファルマシア社製）なども好適に使用される。
発現ベクター群の内から選択されたベクターのプロモー
ターの下流に、シグナルペプチドをコードしている遺伝
子と変異ヒトリゾチーム遺伝子を連結させて挿入するこ
とにより組立てられる。本明細書中では、GLDプロモー
ターを用いて天然型のヒトリゾチームをコードしている
発現プラスミドpERI 8602の構築を用いて例示したが、
その他、プラスミドpPHO17、pcDX［Okayama,H.およびBe
rg,P.、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジ
ー（Mol.Cell.Biol.）３、280（1983）］、pKSV−10
（ファルマシア社製）なども好適に使用される。
宿主として酵母を用いた場合には、プロモーターとし
て、たとえばPHO5プロモーター、GLDプロモーター、PGK
プロモーター、ADHプロモーター、PHO81プロモーター、
GAL1プロモーター、GAL10プロモーターなどが、宿主と
して動物細胞を用いた場合には、プロモーターとして、
たとえばSV40初期遺伝子プロモーター、メタロチオネイ
ンプロモーター、ヒートショックプロモーターなどがそ
れぞれ利用できる。
て、たとえばPHO5プロモーター、GLDプロモーター、PGK
プロモーター、ADHプロモーター、PHO81プロモーター、
GAL1プロモーター、GAL10プロモーターなどが、宿主と
して動物細胞を用いた場合には、プロモーターとして、
たとえばSV40初期遺伝子プロモーター、メタロチオネイ
ンプロモーター、ヒートショックプロモーターなどがそ
れぞれ利用できる。
なお発現にエンハンサーの利用も効果的である。
発明の作用および効果 本発明のプラスミドpERI 8811は、酵母宿主内で変異
型ヒトリゾチームを発現させ、分泌させるのに好適であ
る。とくに好ましい宿主はサッカロマイセス・セレビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）AH22R-である。その
外、動物細胞用ベクターを用いれば、マウスＬ細胞、チ
ャイニーズハムスター卵母細胞（CHO）、さらには他の
真核細胞も用い得る。酵母の形質転換は当業者既知の方
法のいずれによっても行うことがてき、例えば、ヒネン
（Hinnen）らの方法［プロシージングス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA）75,1927、（1978）］を採用することが
できる。
型ヒトリゾチームを発現させ、分泌させるのに好適であ
る。とくに好ましい宿主はサッカロマイセス・セレビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）AH22R-である。その
外、動物細胞用ベクターを用いれば、マウスＬ細胞、チ
ャイニーズハムスター卵母細胞（CHO）、さらには他の
真核細胞も用い得る。酵母の形質転換は当業者既知の方
法のいずれによっても行うことがてき、例えば、ヒネン
（Hinnen）らの方法［プロシージングス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA）75,1927、（1978）］を採用することが
できる。
真核細胞の形質転換も当業者に既知であり、例えば
「蛋白質・核酸・酵素・28巻、1983年、“組み換え遺伝
子の細胞への導入と発現”（共立出版）」記載の方法で
行うことができる。
「蛋白質・核酸・酵素・28巻、1983年、“組み換え遺伝
子の細胞への導入と発現”（共立出版）」記載の方法で
行うことができる。
形質転換体の培養は、当業者既知の方法のいずれを用
いても行うことができる。
いても行うことができる。
酵母を使用する場合、培地としては、例えばバークホ
ルダー（Burkholder）最小培地［ボスチャン（Bostian,
K.L.）ら、プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンスUSA,77、4505（1980）］
が挙げられる。培養は通常15℃〜40℃、好ましくは24℃
〜37℃で10〜144時間、好ましくは24〜96時間行い、必
要に応じて通気や攪拌を加えてもよい。
ルダー（Burkholder）最小培地［ボスチャン（Bostian,
K.L.）ら、プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンスUSA,77、4505（1980）］
が挙げられる。培養は通常15℃〜40℃、好ましくは24℃
〜37℃で10〜144時間、好ましくは24〜96時間行い、必
要に応じて通気や攪拌を加えてもよい。
動物細胞などの真核生物細胞を宿主とした形質転換体
を使用する場合には、培地として例えばイーグル（Eagl
e）のMEM［H.Eagle、サイエンス（Science）130、432
（1959）］、ダルベッコ（Dulbecco）の改良イーグル培
地（Modified Eagle's Medium）［Orgad LaubおよびWil
liam J.Rutter、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（J.Biol.Chem.）258、6043（1983）］な
どが挙げられる。培養は通常30〜42℃、好ましくは35℃
〜37℃で約１〜10日間行う。
を使用する場合には、培地として例えばイーグル（Eagl
e）のMEM［H.Eagle、サイエンス（Science）130、432
（1959）］、ダルベッコ（Dulbecco）の改良イーグル培
地（Modified Eagle's Medium）［Orgad LaubおよびWil
liam J.Rutter、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（J.Biol.Chem.）258、6043（1983）］な
どが挙げられる。培養は通常30〜42℃、好ましくは35℃
〜37℃で約１〜10日間行う。
培養終了後、当業者既知の方法で細胞と上清とを分離
する。変異型ヒトリゾチームは上清から得られるが、細
胞内に残存する場合には、当分野における通常の方法、
例えば超音波破砕法、フレンチプレスなどを利用した破
砕法、摩砕などの機械的破砕法、細胞溶解酵素による破
砕法などにより細胞を破砕した後抽出する。さらに必要
ならば、トリトン−X100、デオキシコーレートなどの界
面活性剤を加え、産生された変異型ヒトリゾチームを抽
出する。得られた変異型ヒトリゾチームは、通常のタン
パク質精製法、例えば塩析、等電点沈澱、ゲル濾過、イ
オン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフ
ィー（HPLC、FPLC等）などに従って精製することができ
る。
する。変異型ヒトリゾチームは上清から得られるが、細
胞内に残存する場合には、当分野における通常の方法、
例えば超音波破砕法、フレンチプレスなどを利用した破
砕法、摩砕などの機械的破砕法、細胞溶解酵素による破
砕法などにより細胞を破砕した後抽出する。さらに必要
ならば、トリトン−X100、デオキシコーレートなどの界
面活性剤を加え、産生された変異型ヒトリゾチームを抽
出する。得られた変異型ヒトリゾチームは、通常のタン
パク質精製法、例えば塩析、等電点沈澱、ゲル濾過、イ
オン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフ
ィー（HPLC、FPLC等）などに従って精製することができ
る。
本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子を含んだ発現ベク
ターを適当な宿主に導入し、得られた形質転換体を適当
な条件下で培養し、培養上清のヒトリゾチーム活性を有
するタンパク質を単離し、所望により常法にしたがって
精製することにより、容易かつ簡便に一定した高いヒト
リゾチーム活性を有し、かつ熱安定性および酵素消化に
対する安定性の向上した変異型ヒトリゾチームを得るこ
とができる。また、この方法はあるタンパク質に金属イ
オンの結合部位を人工的に構築することにより熱安定性
で酵素消化に対する安定性の向上したタンパク質を得る
一般的方法となりうる。
ターを適当な宿主に導入し、得られた形質転換体を適当
な条件下で培養し、培養上清のヒトリゾチーム活性を有
するタンパク質を単離し、所望により常法にしたがって
精製することにより、容易かつ簡便に一定した高いヒト
リゾチーム活性を有し、かつ熱安定性および酵素消化に
対する安定性の向上した変異型ヒトリゾチームを得るこ
とができる。また、この方法はあるタンパク質に金属イ
オンの結合部位を人工的に構築することにより熱安定性
で酵素消化に対する安定性の向上したタンパク質を得る
一般的方法となりうる。
以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明す
る。尚、以下の実施例は単なる例示にすぎず、如何なる
意味においても、本発明を制限するものではない。
る。尚、以下の実施例は単なる例示にすぎず、如何なる
意味においても、本発明を制限するものではない。
実施例１ プラスミドpERI 8602の構築 ｉ）1.6kb,8.3kb断片の調製 BamH I用緩衝液［6mM Tris−HCl（pH7.9）、150mM Na
Cl、6mM MgCl2］100μ中で化学合成したヒトリゾチー
ム遺伝子を含有しているプラスミドpGEL125［ヨシムラ
（K.Yoshimura）前掲］48.5μｇに60UのBamH I（ベーリ
ンガーマンハイム山之内製）を加えて37℃で２時間反応
させたのち、常法通り、冷エタノールを加えてDNAを集
めた。このDNAを、上記BamH I用緩衝液（100μ）中で
40UのXho I（ベーリンガーマンハイム山之内）を加えて
37℃で15分間部分消化したのち、60℃で15分間加熱して
反応を停止させた。この反応液を0.7％アガロース電気
泳動にかけ、1.6kb断片を含むゲルを切り取り、電気泳
動溶出によってゲルから抽出した。
Cl、6mM MgCl2］100μ中で化学合成したヒトリゾチー
ム遺伝子を含有しているプラスミドpGEL125［ヨシムラ
（K.Yoshimura）前掲］48.5μｇに60UのBamH I（ベーリ
ンガーマンハイム山之内製）を加えて37℃で２時間反応
させたのち、常法通り、冷エタノールを加えてDNAを集
めた。このDNAを、上記BamH I用緩衝液（100μ）中で
40UのXho I（ベーリンガーマンハイム山之内）を加えて
37℃で15分間部分消化したのち、60℃で15分間加熱して
反応を停止させた。この反応液を0.7％アガロース電気
泳動にかけ、1.6kb断片を含むゲルを切り取り、電気泳
動溶出によってゲルから抽出した。
同様の方法で48.5μｇのpGEL125を60UのBamH Iで消化
し、常法に従ってエタノールでDNAを沈澱させた。このD
NAにBamH I用緩衝液中で80UのXho Iを37℃で２時間作用
させたのち、前記1.6kb断片と全く同様の方法で、プラ
スミドpGEL125からプロモーター、シグナル配列、およ
びヒトリゾチームコード領域が除去された8.3kbのBamH
I−Xho I制限断片を調製した。
し、常法に従ってエタノールでDNAを沈澱させた。このD
NAにBamH I用緩衝液中で80UのXho Iを37℃で２時間作用
させたのち、前記1.6kb断片と全く同様の方法で、プラ
スミドpGEL125からプロモーター、シグナル配列、およ
びヒトリゾチームコード領域が除去された8.3kbのBamH
I−Xho I制限断片を調製した。
ii）Sma I認識配列を含む合成オリゴマーの調製pGEL125
のヒトリゾチーム遺伝子の３′末端側のXho I切断部位
をSma I切断部位に変換するために、常法に従い、５′T
CGACCCGGG３′を合成した。
のヒトリゾチーム遺伝子の３′末端側のXho I切断部位
をSma I切断部位に変換するために、常法に従い、５′T
CGACCCGGG３′を合成した。
iii）1.6kb断片と合成オリゴマーの連結 ii）で得た合成オリゴマー（100ng）と1.6kb断片（２
μｇ）を20μのライゲーション用緩衝液［50mM Tris
−HCl（pH7.8）、10mM MgCl2、20mMジチオスレイトール
（DTT）、1mM ATP］に溶かし、T4DNAリガーゼ（NEB製）
800Uを加えて14℃で一夜反応させ、DNAを結合させた。
常法に従い、エタノールを加えてDNAを集めたのち、100
μのBamH I用緩衝液に溶かし、36UのBamH Iを加えて3
7℃で１時間反応させ、同様にエタノールを加えてDNAを
集めた。次にこのDNAを50μのSma I用緩衝液［20mM K
Cl、10mM Tris−HCl（pH8.0）、10mM MgCl2、1mM DTT］
に溶かし、21UのSma I（宝酒造製）を加えて30℃で１時
間反応させた。これを0.7％アガロース電気泳動にか
け、常法通り所望の部分を切り出し、電気泳動溶出によ
って1.6kbのBamH I−Sma I断片を得た。
μｇ）を20μのライゲーション用緩衝液［50mM Tris
−HCl（pH7.8）、10mM MgCl2、20mMジチオスレイトール
（DTT）、1mM ATP］に溶かし、T4DNAリガーゼ（NEB製）
800Uを加えて14℃で一夜反応させ、DNAを結合させた。
常法に従い、エタノールを加えてDNAを集めたのち、100
μのBamH I用緩衝液に溶かし、36UのBamH Iを加えて3
7℃で１時間反応させ、同様にエタノールを加えてDNAを
集めた。次にこのDNAを50μのSma I用緩衝液［20mM K
Cl、10mM Tris−HCl（pH8.0）、10mM MgCl2、1mM DTT］
に溶かし、21UのSma I（宝酒造製）を加えて30℃で１時
間反応させた。これを0.7％アガロース電気泳動にか
け、常法通り所望の部分を切り出し、電気泳動溶出によ
って1.6kbのBamH I−Sma I断片を得た。
iv）8.3kb断片と合成オリゴマーの連結 iii）と全く同様にして、１μｇの8.3kb断片と100ng
の合成オリゴマーとを連結したのち、同様にBamH I、お
よびSma Iで処理して電気泳動にかけ8.3kbのBamH I−Sm
a I制限断片を得た。
の合成オリゴマーとを連結したのち、同様にBamH I、お
よびSma Iで処理して電気泳動にかけ8.3kbのBamH I−Sm
a I制限断片を得た。
ｖ）1.6kb BamH I−Sma I断片と8.3kb BamH I−Sma I断
片との連結 iv）で得た8.3kb断片（120ng）と1.6kb断片（360ng）
を100μのライゲーション用緩衝液（（iii）に同じ）
中で800UのT4DNAリガーゼ（NEB製）を加えて14℃一夜反
応させた。その1/5量を用いてE.coli DH1を形質転換
し、プラスミドpERI 8602を得た。
片との連結 iv）で得た8.3kb断片（120ng）と1.6kb断片（360ng）
を100μのライゲーション用緩衝液（（iii）に同じ）
中で800UのT4DNAリガーゼ（NEB製）を加えて14℃一夜反
応させた。その1/5量を用いてE.coli DH1を形質転換
し、プラスミドpERI 8602を得た。
プラスミドpGEL125およびプラスミドpERI 8602の制限
酵素切断地図およびプラスミドpERI 8602の構築模式図
を第１図に示す。
酵素切断地図およびプラスミドpERI 8602の構築模式図
を第１図に示す。
実施例２ M13mp19XhLZMの構築 ｉ）ヒトリゾチーム遺伝子を含むXho I−Sma I断片の調
製 Ｉ断片の調製 実施例１で調製したプラスミドpERI 8602 100ngを実
施例１記載の方法に従ってXho I、Sma Iで切断し、シグ
ナル配列コード領域およびヒトリゾチーム遺伝子を含む
Xho I−Sma I制限断片を調製した。
製 Ｉ断片の調製 実施例１で調製したプラスミドpERI 8602 100ngを実
施例１記載の方法に従ってXho I、Sma Iで切断し、シグ
ナル配列コード領域およびヒトリゾチーム遺伝子を含む
Xho I−Sma I制限断片を調製した。
ii）M13mp19へのXho I制限部位の導入M13mp19の複製型
（RF）（宝酒造製）2.4μｇを30μのHind III用緩衝
液［50mM NaCl、10mM Tris−HCl（pH7.5）、10mM MgC
l2、1mM DTT］中で27UのHind III（ベーリンガーマンハ
イム山之内製）と37℃で２時間反応させたのち、常法通
り冷エタノールを加えてDNAを沈澱させた。
（RF）（宝酒造製）2.4μｇを30μのHind III用緩衝
液［50mM NaCl、10mM Tris−HCl（pH7.5）、10mM MgC
l2、1mM DTT］中で27UのHind III（ベーリンガーマンハ
イム山之内製）と37℃で２時間反応させたのち、常法通
り冷エタノールを加えてDNAを沈澱させた。
一方、常法に従って合成した２本のオリゴマー５′TC
GAGGCCA３′（100ng）および５′AGCTTGGCC（100ng）を
ATPを含まないライゲーション用緩衝液（前出）20μ
中で80℃、５分処理したのち、室温まで徐々に冷却して
二本鎖とした。この反応液に上で得たHind III処理した
M13mp19RF500ngとATPを1mMとなるように加え、14℃で一
夜反応させた。次にこの1/10量をE.coliTG1に感染さ
せ、常法に従いXho I切断部位をもったM13mp19RFを得
た。この５μｇを実施例１、iii）記載の方法でXho Iお
よびSma Iで処理し、エタノールで沈澱させた。
GAGGCCA３′（100ng）および５′AGCTTGGCC（100ng）を
ATPを含まないライゲーション用緩衝液（前出）20μ
中で80℃、５分処理したのち、室温まで徐々に冷却して
二本鎖とした。この反応液に上で得たHind III処理した
M13mp19RF500ngとATPを1mMとなるように加え、14℃で一
夜反応させた。次にこの1/10量をE.coliTG1に感染さ
せ、常法に従いXho I切断部位をもったM13mp19RFを得
た。この５μｇを実施例１、iii）記載の方法でXho Iお
よびSma Iで処理し、エタノールで沈澱させた。
iii）M13mp19XhLZMの構築 ｉ）で調製したXho I−Sma I断片300ngとii）で調製
したM13mp19を含む大きいXho I−Sma I制限断片100ngと
を50μのライゲーション用緩衝液（前出）中400UのT4
DNAリガーゼ（NEB製）と14℃で一夜反応させ、その1/5
量をE.coliTG1に感染させ、M13mp19XhLZMRFを得た。
したM13mp19を含む大きいXho I−Sma I制限断片100ngと
を50μのライゲーション用緩衝液（前出）中400UのT4
DNAリガーゼ（NEB製）と14℃で一夜反応させ、その1/5
量をE.coliTG1に感染させ、M13mp19XhLZMRFを得た。
M13mp19XhLZMの構築模式図を第２図に示す。
実施例３ 変異ヒトリゾチーム遺伝子の調製 変異ヒトリゾチーム遺伝子の調製には、オリゴヌクレ
オチド−デイレクテッド・インビトロ、ムタゲネシスシ
ステム（アマーシャム社製キット）を用いた。また、操
作方法はアーマシャム社製キット用マニュアルに従っ
た。
オチド−デイレクテッド・インビトロ、ムタゲネシスシ
ステム（アマーシャム社製キット）を用いた。また、操
作方法はアーマシャム社製キット用マニュアルに従っ
た。
ｉ）Gln86およびAla92をAspに変換するためのオリゴマ
ーの合成 常法に従って次のオリゴマーを合成した。
ーの合成 常法に従って次のオリゴマーを合成した。
（Ｉ）Gln86→Asp,Ala92→Asp Ｘは変更後の塩基を示す。
ii）アニーリングおよびライゲーション 実施例２で得たM13mp19XhLZMの単鎖DNA10μｇを含む
溶液（13μ）、５′をリン酸化したオリゴマー（Ｉ）
と（II）（〜1.6pmol/μ）（５μ）、緩衝液Ｉ（７
μ）および水（４μ）を混合し、80℃で３分間処理
したのち、室温で30分間放置した。この反応液にMgCl2
液（10μ）、ヌクレオチド混液１（38μ）、水（12
μ）、クレノーフラグメント（12U）、T4DNAリガーゼ
（12U）を加え、14℃で一夜反応させた。反応液をニト
ロセルロースフィルターで濾過し、未反応の単鎖DNAを
除去したのち、常法に従いエタノールでDNAを沈澱さ
せ、50μの緩衝液２に溶解した。
溶液（13μ）、５′をリン酸化したオリゴマー（Ｉ）
と（II）（〜1.6pmol/μ）（５μ）、緩衝液Ｉ（７
μ）および水（４μ）を混合し、80℃で３分間処理
したのち、室温で30分間放置した。この反応液にMgCl2
液（10μ）、ヌクレオチド混液１（38μ）、水（12
μ）、クレノーフラグメント（12U）、T4DNAリガーゼ
（12U）を加え、14℃で一夜反応させた。反応液をニト
ロセルロースフィルターで濾過し、未反応の単鎖DNAを
除去したのち、常法に従いエタノールでDNAを沈澱さ
せ、50μの緩衝液２に溶解した。
iii）変異DNAを含むプラスミドによる大腸菌の形質転換 ii）で得たDNA溶液50μの内10μに、65μの緩
衝液３と5UのNci Iを加え37℃で90分間反応させて変異
していないDNAにニックを入れた。反応後さらに500mM N
aCl（12μ）、緩衝液４（10μ）、エキソヌクレア
ーゼIII（50U）（２μ）を加えて、37℃で30分間反応
させ、ニックを入れたDNAを消化した。
衝液３と5UのNci Iを加え37℃で90分間反応させて変異
していないDNAにニックを入れた。反応後さらに500mM N
aCl（12μ）、緩衝液４（10μ）、エキソヌクレア
ーゼIII（50U）（２μ）を加えて、37℃で30分間反応
させ、ニックを入れたDNAを消化した。
次に70℃で15分間加熱して酵素を失活させた。冷却
後、ヌクレオチド混液２（13μ）、MgCl2液（５μ
）、DNAポリメラーゼＩ（3U）、T4DNAリガーゼ（2U）
を加えて14℃で３時間反応させた。この反応液10〜20μ
を用い、E.coliTG1を形質転換した。
後、ヌクレオチド混液２（13μ）、MgCl2液（５μ
）、DNAポリメラーゼＩ（3U）、T4DNAリガーゼ（2U）
を加えて14℃で３時間反応させた。この反応液10〜20μ
を用い、E.coliTG1を形質転換した。
iv）変異DNAの調製と変異の確認 iii）で得た形質転換体をYT寒天培地（バクトトリプ
トン8g、バクト酵母エキス5g、NaCl5g、寒天15g、水１
）にまき、プラークを生じさせた。プラークを採取
し、E.coliTG1に感染させ、これをYT培地で37℃におい
て一夜、液体培養し、培養上清を集めた。この上清1ml
にPEG/NaCl（20％ポリエチレングリコール6000、2.5MNa
Cl）200μを加え、よく混合して15分間放置したの
ち、遠心分離して上清を除去した、沈澱にTE緩衝液（10
mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0）（100μ）および、
TE緩衝液飽和フェノール（50μ）を加えてよく攪拌し
たのち、遠心分離し、水層を採取した。この水層に冷エ
タノールを加えて、単鎖DNAを沈澱させた。この単離DNA
を鋳型としてジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法によ
って塩基配列を決定し、目的通り変異したDNAを得た。
トン8g、バクト酵母エキス5g、NaCl5g、寒天15g、水１
）にまき、プラークを生じさせた。プラークを採取
し、E.coliTG1に感染させ、これをYT培地で37℃におい
て一夜、液体培養し、培養上清を集めた。この上清1ml
にPEG/NaCl（20％ポリエチレングリコール6000、2.5MNa
Cl）200μを加え、よく混合して15分間放置したの
ち、遠心分離して上清を除去した、沈澱にTE緩衝液（10
mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0）（100μ）および、
TE緩衝液飽和フェノール（50μ）を加えてよく攪拌し
たのち、遠心分離し、水層を採取した。この水層に冷エ
タノールを加えて、単鎖DNAを沈澱させた。この単離DNA
を鋳型としてジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法によ
って塩基配列を決定し、目的通り変異したDNAを得た。
実施例４ プラスミドpERI 8811の構築 実施例３、iv）で得た変異DNAをE.coli TG1から常法
によって調製したのち、実施例１、iii）、記載の方法
に従ってXho IおよびSma Iで処理して、シグナル配列の
コード領域と変異ヒトリゾチーム遺伝子とを含むXho I
−Sma I制限断片（ａ）を得た。一方プラスミドpERI 86
02を同様にXho IおよびSma Iで処理したのち、常法通り
電気泳動によって9.5kbのXho I−Sma I制限断片（ｂ）
を単離した。
によって調製したのち、実施例１、iii）、記載の方法
に従ってXho IおよびSma Iで処理して、シグナル配列の
コード領域と変異ヒトリゾチーム遺伝子とを含むXho I
−Sma I制限断片（ａ）を得た。一方プラスミドpERI 86
02を同様にXho IおよびSma Iで処理したのち、常法通り
電気泳動によって9.5kbのXho I−Sma I制限断片（ｂ）
を単離した。
次いで、これらのDNA断片（ａ）（ｂ）各10ngと30ng
を20μのライゲーション用緩衝液中で実施例１、ii
i）と同様に反応させて連結し、このライゲーション反
応混合物でE.coli DH1を形質転換した。形質転換体か
ら、変異ヒトリゾチーム遺伝子を含有しているプラスミ
ド数種を得、その一つをpERI 8811と命名した。プラス
ミドpERI 8811の構築模式図を第３図に示す。
を20μのライゲーション用緩衝液中で実施例１、ii
i）と同様に反応させて連結し、このライゲーション反
応混合物でE.coli DH1を形質転換した。形質転換体か
ら、変異ヒトリゾチーム遺伝子を含有しているプラスミ
ド数種を得、その一つをpERI 8811と命名した。プラス
ミドpERI 8811の構築模式図を第３図に示す。
実施例５ 酵母形質転換体の調製 実施例４で得た発現プラスミドpERI 8811を用い、ヒ
ネンらの方法（前出）に従い、S.セレビシエAH22R-を形
質転換し、形質転換体S.セレビシエAH22R-/pERI 8811を
得た。この菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に
受託番号FERM P−10577で寄託されている（寄託日：平
成１年２月27日）。
ネンらの方法（前出）に従い、S.セレビシエAH22R-を形
質転換し、形質転換体S.セレビシエAH22R-/pERI 8811を
得た。この菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に
受託番号FERM P−10577で寄託されている（寄託日：平
成１年２月27日）。
実施例６ S.セレビシエAH22R-/pERI 8811の培養 実施例５で得た形質転換体S.セレビシエAH22R-/pERI
8811を、試験管中のバークホルダー（Burk holder）
［アメリカン・ジャーナル・オブ・ボタニー（Amer.J.B
ot.）30、206（1943）］の改変培地III（１当たりKH2
PO40.4g、グルコース10g、アラパラギン5g、シュークロ
ース80gを含有）5mlに接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。得られた培養液1mlをそれぞれ上記培地III4mlを含
む試験管へ移し、30℃で１日振盪培養した。この培養液
2mlを上記培地III18mlを含む200ml容三角フラスコに移
し、30℃で振盪培養し、72時間後に培養液を採取した。
8811を、試験管中のバークホルダー（Burk holder）
［アメリカン・ジャーナル・オブ・ボタニー（Amer.J.B
ot.）30、206（1943）］の改変培地III（１当たりKH2
PO40.4g、グルコース10g、アラパラギン5g、シュークロ
ース80gを含有）5mlに接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。得られた培養液1mlをそれぞれ上記培地III4mlを含
む試験管へ移し、30℃で１日振盪培養した。この培養液
2mlを上記培地III18mlを含む200ml容三角フラスコに移
し、30℃で振盪培養し、72時間後に培養液を採取した。
実施例７ 分泌された変異型ヒトリゾチームの精製 実施例５で得た形質転換体S.セレビシエAH22R-/pERI
8811を実施例６に示した培地5mlを含む試験管３本に接
種し、30℃で３日間振盪培養した。上記培地18mlを含有
する200ml容三角フラスコを５本用意し、その各々に、
上の培養液2mlを移し、30℃で１日振盪培養した。次に
上記培地200mlを含有する１容三角フラスコを５本用
意し、その各々にこの培養液20mlを移し、30℃で４日間
培養した。この培養液を遠心分離機にかけ、上清と菌体
を分離した。この上清（約１）を50mMリン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH6.5）で平衡化した陽イオン交換樹脂（Ind
ion）カラム（0.7cm×15cm）に吸着させ、同緩衝液30ml
で洗浄後、0.5M NaClを含む同緩衝液で溶出した。溶出
液を1mlずつ分取し、各フラクションについて実施例８
に従ってリゾチーム活性を測定した。リゾチーム活性が
最大となるフラクションを取り、これを高速液体クロマ
トグラフィー（Asahipak502C）により、さらに精製し
た。50mMリン酸ナトリウム緩衝液を含む0.6M硫酸ナトリ
ウム０−30％の直線濃度勾配により30分間溶出を行い、
保持時間20.831分に現れる280nmの吸収ピークを分取
し、これをD86/92とした。この溶出パターンを第４図に
示した。
8811を実施例６に示した培地5mlを含む試験管３本に接
種し、30℃で３日間振盪培養した。上記培地18mlを含有
する200ml容三角フラスコを５本用意し、その各々に、
上の培養液2mlを移し、30℃で１日振盪培養した。次に
上記培地200mlを含有する１容三角フラスコを５本用
意し、その各々にこの培養液20mlを移し、30℃で４日間
培養した。この培養液を遠心分離機にかけ、上清と菌体
を分離した。この上清（約１）を50mMリン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH6.5）で平衡化した陽イオン交換樹脂（Ind
ion）カラム（0.7cm×15cm）に吸着させ、同緩衝液30ml
で洗浄後、0.5M NaClを含む同緩衝液で溶出した。溶出
液を1mlずつ分取し、各フラクションについて実施例８
に従ってリゾチーム活性を測定した。リゾチーム活性が
最大となるフラクションを取り、これを高速液体クロマ
トグラフィー（Asahipak502C）により、さらに精製し
た。50mMリン酸ナトリウム緩衝液を含む0.6M硫酸ナトリ
ウム０−30％の直線濃度勾配により30分間溶出を行い、
保持時間20.831分に現れる280nmの吸収ピークを分取
し、これをD86/92とした。この溶出パターンを第４図に
示した。
実施例８ 精製変異型ヒトリゾチームの分析 実施例７で精製した変異型ヒトリゾチーム精製標品に
ついて比活性を測定した。測定はpH5.5の0.1M酢酸緩衝
液中、グリコールキチンを基質として行った。タンパク
質の定量は、ヒトリゾチームの280nmにおける吸光度を
測定した行った。その結果、天然型ヒトリゾチームの比
活性を100としたとき、変異型ヒトリゾチームの比活性
は、150％であった。
ついて比活性を測定した。測定はpH5.5の0.1M酢酸緩衝
液中、グリコールキチンを基質として行った。タンパク
質の定量は、ヒトリゾチームの280nmにおける吸光度を
測定した行った。その結果、天然型ヒトリゾチームの比
活性を100としたとき、変異型ヒトリゾチームの比活性
は、150％であった。
次に、この精製した変異型ヒトリゾチームについて全
アミノ酸組成の決定を行った。全アミノ酸組成の決定
は、精製標品0.1mgを用い、６規定塩酸中、110℃、22時
間加水分解を行い、アミノ酸自動分析計（日立733型）
により自動的に行った。
アミノ酸組成の決定を行った。全アミノ酸組成の決定
は、精製標品0.1mgを用い、６規定塩酸中、110℃、22時
間加水分解を行い、アミノ酸自動分析計（日立733型）
により自動的に行った。
結果を以下の表１に示す。
また、この精製した変異型ヒトリゾチームについてカ
ルシウム含有量を決定した。カルシウム含有量の決定
は、原子吸光分析法により行った。
ルシウム含有量を決定した。カルシウム含有量の決定
は、原子吸光分析法により行った。
結果を以下の表２に示す。
実施例９ 精製変異型ヒトリゾチームの安定生の測定 実施例７で精製した変異型ヒトリゾチーム精製標品の
熱に対する安定性の測定は、温度に対する酵素活性の依
存性を測定することにより行った。pH5.5の0.1M酢酸緩
衝液中、グリコールキチンに対する活性を、30−100℃
の範囲で測定した結果、天然型リゾチームは、温度の上
昇とともに、活性が約70℃まで増加し、約80℃で失活し
たが、変異型ヒトリゾチームは約80℃まで活性が上昇し
つづけ、約90℃で失活した。したがって、熱に対する抵
抗性が、約10℃増したことがわかった。このとき、変異
型リゾチームは、天然型リゾチームの40℃の活性を100
とすると、80℃で540という高い活性を示した。結果を
第５図に示した。
熱に対する安定性の測定は、温度に対する酵素活性の依
存性を測定することにより行った。pH5.5の0.1M酢酸緩
衝液中、グリコールキチンに対する活性を、30−100℃
の範囲で測定した結果、天然型リゾチームは、温度の上
昇とともに、活性が約70℃まで増加し、約80℃で失活し
たが、変異型ヒトリゾチームは約80℃まで活性が上昇し
つづけ、約90℃で失活した。したがって、熱に対する抵
抗性が、約10℃増したことがわかった。このとき、変異
型リゾチームは、天然型リゾチームの40℃の活性を100
とすると、80℃で540という高い活性を示した。結果を
第５図に示した。
また、タンパク質分解酵素（プロナーゼ）によるリゾ
チームの消化実験を行い変異型リゾチームの消化安定性
を測定した。pH7.1の条件で、リゾチーム10μｇをプロ
ナーゼ10μｇで消化した結果、残存酵素活性の半減期
（t1/2）は、天然型リゾチームでは56分、変異型リゾチ
ームでは70分であった。したがって、変異型リゾチーム
は、酵素消化に対する安定性も増加したことがわかっ
た、結果を、第６図に示した。
チームの消化実験を行い変異型リゾチームの消化安定性
を測定した。pH7.1の条件で、リゾチーム10μｇをプロ
ナーゼ10μｇで消化した結果、残存酵素活性の半減期
（t1/2）は、天然型リゾチームでは56分、変異型リゾチ
ームでは70分であった。したがって、変異型リゾチーム
は、酵素消化に対する安定性も増加したことがわかっ
た、結果を、第６図に示した。
第１図はプラスミドpERI 8602の構築模式図並びにプラ
スミドpGEL 125およびプラスミドpERI 8602の制限酵素
切断地図、第２図はM13mp18XhLZMの構築模式図、第３図
はプラスミドpERI 8811の構築模式図、並びに制限酵素
切断地図、第４図は高速液体クロマトグラフィーによる
変異タンパク質の溶出状態を示すグラフ、第５図は天然
型および精製変異型ヒトリゾチームの活性の温度依存性
を示すグラフ、第６図はタンパク質分解酵素（プロナー
ゼ）によるリゾチームの消化実験から得られた、天然型
および変異型リゾチームの残存酵素活性の時間変化を示
したグラフ、第７図は天然型ヒトリゾチームのアミノ酸
配列およびそれをコードしているDNAのヌクレオチド配
列を示す模式図である。
スミドpGEL 125およびプラスミドpERI 8602の制限酵素
切断地図、第２図はM13mp18XhLZMの構築模式図、第３図
はプラスミドpERI 8811の構築模式図、並びに制限酵素
切断地図、第４図は高速液体クロマトグラフィーによる
変異タンパク質の溶出状態を示すグラフ、第５図は天然
型および精製変異型ヒトリゾチームの活性の温度依存性
を示すグラフ、第６図はタンパク質分解酵素（プロナー
ゼ）によるリゾチームの消化実験から得られた、天然型
および変異型リゾチームの残存酵素活性の時間変化を示
したグラフ、第７図は天然型ヒトリゾチームのアミノ酸
配列およびそれをコードしているDNAのヌクレオチド配
列を示す模式図である。
Claims (7)
- 【請求項１】天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第
86位のグルタミンおよび第92位のアラニンがアスパラギ
ン酸で置き換えられたポリペプチドをコードしている変
異ヒトリゾチーム遺伝子。 - 【請求項２】天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第
86位のグルタミンおよび第92位のアラニンがアスパラギ
ン酸で置き換えられたポリペプチドをコードしている変
異ヒトリゾチーム遺伝子と、シグナルペプチドをコード
しているヌクレオチド配列とを含有し、真核生物内で自
律的に複製可能な変異型ヒトリゾチーム発現ベクター。 - 【請求項３】プラスミドpERI 8811である第２項記載の
発現ベクター。 - 【請求項４】第２項に記載の発現ベクターを用いて宿主
を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、培養液中
に分泌されたヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を
分離し、所望により精製することからなる、天然型ヒト
リゾチームの第86位のグルタミンおよび第92位のアラニ
ンがアスパラギン酸で置き換えられた変異型ヒトリゾチ
ームの製造方法。 - 【請求項５】宿主がサッカロマイセス・セレビシエAH22
R-である第４項記載の方法。 - 【請求項６】天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第
86位のグルタミンおよび第92位のアラニンがアスパラギ
ン酸で置き換えられている変異型ヒトリゾチーム。 - 【請求項７】リゾチームに金属結合部位を構築すること
により熱安定性および酵素消化に対する安定性を向上さ
せる方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7752689A JP2533641B2 (ja) | 1989-03-29 | 1989-03-29 | 変異型ヒトリゾチ―ム |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7752689A JP2533641B2 (ja) | 1989-03-29 | 1989-03-29 | 変異型ヒトリゾチ―ム |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02255091A JPH02255091A (ja) | 1990-10-15 |
| JP2533641B2 true JP2533641B2 (ja) | 1996-09-11 |
Family
ID=13636418
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7752689A Expired - Lifetime JP2533641B2 (ja) | 1989-03-29 | 1989-03-29 | 変異型ヒトリゾチ―ム |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2533641B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1252257C (zh) * | 2001-03-02 | 2006-04-19 | 复旦大学 | 人类g型溶菌酶、其编码序列、制法及用途 |
| CN100469391C (zh) * | 2004-06-10 | 2009-03-18 | 安米 | 人溶菌酶在制备治疗痤疮的药物中的应用 |
-
1989
- 1989-03-29 JP JP7752689A patent/JP2533641B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02255091A (ja) | 1990-10-15 |
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