JPH02117387A - 変異型ヒトリゾチーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、組換えＤＮＡ技術による変〃′、型ヒトリゾ
チームの製造に関するものて」うる。さらに詳しくは、
本発明は、天然型ヒトリゾチーム（以下、単にヒトリゾ
チームともいう）のアミノ酸配列の第１１０位のバリン
がアラニンて置き換えられた変異型ヒトリゾチームをコ
ートしているＨヒトリゾチーム遺伝子、該遺伝子を真核
性宿主内で発現させるための発現ベクター、践発現ベク
ターで形質転換された真核性宿主細胞、該形質転換体を
用いてヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を製造す
る方法、並びにこのようにして製造された変異型ヒトリ
ゾチームに関するものである。

従来技術および発明が解決すべき課題 リゾチームはヒトをも含めた動物の各種組織、分泌液、
卵白等に広く分布しており、一部の植物にも見出されて
いる酵素であって、細菌細胞壁のペプチドグリカンに作
用してＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサ
ミンのβ−１，４結合を加水分解することにより溶菌作
用を現す。

この溶菌作用により生成される少糖を同定することによ
って、細胞壁の化学構造に関する手懸かりが得られるの
で、リゾチームは、細菌学、蛋白質化学、生化学等、様
々な研究分野において有用な酵素である。リゾチームは
ニワトリの卵白から比較的容易に高純度で単離されるた
め、ニワトリリ／チームが様々な分野でｆＩＩ用されて
いる。例えば、食品保存の目的で、チーズ、ソーセージ
、水産食品などに添加されたり、牛乳のヒト母乳化の目
的で使用されている池、止血、抗炎症、組織再生、抗腫
瘍活性などの薬理活性を有することも知られており、消
炎酵素剤として市販されている。

しかしながら、上記のニワトリ卵白由来のりゾチームを
含有する物質には不都合な点もあることが指摘されてい
る。特に医薬として用いると、異種タンパクに対する免
疫応答によると思われる発疹、発赤などの過敏症状がし
ばしば、副作用として発現する。従って、ヒトを対象と
する医薬の場合には、ヒト起源のリゾチームを使用する
ことが好ましく、ヒトリゾチームの安定した供給が待た
れている。また、リゾチームの生理学的作用に関する研
究を押し進めるためにも、ヒトリゾチームの大量供給が
必要である。

しかしながら、ヒトの人乳や涙液から単離、精製し得る
ヒトリゾチームの量は僅かである。従って、上記の治療
、あるいは生体内機能に関する研究推進のためにも、遺
伝子組換え技術を利用したヒトリゾチーム製造手段の確
立が強く望まれている。

このような状況の下、遺伝子組換え技術を利用してヒト
リゾチームを生産し、安定供給する試みがなされてきた
。ヒトリゾチームタンパク質は１３０個のアミノ酸から
なり、その配列は公知である［日本生化学全編、生化学
データブ・７り巻１．　１８９頁（１９７９）ｊ。この
アミノ酸配列に基いて、ヒトリゾチームをコードするＤ
ＮＡが化学合成されている［１　ｋｅｈａｒａ、　Ｍ、
ら、ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・プリ
テン（Ｃｈｅｍ、　Ｐ　ｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、）３４
．２２０２（＋９８６）］。従って、この公知のＤＮＡ
塩基配列を利用してヒトリゾチーム発現ベクターを構築
し、適当な宿主に導入して？ＩＪられた形質転換体を培
養することにより、大型にヒトリゾチームを得ることか
できると考えられる。例えば、ムラキ（Ｍｕｒａｋｉ）
らは大腸菌を宿主としてヒトリゾチームの直接発現を試
みた［Ｍｕｒａｋｉ、　Ｍ、ら、アグリカルチュラル・
アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａ　ｇｒｉｃ
、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　）赳、７１３（１９８６
）］。しかしながら、直直接税ではヒトリゾチーム活性
を有するタンパク質を得ることができなかった。ジガミ
らは、酵母を宿主とする分泌系発現で、活性のあるヒト
リゾチームを得た［　Ｊ　ｉｇａｍｉ、　Ｙ　、　　ら
、ジーン（Ｇｅｎｅ）土Ｊ１２７３（１９８６）コが、
生産量（菌体内外の総和）が少ない上、生産量中に占め
る分泌量の比率は５５〜６５％程度であって、十分なも
のではなかった。

本発明者らは、ヒトリゾチーム活性を有するタンパク質
を効率良く生産することを目的として、卵白リゾチーム
のシグナルペプチド（こ修飾を施し、形質転換された酵
母宿主内で発現された該タンパク質を効率よく分泌させ
るリーダー配列を得た（特願昭６２−０６９７６４号お
よび特願昭６２−６９７６５号）。

一方では、本発明者らは、天然型ヒトリゾチームのアミ
ノ酸配列に修飾を施し、活性の高い変異型ヒトリゾチー
ムを得ることを目的として研究を重ね、第７７位と第９
５位のシスティンをアラニンで置き換えることにより、
分泌効率が高く、生産性の増大された変異型ヒトリゾチ
ームを得ることに成功した（特願昭６２−２４５２８４
号）。

さらに、本発明者らは、より高活性の変異型ヒトリゾチ
ームを安定して得るために継続して検討をｍねできたが
、その過程において、１１０位のバリンが酵素活性に及
ぼす影響に着目するに至った。即ち、１１０位バリンを
他のアミノ酸に変えると、基質との結合の強さを変化さ
せずに、比活性のみを変化させ得るということを予測さ
せる実験データーを得た。この結果に基き、１１０位バ
リンを様々なアミノ酸置換し、酵素活性に及ぼす影響を
調べた。そのような置換による突然変異誘発は、遺伝子
組換え技術に係る分野においては通常の技術であり、当
業者は、既知の方法で、容易に行うことができる。従っ
て、どのようなアミノ酸を用いるかが最も重要な課題で
ある。本発明は、目的に適ったアミノ酸を見出し、それ
を用いて高活性な変異型ヒトリゾチームを得ることに成
功した結果、完成されたものである。

課題を解決するための手段 即ち、本発明は、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列
の第１１０位のバリンがアラニンで置き換えられている
ポリペプチドをコードしている変異ヒトリゾチーム遺伝
子を提供するものである。

また本発明は、変異りゾチーム遺伝子とシグナルペプチ
ドをコードしているヌクレオチド配列とを含有し、真核
生物内で自律的に複製可能な発現ベクターを提供するも
のである。

さらに本発明は、上記発現ベクターで形質転換され、変
異型ヒトリゾチームを産生し、分泌し得る形質転換体、
並びに、該形質転換体を培養し、培養液中に分泌された
ヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を分離し、所望
により精製することからなる変異型ヒトリゾチームの製
造方法、およびこのようにして製造された変異型ヒトリ
ゾチームを提供するものである。

本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子の調製、該遺伝子を
含有する発現ベクターの構築、該発現ベクターによる宿
主細胞の形質転換、および得られた形質転換体を用いる
変異型ヒトリゾチームの製造は、全て本出願人の出願に
係る特願昭６２−２４５２８４号および特願昭６３−２
２６８７３号に開示した方法に準じて行われた。

即ち、第１図に示すように、天然のヒトリゾチームのア
ミノ酸配列をコードしている合成遺伝子を含有する公知
のプラスミドｐＧＥＬ１２５［ヨシムラ（Ｋ、　Ｙｏｓ
ｈｉｍｕｒａ）バイオケミカル・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　
１ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｆｆｉｍｕｎ、　）　
ｌ　４５．７１２（１９８７）］から、シグナルペプチ
ドの上流にのみＸｈ。

Ｉ認識部位を有するプラスミドｐＥＲＩ　　８６０２を
得る。

次いで、プラスミドｐＥＲＩ　　８６０２から、シグナ
ルペプチドとヒトリゾチームとをコードしているヌクレ
オチド配列を含んだＸｈｏｌ　−３ＩＩｌａｌ断片を切
り出し、これを、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ［Ｍ１３ｍｐファ
ージＤＮＡの複製型（ＲＦ）］にＸｈｏｌ認識部位を挿
入したファージＤＮＡの大きい方のＸｈｏｌ−３ｍａｌ
断片と連結（ライゲーション）することにより、シグナ
ルペプチドとヒトリゾチームとをコードしている一本鎖
ファージＤＮＡである、Ｍ　１３ｍｐｌ　８　ＸｈＬ　
ＺＭを得る（第２図参照）。

このＭ１３ｍｐ１８ＸｈＬＺＭのＥｃｏＲＩ　−Ｘｈｏ
［断片を、ｐＢＲ３２２ＸのＥｃｏＲＩ　−Ｘｈｏｌ断
片とライゲーションしてｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ
）を構築する。ＰＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）の構築
模式図を第３図に示す。

一方、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第１１０
位のバリンがアラニンで置換されたアミノ酸配列部分を
コードしている２本鎖合成オリゴマーを合成し、該合成
オリゴマーを、ｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）のＢａ
ｍＨｌ−Ｃ１ａｌ断片とライゲーションしてｐＢＲ３２
２ＸｈＬＬＺＭ（Ａｌａ目０）を得る。ｐＢＲ３２２Ｘ
ｈＬＺＭ（Ａｌａ”’°）の構築模式図を第４図に示す
。

このＤＮＡからシグナルペプチドと変異型ヒトリゾチー
ムをコードしているＸｈｏｌ　−３ｍａｌ断片を切り出
し、上記プラスミドｐＥＲＩ　　８６０２の９．５ｋｂ
　Ｘｈｏｌ−５ｍａｌ断片とライゲーションし、変異型
ヒトリゾチーム発現ベクター、プラスミドｐＥＲＩ　　
８８５２を構築する。プラスミドｐＥＲ＋　　８８５２
の構築模式図、並びに制限酵素切断地図を第５図に示す
。

以上に概説した一連の操作における個々の操作は当業者
によ（知られている。例えば、ＤＮＡのクローニング等
における大腸菌の形質転換は、シーエン（Ｃｏｈｅｎ）
らの方法［Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ　、　Ｎ　　ら、プロシー
ジング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ）６９．２１１０（１９７２）］によって行うこと
ができる。大腸菌宿主としてはＥ、ｃｏｌｉ２９４、Ｅ
、ｃｏｌｉＤＨｌ、　Ｅ、ｃｏｌｉＷ３１１０、Ｅ、ｃ
ｏｌｉＣ６００などを用いることができる。

また、形質転換体から、所望の遺伝子が挿入されたプラ
スミドＤＮＡを単離するには、アルカリ抽出法［Ｂ　ｉ
　ｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ、Ｃ、およびＤｏｌｙ、　Ｊ−、
ヌクレイツク・アシ、ズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　）７．１５１３（１９７９）］等
を利用することができる。次いで、プラスミドＤＮＡを
適当な制限酵素で処理することによって、挿入された該
遺伝子を切り出し、たとえばアガロースゲル電気泳動あ
るいはポリアクリルアミド電気泳動によってこれを単離
する。これらの一連の操作は公知であり、文献、例えば
［モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｃｔｏｎｉｎｇ）（１９８２）、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ　ｐｒ
ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｊに詳し
く記載されている。

ＤＮＡの化学合成は、たとえばｃ　ｒｃａらの方法［Ｃ
ｒｅａ、Ｒ，ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵＳＡ）７５．７６５（１９７
８）］などに従って行うことができる。

さらに、ＤＮＡの所望の部位に、特異的に変異を起こさ
せるためには、市販のキット（例えばアマ−ジャム社製
キットなど）が用いられ、その配列の確認には、ジデオ
キシヌクレオチド合成鎖停止法［Ｓ　ａｎｇｅｒ、　Ｆ
　、　　ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７４．５４６３（１９７
７）］が用いられる。

本発明の発現プラスミドは、真核細胞内で自律的に複製
可能な発現ベクター群の内から選択されたベクターのプ
ロモーターの下流に、シグナルペプチドをコードしてい
る遺伝子と変異ヒトリゾチーム遺伝子を連結させて挿入
することにより組立てられる。本明細書では、ＧＬＤプ
ロモーターヲ用い、天然型ヒトリゾチームをコードして
いる発現プラスミドｐＥＲＩ　　８６０２を使用して本
発明の発現プラスミドの構築例を示したが、その他、プ
ラスミドｐＰＨＯ１７、ｐｃ　Ｄ　Ｘ　［Ｏｋａｙａｍ
ａ、　ＨおよびＢｅｒｇ、Ｐ、モレキュラー・アンド・
セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅｌ　１．　Ｂ
　ｉｏｌ、　）　３．２８０（１９８３）］、ｐＫＳＶ
−１ｏ（ファルマシア社製）なども利用し得る。

酵母宿主の場合には、プロモーターとして、たとえばＰ
　Ｈ０５プロモーター、ＧＬＤプロモータ、ＰＧＫプロ
モーター、Ａ　Ｄ　ＨプロモーターＰＨ０８１プロモー
ター、ＧＡＬＩプロモーターＧＡＬＩＯプロモーターな
どが、動物細胞宿主を用いた場合には、プロモーターと
して、たとえば５Ｖ４Ｑ初期遺伝子プロモーター、メタ
ロチオネインプロモーター、ヒートショソタブロモータ
ーなどがそれぞれ利用できる。なお発現にエンハンサ−
の利用も効果的である。

本発明のプラスミドｐＥＲ＋　　８８５２は、酵母宿主
内で変異型ヒ）　ＩＪゾチームを発現させ、分泌させる
のに好適である。とくに好ましい宿主はサッカ０？イセ
ス・セレビシェ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａ　Ｈ２２Ｒ−である。

本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子を、動物細胞用ベク
ターに挿入することにより、マウスＬｔ（Ｅｌ胞、チャ
イシーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ）、さらには他の
真核細胞を宿主として用い得る。

真核細胞の形質転換方法は当業者既知であり、例えば酵
母の形質転換は、ヒ不ン（Ｈｉｎｎｅｎ）らの方法［プ
ロシージンゲス・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンス（Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎ　ａｔ　１．ΔＣ
ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７５Ｓ　１９２７（１９７８）
］により、また、真核細胞の形質転換は、「蛋白質・核
酸・酵素・２８巻、１９８３年、“組み換え遺伝子の細
胞への導入と発現”（共立出版）」記載の方法で行うこ
とができる。

形質転換体の培養も、当業者既知の方法のいずれを用い
ても行うことができる。

酵母を使用する場合、培地としては、例えばバ−クホル
ダー（Ｂ　ｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地［ボスチャン
（Ｂｏｓｔｉａｎ、　Ｋ、　Ｌ、）ら、プロシージンゲ
ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンスＵＳＡ、７ヱ、４５０５（１９８０）コが挙げられ
る。

培養は通常１５℃〜４０°Ｃ１好ましくは２４℃〜３７
°Ｃで１０〜１４４時間、好ましくは２４〜９６時間行
い、必要に応じて通気や攪拌を加えてもよい。

動物細胞などの真核生物細胞を宿主とした形質転換体を
使用する場合には、培地として例えばイーグル（Ｅ　ａ
ｇｌｅ）のＭ　Ｅ　Ｍ　［Ｈ、Ｅ　ａｇｌｅ、サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１旦０，４３２（＋　９５９）］
、ダルベツコ（Ｄ　ｕ　１ｂｅｃｃｏ）の改良イーグル
培地（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕ
Ｉｌｌ）［Ｏｒｇａｄ　ＬａｕｂおよびＷｉｌｌｉａｍ
Ｊ　、　Ｒｕｔｔｅｒ、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｓ、）２
５８，６０４３（１９８３）］などが挙げられる。培養
は通常３０〜４２°Ｃ１好ましくは３５℃〜３７℃で約
１〜１０日間行う。

培養終了後、当業者既知の方法で細胞と上清とを分離す
る。本発明の発現ベクターによれば、生成した変異型ヒ
トリゾチームは効率良く分泌されるので、上清から得ら
れるが、細胞内に残存する場合には、当分野における通
常の方法、例えば超音波破砕法、フレンチプレスなどを
利用した破砕法、摩砕などの機械的破砕法、細胞溶解酵
素による破砕法などにより細胞を破砕した後抽出する。

さらに必要ならば、トリトン−Ｘ１００、デオキシシー
レートなどの界面活性剤を加え、産生された変異型ヒト
リゾチームを抽出する。得られた変異型ヒトリゾチーム
は、通常のタンパク質精製法、例えば塩析、等電点沈澱
、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，ＦＰＬＣ等）などに従
って精製することができる。

このようにして得られた形質転換体培養物から分離した
培養上清並びに菌体中のヒトリゾチームを精製単離し、
その活性を後述のアッセイ法で測定し、比活性を求めた
ところ、天然型のヒトリゾチームをコードしている発現
ベクターを用いて調製された形質転換体の場合と比較す
ると、本発明の変異型ヒトリゾチーム形質転換体は、従
来のものよりも高い比活性を有するタンパク質を生産す
ることが分かった。

即ち、本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子を含んだ発現
ベクターを適当な宿主に導入し、得られた形質転換体を
適当な条件下で培養し、培養上清のヒトリゾチーム活性
を有するタンパク質を単離し、所望により常法にしたが
って精製することにより、容易かつ簡便に一定した、高
活性の、ヒトリゾチーム活性を有するタンパク質（変異
型ヒトリゾチーム）を得ることができる。

以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。

尚、以下の実施例は単なる例示にすぎず、如何なる意味
においても、本発明を制限するものではない。

実ｍ例１　クローニングベクターｐＢＲ３２２Ｘの構築 大腸菌ベクターｐＢＲ３２２（５μｇ）に制限酵素Ｂａ
１ｌ（１，５ユニツト）を加え、４０ａ（ｌの反応液［
１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１０ｍ
ＭＭｇＣ１，，１ｍＭジチオスレイトール］中で３７℃
、５時間反応させた後、常法通りフェノール抽出し、次
いで、ＤＮＡをエタノール沈殿させた。このＤＮＡにリ
ン酸化したＸ　ｈｏ　Ｉリンカ−ｄ［ｐＣＣＴ　ＣＧＡ
ＧＧ］［ニュー・イングランド・バイオラホ（ＮＥＢ）
社製１５０ｎｇを加え、常法に従ってＴ４ＤＮリガーゼ
で両者を結合させた。

この反応液で大腸菌ＤＨＩ株を形質転換し、得られたア
ンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性コロニーから、
アルカリ抽出法でプラスミドを抽出し、Ｂａ１ｌ認識部
位がＸｈｏｌ認識部位に変換されたプラスミドｐＢＲ３
２２Ｘを得た。

実施例２　プラスミドｐＥＲＩ　　８６０２の構築ｉ）
　　１．６ｋｂ、　　８．３ｋｂ断片の調製ＢａｍＨＩ
用緩衝液［６ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ　−ＨＣ１（ｐＨ７９）
、１５０ｍＭ　ＮａＣＩ、　６ｍＭ　ＭｇＣ１，］　１
００μｅ中で化学合成したヒトリゾチーム遺伝子を含有
しているプラスミドｐＧＥＬ１２５［ヨンムラ（Ｋ　、
　Ｙ　ｏｓｈｉｍｕｒａ）前掲］４８．５μｇに６００
のＢａｍＨｌ（ベーリンガーマンハイム山之内製）を加
えて３７°Ｃで２時間反応させたのち、常法通り、冷エ
タノールを加えてＤＮＡを集めた。このＤＮＡを、上記
ＢａｍＨＩ用緩衝液（１００，ｃｌ）中で４０ＵのＸｈ
ｏｌ（ベーリンガーマンハイム山之内）を加えて３７℃
で１５分間部分消化したのち、６０°Ｃで１５分間加熱
して反応を停止させた。この反応液を０７％アガロース
電気泳動にかけ、１．６ｋｂ断片を含むゲルを切り取り
、電気泳動溶出によってゲルから抽出した。

同様の方法で４８．５μｇのｐＧＥＬ１２５を６００＜
７）ＢａｍＨＩで消化し、常法に従ってエタノールでＤ
ＮＡを沈澱させた。このＤＮＡにＢａｍＨ１用緩衝液中
で８０ＵのＸｈｏｌを３７°Ｃで２時間作用させたのち
、前記１．６ｋｂ断片と全く同様の方ｌ去で、プラスミ
ドｐＧＥＬ１２５からプロモータ、シグナル配列、およ
びヒトリゾチームコード領域が除去された８、３ｋｂの
ＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌ断片を調製した。

）Ｓｍａｌ認識配列を含む合成オリゴマーの調製ｐＧＥ
Ｌ１２５のヒトリゾチーム遺伝子の３′末端側のＸｈｏ
ｌ切断部位をＳｗ＋ａｌ切断部位に変換するために、常
法に従い、”　Ｔ　ＣＧ　Ａ　ＣＣＣＧ　Ｇ　Ｇ　”を
合成した。

１ｉｉ）　　１．６ｋｂ断片と合成オリゴマーの連結ｉ
ｉ）で得た合成オリゴ？　　（１００ｎｇ）と１　、６
　ｋｂ断片（２μｇ）を２０μＱのライゲーション用緩
衝液［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，８）、１
０　’ＩＩＩＭ　Ｍ　ｇＣｌ、、２０−Ｍジチオスレイ
トール（ＤＴＴ）、１ｍＭＡＴＰ］に溶かし、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（ＮＥＢ製）８０００を加えて１４°Ｃで一
夜反応させ、ＤＮＡを結合させた。常法に従い、エタノ
ールを加えてＤＮＡを集めたのち、ｌＯＯμＱのＢａｍ
ＨＩ用緩衛液に溶かし、３６ＵのＢａｍＨＩを加えて３
７°Ｃで１時間反応させ、同様にエタノールを加えてＤ
ＮＡを集めた。次にこのＤＮＡを５０μＱのＳｍａｌ用
緩衝波緩衝液ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ（ｐＨ８，０）、１０　ｍＭ　ＭｇＣＩｔ、１ｍＭＤ
ＴＴ］に溶かし、２１ＵのＳ＋ＩＩａｌ（宝酒造製）を
加えて３０℃で１時間反応させた。これを０．７％アガ
ロース電気泳動にかけ、常法通り所望の部分を切り出し
、電気泳動溶出によって１．５ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｓｍ
ａｌ断片を得た。

１Ｖ）８．３ｋｂ断片と合成オリコマ−の連結ｉｉｉ　
）と全く同様にして、ｌμｇの８．３ｋｂ断片と１１０
０ｎの合成オリゴマーとを連結したのら、同様にＢａｍ
ＨＩ、およびＳｍａｌで処理して電気泳動にかけ８．３
ｋｂの１３　ａｍｌ−Ｉ　Ｉ　−Ｓ　ｍａ　ｆ断片を得
た。

ｖ）１．６ｋｂＢａｍ）目−Ｓ　ｍａ　Ｉ断片と８．３
ｋｂＢａｍＨ１−Ｓｍａｌ断片との連結 ｉｖ）で得た８、３ｋｂ断片（１２０ｎｇ）と１．６ｋ
ｂ断片（３６０ｎｇ）を１００μＱのライゲージクン川
緩ｌｉ液（（ｉｉｉ）ニ同じ）中Ｔ８００ＵのＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（ＮＥＢ製）を加えて１４°Ｃ−夜反応させ
た。

そのｌ　／　５　！ｉｔを用いてＥ、ｃｏｌｉ　Ｄｌｌ
　１を形１１転換し、プラスミドｐＥＲ１８６０２を１
１）だ。

プラスミドｐＧＥ１．１２５およびプラスミドｐＥＲ＋
　　８６０２の制限ｎマ素切断地図およびプラスミドｐ
ｌＲ１８６０２の構築模式図を第１図に示す。

ｌＪｆ！ＪＩ３　　Ｍ１３ｍｐ１８ＸｈＬＺＭの構築）
ヒトリゾチーム遺伝子を含むＸｈｏｌ　−Ｓｍａｌ断片
の調製 実施例２で調製したプラスミドｐＥＲＩ　　８６０２　
１１００ｎを実施例２記載の方法に従ってＸｈ。

１．５ＩＩｌａｌで切断し、シグナル配列フード領域お
よびヒトリゾチーム遺伝子を含むＸｈｏｌ　−Ｓｍａｌ
断片を調製した。

）Ｍｌ　３ｍｐｌ　８へのＸｈｏｌ制限部位の導入Ｍ１
３ｍｐ１８の複製型（ＲＦ）（宝酒造製）２．４μｇを
３０ｕＱのＨｉｎｄＩＩｌ用緩衝液［５０ｍＭ　ＮａＣ
１，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１０
ｎ＋Ｍ　ＭｇＣｌ２．１ｍＭＤＴＴ］中で２７ＵのＨｉ
ｎｄｒ［ｌ（ベーリンガーマンハイム山之内製）と３７
°Ｃで２時間反応させたのち、常法通り冷エタノールを
加えてＤＮＡを沈澱させた。

一方、常法に従って合成した２本のオリゴマー５°ＴＣ
ＧＡＧＧＣＣＡ”°（１００ｎｇ）および”ＡＧＣＴＴ
ＧＧＣＣ（ｌｏＯｎｇ）をＡＴＰを含まないライゲーシ
ョン用緩衝液（前出）２０μＱ中て８０°Ｃ１５分処理
したのち、室温まで徐々に冷却して二本鎖とした。この
反応液に上で得たＨｉｎｄＩＩＩ処理したＭ１３ｍｐｌ
　８ＲＦ５００ｎｇとＡＴＰをｌａＭとなるように加え
、１４°Ｃで一夜反応させた。次にこのｌ／１０型をＥ
、ｃｏｌｉＴＧ　ｌに感染させ、常法に従いＸｈｏｌ切
断部位をもったＭ１３ｍｐ１８ＲＦを得た。この５μｇ
を実施例２、ｉｉｉ　）記載の方法でＸｈｏｌおよびＳ
　ａｈａ　Ｉで処理し、エタノールで沈澱させた。

ｉｉｉ）Ｍｌ　３ｍｐｌ　８ＸｈＬＺＭの構築ｉ）で調
製したＸｈｏｌ　−３ｍａｌ断片３００ｎｇとｉｉ）で
調製したＭ１３ｍｐ１８を含む大きいＸｈｏｌ−Ｓ　ｍ
ａ　ｉ断片１１００ｎとを５０μＱのライゲージコン用
緩１ｉ液（前出）中４００Ｌｌの７４ＤＮＡリガーゼ（
ＮＥＢ製）と１４°Ｃで一夜反応させ、その１１５ｒｉ
ｔをＥ、ｃｏｌｉＴＧ　ｌに感染させ、Ｍ１３ｍｐ１８
ＸｈＬＺＭＲＦを得た。

Ｍ１３＋ｐ１８ＸｈＬＺＭの構築模式図を第２図に示す
。

実施例４　ヒトリゾチーム遺伝子へのＢ　ａｎｔ−１ｌ
　オよびＣ１ａｌ認識部位の造成 天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の１１０位バリン
を池のアミノ酸に変換するために、オリゴヌクレオチド
−デイレクチイツト、インビトロ、ムタゲネシスシステ
ム（了マージャム社製キット）を用い、カセット式変異
法で、上記１１０位バリンをコードするコドンの両側に
Ｂａ＠ＨｌおよびＣ１ａｌ認識部位を造成した。

ｉ　）　Ｂａａｌｌ　Ｉ認識部位およびＣ１ａｌ認識部
位造成のためのオリゴマーの合成 常法に従って次のオリゴマー（５０マー）を合成した。

（Ｔ）　　　（ＴＸＡ） ＧＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＧＣＴＴＧＧＡにＡ（０犯） Ｘは変更後の塩基を、（）内は本来の塩基を示す。

また、下線は、５゛側から順番に、新たに造成されたＢ
ａｍＨＩ認識部位およびＣ１ａｌ認識部位を示す。なお
、この変換でもコードするアミノ酸の種類はもとのまま
である。

上線で示したＧＴＣコドンは、１１０位バリンをコード
している。

１１）アニーリングおよびライゲージジン実施１ｒ１３
で得たＭｌ　３ｍｐｌ　８ＸｈＬＺＭの単鎖ＤＮＡｌ０
μ９を含む溶液（５μＱ）、５°をリン酸化したオリゴ
マー（〜１．６ｐｍｏｌ／μｃ）（５μｍ２）、緩衝液
１（７μＱ）および水（１７μＱ）を混合し、８０°Ｃ
で３分間処理したのち、室温で３０分間放置した。この
反応液にＭｇＣ＋７（１０μＱ）、ヌクレオチド混液１
（３８μ１２）、水（１０μＱ）、クレノーフラグメン
）（１２１Ｊ）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１２Ｕ）を加え
、１４°Ｃで一夜反応させた。反応液をニトロセルロー
スフィルターで濾過し、未反応のｆｌｌ鎖Ｄ　Ｎ　Ａを
除去したのち、常法に従いエタノールでＤＮＡを沈澱さ
せ、５０μＱの緩衝液２に溶解した。

ｉｉｉ　）変異ＤＮＡを含むプラスミドによる大腸菌の
形質転換 １１）で得たＤＮＡ溶液５０μＱの内ｌＯμＱに、６５
ｕＱの緩衝液３と５ＵのＮｃｉ　Ｉを加え３７°Ｃで９
０分間反応させて変異していないＤＮＡにニックを入れ
た。反応後さらに５００ａＭ　ＮａＣ１（１２μの、緩
衝液４（１０μＱ）、エキソヌクレアーゼｌ１ｌ（５０
Ｕ）（２μＱ）を加えて、３７°Ｃで３０分間反応させ
、二・ツクを入れたＤＮＡを消化した。

次に７０°Ｃで１５分間加熱して酵素を失活させた。冷
ｉｌｌ後、ヌクレオチドｉ１１．液２（１３μＱ）、Ｍ
ｇＣ１ｔｌ夜（５μＱ）、ＤＮＡポリメラーゼｌ　（３
Ｕ）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２Ｕ）を加えて１４°Ｃ１
’４時間反応させた。この反応液２０μＱを用い、Ｅ、
ｃ。

１ｉＴＧｌを形質転換した。

ｉｖ）変異ＤＮＡの調製と変異の確認 Ｉ■１）で得た形質転換体をＹＴ寒天培ｔｔｌｌ（バタ
トトリプトン８ｇ、バクト酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ２
５ｇ、寒天１５ｇ、水１にまき、プラークを生じさせた
。プラークを採取し、Ｅ、ｃｏｌｉＴＧ　１に感染させ
、−ごれをＹＴ培地で３７°Ｃにおいて一夜、液体培養
し、培養上清を集めた。この上清１ｍｇにＰＥＧ／Ｎａ
ＣＩ（２０％ポリエチレングリコール６０００．２．５
ＭＮａＣ１）２００μｍ２を加え、よく混合して１５分
間放置したのち、遠心分離して上清を除去した。沈澱に
ＴＥ緩衝ｅ、（１０＋ｎＭ　ＴｒｉｓＨＣＬ　　１＋Ｍ
　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）（１００μｌりおよび、ＴＥ
緩衝液飽和フェノール（５０μａ＞を加えてよく攪拌し
たのち、遠心分離し、水層を採取した。この水層に冷エ
タノールを加えて、単鎖ＤＮＡを沈澱させた。この単１
！ｌｉ　Ｄ　Ｎ　Ａを鋳型としてジテオキンヌクレオチ
ド合成鎖停止法によって塩基配列を決定し、目的通り変
異したＤＮＡを数種得た。

実施例５　変異したヒトリゾチーム遺伝子のｐ’ＢＲ３
２２Ｘへの組み込み ）ＥｃｏＲＩ、Ｘｈｏｌ認識部位を末端にもつｐＢＲ３
２２Ｘの調製 実施例１で調製したｐＢ　Ｒ３２２Ｘ（３ｎｇ）ｌ−制
限酵素ＥｃｏＲＩ（１５Ｕ）とＸｈｏｌ（１６Ｕ）とを
加工、ＥｃｏＲＩ緩衝ｉ＆（ベーリンガーマンハイム社
製）１００μｇ中で３７°Ｃにおいて２時間反応させた
後、フェノール抽出、エタノール沈殿に付し、ＤＮＡ混
合物を得た。

得られたＤＮＡ混合物を１．０％アガロースゲル電気泳
動にかけて大きい断片を切り出し、電気泳動溶出によっ
てゲルから抽出した。

）Ｍｌ　３＋ｎｐｌ　８ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）からのＢａ
ｍＨＩ。

Ｃ１ａｌ認識部位を有するヒトリゾチーム遺伝子の調製 上記１）と同様にして、制限酵素処理、電気泳動溶出を
行い、実施例３で得たＭ１３ｍｐ１８ＸｈＬＺＭ（ＢＣ
）（２０μｇ）からヒトリゾチーム遺Ｃ云子を含むＥｃ
ｏＲＩ−Ｘｈｏｌ断片を調製した。

ｉｉｉ）ｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）の調製１）で
得た１）ＢＲ３２２Ｘ（７）大きい方（ＩＩ）ＥｃｏＲ
ＩＸｈｏｌ断片（２５０ｎｇ）とｉｉ）で得たヒトリゾ
チーム遺伝子を含むＥｃｏＲ１−Ｘｈｏｌ断片（１２０
ｎｇ）とをＴ４リガーゼ（８００Ｕ）の存在下、１４℃
で一夜反応させてライゲート（連結）した。このライゲ
ーション混合物を用いて大腸菌ＤＨＩを形質転換し、プ
ラスミドｐＢ　Ｒ３２２ＸｈＬ　ＺＭ（ＢＣ）を得た。

プラスミドｐＢ　Ｒ３２２ＸｈＬ　ＺＭ（ＢＣ）の構築
模式図を第３図に示す。

実施例６　１１０位のアミノ酸がアラニンに変換された
ヒトリゾチームの遺伝子の調製 ’）Ｖａｌ”ｏをＡｌａ”’に変換するためのオリコマ
−の合成 常法に従って、以下の２本のオリゴマーを合成した。

（２）　　　　　ＧＣＴ　ＣＧＧ　ＡＣＣＣＧＡ　ＣＧ
Ａ　ＡＣＣＴＣＴ　’ｔＴＡ　ＧＣ’。

ｉ）ｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）のＢａｍＨＩおよ
びＣ１ａｌ処理 実施例５で得？、：ｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）（
１００ｎｇ）を、Ｃ１ａｌ（６０Ｕ）を含んだＴＡ（Ｊ
衝液（０’　Ｆ　ａｒｒｅｌｌら、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇ　
ｅｎ、　Ｇ　ｅｎｅｔ、、１７９．４２１−４３５（１
９８０））５００μＱ中、３７℃で３時間反応させた後
、ＤＮＡをエタノール沈殿させた。このＤＮＡに蒸留水
４４０μσを加えて溶解させ、ＢａｍＨ１緩衝液（ベー
リンガー社製）５０　ｕＱＳＢａｍＨＩ　Ｉ　Ｏμ１２
（９０Ｕ）を加え、３０℃で一夜反応させた。この半ｍ
を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、大きい方の断片
を切り出し、電気泳動溶出してｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ
（ＢＣ）の大きい断片を得た。

■）アニーリングおよびライゲーション）で得た合成オ
リゴマー（１）および（２）夫々５００ｎｇを用い、Ｔ
４ＤＮＡキナーゼ２μ＆（１４Ｕ）、ｌｏｍＭ　ＡＴＰ
３μｆ２，１０Ｘライゲーシヨン緩衝液（前出）３μｇ
を含む３０μρ中で、３７°Ｃにおいて３０分間反応さ
せた後、６５°Ｃで１５分間加熱して反応を止めた。

次いで、このようにして得たＤ　Ｎ　Ａ断片１７　ｎｇ
と１１）テ得りｐＢ　Ｒ３２２ＸｈＬ　ＺＭ（Ｂ　Ｃ）
の大きい断片５０ｎｇとをタカラ（ＴＡＫＡＲＡ）ライ
ゲーションキット（宝酒造製）中で１４℃において１時
間反応させ、この半量を使ってＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨｌを
形質転換した。このようにして得られたプラスミドを大
腸菌から抽出しｒｐ１３　Ｒ３２２ＸｈＬ　Ｚ　Ｍ（Ａ
１ａ１１０）と命名した。この変異ヒトリゾチーム遺伝
子を常法通りジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法でそ
の塩基配列を決定し、所望のＤＮＡが挿入されているこ
とを確認した。プラスミドｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（Ａ
ｌａ”’）の構築模式図を第４図に示す。

実施例７　プラスミドｐＥＲＩ　　８８５２の構築実施
例６、ｉｉｉ　）　テ得りｐＢ　Ｒ３２２ＸｈＬ　ＺＭ
（Ａｌａｌｌｏ）を大腸菌ＤＨＩから常法に従って調製
した後、実施例２　、ｉｉｉ　）に記載の方法に従って
Ｘ　ｈｏ　ＩおよびＳ　ｍａ　Ｉで処理して、シグナル
配列のコード領域と変異ヒトリゾチーム遺伝子とを含む
ＸｈｏｌＳｍａｌ断片（ａ）を得た。一方プラスミドｐ
ＥＲ１８６０２を同様にＸｈｏｌおよびＳ　ｍａ　Ｉで
処理したのち、常法通り電気泳動によって９．５ｋｂの
Ｘｈ。

１−３ｍａｌ断片（ｂ）を単離した。

次いで、これらのＤＮＡ断片（ａ）および（ｂ）のそれ
ぞれ、１０ｎｇと３０ｎｇを２０ｔｔ（ｌのライデー／
ジン用緩衝液中で実施例２、山）と同様に反応させて連
結し、この反応混合物でＥ、ｃｏｌｉ　ＤＩ−１１を形
質転換した。形質転換体から、変異ヒトリゾチーム遺伝
子を含有しているプラスミド数種を得、その一つをｐＥ
ＲＩ　　８８５２と命名した。プラスミドｐＥＲ１８８
５２の構築模式図を第５図に示す。

実施例８　酵母形質転換体の調製 実施例７で得た発現プラスミドｐＥＲ１８８５２を用い
、ヒネンらの方法（前出）に従い、Ｓ、セレビシェＡＨ
２２Ｒ−を形質転換し、形質転換体Ｓ、セレビシェＡＨ
２２Ｒ−／ｐＥＲＩ　　８８５２を得た。この菌株は、
工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ　
Ｐ−１０２５９で寄託されている（受託臼：昭和６３年
８月３１日）。

実施例９　　Ｓ、セレビシェＡＨ２２Ｒ−／ｐＥＲ＋８
８５２の培養 実施例８で得た形質転換体Ｓ、セレビシェＡＨ２２Ｒ−
／ｐＥＲＩ　　８８５２を、試験管中のパークホルダー
（Ｂ　ｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）　［アメリカン・ジャーナ
ル・オブ・ボタニー（Ａｍｅｒ、　Ｊ　、　Ｂｏｔ、）
３０．２０６（１９４３）］の改変培地ＩＩＩ（１１２
中、ＫＨ，Ｐｏ。

０．４ｇ、グルコース１０ｇ、アラニン５ｇ、シューク
ロース８０ｇを含有）５＋ｎ＋２に接種し、３０°Ｃで
７２時間振盪培養した。得られた培養液１ｍ１２をそれ
ぞれ上記培地［１４ｔｔ＋Ｑを含む試験管へ移し、３０
°Ｃで１日振盪培養した。この培養液２ｍ（ｌを上記培
地Ｉｎ１８ｍ（ｌを含む２００ＩＩＩＱ容三角フラスコ
に移し、３０°Ｃで振盪培養し、７２時間後に培養液を
採取し、アッセイ用試料の調製に用いた。

実施例１０　アッセイ試料の調製 実施例９で得た培養液を遠心分離し、上清と菌体を分離
した。上清はアッセイに供し、菌体は１２Ｍスクロース
を含ｔ；　５０　ｍＭリン酸ハソファ−（ｐＨ７，０）
で洗浄した後、ライモリアーゼ（Ｚｙ亀ｏ１ｙａｓｅ）
　［生化学工業（株）製コを０　、５　ｍ９／　ｍＱに
なるように加えた同バッファーに懸濁し、室温で２時間
反応させた。この反応液に４倍量の５０ｍＭリン酸バッ
フｙ　　（ｐＨ７，０）［１０ｍＭ　ＥＤＴΔ、１ｍＭ
ＰＭＳＦを含む］を加え、室温で１時間反応させたのち
、上清を集めて菌体抽出液とした。

実施例１１　　変異型ヒトリゾチーム産生量の測定実施
例１０で得た上清と菌体抽出液とを変異型ヒトリゾチー
ムのアッセイに供した。

ヒトリゾチーム活性の測定は、実質上ワーシントン・エ
ンザイム・マニュアル（Ｗｏｒｔｈｉｇｔｏｎ　Ｅ　ｎ
ｚｙｍｅ　ＭａｎｕａＬ　ｐｉ　００、Ｗｏｒｔｈｉｇ
ｔｏｎ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ、　Ｕ　Ｓ　Ａ、　　１９７２）によった。

標準ヒトリゾチームとしてはシグマ（Ｓ　ｉｇｕｍａ）
社製を使用した。１単位は、０．１Ｍリン酸バッファー
（ｐＨ６，９）中でマイクロコツカス・ルテウス（Ｍｉ
ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　１ｕｔｅｕｓＸ生化学工業社製）
を基質として２５℃で１分間反応させ、４５０究μの吸
収を０．００１減少させるに必要な酵素量とした。同様
の実験を３回行って得たヒトリゾチーム活性で表した産
生量は、以下の表１に示す通りであった。

なお、天然型のヒトリゾチームを産生ずる形質転換体Ｓ
、セレビシェＡ　Ｈ２２Ｒ−／ｐＧＥ　Ｌ　−ＣＬｌｏ
＜ＦＥＲＭｐ−９２８５）を対照として同様に培養し、
本発明の形質転換体におけるヒトリゾチーム活性を有す
るタンパク質の産生量と比較した。

結果を表１に示す。

表　　１ ヒトリゾチーム 実施例１１　　分泌された変異型ヒトリゾチームの精製 実施例７で得た形質転換体Ｓ、セレビ／工ＡＨ２２Ｒ−
／ｐＥＲ＋　　８８５２を実施例９に示した培地５ｍｌ
！を含む試験管に接種し、３０°Ｃで３日間振盪培養し
た。次に、上記培地１８ｄを含有する２００ｍＩ２容三
角フラスコに、上の培養液２ｍＣを移し、３０°Ｃで１
日振盪培養した。次に上記培地２５０＋ＩＩＱを含有す
るＩＱ容三角フラスコにこの培養１（ｉ２０＋ｎｇを移
し、３０℃で３日間培養した。この培養液を遠心分離機
にかけ、上清と菌体を分離した。この上清く約１のを５
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５）で平衡化
した陽イオン交換樹脂（Ｉ　ｎｄｉｏｎ）カラム（０，
７ｃｍＸ　１５　ｃ＋ａ）に吸着させ、同緩衝液３０Ｉ
ＩＩＱで洗浄後、０．５ＭＮａＣｌ２を含む同緩衝液で
溶出した。溶出液を１ｎ１２ずつ分取し、各フラクショ
ンについて実施例１Ｏに従ってリゾチーム活性を測定し
た。リゾチーム活性が最大となるフラクションを取り、
これを高速液体クロマトグラフィー（Ａｓａｈｉｐａｋ
５０２　Ｃ）により、さらに精製した。５０＋Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液を含む０．６Ｍ硫酸ナトリウム０−３
０％の直線濃度勾配により３０分間溶出を行い、保持時
間２３４８０分に現れる２８０ｎｍの吸収ピークを分取
し、これをＡ１１０とした。この溶出パターンを第６図
に示す。

実施例１２　精製変異型ヒトリゾチームＡ　Ｉ　Ｉ　Ｑ
の分析 実施例１１で精製した変異型ヒトリゾチーム精製標品に
ついて比活性を測定した。タンパク質の定量は市販のヒ
トリゾチーム（シグマ社）を標準としてＢＣＡプロティ
ンアッセイ試薬（ピアス社）を用いて行った。その結果
、市販の天然型ヒトリゾチームの比活性を１００とした
とき、変異型ヒトリゾチームの比活性は１２１と高いこ
とが分かった。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＥＲ＋　　８６０２の構築模式図
、並びにプラスミドｐＧＥＬ１２５およびプラスミドｐ
ＥＲ＋　　８６０２の制限酵素切断地図、第２図はＭ１
３ｍｐｌ　８ＸｈＬＺＭの構築模式図、第３図はプラス
ミドｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）の構築模式図、並
びに制限酵素切断地図、第４図はプラスミドｐＢＲ３２
２ＸｈＬＺＭ（Ａｌａ”’）の構築模式図、並びに制限
酵素切断地図、第５図はプラスミドｐＥＲＩ　　Ｂ２Ｓ
３の構築模式図、並びに制限酵素切断地図、第６図はＡ
ｓａｈｉｐａｋ５０２ＣによるＡ１１０の溶出状態を示
すグラフである。 第３図 特許出願人　　株式会社蛋白工学研究所代　理　人　　
弁理士　青白　葆（外２名）第６図 保持時間（ガ） 補正の内容。 （内容に変更なし）を提出致します。 手続補正言動式） 発明の名称 変異型ヒトリゾチーム ３゜ 補正をする者 事件との関係

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第１１０位
   のバリンがアラニンで置き換えられたポリペプチドをコ
   ードしている変異ヒトリゾチーム遺伝子。 ２　請求項１に記載の変異ヒトリゾチーム遺伝子と、シ
   グナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列とを
   含有し、真核生物内で自律的に複製可能な発現ベクター
   。 ３、プラスミドｐＥＲＩ８８５２である請求項２に記載
   の発現ベクター。 ４、請求項２または３に記載の発現ベクターで形質転換
   されており、変異型ヒトリゾチームを産生し、分泌し得
   る宿主細胞。 ５、形質転換体サッカロマイセス・セレビシェＡＨ２２
   Ｒ＾−／ｐＥＲＩ８８５２である請求項４に記載の宿主
   細胞。 ６、請求項４または５に記載の形質転換体を培養し、培
   養液中に分泌されたヒトリゾチーム活性を有するタンパ
   ク質を分離し、所望により精製することからなる変異型
   ヒトリゾチームの製造方法。 ７、請求項６に記載の方法で製造された変異型ヒトリゾ
   チーム。