JPH0829092B2

JPH0829092B2 - 変異型ヒトリゾチーム

Info

Publication number: JPH0829092B2
Application number: JP24528487A
Authority: JP
Inventors: 正和菊池; 善雄山本; 佳央谷山; 森男池原
Original assignee: 株式会社蛋白工学研究所
Priority date: 1987-09-29
Filing date: 1987-09-29
Publication date: 1996-03-27
Anticipated expiration: 2011-03-27
Also published as: JPS6486876A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、組み換えDNA技術による変異型ヒトリゾチ
ームおよびその製造に関するものである。さらに詳しく
は、天然型ヒトリゾチーム（以下、単にヒトリゾチーム
ともいう）のアミノ酸配列の第77位および第95位のシス
ティンがアラニンで置き換えられた変異型ヒトリゾチー
ムをコードしている変異ヒトリゾチーム遺伝子を、シグ
ナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列と共に
含有してなる変異型ヒトリゾチーム発現ベクター、該発
現ベクターを用いてヒトリゾチーム活性を有するタンパ
ク質を製造する方法、該発現ベクターで形質転換された
形質転換体、並びに該形質転換体により生産された変異
型ヒトリゾチームに関するものである。

従来技術とその問題点リゾチームは細菌細胞壁のペプチドグルカンに作用し
てＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミン
のβ−1,4−結合を加水分解する酵素である。該酵素を
細菌に作用させると溶菌を引き起こし、その反応生成物
である少糖を同定することによって細胞壁の化学構造の
研究における手懸かりを得ることができる。従って、リ
ゾチームは、細菌学、蛋白質化学、生化学等、様々な研
究分野において有用な酵素である。リゾチームは、ヒト
をも含めた動物の各種組織、分泌液、卵白等に広く分布
しており、一部の植物にも見出されている。

卵白からは比較的容易に純度の高いリゾチームが単離
できるため、この酵素は食品保存の目的で、チーズ、ソ
ーセージ、水産食品などに添加されたり、あるいはま
た、牛乳のヒト母乳化の目的で使用されている［林勝
哉、井本泰治、リゾチーム、南江堂（1974）］。リゾチ
ームはまた、止血、抗炎症、組織再生、抗腫瘍活性など
の薬理活性を有することも知られており（例えば“最近
の新薬34集"107頁、薬事日報社、東京、1983）、消炎酵
素剤として市販されている。

これらニワトリ卵白由来のリゾチームを医薬目的で使
用する場合には、しばしば発疹、発赤などの過敏症状の
現れることがあり、これらは異種蛋白による免疫応答に
よる副作用であると考えられている。従って、特に医薬
用途に用いる場合には、ヒトリゾチームを使用すること
が好ましい。

ヒトリゾチームのアミノ酸配列は公知であり（第１
図）、130個のアミノ酸からなる［日本生化学会編：生
化学データブック巻1,189頁（1979）］。またこのアミ
ノ酸配列に基づき、ヒトリゾチームをコードするDNAが
化学合成されている［Ikehara,M.ら、ケミカル・アンド
・ファーマシューティカル・ブリテン（Chem.Pharm.Bul
l.）34、2202（1986）］。

ヒトリゾチームの生産については、組み換えDNA法を
用いてムラキ（Muraki）らが大腸菌での発現を試みた
が、この発現系では活性のあるヒトリゾチームが得られ
ていない［Muraki,M.ら、アグリカルチュラル・アンド
・バイオロジカル・ケミストリー（Agric.Biol.Chem.）
50、713（1986）］。一方、酵母を用いて培地中にリゾ
チームを分泌させる分泌生産では、活性のあるヒトリゾ
チームが得られることが明らかにされたが［Jigami,Y.
ら、ジーン（Gene）43、273（1986）］、その生産量
（菌体内外の総和）は十分なものではなく、かつ、生産
量に対する分泌量も55〜65％と十分なものではない。

この様に、ヒトリゾチームを効率良く生産する方法が
ないことが、ヒトリゾチームの治療その他への適用を困
難にしている。その上、ヒトリゾチームに関しては、生
体内での機能等に未解明の部分が多く、研究の促進が待
たれている。これらの目的のためには、充分な量の一定
したヒトリゾチーム活性を有するタンパク質が供給され
ることが必要である。

以上から明らかなように、一定したヒトリゾチーム活
性を有するタンパク質を効率よく、大量に得る方法が得
られたならば、医療分野はもとより、該酵素の生理学的
役割の研究等、様々な分野に大いに貢献し得ると考えら
れる。

問題点を解決するための手段本発明者らは、組み換えDNA技術による分泌タンパク
質の製造において、生成したタンパク質を効率よく分泌
せしめるリーダー配列の開発研究に取り組み、その結
果、卵白リゾチームのシグナルペプチドをコードしてい
るヌクレオチド配列にある種の修飾を施し、得られた改
良ヌクレオチド配列をヒトリゾチームをコードしている
ヌクレオチド配列と一緒に、自律的に複製し得るベクタ
ーに挿入し、該ベクターを用いて酵母内でヒトリゾチー
ムを発現させ、効率良く分泌させることに成功した（特
願昭62−069764号および特願昭62−69765号）。他方、
本発明者らは、ヒトリゾチームをより効率よく分泌させ
るために、ヒトリゾチームのアミノ酸配列の一部を改変
する試みも行って来た。その結果、天然型ヒトリゾチー
ムのアミノ酸配列の第77位および第95位のシスティンを
アラニンで置き換えた変異型ポリペプチドをコードして
いる変異ヒトリゾチーム遺伝子を調製し、該遺伝子を、
シグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列と
共に、適切な発現ベクターに挿入し、得られた発現ベク
ターを酵母宿主に導入し、得られた形質転換体を適当な
条件下で培養すると、培地中に充分なリゾチーム活性を
有するタンパク質が分泌されることを見出し、本発明を
完成するに至った。

即ち、本発明は、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配
列の第77位および第95位のシスティンがアラニンで置き
換えられた変異型ヒトリゾチームをコードしている変異
ヒトリゾチーム遺伝子を提供するものである。

更に、本発明は、該遺伝子を、シグナルペプチドをコ
ードしているヌクレオチド配列と共に含有している変異
型ヒトリゾチーム発現ベクターを提供するものである。

また本発明は、上記発現ベクターを用いて酵母宿主を
形質転換し、得られた形質転換体を培養し、培養液中に
分泌されたヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を分
離することからなる変異型ヒトリゾチームの製造方法、
およびこの様にして製造された変異型ヒトリゾチームを
提供するものである。

本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子は、後述の実施例
に記載の如く、当業者既知の方法で調製された。

天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列およびそれをコ
ードしている化学合成したDNAのヌクレオチド配列を第
１図に示す。

本発明の変異型ヒトリゾチーム発現ベクター、即ちプ
ラスミドpERI8716の構築における出発プラスミドとし
て、天然のヒトリゾチームアミノ酸配列をコードしてい
る合成遺伝子を含有する公知のプラスミドpGEL125［ヨ
シムラ（K.Yoshimura）バイオケミカル・バイオフィジ
カル・リサーチ・コミュニケーション（Biochem.Biophy
s.Res.Commun.）145、712（1987）］を用いた。このプ
ラスミドpGEL125は、酵母内で機能する２μ複製起源を
有し、GLDプロモーター、卵白リゾチームのシグナルペ
プチドおよびヒトリゾチームをコードしているヌクレオ
チド配列をこの順番で含有している。このプラスミドpG
EL125を、BamHIによる消化に付した後、XhoIで部分消化
することにより、GLDプロモーター、シグナルペプチ
ド、およびヒトリゾチームのコード領域を含んだ1.6kbD
NA断片と、プラスミドpGEL125の残余のヌクレオチド配
列に相当する8.3kbのDNA断片とを別個に切り出し、SmaI
認識配列（以下、単に制限部位という）を有するSmaIリ
ンカーを用い、それぞれのXhoI制限末端をSmaI制限末端
に変換する。次いでこれらのDNA断片を再結合させる
と、シグナルペプチドの上流にのみXhoI制限部位を有す
るプラスミドpERI8602が得られる。プラスミドpERI8602
の組立て模式図、並びにプラスミドpGEL125およびプラ
スミドpERI8602の制限酵素切断地図を第２図に示す。

天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第77位および
第95位のシスティンがアラニンで置換された変異型ヒト
リゾチームをコードしているヌクレオチド配列を得るた
めに、プラスミドpERI8602から、シグナルペプチドとヒ
トリゾチームとをコードしているヌクレオチド配列を含
んだXhoI−SmaI制限断片を切り出し、これを、M13mp19R
F［M13mpファージDNAの複製型（RF）］にXhoI制限部位
を挿入したファージDNAの大きい方のXhoI−SmaI制限断
片と結合（ライゲート）させることにより、シグナルペ
プチドとヒトリゾチームとをコードしている一本鎖ファ
ージDNA、M13mp19XhLZMを得る。M13mp19XhLZMの組立て
模式図を第３図に示す。

一方、アミノ酸配列の第77位および95位のシスティン
がアラニンで置換された短いアミノ酸配列をコードして
いる２本のオリゴヌクレオチドを合成し、これら、変異
を含んだオリゴマーの５′末端をりん酸化し、M13mp19X
hLZMを含む一本鎖DNAと混合し、常法に従い、アニーリ
ングおよびライゲーションに付す。次いで、変異してい
ないDNAを除去した後、得られた変異ヒトリゾチームDNA
を含有する混合物を用い、大腸菌、E.coliTG1をトラン
スフェクション（感染）した。プラークを形成させた
後、さらにこのプラークをE.coliTG1に感染させ、その
形質転換体を培養し、その培養上清からPEG/NaCl沈澱、
フェノール抽出、エタノール沈澱により単鎖DNAを分離
し、ジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法による塩基配
列決定に付し、所望の変異DNAの生成を確認する。

次いで、常法に従い、一本鎖DNAをE.coliTG1に導入し
て２本鎖DNAを得、このDNAからシグナルペプチドと変異
型ヒトリゾチームをコードしているXhoI−SmaI制限断片
を切り出し、上記プラスミドpERI8602のい9.5kbXhoI−S
maI制限断片とのライゲーション反応に付す。得られた
混合物を用いてE.coliDH1を形質転換し、形質転換体か
ら所望の変異型ヒトリゾチーム発現ベクター、プラスミ
ドpERI8716を単離する。プラスミドpERI8716の組立て模
式図、並びに制限酵素切断地図を第４図に示す。

以上の一連の操作における個々の操作は当業者によく
知られており、例えば、大腸菌の形質転換は、コーエン
（Cohen）らの方法［Cohen,S.N.ら、プロシージング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）69、2110（1972）］によっ
て行うことができる。宿主としてはE.coli294、E.coliD
H1、E.coliW3110、E.coliC600などを用いることができ
る。

また、形質転換体から、所望の遺伝子が挿入されたプ
ラスミドDNAを単離するには、アルカリ抽出法［Birnboi
m,H.C.およびDoly,J.、ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ（Nucleic Acids Res.）7、1513（1979）］等を利
用することができる。次いで、プラスミドDNAを適当な
制限酵素で処理することによって、挿入された該遺伝子
を切り出し、たとえばアガロースゲル電気泳動あるいは
ポリアクリルアミド電気泳動によってこれを単離する。
これらの一連の操作は公知であり、文献、例えば「モレ
キュラー・クローニング（Molecular Cloning）（198
2）,Cold Spring Harbor Laboratory」に詳しく記載さ
れている。

またDNAの化学合成は、たとえばCreaらの方法［Crea,
R.ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）7
5、765（1978）］などに従って行うことができる。

またDNAの所望の部位に、特異的に変異を起こさせる
ためには、市販のキット（例えばアマーシャム社製キッ
トなど）が用いられ、その配列の確認には、ジデオキシ
ヌクレオチド合成鎖停止法［Sanger,F.ら、プロシージ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）74、5463（1977）］
が用いられる。

発現プラスミドは、真核細胞内で自律的に複製可能な
発現ベクター群の内から選択されたベクターのプロモー
ターの下流に、シグナルペプチドをコードしている遺伝
子と変異ヒトリゾチーム遺伝子を連結させて挿入するこ
とにより組立てられる。本明細書中では、GLDプロモー
ターを用いて天然型のヒトリゾチームをコードしている
発現プラスミドpERI8602の構築を用いて例示したが、そ
の他、プラスミドpPHO17、pcDX［Okayama,H.およびBer
g,P.、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（Mol.Cell.Biol.）3、280（1983）］、pKSV−10（ファ
ルマシア社製）なども好適に使用される。

宿主として酵母を用いた場合には、プロモーターとし
て、たとえばPHO5プロモーター、GLDプロモーター、PGK
プロモーター、ADHプロモーター、PHO81プロモーター、
GAL1プロモーター、GAL10プロモーターなどが、宿主と
して動物細胞を用いた場合には、プロモーターとして、
たとえばSV40初期遺伝子プロモーター、メタロチオネイ
ンプロモーター、ヒートショックプロモーターなどがそ
れぞれ利用できる。

なお発現にエンハンサーの利用も効果的である。

発明の作用および効果本発明のプラスミドpERI8716は、酵母宿主内で変異型
ヒトリゾチームを発現させ、分泌させるのに好適であ
る。とくに好ましい宿主はサッカロマイセス・セレビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）AH22R^-である。その
外、動物細胞用ベクターを用いれば、マウスＬ細胞、チ
ャイニーズハムスター卵母細胞（CHO）、さらには他の
真核細胞も用い得る。酵母の形質転換は当業者既知の方
法のいずれによっても行うことができ、例えば、ヒネン
（Hinnen）らの方法［プロシージングス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA）75、1927、（1978）］を採用することが
できる。

真核細胞の形質転換も当業者に既知であり、例えば
「蛋白質・核酸・酵素・28巻、1983年、“組み換え遺伝
子の細胞への導入と発現”（共立出版）」記載の方法で
行うことができる。

形質転換体の培養は、当業者既知の方法のいずれを用
いても行うことができる。

酵母を使用する場合、培地としては、例えばバークホ
ルダー（Burkholder）最小培地［ボスチャン（Bostian,
K.L.）ら、プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンスUSA,77、4505（1980）］
が挙げられる。培養は通常15℃〜40℃、好ましくは24℃
〜37℃で10〜144時間、好ましくは24〜96時間行い、必
要に応じて通気や攪拌を加えてもよい。

動物細胞などの真核生物細胞を宿主とした形質転換体
を使用する場合には、培地として例えばイーグル（Eagl
e）のMEM［H.Eagle、サイエンス（Science）130、432
（1959）］、ダルベッコ（Dulbecco）の改良イーグル培
地（Modified Eagle′s Medium）［Orgad LaubおよびWi
lliam J.Rutter、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（J.Biol.Chem.）258、6043（1983）］な
どが挙げられる。培養は通常30〜42℃、好ましくは35℃
〜37℃で約１〜10日間行う。

培養終了後、当業者既知の方法で細胞と上清とを分離
する。変異型ヒトリゾチームは上清から得られるが、細
胞内に残存する場合には、当分野における通常の方法、
例えば超音波破砕法、フレンチプレスなどを利用した破
砕法、摩砕などの機械的破砕法、細胞溶解酵素による破
砕法などにより細胞を破砕した後抽出する。さらに必要
ならば、トリトン−X100、デオキシコーレートなどの界
面活性剤を加え、産生された変異型ヒトリゾチームを抽
出する。得られた変異型ヒトリゾチームは、通常のタン
パク質精製法、例えば塩析、等電点沈澱、ゲル過、イ
オン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフ
ィー（HPLC、FPLC等）などに従って精製することができ
る。

このようにして得られた形質転換体培養物から分離し
た培養上清並びに菌体中のヒトリゾチーム活性を後述の
アッセイ法で測定し、天然型のヒトリゾチームをコード
している発現ベクターを用いて調製された形質転換体の
場合と比較すると、本発明の変異型ヒトリゾチーム形質
転換体の培養上清には、従来のものよりもはるかに多く
のヒトリゾチーム活性を有するタンパク質が分泌されて
いることが分かった。

即ち、本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子を含んだ発
現ベクターを適当な宿主に導入し、得られた形質転換体
を適当な条件下で培養し、培養上清のヒトリゾチーム活
性を有するタンパク質を単離し、所望により常法にした
がって精製することにより、容易かつ簡便に一定したヒ
トリゾチーム活性を有するタンパク質（変異型ヒトリゾ
チーム）を得ることができる。

以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明す
る。尚、以下の実施例は単なる例示にすぎず、如何なる
意味においても、本発明を制限するものではない。

実施例１プラスミドpERI8602の構築ｉ）1.6kb,8.3kb断片の調製 BamHI用緩衝液［6mM Tris−HCl（pH7.9）、150mM NaC
l、6mM MgCl₂］100μｌ中で化学合成したヒトリゾチー
ム遺伝子を含有しているプラスミドpGEL125［ヨシムラ
（K.Yoshimura）前掲］48.5μｇに60UのBamHI（ベーリ
ンガーマンハイム山之内製）を加えて37℃で２時間反応
させたのち、常法通り、冷エタノールを加えてDNAを集
めた。このDNAを、上記BamHI用緩衝液（100μｌ）中で4
0UのXhoI（ベーリンガーマンハイム山之内）を加えて37
℃で15分間部分消化したのち、60℃で15分間加熱して反
応を停止させた。この反応液を0.7％アガロース電気泳
動にかけ、1.6kb断片を含むゲルを切り取り、電気泳動
溶出によってゲルから抽出した。

同様の方法で48.5μｇのpGEL125を60UのBamHIで消化
し、常法に従ってエタノールでDNAを沈澱させた。このD
NAにBamHI用緩衝液中で80UのXhoIを37℃で２時間作用さ
せたのち、前記1.6kb断片と全く同様の方法で、プラス
ミドpGEL125からプロモーター、シグナル配列、および
ヒトリゾチームコード領域が除去された8.3kbのBamHI−
XhoI制限断片を調製した。

ii）SmaI認識配列を含む合成オリゴマーの調製pGEL125
のヒトリゾチーム遺伝子の３′末端側のXhoI切断部位を
SmaI切断部位に変換するために、常法に従い、^５′TCGA
CCCGGG^３′を合成した。

iii）1.6kb断片と合成オリゴマーの連結 ii）で得た合成オリゴマー（100ng）と1.6kb断片（２
μｇ）を20μｌのライゲーション用緩衝液［50mM Tris
−HCl（pH7.8）、10mM MgCl₂、20mM ジチオスレイトー
ル（DTT）、1mM ATP］に溶かし、T4DNAリガーゼ（NEB
製）800Uを加えて14℃で一夜反応させ、DNAを結合させ
た。常法に従い、エタノールを加えてDNAを集めたの
ち、100μｌのBamHI用緩衝液に溶かし、36UのBamHIを加
えて37℃で１時間反応させ、同様にエタノールを加えて
DNAを集めた。次にこのDNAを50μｌのSmaI用緩衝液［20
mM KCl、10mM Tris−HCl（pH8.0）、10mM MgCl₂、イー
グルmM DTT］に溶かし、21UのSmaI（宝酒造製）を加え
て30℃で１時間反応させた。これを0.7％アガロース電
気泳動にかけ、常法通り所望の部分を切り出し、電気泳
動溶出によって1.6kbのBamHI−SmaI断片を得た。

iv）8.3kb断片と合成オリゴマーの連結 iii）と全く同様にして、１μｇの8.3kb断片と100ng
の合成オリゴマーとを連結したのち、同様にBamHI、お
よびSmaIで処理して電気泳動にかけ8.3kbのBamHI−SmaI
制限断片を得た。

ｖ）1.6kbBamHI−SmaI断片と8.3kbBamHI−SmaI断片との
連結 iv）で得た8.3kb断片（120ng）と1.6kb断片（360ng）
を100μｌのライゲーション用緩衝液（（iii）に同じ）
中で800UのT4DNAリガーゼ（NEB製）を加えて14℃一夜反
応させた。その1/5量を用いてE.coliDH1を形質転換し、
プラスミドpERI8602を得た。

プラスミドpGEL125およびプラスミドpERI8602の制限
酵素切断地図およびプラスミドpERI8602の構築模式図を
第２図に示す。

実施例２ M13mp19XhLZMの構築ｉ）ヒトリゾチーム遺伝子を含むXhoI−SmaI断片の調製実施例１で調製したプラスミドpERI8602 100ngを実施
例１記載の方法に従ってXhoI、SmaIで切断し、シグナル
配列コード領域およびヒトリゾチーム遺伝子を含むXhoI
−SmaI制限断片を調製した。

ii）M13mp19へのXhoI制限部位の導入 M13mp19の複製型（RF）（宝酒造製）2.4μｇを30μｌ
のHindIII用緩衝液［50mM NaCl、10mM Tris−HCl（pH7.
5）、10mM MgCl₂、1mM DTT］中で27UのHindIII（ベーリ
ンガーマンハイム山之内製）と37℃で２時間反応させた
のち、常法通り冷エタノールを加えてDNAを沈澱させ
た。

一方、常法に従って合成した２本のオリゴマー^５′TC
GAGGCCA^３′（100ng）および^５′AGCTTGGCC（100ng）を
ATPを含まないライゲーション用緩衝液（前出）20μｌ
中で80℃、５分処理したのち、室温まで徐々に冷却して
二本鎖とした。この反応液に上で得たHindIII処理したM
13mp19RF500ngとATPを1mMとなるように加え、14℃で一
夜反応させた。次にこの1/10量をE.coliTG1に感染さ
せ、常法に従いXhoI切断部位をもったM13mp19RFを得
た。この５μｇを実施例１、iii）記載の方法でXhoIお
よびSmaIで処理し、エタノールで沈澱させた。

iii）M13mp19XhLZMの構築ｉ）で調製したXhoI−SmaI断片300ngとii）で調製し
たM13mp19を含む大きいXhoI−SmaI制限断片100ngとを50
μｌのライゲーション用緩衝液（前出）中400UのT4DNA
リガーゼ（NEB製）と14℃で一夜反応させ、その1/5量を
E.coliTG1に感染させ、M13mp19XhLZMRFを得た。

M13mp19XhLZMの構築模式図を第３図に示す。

実施例３変異ヒトリゾチーム遺伝子の調製変異ヒトリゾチーム遺伝子の調製には、オリゴヌクレ
オチド−テイレクテッド・インビトロ、ムタゲネシスシ
ステム（アマーシャム社製キット）を用いた。また、操
作方法はアーマシャム社製キット用マニュアルに従っ
た。

ｉ）Cys⁷⁷およびCys⁹⁵をAlaに変換するためのオリゴマ
ーの合成常法に従って次の二本のオリゴマーを合成した。

×は変更後の塩基を、（）内は本来の塩基を示す。

ii）アニーリングおよびライゲーション実施例２で得たM13mp19XhLZMの単鎖DNA10μｇを含む
溶液（13μｌ）、５′をリン酸化したオリゴマー（Ｉ）
と（II）（〜1.6pmol/μｌ）（５μｌ）、緩衝液Ｉ（７
μｌ）および水（４μｌ）を混合し、80℃で３分間処理
したのち、室温で30分間放置した。この反応液にMgCl₂
液（10μｌ）、ヌクレオチド混液１（38μｌ）、水（12
μｌ）、クレノーフラグメント（12U）、T4DNAリガーゼ
（12U）を加え、14℃で一夜反応させた。反応液をニト
ロセルロースフィルターで過し、未反応の単鎖DNAを
除去したのち、常法に従いエタノールでDNAを沈澱さ
せ、50μｌの緩衝液２に溶解した。

iii）変異DNAを含むプラスミドによる大腸菌の形質転換 ii）で得たDNA溶液50μｌの内10μｌに、65μｌの緩
衝液３と5UのNciIを加え37℃で90分間反応させて変異し
ていないDNAにニックを入れた。反応後さらに500mM NaC
l（12μｌ）、緩衝液４（10μｌ）、エキソヌクレアー
ゼIII（50U）（２μｌ）を加えて、37℃で30分間反応さ
せ、ニックを入れたDNAを消化した。

次に70℃で15分間加熱して酵素を失活させた。冷却
後、ヌクレオチド混液２（13μｌ）、MgCl₂液（５μ
ｌ）、DNAポリメラーゼＩ（3U）、T4DNAリガーゼ（2U）
を加えて14℃で３時間反応させた。この反応液10〜20μ
ｌを用い、E.coliTG1を形質転換した。

iv）変異DNAの調製と変異の確認 iii）で得た形質転換体をYT寒天培地（バクトトリプ
トン8g、バクト酵母エキス5g、NaCl5g、寒天15g、水１
）にまき、プラークを生じさせた。プラークを採取
し、E.coliTG1に感染させ、これをYT培地で37℃におい
て一夜、液体培養し、培養上清を集めた。この上清1ml
にPEG/NaCl（20％ポリエチレングリコール6000、2.5MNa
Cl）200μｌを加え、よく混合して15分間放置したの
ち、遠心分離して上清を除去した。沈澱にTE緩衝液（10
mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0）（100μｌ）および、
TE緩衝液飽和フェノール（50μｌ）を加えてよく攪拌し
たのち、遠心分離し、水層を採取した。この水層に冷エ
タノールを加えて、単鎖DNAを沈澱させた。この単離DNA
を鋳型としてジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法によ
って塩基配列を決定し、目的通り変異したDNAを数種得
た。

実施例４プラスミドpERI8716の構築実施例３、iv）で得た変異DNAをE.coliTG1から常法に
よって調製したのち、実施例１、iii）、記載の方法に
従ってXhoIおよびSmaIで処理して、シグナル配列のコー
ド領域と変異ヒトリゾチーム遺伝子とを含むXhoI−SmaI
制限断片（ａ）を得た。一方プラスミドpERI8602を同様
にXhoIおよびSmaIで処理したのち、常法通り電気泳動に
よって9.5kbのXhoI−SmaI制限断片（ｂ）を単離した。

次いで、これらのDNA断片（ａ）（ｂ）各10ngと30ng
を20μｌのライゲーション用緩衝液中で実施例１、ii
i）と同様に反応させて連結し、このライゲーション反
応混合物でE.coliDH1を形質転換した。形質転換体か
ら、変異ヒトリゾチーム遺伝子を含有しているプラスミ
ド数種を得、その一つをpERI8716を命名した。プラスミ
ドpERI8716の構築模式図を第４図に示す。

実施例５酵母形質転換体の調製実施例４で得た発現プラスミドpERI8716を用い、ヒネ
ンらの方法（前出）に従い、S.セレビシエAH22R^-を形質
転換し、形質転換体S.セレビシエAH22R^-/pERI8716を得
た。この菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に受
託番号FERMP−9621で寄託されている（寄託日：昭和62
年９月24日）。

実施例６ S.セレビシエAH22R^-/pERI8716の培養実施例５で得た形質転換体S.セレビシエAH22R^-/pERI8
716を、試験管中のバークホルダー（Burk holder）［ア
メリカン・ジャーナル・オブ・ボタニー（Amer.J.Bo
t.）30、206（1943）］の改変培地III（１当たりKH₂P
O₄0.4g、グルコース10g、アスパラギン5g、シュークロ
ース80gを含有）5mlに接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。得られた培養液1mlをそれぞれ上記培地III4mlを含
む試験管へ移し、30℃で１日振盪培養した。この培養液
2mlを上記培地III18mlを含む200ml容三角フラスコに移
し、30℃で振盪培養し、48、72、96および120時間後に
培養液を採取し、アッセイ用試料の調製に用いた。

実施例７アッセイ試料の調製実施例６で得た培養液を遠心分離し、上清と菌体を分
離した。上清はアッセイに供し、菌体は1.2Mスクロース
を含む50mMリン酸バッファー（pH7.0）で洗浄した後、
ツィモリアーゼ（Zymolyase）［生化学工業（株）製］
を0.5mg/mlになるように加えた同バッファーに懸濁し、
室温で２時間反応させた。この反応液に４倍量の50mMリ
ン酸バッファー（pH7.0）［10mM EDTA、1mM PMSFを含
む］を加え、室温で１時間反応させたのち、上清を集め
て菌体抽出液とした。

実施例８変異型ヒトリゾチーム産生量の測定実施例７で得た上清と菌体抽出液とを変異型ヒトリゾ
チームのアッセイに供した。

ヒトリゾチーム活性の測定は、ほぼワーシントン・エ
ンザイム・マニュアル（Worthigton Enzyme Manual,p10
0、Worthigton Biochemical Corporation,USA、1972）
によった。標準ヒトリゾチームとしてはシグマ（Sigum
a）社製を使用した。１単位は、0.1Mリン酸バッファー
（pH6.9）中でマイクロコッカス・ルテウス（Micrococc
us luteus）（生化学工業社製）を基質として25℃で１
分間反応させ、450mμの吸収を0.001減少させるに必要
な酵素量とした。同様の実験を３回行って得たヒトリゾ
チームの産生量は、以下の表１に示す通りであった。な
お、天然型のヒトリゾチームを産生する形質転換体S.セ
レビシエAH22R^-/pGEL・CL10（FERMp−9285）を対照とし
て同様に培養し、ヒトリゾチーム活性を有するタンパク
質の産生量を比較した。結果を表１に示す。

表１から、本発明の変異型ヒトリゾチームをコードし
ている形質転換体は、従来のものと比較して、ヒトリゾ
チーム活性を有するタンパク質の分泌量または分泌効率
が飛躍的に改善されていることが分る。

実施例９分泌された変異型ヒトリゾチームの精製実施例５で得た形質転換体S.セレビシエAH22R^-/pERI8
716を実施例６に示した培地5mlを含む試験管３本に接種
し、30℃で３日間振盪培養した。上記培地18mlを含有す
る200ml容三角フラスコを５本用意し、その各々に、上
の培養液2mlを移し、30℃で１日振盪培養した。次に上
記培地200mlを含有する１容三角フラスコを５本用意
し、その各々にこの培養液20mlを移し、30℃で４日間培
養した。この培養液を遠心分離機にかけ、上清と菌体を
分離した。この上清（約１）を50mMリン酸ナトリウム
緩衝液（pH6.5）で平衡化した陽イオン交換樹脂（CM−T
oyopearl 650C）カラム（1.6cm×36cm）に吸着させ、同
緩衝液500mlで洗浄後、0.5M NaClを含む同緩衝液で溶出
した。溶出液を5mlずつ分取し、各フラクションについ
て実施例８に従ってリゾチーム活性を測定した。リゾチ
ーム活性が最大となるフラクションから200μｌを取
り、逆相高速液体クロマトグラフィー（TSKgel ODS120T
カラム）により、さらに精製した。溶出は、0.1％トリ
フルオロ酢酸を含むアセトニトリルの０〜100％の30分
間の直線濃度勾配により行い、280nmの吸収ピークを分
取した。この分取液の溶媒を減圧下、蒸発させ、乾燥粉
末として変異型ヒトリゾチームの精製標品を得た。

実施例10 精製変異型ヒトリゾチームの分析実施例９で精製した変異型ヒトリゾチーム精製標品に
ついて比活性を測定した。タンパク質の定量は市販のヒ
トリゾチーム（シグマ社）を標準としてプロティンアッ
セイ試薬（バイオラッド社）を用いて行った。その結
果、市販の天然型ヒトリゾチームの比活性を100とした
とき、変異型ヒトリゾチームの比活性は90±５であっ
た。

次に、この精製した変異型ヒトリゾチームについてＮ
末端９残基のアミノ酸配列の決定を行った。Ｎ末端配列
の決定は、精製標品７μｇを用い、プロティン・シーケ
ンサー（Applied Biosystems社、477A）により自動的に
行った。

結果を以下の表に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列、および
それをコードしている化学合成したヌクレオチド配列を
示す配列図、第２図はプラスミドpERI8602の構築模式
図、並びにプラスミドpGEL125およぴプラスミドpERI860
2の制限酵素切断地図、第３図はM13mp19XhLZMの構築模
式図、第４図はプラスミドpERI8716の構築模式図、並び
に制限酵素切断地図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第
77位および第95位のシスティンがアラニンで置き換えら
れている変異型ヒトリゾチーム。
【請求項２】天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第
77位および第95位のシスティンがアラニンで置き換えら
れたポリペプチドをコードしている変異ヒトリゾチーム
遺伝子と、シグナルペプチドをコードしているヌクレオ
チド配列とを含有し、真核生物内で自律的に複製可能な
変異型ヒトリゾチーム発現ベクターを用いて宿主を形質
転換し、得られた形質転換体を培養し、培養液中に分泌
されたヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を分離
し、所望により精製することからなる、天然型ヒトリゾ
チームの第77位および第95位のシスティンがアラニンで
置き換えられた変異型ヒトリゾチームの製造方法。
【請求項３】宿主がサッカロマイセス・セレビシエAH22
R^-である第２項記載の方法。