JPH04504105A - フォリスタチンおよびその精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 フオリスタチンおよびその精製法 本発明はブタより得た身体材料から実質的に均質な状態で単離される、インヒビ ン様活性をもち、フオリスタチン（ｆｏＬｌｉｓｔＩＳｔｉｎ）と呼ばれる蛋白 質に関する。

発明の背景 生殖腺で産生されるが、脳下垂体レベルに特異的に作用して卵胞刺激ホルモン（ ＦＳＨ）の分泌を抑制する水溶性物質としてのインヒピンの概念は１９３２年に マツカラフ（ＭｃＣｓＬ　ｌａｇｈ　）　により仮定された（ＳＢｉａｎｃａ＋ ７６．１９−２０）。ゴナドトロピン分泌のこのような優先的調節は大いに関心 がもたれ、この５０年間に多数の研究所がかりたてられてこの物質を種々のバイ オアッセイ法により精巣、精子、精巣網液、精液漿および卵胞液の抽出液からこ の物質な単離および解明することを試みた。文献にはｓ、ｏ　ｏ　ｏ〜１００． ０００ダルトンの分子量をもつインヒビン様物質の精製を主張する多数の報文が 見られるが、これらの物質は均質でもな（、真のインヒピンに予想される高い特 異的活性も備えていなかった。

ブタ卵胞液（ＰＦＦ）からの２種の３２に形インヒビンの全配列が見出され、発 表された：メインン（Ｍα１１０ｎ、　Ａ。

Ｊ、）らＭａｔｕｒｅｒ　３１８．６５９−６６３（１９８５）。

双方とも１４ｆのβ−サブユニットと架橋した１８α−サブユニットの二量体で あった。インヒビン様活性をもつ物質は哨乳動物、特に雄の動物において妊娠を 調節するために用いられる。

発明の要約 本発明によれば２種類の蛋白質、すなわち一方は分子量約３５，０００ダルトン （３５ｆ）、他方は約３２，０００ダルトン（３２Ｋ）をもち、双方ともインヒ ピン活性を備えたものがブタ卵胞液から効果的に単離される。これら２種類の蛋 白質はミクロ配列決定法および分子生物学的方法により完全に解明された。ブタ アミノ酸配列情報を用（・て、これらの蛋白質をコードするｃ　Ｄ　Ａ’　Ａク ローンがブタ卵巣ａ　Ｄ　＃　Ａライブラリーから同定された。次いでこのブタ ｃ　Ｄ　Ａ’　Ａをプローブとして用いて、対応するヒトおよびラットの蛋白質 のクローニングおよび配列決定が行われた。

より詳細には、まずブタの身体より得た材料から上記蛋白質を分離および精製し て実質的に均質となし、以下これらをフオリスタチンＡおよびフオリスタチンＢ と呼ぶ。各蛋白質は単一ポリペプチド鎖からなる。ミクロ配列決定法により両所 白質のアミン末端アミノ酸残基配列はＧＬｙ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌａｗ −Ａｒｇ−Ｇｉｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｉｎ −Ｖａｌ−Ｌａｗであることが示された。フオリスタチンＡの次の８個の残基が Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｉｓ−Ｌｇｓ−５ｇｒ−Ｌｙｅ−ＧＬｕであること も確認された。フオリスタチンＡはさらにミクロ配列決定法および分子生物学的 方法を利用した結果、現在では完全に解明されている。各蛋白質は、ＦＳＩＩの 基礎分泌を特異的に抑制し、ただし黄体形成ホルモン（ＬＨ）の基礎分泌は抑制 しないという点で、インヒビン様活性を示す。

実質的に均質になるまで、すなわち画分中の総蛋白質の約９０％となるまでのブ タフオリスタチンの精製はヘパリンーセファロースーアフイニテイクロマトグラ フイー、ゲル濾過および逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ） を含む蛋白質分離法の組合わせによって達成された。

図面の簡単な説明 第１図はフオリスタチン（ＦＳ）および他の蛋白質をブタ卵胞液（ＰＦ’Ｆ）か ら下記の条件下に精製する際の特定の初期工程を示す３攬のクロマトグラム群で ある：第１ｃ図は、ゲル濾過により回収したＦＳＨ放出抑制蛋白質およびＦＳＨ 放出蛋白質のＲＰ−ＨＰＬＣ精製を示す。ゲル濾過により得た有効領域の成分− インビトロバイオアッセイ法により確認−をプールし、凍結乾燥し、そして０． ２Ｎ酢酸に溶解したのちバイダック（Ｖｙｄａｃ　）　０４カラムにそのまま施 し、ＴＥＡＰ緩衝液系中の指示されたアセトニトリル濃度勾配により３−７分で 溶離した。２種類のインヒピン蛋白質、インヒビンＡおよびＢ、フオリスタチン 、ならびに２糧類のアクチビン蛋白質−黒い棒線で示す−が回収された。

第１ｂ図は第１α図にお（・てフオリスタチンと表示された黒い棒線により示さ れる有効画分３？よび４を示すものであり、これらをプールし、それらのもとの 容量の３倍に希釈したのちバイダックＣ４カラムにそのまま施し、トリフルオロ 酢酸（ＴＦＡ）緩衝液系中の指示されたアセトニトリル濃度勾配により３ゴ／分 で溶離した。

第１ｃ図は第１ｂ図において黒い棒線で示した有効物質を示すものであり、これ をプールし、そしてアセトニトリルを除去し、ｐＨ６，５に調整したのち、スフ エロゲｋ　（Ｓｐｈｇｒｏｇｅｌ　）　−Ｔ　ＳＫ　ＤＥＡＥ　−５ｐ％ｏカラ ムに施し、次いでこれからリン酸ナトリウム緩衝液系中の指示された塩化ナトリ ウム濃度勾配により１ｍＪ／分の量で溶離した。

第２図は下記のとおりフオリスタチンのＲＰ−ＨＰＬＣ精製のクロマトグラムを 示す二 第２α図は第１ｃ図に示したカラムから得た有効物質画分を示すものであり、こ れらをプールし、それらのもとの容量の３倍に希釈したのち、そのままバイダッ クＣ４カラムに施し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）緩衝液系中の指示されたアセ トニトリル濃度勾配により１ｍｌ／分で溶離した。

第２ｂ図は第２ａ図に黒い棒線■で表わす、カラムから得た有効物質画分を示す ものであり、これらをプールし、そのもとの容積の３倍に希釈し、同様にパイダ ツタフェニル力うム上で、トリエチルアンモニウムホスフェ−ト（ＴＥＡＰ）緩 衝液系中の指示されたアセトニトリル濃度勾配により１ｍ１１分で精製した。

第２ｃ図は第２ｂ図に黒い棒線で表わす、カラムから得た有効物質画分を示すも のであり、これらをプールし、アクアポア（Ａｑｕａｐｏｒｇ　）ＲＰ　−３０ ０カラム上で、ＴＦＡ緩衝液系中の指示されたアセトニトリル濃度勾配により０ ．５′ｒｎｌ／分で濃縮した。

第３図は３１７および３４４アミノ酸前駆体をコードするヒトフオリスタチンＣ ＤＮＡならびにヒトフオリスタチタチン遺伝子のヌクレオチド配列および推定蛋 白質配列を示し；ヌクレオチドは左および右に番号を付し、−文字コード法で示 したアミノ酸には全体に番号を付した。

多工程法により２ｆｌ類のペプチドをブタ卵胞液（ＰＦＦ）から実質的に均質に なるまで分離した。各蛋白質（フオリスタチンＡおよびフオリスタチンＢ）は単 量体であり；約３５におよび３２にの分子量をもつ。全蛋白質のアミノ酸分析を それぞれにつき行い、６鎖のアミノ末端のアミノ酸残基配列をミクロ配列法によ り判定し、以下のとおりであることが見出された：　ＧＬｙ−Ａａｎ−Ｃｙｓ− Ｔｒｐ−Ｌｍｓ−Ａｒｇ−Ｇｉｎ−ＡＬａ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ− Ｃｙｓ−Ｇｉｎ−ＶａＬ−Ｌｅｓｏその後の研究の結果、３５にフオリスタチン Δはアミノ酸残基３１５個および遊離酸型Ｃ−末端を含むと考えられる。フオリ スタチンＢは残基２８８個の遊離酸であり、Ｃ−末端において残基２７個だけ短 縮されていると考えられる。

各蛋白質は酸性であり、約５の、Ｋａをもち、一般に水性媒質に可溶性である。

コンカナバリンＡに対するアフイニテイが限定されていることにより判定される ように、それぞれある程度グリコジル化されている。各蛋白質はラット脳下垂体 前葉単層培養系においてＦＳＨの基礎分泌を特異的に抑制するという点でインヒ ピン活性を示す。

７ｔリスタチンＡは２．５−６．０８９／ｄｃ　０．０７−０．１７Ｘ　１０− ”Ｍ）の濃度においてＦＳＨ放出最大値の％抑制を示す。各蛋白質は哺乳動物、 特に雄の妊娠を調節するのに有用である。

この精製法においては、ブタフオリスタチンをブタの身体より得た粗抽出液材料 、特にブタ卵胞液（ＰＦＦ）−他の適宜な身体抽出液も使用しうるが−から、ヘ パリンーセファロースーアフイニテイクロマトグラフイー、ゲル濾過、ならびに 異なる条件の°固定相および／または移動相のＲＰ−ＨＰＬＣ少なくとも１回、 好ましくは２回以上を含む連続精製法によって単離する。組換えＤＮＡ法により 得られる粗抽出液から目的とする哺乳動物フオリスタチン蛋白質を得る際にも同 じ方法が用いられる。

ブタインヒピンをまず実質的純度になるまで単離する好ましい方法においては、 ＰＦＦをまずヘパリンーセファロースーアフイニテイクロマトグラフイーにより 、次いでセファクリル（５ａｐｈａｃｒｙＬ　）　Ｓ　−２００ゲル上でのゲル 濾過により、次いで異なる移動相濃度勾配および／または誘導体化シリカ支持体 を用いる５回の連続ＲＰ−ＨＰＬＣプラス１工程のイオン交換ＨＰＬＣによす精 ↓した。比較的低い疎水性の固定相を用いることが好ましく、Ｃ，−Ｃ８カラム が好ましく、Ｃ，−Ｃｓおよびフェニルカラムが特に好ましい。移動相の溶質特 異性は好ましくは有機成分、特にアセトニトリルの濃度を変化させることにより 調整される。１回のＲＰ−ＨＰＬＣ分画によってもゲル濾過した材料に比べて純 度が有意に高まるが、ヘパリンーセフテロースークロマトグラフィーおよびゲル 濾過による連続処理に続いて２回以上、好ましくは６回以上のＨＰＬＣ精製が一 般に行われる。

この処理法における原料はジェイ・アール・サイエンティフィツク（゛カリフォ ルニア州ウッドランド）により製造された。この凍結ＰＦＦ約１８１を２５０− のバッチで処理してフオリスタチンを単離した。精製の第１工程はヘパリンーセ ファロースーアフイニテイクロマトグラフイーであり、その際蛋白質をセファロ ース結合ヘパリン部分に付与条件下で吸着させ、吸着した７オリスタチン材料を １Ｍ−ＮαＣ７ｊ溶離により回収する。この工程は粗抽出液の精製処理を大幅に 促進する。これによって比較的大量の粗抽出液、たとえばＰＦＦをかなり迅速に 処理することができ、一方では粗抽出液の場合の少な（とも９０％に等しい輸イ ンヒビン様活性を示す量の蛋白質が回収されるからである。

精製処理全体を通してインヒピン様活性はラット脳下垂体前葉単層培養を用いる インビトロ−バイオアッセイ法により監視された：ヴエイル（Ｖａｌａ、Ｗ、） ら約すると、２１日令雌ラットの脳下垂体前葉を採取し、酵素により分散し、１ 日目にＨＤＭＥＭ中の１０％ウシ胎仔血清（ジブコ・ラボラトリーズ、カリフォ ルニア州すンタクレア）中において２４ウ工ル型組織培養プレート（ファルコン ・プラスチック、カリフォルニア州オクスナード）に接種する。２日目に培地を ＥＤＭＥＭ中の１％ウシ胎仔血清に交換し、試料を添加する。さらに４８時間、 インキュベーションを続ける。次いで培地を採取し、ＮＩＡＤＤＫＤの下垂体ホ ルモンプログラムにより提供される材料を用いるラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ ）法によってＬＥおよびＦＳＨ含量を測定する。

このアッセイ法において、インキュベーション培地のみを添加した対照細胞と比 べて、フオリスタチンおよびインヒビン蛋白質はＦＳＩＩの基礎放出のみを抑制 し、ＬＨの放出は抑制しない。

種々のカラム画分中のこれらのインヒビン活性を測定するために、０．０１〜０ ．１容量％のアリコートを取出し、水１００μｌ中のヒト血清アルブミン１００ μｔを添加したのち、溶剤をスピード−バクＣ５ｐａｍｄ−ＶαＣ）濃縮機（サ バント、ニューヨーク州ヒツクスビレ）により蒸発させた。残渣をＨＤＭＥＭ中 の１％ウシ胎仔血清３ｍｌ！に再溶解し、ミレツクス（Ｍｉｌｌｅｚ）　−Ｇ　 Ｓ　Ｏ，２２ｔｔ　ｓ　フィルター（ミリボア社、マサチュセッッ州ベッドフォ ード）で濾過し、二重反復法によりアッセイした。精製処理中のバイオアッセイ を促進するために、フォリスタチンおよびインヒビンが及ぼすＦＳＨ分泌基礎抑 制のみを測定し、クロマトグラムにおいてこれらの蛋白質が移行すると予想され る領域にプロットした。

ヘパリンーセファロースーアフイニテイクロマトグラフイーを行うためには、凍 結ＰＦＦの５００耐ボトルを解凍し、ベックマン／２−２１遠心機（ベツクマン ーインスツルメンツ社、カリフォルニア州パロアルト）によりＪＡ−２Ｑｏ−タ ーを用いて１０＝ＯＯＯｒｐｔｎで３０分間、細胞残層な遠心沈殿させた。上澄 液の半量（２５０ゴ）を４１の三角フラスコ内で０．１　Ｍ　、　ＮＧＣＩＩ含 有０．０１＆）リス−ＨＣＩＣｐＨ７＞　２，２５０−の添加によりその容量の １０倍に希釈し、２個のラビット（Ｒαｂｂ’−ｊｃ）　４チヤンネル型ぜん（ 嬬）動ポンプ（レイコン・インスツルメント社、カリフォルニア州エメリービレ ）によりカラム当たり４Ｑａｌ／時間で８本のシラスチックチューブ（内径０． ７６ｎ）を通して同時に８個のヘパリン−セファロース（ファルマシア・ファイ ン・ケミカルズ、ニューシャーシー州ビスカッタウェイ）カラム（３，５Ｘ９ｃ ｒｒＬ）に送入した。すべての液体がヘパリン−セファロースにポンプ送りされ たのち、Ｑ、ＩＭ−ＮαＣ７ｌ含有０．０１Ｍトリス−ＥＣＩ　ＣｐＨ７）　３ ．５１で同様にして８個のカラムを同時に洗浄した。ＬＭ−ＮａＣ１含有０．　 Ｉ　Ｉ’ｄ　）リス−ＨＣｌ、　ＣｐＨ７）　１．３１で同様にして８個のカラ ムを同時に洗浄することにより、インヒビン活性をもつ吸着された蛋白質を取出 し、洗液を１ｆｌｌｌＡ’の画分に採集した。

上記のインビトロ−バイオアッセイ法によりインヒビン活性を監視した。カラム はさらに０．０１＆トリス−ＭＣＩ（ｐＨ７）中の２Ｍ−ＮＧＣＩ　１．６１で 洗浄することにより再生され、０．１　Ｍ−ＮａＣ１含有０．０１＆）リス−Ｅ ＣＩＩ３．５１で再平衡化され、残り２５０ｄのＰＦＦの精製に用いられた。

次いで上記材料をゲル濾過により分画して、蛋白質を一般にそれらの分子量に従 って分離した。８個のヘパリルーセファロースー力ラムにより抽出されたこれら のインヒビン様活性を示す画分をプールしく４００ａｇ）、シリンダー直径２８ ．６１１１１．　Ｍｒカットオフ３，５００のスペクトレーバー（５ｐａｃｔｒ ａｐｏデ）屑３メンブレンチューブ（スペクトラム・メディカル・インダストリ ーズ社、力ｌｊ　７オルニア州ロスアンジエルス）中で３０％酢酸１６１に対し 一夜透析した。保持された流体を上記と同様に遠心分離して白色沈殿を除去し、 上澄液を８個の均等部分に分け、８個の５×１００ｃｒＩＬセフアクリル５−２ ００超微粒カラム（ファルマップ・ファイン・ケミカルズ、ニューシャーシー州 ビスカッタウェイ）に施すのに用いた。各カラムを３０％酢酸で溶離し一２Ｑｍ ／、２２分間−、カラム画分を２８Ｏｎ毒でのＵＶ吸収およびバイオアッセイに より監視した。

七フアクリル５−２００カラムにより精製された材料の溶出プロフィルはインヒ ビンおよびＦＳＩＩ放出活性を示す数個の溶出帯域を示した。これらの領域をＲ Ｐ−ＨＰＬＣによる後続精製用として選び、従ってプールし、凍結乾燥した。凍 結乾燥した材料（４０■）を０．２Ｎ酢酸４０ｍ１に溶解し、ミレックスーＨＡ Ｑ、４μ惰フィルター（ミリポア社、マサチュセッッ州ベッドフォード）で濾過 した。戸板をそのまま１　ｘ　２５ｃＭＬバイダック５μ憔粒径Ｃ４カラム（ザ ・セパレーション・グループ、カリフォルニア州へスペリア）に施し、ＴＥＡＰ 緩衝液の濃度勾配に対して展開した。ＴＥＡＰ系においては、緩衝液Ａは０．２ ５Ａ’トリエチルアンモニウムホスフエートＣＴＥＡＰ）ＣｐＨ３）からなり、 緩衝液Ｂは緩衝液Ａ中の８０％アセトニトリルである。Ｆ液をすべて装填したの ち、ＵＶ吸収がベースラインに達するまで水性緩衝液Ａでカラムを洗浄した。イ ンヒピンおよびＦＥＢ放出活性を示す画分が、スペクトロフロー（Ｓｐｇｃｔｒ ｏｆｌｏｖ）７５７ＵＶ検出装置（クラトスーアナリティヵル・インスツルメン ツ、ニューシャーシー州うムゼー〕、ツルチック（Ｓｏｌｔａｃ）　２２０レコ ーダー（ンルテック社、カリフォルニア州サンバレー）、およびレディラック２ １１２フラクシヨンコレクター（ＬＫＢインスッルメンツ社、マリーランド州ギ ャザースバーグ）を備えたペックマン３３２傾斜液体クロマトグラフィーシステ ム（ベックマン・インスツルメンツ社、カリフォルニア州バークレー）により分 離された。実質的なインヒビン活性をもつ３帯域が検出され、先に溶出する帯域 はフオリスタチンと呼ばれ、のちに溶出帯域はインヒビンＡおよびインヒビンＢ であった。ＦＳＢ放出因子の２帯域が検出され、これらはのちにアクチピンＡお よびアクチピンＡＢと命名され、それぞれ四種二量体および異穫二量体であった 。第１ａ図に示すよ５に、フオリスタチン帯域は７〜１２分目の濃度勾配におし ・て最初に溶出した。

第１α図に示すカラムからのフオリスタチン画分をプールし、等容量の０．２　 Ｎ酢酸と混合し、さらに１×２５０バイダック５μ鶏粒径Ｃ４カラムおよびトリ フルオロ酢酸（ＴＦＡ）緩衝液系を用いる他のＲＰ−ＨＰＬＣ工程により精製し た（第１ｂ図）。ＴＦＡ系においては緩衝液Ａは水９９９ｍ１中に１−のトリフ ルオロ酢酸を含有し、緩衝液Ｂは水１９９ｒｎｌおよびアセトニトリル８０〇− 中のトリフルオロ酢酸１ｍｌである。有効物質は９０分間にＴＦＡ系中２１から ３０％アセトニトリルの直線濃度勾配で３罰／分の流量においてカラムから溶出 する。バイオアッセイ法により検出してＦＳＢ放出抑制活性をもつ画分（画分１ ９−２３）をプールし、スピード−バク濃縮機（サバント、ニューヨーク州ヒツ クスビレ）によりアセトニトリルを除去したのち０．ＩＮ水酸化アンモニウムで ｐＨ６，５に調整し、７．５Ｘ７５ｕスフエロゲルーＴＳＫ　１０μＤＥＡＥ− ５ＰＷカラム（東洋曹達、日本国東京）にそのままポンプ送入した。装填後にカ ラムをＵＶ吸収がベースラインに達するまで緩衝液Ａで洗浄した。緩衝液Ａは０ ．１　Ｍリン醗水素ナトリウム（Ｎａ、ＨＰＯ，）、ｐＨ７，５であった。フオ リスタチン活性は第１Ｃ図に示すように９０分間に緩衝液Ａ中Ｏから０．３　Ｍ 　−ＮａＣ１の直線濃度勾配で１ｍＪ／分の流量において分離された。画分１９ −２２中にカラムから溶出する有効物質をプールし、０，２Ｎ酢酸でそのもとの 容量の４倍に希釈したのちさらにＩ　Ｘ　２５ｃｒＩｔバイダツク５μＣ４カラ ム上で第２ａ図に示すように９０分間にＴＦＡ溶剤系中２１から３０チアセトニ トリルの直線濃度勾配で１ｍＪ／分の流量において溶離することにより精製した 。画分３３−３５（ピークＩ）中に溶出する有効物質をプールし、七のもとの容 量の２倍に希釈し、１１０Ｘ２５０ｔバイダツク５μフエニルカラム上で、第２ ｂ図に示すように９０分間にＴＥＡＰ系中１８から２７％アセトニトリルの直線 濃度勾配で１１１ＬｌＺ分の流量において再クロマトグラフィー処理した。最後 に、画分３４−３６中の７オリスタチンをプールし、０．２Ｎ酢酸で希釈したの ち第２Ｃ図に示すように０，４６Ｘ２５ｃ１ｎアクアポア（Ａｑｓａｐｏｒａ　 ）　ＲＰ　−３００，１０μｍ粒径カラム（ブラウンリー・ラボ、カリフォルニ ア州すンタクレア）を用いてＴＦＡ緩衝液系中２０から８０％アセトニトリルの 直線濃度勾配により濃縮した。１８／のＰＦＦから合わせて約４００μノの有効 物質が単離および精製され、７オリスタチンＡと命名された。

実質的に均質なフォリスタチンＡのアミノ酸分析をボーンｙ　（Ｂｏｈｌ　ａｎ 　Ｐ−）らＡｎａｌ、Ｂｉｏｃｈａｍ、　１２６　１４４−１５２（１９８２） の記載に従って行い、結果を下記の第１表に示す。

ブタ卵胞液から精製した ７オリスタチン蛋白質のアミノ酸組成 アミノ酸　７オリスタチンＡ＊　７オリスタチ７Ｂ”（Ｍｒ　３５，０００）　 （Ｍｒ　３　２．０　０　０　）Ａｓｓ　３４．１ｆＯ，２２８，４±０．０Ｔ ｈＩＦ　１７．７±０．３　１５．９±０．０Ｓａｙ　２５．６ｆ０．２　２２ ．２±０．２Ｇ１２　３６．７±０．１　３１．１±ｏ、１ＧＬＩ　２３．３ｆ ０．２　２４．５ｆ０．ＯＡｌα　１７．１±０．２　１５．６±０２ＯＶａｔ 　１５．５ｔ０．３　１４．０±０．０Ｈａ　ｇ　３．２±０．１　“　３．４ ±０．０Ｉｔｓ　１０．１±０．１　７．５±０．１Ｌａｓ　２０．９±０．２ 　１９．１ｆ：０．０ｒ、デ　９，５±０．１　８．８±０．１Ｐｋａ　５．０ ｆ＝０．１　４．６±０．０Ｈｉｓ　２．２ｆＯ，０２，Ｏｆ：０．０Ｔ７ｐ　 ５．８±０．１　５．６±０．１Ｌｙｓ　２６．２±０．０　２５．２±０．Ｉ ＡｒＱ　１２．７±０．１　１３．７±０．１ｃｙ、１　３５．９±０．２　３ ３．５ｆ：０．１Ｐｒｏ　１３．５±０．３　１３．０±０．１本　データは２ 回の分析の平均±５１）Ｋ相当し、Ｍ。

３５．０００形フオリスタチンについては３５．０００ダルトンの蛋白質に、＆ 、３２，０００形のものについては３２，０００ダルトンの蛋白質に正規化され ている。

率＊システィンは過ギ酸酸化後に７ステイン酸として測定された。

最終ＲＰ−ＨＰＬＣ精製により得た７オリスタチンＡを還元性および非還元性条 件下に１０厚の１０％アクリルアミドゲル中でレムリ（ＬａａｍｓｌｉｒＵ、） 、Ｎ（Ｌ　ｔ％ｒｅ　２２７１６７７−１６８５（１９７０）の方法に従って分 析した。蛋白質は銀染色試薬（パイオーラド、カル７オルニア州リツチモンド） により解明された。ゲルを検量するために下記の分子量基準を用いた：ウシ血清 アルブミン（ｘ、＝６７．０００　）、卵７／Ｉ／ブミ：／　（Ｍ、−４３，０ ００）、α−キモトリプシノゲンＣＭ、−２５，７００）およびリゾチーム（Ｍ ｒ−１４，５００）　ｏ　非還元条件下では、水２０μｌ中の７オリスタチンＡ 　２μｍを２０μｊの緩衝液（０，１５２Ｍ　トＩ）ス−ＨＣ１、ｐＨ６，８， ２０％クリセリフ（Ｖ／Ｖ）、４％ドデシル硫酸ナトリウム、および０．０４チ プロムフエノールプルーを含有）と共に３７℃で１時間インキュベートしたのち ゲルに装填した。電気泳動は一定の２００ボルトで６時間、室温において行われ た。

還元条件下では蛋白質２μノをまず０．０２　、Ｍジチオトレイトール２０μｌ と共に３７℃で１５分間インキュベートしたのち緩衝液２０μｌを添加し、イン キュベーションをさらに１時間継続したのち試料をゲルに施した。電気泳動は上 記に従って行われたが、ただし０．００５Ｍジチオトレイトールを電気泳動用緩 衝液に含有させた。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で、フオリスタチンＡは非還元条件下ではＭｙ　３５，００ ０に移行する単一バンドを示し、還元条件下ではこれはＭｙ　４２，０００に移 行する、同様に単一のバンドを示した。

同様な逆相ＨＰＬＣ条件を用いて、Ｍｒ　３２，０００形の、フオリスタチンＢ と呼ばれるものを第２Ｇ図の画分３６−３７（ピーク■）がら単離した。そのア ミノ酸組成はＭｙ　３５，０００形のものに関連があり（第１表参照）、還元す るとこの蛋白質も単一バンドとしＭｙ　４０，０００に移行した。

ブタ７オリスタチ／ＡおよびＢ（ｐＦｓ−Ａおよび、ＦＳ−Ｂ）のＮＨ，末端配 列分析はニッシュ（Ｅａｃｈ、　Ｆ、）Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｇｍ、　１３ ６．３９−４７、１９８４の記載に従って行われた。両フォリスタチンの多数回 の配列決定分析に基づいて、それぞれのＨＥ、末端残基はＧｊ　Ｖ−Ａｓｓ−（ ４ｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｓ−ＧＬｙ−Ａ ｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｉｎ−Ｖａｔ−Ｌａｓであることが確認された。

フオリスタチンＡのＮＨ，末端残基は残基Ｔｙｒ−Ｌｙｅ　−Ｔｈｒ−Ｇｌｓ− Ｌａｗ−５ｕｒ−Ｌｙｅ−ＧＬｓと続いていた。

フオリスタチンの配列の実質的な部分が分かると、この蛋白質をコードするｍＲ ＮＡを単離し、組換えＤＮＡ技術によりｃ　Ｄ　＃　Ａを合成することができる 。メツセンジャーＲＮＡ　ＣｍＲＮＡ）はフォリスタテンを産生ずる卵巣組織か ら得られ、次いでこのｍ　Ｒ＃　Ａから逆転写により６ＤＮＡが合成される。こ のｃ　Ｄ　＃　Ａをクローニングベクターに挿入し、これを用いて適切な宿主を 形質転換し、ｃＤＮＡライブラリーを形成する。

解明された部分アミノ酸残基配列に基づいて、対応するｃ　Ｄ　Ａ’　Ａを検出 するための標識オリゴヌクレオチドが合成される。遺伝暗号の縮重のため、混合 ハイブリダイゼーションプローブを調製し、プローブとして用いた。

下記の２種のプローブを用いて、フオリスタチンをコードする特定の遺伝子配列 を含むｃ　Ｄ　＃　Ａクローンをライブラリーから選択した：　３’−ＡＣＣＴ ＧＴ　ＣＴＣＣＴＣＣＴＡ　ＣＡＣＴＴＡ　ＣＴＧ　ＴＴＧ　ＴＧＧ　ＧＡＣＡ ＡＧ　ＴＴＣ−５′および３’−ＣＴＣＧＴＣＡＴＧ　ＧＡＣＡＣＡ　ＣＣＧＴ ＴＡ　ＣＴＡ　ＣＣＧ　ＣＡＣＴＧＧ　ＡＴＧ−５’。両プローブをハイブリダ イズする１３クローンを同定し、精製した。

ｃ　Ｄ　Ａ’　Ａライブラリーは７オリスタチン鎖に対して形成された抗体を用 いる免疫学的発現アッセイ法によってもスクリーニングすることができる。免疫 学的発現アッセイ法はハイブリダイゼーションプローブを用いるスクリーニング を確認するためにも用いられる。

選ばれた１３クローンのうち１２から、ＥｃｏＲＩによりｃＤ　Ｎ　Ａを切取り 、Ｍ１３渇ｐｉｃ＋ファージに挿入し、、ここでこれらは配列分析のためにサブ クローン化される。

配列分析の結果、２種の前駆体蛋白質がコードされることが推定される。すなわ ち３４４アミノ酸のもの、およびそのＣ−末端が短縮された３１４アミノ酸のも のである。さらにこれらの前駆体は２種の成熟ＦＳ蛋白質を分泌し、それらの５ ち一方、フォリスタチンＡは下記の配列をもつ３１５残基の単量体であると結論 される：Ｇ１１１−Ａａｎ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｓ−Ａｒｇ−０１％−Ａｌａ −１４ａ　−Ａｓｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｌａｓ−Ｔｙ ｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ　−Ｇｌｓ−Ｌａｓ−５ｅｔ−Ｌｙａ−Ｇｌｓ−Ｇｌｕ−Ｃ ｙｓ−Ｃｙｓ−５ｕｒ−Ｔｈｒ−ｃｔｙ−Δｒｇ−Ｌｍｓ−５ａｔ−Ｔｈｒ−５ ａｔ−Ｔｒｐ−Ｔｈｅ−０１％−Ｇｌｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａ ｓ％−Ｔｈｒ−Ｌａｓ−Ｐｈｇ−Ｌｙｅ−Ｔｒｐ−Ｈａ　ｔ−１’ｌ　ｇ−Ｐｈ ａ−Ａｓｓ−ＧＬｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｃｙｇ−１１ａ−Ｐｒ ｏ−Ｃｙａ−Ｌｙｅ−Ｇｌｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙａ−Ｇｌｓ−Ａａｎ−Ｖａｔ−Ａｓ ｐ−Ｃｙｓ−ＧＬｙ−Ｐｒｏ−ＧＬｙ−Ｌｙｓ−Ｌａｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌ ａ　ｔ−Ａａｎ−Ｌｙｅ−Ｌｙｅ−Ａｓｓ−Ｌｙｅ−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ−Ｃｙｓ −Ｖａｌ−Ｃｙｓ−ＡＬａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−５ａｙ−ＡｓｆＳ−１１ ｇ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｅ−Ｇｌ　ｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｙａ−Ｇｌ　ｙ− Ｌａｓ−Ａｓｐ−Ｇｌ　ｙ−Ｌｙｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｘ −Ｃｙｓ　−Ａｌ　ａ−Ｌａｗ−Ｌａｓ−Ｌｙｅ−Ａｔ　ａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ− Ｌｙｅ−ＧＬｓ−Ｇｉｎ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｇｌ’ｘ−Ｌ　ａ　５−Ｇｌ　ｕ　−Ｖ ａ　ｌ　−Ｇｔ　ｎ−Ｔ　ｙ　ｒ−ＧＬ　５−ＧＬ　ｙ−Ｌｙａ−Ｃｙｓｔ−Ｌ ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐ ｒｏ−Ｇｌｙ−５ａｔ−５ａｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−Ａａｐ−Ｇ ｉｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｓ−Ａａｎ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ　−Ｔｈｅ− Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−１１ｇ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−ＧＬｘ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ　 −５ｕｒ−５ａｒ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｔｙｒ−Ｌａｗ−Ｃｙａ−Ｇｌｙ−Ａｓｈ 　−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−５ａｙ−５ａｒ−Ａｌａ−Ｃｙ ａ−Ｈｉｓ−Ｌｇｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｊ−ＡＬａ−Ｔｈｒ−Ｃｙａ−Ｌａｓ−Ｌａ ｗ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−５ａｔ−１１１−Ｇｌｙ−Ｌａｗ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌ ｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙａ−Ｉ　Ｌ　ａ・−Ｌｙｅ−ＡＬ　ａ−Ｌｙｓ−５ｓ 　ｒ−（４ｓ−Ｇｌ　ｓ−Ａｍｐ−１１ａ−ＧＬｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ− Ｇｌ　ｙ−Ｌｙｅ−Ｌｙｅ−Ｃｙａ−Ｌａｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｐｈａ−Ｌａｓ −Ｖａｔ−ＧＬｖ−Ａｒｇ−Ｇｔｙ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−５ａｙ−Ｌｍｓ−Ｃｙａ −Ａｍｐ−Ｇｌｓ−Ｌｇｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｓ−５ａｒ−Ｌｙｅ−５ａｙ −Ｇｌｓ−Ｇｌｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｙａ−Ａｌａ−５ｅｔ−Ａｍｐ−Ａｓｓ −ＡＬａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−ＡＬａ−５ａｒ、−Ｇｌｓ−Ｃｙｓ−Ａｌ　ａ−Ｍ ｇ　ｔ−Ｌｙｅ−Ｇｌｓ−ＡＬａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｅａｒ−５ｕｒ−Ｇｌｙ− Ｖａｌ−Ｌｍｓ−Ｌａｗ−Ｇｌｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｅ−Ｈｉｓ−５ｅｔ−Ｇｌｙ− ５ａｒ−（４ａ−Ａｓｓ−５ｕｒ−１１ｅ−５ａｙ−Ｇｌｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ− Ｇｉｎ−Ｇ　１　％−Ｇ　ｌ　５−Ｇｌ　ｓ−Ｇ　ｌ　５−Ａｓ　ｐ　−Ｇ　ｌ 　ｓ−Ａｍ　ｐ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａｓ　ｐ−Ｔｙｒ−５ａｒ−Ｐｈａ−Ｐｒｏ−１ １１１−５ａｒ−５デーＩＩ　ａ−Ｌａｓ−Ｇｉｎ−ＴデＰ。

この判定はＰＦＦから得た精製蛋白質材料についての先の分析と一致する；残基 の数と３５にの測定値との相違はグリコジル化の存在によって説明される。標識 ７オリスタチンｌの約６３％がコンカナバリンＡ−セファロース４Ｂ−アフィニ ティカラムに保持され、これは０．２Ｍ・α−メチル−Ｄ−マンノピラノシドで 置換することができ、これによりフオリスタチンＡがグリコジル化されているこ とが示された。分子量約３０００ダルトンの炭水化物部分がＡｌ？ｌ残基、恐ら （９５位の残基または２５９位の残基の側鎖に結合していると思われる。他方の 成熟蛋白質、７オリスタチンＢはフォリスタチンＡと同じ配列をもつが、そのＣ −末端において２７残基だけ短縮されている。これはグリコジル化されていない か、または異なるグリコジル化を含むであろう。

精製したこれらの蛋白質は２．５−６．０％ｒ／ゼ（０，０７−０，１７Ｘ　１ ０−ｇＭ）の濃度でＦＳＢ放出最大値の％抑制を示し、これはインヒビンＡの場 合の約％である。双方とも黄体形成ホルモン、成長ホルモン、プロラクチンまた は甲状腺刺激ホルモンの分泌に影響を与えない。

異種から得たインヒビンが大幅な相同性を示す−たとえばブタ、ヒト、ウシ、ヒ ツジおよびラット−ので、他種から得た相同な７オリスタチンをブタＣＤＮＡラ イブラリーの探査に用いたと同じプローブを用いて推定しうろことは確実である と思われる。あるいはブタフォリスタチンをコードする遺伝子配列のｃ　Ｄ　Ａ ’　Ａ断片を用いてプローブを調製することができる。従ってブタフォリスタチ ンの配列の知見から今日の分子生物学者は他種のフオリスタチンの配列を推定し 、かつそれらのホルモンを組換えＤＮＡ技術により調製することができる。

ブタＦＳ　（、ＦＳ　）前駆体の最初の３１７個のアミノ酸をコードするｃ　Ｄ 　Ａ’　Ａプローブを用いて精巣λｇｔｔｔｃ　Ｄ　Ａ’　Ａライブラリーをス クリーニングする。８．１×１０５フアージプラクから１２の陽性クローンが得 られ、８クローンを選んで＆１３ｍｐ１９ベクターにサブクローニングしたのち ジデオキシ連鎖停止法により配列決定する。これらのクローンのヌクレオチド配 列から、３４４残基ｐＦｓ前駆体との相同性が高く、６残基のみが異なる３４４ アミノ酸配列を含むｈＦｓ前駆体がコードされることが判定された。同様なＣ末 端短縮前駆体も他のクローンによりコードされる。

これら２前駆体の由来をさらに明らかにするためにｈＦｓ遺伝子をクローン化し 、ヒトゲノムライブラリーから配列決定する。１００万フアージプラクから同じ ブタｃＤ　Ｎ　Ａプローブとのハイブリダイゼーションにより陽性のもの３種が 得られた。制限マツピングおよびヌクレオチド配列分析により長さ１９．１＆＆ の１クローンが５エクンンを含むヒトＦＳ遺伝子のほぼ全体をコードすることが 解明された。第３図に示すように、これら５エクンンはそれぞれＦＳのシグナル 配列および最初の４ドメイン（Ｉ−ＩＶ）をコードする。他の１５．０＆６のク ローンは３４４残基前駆体の最後の２７個のＣ−末端残基をコードする最後のエ クソン（Ｖ）のみを含む。第２クローンの５′−末端配列がより長鎖のクローン の３′−末端と結合して完全な遺伝子配列を与えることはないと思われる。それ にもかかわらず、ヒトＦＳの全ゲノム配列は、第３図に示した位置で５イントロ ンにより分断された６エクンンにつき長さ５＆６以上であるＤＮＡ配列からなる と推定される。シグナル配列をコードする最初のエクソンを除いて、ドメインＩ 〜■をコードする以下の４エタンンはほぼ同サイズである。この前駆体の最初の ２９アミノ醸残基は推定シグナル配列に相当し、３６システインで示される４反 復ドメインがこれに続（。配列が完全に決定された最初の４イントロンはそれぞ れ２００９．４３０．３４６および７０２塩基対を含み、それらすべてが共通配 列５’−ＧＴ・・・・・・ＡＧ−３’のドナーおよびアクセプタースプライシン グ部位をもつ。

第３図は３１７および３４４残基ｈＦｓ前駆体のクローン化ｃＤＮＡ配列および 対応するアミノ酸配列を示す。

、ＦＳとｈＦｓの相違は第３図のかっこ内に示され、各位置のヒト残基の真下に 対応する。ＦＳの残基を示す。

ｐｒｍＦｓ３１７をコードする。ＤＮＡはシェードを施した範囲のヌクレオチド を含み、これに対しｐｒａＦｓ３４４をコードするｃ　Ｄ　ＮＡはこの範囲のヌ クレオチドがスプライスされている。前駆体蛋白質において可能性のあるＮ−結 合グリコシル化部位２か所を星印で示す。矢印はフオリスタチン遺伝子において ５インストロンが見られる位置を示す。

ブタの構造と比較すると、これら２種間にはわずか６個の保守アミノ酸置換があ るにすぎず、それらの置換のうち２か所はシグナル配列内で起こっていることが 分かる。前駆体蛋白質は残基９５および２５９の位置に可能性のあるＮ−結合グ リコシル化が予想される。ブタＦＳの場合１，４ｓｔＬ（２５９）におけるグリ コジル化は暫定的に同定されたが１，４ａｍ（９５）においては炭水化物鎖が検 出されていない。この様式のグリコジル化がヒトＦＳに適用されるか否かは未確 認である。従ってヒトフオリスタチン成熟蛋白質の配列は３１５残基のうち３１ １について推定され、ブタの場合と全く同じであり；ヒトとブタのフオリスタチ ンの相違４か所は下記のとおりである１１３４位のＬｙｓＯ代わりにＡｒｇ　； 　１７１位のＴｈｒの代わりにＡｌａ；２４７位および２５１位のＧｌｓの代わ りにＡｓｐ０ラット成熟ＦＳも推定された。３１５残基配列につきラットＦＳと ｈＦｓＯ間には下記の７か所の相違がある１１３４位のＡｒｇの代わりにＬｙｓ 　；　１７１位のＡｌａの代わりにＳｍｒ；１７６位のＴｖｒの代わりにＳｍｒ 　；２２２位のＴｈｒＯ代わりにＧｉｙ：２９３および３００位のＡｓｐの代わ りにＧ１％　；ならびに３１２位のＩｔ−の代わりにＴｈｒ　０ 実質的に純粋なフオリスタチンＡもしくはＢ１またはそれらの無毒性塩類を薬剤 学的に受容できるキャリヤーと組合わせて薬剤組成物としたものを、妊娠調節の ためにヒトを含めだ補乳動物に静脈内、皮下、経皮、筋肉内または経口的に投与 することができる。フオリスタチンの投与により、雌動物において妊娠の減少が 、雌動物において精子形成の減少が誘発される。十分量のフオリスタチンの投与 によって哨乳動物に不妊が誘発され、不妊を診断するための試験にも有用であろ う。現在ＦＳは生殖組織および腎臓でのみ発現し、腎臓でのその発現に伴い若干 の付加的生物活性が示されるであろう。

フオリスタチンの４ドメインのうち、下記の３ドメインは相同である：残基６６ 〜１３５の配列、残基１３９〜２１０の配列、および残基２１６〜２８７の配列 。これらのドメインの各配列を含むペプチドは生物活性をもつと考えられる。従 って下記のペプチドを個々に調製することが望ましいと考えられるニブタフオリ スタチン（６６−１３５）；プタフオリスタチン（１３９−２１０）；プタフオ リスタチン（２１６−２８７）；ヒトフオリスタチン（６６−１３５）；および ヒトフオリヌタチン（２１６−２８７）。

ｈＦｓをコードする合成ｈＦｓ遺伝子が形成される。たとえばオーバーラツプす る相補的配列を含むオリゴヌクレオチドが応用Ｂ１０システムズ自動合成装置に より合成される。これらのオーバーランプオリゴヌクレオチドを融合させて二本 鎖ＤＮＡを形成し、ギャップをＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４リガーゼにより充 填して、哨乳動物フオリスタチンをコードする非染色体ＤＮＡを得る。

あるいはｈＦｓ配列が由来するクローンからの適宜なｃＤ　Ｎ　Ａ配列をＤＮＡ ポリメラーゼで処理して、成熟ｈＦｓ蛋白質をコードする目的の二本鎖ＤＮＡを 得る。

有意な鎖中のＦＳコード化配列の５′側に隣接してＡＴＧ開始シグナルがあり、 その結果発現ポリペプチドのＮ−末端に余分なメチオニンが付加される。ＦＳコ ード化配列の３′側に隣接して停止シグナルがある。５′ＤＮＡ鎖はそのまま、 ビエイラ（Ｖｉａｉｒα）ら丘２二ができる。β−ガラクトシダーゼプロモータ ーの制御下にあり、ＡＴＧ開始シグナルおよびシャインダルガノ配列がそれらの 天然の向きでプロモーターと連係して保有されているｐＵｃＦ３プラスミド中へ 、上記ＤＮＡ鎖をアニールする。

この組換えベクター（ｈＦｓと表示する）を塩化カルシウム法（前掲Ｃ３Ｈ）に より大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１１　）のＤＢ−１鎖中へ形質転換する。形質転換され た大腸菌をＬグロス中で培養し、アンピシリン耐性菌株を選択する。

ＤＮＡ鎖はそのＤＮＡ鎖の蛋白質生成物を発現させると予想される向きでプラス ミド中へ挿入されているので、アンピシリン耐性コロニーはｈＦｓに対して形成 された抗血清との反応性についてスクリーニングされる。これの免疫学的方法に よりスクリーニングされ、ｈＦｓ抗体と陽性反応を示すコロニーがさらに解明さ れる。細胞をそれらの培地から分離し、細胞溶解してそれらの上澄液を得る。形 質転換細胞からの上澄液をｈＦｓに対して形成された抗体との反応性につきＲＩ Ａにより測定する。

細胞上澄液１００ＷＬｌが得られ、これから下記の方法でｈＦｓが精製される。

総蛋白質の９８重量％にまで精製されたｈＦｓ約０．０１１Ｒ９が得られる。

余分なＮ−末端メチオニン残基を含む合成ｈＦｓの生物活性は、合成ｈＦｓが前 記のようにラット脳下垂体後葉培養系においてＦＥＨの基礎分泌を特異的に抑制 するインヒビン活性を示す能力により試験される。合成ｈＦｓの生物活性は天然 の精製、ＦＳのものと実質的に等しい。

余分なＮ−末端残基は臭化シアンまたはインチオシアン酸フェニルを用いる部分 的化学消化、およびこれに続く無水強酸、たとえばトリフルオロ酢酸を用いる処 理によって除去しうる。しかしこの方法は内部Ｍａｔ残基を攻撃し、天然蛋白質 構造をもつｐＦｓを若干は生成するが、生物活性蛋白質の全量を実質的に減少さ せる。これを酵素により除去する方が好ましい。

さらにｈＦｓ産生大腸菌クローンのいずれかにおいてミドをアガロースゲル上で 電気泳動し、増幅されたｈＦｓ挿入配列を分離および回収することができる。次 いで大腸菌およびビール酵母菌の双方を形質転換するために使用できるシャトル ベクターであるプラスミドｐＹＥ、に上記挿入配列を挿入する。合成りＮＡ鎖を この地点に挿入することにより、ＤＮＡ配列がプロモーターの制御下で、ＡＴＧ シグナルから適正な解読フレーム内に、かつキャップ部位に対し適正な間隔を置 くことが保証される。このシャトルベクターは、オラテートーモノホスフエート ーデカルポキシラーゼ遺伝子を欠失したビール酵母菌株であるＵＲＡ３を形質転 換するために用いられる。

形質転換された酵母を培地中で増殖させ、対数増殖に到達させる。酵母をその培 地から分離し、細胞溶解物を調製する。プールされた細胞溶解物はｈＦｓに対し て形成された抗体と反応性であることがＲＩＡにより判定される。これはｈＦｓ ペプチドセグメントを含むペプチドが酵母細胞内で発現されたことを証明する。

本発明は特定のポリペプチドを提供し、それらを生物学的に、および治療用とし て利用するのを可能にする。

ｈＦｓの産生は原核および真核双方の細胞系列において行うことができる。ｈＦ Ｓ合成は細菌または酵母細胞系列のいずれにおいても証明されるが、合成遺伝子 は高等動物の細胞、たとえば哺乳動物腫瘍細胞における発現のために挿入可能で なげればならない。これらの哺乳動物細胞はたとえば宿主動物内で腹腔内腫瘍と して増殖させ、腹腔液からｈＦｓを採取することができる。

以上の例はｈＦｓを組換えＤＮＡ技術により合成しうろことを示すが、生産が最 大であることを主張するためのものではない。今後、より効果的なりローニング ベクターおよび宿主細胞系列を選ぶことによりｈＦｓの収率が増大すると期待さ れる。生産を増大させるためには、真核細胞および原核細胞双方につき既知の遺 伝子増幅技術を用いることができる。

この種のペプチドはしばしば薬剤学的に受容できる無毒性塩類、たとえば酸付加 塩、または亜鉛、鉄などとの金属錯体（これらも本発明の目的に関して塩類と考 えられる）の形で投与することができる。これらの酸付加塩の例は塩酸塩、臭化 水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩 、コハク酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。有効成 分を錠剤の形で投与したい場合、錠剤は結合剤、たとえばトラガカント、コーン スターチまたはゼラチン；崩解助剤、たとえばアルギン醸；および滑剤、たとえ ばステアリン酸マグネシウムを含有することができる。液状での投与が望まれる 場合、甘味料および／または香味剤を用いることができ、等侵食塩液、リン酸塩 緩衝液中などにおいて静脈内投与することができる。

フオリスタチンは医師の指導のもとに投与すべきであり、薬剤組成物は通常、有 効量のペプチドを通常の薬剤学的に受容できるキャリヤーと組合わせて含有する 。用量は上記蛋白質を投与する個々の目的に応じて異なり、その蛋白質を常法に より雄性避妊薬として投与する場合、用量水準的０，１〜約１・η７／４（体重 ）で用いられる。

７オリスタチンの精製法を主としてＰＦＦからの単離について述べたが、フォリ スタチンは他の粗抽出液からも同様に精製することができる。ここで用いる“粗 抽出液”という語は卵胞液のほかに他の哺乳動物材料、ならびに哺乳動物フォリ スタチン■白質を製造するためにその時点の技術水準により形質転換された実試 室微生物、たとえば原核細胞（たとえば大腸菌）および真核細胞（たとえばビー ル酵母）をも意味する。

本発明を、現在本発明者が知る最良の様式をなす好ましい形態に関して記述した が、請求の範囲に示される本発明の範囲から逸脱することなく、当業者に自明の 変更および修正をなしうると解すべきである。

本発明の個々の特色は以下の請求の範囲に示される。

浄書（内容に変更なし） ｊ１９　ＮＯ ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　０　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ″の１′１１１　″ オーＮ＋−０：　：　Ｉ；シー　〜　″　４　″　リ　ト　の　−−−手続補正 書坊式） 平成　４年　３月シｇ日 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０２９７１ 昭和６３年特許願第５０７５１４号 ２、発明の名称 フォリスタチン及びその精製法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名　称　ザ・ソーク・インステチュート・フォー・バイオロジカル・スタディー ズ ４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付　平成　４年　３月１０日溌送印国際調査報告 １−１ｎ　Ａ＠−”　”ＰＣＴ１０ｓ８８１０２９７１

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．同定されない蛋白質を実質的に含有しない単量体哺乳動物フオリスタチン蛋 白質。
2. ２．ヒトフオリスタチンである、請求の範囲第１項に記載の蛋白質。
3. ３．ブタフオリスタチンである、請求の範囲第１項に記載の蛋白質。
4. ４．グリコシル化されている、請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載 の蛋白質。
5. ５．総蛋白質の少なくとも約９０重量％の純度を有する、請求の範囲第１項に記 載の３５，０００ダルトンの蛋白質において、該蛋白質が約５のｐＫａを有し、 該蛋白質が約３２，０００の分子量を有しかつＧｌｙ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ −Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ −Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌａｕで始まるアミノ末端配列を有するポリペプチドからな り、該蛋白質が黄体形成ホルモンの基礎分泌を抑制することなく卵胞刺激ホルモ ンの基礎分泌を特異的に抑制するものである蛋白質。
6. ６．下記の配列を有するか： 【配列があります】 【配列があります】、またはＦＳＨの基礎分泌を抑制する生物活性を示すその断 片である、請求の範囲第１項に記載の蛋白質。
7. ７．そのＣ−末端において約２７残基だけ短縮された、請求の範囲第６項に記載 の蛋白質。
8. ８．下記の配列を有するか： 【配列があります】、またはＦＳＨの基礎分泌を抑制する生物活性を示すその断 片である、請求の範囲第１項に記載の蛋白質。
9. ９．約２７残基だけ短縮されている、請求の範囲第８項に記載の蛋白質。
10. １０．フオリスタチン活性を有する材料を予備調製し、該材料をヘパリン部分が 結合している支持媒体にフオリスタチン蛋白質がヘパリン部分に吸着する条件下 で施し、次いでフオリスタチン蛋白質をヘパリン部分から溶離し、溶離されたフ オリスタチン蛋白質をゲル濾過してフオリスタチン活性を有する画分を選択し、 そしてグル濾過された画分を少なくとも１回、逆相高性能液体クロマトグラフィ ーカラムにより分画することよりなる、請求の範囲第１項に記載の実質的に均質 な蛋白質の採取法。
11. １１．組換えＤＮＡ法などにより調製された、請求の範囲第１項に記載の合成蛋 白質。
12. １２．請求の範囲第１項に記載の、哺乳動物フオリスタチンをコードする非染色 体ＤＮＡ。
13. １３．ブタフオリスタチン（６６−１３５）；ブタフオリスタチン（１３９−２ １０）；ブタフオリスタチン（２１６−２８７）；ヒトフオリスタチン（６６− １３５）；およびヒトフオリスタチン（２１６−２８７）よりなる群から選ばれ るポリペプチド配列からなる、請求の範囲第１項に記載の哺乳動物フオリスタチ ンの蛋白質セグメント。