JPS63119679A - インヒビンのα鎖またはβ鎖をコ−ドしている核酸、並びにその様な核酸を用いてポリペプチドを合成する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 α鎖またはインヒビンβ鎖を含有するタンパク質の製造
方法に関する。さらに詳しくは、本発明は。

インヒビンをコードしているＤＮＡを得る方法、並びに
、それを用いる方法、さらには動物またはヒトの天然の
インヒビンあるいは自然界に存在するそれらのアレルの
アミノ酸配列を出発物質としてインヒビン変異体を製造
する方法に関するものである。

インヒビンは性腺（生殖腺）で産生され、下垂体レベル
において、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌を特異的
に阻害するよう作用するタンパク質である。インヒビン
の存在については、最初、マツクラーフ（ＭｃＣｕｌ　
Ｉ　ａｇｈ　）により仮説が出された［１９３２、「サ
イエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　Ｊ７６：１９−２０）
。その様なゴナドトロピン（性腺刺激ホルモン）分泌に
対する優先的な制御作用に大きな関心が寄せられ、過去
５０年間に、多数の研究者達が、精巣抽出液、精子、精
巣網成、精液血東および卵胞液からこの物質を単離し、
様々なバイオアッセイを用いて特性化することを試みた
。多くの文献において、５，０００〜１００，０００ダ
ルトンの分子量を有するインヒビン様物質を精製したと
報告されているが、継続研究において。

これらの物質はホモジーニアス（均質）でなかったり、
真のインヒビンに予測される高度の特異活性を持たず、
そして／または本明細書に記載したインヒビンの分子特
性を示さない物質であることが分った〔ドウ・ジョン（
ｄｅ　Ｊｏｎｇ　）、インヒビン・ファクター・アーテ
ィファクト（Ｉｎｈｉｂｉｎ−Ｆａｃｔｏｒ　　Ａｒｔ
ｉｆａｃｔ　）　　［−Ｔ−レキュラー・アンド・・セ
ルラー・エンドウリン（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　＆Ｃｅ
１ｌｕｌａｒ　　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ　）　　Ｊ　１３　
　：　　１　−　１０　　（１９７９）：　　シエスら
（５ｈｅｔｈ）　１９８４　ｒ　Ｆ　。

Ｅ、　Ｂ、　Ｓ、　Ｊ　１６５（１）　１１−１５　；
　　セイダーら（Ｓｅｉｄａｈ　）％１９８４　　「Ｆ
、Ｅ、Ｂ、Ｓ、　Ｊ　１７５　（２）：　　３４９−３
５５　：ジルジャら（Ｌｉ１ｊａ　）、１９８５年３月
、［Ｆ、　Ｅ、Ｂ、　Ｓ、　Ｊ　１９８２　（１）　：
１８１−１８４　：　　りら（Ｌｉ）１９８５年６月「
プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
イ・オブ・サイエンスイズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

Ａｃｄ、Ｓｃｉ、　）　ＵＳＡ　Ｊ　８２　：　４０４
１−４０４４　＋セイダーら（５ｅｉｄａｈ　）　［Ｆ
、　Ｅ、Ｂ　、Ｓ、　Ｊ　　１６７（１）　：　９８−
１０２　：およびベクサツクら（Ｂｅｋｓａｃ　）　１
９８４．　ｒインター・ジエイ・アンドｏｏシイ（Ｉｎ
ｔｅｒｎ、Ｊ、Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ　）　Ｊ　　７　：
３８９−３９７　）。

インヒビン活性を有するポリペプチドが、ウシまたはヒ
ツジの卵胞液から精製された（　ＰＣＴ８６１０００７
８．１９８６年１月３日公開）。このタンパク質はＳＤ
Ｓ　−ＰＡＧＥに基づく分子量５６，０００±１．００
０を有しており、見掛は上の分子量４４，０００±３，
０００および１４，０００±２．０００を有する２つの
サブユニットに解離し得ることが報告されている。各サ
ブユニットのアミン末端配列が記載されている。

いずれも約３２，０００ダルトンの分子量の、インヒビ
ン活性を有する２種のタンパク質をブタの卵胞液から単
離することに成功した。ヘパリン−セファロース・アフ
イニテイ・クロマトグラフィ　。

−、ゲル濾過および逆相高速液体クロマトグラフィー（
ＲＰ−ＨＰＬＣ）　　等のタンパク質分離法を組み合わ
せて、実質上均質（総タンパク質重量の９０％）に、ブ
タインヒビンを精製した。

これらのタンパク質は豚から得た物質から実質上、均質
な状態で単離され、プロティンＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ
　）およびプロティンＢ　（ＰｒｏｔｅｉｎＢ）と命名
された。各タンパク質は分子量３２，０００ダルトン（
３２Ｋ）であり、これらは分子量が１８．０００　ダル
トンおよび１４，０００　ダルトンであって、タンパク
質内でジスルフィド結合を介して結合し、ホルモン活性
を示す２本のポリペプチド鎖からなっている。両タンパ
ク質の１８，０００ダルトン（１８Ｋ）鎖またはアルフ
ァ（α）鎖のアミノ末端アミノ酸残基配列は１式： ％式％ で示される。また、プロティンＡの１４，０００　ダル
トン（１４Ｋ）鎖またはベーター（β）鎖のアミノ末端
アミノ酸残基配列は、式： ％式％ で示され、プロティンＢのそれは１式：Ｃ１ｙ−Ｌｅｕ
−Ｇｌ　ｕ−Ｘ−Ａｔ　ｐ−Ｇｌ　ｙ−Ａｒ　ｇ−Ｔｈ
ｒ−Ａｓ　ｎ−Ｌｅｕ　−Ｘ−Ｘ−Ａｒ　ｇ−Ｇｌ　ｎ
−Ｇ１　ｎ−ｐｈ　ｅ　−Ｐｈｅ−Ｉ　１　ｅ−Ａｓｐ
−ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕで示される。・プロティンＡ
およびプロティンＢは完全に特性化されている。各３２
にタンパク質はいずれもインヒビン活性を示し、ＦＳＨ
の基礎的な分泌を特異的に阻害するが、黄体形成ホルモ
ン（Ｌ　Ｈ）の分泌を阻害することはない。各ポリペプ
チド鎖はホルモン活性を示さなかった。これに関する元
の（親）出願を行った後、インヒビンβ鎖二量体（ダイ
マー）が、卵胞液中に天然の存在物（アクティピンと称
される）として存在しており、それが、ラット脳下垂体
前葉細胞によるＦＳ）Ｉ分泌を刺激する作用を有するこ
とが示された〔バレら（Ｖａｌｅ）、１９８６ネイチヤ
ー「Ｎａｔｕｒｅ　Ｊ３２１　：　７７６−７７９およ
びリングら（Ｌｉｎｇ　）１９８６　　［ネイチャーＪ
　３２１　：　　７７９−７８２　、］。

ヒト由来のインヒビンのα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列
は、本発明より以前には知られていなかった。動物のイ
ンヒビンに関して行われた研究に匹敵する研究を行うた
めに必要な大量のヒト卵胞液の入手が容易でないばかり
か、ヒトのインヒビンと動物のインヒビンとが、同様の
精製方法が有効な程度に、充分類似しているという保証
もない。

従って、ヒトインヒビンのアミノ酸配列の特徴を決定す
る方法が必要とされている。

また、インヒビンのα鎖またはβ鎖を、好ましくは、懸
案の（ｑｕｅｓｔｉｏｎｅｄ　）インヒビンにとってホ
モローガス（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　）な種のタンパク
質を殆んど、あるいは全く含有しない状態で、好ましく
は生物学的に活性なインヒビンのα鎖またはβ鎖を製造
するための経済的な方法が必要とされている。

これらの、並びに他の目的は本発明の全脱から明らかと
なるであろう。

要約 ブタおよびヒトの成熟インヒビンのα鎖およびβ鎖、お
よびそれらのプレプロ形並びにプロ形の前駆体をコード
している核酸を単離し、複製可能なベクターにクローン
した。インヒビンをコードしているｃＤＮＡの配列決定
により、成熟インヒビン鎖のＮ末端に位置し、−緒にな
って生物活性なポリペプチドを発現するプロドメイン（
ｐｒｏｄｏｍａ　ｉｎ　）　　＠域が同定された。この
プロドメイン領域、あるいはプロドメイン・イムノゲン
（免疫原）は、形質転換細胞におけるプレプロインヒビ
ンのプロセッシングの監視（モニター）、マたは動物に
おける臨床条件の変化あるいは生殖生理学上の変調に関
する実験に有用である。本発明においてはα鎖の核酸ま
たはβ鎖の核酸を用いて宿主を形質転換し、成熟インヒ
ビンα鎖および／またはβ鎖を組換え発現させ１診断学
的検定に用いるために、前駆体インヒビン鎖のプロドメ
イン配列を調製した。さらに詳しくは、該領域をコード
している核酸をプロモーターのコントロール下において
、複製可能なベクターにライゲートし。

このベクターで宿主細胞を形質転換し、宿主細胞を培養
し、培養された細胞からプロドメイン、アクティビンま
たはインヒビンを回収することからなる方法により、イ
ンヒビンα鎖および／またはβ鎖を組換え細胞培養内で
発現させた。本発明方法によれば、インヒビン、アクテ
ィビンおよびプロドメインを、ホモローガスな供給源の
タンパク質を全く含まず、生物学的に活性な形で製造す
ることができる。

本発明において同定された核酸はブタまたはヒトのイン
ヒビンのα、βＡおよびβＢ鎖をコードしている。組換
え細胞は、αβＡまたはαβＢインヒビンを発現するか
、あるいは、β−鎖へテロ二量体またはホモ二量体（こ
れらは文献中にアクティビンとして総括されている）を
発現するよう形質転換された。組換え細胞の発現産物で
あるβ鎖二量体は、天然状態で好適に伴なっているホモ
ローガスなタンパク質を含んでいない。

インヒビンまたはアクティビン並びにそれらの無毒な塩
と薬学上許容し得る担体とを混合して製剤化し、徳性（
好性）をコントロールするためにヒトを含む哺乳類に投
与することができる。インヒビン投与によって雌性哺乳
類では徳性の減少、雄性哺乳類では精子形成の減少を来
し、充分量を投与することにより不稔を引き起こす。イ
ンヒビンは不妊の診断にも有用である。文献によるとア
クティビンは脳下垂体細胞からのＦＳＨ分泌を刺激する
ことができることが示されており、従って、稔性誘導治
療に有用である。

また、本発明方法により、インヒビン、アクティビンお
よびプロドメインの、天然の類似体からの、−次アミノ
酸配列および／またはグリコシル化における変化を伴な
った変異体の簡便な製造方法、とりわけ、インヒビン、
アクティビンまたはプロドメイン領域と免疫原ペプチド
との融合物を簡便かつ容易に製造することができる。

第１Ａ図はブタα鎖のｍ　ＲＮ　Ａの模式図である。

配列決定に用いたオーバーラツプした（　Ｉ）　Ｎ　Ａ
クローンをｍＲＮＡ構造を示す図の上方に記した。

λクローンの３′末端の黒い四角はこれらのクローンが
特異的なプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ　）　　により
得られたことを表わしている。非翻訳配列を直線で示し
、暗号配列を四角で囲んで示した。空白部分はシグナル
配列およびプロ配列の暗号領域を指し、交差した斜線で
示した領域は１３４アミノ酸α−鎖を指す。スケールは
ヌクレオチドを最長のｃＤＮＡクローンの５′末端から
表わしたものである。

第１Ｂ図はブタインヒビンα鎖前駆体のヌクレオチド配
列および推定のアミノ酸配列を示す。ヌクレオチド番号
は左側に、アミノ酸番号は全般を通して記載されている
。下線を付したアミノ酸配列は長い合成りＮＡプローブ
を設計するのに用いられた配列である。この３６４アミ
ノ酸前駆体には、疎水性のシグナル配列、プロ領域、並
びに成熟の鎖（アミノ酸２３１−３６４）が含まれてい
る。成熟α鎖のＮＨ２末端の直ぐ上流にタンパク分解的
なプロセッシング部位であるＡｒｇ−Ａｒｇ（黒色バー
で表示）がある。その他、プロ領域内に存在する、幾つ
かの推定の二塩基性プロセッシング部位は白色バー（空
白の捧）で示されている。

単一の、潜在的ｒｌＮ−結合グリコシル化部位は、交差
斜線を引いたバーで示されている。ｍ　ＲＮ　Ａの３′
末端と近接したＡＡＴＡＡＡ　　ボックスに下線を施し
て示した。

第２Ａ図はブタのβＡサブユニットｍＲＮＡおよびβＢ
サブユニットｍＲＮＡを表わし、その暗号配列を四角で
囲んで示した模式図である。βＡサブユニットおよびβ
Ｂサブユニット（ダッシュで表示）は、暗号配列の３′
末端に向かってコードされている。３′および５′非翻
訳領域は線で示されている。βＢサブユニットｍＲＮＡ
の５１および３′非翻訳領域の長さはｍ　ＲＮ　Ａのサ
イズ（第３図）、並びに、それとβＡｍＲＮＡとの明白
な類似性に基づいて帰納的に決められた。図中、破線は
ｃＤＮＡの仮定の領域を示している。オーバーラツプす
るオリゴｄＴにプライムされたｃＤＮＡクローンおよび
ランダムにプライムされたクローン（λＰＩＮ７９Ａ５
ｇ、λＰＩＮβＢＩＳ、およびλＰＩＮβＢ２５）の相
対的な位置を示した。スケールは４，５　ｋｂ　ｍＲＮ
Ａの５′末端から、ヌクレオチド番号で示されている。

ｊ４２Ｂ図は、ブタ・インヒビンのβサブユニツト前駆
体のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列を示す
。βＢ配列はβＡ配列と、最大限ホモロジイに並んでい
る。βサブユニツト前駆体のＮＨ３末端は角型かつこと
矢印で示されている。

システィン残基には陰影を施し、可能なプロセッシング
部位を白色バーで示すと共に、可能なグリコシル化部位
を交差した斜線を付した箱で囲んだ。

両配列の、終止コドンの３′側に存在する極めてＧＣに
富む領域、イントロン配列に、上線（オーバーライン）
または下線を付した。オリゴヌクレオチドの設計に用い
たアミノ酸配列に、ＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナ
ルの如く下線を付した。λＰＩＮ−βＡ８　とこの領域
をカバーする他のクローン類との間には１個のヌクレオ
チドの相違があった。Ｇ　−、Ａ変化によりアミノ酸２
７８のグリシンからセリンへの変化が起きた。成熟βＡ
サブユニットのＮＨ２末端の直ぐ上流には、プロ配列を
つ 伴なて、Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　（
黒色バ△ −）タンパク分解的プロセッシング部位が存在する。β
Ａサブユニットのアミノ酸配列にのみ番号が付されてい
る。

第３図はα、βＡおよびβＢサブユニット・ハイブリダ
イゼーションプローブを用いて行ったブタの卵胞ｍ　Ｒ
Ｎ　Ａについてのノーザン・プロット・分析の結果を示
す図である。ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｆレーンはポリＡ＋
ｍＲＮＡ　　を、ｅおよびｇレーンは全ＲＮＡを示して
いる。２８５および１８Ｓリポソーム性ＲＮＡの位置を
表示した。ａ、　ｄおよびＣレーンはαサブユニットｃ
ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ：ｄ、ｅおよびｇ
レーンはβＡサブユニット特異的プローブとハイブリダ
イズさせ：ＣレーンはβＢサブユニット特定的プローブ
とハイブリダイズさせた結果を示す。αサブユニットｍ
ＲＮＡは約１，５ｋｂであり、βＡサブユニッ１−ｍＲ
ＮＡは約４．５ｋｂである。３％　ｂおよびＣレーンに
示したハイブリダイゼーションは、ｍＲＮＡの相対レベ
ルを判定するために略等しい長さと特異活性を有するプ
ローブを用いて行われた。

第４Ａ図はヒトβ−ＴＧＡ７′ミノ酸配列と、ブタイン
ヒビンのβＡおよびβＢアミノ酸配列とを比較して示し
た図である。システィン残基周辺の配列が示されている
。同一残基は箱で囲まれているが保存的な変化は星印に
より示されている。図中、Ｉｎｈ　　はインヒビンを表
わす。

第４Ｂ図はαサブユニット配列とβＡインヒビン配列と
の比較図である。図中、ｌｎｈ　　はインヒビンを表わ
す。

第５図は代表的な、ブタインヒビンの組換え発現プラス
ミドの組立て模式図である。図中、Ｉｎｈはインヒビン
を表わす。

第６図はヒトαイン上ビンｃＤＮＡのヌクレオチド配列
および推定のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸数
３３５のプロまたはイントロン配列Ｋ、仮定のシグナル
開裂部位から番号を付した。

アミノ酸数１６のシグナル配列は−１から−１６までの
番号が付されている。ブタの配列と相同（ホモロジイ）
の場合は、シグナル配列中の１２アミノ酸残基がさらに
予測される。この図および他の図において、推定の二塩
基性プロセッシング部位を白色バー、グリコシル化部位
を斜線を付したバーで、そしてアミン末端成熟鎖プロセ
ッシング部位を黒色バーで示した。ボＩＪ（Ａ）付加シ
グナル配列には下線を施した。システィン残基には陰影
を施した。

第７図はヒトとブタのαインヒビンタンパク質配列の比
較図である。ホモロジイを最大にするために間隙を配し
、同定していない位置には星印を付した。番号はブタ配
列に関して付されており、これは、ヒトの配列よりもア
ミノ酸１個分短かい。

第８図はアミノ酸数２８のヒトβＡインヒビンシグナル
配列（残基−２８〜−１）　と、長さ３７８アミノ酸の
前駆体のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列を
示す図である。前駆体中の基本的なプロセッシング部位
は黒色バーを、潜在的なグリコシル化部位は斜線を付し
たバーを、それぞれ配列の上方に配して示した。システ
ィン残基には陰影を付した。

第９図はヒトβＢインヒビンｃＤＮＡのヌクレオチド配
列および推定のアミノ酸配列を示す図である。この配列
はシスティン残基（７位）から始まり、βＡ配列（第８
図）中の残基７に存在するシスティンから並んでいる。

成熟インヒビンのプロセッシング部位は黒色バーで、潜
在的なグリコシル化部位は交差斜線を付したバーで示さ
れている。システィン残基には陰影を施した。

詳しい記述 本発明のポリペプチドはインヒビンのα鎖およびβ鎖、
並びにそれらの多量体形（アクティビンおよびインヒビ
ン）、それらのプレプロ形、それらのプロドメイン、そ
れら多路および多形のグリコシル化および／またはアミ
ノ酸配列における変異体を含む。ヒトまたは動物供給源
由来のインヒビン（アレルを含む）は、脳下垂体前葉細
胞からのＦＳＨの基礎分泌を阻害するがＬＨの基礎分泌
を阻害せず、アクティビンはその逆の作用を表わす〔以
後、１ホルモン活性（ｈｏｒｍｏｎａｌ　ｌ　ｙ　ａｃ
ｔ　１ｖｅ）”アクティビン、または１ホルモン活性”
インヒビン吉呼称〕。

一般に、アミノ酸配列変異体は第１Ｂ図、２Ｂ図、６図
、８図および９図に示したブタまたはヒトのαあるいは
β鎖配列と、適切な割合で、実質上ホモローガスである
。実質上ホモローガスとは、２種のタンパク質を、その
アミノ酸残基の番号が最大限一致する様に並べたとき、
候補ポリペプチドの一次アミノ酸配列の約７０％以上が
ブタまたはヒトの鎖と対応していることを意味する。残
基の一致を最大にするためには、アミノ酸および／また
はカルボキシ末端のシフトや、必要なギャップの導入お
よび／または候補ポリペプチド中に挿入体として存在す
る残基の欠失が行われる。例として、βＡおよびβＢサ
ブユニット、あるいはヒトおよびブタのび一インヒビン
配列が最大限ホモロジイに並んでいる第２Ｂ図および第
７図を参照されたい。一般に、アミノ酸配列上の変異体
は第１Ｂ、２Ｂ、６．８および９図に示した対応する天
然の配列と約９０％以上ホモローガスである。

ホルモン的に活性でないが（１）天然の対応物（カウン
ターパーツ）に対して惹起された抗体と免疫学的に交差
反応し得るか、あるいは（２）その様な対応ポリペプチ
ドと、細胞表面の受容体への結合において拮抗し得る変
異体であって、成熟インヒビン鎖またはプロドメイン配
列と実質上ホモローガスであるか、あるいはホモローガ
スでないポリペプチドを包含する変異体も本発明の範囲
に含まれる。ホルモン的に不活性な変異体は、フチグメ
ントなかんずく単離されたインヒビンのαまたはβ鎖の
組換え合成法あるいは有機合成法によって製造されるか
、またはアミノ酸配列に変化を導入することにより、分
子が前記定義のホルモン活性をもはや示さなくなり、生
産される。

免疫学的な交差反応性または受容体との交差反応性とい
う語句は、候補ポリペプチドがホルモン活性類似体とホ
ルモン活性類似体に対して惹起されたポリクローナル抗
血清との結合を競合的に阻害し得ることを意味する。そ
の様な抗血清は、ヒツジまたはウサギのＳ、Ｃとホルモ
ン活性類似体を注射するか、あるいは、完全フロイント
のアジュバント中に入れた誘導体を与え、不完全フロイ
ント中のＳ、Ｃを腹腔内にブースター注入することによ
り常法通り調製される。

゛　ホルモン活性を有さないが、ホルモン活性なインヒ
ビン、アクティビンまたはプロドメインに対する抗血清
と反応し得る変異体は、（ａ）天然の類似体またはその
抗体の診断アッセイにおける試薬（ｂ）既知の方法で不
溶化した場合には、抗血清から抗−天然同族体抗体を精
製するための物質として、（（ｃ）ホルモン活性同族体
に対する抗体を惹起するための免疫原として、有用であ
る。

本発明は、インヒビンαまたはβ鎖前駆体のプロ配列お
よび／またはプレプロ配列、あるいはそれらの免疫学的
または生物学的に活性なフラグメントであって、実質上
、対応する成熟インヒビン鎖を含んでいないものを含む
。ブタまたはヒトのインヒビンに関するこれらの配列は
、第１Ｂ、２Ｂ、６．８および９図に示されている。ブ
タαサブユニット前駆体のプレプロ配列は残基１から約
２３０までのポリペプチドであり、βＡサブユニットの
プロ配列は残基１から約３０８によって構成されている
。本明細書中では、これらの配列をプロドメイン配列に
包含させることとする。

αおよびβサブユニツトプロドメイン配列は。

タンパク分解的部位によって境を接しているいくつかの
ドメイン（領域）から成っており、本発明においては、
それらドメインを、個別に、あるいは他のドメインと結
合した形で合成する。基本的なブタのβＡドメインは、
残基１〜約７０（ドメイン■）、約７０〜約１１０（ド
メイン■）、約１１０〜約１８０（ドメイン■）、約１
８０〜約２６０（ドメイン■）および約２７０〜約３０
９（ドメイン■）にある。さらに詳しくは、ブタαドメ
インは、式： ％式％ のドメインを含む。また、ブタβＢ　ドメインはホモロ
ーガスなβドメインと同じ配列のドメインおよび、式： ％式％ で示されるドメインを含む。さらにブタαドメインは、
式： ％式％ で示されるドメインを含む。代表的な結合（コンビネー
ション）ドメインポリペプチドは、βＡ　ドメイン■の
Ｃ末端とβＡドメイン■のＮＨ２末端とが結合してなる
ポリペプチドである。さらに、これらのドメインは、第
１Ｂまたは２Ｂ図に示さ分解に抵抗性の１〜４残基ポリ
ペプチド（例えばグルタミニル残基またはヒスチジル残
基）により融合しているか、あるいは直接、融合してお
り、結合ドメインポリペプチドの産生にはこれら３種の
場合の全てがあてはまる。

基本的なヒトα鎖プロドメインは、大概残基３゜−１９
９および１−２９、ヒトα鎖プロドメインは大概、残基
１−３０．３２−４０，４３−５９．６２−８０．８３
−１８５　および１８６−２３０゜ヒトα鎖プロドメイ
ンは大概、残基１−１３．１５−３０．３２−５９．６
２−１４５．１４８−１９５および１９８−２４１それ
ぞれ、第６．８および９図の番号付けによる）である。

結合プロドメインポリペプチドも本発明の範囲内に含ま
れ、それらは、例えば、残基的４３−８０のβＡプロト
イン、残基的１−３０および約３２−１４５のβＢプロ
ドメインである。好ましいヒトα、βＡおよびβＢ鎖プ
ロドメインは、残基的１−２９、約４３−８０および約
１−３０である。

無傷の、単離されたプレプロまたはプロドメイ”ンβＡ
、βＢまたはα配列は、組換え細胞培ｉＫより最もよく
製造できる。個々の準構成（サブコンポーネント）ドメ
インは、有機化学における常套手段、あるいは組換え細
胞培養により合成される。次いでそれらを既知の方法を
用い、放射性同位元素、あるいは、酵素または螢光等の
検出可能な基で標識し、プレプロまたはプロ形のインヒ
ビン（個々のドメインをも含む）あるいはその前駆体を
コードしているＤＮＡを有する形質転換体におけるプレ
プロまたはプロ形のインヒビン（ドメインを含む）のレ
ベルを検出するためのイムノアッセイに用いる。このア
ッセイは、プロインヒビンのタンパク分解的加水分解が
宿主形質転換体内で起きているか、あるいはその培地中
で起きているかを決定するのに有用である。このアッセ
イはまた、組換え合成における律速段階が、ｍ　ＲＮ　
Ａのプレプロ形への翻訳か、プレプロ形から成熟インヒ
ビンへのプロセッシングのいずれにあるかを調べるのに
も有用である。例えば、プレプロまたはプロインヒビン
が細胞リゼイト中に高レベルに存在しており、分泌され
た成熟インヒビンのレベルが比較的低いということは、
宿主細胞がインヒビンＤＮＡを適当に転写し、翻訳して
いるが、充分な速度で前駆体をプロセッシングしていな
いことを示唆している。従って、この場合には、専ら、
形質転換用プラスミドの転写効率や翻訳効率の向上を目
的とする宿主細胞以外の宿主細胞を選ぶ方が良く、それ
は、例えば、他のプロモーターを選択することで行われ
る。プロドメイン配列は、動物の生殖サイクルおよび徳
性における生理学上の共同調節に関与していると思われ
ている。

アミノ酸配列の変異体は、（１）ホルモン活性であるか
、（２）成熟インヒビンあるいはプロドメインαまたは
β鎖配列に対して惹起された抗体と交差反応し得るか、
あるいは（３）イン上ビン／アクティビンの細胞表面受
容体と交差反応し得るものであって、天然のインヒビン
またはプロドメイン配列の配列を出発物質とする一次ア
ミノ酸配列を有することを特徴とする配列である。これ
らの誘導体は、通常、標的ＤＮＡをコードしているＤＮ
Ａが変異体をコードする様に修飾するためＫ、ヌクレオ
チドの挿入、欠失または置換を行った後、組換え細胞培
養内でＤＮＡを発現させることにより調製される。約１
００−１５０までの残基を有するポリペプチドはまた、
インビトロ合成法により、好都合に調製できる。その様
な変異体は、天然に存在するアレル変異または種間変異
とは異なる特徴である、予め定められた性質上の変化を
有することを特徴とする。変異体は天然に存在する類似
体と質的に同じ生物学的活性を示すか、あるいはその様
な類似体に対して拮抗的に作用することができる。

配列の変化を導入する部位は予め定めておくが、突然変
異そのものを予め定めておく必要はない。

例えば特定の位置の残基での突然変異を適切に行うため
には、標的コドンまたは領域に無作為な変異誘発を行い
１発現されたインヒビン突然変異体を、所望の活性の適
切な組合わせについてスクリーニングする。既知の配列
を有するＤＮＡの予定の部位で置換突然変異を誘発する
方法はよく知られている（例１Ｍ１３プライマー突然変
異誘発）。

突然変異誘発は、通常、アミノ酸残基約１〜１０鉱の挿
入、または約１〜３０残基の欠失により行われる。欠失
または挿入は隣接する１対、即ち、２残基の欠失または
２残基の挿入により行うことが好ましい。置換、欠失、
挿入、またはそれらの併用１等を組合わせて最終的な組
立てを行う。挿入には、アミノ末端またはカルボキシ末
端の融合、例えばカルボキシ末端における付加的疎水性
の延長も含まれる。しかしながら、置換突然変異のみを
行うことが好ましい。暗号ＤＮＡ内における突然変異は
、暗号配列をリーディングフレーム外に位置せしめるよ
うなものであってはならず、また。

ハイブリダイズして、ループやヘアピンの如き、ｍ　Ｒ
Ｎ　Ａの二次構造を形成させる可能性のある相補領域を
作らないことが好ましいことは明らかである。

本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡに於ける
突然変異の全てが最終分泌産物に発現されるわけではな
い。例えば、置換型のＤＮＡ突然変異体の主なものは、
固有のブタまたはヒトのびまたはβ鎖分泌リーダーが、
そのリーダー配列内での欠失、または置換のいずれかに
より、異る分泌リーダーまたはシグナルで置き換えられ
、固有のリーダー配列の大部分または全部が所望の宿主
によって一層認識され易いリー　グーに変化されたもの
である。例えば、原核性発現ベクターを組立てるには、
細菌のアルカリホスファターゼリーダーまたは熱安定性
エンテロトキシン１１１Ｊ−グーのためにブタまたはヒ
トのαまたはβ鎖分泌リーダーを欠失させ、酵母発現ベ
クターの組立てには、酵母インバーターゼリーダー、α
因子リーダーまたは酸ホスファターゼリーダーで、該リ
ーダーを置換する。しかしながら、ブタおよびヒトの分
泌リーダーは多くの、異質（ヘテロローガス）のより高
等な真核細胞によって認識される。宿主によって分泌リ
ーダーが「認識コされると、成熟インヒビンまたはプロ
ドメインと、Ｃ末端において融合しているリーダーポリ
ペプチドの融合が、宿主のシグナルペプチダーゼで開裂
され、成熟インヒビンまたはプロドメインポリペプチド
が分泌され得る。

最終的なアミノ酸配列誘導体として発現されないもう一
つの主ｆｌ　Ｄ　Ｎ　、Ａ突然変異体は、発現を促進す
るためのヌクレオチド置換に関するものであり、それは
、第−義的に、転写されたｍ　ＲＮ　Ａに５′ステムア
ンドループ構造が形成されることを回避する〔ドウ・ボ
アら（ｄｅ　Ｂｏｅｒ　）　ＥＰ７５゜４４４Ａを参照
〕ためであり、あるいは、選択された宿主によってより
転写され易いコドンを与える（例えば、大腸菌または酵
母による発現に好都合な、周知のコドンを与える）ため
のものである。

これらの置換物は、置換されたアミノ酸をコードしてい
ても、いなくともよいが、コードしていない方が好まし
い。　　゛ 挿入および置換によるアミノ酸配列変異体は、標的イン
ヒビン、アクティビン、プロドメインあるいはプロ形の
インヒビンまたはアダティビンの予め定められた位置に
１またはそれ以上のアミノ酸残基が導入されているか、
その位置から除去されているタンパク質である。最も一
般的には、挿入変異体は、ｃｔまたはβ鎖、プロドメイ
ン、あるいは他のインビトロ合成のアミン末端またはカ
ルボキシ末端にヘテロローガスなタンパク質またはポリ
ペプチドが融合している融合物である。免疫原性誘導体
は、例えばプロドメインポリペプチド等の標的配列に、
インビトロ合成、あるいは。

融合物をコードしているＤＮＡで形質転換した組換え細
胞培養により、免疫原性ポリペプチドを融合させること
により調製される。その様な免疫原性ポリペプチドは、
じｐＬＥやベーターガラクトシダーゼ等とそれらの免疫
原性フラグメントとが一緒になった細菌ポリペプチドで
あることが好ましい。その他、分泌されるべきタンパク
質のＮＨ２末端上流に、ヘテロローがスな真核性の分泌
シグナル（例えばヘルペスウィルスｇＤシグナル）、１
または微生物の分泌シグナルを挿入したり、プロテアー
ゼプロセッシング配列を挿入することも含まれる。シス
ティン等の不安定な残基の欠失は、例えば、α鎖または
β鎖の酸化安定性が増強されるので、好ましい。欠失誘
導体は、α鎖フラグメントまたはβ鎖フラグメントを産
生ずるであろう。

その様なフラグメントも、それが生物学的または免疫学
的に活性であれば、本発明の範囲内に含まれる。例えば
、約１１〜４５（成熟Ｇｌｙｌからの番号による）のβ
ＢまたはβＡ残基を含むフラグメントは本発明範囲に含
まれる。

プロドメインポリペプチド、インヒビンおよびアクティ
ビンの免疫原性コンジュゲート（抱含体）は、βラクタ
マーゼまたはヘルペスｇＤタンパク質の如きウィルス性
抗原の様な免疫原性ポリペプチドとの融合物として、組
換え細胞培養により合成するか、あるいは、融合してい
ない形でポリペプチドを合成（組換え法またはインビト
ロ合成法により）した後、二価の交差結合剤を用いてキ
ーホール・リンペット・ヘモシアニンまたはｓＴ工の如
き免疫原性ポリペプチドと共有結合性の交差反応を生せ
しめるこきにより、容易に合成することができる。この
免疫原性ポリペプチドは、ミョウバンまたはフロイント
の如きワクチンアジュバントと一緒に処方される。アジ
ュバント中のタンパク質の調製法や、交差結合の方法は
、動物に対するワクチン接種法として当業者によく知ら
れており、用いられている方法である。免疫原性コンジ
ュゲートは、インヒビン製造における監視に用いるため
の、プロドメイン領域に対する抗体を製造する上で有用
であり、あるいは、動物の生殖系または徳性における生
理学的調節を行い得る抗体を惹起するためのワクチン接
種において、インビボで有用である。通常、様々な用量
でプロドメインまたはその免疫原を実験動物またはブタ
を徳性にするために投与し、動物の生殖系および徳性を
監視すると共に、通常の競合的またはサンドイッチイム
ノアッセイによって抗イムノゲンまたはプロドメインの
血清レベルを検定する。

置換誘導体は、標的コドンのＤＮＡに突然変異が誘発さ
れており、以後はそのコドンにより異るアミノ酸がコー
ドされているが、この突然変異したＤＮＡから発現され
る分子の残基の番号が混乱していることはない。置換ま
たは欠失は、例えば、タンパク分解部位の内部で、また
はその近辺で残基を置換する、あるいはその部位の残基
を欠失させる。または、システィンを他の残基て置き換
えてジスルフィド結合を追加することによりタンパク分
解部位を消失させ、本発明のタンパク質の安定性を増加
させるのに有用である。置換は成熟、またはプロドメイ
ンαまたはβ鎖の合成あるいは回収を容易にするのに有
用である。例えば、成熟インヒビン配列中のメチオニン
残基を置換または欠失させ、プレプロ配列を欠失させ、
成熟ＮＨ２末端残基のＮＨ２末端の直ぐ隣りの一１部位
にメチオニンを挿入し、他の配列を外来性メチオニンの
Ｎ末端側に挿入する。この場合、インヒビン誘導体は中
間にメチニル残基を有する融合物として発現し、次いで
、この残基の位置において、臭化シアンを用いる既知の
手段はより開裂される。次いで融合物から遊離した成熟
インヒビン誘導体を回収する。

ブタインヒビン誘導体の例として、［Ａ　Ｓ　ｎ　２６
６−）Ｇｌｎ３１ｎｈｃｔ（仮定のグリコシル化部位を
除去するため）、〔ＣｙＳ３２５　またはＣｙ　ｓ　ａ
。４−〉△〕Ｉ　ｎｈα、　（ｃｙ　Ｓ　３６１または
ＣｙＳ３６３−＞△）　Ｉｎｈｃｒ　。

〔ＬｙＳ３２１またはＬｙＳ３２２−＞△〕ＩｎｈβＡ
　または［Ｌ　ｙ　Ｓ　３２２−　）Ｈｔ　ｓまたは５
ｅｒ　）　ＩｎｈβＡ（潜在的なタンパク分解部位を不
活化するため）　、　（Ｌｙｓ３□５−）Ａｒｇ　　；
　　Ｖａ１３１６−）　　Ｔｈｒ　）　　ＩｎｈβＡ　
（βＡ／β３／％イブリッドを生成するため）　、、　
［：ＣｙＳ３Ｂ８　　またはＣｙ　ｓ　３９０−）△］
　ＩｎｈβＡ　、　（ＬｙＳ４１１−）Ｇｌ　ｎ　〕Ｉ
ｎｈβ、　、　［Ａｒ　ｇ３１ｓ　−）　Ｌ　ｙ　ｓ　
、　Ｖａ　ｌ　３１６−）Ｔｈ　ｒ　〕Ｉ　ｎｈ　／３
　Ｂ、　（βＢ／β９ハイブリッドを生成するため）。

〔ＣｙＳ３１９またはＣｙＳ３２０−＞△）　Ｉｎｈβ
Ｂ（Ｐ　ｒ　Ｏ３８１ビンの省略形であり、ＩｎｈβＢ
　の残基番号は。

Ｉｎｈβ９　に用いられている番号に対応している（第
２Ｂ図参照）〕を挙げることができる。

突然変異性の置換または欠失を行う上で主な候補である
ｈβＡ　アミノ酸（あるいは、残基挿入部位の隣接アミ
ノ酸）の位置は、残基２９３−２９７．３６４−３７６
　、および３８７−３９８（第８図）である。これらの
配列中のプロリン、システィンおよびグリシン残基は修
飾しない方が好ましい。

インヒビンまたはアクティビンよりも大きい効力を有す
る候補、あるいは、インヒビンまたはアクティビン拮抗
物として作用する候補を、該候補を一定社のインヒビン
またはアクティビンを含有している溶液で希釈し、得ら
れた組成物をラット脳下垂体細胞アッセイにより分析す
ることからなるスクリーニングアッセイにかけて同定す
る。インヒビンまたはアクティビンの作用を示さず、ま
たそれらに拮抗することもない候補を、天然のホルモン
に対するポリクローナル抗体に対する、天然ホルモン由
来のラベルしたインヒビンまたはアクティビンとの競合
的な免疫置換を測定することにヨリ、インヒビンまたは
アクティビンを測定するためのイムノアッセイに用いる
目的でスクリーンする。想定されるｈβＡ　変異体配列
の例には、Ｐｈｅ３ｏ２−、＞ＩｌｅまたはＩ−ｅ　ｕ
　；Ｇ　ｌ　ｎ　２９７−　＞　Ａ　ｓ　ｐまたはＬｙ
Ｓ；ＴｒＰ３ｏ７−〉ＴｙｒまたはＰｈｅ　：ＴｒＰ３
１０−＞ＴＹｒまたはＰｈｅ　：　ｌ１ｅ３１１−）Ｐ
ｈｅまたはＶａｌ　；　Ｔｙｒ３１７−）Ｔｒｐまたは
Ｔｈｒ；Ｉ−■１Ｓ３１８−〉ＬｙＳ；Ａｌａ３１９−
〉Ｓｅｒ：ＡＳｎ３２０−）　Ｇｌ　ｎ　、　Ｔｙ　ｒ
またはＨｉｓ　：　Ｔｙｒ３２１−）ＴｈｒまたはＡｓ
ｐ　、　Ｐｈｅ３４ｏ−）Ｔｙｒ　（ＴＧＦ−β／βＡ
鎖間ハイブリッド）：看ｉ〒汀〒矢ヤ〒畔）１１ｓ３ｓ
３−）Ａｓｐ　；　Ｈｉｓ３５３−）　Ｌｙｓ　　（ｓ
ａ−βＡ／βＢ）−イブリッド）　；Ｐｈｅ３ｓ６−）
Ｔｙｒ　：　Ｖａｌａ６４−）Ｐｈｅ：ｖａＩ３６４−
〉Ｌｅｕ：Ｔｙｒ３７５−〉Ｔｈｒ；Ｔｙｒ３７６−）
Ｔｒｐ　：　Ａｓｎ３８９−）　ＧＩ　ｎ　、　Ｈｉ　
ｓまたはＬｙｓ　：ｌ１ｅ３９１−〉ＬＣｕまたはＴｈ
ｒ　；　Ｎｆｅｊａ９ｏ　　−）ＬｅｕまたはＳｅｒ　
；　Ｖａ１３９２−）Ｐｈｅ　、　Ｇｌ　ｕ　、　Ｔｈ
ｒまたは１１ｅが含まれる。ヒトβＢ鎖にもこれと匹敵
する修飾が施される。例えば、ｈβＡは残基３０２にフ
ェニルアラニル残基を含有しており、ｈβＢを、第４Ａ
図のブタβＢにみられる様なやり方と同様に並べると、
これもまたホモローガスな位置（２６４位、第９図）に
フェニルアラニル残基を含有している。上記の如くβＡ
のＰ　ｈ　ｅ　３０２はインロイシニルまたはロイシニ
ル基で置換されるので、βＢのＰ　ｈ　ｅ　２６４も同
じ残基で置換される。

ポリペプチドをインヒビン、アクティビンまたはインヒ
ビン変異体であると同定するための因子の１つは、成熟
インヒビンまたはアクティビンのホルモン活性を実質上
中和し得る抗血清が懸案のポリペプチドのホルモン活性
をも実質上、中和し得るということである。しかしなが
ら、免疫学的同一性とホルモン活性とは必ずしも同一範
囲内でなくてよい。例えば、インヒビンのための中和抗
体は、該中和抗体がたまたまインヒビンの活性にとって
臨界的な部位に特異的に結合するものでないために候補
タンパク質と結合しないかもしれない。むしろこの抗体
は、無害な領域に結合し、その中和効果を立体障害によ
って表わしているのかもしれない。従ってその無害な領
域で突然変異を生じた候補タンパク質はもはや中和抗体
と結合しないが、それにもかかわらず、実質上ホモロジ
イという意味、および生物学的活性において、インヒビ
ンである。

卵胞液等の組織供給源から得た天然または野生型の成熟
インヒビンまたはアクティビンに関する分子量や等重点
の様な特性が天然形のもののみについて記載されている
ということを観察することが重要である。前記の定義に
包含される変異体は天然の同族体の特性を全て表わすわ
けではない。

例えば、上記の、挿入突然変異体、欠失突然変異体また
は融合タンパク質の如きインヒビン誘導体において、例
えば成熟インヒビンとの融合物またはプロインヒビンそ
れ自体、並びに挿入突然変異体は、天然の成熟インヒビ
ンよりも大きい分子量を有しているので、対応する天然
インヒビンに対して確立された分子量から離脱した分子
量を示すことになる。他方、天然の成熟インヒビンの欠
失突然変異体は、より低い分子量を有することになる。

最後に、ヘテロローガスなセルラインにおけるプレプロ
インヒビン鎖の翻訳後プロセッシングは、ホモローガス
宿主細胞による程忠実に行われないかもしれないので、
αおよび／またはβ鎖のアミノ末端に幾らかの変異が生
じ得る。この変異は、成熟タンパク質にプロ配列が残留
しているか、あるいは、プロ配列と一緒に成熟タンパク
質の残基数個が開裂され、失なわれていることによる場
合もある。同じことがヘテロローガス組換え細胞内での
プレタンパク質のプロセッシングについても言える。

インヒビン、アクティビンまたはプロドメインの共有結
合的修飾物も本発明の範囲内に含まれ。

それらには他の化学部分との共有結合的または凝集によ
るコンジュゲートが含まれる。共有結合誘導体は、当業
者既知の方法でインヒビンアミノ酸側鎖あるいはＮまた
はＣ末端に見い出される基の機能的部分と結合させるこ
とにより調製される。

例えばこれらの誘導体にはカルボキシ末端、あるいはア
スパルチル残基の如きカルボキシ残基を含む残基の脂肪
族エステルまたはアミド、セリルまたはアラニル等のヒ
ドロキシル基含有残基のＯ−アシル誘導体、並びにアミ
ン末端アミノ酸またはリジンやアルギニン等のアミノ基
含有残基のＮ　−アシル誘導体が含まれる。アシル基を
形成するにはアルキル部分（ｃ３〜ＣＩＯの直鎖アルキ
ルを含む）のグループから選んでアルカノイル種を形成
することにより、また、炭素環または異項環化合物を選
んでアロイル種を形成することができる。

反応性の基は、例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ
−ヒドロキシサクシンイミドエステルの如く、反応性の
側鎖基を通してタンパク質を交差結合させて不溶性のマ
Ｉ−ＩＪラックスするのに用い得ることが自体既知であ
る二機能性化合物であることが好ましい。好ましい誘導
体化部位はヒスチジン残基である。

成熟インヒビン、アクティビンまたはプロドメイン配列
の共有結合誘導体または凝集反応誘導体はイムノアッセ
イにおける試薬、あるいはアフイニテイ精製法のための
試薬として有用である。例えばインヒビンまたはプロド
メインを臭化シアン−活性化セファロースと自体既知の
方法で共有結合的に結合させて不溶化するか、あるいは
ポリオレフィン表面（グルタルアルデヒド交差結合を持
つものまたは持たないもの）に吸着させることにより不
溶化し、抗−インヒビン抗体または抗プロドメイン抗体
、あるいは細胞表面受容体の分析または精製に用いる。

またインヒビンまたはプロドメイン配列を、例えば、ク
ロラミンＴ法によって放射性沃素化する。希土類キレー
ト化合物と共有結合させる、あるいは別の螢光成分と結
合させる。

等の方法で標識し、診断学的アッセイ、特に、生物標本
中のインヒビンまたはプロドメインレベルを競合型イム
ノアッセイによって診断学的アッセイするのに用いる。

イン上ビン／アクティビンの完全なα鎖およびβ鎖をコ
ードしているＤＮＡは化学合成するか、あるいは卵巣か
ら得たｍＲＮＡ逆転写物をスクリーニングする、または
何らかの細胞からのゲノムライブラリィをスクリーニン
グすることにより得られる。スクリーニングには、αお
よびβ鎖をコードしているｃＤＮＡまたはゲノムライブ
ラリィからＤＮＡを同定しなければならないので、所望
のＤＮＡ部分を単純に合成する方が効率が良い。

また、合成法によれば、ＤＮＡの調製時に特異（ユニー
ク）な制限部位を導入し、さもなければ天然の配列中に
存在しない制限部位を含有するベクター内で遺伝子を用
いることができると共に、突然変異等によるＤＮＡをさ
らに修飾する必要なしに上記の如き翻訳効率の向上を図
る工程をとることができるので、これもまた有利な方法
である。

αまたはβ鎖をコードしているｃＤＮＡは非翻訳介在配
列（イントロン）並びに、それらの供給源にとってホモ
ローガスな他のタンパク質をコードしている、側方の（
フランキング）　Ｄ　Ｎ　Ａを含んでいない。

αおよびβ鎖をコードしているＤＮＡは、（ａ）標、的
動物の卵巣からｃＤＮＡ　ライブラリィを得、（ｂ）ｃ
ＤＮＡライブラリィ中の、ホモローガスな配列を含んで
いるクローンを検出するためにブタまたはヒトのびおよ
びβ鎖あるいはそのフラグメントをコードしている標識
ＤＮＡを用いてサザーン分析を行い、（ｃ）得られたク
ローンを制限酵素分析および核酸配列決定に付してクロ
ーンの全長を同定し、もしもライブラリィ中に全長に及
ぶクローンが存在していないとき例は、種々のクローン
から適当なフラグメントを回収し、これらをクローンに
とって共通の制限部位でライゲートして全長に及ぶ分子
をコードしているクローンを組立てることにより、ブタ
またはヒト以外の供給源からも得ることができる。以下
に示す如く、ライブラリィ中に不足している配列は、ラ
イブラリィのスクリーニングによって同定されたｃＤＮ
Ａと相補的な合成オリゴデオキシヌクレオチドを卵巣ｍ
ＲＮＡの３′側に延長させて得るか、あるいは、既知の
動物ｃＤＮＡからホモローガスな配列を得てもよい。こ
の方法は、所望の種からのプレプロインヒビンから成熟
インヒビンへのプロセッシングが容易なプレまたはプレ
プロインヒビン配列を組立てる上で特に有用である。

ブタおよびヒトの卵巣ｃＤＮＡ　ライブラリィを、まず
、精製ブタインヒビンを分析して決定した部分的アミノ
酸配列に基づく配列を有するオリゴヌクレオチドであっ
て標識されているもの（ヒトｃＤＮＡの場合はブタｃＤ
ＮＡプローブ）を用い。

インヒビンをコードしているＤ　Ｎ　Ａ　Ｋ関してプロ
ーブする。しかしながら、−度ヒトおよびブタのインヒ
ビン、並びにプロドメインをコードしているｃＤＮＡが
記録されれば、当業者はこの記述された配列を基に、残
余のヒトまたはブタの遺伝子を得るために、確実にハイ
ブリダイズするプローブを容易に調製し得る。

同定されたブタおよび′ヒトのｃＤＮＡクローンのヌク
レオチド配列決定によりインヒビンの両型の生合成によ
る前駆体の構造が明らかになった。

興味深いことに、２本のインヒビン鎖は単一の、プロセ
ッシングされた前駆体から得られたものでなかった。そ
うでなく、これら２本の鎖は別々のｍ　ＲＮ　Ａから翻
訳され、その後にジスルフィド交差結合による２本鎖分
子に組立てられている。

第１Ｂおよび２Ｂ図、第６．８および９図は。

ブタおよびヒトのプレプロインヒビンおよびプレプロア
クティビンを構成するポリペプチド鎖をコードしている
ＤＮＡを示す図である。明らかに、これらの図中に開示
されたコドンには縮重があってよく、それによっても同
じアミノ酸がコードされている。第１Ｂ、２Ｂ、６．８
および９図のＤＮＡを突然変異させ、上記のびおよびβ
鎖のアミノ酸変異体をコードさせる。特に、懸案の成熟
鎖を組換え培養中で直接発現させるために、プレプロ配
列を欠失させ、該配列の５′側に隣接して開始コドンを
挿入する。このＤＮＡを例えば放射活性なりんで標識し
、卵巣ｃＤＮＡライブラリィのスクリーンに用い、上で
一総括的に述べた様に。

他の種のものをコードしているＤＮＡから、αまたはβ
鎖を同定することができる。

このＤＮＡの共有結合的な標識は、螢光性の基、放射活
性な原子、あるいは化学発光性の基等の検出可能な基に
より自体既知の方法で行われる。次いで、標識ＤＮＡを
、通常のハイブリダイゼーション分析（アッセイ）に用
いる。その様な分析法は、以下の実施例に述べる如く、
ベクターや形質転換体を同定するために、または、組織
試料中のｍ　ＲＮ　Ａの検出の如く、インビトロでの診
断に利用される。

長い配列はそれら、例えばインヒビンまたはプロドメイ
ン配列をコードしているＤＮＡを含むベクターで形質転
換された宿主細胞中で合成されることが望ましい。ベク
ターは、以後のプロセッシングのために多量のＤＮＡを
調製する（クローニングベクター）か、あるいは、これ
らの鎖を発現させる（発現ベクター）目的で、該鎖をコ
ードしているＤＮＡを増幅させるために用いられる。発
現ベクターは、αまたはβ鎖をコードしているＤＮＡと
、それらの適当な宿主内での発現に影響を及ぼし得る適
当なコントロール配列とが機能的に結合した複製可能な
りＮＡ組立て物である。クローニングベクターは発現コ
ントロール配列を含有している必要がない。一般に、コ
ントロール配列には、転写プロモーター、転写をコント
ロールするための任意のオペレーター配列、適切ｆｌ　
ｍ　ＲＮ　Ａリボゾーム結合部位をコードしている配列
（原核性発現のために）、および転写および翻訳の終止
をコントロールするための配列が含まれる。ベクターは
、所望のポリペプチドを安定な発現、および／または形
質転換体の選択を容易にするために選択遺伝子を含有し
ている必要がある。しかしなから、αおよび／またはβ
鎖の発現を維持するための選択遺伝子は真核性宿主細胞
を用い同時（共）慨換法により、別のベクターから供給
することもできる。

ベクターにはプラスミド、ウィルス（ファージを含む）
、および組込み可能ｆｌ　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメント（即
ち、組換えによって宿主のゲノム内に組込まれ得るもの
）が含まれる。本明細書に記載されている。αおよび／
またはβ鎖の真核性細胞内発現に用いるためのベクター
は、微生物内でクローニングするためのプラスミド配列
を含有しており。

該微生物内でプラスミドは、宿主のゲノムと別に自律し
て複製するが、形質転換に際してＤＮＡは真核性宿主細
胞のゲノムに組込まれると考えられている。同様に、細
菌内でホモローガス組換えによってゲノム内に組込むこ
とのできるバチルス（ｂａｃｉｌｌｕｓ　）ベクターも
有用である。しかしながら、その他の同等な機能を有す
る他の形のベクターであって、現在知られている、ある
いは将来知られるであろうベクターも本発明に用いるこ
とができる。

適当なベクターは一般に、意図する発現用宿主にとって
適合し得る種から導かれたレプリコン（複製起源、非組
み込み性ベクターの場合）およびコントロール配列を含
有している。形質転換された宿主細胞とは、インヒビン
αおよび／またはβ鎖をコードしているＤＮＡを含有し
ているベクターで形質転換またはトランスフェクトされ
た細胞である。形質転換された宿主細胞はクローンした
ＤＮＡを含有しており、発現ベクターで形質転換さ、れ
た場合にはαおよび／またはβ鎖を発現する。

発現されたポリペプチドは、選択した宿主細胞、並びに
発現したタンパク質中の適当なプロセッシングシグナル
（ホモローガスまたはヘテロローガスなシグナル配列）
の存在に応じて、細胞内に沈着するか、あるいはべりプ
ラスミック間隙に分泌される。

（以下余白） ＤＮＡ領域は、それらが、互いに機能的に関連している
場合は、機能的（操作可能）に結合（ｏｐｅｒａｂｌｙ
　１１ｎｋｅｄ）　　Ｌティる。例えば、プレ配列また
は分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチド
の分泌に与るプレタンパク質として発現されるならば、
該ポリペプチドに関するＤＮＡと機能的に結合している
；プロモーターは、それが結合している暗号配列の転写
をコントロールするものであるならば、該配列と機能的
に結合している；リボゾーム結合部位は、それが結合し
ている暗号配列の翻訳を可能にする様な位置に存在して
いるならば、該暗号配列と機能的に結合している。一般
に、機能的に結合している、とＧ）うことは結合してい
るＤＮＡが近接（コンテイギュアス〕していることを意
味し、分泌リーダー配列の場合には、近接し、かつ解読
相内にあることを意味する。

適当な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞または高等な真
核細胞である。原核生物にはダラム陰性またはダラム陽
性の微生物、例えば、大腸菌（（Ｅ、ｃｏｌｉ）やバチ
ルス（桿菌、Ｂａｃｉｌｌｉ　）　　が含まれる。高等
な真核細胞には、以下に述べる如く哨乳類動物起源の樹
立（確立された）セルラインが含まれる。好適な宿主細
胞は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）株であるが
、他の原核生物、例えば大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６　
（ＡＴＣＣ３１，５３７つ、大腸菌２９４　（ＡＴＣＣ
３１，４４６）、大腸菌Ｗ３１１０　（ＡＴＣＣ２７，
３２５）、シュードモーナス（Ｐｓｅｎｄｏｍｏｎａｓ
　）種、アルイはセラシア・マーセサ７　ス（Ｓｅｒｒ
ａｔ　ｉａ　Ｍａｒｃｅｓａｎｓ　、霊菌〕等も適する
。

一般に、宿主細胞のための発現ベクターには、複製起源
（クローニングの場合の様に染色体外での増幅が望まれ
る場合の複製起源は、細菌起源である〕、インヒビン暗
号領域の上流に位置するプロモーターであって、リボゾ
ーム結合部位を伴なうもの（リボゾーム結合配列または
シャイン−ダルガノ配列は、原核性発現の場合曝のみ必
要とされる〕、ＲＮＡスプライス部位（インヒビンＤＮ
Ａが１またはそれ以上のイントロンを含むゲノムＤＮＡ
を含有している場合り、ポリアデニル化部位、並びに転
写終止配列を含有している。当業者なら認めることであ
るが、ある種の宿主内における発現には、上記の配列の
内、ある種のものは必要でない。微生物に用いる発現ベ
クターの場合には、所望の宿主が認識し得る複製起源、
宿主内で機能し得るプロモーター、並び（こ表現型の選
択性遺伝子（例えば抗生物質耐性を付与するタンパク質
をコードしている遺伝子、または独立栄養生物の要求を
満す椋なタンパク質をコードしている遺伝子のみが必要
とされる。インヒヒンＤＮＡはｉ常、大腸菌種から得ら
れるプラスミドｐＢＲ３２２〔ポリバー（Ｂｏｌ　１ｖ
ａｒ）ら、１９７７　、’ジーン（Ｇｅｎｅ）’　２　
：　９５　］を用いて大腸菌内でクローニングされる。

ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐
性のための遺伝子を含有しており、これらは形質転換細
胞１を容易に同定し得る手段となる。

発現ベクターはクローニングベクタート異Ｙ、ｕ）、宿
主生物によって認識され得るプロモーターを含有してい
なければならない。このことは、一般（こ、プロモータ
ーは所望の宿主にとってホモローガスであることを意味
する。組換えＤＮＡ組立て物に最も普通に用いられるプ
ロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ〕
およびラクトースプロモーター系〔チャン（ｃｈａｎｇ
、）ら、１９７８１ネイチヤー“、２７５　：６１５；
およびゲッタ／Ｌ；（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、１９７９　
’ネイチャー’２８１：５４４〕　、トリプトファン（
’ｒＰ）プロモーター系〔ゲラデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ　
）ら、１９８０′ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ　、）　’　８　：
４０５７オヨヒＥ　Ｐ　Ｏ出願公開番号３６．７７６　
）並びにｃａｃプロモー　ター　（：　Ｈ，ドウボｘル
（ＨｏＤｅ　Ｂｏｅｒ　）ら、′プロシーディンゲス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
イズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｃ’１．Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　）
Ｕ、Ｓ、Ａ、”且：　２１−２５　（１９Ｂ３）］が含
まれる。

これらが最も普通に用いられているが、その他の既知の
微生物プロモーターも使用し得る。それらの詳しいヌク
レオチド配列は公開これているので、当業者は、それら
をプラスミドベクター内の、インヒビンをコードしてい
るＤＮＡと機能的にライゲートさせることができる〔シ
ーベンリスト（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓりら、１９８０、′
セル（ｃｅｌｌ）“２０：２６９］。原核性発現系に用
いられるプロモーターは、インヒビンと機能的に結合し
たシャインダルガノ（Ｓ、Ｄ、　）配列をも含有してい
ることを要する（　Ｓ、Ｄ、は翻訳を容易にする様に位
置している〕。このことは、一般に、細菌の構造遺伝子
の第２コドンの上流に位置してプロモーターおよびＳ、
Ｄ、配列があり、これらが成熟αおよび／またはβ鎖の
５′側における、プレプロインヒビンの配列と置換され
ていることを意味する。

原核生物に加えて、酵母培養の如き真核性微生物もイン
ヒビン暗号化ベクターにより、形質転換され得る。下等
な真核性宿主微生物の内、サツ力ロミケス・セレビシェ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ　−１（ｉ
ａｅ）または通常のパン酵母が最も一般的に用いられる
。しかし、その他多数の株も普通に手に入れ、本発明に
用い得る。酵母ベクターは、通常、２ミクロン酵母プラ
スミドからの複製起源または自律的複製配列（ＡＲ５）
、プロモーター、αおよび／またはβ鎖をコードしてい
るＤ　Ｎ　Ａ並びにポリアデニル化および転写の終止の
ための配列、および選択遺伝子配列を含有している。酵
母内での発現に適したプラスミドはＹＲ９７である〔ス
テイア　ｆ　：］　ム（Ｓｔ　ｉｎｃｈｃｏｍｂつら、
１９７９、′ネイチャー”２８２：３９：　　キンゲス
−７７（Ｋｉｎｇｓｍａｎ）ら、１９７９、′ジーン“
７　：　１４１　：　　チェンバー　（Ｔｓ　ｃｈｅｍ
ｐｅ　ｒ　）ら、１９８０、′ジーン″よ止：１５７　
］。このププラストは既にｔｒｐｌ遺伝子を含有してお
り、この遺伝子は、酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣ
Ｎｏ、４４０７６またはＰＥＰ４−１〔ジョーンズ（Ｊ
ｏｎｅｓ）　、１９７７．１ジエネテツクス″８５　：
１２’ｌ］に、トリプトファン中で増殖する能力を持た
ないという選択マーカーを与える。

この酵母宿主細胞ゲノムはｔｒｐｌ障害を有するので、
形質転換体をトリプトファンの非存在下で増殖させるこ
とで、形質転換体の検出に効果的な環境を得ることがで
きる。

酵母用ベクターの好適なプロモーティング配列には、以
下のものに対するプロモーターが含まれる：メタロチオ
ナイ：／　（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）、３−
ホスホグリセレート・キナーゼ〔ヒララマン（川ｔｚｅ
ｍａｎ）ら、１９８０　’ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリイ’　２５５　　：　　２０７３〕
またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェ
ート・デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート
・デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グル
コース−６−ホスフェート・インメラーゼ、３−ホスホ
グリセレート・ムターゼ、ピルベート・キナーゼ、トリ
オセホスフエート・インメラーゼ、ホスホグルコース・
インメラーゼ、グルコキナーゼ等の他の解糖酵素類〔ヘ
ス（Ｈｅｓりら、１９６８、′ジャーナル・オブ・アド
バンスイズ・イン・エンザイム・レグ（Ｊ。

Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、）“ヱ：１４９　：
およびホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）　　ら、１９７８、
′バイオケミストリイ″３７　　：４９００］。更に、
酵母内で発現させる上で好適なベクターおよびプロモー
ターは艮、ヒフ　７７ン（Ｒ，Ｈｉｔｚｅｍａｎ）　ら
により、ＥＰ７３，６５７　Ａ中に記述されている。

その他、増殖条件によって転写がコントロールされると
いう利点をも有する酵母プロモーターとして、アルコー
ル・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ１酸ホス
フアターゼ、窒素代謝に関連する減成酵素、前記メタロ
チオナイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・
デヒドロゲナーゼ、並びにマルトースおよびラクトース
の利用に与る酵素類等に関するプロモーター領域が含ま
れるっ適当な発現プラスミドを組立てるには、これらの
遺伝子に関連する終止配列を、発現ベクター内のインヒ
ビンまたは誘導体暗号配列の３′側にライゲートし、ｍ
ＲＮＡの終止およびポリアデニル化を与える。

多細胞生物からの細胞培養も、ホルモン活性なインヒビ
ンまたはアクティビンの発現はその様な細胞内でのみ起
こり、微生物発現では、免疫学的交差反応活性の発現が
殆んどであると考えられるので、本発明における好まし
い宿主である。原則として、を推動物の培養物であるか
無を推動物の培養物であるかに拘らず、あらゆる高等な
真核細胞培養を使用し得る。最近では、その様な細胞を
細胞培養中で増殖させることは日常的な操作きなってい
る〔ティッシュ・カルチャー　（ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔ
ｕｒｅ）アカデミツク・プレス、クルスおよびパターソ
ン（Ｋｒｕｓ　ａｎｄ　ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）編、（１
９７３）〕。

高等な真核生物内でαまたはβ鎖を発現させる上で適切
な宿主細胞には以下のものが含まれる：５Ｖ４Ｑで形質
転換されたサルの腎臓ＣＶＩ系（ｃＯ５−７、ＡＴＣＣ
ＣＲＬ　　１６５１）：ベビーハムスターの腎臓細胞（
ＢＨＫ％ＡＴＣＣＣＲＬＩＱ）：チャイニーズハムスタ
ーの邪巣細胞−ＤＨＦＪ：ウーラウブ（Ｕｒｌａｕｂ）
およびチャック７　（ｃｈａｓ　ｉｎ）著、ＰＮＡＳ　
（ＵＳＡ）７７−４２１６（１９８０）］：マウス・セ
ルトリー細胞〔１Ｍ４、マザー（Ｍａｔｈｅｒ）　、Ｊ
、Ｐ、、バイオローレプロド（Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｒｏｄ
、　）２３　　：　２４３−２５１（１９８０）〕；　
サル腎細胞（ｃＶＩ　　ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；　アフ
リカミドリザルの腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣ
ＲＬ−１５８７）：ヒト子宮頚がん細胞（ＨＥＬＡ％Ａ
ＴＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣ
Ｃ：Ｌ　３４〕；バッファロー・ラット腎細胞（Ｂ　Ｒ
ｔ、　３Ａ　。

ＡＴＣＣＣＲＬ　１４４２　）：ヒト肺細胞（Ｗ１３８
、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）：ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２Ｍ１
．５４、バウマンら（ＢａｕｍａｒＱ、ジャーナル・オ
ブ・セルラー・バイオロジイ（Ｊ、Ｃｅｌ　１　。

Ｂｉｏｌ、　）　８５　　：　　１−８　　（１９８０
）　　］：およびＴＲＩ細胞〔マザーＪ、Ｐ、ら、アナ
ルス・Ｎ、Ｙ。

アカド・サイ（Ａｎｎａｌｓ　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　）謄ユニ　　４４−６８（１９８２）］。

を椎動物細胞に使用される発現ベクターのための転写お
よび翻訳コントロール配列は、ウィルス起源から供給さ
れることが好ましい。例えば、普通用いられているプロ
モーターはポリオーマ、アデノウィルス２、および最も
好ましくはシミアンウィルス４０（ＳＶ４（１）から導
かれる。初期（早期）および後期プロモーターは、いず
れもＳＶ４０ウイルスの複製起源をも含有しているフラ
グメントとして該ウィルスから容易に得られるので特に
有用である〔ファイヤーズ（Ｆｉｅｒｓ）ら、１９７８
．１ネ４チー１’−’　２７３　：　１１３　）、ＳＶ
４０のより小さい、またはより大きいフラグメントも、
それらがウィルス性複製起源内に存在するＨｉｎｄＩ［
Ｉ部位からＢｇｌ　Ｉ部位に至る約２５０　ｂｐの配列
を含有している限り用いることができる。更に、αまた
はβ鎖に自然に伴なわれているゲノムプロモーター、コ
ントロールおよび／またはシグナル配列も、その様なコ
ントロール配列が宿主細胞に適合し得ることを条件とし
て用いることができ、またしばしば好ましいことである
。

複製起源は、例えばＳＶ４０その他のウィルス性起源（
例えばポリオーマ、アデノウィルス、■ＳＶ、ＢＰＶ等
〕から導かれる複製起源等の外来性起源を含む様にベク
ターを組立てることにより、あるいは宿主細胞の染色体
性複製機構により、与えられる。もしもベクターが宿主
細胞染色体に組込まれるのなら、しばしば、後者の機構
で十分である。

ウィルス性の複製起源を含有しているベクターを用いず
に、選択マーカーをコードしているＤＮＡとαおよび／
またはβ鎖をコードしているＤＮＡとを用い、同時形質
転換法によって哺乳類細胞を形質転換することもできる
。適当な選択マーカ−の例として、ジヒドロ葉酸還元酵
素（ＤＨＥ艮〕△ またはチミジン（ｔｈｙｍｉｚｉｎｅ）キナーゼを挙げ
ることができる。その様なマーカー類はタンパク質であ
り、一般には形質転換細胞（即ち、外因性ＤＮＡの取り
込みに適合した（コンピテント）細胞〕の同定を可能に
する酵素である。通常、同定は細胞がそのマーカータン
パク質を取り込んでいなければ、該細胞にとって有毒な
培地、あるいは、該細胞が必須栄養素を得ることができ
ない培地で、形質転換体は生存し得る、ということに基
づいて行う。

インヒビンとＤＨＦＲの両者をコードしているＤＮＡ配
列を含むベクターでトランスフエフトスるのに好適な哺
乳類宿主細胞を選択するのに際しては、用いるＤ　Ｉ（
ＦＲタンパク質のタイプに従って宿主を選択するのが適
当である。野生型Ｄ　ＨＦ　Ｒタンパク質を用いる場合
には、ＤＨＦＲ欠損宿主細胞を選択するのが好ましく、
そうすることにより、Ｄ　ＨＦＲの非存在下では利用し
得ない必須栄養素である、ピポキサンチン、グリシンお
よびチミジンを欠（選択培地（ｈｇ”）内で成功したト
ランスフェクションを選択するためのマーカートシてＤ
ＨＦＲ暗号配列を用いることができる。この場合、好ま
しい宿主細胞はＤ　ＨＦ　Ｒ活性を欠くチャイニーズハ
ムスターの卵巣（ｃＨＯ）セルラインであり、これは、
ウーラウブおよびチャッシン（Ｕｒｌａｕｂ　ａｎｄ　
Ｃｈａｓｉｎ］：　１９８０、′プロシーディンゲス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
イズ’　（ＵＳＡ）−υ：４２１６〕の方法で調製し、
増殖させることができる。

メトトレキセ−１−（ＭＴＸ）に対する結合親和性の低
いＤＨＦＲタンパク質をコードしているＤＮＡをコント
ロール配列に用いる場合には、ＤＨＦＲ耐性細胞を用い
る必要はない。突然変異Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　ＲはＭＴＸ耐
性であるので、宿主細胞自身がＭＴＸ感受性であるなら
ば、Ｍ　Ｔ　Ｘ含有培地を選択の手段として用いること
ができる。ＭＴＸを吸収することのできる真核細胞の大
多数は、メトトレキセート感受性であると思われる。そ
の様な、有用なセルラインはＣ）１０系、ＣＨＯＫＩ　
（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ５１）である。まず形質転換体
をネオマイシン耐性に関して選択しくネオマイシフ耐性
付与遺伝子をコードしているｏ　Ｎ　Ａ　ｆ：共に用い
てトランスフェクションを行う〕、次いて場合に応じて
αおよび／またはβ鎖発現のＭＴＸ増幅を選択すること
が好ましい〔キムら（Ｋ　ｉ　ｍ　）、゛セル（ｃｅ：
４）　’　４２　：　１２９−１３８（１９８５）およ
びＥＰ△　　　− １６０，４５７Ａ参照〕 その他、組換えを椎細胞培養内でのαおよび／またはβ
鎖の合成に適用するのに好ましい方法として、Ｍ−Ｊ、
　　ゲシング（ＧｅｔｈｉｎｇＪ　　ら、１ネイチヤー
′幻ユニ　６２０−６２５　（１ｃ＋ｓＢ　　：　Ｎ、
マンティ（ＭａｎｃｅｉＪら、′ネイチャー“２８１　
：４０−４６　：　Ａ、Ｌ／ビア　ソ７　（Ｌｅｖｉｎ
ｓｏｎ）ら、ＥＰ１１７゜０６ＯＡおよび１１７，０５
８Ａ等が述べている方法がある。

組換え細胞培養中で、インヒビンα鎖は、β鎖分子のい
ずれかと一緒に、または別個に発現される。同様に、成
熟β鎖のいずれかまたは両方をコードしているＤ　Ｎ　
Ａで宿主細胞を形質転換する。

ＴＧＦ−βとの類似性に基づいて、組換え培養中での発
現に際し、成熟β鎖はホモ二量体またはβＡ／βＢへテ
ロ二量体を形成し得る。これらの構造物はインヒビンで
なく、従って、本明訓書中ではβ−鎖二量体またはアク
テ・ｆビンと称する。これらは、活性インヒビンの製造
におけるβ鎖の供給源として有用であり、あるいは、α
およびβ鎖同時形質転換によって合成されたβ鎖のβ・
鎖二指体への転換を検出する上で、ゲル電気泳動法にお
ける標準として用いることができる。実施例４にみられ
る様に、このことは仮定の問題ではない。

もちろん、上記の如（、生殖の調節においても二量体は
有用である。

β鎖のへテロ二量体あるいはホモ二量体は、インビトロ
で個々の鎖を変性（アンホールディングクした後、一般
に既知の方法に従ってα−鎖と酸化的ジスルフィド結合
させて分離する。しかしながら、成熟インヒビンの調製
には、α鎖と、β鎖のいずれか一方との両者をコードし
ているＤＮＡで組換え宿主を形質転換するのが好ましい
。その結果、宿主細胞の生体内でホルモン活性な分子が
そのまま結合するので、インビトロでの処理により２本
の鎖を結合させる必要がない。αおよびβ鎖は同じベク
ター内に、同じプロモーターのコントロール下に配置さ
れていることが好ましいが、それが必須というわけでは
ない。

スクリーニングにおいて同定されたある種のβ鎖アミノ
酸配列変異体は下垂体の細胞表面受容体を結合しないか
、あるいは、結果的にホルモン活性を表わさない。その
様な変異体が組換え細胞培養中でホモ二量体として発現
された場合、それらが天然のβ鎖と交差反応性の免疫学
的エピトープを有するならば、アクティビンのイムノア
ッセイに有用である。さらに、その様な変異体は、ホル
モン活性なβ鎖をコードしているＤＮＡ（！ニー緒に同
時発現され、固有のβ鎖と変異体β鎖とを含むハイブリ
ッドが得られる。この場合、変異体は固有のβ鎖の構造
を安定化する様、作用する。この形のβ鎖へテロ二量体
はホモ二量体と同様に、アクティビンのイムノアッセイ
に有用である。これはまたアクティビンの拮抗体として
も機能し得る。

マタ、β鎖／ＴＧＦ−βハイブリッドを生産するために
アクティビン／インヒビンβ鎖をＴＧＦ−βと同時発現
させる。ＴＧＦ−βを発現するベクター並びに発現させ
る方法は既知である〔例えば、プリンクら（Ｄｅｒｙｎ
ｃｋ）　、ヒト形質転換成長因子−β相補ＤＮＡ配列、
並びに正常および形質転換細胞内での発現（Ｈｕｍａｎ
　Ｔｒａｎｓ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔ
ｏｒ−βＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮ　Ａ　５ｅ
ｑｕｅｎｃｅａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｎ
ｏｒｍａｌ　ａｎｄ　ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＣｅｌｌ
ｓ）　’ネイチャー’　３１６　：　７０１−７０５　
　（１９８５）参照〕。プリンク（Ｄｅｒｙｎｃｋ）　
　らの記載の如くに、ＴＧＦ−β遺伝子を担ったベクタ
ーによる補元類細胞の同時形質転換をアクティビン／イ
ン上ビンのβＡまたはβＢ鎖と一緒に行うことにより、
β鎖／ＴＧＦ−βハイブリッド二量体がある割合で分泌
されるであろう。このハイブリッドはＴＧＦ−β／β鎖
イムノゲンの調製またはイムノアッセイに有用である。

形質転換細胞から自体既知の方法によってインヒビン、
アクティビンまたはプロドメイン配列を回収する。ポリ
ペプチドが組換え細菌内で屈折体として発現される場合
には、所望のポリペプチドを回収し、常法通り、所望の
ポリペプチドを再生する。別法として、アクティビンま
たはインヒビンを分泌する形質転換細胞、好ましくは哺
乳類細胞の細胞培養を単に遠心することにより、細胞か
ら上清を分離する。次いで、一般に、ヘパリンーセファ
ロースアフイニテイクロマ吐グラフィー、ゲル濾過、お
よび少くとも１回の（好ましくは数回の〕固定相および
／または移動相内での種々の条件下におけるＲＰ−ＨＰ
　ＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー〕工程を含む
連続精製法により、インヒビンを精製する。インビトロ
合成法で生産されたプロドメイン配列は常法通り精製さ
れる。

本発明に用いるのに好ましいプロドメインポリペプチド
は、所望のプロドメインに適したαおよび／またはβ鎖
を合成する様、形質転換された組換え細胞の培地から回
収される。特１こそれらの回収は、まず固有の電気泳動
ゲル上で培養培地ポリペプチドを分離し、予測される分
子量のバンドを切り取った後、溶離したポリペプチドを
例えばＦＰＬＣまたはＨＰＬＣによってさらに精製し、
次いで、実質上ホモジーニアスな分離されたポリペプチ
ドをアミノ酸配列決定に付すことにより回収される。次
に、この精製（純化）プロドメインポリペプチドを用い
て、例えば、ウサギ等に抗体を産生させ、それをイムノ
アフイニテイ精製に用いれば、プロドメインの回収が単
純になると思われる。

単離されたブタのホルモン活性なインヒビンを精製する
には、まず、清澄な形質転換培養の上清または細胞リゼ
イトをヘパリンーセファロースアフイニテイクロマトグ
ラフイーにより精製し、次に、セファクリルＳ−２００
ゲルにかけてゲル濾過した後、種々の移動相グラディエ
ンドおよび／または誘導体化シリカゲル支持体を用い、
４回の連続的なＲＰ−ＨＰＬＣに付す方法が好ましい。

好ましくは、比較的疎水性の低い固定相を用い、ｃ３−
ｃＢカラムで行うことが好ましく、Ｃ３−０５であって
フェニルカラムを用いることが特に好ましい。移動相の
溶質特異性は、有機成分特にアセトニトリルの濃度を変
えることにより適宜調節できる。１回のＲＰ−ＨＰＬＣ
，分画によってもゲル濾過物質に比べてかなり純度が高
くなるが、ヘパリン−セファロースクロマトグラフィお
よびゲル濾過による連続処理の後、通常、２またはそれ
以上、好ましくは４〜回のＲＰ−ＨＰＬＣ精製を行う。

この方法は、組換え細胞培養からのヒトインヒビンの精
製にも同様に適用し得ることが分った。

精製の第１段階はヘパリンーセファロースアフィニテイ
クロマトグラフイーであり、ここでは、タンパク質が適
用した灸件下においてセファロース−結合ヘパリン部分
に吸着され、この吸着されたインヒビンを１ＭＮａｃＪ
で溶にして回収する。

この段階において、かなり大量の粗抽出物を相当迅速に
処理し、総インヒビン活性が粗抽出物の少（とも９０チ
に匹敵する多量のタンパク質を回収することができるの
でこの段階で、粗抽出物の精製工程が極めて促進される
。

様々なカラム画分中のインヒビン活性を検出するために
、容量比で約０．０１％〜０．１％を分取し、水１００
μｌ中に入れたヒト血清アルブミン１００μｆｌを加え
た後、スピード−バク（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）コンセン
トレータ−（濃縮器つ〔サバント（Ｓａｖａｎす、ヒッ
クスビレ、ＮＹ〕中で溶媒を留去した。残留物を３　ｒ
ｔｔｌのＨＤＭＥＭ中１％ウシ胎児血清に再溶解し、ミ
ｔｚ’７クス（Ｍｉｌｌｅｘ）　−Ｇ　Ｓ　Ｏ，２２μ
ｒｎフィルター〔ミリポア　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）コ
ーポレーション、ベッドフォード、ＭＡ’）で濾過し、
複製して分析した。精製工程におけるバイオアッセイの
スピードを上げるために、インヒビン活性によるＦＳＨ
分泌の基礎的な阻害のみを測定し、クロマトグラム中の
、インヒビンタンパク質が泳動していると予測される領
域をプロットした。

ヘバリンーセファロースアフイニテイクロマトグラフイ
ーを行うために、細胞分層を、ベックマンＪ２−２１遠
心機（ベツクマンインスツルメンツインコーポレーテツ
ド、パロ・アルド、ＣＡ）中において、ＪＡ２０ロータ
ーを用い、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心すること
により沈降させた。

エーレンマイヤーフラスコ中で、上清丁に０．１ＭＮａ
Ｃ１含有０．０１　Ｍ　ｌ−１）　スＨＣｌ　（ＰＨ７
）　ヲ加えて元の容量の１０倍に希釈し、２個のラビッ
ト（Ｒａｂｂｉす４チャンネル嬬動ポンプ〔ライニン・
インスツＪＬ／メント（Ｒａｉｎｉｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔ）Ｃｏ、Ｉｎｃ。

エメリービレ、ＣＡ〕により、ヘパリン−セファロース
〔ファルマシア・ファイン・ケミカルス（Ｆａｒｍａｃ
ｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌす、ビスカッタウェ
イ、Ｎ、Ｊ、’ｌ］カラム（３，５Ｘ９０９に、カラム
当り、４０ａ／／時間の速度で、シラスティック（Ｓｉ
ｌａｓｔｉｃ）チューブ（０，７６ｍｔｘ■Ｄ）を通し
て同時にポンプ注入した。液体全てがヘパリン−セファ
ロースカラム内にポンプ注入された後、８本のカラム全
てを同時に、０．１Ｍ　ＮａＣ／！　を含有する０、０
１ＭトリスＨＣ：Ｊ、ｐＨ７により、同様にして洗浄し
た。

吸着された、インヒビン活性を有するタンパク質を、８
本のカラムを、上記の如＜　Ｉ　Ｍ　ＮａＣＪ　含有０
．ＯＩＭＩ−リスＨＣ，Ｊ（ｐＨ７）によって同時に洗
浄することにより除き、洗浄液を画分ｔこ分けて集めた
。上記の如きインビトロでのパイ方アッセイによってイ
ンヒビン活性を監視した。残る抽出物の精製のために、
カラムを０．０１　Ｍ　ト＋）スＨＣ１（ｐＨ７）中２
　ＭＮａＣＪ　　で洗浄して再生させ、０．１　Ｍ　Ｎ
ａＣ／　含有０．０１ＭトリスＨＣＪで再度平衡化した
。

次に、得られた物質をゲル濾過して分画し、通常、分子
量に従ってタンパク質を分ける。ヘパリン−セファロー
スカラムによって抽出したインヒビン活性を有する画分
をプールし、分子１ｉ　（Ｍｒ　）カットオフ３，５０
０である、シリンダー（直径２８．６朋〕のスペクトラ
ボール（ＳｐｅＣ【ｒａｐＯｒ）ＮＯ，３メンプラン・
チュービング〔スペクトラム・メジカ／ｌｚ−インダス
トリイズ（Ｓｐｅｃｉｕｍ　ＭｅｄｉｃａｌＩｎｄｕＳ
ｔｒｉｅｓ）インコーホレーテッド、ロスアンゼルス、
ＣＡ）中、３０％酢酸に対して一夜透析し、Ｎａ１ｌを
除去する。上記の如くにして保持液を遠心して白色の沈
殿を除き、上清を５Ｘ１００ｃｍのセファクリル（Ｓｅ
ｐｈａｃｒｙｌ　）　　Ｓ　−２０Ｑ微細（スーパーフ
ァイン〕カラム〔ファルマシア・ファイン−ケミ力／Ｌ
／　ス’（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ　）ビスカッタウェイ、Ｎ、Ｊ、）にかけるた
めに等分量づつ分ける。各カラムを３０％酢酸２０ａｌ
で。

２２分間溶離し、２ｇＱ　ｎｍにおけるＵＶ吸収とバイ
オアッセイによりカラムからの両分を監視する。

Ｓ−２００カラムから得たバイオアッセイ陽性タンパク
質をプールし、凍結乾燥する。この凍結乾燥品を０．２
Ｎ酢酸に溶解しく　１　ｒｔｔＶｒｕｅ　）、ミレック
ス−ＨＡ　（Ｍｉｌｌｅｘ　−ＨＡ）　０．４５　ｔｔ
ｎｃ　フィルター〔ミリポア　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
　Ｃｏｒｐｌ、ベッドフォード、ＭＡ〕で諷過する。Ｐ
液をｌＸ２５ｃｍヴイダツク（Ｖｙｄａｃ）５μ乳粒子
サイズの０４カラム〔ザ・セパレーションズ・グループ
・ヘスペリア（ＴｈｅＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｒｏ
ｕｐ　Ｈｅ５ｐｅｒｉａ）、ＣΔ〕に直接適用し、ＴＥ
ＡＰバッファーのグラディエンドで展開する。ＴＥＡＰ
系において、バッファーＡは０．２５Ｎりん酸トリエチ
ルアンモニウム（ｐＦＩ３）からなり、バッファーＢは
バッファーＡ中の８０％アセトニドＩＪルで構成されて
いる。全炉液を適用した後、ＵＶ吸収が基線に至るまで
、水性バッファーＡによりカラムを洗浄する。インヒビ
ン活性を示す画分をスペクトロフロー（Ｓｐｅｃｔｒｏ
−ＥｌｏＩＭ）　７５７　Ｕ■検出器〔クラトス・アナ
リテイカ／ｌｚ−インスツルメン７　（Ｋｒａｔｏｓ　
ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔす、ラムセ
イ、Ｎ、Ｊ、）、ツルチック（Ｓｏｌｔｅｃ）　２２０
記録計〔ツルチック（Ｓｏｌ　ｔｅｃ）Ｃｏｒｐ、サン
バレー、ＣＡ〕およびレディラック（Ｒｅｄｉｒａｃ）
２１１２　　フラクション・コレクター〔ＬＫＢインス
ツルメンツ）　Ｉｎｃ、　、ギヤザースバーグ、ＭＤＩ
を備えたベックマン２３２グラデイ工ンド液体クロマト
グラフィー系〔ベックマン・インスツルメンツ（Ｂｅｃ
ｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）Ｉｎｃ、、バーク
レー、ＣＡＩ内で分離する。インヒビン活性ヲ示すゾー
ンをバイオアッセイによって検出する。

所望によりさらに２段階のＲＰ−）ＩＰＬＣを行うこと
により、βＢ鎖を含むインヒビンタンノ櫂り質を精製し
、βＡ種を含まないインヒビンを得る。

第１段階ではＩ　Ｘ２５ｃｍのＶｙｄａｃ　５１１ｍ、
−粒子サイズのＣ４カラムとトリフルオロ酢酸（ＴＥＡ
）バッファーとを用い、第２段階では１×２５αＶｙｄ
ａｃ　５μｍ粒子サイズのフェニルカラムとＴＥＡＰバ
ッファー系とを用いる。ＴＦＡ系において、バッファー
Ａは水９９９　ＴｒＬｇ中にトリフルオロ酢酸１　ｍｌ
を含有し、バッファーＢは水１９９　ｒｔｔｌおよびア
セトニトリル８００　ｒｔｔｌ中にトリフルオロ酢酸１
ｍｅを含有している。２種のインヒビン種は別々に溶離
すれる。いくつかのバッチから蓄積したインヒビンを０
．４６Ｘ２５ｃｍのアクアポア（Ａｑｕａｐｏｒｅ　）
ＲＦ−３００１０μｍ粒子サイズカラム〔プラウ７−リ
ー（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ）ラボス（Ｌａｂｓ　）　、サン
タクララ、ＣＡＢとＴＦＡバッファー系とを用いるＲＰ
−ＨＰＬＣにより濃縮した。しかしながら、通常、βＡ
またはβＢ鎖のみをコードしているＤＮＡによる形質転
換体から得た細胞培養上清については、この精製段階は
使用されない。

インヒビン、アクティビン、プロドメイン配列またはそ
れらの変異体は薬学的に許容し得る無毒な塩類、例えば
酸付加塩や、金属錯体（コンプレックス）、例えば、亜
鉛および鉄等（これらもまた、本発明の目的においては
、塩とみなされる）の形で投与される。その様な酸付加
塩の例には塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、りん酸塩、
マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハ
ク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、および酒石酸
塩等がある。等張性生理食塩水やりん酸緩衝液等の溶液
として静脈内投与するのが適当である。

本発明のポリペプチドは医師の指導の下で投与されるべ
きであり、普通、医薬組成物中には、有動量のペプチド
と通常の、薬学的に許容し得る担体とが含まれている。

投与量は、該タンパク質の投与における特定の目的によ
り変化し、雄性の不稔のために規則的にインヒビンを投
与する場合の用量レベルは約０．１〜約１〜膚（体重っ
の範囲とすることができる。

インヒビン、アクティビン、プロドメイン配列およびそ
れらの誘導体は、埋め込み（移植）可能な、あるいは皮
膚に接着可能な、持続的放出製品から投与することが望
ましい。適当な系には、例えば、Ｌ−グルタミン酸とガ
ンマ−エチル−Ｌ−グルタメートとの共重合体〔シトマ
ン（（Ｊ、５ｉｄｎａｎＪら、１９８３、′バイオボリ
マーズ（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）　’スλ（１）二５
４７−５５６　］、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタ
クリレート〕〔ランガー（Ｒ。

Ｌａｎｇｅｒ　）ら、１９８１、”）エイ−バイオｌ　
）’・７ター・レス（Ｊ、　Ｂｉｏｍｅｄ、　Ｍａｔｅ
ｒ、　Ｒ，ｅｓ、）’上回：　１６７−２７７およびＲ
，ランガーら、１９８２．１ケミ・チク（ｃｈｅｍ、Ｔ
ｅｃｈ、）　’　１２　　：　９８−１０５〕、エチレ
ンビニルアセテート（Ｒ，ランガーら、同上り、あるい
はポリ−Ｄ　−（−）　−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ　
１３３，９８８Ａ）等が含まれる。その様な製品は、皮
下に埋め込んだり、皮膚または粘膜と接融させる櫟に付
して用いられる。

実施例の記載を簡単にするため、頻繁に用いられる方法
を短い熟語に略して示す。

プラスミドは小文字のＰを先頭にし、そして／または大
文字および／または数字を続けることによって表わされ
る。本発明の出発物質であるプラスミドは市販されてい
るか、または非制限的な施設から一般に入手可能であり
、あるいはこの様にして入手し得るプラスミドまたはＤ
ＮＡから、公知の方法に従って組立てることができる。

更に、その他の同等なプラスミドも当業者には知られて
おり、通常の技術者にとって自明であろう。

ＤＮＡの１消化′とは、ＤＮＡを、該ＤＮＡのある位置
に対してのみ作用する酵素で触媒的に開裂することを指
す。その様な酵素を制限酵素と称し、該酵素にとって特
異的な部位を制限部位（サイトつと称する。１部分１消
化とは、制限酵素による不完全な消化であり、特定のエ
ンドヌクレアーゼに対するＤＮＡ基質中の部位の全てで
な（、そのうちのいくつかを開裂する様な条件を選んで
行う。本発明において用いる様々な制限酵素は市販され
ており、その反応条件、コファクター、およびその他必
要なものは、酵素の供給業者の指示に従って使用した。

制限酵素類は、各制限酵素が最初に得られた微生物を表
示する大文字、次いで他の文字、更に、通常、数字から
なる略号で表わされる。一般に、特別の場合を除き、約
ｌμｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２
０μｅの緩衝液中の約１単位の酵素と共に使用する。

特定の酵素について適当な緩衝液および基質の量は、製
造業者によって明示されている。通常、インキュベーシ
ョン時間は３７℃で１時間とするが、供給者の指示に従
って変えてもよい。インキュベーションした後、フェノ
ールおよびクロロホルムでタンパク質を抽出して除き、
水性フラクションからエタノール沈殿によって消化され
た核酸を回収する。時たま、制限酵素による消化の後、
ＤＮＡフラグメントの２つの制限的開裂末端が１閉環（
サーキュライディング）′シたり、閉じたループを形成
することにより、該制限部位に他のＤＮＡフラグメント
が挿入されにく（なるのを防止するために、５′末端の
ホスフェートを細菌性アルカリホスファターゼで加水分
解することがある。明示しない限り、プラスミドの消化
には、５′末端の脱りん酸反応は伴なわないものとする
。脱りん酸の方法および試薬は常法に従う［Ｔ、マニア
ナイス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　）ら、１９８２、モ
レキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）　ｐｐ、　１３３−１３４〕。

制限酵素による消化によって得られたＤＮＡフラグメン
トの１回収１または１単離“とは、この消化物をポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけて分離し、フラグメン
トの啓動度を分子量既知のマーカーＤＮＡフラグメント
のそれと比較して所望ノフラクメントを同定し、該フラ
グメントラ含むゲルの部分を取り除き、該ゲルからＤＮ
Ａを分離することを意味する。この方法は一般的に知ら
れている。例、艮、ローン（Ｒ，ＬａｗｎＪら、１９８
１、’ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ１隻：６１０
３〜６１１４およびり、ゲラデル　（Ｄ。

Ｇｏｅｄｄｅｌ　）ら、１９８０　’ヌクレイツク・ア
シッズ・リサーチ’８：４０５７参照。

１サブ一ン分析“とは、消化物中のＤＮＡ配列またはＤ
ＮＡ含有組成物中のＤＮＡ配列の存在を、既知の、標識
したオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントとの
ハイブリダイゼーションによって確認する方法である。

本明細書中では、特に断らない限り、サブーン分析とい
う時は、Ｅ、サブ−ン（Ｅ、　５ｏｕｔｈｅｒｎ　）の
方法〔１９７５’″ジヤーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジイ（Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　）’　９８　：　５０３−５１７
　］　に従って、消化物を１％アガロース上で分離し、
変性し、そしてニトロセルロース上に移し、Ｔ、マニア
ナイスらの方法〔１９７８、′セル’　１５　：　６８
７−７０１〕に従ってハイブリダイゼーションｙＥ−行
なうことを意味する。

１形質転換“とは、ＤＮＡを生物内に導入することを意
味し、その結果ＤＮＡが染色体外成分として、あるいは
染色体内に組込まれて複製されることを意味する。特に
明示しない限り、本発明における大腸菌の形質転換法は
マンデル（Ｍａｎｄｅｌ）らノＣａ　Ｃｌ！　２法（１
９７０、′ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジイ’５３：１５４）を採用する。

１ライゲーシヨン（結合）Ｉとは、２個の二本鎖核酸フ
ラグメントの間ｌこホスホジエステル結合を形成する工
程を言う（Ｔ、　マニアナイスら、前掲Ｐ１４６）。特
に明示しない限り、ライゲーションは既知の緩衝液と条
件を使用し、略等モル量のライゲートすべきＤＮＡフラ
グメント０．５μｇ当たりＴ４ＤＮＡリガーゼ（１リガ
ーゼ１）１０単位を用いて行う。

形質転換体からＤＮＡを１調製する′とは、プラスミド
ＤＮＡを微生物培養物中から単離することを意味する。

明示しない限り、マニアナイスらのアルカリ性／ＳＤＳ
法（同上ｐ、９０　）を採用する。

１オリゴヌクレオチド“とは、短かい一本鎖または二本
鎖ポリデオキシヌクレオチドであって、既知の方法によ
って化学的１こ合成され、次いでポリアクリルアミドゲ
ル上でＲＮされたものである。

引用した文献は、参考までに全て末尾の文献目録に示し
た。

以下に実施例を挙げて本発明の詳細な説明する。

（以下俄つ） 実施例１ ブタインヒビンのサブユニットをコードしている配列を
含有するクローンの同定法は、いくつかの先行例〔アン
ダーソン等（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ　、　）、
プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブｌ−イエンシーズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａ
ｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）、８０、：６８３６〜６８４２（
１９８３）およびニルリッチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ　ｅｔ　
ａｔ、　）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ　）、３０９
：４１８〜４２５（１９８４））において成功した、“
長いプローブを用いる方法に基づいている。簡単に説明
すると、λｇｔ　１０において作成し、そしてオリゴ−
ｄＴをプライマーとするＣＤＮＡ合成によってブタ卵巣
ｍＲＮＡから得た、高度に錯綜したＣＤＮＡライブラリ
ーを、ブタインヒビンのα−鎖のＮ−末端アミノ酸配列
に向けられた６４塩基の長さの１本鎖合成オリゴデオキ
シヌクレオチドでスクリーニングした。インヒビン鎖の
ｍＲＮＡは明らかに不安定であるが故に、ライブラリー
を新鮮な卵巣組織から調製すべきであるということがわ
かった。２，０００個のプラーク中約１個がこのプロー
ブと交雑し、雑種化しているクローン化ＣＤＮＡ数個を
配列分析してプローブ同定が正しいことを確認した。こ
の分析により、特徴づけられたＣＤＮＡのすべてが、α
−鎖の前駆体タンパク質の完全な構造を予想するための
十分な配列情報を含んでいないことがわかった。同一の
ＣＤＮＡライブラリー由来のさらに多くのクローンを分
析する代わりに、α−前駆体残基６Ｏ−６４（第１Ａ図
）をコードする配列化領域に相補的な合成オリゴヌクレ
オチドの卵巣ｍＲＮＡ上の３′側延長によって第２のラ
イブタＩＪ−を作成した。このライブラリ・−を、予め
分析しておいたＣＤＮＡからの適当な制限フラグメント
でスクリーニングし、α−前駆体のＮ−末端領域をコー
ドするＤＮＡ配列の残りを指定、する数個の単離体を得
た。このコード化配列の完全性を、ブタα−鎖ペプチド
配列を指定し、そしてメチオニンコドン（前にフレーム
内停止コドンを有し、後ろにシグナルペプチドの特質を
備えた疎水配列が続く）で開始する長いリーディング・
フレームの存在によって判定した。この前駆体タンパク
質およびそのＣＤＮＡの完全配列を第１Ｂ図に示す。シ
グナルペプチドを含有する完全なタンパク質は、３６４
個のアミノ酸からなり、〜４０にのＭ　ｒ値を有し、こ
のうちＣ末端側の１３４個（Ｍ　ｒ〜１４．５Ｋ）はブ
タイン上ビンα−鎖を構成する。前駆体のプロ領域には
Ａｒｇ−Ａｒｇ配列が数個存在し、そのうちの１個はα
−サブユニットの前に直接して存在する。この塩基残基
の後者の対がタンパク質加水分解によるα−ペプチド放
出のプロセシング部位であると我々は考えている。この
推定の前駆体配列により、２つのＮ一連鎖グリコシレー
ト化部位が予想され、その１つはα鎖プロパー内にある
と予想される。

コード領域に加え、このＣＤＮＡ配列は１６７個のヌク
レオチドからなる３′−非翻訳配列（正規のＡＡＴＡＡ
Ａポリアデニル化シグナルを含有する）、および５′−
非翻訳領域（この領域の正確な長さは現在わかっていな
い）。

この方法の詳細は以下のようである。

ポリアデニル化したｍＲＮＡを、新鮮なうちに凍結させ
たブタ卵巣から調製した〔カブラン等（Ｋａｐｌａｎ　
ｅｔ　ａｌ、）、ジャーナル・サブ・バイオケミストＩ
Ｊ　　　（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、１８３：１８
１〜１８４　）。

用いたＥｃｏＲけダブターが配列： ５’−ＡＡＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＣ−３’３’　
−ＧＴＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧ−５／Ｐを有するものであ
ること以外は、ウッド等［Ｗｏｏｄｅｔａｌ、、ネイチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　、３１２　：　３３０＝３３
７（１９８４）〕（７）開示のようにして、ポリＡ＋−
ｍＲＮＡ５μｇからλｇｔｌｏにおいて〜６×１０６ク
ローンのオリゴ−ｄＴ　　プライマー処理したＣＤＮＡ
ライブラリー［ヒユー４７等（Ｈｕｙｎｈ　ｅｔ　ａｔ
、　）　、Ｄ　Ｎ　Ａ・クローニング・テクニックス（
ＤＮＡ　ＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　）、ク
ローバ−（Ｄ、Ｃ１ｏｖｅｒ　）編、１９８４　〕を調
製した。

約１×１０６の未増幅ＣＤＮＡクローンを、第１Ｂ図で
下線を引いたアミノ酸配列に基づ（、呑５α−サブユニ
ット・オリゴヌクレオチド：５／ｍｌＡＣＣＧＣＣＣＣ
ＴＴＴＧＣＣＴＴＧＧＣＣＴＴＧＧＴＣＣ−ＣＣＴＧＣ
ＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣ＋
ＴＣＣＴＧＡＧＧ−３’ でスクリーニングした。交雑は、５　Ｘ　５ＳＣ１４０
％ホルムアミド中、３７℃で、ホスホリル化した３２ｐ
ラベル化プローブを用いて行なった。交雑が陽性である
クローン約５００個が得られ、そのうち１２個を精製し
、挿入の大きさについて試験した。これらのうち５個の
Ｅｃｏ　ＲＩ挿入体（λＰＩＮ−α２、−α５Ａ、−α
５、−α９、−α１０）をＭ　ｌ　３誘導体〔メシング
等（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ　、　）　、ヌクレイ
ツク・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、　）、９　：　３０９〜３２１（１９８１）〕
にサブクローンし、サンガー等［Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　
ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７４：５４６３〜５４６７（１９７７））のジ
デオキシ鎖停止法によって配列決定した。特異的にプラ
イマー処理されたライブラリーを、ポリＡ七ｍＲＮＡ　
５μｇをオリゴヌクレオチド：５’−ＣＣＣＣＡＣＡＧ
ＣＡＴＧＴＣＴＴ−３Ｉ（ヌクレオチド２４８〜２６３
に相補性）でプライマー処理し、次いでλｇ【１０にク
ローニングすることによって調製した。得られた１×１
０６クローンのうち約２　Ｘ　１０５クローンを、λＰ
ＩＮ−ｔｔ２から調製した５’　　１００ｂｐ　Ｅｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントでスクリーニングした。

得られた交雑が陽性であるクローン１７０個のうち１２
個について精製を行ない、２個（λＰＩＮ−５１２５．
−５４ｓ）についてジデオキシ法で配列決定した。α−
サブユニット　ＣＤＮＡの完全なヌクレオチド配列は、
異なるλ単離体からの種々の制限フラグメントをＮ（１
３フア一ジ誘導体にサブクローンすることによって得ら
れた。Ｅ、コリの１本鎖結合タンパク質（ファーマシア
）と組み合わせてデオキシイノシン混合物を用いること
によって圧縮体を溶解した。

ＣＤＮＡの単離 インヒビン・β−サブユニットの前駆体をコードしてい
るＣＤＮＡ配列は、α−サブユニットの際に用いたもの
と同一のＣＤＮＡライブラリーから得られた。重なり合
うｃＤＮＡクローンは、始めに２つのＮ−末端・β−サ
ブユニット配列に基づく単独の長い合成オリゴデオキシ
ヌクレオチドのプローブでスクリーニングし、次いで５
′および３′の両方向に１歩く１プローブとして働く、
特徴っけがなされたＣＤＮＡクローン由来の適当な制限
フラグメントでスクリーニングすることによって単離し
た（第２Ａ図）。

より詳細に説明すると、約２×１０５のオリゴ−ｄＴプ
ライマー処理した卵巣ＣＤＮＡクローンを、残基３２１
〜３３９のアミノ酸配列に基つ＜５′末端標識化βＡオ
リゴヌクレオチド： ５Ｉ−ＡＡＧＡＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣＴ
ＴＣＡＡＧ−ＧＡＣＡＴＴＧＣ，ＣＴＧＧＡＡＴＧＡＣ
ＴＧＧＡＴＣＡＴＴＧＣニー３′ でスクリーニングした。交雑が陽性であるものが５つ得
られ、そのうちの３つが、βＡコード化配列（λＰＩＮ
−βＡ２．−βＡ４、−βＡ８）　　を含有することを
証明した。λＰＩＮβＡ２由来の３′末端２１３ｂｐＥ
ｃｏＲＩ−Ｐｓｔフラグメント（ヌクレオチド１６７９
〜１８９２　）および５′末端１５４　ｂｐ肚ｏ　ＲＩ
−卑剪■（ヌクレオチド１５８〜２９７）を用いて、α
−鎖の特異的プライマー処理ライブラリーからの２×１
０５クローンおよび２×１０６オリゴーｄＴプライ”　
−処理化ｃＤＮＡクローンをスクリーニングした。

詳細に分析した１６のクローンの他に、２つがより大き
い５′末端を有することがわかり（λＰＩＮ−βＡ５Ｓ
、−βＡ２２）、そして１つのクローン、λＰＩＮ−β
Ａ２１は完全な３′−非翻訳領域を含有していた。ブタ
インヒビンβＢサブユニットＣＤＮＡクローンは、特異
的にプライマー処理したライブラリーからの２　Ｘ　１
０”クローンを、第１Ａ図に記載されているＮ　Ｈ２−
末端配列に基づくβＢオリゴヌクレオチド： ５ｌ−ＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＴＣ；ＧＧＡＧＡ
ＡＣＣＡＡＣＣ−ＴＧＴＣＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＧＡＡ
ＴＴＴＴＴＣＡＴＣＧＡＴＴ−ＴＣＡＧＧＣＴ−３’ でスクリーニングすることによって単離した。陽性を示
したクローンについては、さらにオリゴヌクレオチド・
イノシン・プローブ： ５’−ＡＡＩＴＣＴＡＴＩＡＡＩＡＡＴＴＧＴ−３’　
　Ｃ 〔配列中、■はイノシンを表わす〕 でスクリーニングした（これは、アミノ酸配列：ＱＱＦ
ＦＩＤＦのための非コード化鎖におけるすべての可能性
をカバーしている）。

２種のクローン（λＰＩＮβＢ−１５、−２５）を単離
し、配列決定し、βＢサブユニットをコードしているこ
とを確認した。２３０ｂｐのＥｃｏＲＩ　−Ｓｍａ（ヌ
クレオチド２１〜２５１）フラグメントをλＰＩＮβＢ
−Ｉから単離し、これを交雑プローブとして用いて２×
１０６オリゴーｄＴプライム処理したＣＤＮＡクローン
をスクリーニングした。陽性ヲ示したものが２種類得ら
れた（λＰＩＮβＢ　−３，４）。

これらの重なり合ったクローンのヌクレオチド配列を用
いて、示されている配列を作成した。すべての配列は、
特異的なフラグメントをＮ１１３フアージベクター〔メ
シング等、前記〕にサブクローニングすることによって
得た。上記に記載したＥｃｏλＩ制限部位はすべてｃＤ
ＮＡアダプターフラグメント中に含まれており、ＣＤＮ
Ａ中に存在する配列を意味するものではない。

オリゴ−ｄＴプライマー処理したライブラリー由来の極
めてわずかのクローン（２×１０５のうち４つ）だけが
インヒビンＡのβ−サブユニット用の合成プローブと交
雑することに我々は気付いた。

これらのほとんどはＤＮＡ配列分析によって正しいこと
が証明されたが、その３′末端においてポリＡホモポリ
マーがないことから判断する限り、完全な３′−非翻訳
化領域を含有するものは全くない。

ポリＡの尾部がないことは、ライブラリー作成用に用い
るポリメラーゼによって複製することが困難であること
を示す構造領域および／またはこのｍＲＮＡ片における
極めて長い３′−未翻訳化配列の存在を示唆した。より
多量（〜１０倍）のインヒビンβＡサブユニットコード
化配列が、予想外に、α−サブユニツｌ−ｍＲＮＡ上を
特異的にプライマー処理して作成したＣＤＮＡライブラ
リー中に見い出された。このライブラリーを、α前駆体
ｍＲＮＡがβサブユニットをもコードしているであろう
という間違っていることが後に証明された理論に基づい
て、インヒビンＡのβ−鎖用の合成プローブでスクリー
ニングした。このライブラリーにおける極めて多量のイ
ンヒビンβＡ　ＣＤＮＡを、後に、対応するｍＲＮＡの
３′−非翻訳化部分中の領域に対する、この特異的なα
鎖プライマーの偶然の相補性までトレースした。

我々のライブラリーにおいては、インヒビンＢのβサブ
ユニットをコードしているクローン化ＣＤＮＡが４つだ
け見い出された。これらのクローンから得られた配列情
報によっては、対応する前駆体タンパク質およびそのＣ
ＤＮＡの完全な構造を明らかにすることができなかった
。βサブユニットの前駆体の推定タンパク質構造および
ＣＤＮＡ配列を第２Ｂ図において比較する。インヒビン
βＡサブユニッｌ−ＣＤＮＡのヌクレオチド配列は、そ
の長さが３．５ｋｂであり、４２５アミノ酸からなるタ
ンパク質（Ｍｒ〜４６Ｋ）のためのオープン・リーディ
ング・フレーム〔このうちＣ−末端側１１６残基はβサ
ブユニツトプロパー（Ｍｒ〜１３Ｋ）を表わしている〕
を含有している。このリーディング・フレームはメチオ
ニンで始まり、特徴的なシグナルペプチドをコードする
配列がこれに続き、その真の長さは２９残基であると考
えられている。

このコードされたβサブユニットの前には一連の５個の
アルギニンが存在し、この位置でタンパク質加水分解的
に前駆体から切断されるものと推定される。αサブユニ
ット前駆体と同様に、このβ＃Ｊ’Ｉｌ１体は数個の付
加的な塩基残基対を含有し、ここで今まで未知であった
生物学的に活性なペプチド物質が放出されるものと考え
られる。また、プロ領域（Ａｓｎ、残基１６５）にはＮ
−結合グリコシル化が可能な部位が１個含まれている。

インヒビンＢのβサブユニットのこの推定タンパク質配
列は、βＡサブユニット配列との高度な相同性を示す。

７１個のアミノ酸残基が同一であり、はとんどの変化は
コンサーバテイブ（保存的）なものである。比較的程度
は少ないが、配列相同性は両方のβサブユニツト前駆体
のプロ領域にも見い出される。興味あることに、極端に
プリンに富む配列はコード化領域にはめったに見られな
いが、このインヒビンβＡ前駆体をコードしているＣＤ
ＮＡ中には存在し、相同のβＢ前駆体をコードしている
ＣＤＮＡ中には見い出されることのない珍しいアミノ酸
配列になる。このことは、タンパク質配列を相同性が最
大になるように並べたときに、インヒビンのβＢ前駆体
由来の２２アミノ酸残基の欠陥となる。また、このよう
に並べると、両前連体のシスティン位置に完全な好一対
をも生じさせる（第２Ｂ図を参照）。

卵巣の全ての、そしてポリアデニル化したＲＮＡを、配
列決定されたＣＤＮＡをプローブとして用いるノーチン
法で分析して、ヘテロダイマー性インヒビン分子のＢβ
およびペプチドサブユニットαおよびβをコードしてい
るｍＲＮＡのサイズおよび相対的豊富さについて評価Ｉ
７た。ポリアデニル化したｍＲＮＡ（２ＩＱ！　　：レ
ーンａ、ｂ、ｃおよび［；８μｙ　：レーンｄ）および
全ＲＮＡ（１０μｇ：レーンｅおよびｇ）をホルムアル
デヒド１．２％アカロースゲルで電気に動Ｌ、ニトロセ
ルロースフ羽 イルターにプロットした。以下に挙げる　Ｐ−標識化し
たＣ　ＤＮＡフラグメントを、厳格な条件下、交雑プロ
ーブとして用いた。レーンミニαサブユニットＣＤＮＡ
からの２４０　ｂｐ　Ｅｃｏ　ＲニーＳｍａ　工（ヌク
レオチド１３４〜３７１）ｉ　ｂ　：βＡサブユニッ１
−　ＣＤＮＡから（７）１５４　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−
ＨｌｎｄＩ［（ヌクレオチド１５８〜２９７）；Ｃ：β
ＢサブユニットＣＤＮＡからの２３０　ｂｐ　ＥＣＯＲ
Ｉ−８ｍａ　　（ヌクレオチド２１〜２５１）ｉｄおよ
びｅ：λｐｌＮ−ａ２　　ノ４竺Ｊ挿入体；ｆおよびｇ
：λＰＩＮ−βＡ５　のＥｃｏＲ工挿入体。０．ＩＸ　
５ＳＣ１０，１％ＳＤＳを３回交換して、６０℃で２時
間フィルターを洗浄した。

ＣＤＮＡクローニングから得られる結果で示されるよう
に、αおよびβｍＲＮＡが異なる大きさおよび量を有す
るものであることが分析によってわかった（第３図）。

それぞれのバンドの強さからα前駆体ｍＲＮＡは、βＡ
前駆体のｍＲＮＡに比べ少なくとも１０倍以上の量であ
り、かつβＢ前駆体のｍＲＮＡに比べ約２０倍以上大き
い量であると概算される。

リポソームＲＮＡを大きさの標準として用いると、単一
の種であるこのα前駆体ｍＲＮＡはその長さが〜１５０
０ヌクレオチドであり、これはクローン化したｃＤＮＡ
配列とよく一致する大きさである（第１Ｂ図）。βＡ前
駆体ｍＲＮＡ配列は、長さが〜４，５および〜７．２ｋ
ｂである２つの主な種で表わされる。全ＲＮＡに比ベポ
リアデニル化したＲＮＡにおいての方が両方の種の強度
が高いことは、この４．５ｋｂの種が、（ＤＮＡプロー
ブと交雑する２８Ｓ　　ＲＮＡを表わすものではないこ
とを示唆する。

従って、第２Ｂ図で示されるβ前駆体ＣＤＮＡ配列が４
．５ｋｂのｍＲＮＡを表わすと考えられ、βＡｍＲＮＡ
の５′非翻訳化領域が約９００ヌクレオチドの長さであ
ることを示唆する。このβＢ前駆体は、大きさが約４．
５ｋｂである１つのｍＲＮＡ上にコードされており、２
つのβＡ　ｍＲＮＡの約半分のレベルで存在する。この
２つのβｍＲＮＡは密接に関係しているので、両ｍＲＮ
Ａが同じ構造を有し、従ってこのβＢ　ｍＲＮＡ１（お
そらく長い５′および３′非翻訳化領域（βＡ　ｍＲＮ
Ａについて示されるものと同じ領域）を有するであろう
ということを予想することができる。異なるポリアデニ
ル化シグナルを選択すれば７．２ｋｂの種の存在を説明
しつるであろう。

完全なαおよびβインヒビンサブユニットはそれぞれ７
および９個のシスティン残基を含有している。システィ
ン残基を並べると、この２つのサブユニットが同様のシ
スティン分布を分は合っており、そしである配列相同性
がこの残基のまわりに存在していること（冨４図）が明
らかであり、両種類のサブユニットが１つの前駆遺伝子
に由来することを示唆している。驚くべきことに、この
β鎖と最近決定されたヒトＴＧＦ−βの一次構造との間
にかなりの相同性が見い出された。第４図中に下線を引
いたように、両ペプチドはほぼ等しい長さであり（イン
ヒビンβＡサブユニット：１１６；βＢサブユニット：
　１１５；ＴＧＦＳ：１１６残基）、それらのシスティ
ン残基９個の著しく類似した分布を示す。並べかえにこ
のシスティン”？ｒ格”を用いると、このβＡおよびＴ
ＧＦ−β配列は同一位置に３１個の付加的な残基を有し
、９つの相同場所にわずかな差異を示す。同様の相同性
の高さはβＢとβ−ＴＧＦの比較においても見られる。

よりうまく並べるためにある空白を導入した（第４図）
。

全体の相同性は３５％であるが、ある部分（ブタインヒ
ビンβＡ鎖残基１１〜４５とＴＧＦ残基１５〜４９を比
較して）では６０％に達し、種の違いを考慮するとその
相同性は極めて高い。興味あることに、この相同性はそ
れぞれのＣＤＮＡ中のタンパク質合成のための停止コド
ンを越えて延びている。従って、このＴＧＦ−βのＣＤ
ＮＡおよび両方のイン上ビンβサブユニツトは極めてＧ
とＣに富む配列をこの領域に含有し、またこれらは異常
に長い５′および３′非翻訣化領域を有している。

ヒトおよびネズミのβ−ＴＧＦの間にはほとんど絶対的
な相同性が存在するので、インヒビンのβサブユニット
がヒトＴＧＦ−βのブタ等何物であるというこの示唆を
割引いて考えることができる。

これらの知見は、インヒビンサブユニットとＴＧＦ−β
の両者が共通の祖先を有し、１種類の遺伝子の族に属す
るということを強（示している。３種のペプチドすべて
は、同様の大きさの前駆体（Ｍｒ〜４０Ｋ）から生じる
（それらはＣ−末端の１１０残基程度を占め、アルギニ
ン対の所でタンパク質加水分解切断によって放出される
）。それらはホモまたはヘテロダイマーを形成し、生物
学的に活性な複合体中のサブユニットはジスルヒド架橋
で結合する。しかし、βサブユニットおよびＴＧＦペプ
チドの前にある普通ではない残基を含有する領域は、制
限されているとはいえかなりの配列関連性を示すが、Ｔ
ＧＦ−βとβサブユニツト間には、それらの前駆体のプ
ロ部分においては配列相同性が少ししか存在しない。

実施例２ ブタインヒビンの組み換え合成に用いたプラスミドはｐ
　Ｓ　Ｖ　Ｅ−Ｐ　ａ　Ｂ　Ａ　Ｉ　ｎ　ｈ　−Ｄ　Ｈ
Ｆ　Ｒである。このプラスミドの構築法を第５図に示す
が、これを以下のようにして行なった。

ｐＨＢ５３４８−Ｅ（ＥＰ　００７３６５６Ａ）をＥｃ
ｏＲＩで部分消化し、Ｅ、コリＤＮＡポリメラーゼエ（
フレノウフラグメント）および４種のｄＮＴＰで平滑に
し、ライゲートし、そしてライゲーション混合物をＥ、
コリ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）に導入して形質転換
した。この形質転換培養物をアンピシリン培地プレート
上で平板培養し、耐性コロニーを選別した。ＳＶ４０初
期プロモーターの前にあるＥＣｏＲＩ部位の欠失に対し
てプラスミドをスクリーニングした。この欠失部位を有
するプラスミドをｐＨＢ５３４８−ＥＩＩと称する。

ｐＨＢ５３４８−ＥＩＩをＥｃｏ　ＲＩおよびＥｃｏＲ
Ｉ　テ消化して２種のフラグメント、すなわち５Ｖ４Ｑ
初期プロモーター、ｐｍＬ−Ａｍｐｒ配列およびＨＢ　
ｓ　Ａｇ３′非翻訳化領域を含有するフラグメントＩ、
ならびにＨＢｓＡｇ（肝炎Ｂ抗原）コード化配列を含有
するフラグメント２を得た。

ブタインヒビンβＡサブユニットのコード化領域を含有
するλＰＩＮβＡ５５をＥｃｏＲＩおよび肋！■で消化
し、βＡコード化領領域含有する１３３５ｂｐ　のフラ
グメント（フラグメント３）をポリアクリルアミドゲル
電気泳動で回収した。アガロースゲル電気泳動で回収し
たフラグメントエを７ラグメント３にライゲートし、こ
のライゲーション混合物をＥ、コリ株２９４（ＡＴＣＣ
３１４４６）に導入して形質転換した。この形質転換培
養物をアンピシリン培地プレート上で平板培養し、耐性
コロニーを選別した。プラスミドＤＮＡを形質転換体か
ら調製し、制限分析によって正しいＤＮＡフラグメント
の存在を確認した。このプラスミドをｐＳＶＥ−ＰβＡ
　Ｉ　ｎ　ｈと称する。

ＰＨＢＳ３４８−Ｅ（ＥＰ　００７３６５６Ａ）を胛Ｒ
工で部分的に消化し、Ｅ、コリＤＮＡポリ〆ラーゼエ（
フレノウフラグメント）および４種のｄＮＴＰで平滑に
し、Ｓａｌ　工認識部位を含有する合成オリゴヌクレオ
チド：　５′−ＧＧＴＣＧＡＣＣ−３’にライゲートし
た。この形質転換培養物をアンピシリン培地プレート上
で平板培養し、耐性コロニーを選択した。

プラスミドを余分のＳａｌ　工制限部位の存在について
スクリーニングした。プラスミドＤＮＡをこの構築物か
ら調製した（　ｐＨＢ５３４１３−ＥＳａｌ　工）。

λＰＩＮα−１２ｓおよびλＰＩＮａ−２をＥｃｏＲＩ
およびＢａｍＨＩで消化した。５′コード化領域を含有
するλＰＩＮａ−１２３からのｌ　Ｑ　４　ｂｐ　Ｅｃ
ｏＲＩ　−ＢａｍＨ■フラグメントおよび中央部分と３
′コード化領域を含有するλＰＩＮα−２からの１２４
６ｂｐ　ＥｃｏＲニー１３１ｍＨＩを回収し、いっしょ
にしてライゲートした。このライゲーション混合物をＥ
ｃｏＲＩで消化し、酵素を熱変性し、混合物をＥｃｏＲ
Ｉ消化したｐＵＣ９（ＢＲＬ）にライゲートした。組み
換え体を選別し、制限分析によって確認した。ＤＮＡを
正しいプラスミドから調製した（ｐＰＩＮα）。

ブタα−イン上ビンの完全なコード化領域を含有するＰ
ＰＩＮαをＮＣＯ■およびＥｃｏＲ工テ消化シ、４　ｄ
ＮＴＰの存在下、Ｐｏ１（１）Ｋ　で充填し、１２８０
ｈｐの７ラグメント（フラグメント４）をゲル電気泳動
で回収した。ｐｉ（ＢＳ　３４　ｇ　−ＥＳａｌ　Ｉ　
　をＳｓｔ■およびＨｉｎｄｌｉで消化し、４　ｄＮＴ
Ｐの存在下、Ｐｏｔ（Ｉ）Ｋ　Ｔ：充填し、Ｐ　ＭＬ　
−Ａｍｐ　ｒ領域、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＨ
ＢｓＡｇ３’非翻訳化領域を含有するフラグメント５を
ゲル電気泳動で回収した。フラグメント４および５をい
っしょにしてライゲートし、このライゲーション混合物
を用いてＥ、コリ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質
転換した。

組み換え体をアンピシリン培地プレート上での増殖によ
って選別した。目的の組み換え体をｐＳＶＥ−Ｐα工ｎ
ｈ　　と称する。

ｐＨＢ５３４８−Ｅｓａｔ　ＩをＳａｌ　工およびＨｉ
ｎｄＩ［で消化し、ｐＭＬ−Ａｍｐｒおよび５Ｖ４Ｑ初
期プロモーターを含有するフラグメント６をゲル電気泳
動で回収した。ｐＦＤ［（ＥＰ　１１７，０６ＯＡ）　
　をシリ■およびＨｉｎｄＩ［で消化し、ＨＢｓＡｇ３
’非翻訳化領域と融合した正常なマウスＤＨＦＲ遺伝子
を含有するフラグメント７を回収した。フラグメント６
および７をライゲートし、このライゲーション混合物で
Ｅ、コリ株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換し
た。この形質転換培養物をアンピシリン培地プレート上
で平板培養し、耐性コロニーを選別した。プラスミドＤ
ＮＡを形質転換体から調製し、制限分析によって正しい
ＤＮＡフラグメントの存在を確認した。この構築物をｐ
ＦＤ■−５ａｔ　Ｉ　　と称する。

ｐＳＶＥ−Ｐα工ｎｈをＳａｌ　工で消化し、ＨＢｓＡ
ｇ３’非翻訳化領域と融合したα−インヒビンコード化
領領域よび５Ｖ４Ｑ初期プロモーターを含有するフラグ
メント８を回収した。ｐＦＤＩ［−５ａｌＩをＳａｌ　
工で消化し、ＨＢｓＡｇ３’非翻訳化領域と結合したマ
ウスＤＨＦＲコード化領域およびＳＶ４０初期プ初期プ
ロモーターナ含有ラグメント９を回収した。ｐＳＶＥ−
βＡ　Ｉ　ｎ　ｈをＳａｌ　’ｆ−消化して直線化し、
フラグメント８および９と３成分ライゲーションでライ
ゲートした。このライゲーション混合物でＥ、コリ株２
９４（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換した。この形質
転換培養物をアンピシリン培地プレート上で平板培養し
、耐性コロニーを選別した。３つのＳＶ４０初期プロモ
ーターからの転写が同一の方向に進行するように、フラ
グメント８および９が正しい方向で存在しているかどう
かについて形質転換を 体をスクリーニングした。この最終のプラスミド、ｐｓ
ＶＥ−ＰｃｔβＡ　Ｉ　ｎ　ｈ　−Ｄ　ＨＦ　Ｒと称す
る。

プラスミドｐＳＶＥ−ＰｃｔβＡＩｎｈ−ＤＨＦＲをＤ
Ｅ（ＦＲ欠失ＣＨＯ細胞〔ウルラウブおよびチャーシン
（Ｕｒｌａｕｂ　ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ　）　、プロシ
ーデイングス−オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンス（ＰＮＡＳ）　、７７．４２１６〜４２２０
（１９８０）　Ｅ中にトランスフェクションした。しか
し、すべてのＤＨＦ　Ｒ−咽乳動物宿主細胞がこのプラ
スミドの使用に適している。あるいはまた、宿主細胞を
ネオマイシン耐性をコードしているプラスミドで同時形
質転換するときには、すべての哨乳動物宿主細胞が使用
でき、この場合、形質転換体は、ネオマイシン含有培地
において増殖しうるその能力によって同定される。

このトランスフェクションしたＣＨＯ細胞を１５ＨＧＴ
−培地で培養して選別した。この細胞を直径１５Ｃ！ｎ
のプレート中、集密状態になるまで増殖させた。次いで
、細胞を集める前に、血清を含まない培地で４８時間培
養した。ヒト血清アルブミン１００■を加えた後、上清
培地５０耐を凍結乾燥した。残留物を１ｆｏウシ胎児血
清のＨＤＭＥＭ　［ギブコーラボラトリーズ（ＧＩＢＣ
ＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）、５ａｎｔａ　Ｃ１ａ
ｒａ、　ＣＡ）溶液３　ｍＱ、　ニ再溶解し、マイレツ
’）　ス−ＧＳ　　０．２２ｍＭフィルター（Ｍｉｌｌ
ｅｘ−ＧＳ。

ミリポアー社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、　）、
Ｂｅｄｆｏｒｄ　、　ＭＡ）で濾過し、正副対で検定し
た。

形質転換体上清におけるインヒビンのホルモン様活性を
、ラット下垂体前葉単層培養物を用いる試験管内パイオ
アフセイによって測定した〔ベール等（Ｖａｌｅ　、　
Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、）、エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　）、９１．５６２〜５７２（１９
７２）Ｌ簡単に説明すると、生後２１日日の雌ラット下
垂体前葉を集め、酵素的に分散し、１白目は２４−ウェ
ル組織培養プレート〔ファルコン・プラスチック（Ｆａ
ｌｃｏｎ　Ｐｌａｓｔｉｃ　）、０ｘｎａｒｄ　、　Ｃ
Ａ　）に入れ、１０％ウシ胎児血清のＨＤＭＥＭ　（ｉ
ｌｌ記）溶液中で平板培養した。２日日に培地を１％ウ
シ胎児血清のＨＤＭＥＭ溶液に交換し、形質転換体培地
試料を加え、さらに４８時間インキュベーションを続け
た。

次いでこの単層培地を集め、”ＮＩＡＤＤＫＤの下垂体
ホルモンプログラム１から入手した材料を用い、放射線
免疫検定（ＲＩＡ）によってＬＨおよびＦＳＨ含量を測
定した。この検定において、インヒビンを含有するＣＨ
Ｏ細胞培養物は、インキュベーション培地だけを与えた
対照下垂体細胞と比較すると、基礎的なＦＳＨの放出を
阻害するがＬＨは阻害しない。形質転換体上清中で検知
されたブタインヒビンの量は２０　ｎｇ／ｍｆｌであり
、純粋なブタ卵巣インヒビンで得られた用量−反応曲線
に相応する曲線を示した。

免疫学的な交叉反応性をサンドイッチ型放射線免疫検定
によって検定する。フロイントの完全アジュバント中、
ブタインヒビンをウサギに経皮投与することによって免
疫化し、精製ブタ卵胞インヒビンに対するウサギ抗血清
を高める。抗血清中の抗インヒビンの存在は、抗血清を
精製ブタインヒビンとともにインキュベーションし、常
法、たとえばゲル濾過によって免疫複合体の生成を検定
して測定する。この抗血清の一部を、ヤギー抗−ウサギ
エｇＧを予め塗布したポリスチレン試験管に塗布する。

組み換え培養物上清あるいは抽出物をリン酸緩衝食塩水
で希釈し、上記の塗布試験管に加え、−晩インキユベー
トし、洗浄する。ウサギ抗血清の別の一部をこの試験管
に加え、インキュベートし、洗浄する。放射線ヨウ素化
したヤギ抗つサキエｇＧをこの試験管に加え、インキュ
ベートし、未結合のヤギ抗血清を洗浄して除去する。試
験管での結合数から明白であるように（これは、非形質
転換宿主細胞からの抽出物または培養培地でインキュベ
ートした対照群のそれを上回る）、この組み換えによっ
て生成したインヒビンはウサギ抗血清と交叉反応する。

実施例３ 完全なブタおよびヒトβＡ鎖が同一であるという発見に
より、ヒトインヒビンαβＡの発現は容易である。すな
わち、ヒトイン上ビン発現用ベクターの構築は、ブタβ
ＡをコードしているＣＤＮＡを含有する、実施例１のプ
ラスミドｐＳＶＥ−βＡから行なうことができる。

卵巣ｍＲＮＡ１０μｙから調製したヒト卵巣ＣＤＮＡの
２ｇ【１０　ライブラリーを、α、βＡおよびβＢ鎖を
コードしている放射線リン酸標識化ブタＣＤＮＡを用い
て、サブン分析にかけた。λＨＩＮα−２はヒトαイン
上ビン鎖のコード化領域を含有することが確認された。

ヒトαイン上ビンの場合の雑種化クローンの割合は、ブ
タαイン上ビンについて見い出されるそれよりかなり低
く、ａＩｎｈ用のブタＣＤＮＡの５３５ｂｐＳｍａ■７
ラグメントと交雑したヒトクローン１００，０００　細
巾、１個の位である。

β鎖クローンもまれであり、βＢクローンはβＡの約３
倍量存在する（クローン１，０００，０００個中、それ
ぞれ１個および３個である）。β鎖クローンのすべては
完全な長さのものではない。これらをプライマー処理し
たＣＤＮＡライブラリーで補充し、通常ブタＣＤＮＡに
ついて上記したようにして組み立てた。このλ挿入体を
ＥｃｏＲＩ消、化して回収した。

プラスミドｐ　ＨＩ　Ｎα−２をＮＣＯＩおよびＳｍａ
Ｉテ消化し、ゲル電気泳動によって１０４９ｂｐ１５フ
ラグメント（フラグメント１０）を回収した。ｐＰｉｎ
α（実施例２）をＥＣＯＲ工およびＰｖｕ■で消化した
。

９８ｂｐフラグメント（フラグメント１１）をゲル電気
泳動によって回収した。フラグメント１０および１１を
アダプターエ： ５’−ＣＴＧＣＴＣＣＴＣＴＴＧＣＴＧＴＴＧＧＣＣＣ
ＣＡＣＧＧＡ−ＧＴＧＧＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧ
ＧＣＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧ−ＡＣＣ−３’ に、アダプターエの相補体であるアダプター■と組み合
わせてライゲートした。得られた１２０８　ｂｐフラグ
メント（フラグメント１２）を４ｄＮＴＰおよびＰｏｌ
　（Ｉ）のフレノウフラグメントで処理し、ＨｉｎｄＩ
［および５ａｃＩＩで制限消化して実施例１に記載のよ
うにして平滑末端にしておいたｐ　ＨＢ　５３４８−Ｅ
Ｓａｌ工にライゲートした。別法では、Ｈｐａ　’７１
部位の上流（すなわち、ブタ配列の最初の２１残基）を
コードしているフラグメントを回収化した。この別法に
おいて用いたアダプターを以下に示す： ５’ＣＧＣ，ＡＧＣＴＣＧＡＣＣ３’ ３’　　ＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧ　５’０正しく配向した
フラグメント１２を有するプラスミドｐＳＶＥ−Ｈα■
ｎｈ　を形質転換体の配列分析によって同定した。従っ
て、この構築物（ｐｓＶＥ−Ｈα工ｎｈ）は、ブタシグ
ナル配列の最初の２４残基を、プレプロヒトインヒビン
である残部とともに含有する。プラスミドｐＳＶＥ−Ｈ
αＩｎｈをΣリエで消化した。５Ｖ４Ｑプロモーターお
よびヒトインヒビン配列を含有するフラグメントを、フ
ラグメント９およびＳａｌ　’ｆ−消化したｐＳＶＥ−
βＡＩｎｈ（実施例２）にライゲートした。ｐＳＶＥ−
ｈαβＡＩｎｈ−ＤＨＦＲ１と称するこの最終プラスミ
ドをＤＨＦＲ欠失のＣＨＯ細胞中にトランスフェクショ
ンし、実施例２に記載のようにして選別した。この培養
物の上清はホルモン的に活性なヒトインヒビンを含有し
ていた。

実施例４ 本実施例は、ブタβＢプレプロ領域のかわりにヒトイン
ヒビンβＢのプロ配列を用いること以外は実施例３と同
様である。

実施例３のラムダｇ【１０ライブラリーは、実施例３に
記載したように、λＨＩＮα２を、λＨＩＮβＡ−５お
よび−１４とともに生成した。この後者２種類のファー
ジを用い、λＨＩＮβＡ−５の３１１　ｂｐＥＣＯＲＩ
　−Ｈｌｎｄ　ｌ［７ラグメ７ｌ−（７ラグメ７　）１
３）をλＨＩＮβＡ−１４の１１０１ｂｐ堅■−〒１フ
ラグメント（フラグメント１４）にライゲートし、この
混合物をＥｃｏＲＴ−Ｓｍａ　１消化したｍｐ１８ベク
ター（バイオラブズ）中でライゲートして、完全長さの
βＡコード化ＣＤＮＡを構築した。クローンを適切な大
きさの挿入体についてスクリーニングし、選別した。２
本鎖にするため、正しい挿入体を含有するｍｐ１８ベク
ターをＤＮＡポリメラーゼ（Ｉ）および４種のｄＮＴＰ
で処理し、次いでＸｂａ工で消化しくこれはｍｐ１８ポ
リリンカー配列内を切断する）、ＤＮＡポリポリーゼエ
および４種のｄＮＴＰで平滑にし、そしてＥｃｏＲＴで
消化した。

１３２０ｂｐ　のフラグメント（フラグメント１５）を
、実施例２のＥｃｏＲニーＥｃｏ　ＲＶフラグメント１
にライゲートした。このライゲーション混合物を用いて
Ｅ、コリ２９４細胞を形質転換した。クローンをサブン
・ハイブリダイゼーションでスクリーニングし、制限分
析で確認した。ｈ工ｎｈβＡコード化配列を含有するこ
のクローンをｐｓＶＥ−ｈｕｍβＡ工ｎｈと称する。ヒ
トβＡコード化配列およびヒトα−イン上ビン配列をＤ
ＨＦＲ遺伝子とともに含有するプラスミドを、上記に略
述したようにしてプラスミドｐＳＶＥ−ｈｕｍβＡＩｎ
ｈ、ｐｓＶＥ　−ＨａＩｎｈおよびｐＦＤ工］−５ａｌ
　Ｉから構築する。すなわち、ヒトαイン上ビンおよび
ＤＨＦＲ遺伝子を含有するｐＦＤ工：［Ｓａｌ　Ｉ　　
およびｐ　Ｓ　ＶＥ　−Ｈａ　：［ｎｈ由来のＳａｔフ
ラグメントをＳａｌ工消化したｐＳＶＥ−ｈｕｍβＡ　
Ｉ　ｎ　ｈとライゲートし、３種の遺伝子全部を含有す
るクローンを同定した。ｐｓＶＥ　−ｈｕｍαβＡＩｎ
ｈ　−ＤＨＦＲ２と称するこのプラスミドをＤ　ＨＦ　
Ｒ−ＣＨＯ細胞中にトランスフェクションし、ｇｈｔ−
培地で培養して選別した。２４のクローンを取り出し、
ＣＨＯ細胞に対する通常の条件下、ｇｈｔ〕音地で２日
間集密状態になるまで増殖させ、さらに２日間そのまま
にしておき、次いでこの培養培地を、上記のラット下垂
体細胞検定を用いてインヒビンおよびアクチビン活性に
ついて検定した。４つのクローンがかなりの量のヒトα
βＡインヒビンを分泌することがわかった（ｈαβＡ−
８，１２，１４および１８）。クローンそれぞれの培養
培地中のレベルはそれぞれ１２５，１２５．２００およ
び２５０　ｎ７／ｍＱであった。別のクローン（ｈαβ
Ａ−１１）は、このクローンについて培養培地における
α鎖免疫反応性の欠如および生物学的活性によって測定
する限り、検知しつるインヒビンは全く産生じないが、
βＡβＡホモダイマーとしてアクチビンを産生じた。ク
ローンｈαβＡ−１６はα鎖だけを分泌し、アクチビン
またはインヒビン活性を欠いていた。

実施例５ ベール等（Ｖａｌｅ　ｅｔ　ａｌ、、同じ）およびリン
グ等（Ｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、同じ）が報告している
ように、β鎖Ａおよび／またはＢのホモダイマーおよび
ヘテロダイマーは、下垂体においてインヒビンの逆効果
を有し、ＦＳＨを阻害するよりむしろ誘起する。これら
のタンパク質を一括してアクチピンと称するが、これら
を実施例４に記載したようにして、αおよびβ鎖共形質
転換体において調製する。

しかし、最初のトランスフェクションがα鎖遺伝子を含
有しないベクターあるいはベクター群で行なわれたとき
には、適切な形質転換体をさがすためのスクリーニング
はいく分生なくてよい。適切なベクターは、上記のベク
ターからα鎖遺伝子を切除することによって容易に構築
される。実施例４からのプラスミドｐＳＶＥ−ｈｕｍβ
Ａ　Ｉ　ｎ　ｈをＳａｌ工で消化し、ＤＨＦＲ遺伝子を
含有する７ラグメント９（実施例２）にライゲートする
。このライゲーション混合物を用いてＥ、コリ２９４細
胞をトランスフェクションし、β鎖ＤＮＡと雑種化して
いるがα鎖配列とは雑種化していないことに基づいてコ
ロニーを選別した。α鎖ＤＮＡを削除したクローンｐｓ
ＶＥ−ｈｕｍβＡ　工ｎｈ　−Ｄ　ＨＦ　Ｒを同定した
。このクローンを上記のようにしてＤＨＦＲ−ＣＨＯ細
胞中にトランスフェクションした。形質転換体が培養培
地中にアクチビンを分泌することを確認した。

同様に、βＢコード化配列（ヒトβＡの最初の３４アミ
ノ酸をコードしているＤＮＡをヒトβＢ鎖の残りのコー
ド化配列にライゲートして再構築される）を含有する発
現ベクターは容易に構築され、ｐＳＶＥ−ｈｕｍβＡ　
Ｉ　ｎ　ｈ　−Ｄ　ＨＦ　Ｒと共トランスフェクション
してヘテロダイマーを得た。また、試験管内バイオアッ
セイにおいてインヒビンのαβＡ形と実質的に等しい生
物学的活性を有するαβＢインヒビンを得るために、こ
の再構築ヒトβＢ遺伝子を前記プラスミドに用いた。

本発明をその好ましい態様について記載し、これが、本
発明者が現在知りつる限り最良の態様であるが、当分野
で通常の知識を有する者にとって明白である種々の変更
および修正を、本明細書中の特許請求の範囲に記載した
本発明の範囲を逸脱することなく、これを行ないうるこ
とを理解しておくべきである。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図はブタα鎖ｍＲＮＡを示す模式図、第１Ｂ図は
ブタインヒビンα鎖前駆体のヌクレオチド配列および推
定のアミノ酸配列を示す模式図、第２Ａ図はブタβＡサ
ブユニッ）ｍＲＮＡおよびブタβＢサブユニットｍＲＮ
Ａを示す模式図、第２Ｂ図はブタイン上ビンβサブユニ
ツト前駆体のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配
列を示す模式図、第３図はブタ卵巣ｍＲＮＡの／ｍｌザ
ン・プロット分析法による分析結果を示す模写図、第４
Ａ図はヒトβ−ＴＧＦのアミノ酸配列とブタインヒビン
βＡおよびβＢのアミノ酸配列を対比させて示した模式
図、第４Ｂ図はαサブユニット配列とβＡインヒビン配
列とを対比させて示した模式図、第５Ａ、５Ｂおよび５
Ｃ図はブタインヒビンの代表的な組換え発現プラスミド
の組立て模式図、第６Ａおよび６Ｂ図はヒトαイン上ビ
ンＣＤＮＡのヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配
列を示す模式図、第７Ａおよび７Ｂ図はヒトαイン上ビ
ンタンパク質配列とブタαイン上ビンタンパク質配列と
を比較して示した模式図、第８Ａ、８Ｂおよび８０図は
ヒトβＡインヒビンシグナル配列ノヌクレオチド配列お
よび推定のアミノ酸配列を示す模式図、第９Ａ、９Ｂお
よび９Ｃ図はヒトβＢインヒビン（ＤＮＡのヌクレオチ
ド配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）インヒビンα鎖またはインヒビンβ鎖をコー
   ドしている核酸を含有するベクターを組立て、（ｂ）こ
   のベクターで宿主細胞を形質転換し、次いで、（ｃ）形
   質転換された細胞を培養することからなる方法。 ２、インヒビンα鎖またはインヒビンβ鎖をコードして
   いる核酸が、宿主細胞に認識され得るプロモーターと機
   能的に結合しており、さらに、インヒビンαまたはβ鎖
   二量体を培養培地から回収する工程をも含む第１項記載
   の方法。 ３、細胞が原核性細胞である第１項記載の方法。 ４、ベクターが、インヒビンα鎖およびインヒビンβ鎖
   両者のプレプロ形をコードしている核酸を含んでいる第
   １項記載の方法。 ５、細胞が多細胞生物から得た細胞であり、インヒビン
   がホルモン的に活性である第２項記載の方法。 ６、プロモーターがウィルスのプロモーターである第２
   項記載の方法。 ７、プロモーターがＳＶ４０プロモーターである第６項
   記載の方法。 ８、回収されたインヒビンがブタまたはヒトの成熟イン
   ヒビンである第３項記載の方法。 ９、ベクターがプレプロ形のインヒビンβ鎖をコードし
   ている核酸を含有しており、α鎖を含むことなく成熟β
   鎖二量体を回収する第１項記載の方法。 １０、β鎖がβＡ鎖であり、インヒビンが培地中に約２
   ０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で存在している第５項記載の方
   法。 １１、ベクターがインヒビンのプレプロα鎖およびプレ
   プロβ鎖の両方をコードしている第１項記載の方法。 １２、核酸がインヒビンα鎖またはβ鎖のアミノ酸配列
   変異体をコードしている第１項記載の方法。 １３、未確認のヒトまたはブタのタンパク質を全く含ん
   でいない、ヒトまたはブタのインヒビンを含有する組成
   物。 １４、天然のグリコシル化を伴なわないαまたはβ＿Ｂ
   インヒビンプロドメインを含有する組成物。 １５、インヒビンα鎖を含まない、成熟インヒビンβ＿
   Ａあるいはβ＿Ｂ鎖のホモ二量体を含有する組成物。 １６、インヒビンα鎖を含まない、成熟インヒビンβ＿
   Ａと成熟インヒビンβ＿Ｂとのヘテロ二量体を含む組成
   物。 １７、インヒビンα鎖またはインヒビンβ鎖をコードし
   ている非染色体ＤＮＡ。 １８、介在性の非翻訳配列を含まない第１７項記載のＤ
   ＮＡ。 １９、ブタまたはヒトの、インヒビンα鎖またはインヒ
   ビンβ鎖をコードしている第１７項記載のＤＮＡ。 ２０、検出可能な部分で標識されている第１７項記載の
   ＤＮＡ。 ２１、αまたはβ鎖のアミノ酸配列変異体をコードして
   いる第１７項記載のＤＮＡ。 ２２、インヒビンαまたはβ鎖をコードしているＤＮＡ
   を含有している複製可能なベクター。 ２３、ＤＮＡが、ブタまたはヒトのインヒビンαまたは
   β鎖をコードしている第２２項記載のベクター。 ２４、インヒビンαまたはβ鎖をコードしているＤＮＡ
   と機能的に結合したウィルス性プロモーターを含有して
   いる第２３項記載のベクター。 ２５、インヒビンα鎖とインヒビンβ鎖の両者をコード
   しているＤＮＡを含有している第２２項記載のベクター
   。 ２６、インヒビンβ鎖をコードしているが、インヒビン
   α鎖をコードしていないＤＮＡを含有している第２２項
   記載のベクター。 ２７、インヒビンα鎖またはインヒビンβ鎖をコードし
   ているＤＮＡを含む複製可能なベクターで形質転換され
   た宿主細胞。 ２８、真核性細胞である第２７項記載の細胞。 ２９、ＤＮＡがブタまたはヒトのインヒビンαまたはβ
   鎖をコードしている第２７項記載の細胞。 ３０、成熟インヒビンα鎖配列を含まないインヒヒンα
   鎖プロドメイン配列を含有している細胞不含組成物。 ３１、（ａ）式： 【アミノ酸配列があります】 で示されるインヒビンβ＿Ａ鎖プロドメイン配列または
   、その天然に存在する哺乳類のアミノ酸配列変異体を含
   むポリペプチド、 （ｂ）式： 【アミノ酸配列があります】 で示されるインヒビンβ＿Ｂ鎖プロドメイン配列または
   、その天然に存在している哺乳類のアミノ酸配列変異体
   を含むポリペプチド、あるいは、（ｃ）式： 【アミノ酸配列があります】、 で示されるインヒビンα鎖プロドメイン配列または、そ
   の天然に存在する哺乳類のアミノ酸配列変異体を含む、
   成熟α鎖アミノ酸配列不含のポリペプチドを含有する細
   胞不含組成物。 ３２、インヒビンβ鎖プロドメイン配列を含有する細胞
   不含組成物。 ３３、β鎖がβ＿Ａ鎖であり、成熟β＿Ａ鎖配列を含有
   していない第３２項記載の組成物。 ３４、β鎖がβ＿Ｂ鎖であり、成熟β＿Ｂ鎖配列を含有
   していない第３２項記載の組成物。 ３５、変異体が対応するブタのアミノ酸配列である第３
   １項記載の組成物。 ３６、ポリペプチドが本来のグリコシル化を伴なってい
   ないものである第３１項記載の組成物。 ３７、滅菌されており、ポリペプチドがさらに免疫原性
   ポリペプチドをも含有している第３１項記載の組成物。 ３８、第３１項記載の予め決定されているポリペプチド
   と結合し得る抗体。 ３９、ポリペプチドが検出可能な基とコンジユゲートし
   ているものである第３１項記載の組成物。 ４０、検出可能な基が酵素、螢光性の基または放射性同
   位体である第３９項記載の組成物。 ４１、水不溶性支持体に非共有結合的に吸着されるか、
   あるいは共有結合的に交差結合することにより不溶化さ
   れている第３１項記載の組成物。 ４２、動物組織内にポリペプチドをコントロール下に放
   出するよう、生理学上許容し得る移植可能なマトリック
   スをも含有する第３１項記載の組成物。