JPS61112100A - 新規なホルモン並びに、その製造方法、使用方法および分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規なホルモンの同定法並びに製造方法に関す
るものである。さらに詳しくは、本発明は、哺乳類にお
ける生殖の生化学に関するものである。

発明の背景 ヒトにおける生殖は、胎児発生の初期に現われる視床下
部−脳下垂体−生殖腺軸により、コントロールされてい
る。黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）（また
の名を性腺刺激ホルモン放昆ホルモン（ＧｎＲＨ）とも
いう〕は構造既知のデカペプチドであり、上記コントロ
ール系の中心（キー）分子である。これは視床下部のニ
ューロンで生産され、正中隆起（視床下部の）の毛管そ
うに脈動的に分泌され、下垂体前葉の性腺刺激細胞から
黄体形成ホルモンおよび卵胞刺激ホルモンを放出させる
様、作用する。ＬＨＲＨまたはＬＨＲＨ様の免疫反応性
は生殖組織である胎盤〔Ｇ、コドル（Ｇ、　Ｋｏｄｒ　
）ら、１サイエ７ス’　２０７：３１５−３１７（１９
８０）　　およびＪ、ゴードロア　（Ｊ、Ｇａｕｔｒｏ
ｎ　）ら、１モレキユラー・アンド・セルラー・エンド
クリ１０シイ（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ　）　’　２４　：　１−１６（１９８１）］
および中枢神経系にも見出されて２す、このペプチドが
別の作用を有することを示唆している。Ｌ　ＨＲＨまた
はＬＨＲ）ｉ様作用が中枢神経系に存在していること、
並びに、外因性Ｌ　）Ｉ　ＲＨ投与が行動に及はす作用
に鑑みて、研究者達は、このペプチドを生殖行動のコン
トロールに関与する、真の転写物質（トランスクライバ
−）であるとの仮説を立てた［　Ｒ，モス（Ｒ，Ｍｏ５
ｓ”フエデレーション・プロシーディンゲス（Ｆｅｄ、
　Ｐｒｏｃ。

）１β６：１９７８−１９８３（１９７７））。

視床下部抽出物および胎盤抽出物のクロマトグラフによ
る研究の結果、ＬＨＲＨには前駆体の形か存在すること
が示唆された［Ｊ、ゴートロン（前掲）、艮ミラー（Ｒ
，Ｍｉｌｌａｒ　）ら、′バイオケミカル・アンド・バ
イオフィジカル・リサーチ・コミュ＝　ケ−ンヨ７　（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ
ｍｕｎ。

）’　　７４ニア２Ｏ−７２６（１９７７））。しかし
ながら、これらの形の物質はほとんど特性化されておら
ず、不純な混合物中として存在しており、極く少量しか
手に入れることができない。

これまで長い間、下垂体前葉からのプロラクチンぐＰＲ
Ｌ）の分泌は、主に阻止的なコントロール下にあると考
えられてきた。ドパミンがその様な阻止コントロールを
表わすことは知られていたが、ＰＲＬの阻止に関与して
いるのがドパミンのみであるはずがない、ということの
確かな証拠もあった。ペプチド性の、主要なＰＲＬ−阻
止因子（ＰＩＦ）が存在していることが見出されていた
が、視床下部抽出物中にその様な物質が特性化された例
はなかった。視床下部のＰＩＦを単離しようとする試み
により、ドパミン−不含ＲＩＦ活性を含有してい６領域
が、ＬＨ艮Ｈ−生産細胞および分泌細胞に富む、視床下
部正中基底並びに臓器および１紙管終板領域に位置して
いることが分った〔ｌ＼。

エンジャルバート（Ａ、Ｅｎｊａｌｂｅｒｔ　）ら、′
ニューロエンドクリノロシイ（Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌｏｇｙ　）　’　　２４：１４７−１６１（１
９７７）］。ブタおよびヒツジの視床下部組織を用いた
予備的な精製研究において、この活性物質のサイズは２
０００〜８０００ダルトンと見積られた（Ａ、エンジャ
ルバートら（前掲）；Ａ、Ｐ、Ｓ、ダーリ？　／Ｉ／　
（Ａ、Ｐ、Ｓ、Ｄａｒｉｍａ＋　）ら１エンドクリ／ロ
ジイ’　８２：１２３６−１２４１（１９６８）ｉおよ
びＴ、グライブロック（Ｔ、　Ｇｒｅｉｂｒｏｋｋ　）
ら、′バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーション”　５９ニア０４−７０９
　（１９７４））。これらの出版物が刊行されてからか
なりの年月を経たにも拘らず、ＰＩＦ活性に関与するタ
ンパク質は特性化されておらず、純粋なものは未だ得ら
れていない。

発明の目的 本発明は、前記の如きＬＨＲＨ前駆体、およびＬＨＲＨ
との融合物として一緒に発現されるポリペプチドをコー
ドしているＤＮＡを得ることを目的とするものである。

また本発明は、ＰＩＦ活性を示し得るポリペプチドの精
製法を提供することを目的とするものである。

さらにまた本発明は、その様な前駆体およびポリペプチ
ドを組換え細胞培養内で大量に合成し、それらを純化さ
れた形で得ることを目的とするものである。

また、本発明は、その様な前駆体およびポリペプチドを
分析学的な方法、生殖系に対する治療的な調節、および
プロラクチン依存性腫瘍の治療に用いることを目的とす
るものである。

本明細書の全記載から、本発明が上記のまたはその他の
目的を宵することは、当該技術者にとって明らかであろ
う。

要約 ヒトゲノムの研究において、Ｌ　）Ｉ　ＲＨ前駆体をコ
ードしているＤＮＡを同定した（第１図）。この前駆体
、プレプロＬ）ＩＲ）ムは、Ｆ流に向って、真核性ング
ナルペプチド、ＬＨＲＨおよびＣ−末端ポリペプチド（
ＣＴＰ　）を含有している。このＬＨＲＨとＣＴｆ’を
プロセシングした融合物をプロＬＨＲＨと称する。プロ
ＬＨＲＨは、インビボにおいて、その１または２個のプ
ロテアーゼ（タンパク分解酵素）開裂部位をタンパク分
解的にプロセシングされることにより、最終的にＬＨＲ
ＨおよびＣＴＰを与えると考えられている。ＣＴＰは第
１図において残基１３から６６までの５３アミノ酸ポリ
ペプチドを含む部分であると定義される。ＣＴＰに更に
３個のカルボキン末端残基、Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅが
付加したものをＧ　Ａ　Ｐ　［ＧｎＲＨ−関連（会合）
ペプチド］と称する。

本明細書中で開示した方法によれば、ＣＴＰアミノ酸配
列配列むポリペプチドを、細胞を含ませずに調製するこ
とができる（本明細書中では、ＣＴＰとは、ＣＴＰ並び
に、その突然変異体、およびフラグメントを包含するも
のと定義する）。

これらの細胞を含まない（細胞不含）ポリペプチドには
、ＣＴＰと、Ｌ　ＨＲＨの如き真核性タンパク質との融
合物（プロＬＨＲＨ）および／または、インビボにおい
てプロＬＨＲＨに伴なって正常に発現されるシグナルポ
リペプチド以外のポリペプチド類（例えは、細菌性シグ
ナルまたは細菌性分泌タンパク質）との融合物が含まれ
る。このポリペプチドを、生理学的に許容し得る担体を
含む製剤または放出時期調節製剤の形にして、生殖系の
調整またはＰＲＬ依存性腫瘍の治療のために、生理学的
に許容し得る担体と一緒に補乳類に投与したり、または
検出可能なマーカーで標識し、イムノアッセイに用いた
り、あるいは、診断のために、ＣＴＰまたはその融合物
（例、プロＬ）ＩＲＨ）の精製のために、もしくは酪農
用動物でのＰＲＬ分泌を抑制するために、抗−ＣＴＰ抗
血清を惹起させる目的で用いることができる。

この様なポリペプチドをコードしているＤＮＡは、それ
が、天然状態で伴なっているものを含まないで得られた
ならば（プレプロＬＨＲＨの場合）、新規である。即ち
、本発明のプレプロＬＨＲＨは、ｃ−ｒｐをコードして
いるゲームＤ　Ｎ　Ａ中に存在していることが分ってい
る２個のイントロンの内、少くとも１個は含んでおらす
、ＣｒＰのためのｃＤＮＡはこれらイントロンの両者を
含んでいない。また一方で、このＤＮＡは、正常な状態
てプレプロＬＨＲＨ遺伝子に付随して見出される、５′
または３′の境をなす染色体性ゲノムＩ）　Ｎ　Ａ配列
を含んでいない。このＤＮＡは、ＬＨＲＨ暗号化ＤＮＡ
配列の同定のためのプローブの調製に、あるいは、本明
細書中で述べる様々なポリペプチドの組換え細胞培養合
成を行う目的で、宿主を形算転換するのに用いるプロー
ブを調製するのに有用である。

これらのポリペプチド（ＣＴＰをも含めて）は、通常の
有機化学的技術により、または、好ましくは組換えＤＮ
Ａ技術により合成される。後者の方法は、該ポリペプチ
ドをコードしていることが分っているベクターで宿主細
胞を形質転換し、該細胞を培養し、更に、通常、該細胞
からポリペプチドを回収することからなる。

図面の説明 第１図は、ヒト胎盤組織から単離したプレプロＬＨＲＨ
およびそのｃＤＮＡのアミノ酸およびヌクレオチド配列
を示す図である。アミノ酸番号は配列式中に記したが、
ヌクレオチド番号は右側に記した。このヌクレオチド配
列は、後述する実施例２に従って得た約１５００ｂｐ　
ｃＤＮＡクローン（λＬＨＲＨ−１）のそれである。短
かい方のｃＤＮＡのためのｃＤＮＡは、ヌクレオチド番
号６８３（水平方向の矢印）から始まる。これら２個の
ＣＤＮＡにおけるヌクレオチドの相違も示した（７０２
および９９７のヌクレオチド）。オーバーラインを付し
たＡＴＣは、もう一つの翻訳開始コドンである。前駆体
配列のためのＬγｓ−Ａｒｇ　　プロセシング部位をボ
ックスで囲むと共に、カルボキシ末端のアミド化に係る
グリシン残基に下線を施した。前駆体タンパク質のカル
ボキン末端において６１能な、第２のプロセシング部位
を、ハイフンで囲んで示した。矢印は、対応するゲノム
ＤＮＡ配列において、イントロンによる中断のある位置
を指示している。Ａ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａポリアデニル
化ングナルを下線で示した。

第２図は、ＬＨＲＨ暗号配列の単離に用いた、化学合成
されたオリゴヌクレオチドを示す図である。ＬＨＲＨの
アミノ酸配列（１−１０）と−緒に、このプローブの合
成の際に、これがＬＨＲＨ前駆体の一部であると推測さ
れた配列（“延長されたペプチド１）も示されている。

この配列を基に、ヒトゲノムライブラリィをスクリーニ
ングするためのプローブとして用いる目的で、８個の、
オリゴヌクレオチド〔１長いプロー　７　（ｌｏｎｇ　
ｐｒｏｂｅｓ　）　’５′から３′〕を含むプールを組
立てた。進化論に基つき、ＬｅｕのコドンとしてはＴＴ
Ｇのみを選択した。ＬＨＲＨのアミノ酸の１から６まで
をコードしている配列と相補的な、１６個のヘプタデカ
マー（’短いプローブ＠３′から５′へ）を含むプール
を、長いプローブとハイ７リダイズした多数のゲノムク
ローンから、目的物を選択するのに用いた。

黒丸（・）はコドンの第３査目か、可能な２個のコドン
の内のいずれか１つであり、白丸（○）は、同じく可能
な４個のヌクレオチドの内の１つであることを示してい
る。

８１４３図は、第２因に示した合成ロング（長い）プロ
ーブの分析結果を示している。図中、二本鎖ＤＮＡは、
延長ＬＨＲＨペプチド（第２図）をコードしている合成
３８マープール（＋）および、相補的なノナマー（９量
体）プライマー（両者を大活字で示した）、並びに酵素
的なりＮＡ合成法によって得られた上記相補鎖の残余部
分（−）（通常の活字）からなっている。このＤＮＡを
分子クローンし、１４個のクローンの配列決定を行った
。それらの配列中、ヌクレオチドが変化している部分だ
けを、この二本鎖ＤＮＡの上下に示した。

ハイフンは、ヌクレオチドのないことを表わす。

クローンしたＤＮＡの内の１つに見出された、Ｔｙｒコ
ドンにおけるＧＭＰ挿入部位をも示した。

第４図は、ＬＨＲＨ暗号配列を担っている、クローンさ
れたヒトゲノムＤＮＡセグメントの同定方法を示す因で
ある。２個のオリゴマーのプール〔ロング（長い）プロ
ーブ（３８）およびショート（短い）プローブ（１７）
、第２図参照〕を用いてヒトゲノムライブラリィを連続
的にスクリーニングすることにより、そのＤＮＡがこれ
らオリゴマープローブの両者とハイブリダイズする１個
の単離体を得た。４個の制限エンドヌクレアーゼ（Ｅｃ
ｏＲｆｉ　、ＸｂａＩ、　Ｂｇｌ　■、Ｐｓｔ　Ｉ）を
用いてＤＮＡを消化し、サザーン分析を行った結果を複
写して示した（パネルＡ）。キロ塩基対（ｋｈ）に基づ
くＤＮＡの大きさを）１ｉｎｄｌ［−開裂λＤＮＡ〔ベ
ゼスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　）　　リサーチ・ラボラト
リイズ〕を用いて推定し、左側に示した。パネルＢは、
両オリゴマープールとハイブリダイズした領域を配列決
定ケル（シーケンシングゲル：　Ｇ、　Ａ、　Ｔ、　Ｃ
）が分析した結果を示す解析像である。この領域のヌク
レオチド配列によってコードされているアミ／酸配列が
示されている。

第５図は１５００１）ｐのｃＤＮＡ単離体（第１図　　
　　　　　［）の制限酵素地図、構造上の特徴、並ひに
アミ／酸配列を示す図である。ＧＡＰはＣＴＰ−Ｌｙｓ
　−Ｌｙｓ−Ｉｌｃを表わす。

第６図はＧＡＰのための発現ベクターの組立て゛　工程
を示す図である。

第７図ＡおよびＢはＧＡＰのＰＲＬ阻害作用を示す図で
ある。

詳しい説明 本明細薔中では、便宜上、ＣＴＰを第１図に示した天然
のＣＴＰ配列に関する推定の５３アミ／酸のみならず、
ＣＴＰフラグメントまたぼ、ＣＴＰまたはその様なＣＴ
Ｐフラグメントの突然変異体であるポリペプチドを包含
するものと定義する。

この定義範囲に含まれるポリペプチドは、ＣＴＰと免疫
学的に交差反応し得るか、または、ＣＴＰと実質上同様
な生物学的活性を示す。１実質上同様な生物学的活性１
を有するとは、その候補タンパク質がＣＴＰの生物学的
機能の内の幾らか（全てであることを要しない、例えば
、ＣＴＰの細胞表面受容体との結合能力）を保持してい
ることを意味する。

ＣＴＰ突然変異体には、ＣＴＰまたはそのフラグメント
における欠失、挿入または置換が含まれる。例えば、分
子の酸化に対する安定性を改善するために、４０位のｃ
ｙｓをセリンで置き換えることができる。Ｉｙｓ−ｌｙ
ｓ　　およびＩｙｓ−ａｒｇ　　タンパク分解部位であ
ると推定されている部位、１２−１３および／または６
７−６８をその暗号ＤＮＡに突然変異をもたらして除去
し、代りにヒスチジンを発現させることもできる。さら
に、患者の体内での生物学的活性を高めたり、あるいは
、発現における微生物宿主内での細胞内安定性を増すた
めに、その他の残基を突然変異させることもできる。

ＣＴＰの欠失突然変異体は、フラグメントのアミノ酸配
列実体は、ＣＴＰの対応する鎖酸と全くホモローガスで
あるＣＴＰフラグメントとは区別さｒＬる。欠失突然変
異体は、中間のギャップに挿入がなされた場合にのみ、
ホモローガスとなり得る。

ＣＴＰフラグメントは、基本的には、Ｃ末端あるいはＮ
末端を欠失したものである。配列：　ｃｙｓ　−ｔｈｒ
−ｔｈｒ−ｈｉｓ−ｇｉｎ−ｐｒｏ−ａｒｇ−ｓｅｒ−
ｐｒｏ−１ｅｕ−ａｒｇ−ａｓｐ−１ｅｕ−ｌｙｓ　（
残基４Ｏ−５３）で示されるＣ’ｒＰの核（コア）フラ
グメントは、組換え法によらず、慣槻合成された：しか
し、これは、ＣＴＰｃＤＮＡの欠失突然変異に係る組換
え培養、または、先端を切断された遺伝子の合成等の、
組換え培養によっても得ることができる。ＣＴＰは、Ｃ
ＴＰの核フラグメントに対して惹起されたウサギ抗血清
に対して交差反応性を有するので、以後に述べる如く、
この核フラグメントはＣＴＰのイムノアッセイに有用で
ある。それはまた、ＣＴＰと比較すれは彪少されてはい
るか、本来の生物学的活性を有する。

ＣＴ　Ｐ融合物とは、融合物と切り離されたならは、前
記のＣＴＰに関する定義の範ちゅうに入る様なアミノ酸
配列を含んでいるアミノ酸配列のポリペプチドを指す。

ＣＴＰ融合物の例は、天然のプロＬ）ｉＲＨに最も顕著
に示されており、これは、Ｌ）ＩＲＨデカペプチドのＣ
末端に、ｇｌｙ−Ｌｙｓ　−ａｒｇからなる橋（ブリッ
ジ）を介して、Ｃ末端に３個の付加的なアミノ酸を有し
ているＣＴＰが結合した形の融合物である。従って、こ
の融合物においては、本明細豊で定義され６　ｃ　’ｒ
　ｐは、そのＮ末端が真核性ホルモンと、そのＣ末端が
トリペプチドと、それぞれ融合している。ｃ’ｒｐ融合
物の他の例は、天然の真核性シグナル配列とプロＬ　Ｈ
ＲＨとの融合物である、プレプロＬ）ＩＲＨである。こ
の融合物はプロＬＨＲＨの分泌番こ有用である。同様に
、大腸菌のＳＴ［エンテロトキンンリーダーまたはアル
カリ性ホスファターゼリーダーをＣＴＰまたはプロＬＨ
ＲＨのＮ末端における融合物として発現させ、成熟ホル
モンを分泌させることもてきる。

Ｃ，ＴＰを５３アミノ酸からなるポリペプチドであると
仮定的に定義したことから、そのＣ末端のｌｙｓ−１γ
５−ｉｌｅ部分（第１図参照）を融合物部分と考えるべ
きであるか、これもＣＴＰの定義に含まれるものとする
。

以下に述べるＣＴＰはヒトＣＴＰである。しか■ しながら、ブタやウシ等の他の供給源からのＣＴＰもこ
こで定義したＣＴＰに含まれる。

本発明に係るポリペプチドは、所望のアミノ酸配列の合
成によって製造され得るが、現在、この方法はより長い
フラグメント、即ち、約１５残基以上の７ラグメント、
あるいはＣＴＰまたはその融合物に関しては、経済上非
実用的である。ＣＴＰは、細胞培養、通常、組換え細胞
培養により、合成するのが好ましい。

組換え細胞培養のためには、本明細書中に後述する如く
、所望のポリペプチドまたはその一部をコードしている
ＤＮＡをゲノムライブラリィまたはｃ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　
ライブラリィから単離するか、あるいは、既知の方法に
より、インビトロで合成する。

インビトロにお＋ｊる合成法は、短いＤＮＡセグメント
（即ち、約２００　ｂｐ以内のもの）の場合には好まし
い方法である。望ましいＣＴＰを持っているあらゆる棟
の組織から、ＣＴＰまたはインビボで見出されるＣＴＰ
の通常の融合物をコードしているゲノムＤＮＡを単離す
ることができるか、本明細蕾中でＤＮＡ配列が開示され
たことから、Ｌ）ｉＲｌ（を分泌することが分っている
組ａ（例、胎盤または視床下部）の細胞からｍ　ＲＮ　
Ａを得、既知の手法を用いて逆転写させてｃ　Ｄ　Ｎ　
Ａを調製し、次いで、第１図に示した配列に関する情報
に照らして調製したプローブを用いてその様なりＮＡを
含有している形質転換体を同定する方法が好ましい。仄
いで、合成またはｃＤＮＡに所望のポリペプチドをコー
ドするのに必要な修師を施し、これをクローニングベク
ターに、またはこれにクローニングベクターをライゲー
トする。後に、発現ベクターとして用いるのに不適当な
りローニンクベクターは、発現ベクターに挿入されるＤ
ＮＡの供与体として利用される。

ベクターとは、複製可能なりＮＡ、ｆｆｉ立て物である
。本発明では、ベクターを、ＣＴＰをコードしているＤ
ＮＡの増幅（クローニングベクター）および／またはポ
リペプチドをコードしているＤＮ／〜の発現（発現ベク
ター）のために用いる。冗曳ヘクターとは、その内部で
、ＣＴＰホリベプチドをコードしてい６　Ｄ　Ｎ−Ａ配
列か、適当な箔主内でこのポリペプチドを発現させ得る
適当なコントロール配列と機能的に結合している、複製
可能なりＮＡ組立て物である。その様なコントロール配
列には転写プロモーター、転写をコントロールするため
の任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡ　ＩＪボソ
ーム結合部位をコードしている配列、および転写および
翻訳の終止をコントロールするための配列が含まれる。

ＤＮＡまたはタンパク質機能物質に関して本明細書中で
用いる“機能的（操作可能）に結合した１という語句は
、機能物質（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ　）の内
の一方か他方に影響を及はしていることを意味する。例
えは、プレ配列のためのＤＮＡ（分泌リーダーまたはン
グナルのためのＤＮＡとしても知られてい４ＤＮＡ　）
は、それがポリペプチドの分泌を可能にするプレタンパ
ク質として発現されるならば、該ポリペプチドに関する
ＤＮＡと機能的に結合しているという。プロモーターは
、それが結合している暗号配列の転写をコントロールす
るならば、該配列と機能的に結合している逼りポゾーム
結合部位は、それが結合している暗号配列を翻訳され得
る位置に置くならは、該配列と機能的に結合している。

一般に、機能的に結合している、ということは接触して
いることを意味し、特に分泌リーダー配列の場合には、
接触し、かつ解読相同（こあることを意味する。

ベクターには、例えはプラスミド、ウィルス（ファージ
を含む）、および組換えによって宿主のケノム内に組込
まれ得るＤＮＡフラグメントが含まれる。過当な宿主に
導入（トランス７オーム）されると、プラスミドベクタ
ーは宿主ゲノムとは独立に復製、機能し、または、ある
種のウィルスやフラグメントの場合にはゲノムそのもの
の中に組込まれる。プラスミドは、今日最も晋ｌ！ＩＣ
１こ用いられるベクターであるので本明細書中では、１
ベクター“を１プラスミド１を総称する用語として用い
ることとする。しかしながら、同等の機能を有し、当該
技術分野で知らｎでおり、またはいずれ知られるであろ
う、その他の形のベクターも全　　　　　　　１で、本
発明方法に用いるのに好適である。

好適なベクターは、形質導入または形質転換しようとし
ている宿主と適合し得る棟から堺かれたレプリコンおよ
びコントロール配列を含んでいる。

一般に、ベクターは特定の箔主に用いるために、復製起
源、プロモーター、並びに表現型の選択性遺伝子（例え
は抗生物質耐性を付与するタンパク質の暗号遺伝子、ま
たは栄養要求変異種の要求を与える様なタンパク質の暗
号遺伝子）であって、全て、該宿主内で認識され、機能
し得るものを含む様に選択される。大腸菌は、通常、Ｅ
、　ｃｏｌ　ｉ種から得られるプラスミドｐＢＲ３２２
を用いて形質転換される〔ポリバー（Ｂｏｌ　１ｖａｒ
　）ら、１９７７、′ジー７　（Ｇｅｎｅ）”２：　９
５１］。ｐＢＲ３２２はアンピッリンおよびテトラサイ
クリン耐性のための遺伝子を含有しており、これらは形
質転換細胞を谷筋に同定し得る手段となる。良く知られ
ている市販のＮｉ１３またはλフアージベクターはクロ
ーニンクベクターとして便利に用いられる。

ベクターは、Ｃ’ｒＰＤＮＡと機能的に結合している、
宿主微生物によって認識され得るプロモーターを含有し
ている。原核生物日での組換えＤＮＡの組立てに最も普
通（こ用いられるプロモーターには、β−ラクタマーゼ
（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系〔
チャン（Ｃｈａｎｇ　）ら、１９７８’ネイチヤー１．
２７５：６１５ｉイタクラら、１９８：１０５６（１９
７７）およびゲラデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ　）　　ら、１
９７９　”ネイチャー”２８１５４４）、トリプトファ
ン（ｔｒｐ）プロモーター系〔ゲラチル（Ｇｏｅｄｄｅ
ｌ　）ら、１９８０　’ヌクレイツク・アシソズ・リサ
ーチ’８：４０５７およびＥ　ｌ）　０出醐公開畜号第
３６，７７６］が含まれる。これらが最も普通に用いら
れているか、その他の既知の微生物プロモーターも使用
し得る。それらの詳しいヌクレオチド配列は公開されて
おり、それによって当業者は、それらをプラスミドベク
ター内のＣＴＰをコー　ドしているＤＮＡと、機能的に
ライゲート（結合）させることかできる〔ンーベンリス
ト（Ｓ　１ｅｂｅｎｌ　ｉｓｔ　）ら、１９８０、′セ
ル’２０：２６９）。

本発明にとって好ましいベクターは、ＬｒｐｌＪ−グー
のシャインダルガノ配列およびｔｒｐＬＥ暗号配列の一
部を伴っているｔｒｐプロモーターを含有するｐＢに３
２２誘導体である。

適当な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞およびより高等
な真核細胞である。原核生物にはダラム陰性またはグラ
ム。陽性の微生物、例えば、大腸菌やバチルス（桿菌、
Ｂａｃｉｌｌｉ　）が含まれる。より高等な真核細胞に
は、以下に述べる如く哨乳類動物起源から得られたセル
ラインか含まれる。好適な宿主細胞は大腸菌ＡＴＣＣ３
１４４６であるか、他のｐｓｅｎｄｏｍｏｎａｓ　）　
　種、あるいはセラシア・マーセサ７　ス（５ｅｒｒａ
ｔｉａ　Ｍａｒｃｅｓａｎｓ　、霊菌）等も適する。

形質転換された宿主細胞とは、発現を望まれているＤＮ
Ａを担ったベクターにより形質導入され、しかる後、こ
のＤＮＡからタンパク賞を発現させる細胞を指す。この
様にして発現されたＣＴＰまたはＣＴＰ融合物は、宿主
細胞およびこのＣＴ’Ｐ暗号化ＤＮＡと一緒に用いたシ
グナル番こ応して、宿主細胞の細胞質内に止まるか、あ
るいは、宿主のペリプラズム間隙、または培養欣上清に
分泌される。

酵母培養の叩き真核性微生物も、本発明のポリペプチド
を発現させるために、ＣＴ　Ｐ−暗号ベクターにより、
形質転換さくしる。真核性徴生吻信主の内、サツ力ロミ
ケス・セレビシェ（Ｓ　ａｃｃｈａｒ□ｍγｃｅｓｃｅ
ｒｅｖｉｃｉａｅ　）または通常のパン酵母か最も一般
的に用いられるが、その他多数の菌株も普通に用い得る
。酵母内でＣＴＰを発現させるのに好適なプラスミドは
ＹＲｐ７である〔ステインチコム（ＳＬｉｎ−ｃｈｃｎ
ｍｂ　）ら、１９７９．１ネイチヤー”２８２：３９；
キングスフ　７　（Ｋｉｎｇｓｍａｎ　）ら、１９７９
、′シーン１．７：１４１ｉチエンバー（、Ｔｓｃｈｅ
ｍｐｅｒ　）ら、１９８０　’シーン”　１０：１５７
１゜このプラスミドは既にｔｒｐ１遺伝子を含有してい
るので、トリプトファン中で増殖する能力を持たない、
酵母の突然変異株（例えはＡＴＣＣ魚４４０７６または
Ｐ　Ｅ　Ｉ’４−１）に選択マーカーを与える〔ジョー
ンズ（Ｊｏｎｅｓ）、１９７７、′ジエネテツクス”　
８５：１２’ｌ。　　　　　１この酵母宿主細胞ゲノム
の特徴としてｔｒｐ　ｌ障害があるので、形質転換体を
トリプトファンの非存在下で増殖させることによって、
形質転換体を検出するのに有効な環境を提供すること３
こなる。

酵母用ベクターの好適なプロモーティング配列には、以
下のものに対するプロモーターが含まれる：　ｊ　９　
ロチオナイ７　（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ　）
　、３−ホスホグリセレート・キナーゼ〔ヒララマン（
）１ｉｔｚｅｍａｎ　）ら、１９８０　’ジャーナル・
オン・バイオロジカル・ケミストリイ’　２５５：２０
７３　）またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−
ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピ
ルベート・デカルボキンラーゼ、ホスホフルクトキナー
ゼ、グルコース−６−ホスフェート・インメラーゼ、３
−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルベート・キナー
ゼ、トリオセホスフエート・インメラーゼ、ホスホグル
コース・インメラーゼ、クルコキナーゼ等の他の解糖酵
素類〔ヘス（Ｈｅｓｓ）ら、１９６８、’ジャーナル・
オン・アドバンスイズ・イン・エンザイム・し／）’　
（Ｊ、　Ａｄｖ、ＥｎｚｙｍｅＲｅｇ、）”　７：１４
９　；およびホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら、１９７８
．１バイオケミストリイ’　１７：４９００）。

更に、酵母内で発現させる上で好適なベクターおよびプ
ロモーターは艮、ヒツツ７７（Ｒ，Ｈｉｔｚｅｍａｎ　
）により、ＥＰＯ公開番号第７３．６５７　　号の中に
記述されている。

その他、培養の増殖条件によって転写か活性化さイーむ
、または発現されるという利点をさら１こ有するプロモ
ーターとして、アルコール・デヒドロゲナーゼ２、イソ
チｉクロームＣ１酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連す
る戯成酵素、前記メタロチオナイン、グリセルアルデヒ
ド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、並びにマル
トースおよびガラクトースの利用に与る酵素類等に関す
るプロモーター頭載が含まｎる。酵母番こ適合し得るプ
ロモーター、複製起源および終止配列を含有している、
あらゆるプラスミドベクターか好適である。

好適な酵母発現プラスミドを組立てるには、プロモート
された遺伝子に伴なった終止配列を、発現ベクター内の
、ポリペプチド暗号配列の３′側にライゲートし、転写
の終止、次いでｍ　ＲＮ　Ａのポリアデニル化部位を与
える様にする。

多細胞生物から得た細胞の培ａ物を俗主（ご用いること
もできる。しかしながら、ＣＴＰは比較的低分子量のタ
ンパク質であり、広範囲に及ぶプロセノングを必要とし
ないので、上記のことは、ＣＴ　Ｐの発現に関する限り
、不要である。しかし、その様な細胞の方が細菌細胞よ
りも可溶性ＣＴＰとよく適合すると思われる点で、組繊
細胞培養にも利点がある。原則として、を椎動物である
か無を椎動物であるかに拘らず、その様な、すべての細
胞培養を使用し得る。しかしなから、これまでを椎動物
細胞に大きい関心が寄せられており、最近では、培養（
組織培養）でを椎動物細胞を増殖させることは日常的な
操作となっている〔ティッンユ中カルチャー　（Ｔｉｓ
ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　）アカデミツク・プレス、プ
レスおよびバターソン（Ｋｒｕｓ　ａｎｄＰａｔｔｅｒ
ｓｏｎ　）　　編、（１９７３））。有用な宿主細胞系
統（セルライン）の例には、ＶＥＲＯおよび１−１ｅＬ
ａ　　細胞、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃ１−１０
）細胞系、並ひにｗＴ３８、Ｂ？［Ｋ、ＣＯ５−７およ
びＭ　Ｄ　ＣＫ　他ｆＪｌ系等が含まれる。その様な細
胞のための発現ベクターには、通常（必要ならば）複製
起源および発現さｎるべき遺伝子の上流に位置している
プロモーターが、リボゾーム結付部位、ＲＮＡスプライ
ス部位（インゲノン含耳ゲ／ムυＮＡを用いる場合）、
ポリアデニル化部位および転写終止配列と共に含有され
ている。

を椎動物細胞を形質転換するのに使用される発現ベクタ
ーの転写および紬訳コントロール配列は、しはしはウィ
ルス性起源によって供給される。例えは、普通用いられ
ているプロモーターはポリオーマ、アゾ／ウィルス２、
および最も頻繁にはンミアンウイルス４０（ＳＶ４０）
から導かれる。アＩＪイ（早期）およびレイト（後期）
プロモーターは、いずれも該ウィルスから、ＳＶ　４Ｑ
　のウィルス性複製起源を含有するフラグメントとして
容易に得られるので特に有用である（ファイヤーズ（Ｆ
ｉｅｒｓ）ら、１９７８’ネイチヤー’　２７３　：１
１３）。

ＳＶ　４Ｑのより小さい、またはより大きい７ラグメン
トも、それらがウィルス性複製起源内に位置するＨｉｎ
ｄ　ｌ１１部位からＢｇｌ　Ｉ部位に至る約２５０ｂｐ
の配列を含有している限り用いることができる。更に、
正常な状態でプレプロＬ　Ｉ−Ｉ　ＲＨと関連している
ヒト−ゲノムプロモーター、マタはコントロール配列も
、その様なコントロール配列が宿主細胞系に適合し得る
ことを条件として用いることができ、またしばしは好ま
しいことである。

複製起源は、例えば５Ｖ４Ｑその他のウィルス性起源（
例えばポリオーマ、アゾ／ウィルス、ＶＳＶ、ＢＰＶ等
）から得られるものの様に、外来性の起源を含む様にベ
クターを組立てるか、あるいは宿主細胞の染色体性複製
機構によって与えられる。もしもベクターが宿主細胞染
色体に組込まれるのなら、その様な染色体でも充分であ
ることか多い。

ＣＴＰとデヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の両者をコ
ードしているＤＮＡ配列を含むベクターでトランスフェ
クトするのに好適な哺乳類宿主細杷を選択する（こ際し
ては、用いるＤＩ−ＩＦＲタンパク貝のタイプに従って
宿主を選択するのが適当である。野生型ＤＨＦＲタンパ
ク質を用いる場合には、Ｄ　ＨＦＲ欠損宿主細１把を選
択するのか好ましく、そうすることにより、ヒポキサン
チン、グリシノおよびチミジンを欠く選択培地内で、成
功したトランスフェクションを選択するためのマーカー
としてＤ　［４Ｆ　Ｋ暗号配列を用いることかできる。

この場合、好ましい宿主細胞はＤＨＦＬ活性を欠くチャ
イニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞系統であり、
これは、ウーラウブおよびチャッンン（Ｕｒｌａｕｂ　
ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ　）　（１９８０、’プロシーデ
ィンゲス・オフ・ザ・ナンヨナル・アカデミイ・オフ・
サイエンスイズ’　（ＵＳＡ）７７：４２１６）の述べ
た如くにして調製し、増殖させることができる。

他方、メトトレキセート（ＭＴＸ）に対する結合親和性
の低いＤ？ＩＦＲタンパク質をコントロール配列に用い
る場合には、Ｄ　ｆ（１”　ｌ（耐性細胞を用いる必要
はない。何故ならは突然変異ＤＩ−ｉＦＲは間ＴＸ耐性
であるので、宿主細胞自身がＭＴＸ感受性であるならは
、ＭＴＸ含有培地を選択の手段として用いることができ
るからである。ＭｒＸを吸看することのできる真核細胞
の大多数は、メトトレキセート感受性であると思われる
。その様な、有用な細胞系統の１つはＣＨＯセルライン
、Ｃｌ−１０−Ｋ　ｌ　（ＡＴＣＣ雁ｃｃｔ　６１　）
である。

実施例で示した本発明の好ましい実施態様では、ＣＴＰ
と細菌性タンパク質（ｔｒｐＬＥ）との融合物をコード
しているベクターを用いて大腸菌に形質尋人し、該生物
を培養する。この融合物は細胞質内で不溶性であるため
、細胞内で屈折体として沈積する。屈折体はヘテロロー
ガスな（異種の）タンパク質の不溶性集合体であり、通
常、位相差顕微鏡によれば、１０００倍という低倍率で
観察され得る。屈折体、並びにその回収方法に関しては
、ＥＰＯ出願公開五１１４，５０６（１９８４年７月１
日公開）に記載されている。このＥＰＯ出願には、屈折
体の形で見出された、ＣＴＰと共に使用し得る所望のポ
リペプチドの可溶化法に関する記載もある。

ＣＴＰ暗号配列中に、内因性のメチオニン残基がないこ
とから、臭化シアンを用いて成熟ＣＴＰを融合物中の細
菌性部分から容易に切り離すことができる。しかしなが
ら、融合物から成熟タンパク質を回収するための、その
他の既知の方法（例えは、酵素消化）も上記目的に用い
句ことかできる。

上で一般的に述べた様に、酵母内で屈折体を形成させず
に、ＣＴＦまたはＣｒＰ融合物を片１戊す心ことかでき
る。同様に、ＣＴ　ｌ）のＮ末端に」寒択された細菌性
シグナル配列か直接結合した（１゛１”融合物は、これ
もまた屈折体を形成することなく、成熟ＣＴ　ｌ）とし
て分泌される。

宿主細胞の細胞質、ペリプラズム間隙または培養上滑か
ら、自体既知の方法により、ＣｒＰまたはＣｒＰ融合物
を回収する。用いらイ’Ｌ６回収方法は、ＣＴＰまたは
その融合物の性質並ひに所在により左右される。ペリプ
ラズム性タンパク質は晋波衝撃法で、また細胞質性タン
パク質は俗囚法で回収される。次いで、遠心して不溶性
の細胞性物質からタンパク質を分離し、続いて、例えは
、イ■ オン交換クロマトグラフィー、ゲルｐ過、重速液体クロ
マトグラフィー、イムノアフイニテイ力うム精製法（固
定化洗ＣＴＰへの吸収、および酸脱着法を利用）並びに
塩溶または塩析沈殿法等の自体既知の常法に従い、所望
の程度まで精製する。

次いで、回収した、純化タンパク質を、治療を目的とす
る投与のために投与剤形に調製するか、あるいはイムノ
アッセイに用いるために検出可能なマーカーで標識する
。加えて、精製された、またはされていないＣＴＰある
いはそのフラグメントを、ＣＴＰに対する抗体（抗ＣＴ
Ｐ）を惹起させるために、免疫源として用いることもで
きる。

抗ＣＴＰを、例えば、不溶性のマトリックスと共有結合
させるか、またはポリオレフィン表面に吸着させること
により固定化し、ＣＴＰまたはその融合物のイム／アフ
イニテイ精製に用いる。あるいは、これらをホースラデ
イッンユ（西洋ワサビ）・ペルオキシダーゼの様な酵素
、または放射性沃素等で標識し、ＣＴＰまたはＣＴＰ融
合物のサンドイッチ型イムノアッセイに用いる。また、
ＧｎＲＨエピトープ（抗原決定基）を含まないＣＴＰは
、あらかじめ定めておいたＣＴＰ領域に対する抗体を惹
起させるための抗原を調製するのに有用である。このこ
とは、本発明てＣＴ　ｌ）のアミノ設配列が開示された
結果、０．１能となったのであるＤ）、それは、ＣＴＰ
フラグメントを免疫原物質と帖片させることにより行わ
れる。すなわち、抗体と第１の１ピトープとの結合が、
第２のエピトープのための標識抗体と該エピトープとの
結合を立体的に阻害することのない様、充分に１ＩｉＩ
　２−した位置のエピトープに対して抗体を惹起せしめ
ること２：ｌ）できるので、体数中のＣＴ　Ｐに対する
サンドイッチ型イム／アッセイの感度を高くすることか
できる。

ＣＴＰまたはその融合物は、所望の純度に精製された該
タンパク質と、生理学的に許容し得る担体（即ち、用い
られる用量および濃度において、受容体にとって非毒性
であろ担体）とを混合すること番こより、治療上の投与
のために製剤化することができる。通常、このことは、
ｃ　−ｒ　ｔ’またはその融合物と、バッファー、抗酸
化剤、低分子用（ＦＪ１０残基以内）ポリペプチド、無
毒なタンパク質、アミノ殴、ブドウ糖またはデキストリ
ン等の炭水化物、並ひにその他の安定剤および賦形剤と
を−緒に混合することにより行われる。通常、この操作
を水溶液中で行った後、得られた混合物を細菌を除去す
るのに充分な細かさの小孔を有するフィルターに通す。

滅菌されたｐ液をビンに入れ、長期間保存用には凍結乾
燥しておくのが望ましい。

ＣＴＰ組成物は、生殖機能に障害を有する動物に投与さ
れ、また、生殖サイクル（例えば月経）の調整を行うた
めに、動物に投与される。投与方法は既知の方法（例え
ば静脈内、経鼻腔内、腹腔内、あるいは筋肉内に滅菌溶
液を注入または注射する方法）に従うか、あるいは、以
下に述べる放出時期を調整した放出システムによること
もてきる。

ＣＴＰ組成物の投与は、埋め込み可能な放出時間調節製
品の形によるのが好ましい。ＣＴＰ程度の分子量を有す
るタンパク質に対する適当な系の例には、Ｌグルタミン
酸とｒ−エチル−Ｌ−グルタマートとのコポリ？−（Ｕ
、シト７７　（Ｌｌ、Ｓｉｄｍａｎ）ら、１９８３、′
バイオポリマーズ（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）”２２（
１）：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエナル
ーメタクリレート）（艮、ランガー（Ｒ，Ｌａｎｇｃｒ
）ら、１９８１’ジヤーナル・オフ・バイオメディカル
−７テリアルズ・リサーチ（Ｊ　、Ｂ　ｉｏｍｅｄ６Ｍ
ａｔｅｒ。

１’−ｅ３．）”　１５：１６７−２７７、および艮、
ランカー、１９８２　’ケミカル・チクノロシイ（Ｃｈ
ｅｍ　、　’ｒｅｃｈ。

シ１２：９８−１０５）またはエチレングリコール（ｋ
、ランガーら、同）が含まれる。これらの製品は皮下に
埋め込むことができる。別法として、皮屑に対する接着
テープにＣＴＰを埋め込み、緩慢に経皮投与することも
できる。

ＣＴＰまたはＣ丁Ｐ融合物の投与量は、例えは、投与経
路や患者の症状等によって左方される。治療を施す者は
、最適な生物学的活性か現われる様に、用量を検定し、
投与経路を修正する必要かある。

ＣＴＰ、その融合物（特にプロＬＨ艮Ｈ）およびそれら
に対する抗体を分析するのに用いられる診断的な方法は
従来の方法と同じである。それらには、競合法、サンド
イツチ法および立体障害を利用する方法が含まれる。最
初の２方法においては、相の分離工程が欠くことのでき
ない役割を果たすのに対して、立体障害分析法の場合に
は、単１の反応系（混合物）で行える。ＣＴＰまたはそ
の融合物の分析に関する方法論と、ＣＴＰまたはその融
合物と結合する物質の分析に関する方法論とは、分析す
べき物質の大きさの点で、ある方法が好ましいというこ
とがあるにしても、基本的に同じことを論するものであ
る。従って、本明細書中では、それが抗原または抗体の
いずれの態様であろうと関係なく、被検物質をアナライ
）（ａｎａｌｙｔｅ）と称し、このアナライトと結合す
るタンパク質を、それが抗体、細胞表面または抗原のい
ずれであろうと、結合バー　１−　ｆ　−（ｂｉｎｄｉ
ｎｇ　ｐａｒｔｎｅｒ　）と称することにした。

ＣＴＰ、その融合物、抗ＣＴＰまたは、ＣＴＰの細胞表
面受容体の分析には、全て、以ドに示す試薬の内、１ま
たはそれ以上の試薬を用いる：標識したアナライト類似
体（ａｎａｌｏｇｕｅ　）　、固定化されたアナライト
類似体、標識された結合パートナ−１固定化さ４ｔた結
合パートナ−および立体的なコンジュゲート（共役体）
。標識した試薬は”トレーサー１とも呼はれる。

標識として用いられるものは、アナライトとその結合パ
ートナ−との結合を妨げない、検出”Ｔ能な機能を有す
る全てのものである。イム／アッセイに用いられる標識
には、例えば、ホースラデイッ、ユ、ベルオキンダーゼ
の如き酵素、１４Ｃや１３１１の如き放射性同位元素、
希土類のキレート化合物やフルオレセインの如き蛍光団
、スピン標識等を含めて、数多くのものが知られている
。常法に従ってこれらの標識をタンパク質またはポリペ
プチドと共有結合的に結合させることができる。その株
な結合法は、全てタンパク質性である、ｃ−ｒｐ。

ＣＴＰ融合物、抗ＣＴＰおよびＣＴＰ受谷体に関して、
採用し得る。

ある分析法の場合には、試薬を固定化（不動化）するこ
とが必要である。固定化することにより、結合バｌ”カ
ーと、溶液中に遊離しているアナライトの残分とを分離
することかできる。このことは、通常、分析工程にかか
る前に、結合パートナ−またはアナライトを、水不溶性
のマトリックスまたは表面に、吸着させることにヨリ〔
ベニツヒ（Ｂｅｎｎ１ｃｈ　）ら、Ｕ、Ｓ、　３，７２
０．７６０）　、あるいは共有結合的に結合させること
により（例えば、グルタルアルデヒド交差結合による）
、不溶化するか、あるいは、分析工程に移った後、パー
トナ−または類似体を例えば免疫沈殿法で不溶化するこ
とにより、行われる。

立体コンジュゲートは、ホモジーニアス系（均質系）分
析法における立体障害の手段に用いられる。これらのコ
ンジュゲート類は、低分子量のハプテンと小さいアナラ
イトとを共有結合的に結合させることにより形成される
ものであり、そうすることにより、ハプテンに対する抗
体は、実質上、抗アナライトと同時にコンジュゲートと
結合し得ない様にする。この分析法においては、被検試
料中に存在するアナライトが抗アナライトと結合し、そ
の結果、抗ハプテンとコンジュゲートとの結合によって
、コンジュゲートしているハプテンの性質に変化（例え
ば、ハプテンが蛍光団であるとき（こは、フルオレセイ
ンの変化）をもたらすことができる。前記のＣＴＰ核フ
ラグメントを、コンジュゲートのアナライト成分に用い
るのが好ましい。

その他、競合法またはサンドイツチ法として知られてい
る分析法も充分に確立されて２す、市販の診断関連産業
に広範に利用されている。

競合法（競合的分析法）は、標識した類似体（１トレー
サー“）と、被検試料アナライトとの、これらに共通の
結合パートナ−上に存在する制限された数の結合部位に
対する競合能力に基づく分析法である。一般に、競合さ
せる前または後に結合パートナ−を固定化し、結合パー
トナ−と結合したトレーサーおよびアナライトと、結合
していないトレーサーおよびアナライトとを分ける。こ
の分離は、デカント（結合パートナ−を手前に固定化し
た場合）または遠心（競合反応の後で結合パ−１ナーを
沈殿さまた場合）す′と°０より行　　　　　　１わイ
Ｌる。被検試料アナライトの量は、マーカー物質の量に
基ついて測定される結合したトレーサーの量と逆比例の
関係にある。既知量のアナライトを用いて用量一応答曲
線を作成し、試験結果と比較することにより、被検試料
中に存在しているＣＴＰ、その融合物または抗ＣＴＰの
量を定量的に求める。これらのヘテロローガスな分析系
において、検出可能なマーカーとして酵素を用いた場合
、この系をＥＬＩＳＡ　系と呼ぶ。

競合法のもう一つの種類の分析法（ホモジーニアスな分
析法）においては、相を分離する必要がない。この場合
には、酵素とアナライトとのコンジュゲートを調製し、
抗アナライトが存在する場合には抗アナライトとアナラ
イトとが結合することにより、酵素活性が変化すること
になる。この場合には、ＣＴＰまたはその免疫学的に活
性なフラグメントを二機能性の有機化合物ブリッジを介
してベルオキンダーゼの如き酵素とコンジュゲートさせ
る。コンジュゲートの仕方は、抗ＣＴＰが該コンジュゲ
ートと結合することにより、酵素活性を阻害または強化
する様、抗ＣＴＰと一緒に用いる目的で、選択される。

この方法はＥＭＩＴという名称で広範囲に実用化されて
いる。

ＣＴＰ融合物、抗ＣＴＰまたはＣＴＰ細胞表面受答体の
様な高分子量のタンパク質の測定にはサンドイツチ法が
特に有用である。連続的なサンドイツチ法は、固定化し
た結合パートナ−に被検試料アナライトを吸着させ、被
検試料を洗い流して除いた後、結合したアナライトに標
識した結合パートナ−を吸着させ、次いで、結合した物
質を残ったトレーサーから分離することからなる。結合
したトレーサーの量は被検試料中のアナライトの量に正
比例する。′同時１サンドイッチ法では、標識した結合
パートナ−を加える前に被検試料を分離することを行わ
ない。ＣＴＰおよびＬ）ＩＲＨからプロＬＨＲＨを区別
するには、一方の抗体に抗ＬＨＲＨを、他方の抗体に抗
ＣＴＰを用い、上記の如くに行う連続的サンドイツチ法
か好ましい。

例えば、試験管または微量検定用ウェルの内面に過剰量
の抗Ｌ　ＨＲＨを固定化しておく。これには、試料中の
ＬＨＲＨおよびプロＬＨＲＨの両者か結合する。次いで
抗ｃ′ｒｐを加える。抗しｒ　ｌ）はＬｆ（ＲＨを認識
しないか、あるいは認識したとしても極めて親和性に乏
しいので、抗ＣＴＰとプロＬＬ４Ｋ）（とか正比例関係
の下に結合することになる。

以上述べた事柄は、ＣＴＰ、ＣＴＰ融合物、抗ＣＴＰお
よびＣＴＰ細胞表面受容体の分析法を単に例示したにす
ぎない。現在既に開発されている、あるいは将来開発さ
れるこれらアナライトの測定法も本発明の範囲内に包含
される。

実施例の記載を簡単にするため、当業者既知の頻繁に用
いられる方法を短い熟語に略して示す：゛実施例の中で
は、これらの方法についてその都度記述することなく、
下記の語句で示すだけである。

プラスミドは小文字のＰを先頭にし、そして／または大
文字および／または数字を続けることによって表わされ
る。本発明の出発物質であるプラスミドは市販されてい
るか、または非制限的な施設から一般に入手可能であり
、あるいはこの様にして入手し得るプラスミドから、公
知の方法１こ従って組立てることができる。更に、その
他の同等なプラスミドも当業者には知られてＥす、通常
の技術者にとっては自明であろう。

ＤＮＡのｌ消化１　とは、ＤＮＡを、該Ｄ　Ｎ　Ａのあ
る位置に対してのみ作用する酵素で触媒的に開裂するこ
とを指す。その様な酵素を制限酵素と称し、該酵素にと
って特異的な部位を制限部位（サイト）と称する。本発
明において用いる様々な制限酵素は市販品されており、
その反応条件、コファクター、およびその他必要なもの
は、酵素の供給業者の指示に従って使用した。制限酵素
類は、各制限酵素か最初に得ら（’した微生物を表示す
る大文字、次いで他の文字、更に、通常、数字からなる
略号で表わされる。一般に、ＦＪ１μｇのプラスミドま
たはＤＮＡフラグメントを、約２０μｅの緩衝液中、約
１単位の酵素と共に使用する。特定の酵素多こついて適
当な緩衝液および基質の策は、製造業者によって明示さ
ｎている。通常、インキュベーション時間は３７℃で１
時間とするが、供給者の指示に従ってかえてもよい。イ
ンキュベーションした後、フェノールおよびクロロホル
ムでタンパク質を抽出して回収し、水性のフラクション
からエタノール沈殿によって消化された核酸を回収する
。制限酵素による消化の後、５′末端のホスフェートを
細菌性アルカリホスファターゼで加水分解（脱りん酸化
）することが多い。これは、ＤＮＡフラグメントの２つ
の制限的開裂末端が”閉環（サーキュライデイング）１
　したり、閉じたループを形成することにより、該制限
部位に他のＤＮＡフラグメントが挿入されにくくなるの
を防止するためである。明示しない限り、プラスミドの
消化（こは、５′末端の脱りん反応は伴なわないものと
する。脱りんの方法および試薬は常法に従う（Ｔ、　７
　二７テイス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　）ら、１９８
２、モレキュラー拳クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ）ｐｐ、１３３−１３４）。

制限酵素による消化によって得られたＤＮＡフラグメン
トの“回収１または゛単１１ｉＩ’　とは、この消化物
をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて分離し、フ
ラグメントの移動度を分子量既知のマーカーＤＮＡフラ
グメントのそれと比較して所望の７ラグメントを同定し
、該フラグメントを含むゲルの部分を取り除き、該ゲル
からＤＮＡを分離することを意味する。この方法は一般
的に知らレテイる〔例、Ｒ，ロー　７　（Ｒ，Ｌａｗｎ
）ら、１９８１．１ヌクレイツク・アンッズ・リサーチ
’　　９：６１０３−６１１４およびり、ゲラデル（Ｄ
、　Ｇｏｅｄｄｅｌ　）ら、１９８０　’ヌクレイツク
・アンッズ・リサーチ”　８：４０５７　］。

１サザ一ン分析“とは、消化物またはＤＮＡ含有組成物
中のＤＮＡ配列の存在を、既知の、標識したオリゴヌク
レオチドまたはＤＮＡフラグメントとのハイブリダイゼ
ーンヨンによって確認スる方法である。不明＠Ｂ書中で
は、特に断らない限り、ササーン分析という時は、Ｅ、
サザーン（Ｅ、５ｏｕｔｂｅｒｎ）、１９７５　　’ジ
ャーナル・オフ・モレキュラー−ハイオロ’；イ（Ｊ、
　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　）’　９８：　５０３−５１７
、の方法イこ従って消化物を１％アガＵ−ス上で分離し
、変性し、そしてニドａセルａ−ス上に移し、■、マニ
アテイスらの方法（１９７８，１セル′１５：６８７−
７０１）に従ってハイブリダイセーソヨンを行なうこと
を意味する。

１形質転換“　とは、ＤＮＡを生物内に導入し、その結
果ＤＮＡが染色体外成分として、あるいは染色体内に組
込まれて複製されることを意味する。

特に明示しない限り、本発明における大腸菌の形質転換
法にはマンデル（Ｍａｎｄｅｌ　）らのＣａ　Ｃ１２法
（１９７０、’ジャーナル・オフ・モレキュラー・バイ
オロジイ’　　５３：１５４）を採用した。

“ライゲーション（結合νとは、２個の二本鎖核酸フラ
グメントの間にホスホジエステル結合を形成する工程を
言う（ｒ、マニアテイスら、前掲ｐ１４６）。特に明示
しない限り、ライゲーションは既知の緩衝液と条件を使
用し、略等モル量のライケ−＋−１−べきＤＮＡフラグ
メント０．５μｙ当たりＴ４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼ（’
リガーーｔ”）１０単位を用いて行う。

形質転換体からＤＮＡを１調製する”　とは、プラスミ
ドＤＮＡを微生物培養物中から単離することを意味する
。明示しない限り、マニアティスらのアルカリ性／ＳＤ
Ｓ法（同上、９０頁）を採用する。

”オリゴヌクレオチド１とは、短かい一本鎖または二本
鎖ポリデオキンヌクレオチドであって、既知の方法によ
って化学的に合成され、次いてポリアクリルアミドゲル
上て精製さくしたものてあ句。

引用した文献は全て参照例として示した。

実施例Ｉ　　Ｌ）ｉＲｔ（をコードしているゲノム配列
の単離 ＬＨＲＨを暗号化してい６ＤＮＡ配列の最初のスクリー
ニングには、ｃＤＮＡ　ライブラリィよりもゲノムライ
ブラリィを優先的に用いた。この選択は、ＬＨＲＨｍＲ
ＮＡの量があまり豊富でｆよいと予測されること、３′
非翻訳饋域が非常に長い可能性があること、並びにｍＲ
ＮＡ内のデカペプチド暗号単位の顕著に現われる位置が
不明であ句こと等、多くの理由を挙げることができる。

ゲノムスクリーニングのために計画的に用いたプローブ
を第２図に示す。Ｌ）ｉＲ）ｉデカペプチドは前駆体　
　　　　［タンパク質内では１対の塩基性アミノ酸から
なるプロセシング部位によって先行されており、また、
ＬＨＲＨのアミノ末端であるピロＧｌ　ｕ　（ｐｙｒｏ
　Ｇｌｕ　）はＧｌｎ残基から導かれ、さらに、アミノ
基は、Ｇ１ｙ残基におけるカルボキン末端のアミド化に
より与えられると推測されるので、ＬＨＲＨに３個のア
ミノ酸を加えて延長した。この延長されたペプチド配列
を用いて、８個の、３８塩基対長さのオリゴヌクレオチ
ド（ロングプローブ）を化学合成した［Ｒ，フレア（Ｒ
，Ｃｒｅａ　）ら、　′ヌクレイツク・アシツズ・リサ
ーチ’　　８　：　２３３１−２３４８　　（１９８０
））。これらのプローブにおける縮重（同義性）により
、Ａｒｇ　（ＡＧＰｕおよびＣＣＸ）並びに５ｅｒ（Ａ
ＧＰγおよびＴＣＸ）に関しては２個のコドンをとり得
るが、それ以外の残基に関しては、全て、第３番目のヌ
クレオチドが２個（・）または４個（○）の内の、１個
を選択することができる。

ＬＨＲＨのアミノ末端６アミノ酸の暗号配列としての可
能性を有する全配列（但し、３配列を除く）を包含する
１６個の、ヘプタデカマー（１シヨートプローブ）を合
成し、下記のロングプローブで単離されたクローンの中
から、さらに候補者を選択するのに用いた。

単ｌのロングプローブを用い、幾つかの遺伝子の単離に
成功したとの同様の例もある［５．アンターソ７　（Ｓ
、Ａｎｄｅｒｓｏｎ　）ら、′プロンーデインダス・オ
フ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オフ・サイエンスイ
ズ、Ｕ、Ｓ、Ａ、”　８０６８３８−６８４２　　（１
９８３）　逼Ｍ、シャイエ（Ｍ、　Ｊａｙｅ　）ら　１
ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ’　　１１　２３２
５−２３３５　（１９８３）；Ａ−ウールリッヒ（Ａ、
Ｕｌｌｒｉｃｈ　）　ら、１ジエイ・エンボ（Ｊ、Ｅｍ
ｂｏ）’　３　３６１−３６４（１９８４）〕が、しか
し、これらの例で入手し得るアミノ酸配列は２０残基以
上であった。し［ムＲ１−１暗号配列の単離に成功する
か否かはロングプローブのプールを構成する成分（メン
バー）全てが存圧していること、並びに、充分な数の第
３位のコドン位置に正しく選択されたヌクレオチドが同
時に、挿入され得ることにかかつている。プールの構成
成分を分析し、オリゴヌクレオチドの配列決定を行うた
めに、化学合成された（フレアら、前掲）９量体（ノナ
マー）プライマー分子の存在下、インビトロでのＤＮＡ
合成を行い、オリゴヌクレオチド混合物を二本鎖構造に
転換した（第３図参照）。

５′りん酸化−ロングプローブ２０モルと５′すん酸化
９量体プライマー４０ピコモルとを、４０μａの２０ｍ
Ｍ１−　　リ　７．　　Ｈ（Ｊイ（ｐＨ７，５）　　、
　１００ｍＭ　　ＮａＣ１゜６　ｒｎＭ　　：Ｖ１ｇＣ
％　、０．１　ｒｎＭ　Ｅ　ＤＴＡおよび、ｄＡ−ｒＰ
。

ｄＧＴＰ　５ｄＣＴＰ　１ｄＴＴＰ各１００各間００μ
混合物中、１４℃で１５分間アニーリングした。大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼ■（ラージフラグメント、べ一リン
カー・マンハイム）５Ｕ（単位）を加えてＤＮＡ合成を
開始し、さらに１４℃で３０分間進行させた。フエ／−
ル抽出とエタ／−ル沈殿の後、５０ｍＭ）　　リ　スＨ
Ｃ５（ＰＨ８）　、　Ｉ　　Ｑ　　ｒｎＭ　Ｍｇ　ｃ６
２　、Ｑ、　ｌ　ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡ　、　ｌ　Ｑ　ｍＭ
　　β−メルカプトエタン−ル、０．５　ｍＭ　ｒ　Ａ
ＴＰ　　およびＴ４ＤＮＡリガーゼにューイングランド
バイオラボス）を含む混合物２０μ召中、Ｓｍａ　■開
裂Ｍ　ｌ　３　ｍｐ　ｌ　Ｑ　ＲＦ−ＤＮＡ　　ＩＱｎ
ｇ　と−緒に、ＤＮＡを室温で２時１−ｅｉインキュベ
ートした。このライゲーション混合物を用いてコンピテ
ントな大腸菌ＪＭ　１０３細肥を形質転換した。組換え
ファージを増殖させ、−木鎖ファージＤＮＡを調製し、
ジデオキシヌクレオチドトリホスフェートを用いて配列
決定した。

第４図は、１４の単離体に関す６分析１こより得ら４し
た結果、並ひに、最も重要な点である、ロングプローブ
中の全ヌクレオナトの組合わせを示すものである。この
様（こ、主としてＴｙｒコドン中に幾つかの欠失かあり
、同コドンに１個のヌクレオナトの挿入があるにも拘ら
ず、このオリゴヌクレオチドは質的に、ゲノムライブラ
リィをスクリーニングする上で満足すべきものてあ口と
考えられる。

ヒトゲノムＤＮＡを含有しているλファージ〔Ｒ，ロー
　７　（Ｒ，Ｌａｗｎ　）ら、　１セル’　　１５　：
　１１５７−１１６３（１９７８））１０６個を二重（
ｄｕｐｌ　１ｃａｔｅ　）フィルター上で、比活性が１
０７ｃｐｍ　／　ｐｍｏｌ　　ヲ示す様子めりん酸化し
て８いたロングプローブ（第２図多照）を用いてスクリ
ーニングした。ノ１イフリタイゼーンヨンは、３７°Ｃ
において、３０％ホルム　　　　　　　［アミドの存在
下、１１０７Ｃｐ／フイルターの条件を用いて行った。

フィルターを３７℃において、３ｘＳＳＣ（ｌ　ｘＳ　
５ｃ＝ｏ、１５Ｍ　ＮａＣ５，Ｑ、Ｑ　ｌ　５Ｓｌクエ
ン酸ナトリウム）中で洗浄し、Ｘ線フィルム番こさらし
た。陽性シグナルの査号および位置に相当する３００の
小領域から得たファージを別々のプレート（平板）上に
おき、ロング２よひンヨートプローフを用いてプローブ
した（第２図）。ショートプローブハイプリダイゼーン
ヨンは２０％ホルムアミドの存在下、室温で行い、相当
するフィルターを同温度において、５ｘ、ＳＳＣ中で洗
浄した。以上の両オリゴマープールと７１イブリダイズ
した、単独の単離体から得たＤＮＡを制限酵素で開裂し
、上記の条件の下、２個のオリゴヌクレでチドプールを
プローブとして用い、サザーン分析により、ＤＮＡフラ
クメントを特性化した。ノ１イフリダイズする領域を含
む１２００塩基対のＤ　Ｎ　ｔ＼フラグメントを７７一
ジＭ１３ｍｐ　１８ＲＦ−ＤＮＡ番こクローンし、得ら
れた組換え一本鎖ＤＮＡを、ジデオキシヌクレオチドト
リホスフェートの存在下、プライムＤＮＡ台５５．法を
利用して配列決定し１こ。このクローンの分析結果を第
４図に示す。／マネルＡから、同一の単独の制限フラグ
メントが２組のオリコマ−の両者とハイブリダイズして
いることかわかる。パネルＢは、ハイブリダイズした領
域の配列決定ゲルを示している。このヌクレオチド配列
から導かれたアミノ酸配列は、このＤ（ＪＡが正しく　
ＬＨＲＨペプチドをコードしていることを示している。

また、このＤＮＡのカルボキン末端には、その後方にＬ
ｙｓ−Ａｒｇ　　プロセシング部位を伴なっている、ア
ミド化に必要な、推定のＧｌｙ残基が存在していること
も図から分る。その様なプロセシング部位がＬＨＲＨに
先行すると予測されており（第２図、実際は異なってい
う）、しかも、ロングプローブのヌクレオチド配列か実
際のＬＨＲＨ暗号領域のそれと５個も異っていた（＄２
図と第１図とを比較して）にもかかわらす、これらのプ
ローブは、正しい遺伝子を同定するのに充分な配列上の
ホモロシイを自゛シていたことになる。遺伝子中に介在
配列（イントロン）の存在するａＴ能性があるので、Ｌ
　ＦＩ　ＲＨ前駆体タンパクｖｆの完全な構造を解明す
るために対応するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの単離を試みた。

実施例２　プレプロＬＨＲＨｃＤＮＡの単離ヒト胎盤組
織から得たポリアデニル化ＲＮＡ（１０μ、＠）Ｅ、常
法［Ｔ、７　＝　７テ４　ス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ
　）ら、　１モレキユラー・クローニング、コールド書
スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）　’　　（１９
８２）］に従って二本鎖ｃＤＮＡ　に敦換した。

このｃＤＮＡを、ベクターとしてファージ１λｇｔ１０
を用い、公開された方法［Ｔ、ヒュイン（Ｔ。

）１ｕｙｎｈ　）ら、　′プラクティカル・アプローチ
イズ・イン・ハイオケミストリイ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ戸　（１９８４））に従ってクローンした。１．５Ｘ
１０６の組換えファージを得、これらを、ゲノムクロー
ンから単離し、比活性１１０８ＣＰ／ｌ’ｌｉ’　標識
した６００　ｂｐ　Ｓａｕ　　３　Ａ消化フラグメント
［Ｊ、テーラ−（Ｊ、　Ｔａｙｌｏｒ　）ら、　’ハイ
ｔ’７−ミカル・アンド・バイオフィジカル・アクタ（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　）”　
４　：　３２４−３３０　　（１９７６）’］を用いて
スクリーニングした。ハイブリダイズした２個のλクロ
ーンを単離したところ、それぞれ、約１５００およびＳ
ＯＯ塩基対のｃＤＮＡ神人体を含有していることか分っ
た。一本鎖組換えＭ１３　ＤＮＡを鋳型（テンプレート
）として用い、ジデオキンヌクレオチドトリホスフエー
トの存在下におけるプライムＤＮＡ合成により、上記の
クローンされたｃＤＮＡの配列決定を行った。

これら両ｃＤＮＡの完全なヌクレオナト配列と、ＬＨＲ
Ｈｉｆ；Ｊ躯体タンパク質（プレプロＬ　ｌ−Ｉ　ＲＨ
）の推定のアミノ酸配列を第１図に示す。

このｃＤＮＡの最も顕著な特徴は、１０００ヌクレオチ
ド以上の、非常に長い５′非翻訳領域か存在しているこ
とである。これと同様なサイズの５′匍域を持つものと
してヒトプレプロエンケファリンＢ遺伝子に関する記載
かあるが、それ以外に関しては稀れな現象の様であ６゜
ＬＨＲＨは様々な組織で発現されるので、異る組織特異
的プロモーターから前駆体遺伝子が転写されることか、
胎盤性ｃＤＮＡに、この様に延長された５′領域の存在
していることを説明する糸口とナルかもしれない。

遺伝子に含まれている２個のイントロンは明らかに除去
されているので、上記のクローンがスプライス処理され
ていない核ＲＮ　Ａから導かれたものであるという様な
つまらない説明は論破されてしまうだろう。クローンし
た２個のｃＤＮＡの内、短かい方でも、約４００ヌクレ
オチドの５′非翻訳配列を有することを特徴としている
上、最も良く一致するスプライス受容部位（ヌクレオチ
ド９６０−９７４）を持ち合わせているので、部分的に
スプライスされた翻訳である可能性はないと思われる。

胎盤組織中の、相当するｍＲＮＡの豊富性が極めて乏し
いことから、５′領域の正確な長さを決定すルタめｉｎ
／−ザン分析［Ｈ，レ−ラッハ（Ｈ，Ｌｅｈｒａｃｈ）
ら、　“バイオケミストリイ（ウォッシュ）（Ｂｉｏ−
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（ｗａｓｈ　）　）　’　１６　
：４７４３−４７５１（１９７７）］を利用することが
できない。最後に、この領域と確立さくしたゲノム配列
との間に共直線性が存在しているので、これが逆転写お
よび分子クローニングの間に導入されたものであるとい
う説も排斥される。

最大のオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド１
０６３−１３５０）　　は、ＬＨＲＨの暗号配夕１ｊを
指定すると共に、翻訳さｎて、多機能性タンパク質の前
駆体としての特徴を有する約１０，０００クルトンのタ
ンパク質を与える。このリーディングフレームの終止コ
ドンはオーカーコドンであり、その下流に、１６０ヌク
レオチドからなる３′非翻訳領域が続いており、この領
域のボＩＪ　Ａティル（尾部）のすぐ上流には、ポリア
デニル化のためのＡＡＴＡＡＡ配列か含まれている。こ
のオープンリーディングフレーム内での実際の翻訳開始
コドンは不明瞭である。最初のＡ　Ｔ　Ｇ開始コドン（
１０６３）から４コドン■流には、フレーム内（７）　
Ａ　Ｔ　Ｇコドンがある。第２のコドン（第１のコドン
てなく）の如く、後方にプリンか、そして前方にはＡ（
−３位）かある状態は、真核性の開始コドンに最も多く
みられる例である。従って、第１のＡｒＧＤ）タンパク
質合成の開始哉能を打するということを明確に定めた法
則［Ｍ、：＋サック（〜１．　Ｋｏｚａｃｋ　）１ヌク
レイツク・アシッズ・リサーチ’　　９：５２３：３−
５２５２（１９８１））に反することではあるが、この
１０７５位にあるＡＴＧがＬＨＲＨ前駆体タンパク實の
合成を開始するコドンであると結論さ４する。

または、こｎらのＡＴＧ両者が、タンパク質合成の開始
に係っており、その翻訳効率か低いのかもしれない。

最初の２３アミノ酸は、疎水性の中間部分（ミドルセク
ンヨン）を含む典型的なシグナル配列を形成している。

推定のシグナル配列の末端番こは２個のセリン残基かあ
り、その後方に推定のＬ）（ＲＨデカペプチド配列か存
在している。ツクナルペプチドか切離されると、アミノ
末端はグルタミン残基となり、この残基は自然にまたは
酵素的に環化されてＬｉ（ＲＨの１じ飾されたアミノ末
端であるピロＧｌｕを与える。このデカペプチド配列の
下流には、カルボキン末端のアミド化における標準的な
アミノ基供与体であるグリノンか存在している。

神経内分泌ペプチドの前駆体の多くに見られる様に、酵
素的プロセンング部位としてのＬｙｓ−Ａｒｇ開裂部位
か存在している。

この様（こ、単離されたｃＤＮＡはいずれもＬ１′４Ｒ
Ｈに関する真の前駆体タンパク質をコードしており、そ
の、ノブナル配列と生物学的に活性なペプチドとが直接
結合している様子は、バソプレツノンの＋１ｉｊ　’８
１体に見られる状況を思い起こさせる〔吐う７ド（Ｈ、
Ｌａｎｄ　）ら、　′ネイチャー’　　２９５：２９９
−３０３（１９８２）］。

ＬＨＲＨ＠駆体の残余部分は５６アミノ酸残基のペプチ
ドで構成されている。この部分は、Ｎ−グＩＪ　コ’／
　／Ｉ／化部位（Ａｓｎ−Ｘ−ｒｈｒ／Ｓｅｒ　）を全
く含んておらす、また、その他の既知の視床下部で生産
される神経内分１必ペプチドのための前駆体と比較した
時、なんらホモロジイを認め得ない。興味深いことに、
このペプチドのカルボキン末端は、さらにプロセシング
を行う礫の酵素的な開裂部位であると思われる配列：　
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−１１ｅを有する。

この様にして得らαる５３アミノ酸からなるペプチドＣ
ＴＰ（ＧＡＰてな（）は、Ｌ）ＩＲＨと−緒　　　　　
　　１に放出されると思われている。

実施例３　　ＧＡＰ融合物をコードしているプラスミド
の組立て 実施例２で調製した、クローンした１５００ｈｐｃＤＮ
Ａ　ＥｃｏＲＩ　７ラグメント（λＬ）ＩＫＨ−１）を
、Ｍ１３ｍｐ１９にサブクローンした。この〜ｉ１３ク
ローンから得たＤＮＡを用い、次の様にして５６２１）
Ｐ　ＥｃｏＲ■−Ｐｓｔ　■フラグメントを単離した。

４種類のｄＮＴＰ　（！：ＤＩＮＡポリメラーセエのク
レノーフラグメントとの存在下、この一本川Ｍ１３テン
プレートを、Ｍ１３１７マーのユニバーサル・ソーケン
ソング・プライマー（普遍配列決定ブライマー）を用い
てプライミングし、二本１ＤＮＡを得た（制限酵素によ
る′開裂に必要）。二本鎖Ｄ　Ｎ　ＡをＥｃｏＲＩとＰ
ｓｔ　］：で消化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
と電気７８離によって５６２ｈｐ　　フラグメントを回
収した。このフラグメントを、予めＰｓｔ　ＪとＥｃｏ
Ｒｉで消化しておいたｐ（ＪＣｌｌにライゲートし、こ
のライゲーンヨン混合物を用いて大腸菌ＪＭ８３を形質
転換し、コロニーの１つからプラスミドｐ　Ｇ　ｎ　Ｒ
１−１−１を回収した（第６図）。

ｐ　Ｇ　ｎ　Ｒ）ｌ　−１はＨｉｎ［Ｉで認識される５
個の部位を有している。従って、ｐＧｎＲＨ−１をＨｉ
ｎｔ　Ｉで消化すると５個のフラグメントが生成する。

これらの内、丑も大きい１７７８　ｈｐ　ＨｉｎＦ　Ｉ
フラグメントを単離し、このフラグメントを、ｍｅｔ　
−Ｇ　Ａ　Ｐ配列の５′末端をコードしている合成オリ
ゴヌクレオチドにライゲートした（第６図）。このオリ
ゴヌクレオチドは、ＧＡＰ暗号唄域中に見出される配列
：ＧＡＴＴＣの）ｆｉｎＥＩ　　粘着末端とのみ結合す
る粘着末端を有する様に合成されでい。；その曲のｔ（
ｉｎｆ■部位は、合成りＮＡ中のＨｉｎｆｉ粘着末端と
自己相補性を持たない配列：　ＧＡＣｒＣを有している
。このオリゴヌクレオチドは、２本のＤＮＡ鎖を合成し
、弗２鎖（第６図番こＥけるＦ方の鎖）をポリヌクレオ
チドキナーゼでりん酸化し、両川をアニーリングするこ
とにより、調製した。次に、ライゲーンヨン産吻をＡｈ
ａ和で消化しく平滑末端の形成）、１７７　ｈｐ　Ａｈ
ａ　Ｍ−ＥＣＯＲＩ７ラクメント（そのＣ末端にトリベ
ブチドヵ）融合した形のＧ　Ａ　ｌ’　、ｌコードして
いうフラグメント）を回収した。

この１７７　ｈｐ　　フラグメントを、ＥｃｏＲＩとＨ
ｉｎｃ■で消化しておいた（平滑末端とＥｃｏＲＩ粘着
末端とを形成）〜１１３ファージｍｐ１８とライゲート
した。このライゲーション混合物で大腸菌Ｊ　Ｍｌｏｌ
を形質転換し、白色プラークからファージｍｐ１８　Ｇ
ＡＰ−１（図示せず）を単離した。この１７７　ｈｐフ
ラグメントの配列を、５５Ｍ１３テンプレート（鋳型）
を用いて、ジデオキシ配列決定法により、確認した。１
本鎖ｍｐ１８−ＧＡＰ　　ＤＮＡを、ｄＮＴＰｉとクレ
ノーの存在下、インビトロで、１ｌ量体のＬａｃプライ
マーＣＬ、メツシングら（Ｌ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ　）ら、　１ヌクレイツクアンツズ・リ
サーチ１９　：　３０９−３２１（１９８１））で伸長
させることにより、二本鎖にした。ｍＰ１８ＧＡＰ−Ｉ
　ＤＮＡをＥ　ｃｏＲ■とＨｉｎｄｌ［で消化し、１８
７　ｂｐ　フラグメントを４１離した。

ｐＮＣＶ（ディビス（Ｄａｖｉｓ　）ら、　’　Ｐ、Ｎ
、Ａ、Ｓ、　”７８　：　５３７６（１９８１）］の修
飾形であって、テトラサイクリンを欠除し、アンピシリ
ン耐性とＭ１３ｍｐ１８からのポリリンカー領域とを含
有しているｐｔｒｐＬＥ（図示せず）をＥｃｏＲ１およ
びＨｉｎｄｆｆｌてｌ［１化した。この消化プラス文ト
ＤＮＡをｌ　８７　ｌ１ｌ）ＥｃｏＲニー　Ｈｉｎｄ　
ｌ［フラグメントとライゲートし、得らイまたライゲー
ション混合物を用いて大腸菌２　ｇ　４　Ｍ胞（Ａ−ｒ
ｃｃ　３１４４６　）ヲ形質Ｎｉ侠シ、３２Ｐ夢で標識
した、５５２ｂｐＰｓｔ■−ＥｃｏＲＩ　　ＣＴＰフラ
グメントを用いて行うサザーン分析により、形質転換体
を同定した。形質転換体コロニーからｐｔｒｐ　ＬＥ−
ＧＡＰを回収した。

インビトロでｍｐ　１３ＧＡＰ　−１のＧＡＰｌｙｓ５
４コドンを終止コドン（こ突然変異させ、シＴＰをコー
ドしている同様なベクターを調製した。このＧＡＰ融合
物はＣＴＰよりも、細胞頁内の大腸菌プロテアーゼに対
して安定であった。

実施例４　抗−ＣＴＰの調製 ＣＴＰの核フラクメント：　ＮＨ２−ｃｙｓ−ｔｈｒ−
ｔｈｒ　−ｈｉｓ−ｇｌｎ−ｐｒｏ−ａｒｇ−ｓｅｒ　
−ｐｒｏ−１ｅｕ−ａｒｇ−ａｓｐ−ｌ　ｅｕ一１γ５
−Ｃ０ＯＨを合成した。広いで、このフラグメントを、
既知の方法で、スペリン酸ビス（Ｎ−ヒドロキン−スク
シンイミドエステル）により、４０位のＣγＳを介して
交差結合させることにより、ラン血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）と共有時合同に結合させた。このＢＳＡコンジュゲ
ートを用いて３羽のウサギを免疫した。これら３羽は全
て、力価に差はあるか、このフラグメントに対するポリ
クローナル抗体を産生じた。免疫されたウサギから血清
を得、クロラミンＴ法により、これを１３１１で標識し
た。この標識抗血清を、実施例５で発現させ、ＣＴＰ融
合物の精製における精製度を監視するのに用いるか、こ
の抗血清は血清等の、臨床試験試料中のＣｒＰまたはそ
の融合物を測定するのにも適する。

実施例５　　ＧＡＰ融合物の元現と回収大腸菌２９４　
（ＡＴＣＣ３１４４６）細胞をｐｔｒｐＬＥ−ＧＡＰで
形質転換した。形質転換体を５０１Ｍ’／／　ａｅアン
ピンリン含［１１４９培地Ｌ／２ｆｆｉこ接種し、細廐
田度か０Ｄ５５ｏキ３になるまで増殖させた。定常ル１
の培養培地から細胞を分離し、２％ＳＤＳおよび１％β
−メルカプトエタノール中で溶菌して屈折体を回収し、
１０倍量の冷アセトンで沈殿させた。高密度培養は大腸
菌に１２Ｗ３１１０林細胞を用いて行った。ベレット化
した屈折体を６Ｍグアニジン塩酸塩ｉＱｍｅ中でホモジ
ナイズしてタンパク質を可溶体した。この可溶体さイし
たタンパク質を４Ｍ尿素中で透析し、ヴイダツク（Ｖγ
ｄａｃ　）の、Ｃ４，３００Ａ、１５−２０μｍ　　、
５Ｘ３５ａａカラム（疎水性のンリカゲルアフイニテイ
力ラム）をこ適用し、２５−６０％アセトニトリル１０
．１％トリフルオロ酢酸グラディエンドを用い、流速１
５ｍｅ／分て逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃにかけ、分離した。１５
ａｅづつのフラクションを集めた。抗−Ｃ［２反応性物
質はアセトニ）　ＩＪル約４９　ｖｏｌ　／ｖｏｌ　　
％で溶出した。

抗−Ｃ′ｒＰＩＸ応性フラクンヨンを凍結乾燥した供、
既知の手法で、臭化ンアン（ＣＮＢｒ　）により、開裂
させた：タンパク質約５．９１１ｉｑを７０％キ吸４８
０μｅに路かした。このタンパク實浴液にＣＮＢｒｍ１
（ｆ（キ醒中１００″ＩＱ、／ｍｅ　）　４１．９　ａ
ｌおよびＮ　ａ　５２０３　（Ｍ液（キ毅中１０〕”！
Ｊ／　ｍｅ　）　１８．８μ召を加え、振盪しなから２
４時間インキュペートした。この反応混合物を０．１％
ＴＦＡ中で希釈し、Ｖｙｄａｃ　Ｃ１８，３００Ａ、１
５−２０μｍ。

２．５Ｘ３５αカラム（Ｃ１８シリカゲル、疎水性アフ
イニテイカラム）に入れ、３０−５０％アセトニトリル
１０．１％ＴＦＡグラディエンドで溶離することにより
、クロマトグラフした。免疫活性物質を含有しているフ
ラクションをプールし、凍結乾燥した。

この物質を２Ｍ酢酸に溶かし、セファデックスＧ−５０
カラムにかけ、２Ｍ酢酸で溶離することにより、ゲルｐ
過した。溶出液中の免疫活性物質をＶｙｄａｃ　Ｃ４，
３００Ａ、５μｍ、　　１Ｘ２５ｃｍｆｙラム（Ｃ４、
疎水性アフイニテイ力ラム）を用い、３３−４５％アセ
トニトリル１０．１％ＴＰＡグラディエンドで溶離する
ことからなる逆相ｔｉｉ’Ｌｃによって精製した。４０
　ｖｏＩ　／ｖｏ１％アセトニｌ−ＩＪル溶出液中に単
独のタンパク質を示すピークが含まれており、これがホ
モジーニアスであると判断された。アミノ酸配列決定に
より、この生産物がＧＡＰであることを確認した。

実施例５　　ＧＡＰの生物学的活性 に、ニコリツクス（Ｋ、Ｎ１ｋｏｌｉｃｓ　）らの方法
〔１ベプチビ　２　：　ｂ５−７３（１９８１）］に従
った細胞培養により、雌性スプラーク・ドーリイ（Ｓｐ
ｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ　）ラットから脳下垂体細胞を
調製した。４日間の脳下垂体細胞培養の５×１０５細肥
に対し、１９９培地（栄養培地の１種）中、モル濃度的
１×１０−８モル／ｉのＧＡＰまたはＬＨＲＨ１ｍｌを
加んた。ＣＯ□５％／空気９５％の状況下、３７℃で４
時間インキュベーンヨンした後、細肥培＃物の上澄欣中
にＬＨおよびＦＳＨが放出されているか否かを分析した
。結果を次の表１に示す。

表１ 基準　　　　４２９３±４７４　　　　２７０１±７１
８ＬＨＲＨ１０−８Ｍ３０５０３±３３４２　　　１１
４０３±３５００ＡＰ　１０−８Ｍ　　２５８２５±２
６５５　　　１０４９６±８３８上記のデーターから、
ＧＡＰが、脳ド垂体刺ｌｆｉ活性を有して３す、ＬＨお
よびＦＳ）ｉを放出させる様に作用すること、従って、
生殖系を調整するために、Ｌ　ｌ−Ｉ　ＲＨの代替品と
して用い得ることが分る。同様の実験において、実施例
４のＣＴＰ−核タンパク質もまた、ＧＡＰよりも商濃度
であることを必要とするが、ＬＨおよびＦＳＨの放出活
性を有することが分った。

実施例７　　ＧＡＰのプロラクチン放出阻害作用および
ゴナドトロピン放出作用 ＧＡＰのプロラクチン阻害作用およびゴナドトロピン放
出作用に関してより詳しく調べるために、濃度一応答関
係を求め、これら脳下垂体前葉ホルモンの分泌に影響す
ることが知られている因子類との併用を試みた。

実施例６に述べた如くにして、雌性スプラーグードーリ
イラットから脳下垂体前葉細胞培養を調製した。ＧＡＰ
を、第７Ｂ図に示した各濃度（Ｏｌｌｏ　１１１１山、
３Ｘ１０　”Ｍ　、・、ＩＯＩＯＭ、闇、−９。

１０　Ｍ　、そして△、１０−８Ｍ）ｌこおいて、５×
１０５細胞／（培地ｍｅ　）と共に、２４個のウェルを
設けた培養プレート中で、各指定時間、インキュベート
した。培地中のＰＲＬを測定し、ｒｌ″ｋＬ−ｔｔｔ’
−２基べ「−タンパクｉ′（（ｒｃｒｃｒｃｎｃｃ　ｐ
ｒｏｔｅｉｎ　）　　１ナンヨナル・ピツイタリイ・ア
ンド・ホルモン・プロゲラｔｈ　（Ｎａｔｉｏｎａｌ　
１）ｉｔｕｉｔａｒｙ　ａｎｄ　ｌｌｏｒｍｏｎｃＰｒ
ｏｇｒａｍ　）　）に従って表わした。各点は並行させ
て培養した４つのウェルからの、＆−＆試料のＲＩＡに
よる測定値番こ基つく、平均値±標準偏差を示している
。基準レベルは、並行培養された８個のウェルから決定
した。図中の曲線は、３〜５個の独立した細胞培養の結
果をまとめて示したものである。

第７Ｂ図は、ＧＡＰ（・）とドパミン（ロ）の濃度を増
加させていった場合のラット脳下垂体細胞からのｌ）　
ＲＬ分泌を示す図である。添加しない対照値は白丸（０
）で示されている。＋ｉｎ害されていない基準レベルに
対する割合（％）で、Ｐ艮り分泌を表わした。

ＧＡＰは脳下垂体のラクトトロフ（乳腺刺激細胞、ｌ　
ａｃｔｏｔｒｏｐｈ　）からのプロラクチン分泌を昔し
く阻害した。この作用は、％７Ｂ図１ごみられる様に、
用量および時間に依存しており、最大阻害率は基準値の
４５−５０％に達している。ペプチドのこの阻害作用は
非常に低濃度でも認め得る。

Ｇ　ｋ　ＰのＰＲＬ分泌に対する阻害作用の大きさはド
パミンのそれに匹敵する（第７Ｂ図）。これら２化合物
は、低い濃度では相乗的に作用しない。

プロラクチン放出の刺激作用を有する、チロトロピン放
出ホルモン（ＴＲＨ）は、プロラクチン阻害に必要な用
量を著しく変動させた。１０−７ＭのＴ　Ｒ）４が存在
することにより、最大の阻害をあられすのに必要なＧＡ
Ｐの用量が多くなった。

ＧＡＰの増加によって、ラットの脳下垂体前葉細胞から
のＬ）ｌおよびＦＳ）（の分泌に関する応答が増加した
（表１）。しかし、これら両ゴナドトロピンの放出に対
する最大刺激は、ＧｎＲＨによるそａよりも少い。Ｇｎ
ＲＨ同様、ＧＡＰもＬ）（およびＦＳＨの放出を刺激す
る。ＧＡＰの、ＬＨ放出に対する最大刺激の１／２　の
刺激を与えるＧ　Ａ　ｌ）濃度は、ＧｎＲＨによる場合
のそれよりも幾分高い（ＧＡＰの場合は２Ｘ１０＝Ｍで
あるのに対し、ＧｎＲＨの場合は８Ｘ１０　　Ｍである
）。これら２棟のペプチドを一緒に投与しても、相加的
または相乗的な作用の特徴を示さず、Ｇ　ｎ　ＲＨ単独
の場合に得られる応答と同じ応答を示す。しかしなから
、ＧＡＰは、ＦＳＨの分泌に対しては、ＥＤ５ｏ１ｉｉ
ｉＬＤ）５×１０−１°Ｍ位という、ＧｎＲＨと同程度
の濃度で刺激をあられした。Ｇ　Ａ　Ｐ　、ｌ！：　Ｇ
ｎＲｌ−１との併用によっては、有怠な相加活性を認め
なかった。

プロラクチン放出阻害作用における有効ｍｉｘ域は、ゴ
ナドトロピンの放出において相当するそれよりも低く、
このことは、前記の作用を仲弁すう受容体が、ゴナドト
ロフ（性腺刺激細胞）に関する受答体よりも、該ペプチ
ドに対してより商い親和性を有しているということを示
唆するものである。脳下垂体前葉には、ゴナドトロフよ
゛りもラクトトロフの方が豊富に存在しているので、通
糸、ペプチド分子の大部分はラクトトロフと結合すると
思われる。従って、ＣｒＰの禰）一義的な作用はプロラ
クチン阻害作用であるらしく、従って、ｃ　’ｒ　ｐは
ＰＩＦと称されるのが適切であろう。結果的に、ＧＡＰ
の様なＣＴＰ種は、プロラクチン依存性疾患の治療およ
び月経の調整に肩出である。

プロラクチン依存性疾患には、高プロラクチン血症に起
因する、男性の性機能不全および女性の無月経、並びに
プロラクチン依存性腫瘍、特に哺乳類における新生物が
含まれる。男性における能力、および女性における正常
な月経周期は、冶療冒効量のＣＴＰ種を薬学的に許容し
得る担体に含有させたものを投与することにより、回復
される。

好遇な担体は前述の通りである。投与方法および患者の
状態に応じて用量を検定する。しかしながり、一般に、
用量は、ブロモクリプチン療法におげ句イムノアッセイ
で常法通り測定したとき、約５〜２５　”９　／　ｒｎ
ｅという基準レベルまで、血漿プロラクチン濃度を減少
させるのに有効な量であれば、充分てあ６〔’５．＋７
ダー（Ｓ、　５ａｎｄｅｒ　）ら、１９８４“ジャーナ
ル・オフ・クリニカル・エンドクリノロシイ・アンド・
メタボリズム（Ｊ、　Ｃｌ　ｉｎｉｃａｌＥｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　）　
’　５９　（５）　：　９４１−９４８：Ｓ、ウインタ
ーズ（Ｓ、Ｗｉｎｔｅｒｓ　）ら、１９８４１クリニカ
ル・エンドクリノロシイ（Ｃ１Ｃ１１ｎｉｃａｌＥｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏ　）　’　２１　：　２５７−２６３
　：およびＡ、クリ／＜　７７．　キイ（Ａ、Ｋ１１ｂ
ａｎｓにｉ）ら、１９８４　’ジャーナル・オフ・クリ
ニャル・エンドクリノロシイ・アンド・メタボリズム’
　　５８（６）：１１４１−１１４７］。

ＣＴＣ組成物は、獣医学分野でも、弔−に、分娩後の動
物に忘ける月経の再開を早め、乳汁分泌を調整するとい
う点で、有用である。経済的意義のめ０目的に沿った乳
汁分泌調整作用とは、一般に、１）　ＲＬ合成の抑制を
除き、脳Ｆ垂体から分泌させりだのに、血漿中のｃ’ｒ
ｐレベルを減少させる叩出のことを意味する。このこと
は、例えは乳牛の様な酪農用の水蓄に免疫原性ＣＴ　Ｐ
コンジュゲート（例えは、前記の細菌性タンパク質−Ｃ
ＴＰ融合物または実施例４で述べたＢＳＡ−ＣＴＰフラ
クメント・コンジュゲート）を投与してＣＴＰに対し、
免疫することにより、最も良く達成さ？Ｌ句。

ＣＴＰに対する受動免疫を動物番こけ与するために抗−
ＣＴＰを投与することもあるが、経済上の理由から動物
を積極的に抗免疫化するのが好ましい。動物のＣＴＰの
同定は、特定の種の動物から得たゲノムライブラリィを
実施例２の３２ｐ−標識１５００ｂｐｃ　ＤＮＡフラグ
メントでプローブして該棟におけるＣＴＰ削駆体躯体Ａ
を同定し、得られた動物の遺伝子を配列決定し、次いで
、そイ１を組換え培養内で発現させるか、またはインビ
トロで、そのもの（またはその核フラグメント）を合成
することにより、行う。または、免疫された種のＣＴＰ
を交差反応し得るヒトＣＴＰに対して惹起さイした抗体
も有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト胎盤組織から単離されたプレプロＬＨＲＨ
およびそのｃＤＮＡのアミノ酸配列およびヌクレオチド
配列の模式図である。 第２図はＬＨＲｔ（の単離に用いた、化学合成さ４′シ
たオリゴヌクレオチド、そのＬＨＲＭ　＠躯体の一部と
推定される、延長されたペプチドのアミノ酸配列並びに
、ヒトゲノムライブラリィをプローブするための、ンヨ
ートプローブおよびロングプローブのヌクレオチド配列
の模式図である。 第３図は、第２図の合成ロングプローブを詳細に示した
図であり、そのアミノ酸配列、二本鎖ＤＮＡ配列、並び
に該プローブでクローンさ４ｔた１４個のクローンにお
ける配列上の変異を示す模式図である。 第４図はＬＨｋｌ−１暗号配列を担っている、クローン
されたヒトゲノムＤＮＡセグメントの分析方法を図示し
たものであって、パネルＡはソヨートプローブおよびロ
ングプローブによるサザーン分析による像、パネルＢは
上記のクローン（オリコマ−プール）とハイブリダイズ
した頭載を横切る配列決定ゲルを示す像の模写図てあ口
。 第５図は第１図における、１５００ｂｐ　ｃＤＮＡ単離
体の制限酵素地図、構造上の特徴、並びにアミノ酸配列
を示す模式図である。 第６図はＧＡＰ発現ベクター、ｐｔｒｐＬＥ−ＧＡＰの
組立て模式図である。 第７図はＧＡＰのＰＲＬ阻害活性を示すグラフである。 Ｆ／ｇ、２ ＬＨＲＨ’　（ｐＧｌｕ　Ｈｉ Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｈｉ 処＼ノブＵ−ブ　　　　　　　　　ＧＴ　　ＧＴ≧　　
３　　４　　５　　６　　７　　８　　９　　１０ｓ　
Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐ
ｒｏ　Ｇｌｙ−ＮＨ２ｓ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇ
ｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ”ＡＡ
ＣＣ１０ＧＡＴＡＣＣ Ｇ　　　　ＡＧ　　　　Ｇ ＦｉＱ、３ Ａ　　　　　　　　　　　　　　　ＴＣＡ　　　　　　
　　　　　　　　ＡＧ Ａ　　　　　　　　　　　　　　ＴＣ ＣＴＣ− 〇　　　　　　　　　　　　　　　ＴＣＬｙｓ　　Ａｒ
ｇ　　Ｇｉｎ　　Ｈ７ｓ　　Ｔｒｐ　　Ｓｉｒ　　Ｔｙ
ｒＴ　　　　　　　　　　　　　　ＡＧ ７　　　　　　　　　　　　７Ｃ− Ｇ　　　　　　　　　　　　　　　ＡＧＧ　　　　　　
　　　　　　　　ＴＣＧＧ　　　　　　　　　　　丁Ｃ （３ＡＧ Ｔ　　　　　　　　　　　　　　ＴＣ−Ｔ　　　　　　
　　　　　　　　ＡＧ Ｔ　　　　　　　　　　　　　　ＴＣ−Ｃ−ｍ− ＧＧＣＴＴＧＡＧＧＣＣＴＧＧＣＧＧ　　３’（＋）に
／ｙ　　　Ｌｅｕ　　　Ａｒｇ−Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　　
　に／ｙ　　ぺ１−ｙ−ｙＧ　　　　　　　　　　　　
− Ｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　［Ｆｉｇ
、４ ｂ ＡＴＣ Ｎく

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＣＴＰアミノ酸配列を含有しているポリペプチドか
   らなる、細胞不含の組成物。 ２、ポリペプチドがＣＴＰである第１項記載の組成物。 ３、ポリペプチドが天然のプロＬＨＲＨである第１項記
   載の組成物。 ４、ポリペプチドが検出可能なマーカーで標識されてい
   る第１項記載の組成物。 ５、ポリペプチドが標識されたＣＴＰフラグメントであ
   る第４項記載の組成物。 ６、プロＬＨＲＨおよびＬＨＲＨを含まず、ＣＴＰアミ
   ノ酸配列を含んでいるポリペプチドからなる組成物。 ７、ＣＴＰアミノ酸配列を含有しているポリペプチドの
   合成方法であつて、 （ａ）該ポリペプチドをコードしていることが知られて
   いるベクターで宿主細胞を形質転換し；次いで、 （ｂ）該細胞を培養することからなる方法。 ８、ポリペプチドがＣＴＰまたはＣＴＰと他のポリペプ
   チドとの融合物である第７項記載の方法。 ９、融合物が、ＣＴＰのＮ末端に微生物性ポリペプチド
   が結合したものであるか、または、ＣＴＰのＣ末端にト
   リペプチドｌｙｓ−ｌｙｓ−ｉｌｅか結合したものであ
   る第８項記載の方法。 １０、微生物性ポリペプチドが、ＣＴＰを分泌させるた
   めにＣＴＰと機能的に結合した細菌性シグナルである第
   ９項記載の方法。 １１、融合物がＬＨＲＨとの融合物である第８項記載の
   方法。 １２、宿主細胞が酵母または細菌細胞である第７項記載
   の方法。 １３、第１項記載のポリペプチドをコードしているＤＮ
   Ａであつて、それが第１図のポリペプチドをコードして
   いるときには、そのイントロンの内、少くとも１個のイ
   ントロンを含んでいないことを特徴とするＤＮＡ。 １４、第１項記載のポリペプチドをコードしているＤＮ
   Ａであつて、それが第１図のポリペプチドをコードして
   いるときには、該ＤＮＡは染色体外ＤＮＡである第１項
   記載のＤＮＡ。 １５、複製可能なベクターに機能的に結合している第１
   ４項記載のＤＮＡ。 １６、第１５項記載のベクターで形質転換された宿主細
   胞。 １７、第１項記載の組成物を哺乳類に投与する方法。 １８、組成物が、ポリペプチドが予め定められた速度で
   拡散し得る半透過性の隔壁を含むものである第１７項記
   載の方法。 １９、ポリペプチドが、実質的に、ＣＴＰまたはプロＬ
   ＨＲＨからなるものである第１７項記載の方法。 ２０、哺乳類が過プロラクチン血症の動物である第１７
   項記載の方法。 ２１、哺乳類が性機能不全または無月経の動物である第
   ２０項記載の方法。 ２２、哺乳類宿主がプロラクチン依存性新生物を有して
   いる動物である第１７項記載の方法。 ２３、免疫原性コンジユゲートとして、ＣＴＰ、ＣＴＰ
   融合物またはそのフラグメントを含有している組成物。 ２４、ワクチンに含まれている第２３項記載の組成物。 ２５、ワクチン用アジユバントを含む、第２４項記載の
   組成物。 ２６、アジユバントがフロインドのアジユバントである
   第２５項記載の組成物。 ２７、ＣＴＰ、ＣＴＰ融合物またはそのフラグメントが
   免疫原性タンパク質と共有結合的に交差結合している第
   ２３項記載の組成物。 ２８、ＣＰＴに対する抗体を惹起させるのに充分な量の
   、第２３項記載の組成物を投与することからなる方法。 ２９、動物が酪農用の動物である第２８項記載の方法。 ３０、抗−ＣＴＰを含有する組成物。 ３１、抗−ＣＴＰが検出可能なマーカーで標識されてい
   るか、または、不溶化されていることを特徴とする第３
   ０項記載の組成物。 ３２、被検試料を得、該試料中のＣＴＰ量を測定する方
   法。