JP3406294B2 - Ａｃｓｆ及びそのアンタゴニスト - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ポリペプチドＡＣ
ＳＦ(アデニル酸シクラーゼ刺激因子)、およびインビボ
でＡＣＳＦの活性に拮抗する物質に関する。特に、本発
明は、ＡＣＳＦをコードしているＤＮＡ、およびそのよ
うなＤＮＡを用いてＡＣＳＦおよびそのポリペプチドア
ンタゴニスト(アミノ酸配列変異体および選択したＡＣ
ＳＦエピトープに対して指向性である抗体を含む)を製
造する方法に関する。また、本発明は、特に種々の新生
物に付随する過カルシウム血症を治療するためのＡＣＳ
Ｆアンタゴニスト(拮抗物質)を含有する治療組成物に関
する。

【０００２】種々の癌、最も一般的には乳癌、肺癌およ
び皮膚癌が、非転移性の骨破壊および血清過カルシウム
血症(悪性の体液性過カルシウム血症、またはＨＨＭ)と
臨床的に関連しているが、この現象はこれらの癌に限定
されるものでは決してない。ＨＨＭの原因であると従来
考えられていた腫瘍細胞から放出される可溶性因子に
は、形質転換成長因子、副甲状腺ホルモン、プロスタグ
ランジン、およびその他の比較的その特徴がわかってい
ない因子が含まれる。この対象に関する広範囲な概説に
ついては、マンディーら[Mundy et al.,New England Jo
urnal of Medicine 310：1718 (1984)]を参照。さらに
最近になって、ネズミ腫瘍、ラットライディヒ細胞およ
びヒトＨＨＭ腫瘍から部分的に精製された物質に関する
報告が為されたが、この物質は副甲状腺ホルモン(ＰＴ
Ｈ)受容体を刺激し、アデニル酸シクラーゼ活性を発揮
し、ＰＴＨアンタゴニストＮle⁸ヽ¹⁸、Ｔyr³⁴-ウシＰＴ
Ｈ(３-３４)アミドによって阻害され、そして３０〜４
０ kＤの範囲の分子量を有している[ロダンら(Rodan et
al., J.Clin.Invest. 72：1511 (1983))；ストリュー
ラーら(Strewler et al., J.Clin.Invest. 71：769(198
3))；スチュワートら(Stewart et al.,Clin.Res. 32：4
10A (1984))；メレンジノら（Merendino et al.,Scienc
e 231：388 (1986))；インソグナら（Insogna et al.,
Endocrinology 120：2183 (1987))；スチュワートら(St
ewart et al., J.Bone and Mineral Research 1：267
(1986))；およびバーチスら(Burtis et al., Endocrino
logy 118：1982 (1986))]。これら因子のアミノ酸配列
データはこれらの著者によって開示されておらず、ま
た、候補因子の多数は分子レベルで説明されていなかっ
た。

【０００３】本願出願日の時点で未公表の研究におい
て、マーチン（T.J.Martin)らはＨＨＭ偏平上皮癌(ＢＥ
Ｎ)細胞抽出物からＡＣＳＦを均質になるまで精製し、
この因子のアミノ末端のアミノ酸配列を次のように決定
した：

【化１】 １ 11 ＊＊＊ 21 ＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧＫＳＩＱＸＦＥＲＲＦＦＬ 不確定の残基はアステリスクで示している。

【０００４】この配列からの最初の１７残基に基づくペ
プチド類似体を合成した：Ａla-Ｖal-Ｓer-Ｇlu-Ｈis-
Ｇln-Ｌeu-Ｇlu-Ｈis-Ａsn-Ｃys ｛[Ｇlu⁸、Ａsn¹⁰、Ｃ
ys¹¹]ＡＣＳＦ(１-１１)｝、Ａla-Ｖal-Ｓer-Ｇlu-Ｈis
-Ｇln-Ｌeu-Ｌeu-Ｈis-Ａsn-Ｌys-Ｇly-Ｌys-Ｓer-Ｉle
-Ｇln｛[Ａsn¹⁰]ＡＣＳＦ(１-１６)｝、および[Ａs
n^{1 0}、Ｔyr¹⁷]ＡＣＳＦ(１-１７)。類似体［Ｇlu⁸、Ａsn
¹⁰、Ｃys¹¹]ＡＣＳＦ(１-１１)および[Ａsn¹⁰]ＡＣＳＦ
(１-１６)はアデニル酸シクラーゼ検定において不活性
であり、ＰＴＨそれ自体またはＢＥＮ細胞由来の培養液
の作用に拮抗しなかった。大豆トリプシン阻害物質とコ
ンジュゲートさせた[Ｇlu⁸、Ａsn¹⁰、Ｃys¹¹]ＡＣＳＦ
(１-１１)を用いてウサギをＡＣＳＦに対して免疫し、
得られた抗血清を放射免疫検定に用いた。

【０００５】ＨＨＭに苦しんでいる患者を治療するため
には、ＡＣＳＦのアンタゴニストを得る必要がある。Ａ
ＣＳＦの完全なアミノ酸配列を得るためにＡＣＳＦをコ
ードしているＤＮＡを得るのが本発明の第１の目的であ
る。これにより、組換え細胞の培養においてＡＣＳＦお
よびＡＣＳＦアンタゴニストを製造するのが容易にな
る。さらに、ＡＣＳＦのＣ-末端配列はＡＣＳＦのこの
領域に特異的な抗体を製造することを可能にし、それに
よってＡＣＳＦの免疫検定を改善する。これらおよび本
発明の他の目的は本明細書全体を検討することによって
明らかとなろう。

【０００６】本発明の目的は、ＡＣＳＦをコードしてい
る核酸を得、この核酸で宿主細胞を形質転換し、そして
宿主細胞を培養してＡＣＳＦを培養液中に発現させるこ
とによって達成される。細胞培養液からＡＣＳＦを回収
するのが好ましい。

【０００７】厳格性(ストリンジェンシー)の低い条件下
でＡＣＳＦをコードしているＤＮＡとハイブリダイズす
る核酸を用意する。ＡＣＳＦをコードしているかもしれ
ないし、またコードしていないかもしれないこの核酸を
プローブに用いてcＤＮＡライブラリー、mＲＮＡ調製
物、またはゲノムＤＮＡライブラリー中のＡＣＳＦをコ
ードしている核酸を同定する。

【０００８】本当にＡＣＳＦをコードしている核酸を、
ハイブリダイズさせる核酸と同じ目的でプローブとして
用いる。ウイルスまたはプラスミドなどの発現ベクター
中に挿入し、続いて細菌、酵母または哺乳動物細胞など
の宿主細胞中にトランスフェクションし、そしてこの形
質転換体をＡＣＳＦの発現のために培養するとＡＣＳＦ
の発現を可能にする別の機能を提供する。

【０００９】本発明の範囲内に含まれるのはＡＣＳＦア
ンタゴニストである。そのようなアンタゴニストには、
ＡＣＳＦの生物学的活性を中和することができる抗体
(ポリクローナルまたはモノクローナル)、アンタゴニス
トアミノ酸配列変異体、または患者においてインビボで
中和抗体を生成させることができるＡＣＳＦ免疫原が含
まれる。

【００１０】治療用のＡＣＳＦアンタゴニスト組成物も
提供されるが、これはＨＨＭの治療に有用である。これ
らの組成物には、所望により、ＴＧＦ-αアンタゴニス
ト、ＥＧＦアンタゴニストおよびＰＴＨアンタゴニスト
などの追加の治療物質が含まれる。

【００１１】ＡＣＳＦのＣ-末端は本明細書中に記載さ
れている。この領域は、ＰＴＨとのいかなる相同配列を
も有していないアミノ酸配列を含んでいる。このＡＣＳ
ＦのＣ-末端領域は、ＰＴＨと交差反応しない抗体、従
ってＡＣＳＦの免疫検定において、特にＮ-末端エピト
ープとＣ-末端エピトープに対する抗体を用いるサンド
イッチ型の免疫検定において特に有用な抗体を製造する
のに有用である。また、Ｃ-末端領域に対する抗体は、
ＨＨＭまたは同様の後遺症を有する症状の治療にも有用
であろう。

【００１２】本発明のために、ＡＣＳＦとは、生物学的
に活性であり、かつ図２（配列番号３）に示したアミノ
酸配列を有している一群のタンパク質またはポリペプチ
ド、並びに、図２の配列の置換、削除または挿入変異体
であるタンパク質またはポリペプチドであって、ＰＴＨ
またはその既知のアゴニストまたはアンタゴニスト類似
体を除くものと定義する。

【００１３】構造的には図２の配列は、３１残基のシグ
ナル、これに続く５残基の塩基性プロ配列、および完全
なＡＣＳＦ配列からなるプレＡＣＳＦを示している。完
全なＡＣＳＦは３つの主領域を含んでいる。これらの最
もＮ-末端側、即ち、およそ残基１から残基８３までに
わたるＮ-末端領域と呼ばれる領域は、一部がＰＴＨに
相同である配列を含んでおり、従ってＡＣＳＦのＰＴＨ
受容体結合機能を含んでいるであろう。これに続くＣ-
末端方向に、およそ残基８４から１０８までにわたる塩
基性ペプチドと呼ばれる塩基性の高い領域があり、そし
て最後に、およそ残基１０９から１４１までにわたって
Ｃ-末端ペプチドがある。このＣ-末端ペプチドは、ＰＴ
Ｈ活性に起因しないＨＨＭの１またはそれ以上の作用、
例えば血漿１,２５−ジヒドロキシビタミンＤの減少、
カルシウムの消化管吸着、および腎臓細管のカルシウム
再吸着、並びに骨形成障害の原因であることもある。

【００１４】生物学的に活性とは、ＡＣＳＦタンパク質
またはポリペプチドが図２のアミノ酸配列を有するＡＣ
ＳＦの少なくとも１つの既知または固有の活性を発揮す
る性質を有するか、または、そのような活性を有してい
ないときには、(a)該活性に対してアンタゴニスト的に
作用するか、または(b)図２の配列を有するＡＣＳＦに
対して生成させた抗体と交差反応することができること
を意味する。

【００１５】抗-ＡＣＳＦ抗体を生成させる能力を別に
すると、既知のＡＣＳＦの生物学的活性には、１または
それ以上のアデニル酸シクラーゼ刺激活性、ＰＴＨ受容
体結合活性、および骨再吸収活性が含まれる。好ましく
は、ＡＣＳＦは骨芽細胞様の細胞における環状ＡＭＰの
用量依存性の生成を用いる生物学的な系で検定され、一
方、アンタゴニストは過カルシウム血症を示すＢＥＮ細
胞を有するヌードマウスにおいて、またはラットのライ
ディヒ細胞モデルにおいて最も直接的に検定される。検
定を行うことが可能ないくつかの方法が存在するが、こ
れには骨芽細胞様の細胞の膜ホモジネート中のアデニル
酸シクラーゼ活性の直接測定、および無傷細胞によって
生成される環状ＡＭＰの検定が含まれる。簡単で便利な
ように、そして極めて多数の試料の検定を容易にするた
め、培養培地で被験試料を数段階に希釈し、ＵＭＲ１０
６-０１[マーチンら（Martin et al., Nature 260：436
(1976))]細胞を対照および試験培地を入れた１２ウェ
ルのプラスチック皿中で複製培養物として増殖させ、³
Ｈ-アデニンとともに２時間プレインキュベートするこ
とによって細胞のＡＴＰプールを³Ｈでラベルし、細胞
を簡単に洗浄し、次いで１mＭのイソブチルメチルキサ
ンチン、ホスホジエステラーゼ阻害物質を加えることに
よって応答を検定する。１０分後に反応を停止させ、ダ
ウエックス(Dowex)(登録商標)および中性アルミナの連
続クロマトグラフィーでインキュベート物から³Ｈ-環状
ＡＭＰを精製する。細胞は、環状ＡＭＰ生成の用量依存
性の増加を伴ってＰＴＨおよびＥシリーズのプロスタグ
ランジン(主にＰＧＥ２)に応答する。この検定でのＰＴ
Ｈに対する応答(ＰＧＥ２に対する応答を除く)は、ＰＴ
Ｈのペプチドアンタゴニスト[クボタら（Kubota et a
l., J.Endocrinology 108：261 (1986))]または合成ヒ
トＰＴＨ(１-３４)に対して調製されたＰＴＨに対する
他の抗血清との試料の前インキュベートによって阻害さ
れる。

【００１６】図２の配列の置換、削除、または挿入変異
体は１またはそれ以上の次の活性、即ちＡＣＳＦアンタ
ゴニスト、ＡＣＳＦアゴニスト、または抗-ＡＣＳＦ交
差反応性を有しているであろう。図２で示されるヒトＡ
ＣＳＦ配列の動物類似体(例えば、ウシまたはブタＡＣ
ＳＦ)、およびこのようなＡＣＳＦの種変異体のアレル
変異体はＡＣＳＦ活性を有しているであろうが、通常、
自体既知の方法に従って、上記のインビトロまたはイン
ビボ生物検定でそれぞれの構築物をスクリーニングする
こと、または構築物を免疫検定プロトコールで用いてそ
のＡＣＳＦ交差反応性を測定することが必要であろう。

【００１７】ＡＣＳＦアンタゴニストおよびアゴニスト
活性は、候補の連続希釈を図２の完全配列を有するＡＣ
ＳＦを含む培養培地で行うことを除き、ＡＣＳＦと同じ
方法によるＵＭＲ細胞生物検定で測定するのが好まし
い。アンタゴニストは試験細胞におけるＡＣＳＦ媒介の
cＡＭＰ生成を抑制するその能力によって同定され、ア
ゴニストはその刺激作用によって同定される。

【００１８】また、図２のＡＣＳＦに対する免疫化によ
ってウサギに生成させた抗血清と免疫学的に交差反応性
であるＡＣＳＦ変異体もＡＣＳＦ免疫原として有用であ
ろう。ＡＣＳＦ免疫原は、図２のＡＣＳＦと交差反応す
る抗血清をウサギにおいて生成させるその能力によって
同定される。通常の免疫化プロトコールを用い、フロイ
ンド完全アジュバント中の候補調製物をウサギに皮下接
種し、次に、同じ投与経路でフロインド不完全アジュバ
ント中の連続ブースターを接種する。ＡＣＳＦを明ばん
と配合するか、またはそれをグルタルアルデヒドで架橋
して、検出可能な力価を有する応答を生じさせることが
必要となろう。最初の接種後の最初の月の終わりに、お
よびそれに続く２カ月のそれぞれの終わりに動物を抗-
ＡＣＳＦについて検定する。

【００１９】通常、ＡＣＳＦのアミノ酸配列変異体は、
図２に示した残基番号に基づくと、次の成熟ＡＣＳＦ配
列内のアミノ酸残基の置換、削除、または挿入によって
特徴付けられる：即ち、１−３４、５０、５３、７９、
および８１−１４１。

【００２０】挿入は、示した残基のＮまたはＣ-末端ペ
プチジル結合のいずれかに隣接して導入され、好ましく
は対で導入される。通常、挿入は１〜約３０残基の範囲
であろうが、２が好ましい挿入である。しかし、免疫原
性の配列の挿入が所望であるときには、この挿入はその
目的に適したあらゆる大きさのものであってよく、１０
０残基を越えることも多い。通常、ＡＣＳＦ免疫原は挿
入変異体であり、免疫原性の配列がＡＣＳＦまたは標的
エピトープを有するそのフラグメントのＮまたはＣ末端
に導入される。例えば、大腸菌（Ｅ.coli)のtrpＤ、trp
Ｅまたはブドウ球菌のプロテインＡ遺伝子の免疫原性フ
ラグメントをコードしているＤＮＡをその５'または３'
末端で、ＡＣＳＦをコードしているＤＮＡの５'または
３'末端に連結し、組換え細胞培養物中で発現させてＡ
ＣＳＦ免疫原を調製する。例えば、塩基性ペプチドおよ
びＣ-末端ペプチドを含有している領域をＮ-末端残基の
ところで免疫原性ポリペプチド(通常は細菌性のポリペ
プチド)のＣ-末端残基に結合させて、ＡＣＳＦのＣ-末
端領域に対する抗体を生成させうる免疫原を調製する。

【００２１】同様に、ＡＣＳＦの約８４から１０７にわ
たる残基のＮ-末端にシグナル配列を挿入すると（場合
によっては、ＡＣＳＦの残基１−８３から１０６までの
削除を伴って)、組換え細胞培養物からＡＣＳＦのＣ-末
端領域を分泌させるのに有用であろう。をコードしてい
るＤＮＡの発現アルカリホスファターゼまたはＳＴ−II
エンテロトキシンの配列、または酵母α因子シグナル、
[Ｖ２ＧＧＳ３]ＡＣＳＦ(１−１４１)；[Ｖ２ＳＳ３]Ａ
ＣＳＦ(１−１４１)；[Ｖ２ＥＫＡ３]ＡＣＳＦ(１−１
４１)；[Ｇ１２３ＰＰＤ１２４]ＡＣＳＦ(３−１４
１)；[Ｓ１３０ＦＹＴ１３１]ＡＣＳＦ(３−１４１)；
[Ｒ１３９ＤＹＲ１４０]ＡＣＳＦ(３−１４１)；[Ｖ２
ＡＧＳ３]ＡＣＳＦ(１−１４１)；[Ｔ１３２ＫＫＫＳ１
３３]ＡＣＳＦ(１−１４１)；[Ｓ３ＥＥＥ４]ＡＣＳＦ
(１−３４)；[Ｅ４ＩＨ５]ＡＣＳＦ(１−３４）；[Ｅ４
ＩＨ５ＤＱ６]ＡＣＳＦ(１−３４）；および[Ｐ４４Ｄ
Ｎ４５]ＡＣＳＦ(１−１４１)に対して。このような変
異体は、ＡＣＳＦアゴニストまたはアンタゴニスト活性
を示さない程度で、ＡＣＳＦに対する抗体と交差反応
し、従ってＡＣＳＦの免疫原として、またはＡＣＳＦ免
疫検定において標準もしくは対照として用いるのに有用
となろう。多数の変異体が置換、削除および挿入の組合
せを含んでいることは明らかであろう。

【００２２】また、ＡＣＳＦの削除変異体は本明細書中
の組換え法によって調製することができる。削除変異体
ＡＣＳＦ(１−８３)およびＡＣＳＦ(１−３４)はＰＴＨ
活性を有している。その他の削除変異体には、ＡＣＳＦ
(１−８４、１０９−１４１)、ＡＣＳＦ(１−３４、４
０−１４１)、ＡＣＳＦ(１−５０、６０−１４１)、Ａ
ＣＳＦ(１−７５、８４−１４１)、ＡＣＳＦ(１−１０
９)、ＡＣＳＦ(３−３４)、ＡＣＳＦ(４−３４)、ＡＣ
ＳＦ(５−３４)、ＡＣＳＦ(６−３４)、およびＡＣＳＦ
(３−１２４)が含まれる。好ましい削除はおよその残基
１−３５および８５−１４１のもの、またはその範囲内
のものである(通常、３４以降のＡＣＳＦ残基は削除変
異体中に存在しているであろう)。このような変異体は
ＡＣＳＦエピトープを含有しているので、ＡＣＳＦに対
するアゴニストまたはアンタゴニストではない程度に、
ＡＣＳＦに対する抗体と交差反応するであろう。さら
に、ＡＣＳＦからの削除であってその場所にＰＴＨ由来
の類似配列が挿入されているもの、例えばＰＴＨ(７−
３４)ＡＣＳＦ(３５−１４１)あるいはＰＴＨ(３−３
４)ＡＣＳＦ(３５−１４１)が含まれる。

【００２３】最も普通にはＡＣＳＦの変異体は置換変異
体であり、ＡＣＳＦ中の少なくとも１つの残基が削除さ
れ、別の残基がその位置に挿入されているものであろ
う。通常、置換は次の表に従って行われる：

【表１】元の残基 代表的な置換 Ａla gly；ser Ａrg lys Ａsn Gln；his Ａsp glu Ｃys ser Ｇln asn Ｇlu asp Ｇly ala Ｈis asn；gln Ｉle leu；val Ｌeu ile；val Ｌys arg；gln；glu Ｍet leu；ile Ｐhe met；leu；tyr Ｓer thr Ｔhr ser Ｔrp tyr Ｔyr trp；phe Ｖal ile；leu

【００２４】表１のものより保存性が少ない置換を選択
することによって、即ち、(a)置換領域におけるポリペ
プチド骨格の構造、例えばシートまたは螺旋の立体配
座、(b)標的部位における分子の電荷または疎水性、ま
たは(c)側鎖の大きさ、を維持するその作用がもっと有
意に異なっている残基を選択することによって、機能ま
たは免疫学的な独自性の実質的な変換が行われる。通
常、ＡＣＳＦの性質に最大の変化をもたらすと予想され
る置換は、(a)親水性の残基(例えば、セリルまたはトレ
オニル)が、疎水性の残基(例えば、ロイシル、イソロイ
シル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル)に代
えて(または、によって)置換されているもの；(b)プロ
リンが他のいずれかの残基に代えて(または、によって)
置換されているもの；(c)電気陽性の側鎖を有する残基
(例えば、リジル、アルギニルまたはヒスチジル)が、電
気陰性の残基(例えば、グルタミルまたはアスパルチル)
に代えて(または、によって)置換されているもの；また
は(d)大きな側鎖を有する残基(例えば、フェニルアラニ
ン)が、そのような側鎖を有さない残基(例えば、グリシ
ン)に代えて(または、によって)置換されているもので
あろう。

【００２５】代表的な置換変異は、残基１−９、１２−
１５、２０、２３−２８、３１−３２、４９−５０、５
３、５９−６１、７９−８２、８６−９８、１０４−１
０５、１１５、１１８、１２０、１２３、１２７−１３
３、および１３９−１４０のいずれかに導入されるが、
１−９および１０９−１４１が好ましい。その例には、
[ＭＹ１]ＡＣＳＦ(１−１４１)、［ＭＰ１]ＡＣＳＦ(１
−１４１)、［ＭＧ１]ＡＣＳＦ(１−１４１)、［Ｆ２]
ＡＣＳＦ(１−１４１)、［Ｙ２]ＡＣＳＦ(１−１４
１)、[Ｈ２]ＡＣＳＦ(１−１４１)、[Ｄ３]ＡＣＳＦ(１
−１４１)、[Ｙ３]ＡＣＳＦ(１−１４１)、［Ｈ３]ＡＣ
ＳＦ(１−１４１)、［Ｋ２０]ＡＣＳＦ(１−１４１)、
［Ｅ１９]ＡＣＳＦ(１−１４１)、［Ｖ２１]ＡＣＳＦ
(１−１４１)、[Ｄ２０]ＡＣＳＦ(１−１４１)、[Ｙ２
４]ＡＣＳＦ(１-１４１)、[Ｋ２５]ＡＣＳＦ(１−１４
１)、[Ｅ２５]ＡＣＳＦ(１−１４１)、［Ｍ３１]ＡＣＳ
Ｆ(１−１４１)、［Ｙ３４]ＡＣＳＦ(３−１４１)、
［Ｉ８、Ｉ１８、Ｙ３４]ＡＣＳＦ(３−１４１)、[Ｉ
８、Ｉ１８、Ｙ３４]ＡＣＳＦ(３−３４)、[Ｄ７９]Ａ
ＣＳＦ(１−１４１)、[Ｐ９８]ＡＣＳＦ(１−１４１)、
[Ｐ１０５]ＡＣＳＦ(１−１４１)、[Ｙ９０]ＡＣＳＦ
(１-１４１)、[Ｗ８９]ＡＣＳＦ(１-１４１)、[Ｈ９６]
ＡＣＳＦ(１-１４１)、[Ｆ１１０]ＡＣＳＦ(１０６−１
４１)、[Ｙ１１７]ＡＣＳＦ(１０６−１４１)、［Ｄ１
２２]ＡＣＳＦ(１０６−１４１)、[Ｋ１２５]ＡＣＳＦ
(１０６−１４１)、[Ｙ１３２]ＡＣＳＦ(１０６−１４
１)、[Ａ１３３]ＡＣＳＦ(１０６−１４１)、および[Ｄ
１４１]ＡＣＳＦ(１０６−１４１)が含まれる。これら
の変異体はＡＣＳＦのエピトープを含んでおり、従って
これらが保持していることもあるアゴニストまたはアン
タゴニスト活性にかかわらず免疫原または免疫検定試薬
として有用となろう。

【００２６】ほとんどの削除および挿入、並びに特に置
換は、ＡＣＳＦ分子の性質に激変をもたらさないであろ
う。しかし、置換、削除または挿入の正確な効果をそれ
を行う前に予測することが困難であるとき、例えばＰＴ
Ｈ受容体結合領域または免疫エピトープを修飾するとき
には、通常のスクリーニング検定によってその効果を評
価するのは当業者の認識するところであろう。例えば、
変異体は通常、天然のＡＣＳＦをコードしている核酸の
部位特異的な突然変異誘発、組換え細胞培養での変異核
酸の発現、および所望により、細胞培養物からの精製
(例えば、少なくとも１つの残存免疫エピトープによっ
て変異体を吸着させるためのウサギポリクローナル抗-
ＡＣＳＦカラムへの免疫アフィニティー吸着による)に
よって調製される。これとは異なり、低分子量の変異体
(例えば、約５０以下の残基を有する変異体)はインビト
ロ合成法によって調製するのが好都合である。この方法
は非天然のアミノ酸(例えば、Ｄ-アミノ酸)をＡＣＳＦ
配列中に導入する機会を与える。次いで、合成変異体、
細胞溶解液または精製されたＡＣＳＦ変異体の活性を、
目的の性質に対して適切なスクリーニング検定で調べ
る。例えば、ある抗体に対する親和性などのＡＣＳＦの
免疫学的性質の変化は競合型の免疫検定で測定する。イ
ンビボでのＡＣＳＦの機能がさらにわかったときには、
他の検定がスクリーニングに有用となるであろうが、ア
デニル酸シクラーゼ刺激活性の変化は生物検定で測定す
る。その他のＡＣＳＦの性質、例えば酸化還元もしくは
熱安定性、pＩ、疎水性、タンパク質加水分解に対する
感受性、または担体と、もしくはマルチマーに集合する
傾向などの修飾は当業者には周知の方法によって検定さ
れる。

【００２７】ＡＣＳＦ分子の共有結合修飾が本発明の範
囲内に含まれる。このような修飾は、回収したタンパク
質の標的アミノ酸残基を、選択した側鎖または末端残基
と結合させることができる有機誘導化試薬と反応させる
ことによって、または選択した組換え宿主細胞中で機能
する翻訳後修飾の機序を利用することによって、コード
された分子中に導入される。得られた共有結合誘導体
は、生物学的活性にとって重要な残基を同定することを
目的とする計画において、または免疫原として有用であ
る。例えば、ニンヒドリンと反応させた後のタンパク質
の生物学的活性の完全な不活性化は、少なくとも１つの
アミノ基がその活性に必須であることを示唆し、その
後、選択した条件下で修飾された個々の残基が修飾アミ
ノ酸残基を含むペプチドフラグメントの単離によって同
定される。

【００２８】システイニル残基は、最も普通にはα-ハ
ロアセテート類(および対応のアミン類)、例えばヨウ化
酢酸またはヨウ化アセトアミドと反応させてカルボキシ
メチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。ま
た、システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセト
ン、α−ブロモ−β−(５−イミドゾイル)プロピオン
酸、クロロアセトールホスフェート、Ｎ−アルキルマレ
イミド類、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メ
チル ２−ピリジルジスルフィド、p−クロロマーキュリ
ベンゾエート、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェ
ノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−
１,３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
真正のＡＣＳＦはシステイン残基を欠いているので、有
機誘導体化は、挿入または置換システイン含有のＡＣＳ
Ｆ変異体、例えば免疫原性ペプチドに対する架橋を容易
にするためにＮまたはＣ-末端システインが挿入された
ＡＣＳＦまたはそのフラグメントに対してのみ適用が可
能である。

【００２９】ヒスチジル残基はpＨ５.５〜７.０でのジ
エチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化する
のが好ましいが、これはこの試薬がヒスチジル側鎖に対
して比較的特異的であるからである。パラ−ブロモ−フ
ェナシル ブロミドも有用である；この反応は０.１Ｍカ
コジル酸ナトリウム中、pＨ６.０で行うべきである。

【００３０】リジニルおよびアミノ末端残基はコハク酸
またはその他のカルボン酸無水物と反応させる。これら
の試薬による誘導体化はリジニル残基の電荷を逆にする
作用を有している。αアミノを含有している残基を誘導
体化するのに適したその他の試薬には、メチル ピコリ
ンイミデートなどのイミドエステル類；ピリドキサルホ
スフェート；ピリドキサル；水素化ホウ素類；トリニト
ロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２,４−
ペンタンジオン；およびグリオキシレートとのトランス
アミナーゼ触媒の反応が含まれる。

【００３１】アルギニル残基はいくつかの通常の試薬、
例えばフェニルグリオキサル、２,３-ブタンジオン、
１,２-シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンなどの
いずれかとの反応によって修飾される。アルギニン残基
の誘導体化は、グアニジン官能基の高いpＫaの故に反応
をアルカリ条件で行うことを必要とする。さらに、これ
ら試薬はリジンの基、並びにアルギニンのε-アミノ基
と反応することもある。

【００３２】チロシル残基自体の特異的な修飾が、芳香
族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反
応によってチロシル残基にスペクトル標識を導入するの
に特別の興味を持って、広範囲に研究された。最も普通
には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメ
タンを用いてＯ−アセチル チロシル種および３−ニト
ロ誘導体をそれぞれ得る。¹²⁵Ｉまたは¹³¹Ｉを用いてチ
ロシル残基をヨウ素化し、放射免疫検定で用いるための
ラベルされたタンパク質を調製するが、この目的のため
にはクロラミンＴ法が自体広く採用される。

【００３３】カルボキシル側鎖(アスパルチルまたはグ
ルタミル)は、カルボジイミド類(Ｒ'−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−
Ｒ')、例えば１−シクロヘキシル−３−(２−モルホリ
ニル−(４)−エチル)カルボジイミドまたは１−エチル
−３−(４−アゾニア−４,４−ジメチルペンチル)−カ
ルボジイミドなどとの反応によって選択的に修飾され
る。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基はアン
モニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよび
グルタミニル残基に変換されるが、これは核酸を突然変
異させてアスパラギンおよびグルタミンをコードさせる
別法である。

【００３４】二官能性試薬による誘導体化は、タンパク
質と免疫原性ポリペプチドとの分子間集合体を調製する
のに、並びに、抗体のアフィニティー精製または検定で
用いるための水不溶性の支持体マトリックスまたは表面
にタンパク質を架橋させるのに有用である。さらに、鎖
内架橋の研究は立体配座構造の直接的な情報を与えるで
あろう。通常用いられる架橋剤には、１,１−ビス(ジア
ゾアセチル)−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒ
ド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、例えば
４−アジドサリチル酸とのエステル類、ホモ二官能性イ
ミドエステル類、例えば３,３'−ジチオビス(スクシン
イミジル−プロピオネート)などのジスクシンイミジル
エステル類、および二官能性のマレイミド類、例えばビ
ス−Ｎ−マレイミド−１,８−オクタンが含まれる。メ
チル−３−[(p−アジド−フェニル)ジチオ]プロピオイ
ミデートなどの誘導体化試薬は、光の存在下で架橋を形
成させることができる光活性化しうる中間体を与える。

【００３５】さらに、米国特許Ｎo.3,969,287；3,691,0
16；4,195,128；4,247,642；4,229,537および4,330,440
に記載されている反応性基質、および臭化シアン活性化
した炭水化物などの反応性の水不溶性マトリックスがタ
ンパク質の固定化に用いられる。

【００３６】ある種の翻訳後の誘導体化は、発現された
ポリペプチドに及ぼす組換え宿主細胞の作用の結果であ
る。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は翻訳後に
脱アミド化されて対応のグルタミルおよびアスパルチル
残基になることが多い。別法によれば、これらの残基は
穏やかな酸性条件下で脱アミドされる。これら残基のい
ずれの形態も本発明の範囲内に入る。

【００３７】その他の翻訳後修飾には、プロリンおよび
リジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基
のヒドロキシル基のホスホリル化、リジン、アルギニン
およびヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[クレイ
トン(T.E.Creighton, Proteins：Structure and Molecu
lar Properties, W.H.Freeman & Co., San Franciscop
p.79-86 (1983))]、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およ
びある場合にはＣ-末端カルボキシルのアミド化が含ま
れる。

【００３８】ＡＣＳＦは組換え細胞培養物中での合成に
よって調製するのが好ましい。そうするためには、第１
にＡＣＳＦをコードしている核酸を入手することが必要
である。最終的に決定されたＡＣＳＦをコードしている
ヒトcＤＮＡの配列は図２に示されている。このＤＮＡ
が同定されたときには、ヒトＤＮＡのゲノムライブラリ
ーへの核酸ハイブリダイゼーションによって、または、
別の動物種のＡＣＳＦをコードしているＤＮＡを得るの
が所望であるときには、放射ホスホリル化したλＢＲＦ
５２ cＤＮＡを用いる該種の細胞由来のＤＮＡライブラ
リーのハイブリダイゼーションによって、上記核酸を得
るのは当業者には自明のことである。標的ＤＮＡに対し
て完全に相同であるか、または相同性が高い相補体であ
る極めて長い合成プローブの調製を図２が可能にしてい
るので、ここでのハイブリダイゼーション分析は簡単な
ことである。

【００３９】ＡＣＳＦ核酸の供給源として選択したゲノ
ムライブラリーまたはcＤＮＡがＡＣＳＦの部分的なク
ローンだけを含んでいることもありうる。これらの部分
的なクローンおよびフラグメントは、部分的なクローン
を重なり合い部分中の選択した制限部位で切断し、所望
のフラグメントをそれぞれ回収し、そして適切な順序お
よび配向でそれらを連結することによって、完全長さの
ＡＣＳＦ ＤＮＡに容易に組み立てられる。必要なら、
失われた配列を供給するためにオリゴヌクレオチドを調
製する。

【００４０】次いで、ＡＣＳＦをコードしている核酸
を、さらにクローニングするための、または発現させる
ための複製可能なベクターに連結する。ベクターは適合
宿主細胞と共同して２つの機能を発揮するのに有用であ
る(宿主-ベクター系)。機能の１つは、ＡＣＳＦをコー
ドしている核酸のクローニングを容易にすること、即ち
必要量の核酸を生産させることである。他の機能はＡＣ
ＳＦを発現させることである。これら機能の１つまたは
両方はベクター-宿主系によって行われる。ベクターは
それらに行わせる機能、並びに、クローニングまたは発
現用に選択した宿主細胞に依存して異なった成分を含有
しているであろう。

【００４１】それぞれのベクターは上に記したようにＡ
ＣＳＦをコードしている核酸を含有しているであろう。
通常、これはアミノ末端が分泌シグナルに結合している
成熟ＡＣＳＦをコードしているＤＮＡであろう。この分
泌シグナルは、通常インビボでヒト細胞からＡＣＳＦを
分泌させるＡＣＳＦプレ配列であるのが好ましい。しか
し、適当な分泌シグナルには、動物ＡＣＳＦ由来のシグ
ナル、ＰＴＨシグナル、ウイルス性シグナル、または同
一もしくは関連の種の他の分泌ポリペプチド由来のシグ
ナルも含まれる。

【００４２】発現およびクローニングベクターは、１ま
たはそれ以上の選択した宿主細胞中でのベクターの複製
を可能にする核酸配列を含んでいる。通常、クローニン
グベクターにおいては、この配列は宿主染色体には依存
せずにベクターの複製を可能にする配列であり、複製起
源または自律的に複製する配列を含んでいる。このよう
な配列は種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知
である。よく知られているプラスミドpＢＲ３２２由来
の複製起源がほとんどのグラム陰性細菌に適しており、
酵母に対しては２μプラスミド起源が、そして種々のウ
イルス性起源(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイル
ス、ＶＳＶまたはＢＰＶ)は哺乳動物細胞中のクローニ
ングベクターに有用である。起源は哺乳動物発現ベクタ
ーには必要ではない。ほとんどの発現ベクターは「シャ
トル(往復)」ベクターである：即ち、少なくとも一群の
生物中で複製が可能であり、発現のために別の生物中に
トランスフェクションすることができる。例えば、ベク
ターを大腸菌中でクローンし、次に同じベクターを、発
現宿主細胞染色体とは独立して複製することができない
ものであっても、発現用に酵母または哺乳動物細胞中に
トランスフェクションする。

【００４３】また、ＤＮＡは宿主ゲノム中への挿入によ
ってクローンされる。これは、バシラス種を用い、例え
ばバシラスのゲノムＤＮＡ中に見い出される配列に相補
性であるＤＮＡ配列をベクター中に含ませることによっ
て容易に行われる。このベクターを用いてバシラスをト
ランスフェクションすると、ゲノムとＡＣＳＦ ＤＮＡ
の挿入体による相同組換えが起こる。しかし、ＤＮＡの
切り出しには制限酵素消化が必要であるので、ＡＣＳＦ
をコードしているゲノムＤＮＡの回収は外部で複製され
たベクターのそれよりも複雑である。

【００４４】発現およびクローニングベクターは選択遺
伝子(選択マーカーとも呼ばれる)を含んでいるべきであ
る。これは、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存
または増殖に必要なタンパク質をコードしている遺伝子
である。この遺伝子の存在は、ベクターを欠いているす
べての宿主細胞が形質転換宿主を越える増殖または複製
の利益を受けないことを確実なものにする。通常の選択
遺伝子は、(a)抗生物質またはその他の毒素、例えばア
ンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテ
トラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、
(b)栄養要求欠損を補足するタンパク質、または(c)コン
プレックス培地から入手できない必須栄養物質を供給す
るタンパク質、例えばバシラスのためのＤ-アラニン ラ
セマーゼをコードしている遺伝子、をコードしている。

【００４５】酵母で用いるのに適した選択遺伝子は、酵
母プラスミドＹＲp７中に存在しているtrp１遺伝子であ
る［スティンクコンブら(Stinchcomb et al., 1979, Na
ture 282：39)；キングスマンら(Kingsman et al., 197
9, Gene 7：141)；またはチェンパーら(Tschemper et a
l., 1980, Gene 10：157)]。このtrp１遺伝子は、トリ
プトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、
例えばＡＴＣＣ Ｎo.４４０７６またはＰＥＰ４−１[ジ
ョーンズ(Jones,1977,Genetics 85：12)]の選択マーカ
ーを与える。次いで、酵母宿主細胞ゲノム中のtrp１欠
損の存在は、トリプトファンの非存在下での増殖による
形質転換の検出に有効な環境を与える。同様に、Ｌeu２
欠損酵母株(ＡＴＣＣ ２０,６２２または３８,６２６)
は、Ｌeu２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補
足される。

【００４６】哺乳動物細胞に適した選択マーカーの例
は、ジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)、チミジンキナー
ゼおよびハイグロマイシンまたはネオマイシンに対する
耐性をコードしている遺伝子である。これらのマーカー
は、ＡＣＳＦの核酸の取込みに対してコンピテントであ
る細胞の同定を可能にする。哺乳動物細胞形質転換体
を、マーカーを取込んだために形質転換体だけが唯一生
存に適応する選択圧下に置く。選択圧は、培地中の選択
物質の濃度を連続的に変化させ、それによって選択遺伝
子とＡＣＳＦをコードしているＤＮＡの両方の増幅が導
かれる条件下で形質転換体を培養することによって課さ
れる。増幅とは、増殖に必須であるタンパク質を産生す
ることが強く要求されている遺伝子が組換え細胞の代々
の世代の染色体内に直列で反復される過程である。増加
量のＡＣＳＦが増幅されたＤＮＡから合成される。

【００４７】例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換さ
れた細胞は、始めにヒポキサンチン、グリシン、および
チミジンを欠く培養培地ですべての形質転換体を培養す
ることによって同定する。この場合の適切な宿主細胞
は、アーラウブおよびチャシン[Urlaub and Chasin,198
0,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216]の記載のように調
製し、増殖させた、ＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズ・
ハムスター卵巣(ＣＨＯ)セルラインである。特に有用な
ＤＨＦＲは、ＭＴＸに対して耐性が高い突然変異ＤＨＦ
Ｒである(EP 117,060A)。この選択物質は、内生のＤＨ
ＦＲの存在にもかかわらず、その他のあらゆる適切な宿
主、例えばＡＴＣＣ Ｎo.ＣＣＬ６１ ＣＨＯ−Ｋ１とと
もに用いることができる。次に、ＤＨＦＲを不活性化す
る物質(メトトレキセートまたはＭＴＸ)に暴露すること
によって、ＤＨＦＲとＡＣＳＦコード化ＤＮＡを増幅す
る。連続回の逐次増大するＭＴＸ濃度で増殖することが
できる細胞だけを選択することによって、細胞がさらに
ＤＮＡを必要とした結果、すべての外来性ＤＮＡが増幅
されるのを確実なものにする。本発明の範囲内に含まれ
るのは、ネオマイシンによるneo遺伝子形質転換体の最
初の選択、それに続くＤＨＦＲ増幅マーカー遺伝子の増
幅である。

【００４８】組換え脊椎動物細胞培養におけるハイブリ
ッド受容体の合成に適合させるのに適したその他の方
法、ベクターおよび宿主細胞は、ゲシングら[M.J.Gethi
ng etal., Nature 293：620-625 (1981)]；マンテイら
[N.Mantei et al., Nature 281：40-46]；およびレビン
ソンら[A.Levinson et al., EP 117,060A and 117,058
A]が記載している。ＡＣＳＦの哺乳動物細胞培養発現に
特に有用な出発プラスミドはpＥ３４２.ＨＢＶ Ｅ４０
０.Ｄ２２(EP 117,058A)である。

【００４９】クローニングベクターとは異なり、発現ベ
クターは、宿主生物によって認識され、そしてＡＣＳＦ
の核酸に機能的に結合したプロモーターを含有している
べきである。プロモーターは、その支配下にある核酸の
転写および翻訳をコントロールする、構造遺伝子の開始
コドンの上流(通常、約１００〜１０００bp以内)に位置
している翻訳されない配列である。これらは普通２つの
群、即ち誘導性および構成性に分けられる。誘導性のプ
ロモーターは、培養条件のある変化、例えば栄養素の存
在もしくは非存在または温度の変化に応答してそれらの
支配下のＤＮＡから増大レベルの転写を開始させるプロ
モーターである。天然の塩基性ペプチド領域を含むＡＣ
ＳＦのあらゆる細菌性のタンパク質加水分解は、誘導性
プロモーターを用いてＡＣＳＦ遺伝子の転写をコントロ
ールすることによって減少するであろう。現時点では、
多種の可能性ある宿主細胞によって認識される多数のプ
ロモーターが周知である。これらのプロモーターは、制
限酵素消化によってこれらをこれらの元の遺伝子から取
り、次いでＡＣＳＦの開始コドンの５'に挿入すること
によって、ＡＣＳＦをコードしているＤＮＡに機能的に
結合させる。これは、ゲノムＡＣＳＦプロモーターが哺
乳動物組換え細胞培養において使用することができない
と言うものではない。しかし、一般にヘテロローガスな
プロモーターは、一層高い転写および一層高い発現ＡＣ
ＳＦ収量を与えることになる。

【００５０】核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関
係に置かれたときに機能的に結合される。例えば、プレ
配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチ
ドの分泌に関係するプレタンパク質として発現されるな
らばポリペプチドのＤＮＡに機能的に結合しており；プ
ロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に
影響を及ぼすならば暗号配列に機能的に結合しており；
また、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するよ
うに設置されているならば暗号配列に機能的に結合して
いる。通常、機能的に結合するとは、結合されるＤＮＡ
配列群が近接しており、分泌リーダーの場合には近接し
てリーディング相内にあることを意味する。結合は都合
のよい制限部位でのライゲート(連結)によって行う。そ
のような部位が存在しないときには、常法に従って合成
オリゴヌクレオチド アダプターまたはリンカーを用い
る。

【００５１】原核性宿主で用いるのに適したプロモータ
ーには、β-ラクタマーゼおよびラクトースプロモータ
ー系[チャンら(Chang et al.,1978, Nature 275：61
5)；およびゲデルら(Goeddel et al.,1979,Nature 28
1：544)]、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(t
rp)プロモーター系[ゲデル(Goeddel, 1980,Nucleic Aci
dsRes. 8：4057)およびＥＰＯ出願公開Ｎo.36,776]、お
よびtacプロモーターなどのハイブリッドプロモーター
[デボアーら(H.de Boar et al., 1983, Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 80：21-25)]が含まれる。しかし、その他の
既知の細菌性プロモーターも適している。これらのヌク
レオチド配列は公表されており、従ってこれらを、あら
ゆる必要な制限部位を供給するためのリンカーまたはア
ダプターを用いて、ＡＣＳＦをコードしているＤＮＡに
機能的に連結することができる[シーベンリストら(Sieb
enlist et al.,1980,Cell 20：269)]。また、細菌性の
系で用いるためのプロモーターは、ＡＣＳＦをコードし
ているＤＮＡに機能的に結合させたシャイン-ダルガル
ノ(Ｓ.Ｄ.)配列を含有している。

【００５２】酵母宿主で用いるのに適した促進配列に
は、３−ホスホグリセレート キナーゼ[ヒッツェマンら
(Hitzeman et al., 1980, J.Biol.Chem. 255：2073)]、
またはその他のグルコース分解酵素[ヘスら(Hess et a
l., 1968, J.Adv.Enzyme Reg.7：149)；およびホランド
(Holland, 1978, Biochemistry 17：4900)]、例えばエ
ノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート デ
ヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート デカル
ボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−
６−ホスフェート イソメラーゼ、３−ホスホグリセレ
ート ムターゼ、ピルベート キナーゼ、トリオセホスフ
ェート イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラー
ゼ、およびグルコキナーゼなどのプロモーターが含まれ
る。

【００５３】増殖条件によってコントロールされる転写
の別の利点を有している誘導性プロモーターであるその
他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ
２、イソチトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝
に関与する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアル
デヒド−３−ホスフェート デヒドロゲナーゼ、並びに
マルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素群の
プロモーター領域である。酵母発現において用いるのに
適したベクターおよびプロモーターはヒッツェマンら[H
itzeman et al.；EP 73,657A]がさらに開示している。
また、酵母エンハンサーを酵母プロモーターとともに用
いるのが有利である。

【００５４】哺乳動物宿主細胞中のベクターからのＡＣ
ＳＦの転写は、ポリオーマ、サイトメガロウイルス、ア
デノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよ
び最も好ましくはサルウイルス４０(ＳＶ４０)などのウ
イルスのゲノムから、または例えばアクチンプロモータ
ーなどのヘテロローガスな哺乳動物プロモーターから得
られるプロモーターによってコントロールされる。ＳＶ
４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４
０のウイルス性複製起源をも含有するＳＶ４０制限フラ
グメントとして好都合に得られる[フィアーズら(Fiers
et al., 1978,Nature 273：113)]。また、宿主細胞また
はその関連種由来のプロモーターが本発明において有用
であるのは勿論である。

【００５５】高等真核生物によるＡＣＳＦをコードして
いるＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を
挿入することによって増大する。エンハンサーは、通常
約１０〜３００bpのヌクレオチド配列であり、プロモー
ターに作用してその転写を増強するが、その配向および
位置には比較的無関係に作用する。現在では多数のエン
ハンサー配列が哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスター
ゼ、アルブミン、α-フェトプロテインおよびインスリ
ン)から既知となっている。しかし、真核細胞ウイルス
からのエンハンサーを用いるのが普通である。その例に
は、ＳＶ４０の複製起源の後期側のエンハンサー(bp１
００〜２７０)、サイトメガロウイルスの初期プロモー
ターエンハンサー、ポリオーマの複製起源の後期側のエ
ンハンサー、およびアデノウイルスのエンハンサーが含
まれる。エンハンサーはベクターのＡＣＳＦをコードし
ている配列の５'または３'の位置に継ぎ合わせてよい
が、プロモーターの５'の位置に設置するのが好まし
い。

【００５６】また、真核宿主細胞(酵母、菌類、昆虫、
植物、動物、ヒト、またはその他の多細胞生物由来の有
核細胞)で用いる発現ベクターは、転写の終止およびmＲ
ＮＡの安定化に必要な配列をも含んでいるであろう。通
常、このような配列は真核性またはウイルス性のＤＮＡ
またはcＤＮＡの５'および時には３'非翻訳化領域から
得ることができる。これらの領域は、ＡＣＳＦをコード
しているmＲＮＡの非翻訳化部分においてポリアデニル
化されたセグメントとして転写される領域を含んでい
る。また、３'非翻訳化領域は転写終止部位をも含んで
いる。

【００５７】本発明のベクターのクローニングまたは発
現に適した宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核
細胞である。原核生物にはグラム陰性またはグラム陽性
生物、例えば大腸菌またはバシラスが含まれる。好まし
いクローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ ３１,４
４６)であるが、その他のグラム陰性またはグラム陽性
原核生物、例えば大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣ
Ｃ ３１,５３７)、大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ ２７,３
２５)、シュードモナス種、またはセラッチア・マルセ
サンス(Serratia Marcesans)も適している。

【００５８】原核生物に加えて、糸状菌または酵母など
の真核性微生物もＡＣＳＦをコードしているベクターに
適した宿主である。サッカロマイセス・セレビジエ(Sac
charomyces cerevisiae)または普通のパン酵母が、低級
真核宿主微生物の中で最も普通に用いられる。しかし、
その他多数の属、種、および株が普通に用いられ、本発
明にとって有用である。

【００５９】ＡＣＳＦの発現用に好ましい宿主細胞は多
細胞生物由来の細胞である。原則的には、多細胞生物由
来のあらゆる真核細胞が脊椎動物あるいは非脊椎動物培
養物由来を問わず使用可能であるが、哺乳動物由来の細
胞が好ましい。これら細胞の培養物中での増殖は自体周
知である[Tissue Culture, Academic Press, Kruse and
Patterson, editors (1973)を参照]。有用な哺乳動物
宿主セルラインの例は、ＶＥＲＯおよびＨeＬa細胞、チ
ャイニーズハムスター卵巣セルライン、ＷＩ３８、ＢＨ
Ｋ、ＣＯＳ-７、ＭＤＣＫセルライン、およびヒト胚腎
セルライン２９３である。

【００６０】宿主細胞を上記の発現またはクローニング
ベクターで形質転換し、プロモーターの誘導または増幅
遺伝子を含む形質転換体の選択に適するように修飾され
た通常の栄養培地で培養する。温度、pＨなどの培養条
件は、クローニングまたは発現のために選択した宿主細
胞でこれまで用いられている条件が適当であり(それぞ
れの場合に応じて)、当業者には明らかであろう。

【００６１】ＡＣＳＦは分泌タンパク質として培養培地
から回収するのが好ましいが、分泌シグナルなしで直接
発現されるときには宿主細胞溶菌液から回収することも
できる。第１段階として、培養培地または溶菌液を遠心
して個々の細胞残骸を除去する。完全長さのＡＣＳＦ
を、例えば塩基性緩衝液を用いるカチオン交換樹脂溶離
法による吸着、抗-ＡＣＳＦ免疫アフィニティーカラム
への吸着とpＨ５〜６の緩衝液によるそれからの溶離に
よって、不純な可溶性タンパク質から精製する。別の方
法としては、不純物を除去するためのレクチンアフィニ
ティーカラムおよびアニオン交換カラムでのクロマトグ
ラフィーなどの他の方法が、ＡＣＳＦ含有の培地または
細胞抽出物の最初の精製に用いられる。塩基性のペプチ
ド領域が削除されているＡＣＳＦ変異体は免疫アフィニ
ティーまたは疎水性アフィニティークロマトグラフィー
によって回収するのが最もよい。

【００６２】天然のＡＣＳＦはある条件のもとで集合す
る傾向を有しているので、少量のノニオン系界面活性剤
[例えば、ツイーン(Tween)またはポリエチレングリコー
ル]を分離中に加えることによってマルチマーの集合状
態を安定化させるのが有用であろう。また、ＰＭＳＦな
どのプロテアーゼ阻害物質は精製中のタンパク質加水分
解を阻害するのに有用であり、抗生物質を含有させて外
来不純物の増殖を防止してもよい。

【００６３】天然のＡＣＳＦに適した精製方法が、組換
え細胞培養物中で発現れたときのＡＣＳＦまたはその変
異体の性質を変化させるもととなる修飾を必要とするこ
ともあることは当業者の認めるところであろう。適切な
精製法は特定の組換えＡＣＳＦの性質に依存しており、
当業者には明らかであろう。

【００６４】ＡＣＳＦはナトリウム、カリウム、リン
酸、塩酸などのイオンとの非毒性塩として調製される。
通常、ＡＣＳＦはリン酸緩衝食塩水中で保存されるか、
または糖アルコール類(例えば、マンニトールまたはソ
ルビトール)、モノサッカリド類(例えば、グルコース、
マンノース、ガラクトースまたはフルクトース)、オリ
ゴサッカリド類(例えば、マルトース、ラクトースまた
はスクロース)、およびタンパク質(例えば、ヒト血清ア
ルブミン)を含む賦形剤の存在下に凍結乾燥してもよ
い。

【００６５】また、上記の賦形剤は水溶液保存したとき
の不活性化または沈澱に対するＡＣＳＦの安定性に寄与
することもあり、通常の他の安定剤とともに用いられる
こともある。そのような安定剤には、キレート化試薬
(例えば、ＥＤＴＡ)、酸性アミノ酸、およびノニオン系
界面活性剤(例えば、ポリエチレングリコールまたはポ
リエチレングリコールとポリプロピレングリコールのブ
ロックコポリマー)が含まれる。

【００６６】ＡＣＳＦアンタゴニスト、ＡＣＳＦの中和
抗体、または中和抗体を生成しうる免疫原は、ＨＨＭを
改善するためにヒトまたは動物に投与され、また、ケラ
チノサイトの過増殖を特徴とする疾患(例えば、乾癬)の
治療にその用途を有していることもある。治療用ＡＣＳ
Ｆ組成物は、薬理学的に許容しうる担体中に治療学的有
効量をＡＣＳＦ抗体、アンタゴニストまたは免疫原を含
んでいる。選択される用量、担体および投与経路は、各
種因子の中で、特にアンタゴニストまたは免疫原の選
択、患者の状態、標的の疾患、望ましい投与経路、およ
び選択したＡＣＳＦ変異体の活性に依存するであろう。
これは、治療過程の中で医師によって容易に決定および
モニターされる。

【００６７】ＡＣＳＦの注入または注射のための担体
は、滅菌等張水溶液、例えば注射用食塩水または５％デ
キストロースである。これらの調製物は、鼻内、皮下、
静脈内、腹腔内、またはその他の通常の投与経路で注射
または注入される。

【００６８】また、ＡＣＳＦは持続放出担体中に加えら
れる。適当な例には、一定の形状を有する半透過性の高
分子マトリックス(例えば、座剤またはマイクロカプセ
ル)が含まれる。移植可能な持続放出マトリックスに
は、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートの
コポリマー[シドマンら(U.Sidman et al., 1983, Biopo
lymers 22(1)：547-556)]、ポリ(２−ヒドロキシエチル
メタクリレート)[ランガーら(R.Langer et al., 1981,
J.Biomed.Mater.Res. 15：167-277)およびランガー(R.L
anger, 1982, Chem.Tech. 12：98-105)]、エチレンビニ
ルアセテート[ランガーら(R.Langer et al.；同上)]、
またはポリ−Ｄ−(−)−３−ヒドロキシ酪酸[EP 133,98
8A]が含まれる。また、持続放出ＡＣＳＦ組成物にはリポ
ソームによって捕捉されたＡＣＳＦが含まれる。ＡＣＳ
Ｆを含有するリポソームは自体既知の方法によって調製
される［DE 3,218,121A；エプスタインら（Epstein et
al., 1985, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688-3692)；
ワンら(Hwang et al., 1980, Proc.Natl.Acad.Sci.USA
77：4030-4034)；EP 52322A；EP 36676A；EP 88046A；E
P 143949A；EP 142641A；日本特許出願83-118008；米国
特許4,485,045および4,544,545；およびEP 102,324A]。
通常、リポソームは小さい(約２００〜８００Å)単一膜
型のものであり、脂質含量は約３０モル％コレステロー
ル以上であり、この選択した割合はＡＣＳＦ漏出の最適
速度に調節されている。

【００６９】ＡＣＳＦに対して生成させたポリクローナ
ルのウサギまたはネズミ抗血清は、免疫アフィニティー
精製またはＡＣＳＦのＥＬＩＳＡ検定におけるＡＣＳＦ
に用いられ、そして放射テクネチウムまたはその他同等
の媒体でラベルされたときにはＡＣＳＦ分泌腫瘍のイメ
ージングに用いられる。また、そのような抗体は腫瘍細
胞標的化の細胞毒でラベルされる。ＡＣＳＦの唯一のＣ
-末端に特異的な抗体は次のように調製される：即ち、
動物を免疫原性ＡＣＳＦコンジュゲート(例えば、本明
細書の他の箇所に記載したような組換え細胞培養物で調
製された免疫原融合物)に対して免疫し、次いで、他の
ＡＣＳＦエピトープに指向性の抗体を吸着させるために
抗血清を固定化ＡＣＳＦ(１−８４)のカラムに通し、残
存する抗体を¹²⁵Ｉ-ＡＣＳＦとともにインキュベートし
てＣ-末端エピトープを未吸着抗体中の抗-ＡＣＳＦ抗体
に結合させ、そして¹²⁵Ｉ-ＡＣＳＦの結合量を測定する
ことにより(例えば、プロテインＡセファロースへの吸
着によって)、抗-Ｃ末端ペプチド力価の存在をスクリー
ニングすることによって調製される。別法では、動物を
Ｃ-末端ペプチドに対して免疫し、抗血清を回収する。
いずれの場合にも、モノクローナル抗体がＣ-末端ペプ
チドに対する力価を示す動物のＢ細胞から産生される。
Ｃ-末端特異的な抗体が利用できると、サンドイッチ型
免疫検定または競合型免疫検定(ＰＴＨが干渉しない)の
作成が可能になる。サンドイッチ型検定は、ＡＣＳＦの
残基１−８４の間に位置するエピトープにだけ結合しう
る第１の抗体およびＡＣＳＦの残基８５−１４１の間に
位置するエピトープにだけ結合しうる第２の抗体を得、
第１または第２の抗体のいずれか１つを固定化し、固定
化抗体と被験試料を接触させてＡＣＳＦをそれに吸着さ
せ、結合したＡＣＳＦを洗浄し、結合したＡＣＳＦを第
１または第２の抗体の残りの１つ(残りの抗体は検出可
能な基でラベルされている)と接触させて結合ＡＣＳＦ
をラベルし、そして結合または遊離のラベルの量を測定
することからなる方法である。

【００７０】実施例を簡単にするため、頻繁に出てくる
方法の一部は簡略して表現されている。

【００７１】「プラスミド」は、小文字ｐ、それに先立
つおよび／またはそれに続く大文字、および／または数
字で表す。本発明の出発プラスミドは、市販品から入手
可能であるか、制限のない状態でだれでも入手可能であ
るか、またはそのような入手可能なプラスミドから公知
の方法に従って構築することができる。さらに、その他
の等価なプラスミドが当分野で知られているが、これら
は当業者には明らかであろう。

【００７２】ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡ中のある位
置にだけ作用する酵素によるＤＮＡの触媒的切断を意味
する。そのような酵素は制限酵素と呼ばれ、そのそれぞ
れが特異的である部位は制限部位と呼ばれている。本発
明で用いられる多種の制限酵素は市販品から入手可能で
あり、酵素供給元によって確立された反応条件、補助因
子、およびその他の必要条件を用いた。通常、制限酵素
は、それぞれの制限酵素が最初に得られた微生物を示す
大文字とそれに続く他の文字、およびそれに続く特定の
酵素を示す数字からなる短縮形で表される。通常、約１
μγのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２０μ
ｌの緩衝液中、約２単位の酵素とともに用いる。特定の
制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は製造元に
よって指定されている。通常は３７℃で約１時間のイン
キュベート時間を用いたが、供給元の指図に従って変え
ることもある。インキュベートの後、タンパク質をフェ
ノールおよびクロロホルムによる抽出によって除去し、
消化した核酸をエタノールによる沈澱によって水性分画
から回収する。頻繁なことではないが、制限酵素による
消化に続いて末端５'ホスフェートの細菌性アルカリホ
スファターゼ加水分解を行って、ＤＮＡフラグメントの
２つの制限切断末端が「環状化」または閉じた環を形成
すること(別のＤＮＡフラグメントの制限部位への挿入
を妨げる)を防止する。特に記載がなければ、プラスミ
ドの消化に続いて５'末端の脱ホスホリル化を行うこと
はない。脱ホスホリル化の方法および試薬は通常のもの
である［マニアティスら(T.Maniatis et al.,1982, Mol
ecular Cloning, pp.133-134)]。

【００７３】制限消化物からのあるＤＮＡフラグメント
の「回収」または「単離」とは、電気泳動によるポリア
クリルアミドまたはアガロースゲルでの消化物の分離、
その移動度と既知分子量のマーカーＤＮＡフラグメント
の移動度の比較による目的フラグメントの同定、目的の
フラグメントを含有しているゲル切片の取り出し、およ
びゲルからのＤＮＡの分離を意味する。この方法は広く
知られている。例えば、ロウンら[R.Lawn et al., 198
1, Nucleic Acids Res. 9：6103-6114]およびゲデルら
[D.Goeddel et al., 1980, Nucleic Acids Res. 8：405
7]を参照。

【００７４】「形質転換」または「トランスフェクショ
ン」とは、ＤＮＡが染色体外要素または染色体組込み体
として複製可能なようにＤＮＡを生物中に導入すること
を意味する。特に記さなければ、本発明で大腸菌の形質
転換に用いる方法はマンデルら[Mandel et al., 1970,
J.Mol.Biol. 53：154]のＣaＣｌ２法である。

【００７５】「ライゲート(連結)」とは、２つの２本鎖
核酸フラグメントの間でホスホジエステル結合を形成さ
せる過程を指す[マニアティスら、同上、146頁]。特に
記さなければライゲートは、ライゲートしようとする
０.５μｇのほぼ等しい量のＤＮＡフラグメントに対し
て１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を
用い、既知の緩衝液および条件を用いて行われる。

【００７６】

【実施例】実施例１ Ｎ-末端のタンパク質配列データに基づいて合成したオ
リゴヌクレオチドを用いてプローブしたＢＥＮ細胞mＲ
ＮＡのcＤＮＡライブラリーからＡＣＳＦのクローンを
単離した。メッセンジャーＲＮＡは、ＢＥＮ細胞からＬ
iＣｌ沈澱およびオリゴ-dＴセルロースクロマトグラフ
ィーによって精製した。このＲＮＡから、オリゴ-dＴで
プライムされたcＤＮＡクローンのライブラリーをλgt
１０ベクター中に生成させた。２μｇのポリＡ＋ＲＮＡ
から、３００nｇの２本鎖cＤＮＡを合成した。約１nｇ
のこのcＤＮＡから１,０００,０００以上のクローンを
得た。このクローンの一部を、２種類の７２-merオリゴ
ヌクレオチドプローブ brf.1およびbrf.２(図１、配列
番号１および２)の混合物を用いてスクリーニングし
た。これらプローブのコドンの選択は、哺乳動物コドン
の頻度表(brf.１)またはＰＴＨの相同なアミノ酸におい
て用いられるコドン(brf.２)のどちらかに基づいた。オ
リゴヌクレオチドは³²Ｐで末端標識化し、２０％ホルム
アミド、５ｘＳＳＣ中、４２℃でcＤＮＡクローンのラ
イブラリーとハイブリダイズさせ、そして１ｘＳＳＣ
中、４２℃で洗浄した。スクリーニングした２５０,０
００のクローンから６つのポジティブなクローンを同定
した。これら３つのクローンについて決定したＤＮＡ配
列を図２（配列番号３）に示す。

【００７７】brf.２プローブとハイブリダイズするポジ
ティブなクローンを調べている間に、部分クローンλ５
７は、ＡＣＳＦのＮ-末端に対する相同性が著しいポリ
ペプチドをコードしているが、相同領域のＡＣＳＦ Ｃ-
末端は似ていないことを発見した。さらに、λ５７ポリ
ペプチドの相同領域からＣ-末端までの距離は、ＰＴＨ
に比べ１残基短いだけである。ＡＣＳＦとの一層の相同
性を示す完全クローンの配列の決定は、ＡＣＳＦ、ＰＴ
Ｈおよびこの別のポリペプチドがすべてＰＴＨ-受容体
活性ホルモン群の一員であることを示唆するものであろ
う。

【００７８】ＡＣＳＦのＤＮＡ配列は、換算された分子
量が１６kＤの１４１アミノ酸の成熟タンパク質を予想
させる。これは、ＳＤＳゲル電気泳動により精製ＢＥＮ
細胞タンパク質について測定された１８−１９kＤの分
子量とほぼ同じである。この予想配列は過剰の塩基性残
基(２９Ｋ＋Ｒ vs ２０Ｄ＋Ｅ)を含んでおり、これはＡ
ＣＳＦの塩基性pＩを説明するものである。この配列
は、成熟タンパク質中にシステインが存在しないこと、
および可能性あるＮ-結合グリコシル化部位(ＮＸＳ／
Ｔ)が存在しないことを予想させる。ＡＣＳＦ配列はＰ
ＴＨとのある限定された相同性を示すが、その大部分は
Ｎ-末端の１５アミノ酸に限られる(図３)。

【００７９】アミノ酸８８から１０８に至るＡＣＳＦ配
列は、多数の塩基性残基を含んでおり、１個の前駆体か
ら２個のペプチドを放出するタンパク質切断の領域であ
ろう。この場合、ペプチド１〜８７は、ＰＴＨ１〜３４
が活性であるのと同じようにアデニル酸シクラーゼ刺激
活性を有しているものと予想される。残基１０９〜１４
１を含む第２の機能は新規に同定されたホルモンであろ
う。

【００８０】予想の成熟タンパク質にはメチオニンで始
まる３６アミノ酸配列が先行する。この配列はＰＴＨの
プレプロ配列とは少しの相同性しか有していないが、類
似したプレプロ構造を有している。予想の成熟ＡＣＳＦ
配列には、ＰＴＨの６アミノ酸プロ配列と同様、多数の
塩基性残基を有する５アミノ酸のプロ配列が先行する。
この推定のプロ配列には、細胞からの分泌のためのシグ
ナル配列に予想されるような荷電した残基と境界を接し
ている疎水性アミノ酸の核(コア)を有する３１アミノ酸
配列が先行する。提案した開始ＡＴＧの周囲のＤＮＡ配
列は、タンパク質翻訳の開始に対して見い出されるコン
センサス配列に適合する。

【００８１】実施例２ クローンしたＡＣＳＦを、哺乳動物細胞から活性なタン
パク質を分泌させるための哺乳動物発現ベクター中に継
ぎ合わせる。図４はこの発現ベクターpＣＩＳ２.ＢＲＦ
１.１を構築するために行った工程を示すものである。
このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター、
免疫グロブリンスプライス部位、およびＳＶ４０初期ポ
リアデニル化シグナルならびにＤＨＦＲ転写単位(哺乳
動物細胞中での安定な発現および増幅のための)を含ん
でいる。この構築は、一次cＤＮＡクローンλＢＲＦ.５
２由来の１３４１bpの挿入体をpＵＣ１１９中にサブク
ローンしてpＢＲＦ.５２を得ることによって行った。こ
のサブクローンのＤＮＡ配列を決定し、完全長さのＡＣ
ＳＦを同定した後、暗号領域の大部分を９３２bpのＨga
Ｉ−ＤraＩフラグメントで単離した。これとは別に、哺
乳動物発現ベクターpＣＩＳ２.８c２４ＤをＣlaＩおよ
びＨpaＩで切断し、５３４０bpのフラグメントを単離し
た。これら２種類のフラグメントおよび図４に示した２
本鎖オリゴヌクレオチドを一緒にライゲートして(オリ
ゴヌクレオチドの５'末端にリン酸を付加した後)、pＣ
ＩＳ２.ＢＲＦ１.１(図５)を得た。オリゴヌクレオチド
挿入体のＤＮＡ配列を配列決定によって確認した。ＡＣ
ＳＦ発現プラスミドpＣＩＳ２.ＢＲＦ１.１を、ＡＣＳ
Ｆの発現のためリン酸カルシウム法によって哺乳動物細
胞中にトランスフェクションした。ＣＯＳ-７サル腎細
胞または２９３ヒト腎細胞は一時的な発現に適してお
り、２９３ヒト腎細胞またはＣＨＯ(ＤＨＦＲ^-)チャイ
ニーズハムスター卵巣細胞は、ＮＥＯ同時形質転換およ
びＧ４１８選択(２９３細胞)を用いる、または栄養選択
(ＣＨＯ細胞)による安定な発現に適している。ＡＣＳＦ
はこれらの細胞から分泌され、プロ配列が除去されて活
性なＡＣＳＦが得られる。発現されたＡＣＳＦの活性
を、骨芽細胞様セルラインＵＭＲ-１０６におけるcＡＭ
Ｐレベルの刺激に対する培養物上清の検定によって測定
する。発現された物質は、ＢＥＮ細胞から分泌された天
然分泌について用いられる方法に類似するＨＰＬＣ法に
よって精製する。

【００８２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. <110> UNIVERSITY OF MELBOURNE <120> ACSF AND ANTAGONIST THEREOF <130> 174954 <160> 7 <210> 1 <211> 72 <212> DNA <400> 1 gct gtc tct gag cat cag ctg ctg cat gac aag ggc aag tcc atc cag 48 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 tcc ttt gag cgg cgg ttc ttc ctg 72 Ser Phe Glu Arg Arg Phe Phe Leu 20 <210> 2 <211> 72 <212> DNA <400> 2 gct gtg agt gaa cat cag ctt ctg cat gac aag ggc aaa tcc atc cag 48 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 tcc ttt gag aga cgg ttc ttc ctg 72 Ser Phe Glu Arg Arg Phe Phe Leu 20 <210> 3 <211> 1025 <212> DNA <213> Homosapiens <400> 3 gtcccgagcg cgagcggaga cg atg cag cgg aga ctg gtt cag cag tgg 49 Met Gln Arg Arg Leu Val Gln Gln Trp -35 -30 agc gtc gcg gtg ttc ctg ctg agc tac gcg gtg ccc tcc tgc ggg cgc 97 Ser Val Ala Val Phe Leu Leu Ser Tyr Ala Val Pro Ser Cys Gly Arg -25 -20 -15 tcg gtg gag ggt ctc agc cgc cgc ctc aaa aga gct gtg tct gaa cat 145 Ser Val Glu Gly Leu Ser Arg Arg Leu Lys Arg Ala Val Ser Glu His -10 -5 1 5 cag ctc ctc cat gac aag ggg aag tcc atc caa gat tta cgg cga cga 193 Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg Arg 10 15 20 ttc ttc ctt cac cat ctg atc gca gaa atc cac aca gct gaa atc aga 241 Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala Glu Ile Arg 25 30 35 gct acc tcg gag gtg tcc cct aac tcc aag ccc tct ccc aac aca aag 289 Ala Thr Ser Glu Val Ser Pro Asn Ser Lys Pro Ser Pro Asn Thr Lys 40 45 50 aac cac ccc gtc cga ttt ggg tct gat gat gag ggc aga tac cta act 337 Asn His Pro Val Arg Phe Gly Ser Asp Asp Glu Gly Arg Tyr Leu Thr 55 60 65 cag gaa act aac aag gtg gag acg tac aaa gag cag ccg ctc aag aca 385 Gln Glu Thr Asn Lys Val Glu Thr Tyr Lys Glu Gln Pro Leu Lys Thr 70 75 80 85 cct ggg aag aaa aag aaa ggc aag ccc ggg aaa cgc aag gag cag gaa 433 Pro Gly Lys Lys Lys Lys Gly Lys Pro Gly Lys Arg Lys Glu Gln Glu 90 95 100 aag aaa aaa cgg cga act cgc tct gcc tgg tta gac tct gga gtg act 481 Lys Lys Lys Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp Leu Asp Ser Gly Val Thr 105 110 115 ggg agt ggg cta gaa ggg gac cac ctg tct gac acc tcc aca acg tcg 529 Gly Ser Gly Leu Glu Gly Asp His Leu Ser Asp Thr Ser Thr Thr Ser 120 125 130 ctg gag ctc gat tca cgg agg cat tgaaattttc agcagagacc ttccaaggac 583 Leu Glu Leu Asp Ser Arg Arg His 135 140 atattgcagg attctgtaat agtgaacata tggaaagtat tagaaatatt tattgtctgt 643 aaatactgta aatgcattgg aataaaactg tctcccccat tgctctatga aactgcacat 703 tggtcattgt gaatattttt ttttttgcca aggctaatcc aattattatt atcacattta 763 ccataattta ttttgtccat tgatgtattt attttgtaaa tgtatcttgg tgctgctgaa 823 tttctatatt ttttgtaaca taatgcactt tagatataca tatcaagtat gttgataaat 883 gacacaatga agtgtctcta ttttgtggtt gattttaatg aatgcctaaa tataattatc 943 caaattgatt ttccttcgtg catgtaaaaa taacagtatt ttaaatttgt aaagaatgtc 1003 taataaaata taatctaatt ac 1025 <210> 4 <211> 115 <212> PRT <400> 4 Met Ile Pro Ala Lys Asp Met Ala Lys Val Met Ile Val Met Leu Ala -30 -25 -20 Ile Cys Phe Leu Thr Lys Ser Asp Gly Lys Ser Val Lys Lys Arg Ser -15 -10 -5 1 Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser 5 10 15 Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn 20 25 30 Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser Gln 35 40 45 Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu Lys 50 55 60 65 Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala 70 75 80 Lys Ser Gln <210> 5 <211> 115 <212> PRT <400> 5 Met Met Ser Ala Lys Asp Met Val Lys Val Met Ile Val Met Leu Ala -30 -25 -20 Ile Cys Phe Leu Ala Arg Ser Asp Gly Lys Ser Val Lys Lys Arg Ala -15 -10 -5 1 Val Ser Glu Ile Gln Phe Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser Ser 5 10 15 Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn 20 25 30 Phe Val Ala Leu Gly Ala Ser Ile Ala Tyr Arg Asp Gly Ser Ser Gln 35 40 45 Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Gln Lys 50 55 60 65 Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asp Val Leu Ile Lys Ala 70 75 80 Lys Pro Gln <210> 6 <211> 90 <212> PRT <400> 6 Lys Pro Ile Lys Lys Arg Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn -5 1 5 10 Leu Gly Lys His Leu Ser Ser Leu Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys 15 20 25 Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Ser Ile Val 30 35 40 His Arg Asp Gly Gly Ser Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val 45 50 55 Leu Val Glu Ser His Gln Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Ala 60 65 70 Val Asp Val Leu Ile Lys Ala Lys Pro Gln 75 80 <210> 7 <211> 115 <212> PRT <400> 7 Met Met Ser Ala Ser Thr Met Ala Lys Val Met Ile Leu Met Leu Ala -30 -25 -20 Val Cys Leu Leu Thr Gln Ala Asp Gly Lys Pro Val Lys Lys Arg Ala -15 -10 -5 1 Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ala Ser 5 10 15 Val Glu Arg Met Gln Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn 20 25 30 Phe Val Ser Leu Gly Val Gln Met Ala Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Gln 35 40 45 Arg Pro Thr Lys Lys Glu Glu Asn Val Leu Val Asp Gly Asn Ser Lys 50 55 60 65 Ser Leu Gly Glu Gly Asp Lys Ala Asp Val Asp Val Leu Val Lys Ala 70 75 80 Lys Ser Gln

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＡＣＳＦのアミノ酸配列に従って構築した２
種類の７２merのプローブ(brf.1（配列番号１）およびb
rf.2（配列番号２）)のヌクレオチド配列(上段)を、対
応するＡＣＳＦ cＤＮＡの配列(下段)と比較して示すも
のである。相同なヌクレオチドはアステリスクを付して
目立つようにした。

【図２】 ＡＣＳＦクローンbrf.52のヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列である（配列番号３）。いくつかの制限
酵素切断部位が示されている。

【図３】 ヒトＡＣＳＦのアミノ酸配列と、３種の動物
種のＰＴＨ（配列番号５、６および７）およびヒトＰＴ
Ｈ（配列番号４）のそれを比較するものである。完全に
相同な残基を箱で囲んだ。

【図４】 ＡＣＳＦの発現ベクターの適切な構築方法を
示すものである。簡単に説明すると、ＡＣＳＦ遺伝子を
λクローンbrf.52から回収し、クローニングベクターp
ＵＣ１１９に継ぎ合わせる。クローンした遺伝子を回収
し、Ｎ-末端をコードしているオリゴヌクレオチドとと
もに発現ベクターpＣＩＳ２.８ｃ２４Ｄ中に連結して、
発現ベクターpＣＩＳ２.ＢＲＦ１.１を構築する。

【図５】 発現ベクターpＣＩＳ２.ＢＲＦ１.１の構造
を示すものである。

【図６】 ＢＥＮ細胞cＤＮＡにおいて同定された部分
的なヌクレオチド配列およびポリペプチドのアミノ酸配
列であり、ＡＣＳＦと相同な領域を含んでいる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 3/14 Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:91 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 トーマス・ジョン・マーチン オーストラリア国、ビクトリア、ストー ク・アベニュー６番 (72)発明者 ラリー・ジョン・サバ オーストラリア国ビクトリア、イース ト・キュー、キャンベル・ストリート16 番 (72)発明者 ウィリアム・アイ・ウッド アメリカ合衆国カリフォルニア94402、 サン・マテオ、タリータウン1400番 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 16/18 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号３のアミノ酸残基１〜３４、１
   〜８３または１〜８７で示されるアミノ酸配列からなる
   ＡＣＳＦ断片ペプチドに特異的に結合する抗体。
2. 【請求項２】 ＡＣＳＦに結合して、ＡＣＳＦとＰＴＨ
   受容体との結合を阻害する請求項１に記載の抗体。
3. 【請求項３】 （１）請求項１または２に記載の抗体、
   および （２）生理学的に許容しうる賦形剤、担体および／また
   は希釈剤を含有する組成物。