JPH04128298A - 抗体、その製造法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は新しく見出された後述の式（１）のアミノ酸配
列のうち少なくとも８個の連続したアミノ酸を含有する
ペプチドに対する抗体、ハイブリドーマ、それらの製造
法およびそれらの用途に関する。 来の　　　び 上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆ
ａｃｔｏｒ、　ＥＧＦ）や神経成長因子（ｎｅｒｖｅ　
ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ、　ＮＧＦ）の発見以来、
多くの細胞成長因子が単離され、その構造が明らかにさ
れている。 細胞成長因子は細胞の分化および増殖の機構の解明に役
立ち、さらにヒトＥＧＦのように医薬として期待される
ものもあり、その研究は近年ますますさかんになるっつ
ある・ ヒトＮＧＦについては、そのゲノムＤＮＡは分離されて
はいるが、未だ宿主において発現されたものはなく、シ
たがって、ヒトＮＧＦを大量に生産し用いる研究は、進
展していない。 また本発明者らはヒト神経成長因子（ヒトＮＧＦ）と約
６０％の相同性を示すポリペプチド（１）をコードする
ｃＤＮＡをヒトグリオーマｃＤＮＡライブラリーからク
ローン化した（特願平１−１９３６５４号、第１〜４図
参照）。ポリペプチド（１）は分子中に式（１）で示さ
れる次のアミノ酸配列： ＴｙｒＡ１ａＧ１ｕＨｉｓＬｙｓＳｅｒＨｉｓＡｒｇＧ
ｌｙＧｌｕＴｙｒＳｅｒＶａｌＣｙｓ＾ｓｐＳｅｒＧｌ
ｕＳｅｒＬｅｕＴｒｐＶａｌＴｈｒＡｓｐＬｙｓＳｅｒ
ＳｅｒＡｌａＩｌｅＡｓｐＩｌｅＡｒｇＧｌｙＨｉｓＧ
ｌｎＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕＧｌｙＧｌｕＩｌｅＬｙ
ｓＴｈｒＧｌｙＡｓｎＳｅｒＰｒｏＶａｌＬｙｓＧｌｎ
ＴｙｒＰｈｅＴｙｒＧｌｕＴｈｒＡｒｇＣｙｓＬｙｓＧ
ｌｕＡｌａＡｒｇＰｒｏＶａｌＬｙｓＡｓｎＧｌｙＣｙ
ｓＡｒｇＧｌｙＩｌｅＡｓｐＡｓｐＬｙｓＨｉｓＴｒｐ
ＡｓｎＳｅｒＧｌｎＣｙｓＬｙｓＴｈｒＳｅｒＧｌｎＴ
ｈｒＴｙｒＶａｌＡｒｇＡｌａＬｅｕＴｈｒＳｅｒＧｌ
ｕＡｓｎＡｓｎＬｙｓＬｅｕＶａｌＧｌｙＴｒｐＡｒｇ
ＴｒｐＩｌｅＡｒｇＩｌｅＡｓｐＴｈｒＳｅｒＣｙｓＶ
ａｌＣｙｓＡｌａＬｅｕＳｅｒＡｒｇＬｙｓ１１ｅＧ１
ｙＡｒｇ　　　　　式（１）を含有するものである。 このポリペプチド（１）はＮＧＦと同様の作用、および
動物細胞の分化、成長および増殖の促進。 遺伝子発現の上昇、蛋白質および酵素の誘導など、生体
内で重要な機能を有しているものと考えられ、医薬品と
して利用できる可能性が高い。 が　　しようとする ポリペプチド（Ｉ）に関する基礎知見、例えば生体内に
おける分布やその産生様式、活性発現の機序等を知るこ
とができれば、ポリペプチド（Ｉ）の医薬品としての開
発は容易となる。 またポリペプチド（１）の量を正確に知ることは、この
蛋白質を遺伝子組換え体から精製する際にも重要である
。 従来、神経成長因子の量は、ＰＣ１２細胞に対する突起
伸長作用を測定することにより算出されてきた。また、
ニワトリ、抜根神経節細胞に対する突起伸長作用も利用
されている。しかしながら、この方法は細胞を用いるた
め操作が微妙で測定誤差が大きく、しかも結果を得るの
に長時間を要するという欠点を有する。従って、上記目
的のために簡便かつ正確なポリペプチド（１）の測定手
段の開発が望まれている。 を　　するための 上記実状に鑑み１本発明者らはポリペプチド（１）の実
用的な測定手段を見呂すべく、種々検討した結果、その
測定を可能ならしめるポリペプチド（１）もしくはその
部分ペプチドに対する抗体を作製し、これに基づいてさ
らに研究した結果、本発明を完成した。 本発明は、 （１）式（１）で表わされるアミノ酸配列のうちの連続
した少なくとも８個のアミノ酸を含有するペプチドに対
する抗体；　（２）ポリクローナル抗体である、上記（
１）の抗体；　（３）モノクローナル抗体である、上記
（１）の抗体；　（４）式（１）で表わされるアミノ酸
配列のうちの連続した少なくとも８個のアミノ酸を含有
するペプチドとキャリア蛋白質との複合体を免疫原とし
て得られる上記（１）、（２）または（３）の抗体；（
５）ペプチドが式（１）のアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチド（１）である上記（１）もしくは（４）の抗体
；　（６）ペプチドが式［２）ＴｙｒＡｌａ　Ｇｌｕ　
Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇ
ｌｕ　Ｔｙｒ　５ｅｒＶａｌ　Ｃｙｓで表わされる配列
のうちの連続した１２〜１４個のアミノ酸からなるポリ
ペプチド（１）の部分ペプチド、あるいは式［３）　Ｃ
ｙｓ　Ａｌａ　ＬｅｕＳｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ
　Ｇｌｙ　Ａｒｇで表わされる配列のうちの連続した８
〜９個のアミノ酸からなるポリペプチド（１）の部分ペ
プチドである上記（１）もしくは（４）の抗体；　（７
）式（１）で表わされるアミノ酸配列のうちの連続した
少なくとも８個のアミノ酸を含有するペプチド、または
これらとキャリア蛋白質との複合体で哺乳動物に免疫し
、ポリクローナル抗体を生成させ、これを採取すること
を特徴とする、上記（２）のポリクローナル抗体の製造
法；　（８）式（１）で表わされるアミノ酸配列のうち
の連続した少なくとも８個のアミノ酸を含有するペプチ
ド、またはこれらとキャリア蛋白質との複合体で免疫し
た哺乳動物の脾臓細胞と、該哺乳動物のリンパ球様細胞
とからなるクローン化されたハイブリドーマを液体培地
中または哺乳動物の腹腔内で増殖し、モノクローナル抗
体を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とす
る、上記（３）のモノクローナル抗体の製造法；　（９
）式（１）で表わされるアミノ酸配列のうちの連続した
少なくとも８個のアミノ酸を含有するペプチド、または
これらとキャリア蛋白質との複合体で免疫した哺乳動物
の脾臓細胞と、該哺乳動物のリンパ球様細胞とからなる
クローン化されたハイブリドーマ；　　（１０）式（１
）で表わされるアミノ酸配列のうちの連続した少なくと
も８個のアミノ酸を含有するペプチド、またはこれらと
キャリア蛋白質との複合体で免疫した哺乳動物の脾臓細
胞と、該哺乳動物のリンパ球様細胞とを細胞融合し、ク
ローニングすることを特徴とする該脾臓細胞と該リンパ
球様細胞とからなるクロ一ン化されたハイブリドーマの
製造法；（１１）式［２　］　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ
　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　ＧｌｙＧ
ｌｕ　丁ｙｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｃｙｓで表わされる配
列のうちの連続した１２〜１４個のアミノ酸からなるポ
リペプチド（１）の部分ペプチド：（１２）式〔３〕Ｃ
ｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｉｌ
ｅ　Ｇｌｙ　Ａｒｇで表わされる配列のうちの連続した
８〜９個のアミノ酸からなるポリペプチド（１）の部分
ペプチド；（１３）式（１）で表わされるアミノ酸配列
のうちの連続した少なくとも８個のアミノ酸を含有する
ペプチドとキャリア蛋白質との複合体：　　（１４）ペ
プチドが式（１）のアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ド（１）である、上記（１３）の複合体；（１５）ペプ
チドが上記（１１）または（１２）の部分ペプチドであ
る、上記（１３）の複合体；（１６）上記（１）、（３
），（４）．（５）または（６）の抗体を用いることを
特徴とする、ポリペプチド（夏）の精製法；（１７）上
記（】）、（３）、（４）、（５）または（６）の抗体
を用いることを特徴とする、ポリペプチド（１）の検出
・定量法である。 本発明の抗体を製造するにあたっては、ポリペプチド（
１）またはその部分ペプチドを免疫原として用いること
ができる。 本発明におけるポリペプチド（１）としては、式

【１〕
のアミノ酸配列であるポリペプチド、式〔１〕のアミノ
酸配列のＣ末端にさらにスレオニン残基を有するアミノ
酸配列であるポリペプチドが挙げられる。さらに、本発
明におけるポリペプチド（１）としては、式〔１〕のア
ミノ酸配列のＮ末端に数個のアミノ酸残基を有するおよ
び／またはそのＣ末端に数個のアミノ酸残基を有するポ
リペプチドが挙げられる。 後述の参考例において、大腸菌より発現されたポリペプ
チド（１）は、Ｃ末端にＴｈｒが付加した次のアミノ酸
配列（１’　）： ＴｙｒＡｌａＧｌｕＨｉｓＬｙｓＳｅｒＨｉｓＡｒｇＧ
１ｙＧｌｕＴｙｒＳｅｒＶａｌＣｙｓＡｓｐＳｅｒＧｌ
ｕＳｅｒＬｅｕ丁ｒｐＶａｌＴｈｒＡｓｐＬｙｓＳａｒ
ＳｅｒＡ１ａＩｌｅＡｓｐＩｌｅＡｒｇＧｌｙＨｉｓＧ
１ｎＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕＧ１ｙＧ１ｕＩｌｅＬｙ
ｓＴｈｒＧｌｙＡｓｎＳｅｒＰｒｏＶａｌＬｙｓＧ１ｎ
ＴｙｒＰｈｅＴｙｒＧｌｕＴｈｒＡｒｇＣｙｓＬｙｓＧ
ｌｕＡｌａＡｒｇＰｒｏＶａｌＬｙｓＡｓｎＧｌｙＣｙ
ｓＡｒｇＧ１ｙＩｌｅＡｓｐＡｓｐＬｙｓＨｉｓＴｒｐ
ＡｓｎＳｅｒＧ１ｎＣｙｓＬｙｓＴｈｒＳｅｒＧ１ｎＴ
ｈｒＴｙｒＶａｌＡｒｇＡ１ａＬｓｕ丁ｈｒＳｅｒＧ１
ｕＡｓｎＡｓｎＬｙｓＬｅｕＶａｌＧ１ｙＴｒｐＡｒｇ
ＴｒｐＩ１ｅＡｒｇＩ１ｅＡｓｐＴｈｒＳｅｒＣｙｓＶ
ａｌＣｙｓＡｌａＬｅｕＳｅｒＡｒｇＬｙｓＩｌｅＧｌ
ｙＡｒｇＴｈｒ　　　　　　　　（　１　’　　）を有
するものが製造された． また、後述の参考例において、動物細胞で発現されたポ
リペプチド（１）は、アミノ酸配列（１）または（１′
）を有すると考えられる。 本発明におけるポリペプチド（１）としては、上記した
ポリペプチドの他に、同一の活性を有する上記ポリペプ
チドの一部；または上記アミノ酸配列の一部が他のアミ
ノ酸もしくはアミノ酸配列で置換、付加もしくは挿入さ
れかつ同じ活性を有するポリペプチドも含まれる。 なお、遺伝子組換え技術を用いてポリペプチド（１）を
製造する場合に、該ポリベプチド（１）をコードする遺
伝子の上流の開始コドンＡＴＧに対応するメチオニン残
基がポリペプチド（　１　’）のＮ末端に付加している
ものでもよい． ポリペプチド（１）を得るには、例えばポリペプチド（
１）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを適当
な宿主に組み込み，得られた形質転換体を培養すること
により得られる。 上述のポリペプチド（１）をコードする塩基配列を含有
する発現型ベクターは、例えば、（イ）ポリペプチド（
１）をコードするＲＮＡを分離し、（口）該ＲＮＡから
単鎖の相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）を、次いで二重鎖ＤＮ
Ａを合成し， （ハ）該相補ＤＮＡをプラスミドに組み込み，（二）得
られた組み換えプラスミドで宿主を形質転換し、 （ホ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体から適
当な方法、例えばＤＮＡプローブを用いたコロニーハイ
ブリダイゼーション法、により目的とするＤＮＡを含有
するプラスミドを単離し、（へ）そのプラスミドから目
的とするクローン化ＤＮＡを切り出し、 （ト）該クローン化ＤＮＡをベクター中のプロモーター
の下流に連結する、 ことにより製造することができる。 ポリペプチド（Ｉ）をコードするＲＮＡは種々のポリペ
プチド（１）産生細胞、例えばヒトグリオーマ細胞、下
垂体細胞あるいは線維非細胞から得ることができる。 このようにして得られた発現ベクターを、適当な宿主（
例、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞）に組み込み、得
られた形質転換体を培養することにより、ポリペプチド
（１）を製造することができる。 また免疫原としてはポリペプチド（１）のアミノ酸配列
のうち連続した少なくとも８個のアミノ酸からなる部分
ペプチドを用いることが出来、例えばそのＮ末ペプチド
として式（２）　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　　Ｈｉｓ　
　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｈｉｓ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｙ　
　Ｇｌｕ　　丁ｙｒ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　ＣｙＳで
表わされる配列のうちの連続した１２〜１４個のアミノ
酸からなるペプチド、またＣ末ペプチドとしての式（３
）　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ
　ＩＩｅ　Ｇｌｙ　Ａｒｇで表わされる配列のうちの連
続した８〜９個のアミノ酸からなるペプチドが挙げられ
る。 上記部分ペプチドは、ペプチド合成の公知の常套手段で
製造し得る。そしてそれは、固相合成法、液相合成法の
いずれによってもよい。そのようなペプチド合成の方法
として、例えば、「ザペプチズ（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ）　Ｊ　、第１巻（１９６６年）　、５ｃｈｒｏｄ
ｅｒ　ａｎｄ　Ｌｕｂｋｅ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ
ｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　　”
ペプチド合成″、東屋ら著、丸善株式会社（１９７５年
）あるいは″ペプチド合成の基礎と実験″泉屋ら著、丸
善株式会社（１９８５）に記載の方法が挙げられる。 また、該部分ペプチドは、適当な酵素によりポリペプチ
ド（１）を切断することにより製造してもよい、該方法
として、たとえば、″生化学実験講座ｌ　タンパク質の
化学■パ、日本生化学会編、東京化学同人（１９７６）
の２５５ページから３３２ページに記載の方法が挙げら
れる。 該式（１）で表わされるアミノ酸配列のうちの連続した
少なくとも８個のアミノ酸を含有するペプチドを免疫す
るに際しては、ポリペプチド（１）またはその部分ペプ
チドをキャリヤー蛋白との複合体としてから、これを免
疫に用いてもよい。 該キャリアー用蛋白としては、例えば、牛血清アルブミ
ン、牛チログロブリン、牛ガンマグロブリン、ヘモシア
ニン、フロイントの完全アジュバント（デイフコ社製）
などが挙げられる。 該ペプチドとキャリアー用蛋白との結合には、公知の常
套手段を用いて実施し得る。結合に用いる試薬としては
、例えば、ゲルタールアルデヒド、水溶性カルボジイミ
ドなどが挙げられる。ペプチドとキャリアー用蛋白との
使用比は、約１対工ないし約１対３０（重量比）が適当
であり、特に１対１５〜２０が好ましく、さらに、約１
＝１ないし、１：４が好ましい０反応のｐＨは、中性付
近、特に７．３前後が良好な結果を与える場合が多い。 また１反応に要する時間は、約２〜６時間が良い場合が
多いが、特に、約３時間が適当である。このようにして
作成された複合物は、常套手段で約４℃前後で水に対し
て透析し、凍結して保存しても良いし、凍結乾燥して保
存しても良い。 ポリクローナル抗体を製造するためには１以上のように
して製造した免疫原が、温血動物に接種される６上記抗
体の製造に用いられる温血動物としては、例えば、哺乳
温血動物（例、羊、山羊、ウサギ、ウシ、ラット、マウ
ス、モルモット、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、
ハト、アヒル、ガチョウ、ウズラ）などが挙げられる。 免疫原を、温血動物に接種する方法としては、動物に接
種する免疫原は、抗体産生をするに有効な量でよく、例
えば、ウサギに１回１■を１ｍＱの生理食塩水およびフ
ロイントの完全アジュバントで乳化して、背部ならびに
後肢掌皮下に４週問おきに５回接種すると抗体を産生さ
せる場合が多い、このようにして、温血動物中に形成さ
れた抗体を採取する方法としては、例えばウサギでは１
通常最終接種後７日から１２日の間に耳静脈から採取し
、遠心分離して血清として得られる。得られた抗血清は
、通常、各抗原ペプチドを保持させた担体を用いるアフ
ィティクロマトグラフィーで吸着した両分を回収するこ
とによりポリクローナル抗体を精製することが出来る。 また、ミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの方法〔ネ
イチ’ｒ−（Ｎａｔｕｒｅ）、第２５６巻（１９７５）
、第４９５頁〕に記載の方法と同様の方法により得られ
るモノクローナル抗体も利用できる。すなわち、上記の
ポリクローナル抗体の調製法と同様に免疫された温血動
物、たとえばマウスから抗体価の認められた個体を選択
し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し
、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合さ
せることにより、本発明のモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマを調製することができる。融合操作は既知の
方法、たとえばケーラーとミルスタインの方法〔ネイチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ）、夛咀、４９５　（１９７５））
に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられ
るが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞とし
てはたとえばＮ５−１．Ｐ３Ｕ１、Ｓ　Ｐ　２１０など
があげられるが、特にＰ３Ｕ１が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞（＃ｌＩｍ胞）数と骨髄細胞数
との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥ
Ｇ　（好ましくはＰ　Ｅ　Ｇ　１０００−　Ｐ　ＥＧ　
６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０
〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜ｌＯ分間イン
キュベートすることにより効率よく細胞融合を実施でき
る。 モノクローナル抗体を得るためには、ラット、マウスを
用いるのが好ましい。免疫方法は１例えばマウスを免疫
する場合、皮下、腹腔内、静脈内に（とりわけ皮下）注
入するのが好ましい、また、免疫間隔、免疫量等の可変
度は高く、種々の方法が可能であるが、例えば２週間隔
で約２〜６回免疫し、最終免疫後、約１〜５日、好まし
くは約２〜４日後に摘出した脾臓細胞を用いる方法がよ
く用いられる。免疫量は１回にペプチド量として、マウ
ス当り約０．１μｇ以上、好ましくは約１０μｇ〜３０
０μｇ用いることが望ましい。又、脾臓を摘出する前に
１部分採血を行い、血中の抗体価の上昇を確認した上で
脾臓細胞を用いる融合実験を行うことが望ましい。 上記脾臓細胞とリンパ球様細胞との細胞融合は例えば摘
出したマウスの脾臓細胞を、ヒポキサンチン−グアニン
−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ
″″）やチミジンキナーゼ欠損（ＴＫ”−）の様なマー
カーを持った適切な同種または異種（好ましくは同種）
のミエローマｃ例、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ・８ＵＩ　（市
森ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド（
Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ。 Ｍｅｔｈｏｄ）　８０５５（１９８５））等の、リンパ
球様細胞株との間で融合させる１例えばケラ−およびミ
ルスタインらの方法（ネイチ’ｒ　　（Ｎａｔｕｒｅ）
２５６：４９５（１９７５）〕に準じて融合させること
により製造される。たとえばミエローマ細胞と肺細胞と
を約１＝５の割合で、たとえばイスコツ培地とハムＦ−
１２培地を１＝１に混合した培地（以下ＩＨ培地と称す
る）に懸濁させ、センダイウィルス、ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）等の融合剤が用いられる。もちろんジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）その他の融合促進剤を
加えることも可能である。ＰＥＧの重合度は、ふつう約
１　、０００〜６，０００、時間は約０゜５〜３０分、
濃度は約１０％〜８０％等が用いられるが。 好ましい条件の一例として、Ｐ　Ｅ　Ｇ６，０００を約
３５〜５５％で約４〜１０分処理することにより、効率
よく融合させることが出来る。融合細胞は、ヒポキサン
チン−アミノプテリン−チミジン培地（ＨＡＴ培地；ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、　２５６．４９５（１９７
５））等を用いて１選択的に増殖させることが出来る。 増殖して来た細胞の培養上清は、目的とする抗体産生が
あるか否かについてスクリーニングを行うことができる
が、抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが出来
る。即ち、この場合には、まず第１段階として免疫した
ペプチドに対する抗体産生の有無を、ラジオイムノアッ
セイ（ＲＩＡ）法またはエンザイムイムノアッセイ（Ｅ
ＩＡ）法等の方法で調べることが出来るが、これらの方
法についても種々の変法が可能である。好ましい測定法
の一例として、ＥＩＡを用いる一つの方法について述べ
る。セルロースビーズ等の担体に、例えばウサギ抗マウ
スイムノグロブリン抗体を常法に従ってカプリングさせ
ておき、これに測定したい培養上清や、マウスの血清を
加え、一定時間、定温（約４〜４０℃を示す。以下にお
いても同様。）で反応させる。この後、反応物をよく洗
った後、酵素で標識したペプチド（酵素とペプチドを常
法に従いカプリングさせた後精製）を加え、一定時間、
定温で反応させる。反応物をよく洗った後、酵素基質を
加え、一定時間、定温で反応させ、その後、生成発色物
を吸光度または蛍光度等で測定することが出来る。 選択培地で増殖を示し、かつ免疫に用いたペプチドに対
する抗体活性のみられたウェルの細胞は、限界希釈法等
によりクローニングを行うことが望ましい。クローン化
された細胞の上滑について同様にスクリーニングを行い
抗体価の高いウェルの細胞を増やすことにより、免疫し
たペプチドと反応性を示すモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマクローンが得られる。 このようにしてクローン化されたハイブリドーマを、液
体培地中で増殖させる。具体的には例えば、液体培地た
とえばＲＰ　Ｍ　Ｉ　−１６４０（Ｍｏｏｒｅ、Ｇ、Ｅ
。 ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソ
シエーション（Ｊ、　Ａｍ、　Ｍａｄ、　Ａｓ５ｏｃ、
）　１９９．５４９（１９６７））に約０．１〜４０％
の牛血清を加えた培地等で約２〜１０日間、好ましくは
約３〜５日間培養することにより、培養液から該モノク
ローナル抗体を得ることができる。また哺乳動物の腹腔
内に接種し、細胞を増殖させ、腹水を採取することによ
り抗体を取得することが出来る。このためには、例えば
マウスの場合、ミネラルオイル等を前もって接種したＢ
　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ等のマウスに約１×１０４〜ｌＸ
ｌ０’個、好ましくは約５×ｌＯ″〜２Ｘ１０’個のハ
イブリドーマを腹腔内に接種し、約７〜２０日後、好ま
しくは約１０〜１４日後に腹水液を採取する。 腹水に生成蓄積した抗体は、例えば硫安分画、ＤＥＡＥ
−セルロースカラムクロマトグラフィー等により、容易
にモノクローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単
離することが出来る。 このようにして式（１）で表わされるアミノ酸配列のう
ちの連続した少なくとも８個のアミノ酸を含有するペプ
チドに特異的に結合するモノクローナル抗体が得られる
。 本発明のモノクローナル抗体にあっては免疫原の式（１
）で表されるアミノ酸配列のうちの連続した少なくとも
８個のアミノ酸を含有するペプチドと特異的に結合する
。 なお、本発明のモノクローナル抗体は、製造時に用いた
免疫原のペプチドとは異なる式（１）で表わされるアミ
ノ酸配列のうちの連続した少なくとも８個のアミノ酸を
含有するペプチドと結合する場合もある。 本発明のモノクローナル抗体は、免疫原ペプチドである
式（１）で表わされるアミノ酸配列のうちの連続した少
なくとも８個のアミノ酸を含有するペプチドに対するモ
ノクローナル抗体である。 本発明のモノクローナル抗体は、式（１）で表わされる
アミノ酸配列のうちの連続した少なくとも８個のアミノ
酸を含有するペプチドに特異的に結合するという性質を
有する。 本発明のモノクローナル抗体は、次の性質を有する。 （ａ）分子量：約１４０〜１６０キロダルトン。 （ｂ）免疫グロブリンクラスがＩｇＭまたはＩｇＧに属
する。 上記抗体分子は、そのフラクション【例、Ｆ（ａｂ’　
）ｘ＠　Ｆａｂ’もしくはＦａｂ）であってもよい、後
述の標識剤を直接結合させる抗体分子は、Ｆａｂ’であ
ることが好ましい。 本発明のモノクローナル抗体は、ポリペプチド（１）に
対し特異的に結合することから、ポリペプチド（１）測
定用試薬として極めて有用である。 さらに生体臓器１組織中のポリペプチド（１）の測定を
容易にすることは、ポリペプチド（１）に関する基礎知
見（例えば生体内分布）を得る上からも極めて有用であ
る。生体臓器５組織中のポリペプチド（１）の検出には
、通常酵素免疫測定法（Ｅ　Ｉ　Ａ法）などによる定量
、あるいは蛍光抗体法やラジオイムノアッセイ法（ＲＩ
Ａ法）が用いられる。またこれらの１器、組織中に存在
するポリペプチド（１）の大きさを知るにはタンパクの
ウェスタンブロッティング法が有効である。この方法は
臓器、組織由来の粗抽出液あるいはその部分槽製試料を
アクリルアミド電気泳動した後、メンブランフィルタ−
にトランスファーＬ、ＨＲＰ結合抗体で検出する。 また、中和活性のある抗体では、ポリペプチド（１）の
活性を中和させ、ポリペプチド（１）の生体での機能を
追求することも可能である。 さらに該抗体とポリペプチド（、Ｉ）との結合能を利用
し、抗体アブィニティー力ラムを作製してポリペプチド
（１）の精製の試薬として利用す・ることもできる。 ポリペプチド（１）を検出、定量するために用いられる
ＥＩＡ法またはＲＩＡ法としては、例えば、精製した抗
体を０．１〜１０μｇ／ウェル、９６穴プラスチツクプ
レート（例えばヌンク社、デンマークのイムノプレート
）、ガラスピーズ、プラスチックビーズなとの担体に固
定する。固定は、プラスチックの場合約４℃、−夜また
は室温で約０゜５〜４時間反応させることにより行われ
る。ガラスの場合５例えばプロシージングスナショナル
オブザアカデミーオブサイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、第８０巻、第
３５１３〜３５１６頁（１！Ｊ８３年）に記載したよう
な方法で固定する。その他、抗体固定のための各種プレ
ート（前述、ヌンク社等）の市販されているものを使う
こともできる。 以上のようにして抗体を固定したプレート又はビーズに
抗原ポリペプチド（１）を含む溶液を加え吸着反応を行
う。吸着反応は室温で約０．２〜２時間で行われること
もあるが、約４℃、−夜が望ましい。 抗原−抗体の結合反応の後、ｉＩＡ識剤を結合させた抗
体を加え吸着反応を行う、標識剤としては、放射性同位
元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが挙げられるが、
酵素を用いるのが好ましい、酵素としては、安定で比活
性の大きなものが好ましく、ペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ等を用いることができるが、ペルオキ
シダーゼが好ましい、ペルオキシダーゼとしては、種々
の起源のものを用いることができるが、その例としては
たとえば西洋わさび、パイナツプル、イチジク、せ諸、
ソラマメ、トウモロコシなどから得られるペルオキシダ
ーゼが挙げられ、特に西洋わさびから抽出されたホース
ラデイツシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓ
ｈ　ｐａｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ）が好ましい。 ペルオキシダーゼと抗体を結合するにあたり、抗体分子
としてのＦａｂ　’のチオール基を利用するために、あ
らかじめペルオキシダーゼにマレイミド基を導入したも
のを用いると好都合である。 マレイミド基をペルオキシダーゼに導入する方法として
は、ペルオキシダーゼのアミノ基を介してマレイミド基
を導入することができる。そのためにはＮ−サクシニミ
ジル−マレイミド−カルボキシレート誘導体を用いるこ
とができ、好ましくはＮ−（γ−マレイミドブチルオキ
シ）サクシイミド（ＧＭＢＳと略称することもある）な
どが良い、従って、マレイミド基とペルオキシダーゼと
の間に一定の基がはいっていることとなってもよい。 ＧＭＢＳをペルオキシダーゼに反応させるには、両者を
ｐＨ約６ないし８の緩衝液中で約ＩＯないし５０℃の温
度で約１０分ないし２４時間反応させることによって行
われる。該緩衝液としては、たとえば、ｐＨ７，０の０
．１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。 このようにして得られたマレイミド化ペルオキシダーゼ
は、たとえば、ゲルクロマトグラフィーなどにより精製
することができる。該ゲルクロマトグラフィーを行う際
に用いられる担体としては、例えば、セファデックスＧ
−２５（ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデ
ン）　ＩＩ）　）　、バイオゲルＰ−２〔バイオランド
・ラボラトリーズ社（米国）製）〕などが挙げられる。 マレイミド化ペルオキシダーゼと抗体分子との反応は、
両者を緩衝液中で約０℃ないし４０℃の温度で、約１な
いし４８時間反応させることにより行うことができる。 該緩衝液としては、例えば、ｐＨ６，０の５ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む０．１Ｍリン酸緩
衝液などが挙げられる。 このようにして得られたペルオキシダーゼ標識抗体は、
例えばゲルクロマトグラフィーなどにより精製すること
ができる６該ゲルクロマトグラフイーを行う際に用いら
れる担体としては、例えば、セファデックスＧ−２５（
ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデン）製）
〕、バイオゲゲル−２〔バイオランド・ラボラトリーズ
社（米国）製〕などが挙げられる。 さらにペルオキシダーゼにチオール基を導入し、マレイ
ミド化された抗体分子と反応させても良い。 ペルオキシダーゼ以外の酵素を抗体に直接結合させるに
は、ペルオキシダーゼの場合に準じて行うことができ、
また、自体公知のグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法
、水溶性カルボジイミド法などが用いられる。 酵素標識のものについては、反応基質、例えばＨＲＰの
場合２．２′−ジアジノージー〔３−エチルベンゾチア
ゾリンスルフォネート（６））［２，２−Ａｄｉｎｏ−
ｄｉ（３−ｅｔｈｙｌ　ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎ
ｅ　５ｕｌｆｏｎａｔｅ（６）３などを加え発色させ吸
光度を測定する。放射標識のものは、非結合の放射活性
をシンチレーションカウンターで測定する。サンプルの
吸光度または放射活性を既知の量のポリペプチド（夏）
に対する値と比較することによって定量することができ
る。 後述の２種の抗体で抗原をはさみ込むサンドインチＥＩ
Ａ法の他にも自体公知の鯖合的ＥＩＡ法、間接的ＥＩＡ
法が行なわれる。競合的ＥＩＡ法としては、抗体を担体
に固定し、酵素または放射標識した抗原ポリペプチド（
１）と被検試料とを加えて、反応させ定量する０反応条
件、標識量の測定は、上述と同様に行なわれる０間接的
ＥＩＡ法としては、被検試料と固定していない抗体とを
反応させ、未吸着の抗体を抗原固定のプレートと抗マウ
ス標識抗体によって定量する１反応条件、標識量の測定
は、上述と同様に行なわれる。 本発明のポリペプチド（１）の検出・定量等の測定系に
おける被検試料としては、尿、血清、血漿、髄液等の体
液、あるいは、動物細胞や菌体の抽出液またはその培養
上清が挙げられる。 本発明の測定方法の例として、標識剤がペルオキシダー
ゼの場合について以下に具体的に説明するが、ペルオキ
シダーゼに限定されるものではない。 まず、■；担体に保持された抗体に測定すべきポリペプ
チド（１）含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行
った後、これに前記で得られたペルオキシダーゼと抗体
との結合物を加えて反応させる。 この本測定系における被検試料としては、尿、血清、血
漿、髄液等の体液、あるいは、動物細胞や菌体の抽出液
またはその培養上清が挙げられる。 ポリペプチド（１）の測定方法において用いられる担体
上に保持された抗体における担体としては、例えば、ゲ
ル粒子（例、アガロースゲル〔例。 セファロース４Ｂ、セファロース６Ｂ（ファルマシア・
ファインケミカル社（スエーデン）製）〕、デキストラ
ンゲル〔例、セファデックスＧ−７５、セファデックス
Ｇ−１００、セファデックスＧ−２００（ファルマシア
・ファインケミカル社（スエーデン）製）】、ポリアク
リルアミドゲル〔例、バイオゲルＰ−３０、バイオゲル
Ｐ−６０％バイオゲルＰ−１００（バイオランド・ラボ
ラトリーズ社（米国）製）〕、セルロース粒子〔例、ア
ビセルｌ化成製）、イオン交換セルロース（例、ジエチ
ルアミノエチルセルロース、カルボキシメチルセルロー
ス）〕、物理的吸着剤〔例、ガラス（例、ガラス球、ガ
ラスロンド、アミノアルキルガラス球、アミノアルキル
ガラスロッド）、シリコン片、スチレン系樹脂（例、ポ
リスチレン球。 ポリスチレン粒子）、イムノアッセイ用プレート（例、
ヌンク社（デンマーク）製）〕、イオン交換樹脂（例、
弱酸性陽イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩＲＣ−
５０（ローム・アンド・ハース社（米国）製）、ゼオカ
ーブ２２６（パームチット社（西ドイツ）製）〕１１弱
塩基性陰イオン交換樹脂例、アンバーライトＩＲ−４Ｂ
、ダウエックス３（ダウケミカル社（米国）製）〕）な
どが挙げられる。 担体に抗体を保持させるには、公知の常套手段を応用し
得るが１例えば、“代謝”、第８巻（１９７１年）、第
６９６頁に記載されているブロムシアン法、ゲルタール
アルデヒド法などが挙げられる。また。 より簡便な方法として物理的に担体表面に吸着させても
よい。 ■二〇で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。 ■二上記Φ〜■の操作を既知量のポリペプチド（１）の
標準溶液に対してあらかじめ行い、ポリペプチド（１）
の吸光度もしくは蛍光強度との関係を標準曲線として作
成しておく。 ■：未知量のポリペプチド（１）を含む分析対象物（被
検試料）について得られた吸光度もしくは蛍光強度を標
準曲線にあてはめ、分析対象物中のポリペプチド（１）
の量を測定する。 また、上記抗体はＷｅｓｔｅｒｎブロッティング［％１
゜Ｎ、Ｂｕｒｎｅｔｔａ、アナリティカルバイオケミス
トリ−（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ）　、１１２，１９５（１９８１））によるポリペ
プチド（１）の検出・定量に利用することができる。 以下に−ｅｓｔ８ｒｎブロッティングの具体例を示す。 ポリペプチド（１）を含む試料を、例えばｓａｗｐｉｅ
　ｂｕｆｆｅｒ　（Ｕ、に、Ｌａｅｍｍｌｉ、ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）　＋２２７．６８０（１９７０））
に溶解する。この場合、還元剤として２−メルカプトエ
タノールを加える場合（還元条件下）と加えない場合（
非還元条件下）があり、そのいずれでもよい、この溶液
を約１００℃で５分間加熱したのち、電気泳動にかける
。電気泳動としては、蛋白質が分離できるものなら何で
も良く、具体的には例えばＳＤＳを含むポリアクリルア
ミドゲル電気泳動などが挙げられる。泳動後のゲルから
蛋白質をニトロセルロース膜に移す。 この方法自体は公知であり、例えば、Ｂｕｒｎｅｔｔｅ
の方法〔アナリティ力ルバイオケミストリ−（Ａｎａｌ
ｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋１ｓｔｒｙ）　＋１
１２，１９５（１９８１））などが挙げられる０次にニ
トロセルロース膜のポリペプチド（１）を免疫学的方法
で検出する。即ち、ニトロセルロース膜を例えば３％ゼ
ラチン溶液でブロッキングしたのち、第１抗体反応を行
う、第１抗体として用いる抗体としては抗血清でも精製
したものでも良いが、精製したものの方が好ましい。 ブロッキング後の第１抗体反応の条件としては、該膜上
のポリペプチド（１）が第１抗体と結合できる条件であ
れば何でも良く、例えば室温で約４〜１６時間で行う、
上記の第１抗体反応ののち、第２抗体反応を行う、用い
る第２抗体としては、第１抗体と結合でき、かつ検出が
可能なものであれば何でも良く、例えば、標識酵素と結
合したＩｇＧなどが挙げられる。標識酵素の具体例とし
ては、ホースラディシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ　）
、アルカリフォスファターゼなどが挙げられる。第２抗
体反応の条件としては第１抗体に第２抗体が結合できる
条件であれば何でも良く１例えば室温で約１時間行う、
上記の第２抗体反応の後、発色を行い、ニトロセルロー
ス膜上のポリペプチド（１）のバンドを検出する。上記
のＷｅｓｔｅｒｎブロッキングでは、約Ｓｏｎｇ以上の
ポリペプチド（１）であれば検出が可能であり１種々の
量のポリペプチド（１）のバンドの濃さと、被検体のバ
ンドの濃さを比較することによって被検体中のポリペプ
チド（１）を定量することもできる。なお上記の第１抗
体の代わりに、例えば、抗体とＨＲＰとの複合体を用い
ても良い。 ポリペプチド（１）の精製のためには、精製した当該抗
体を例えば活性化したアガロースゲルビーズの様な適切
な担体に常法に従ってカプリングさせた後、カラムに充
め、培養上清或いは破さいした菌体等の粗ポリペプチド
＜１）を含む資料を抗体カラムにかけ、吸着させた後、
洗浄し、その後例えばＫＳＣＮ　（チオシアン酸カリウ
ム）の様なカオトロピック試薬、或いはポリペプチド（
夏）の失活のない程度の弱酸性条件で溶出させる方法等
により、効率よく精製できる。 抗体カラムの作製は、例えばハイブリドーマを接種した
腹水等から純粋に精製した本発明のモノクローナル抗体
を適切な担体とカプリングさせることにより、以下の様
な方法でできる。 用いる担体は、カプリングの後にポリペブチド（１）が
特異的に効率よく吸着され、その後適切な溶出が可能な
ものであればどの様なものでもよいが、−例として蛋白
の一級アミンが結合し易い様に活性化されたアガロース
ゲルビーズ、例えばアフィゲル−１０（バイオラド社製
）などが以下に述べる様な方法で好都合に用いられる。 アフィゲル−１Ｏと抗体との反応は、約０．００１−Ｌ
Ｍ、好ましくは約０．１Ｍのパイカーボネート等の緩衝
液中で反応を行なう。反応条件は約０℃〜２０℃、約１
０分〜２４時間、種々のｐＨが可能であるが、好ましく
は約４℃、約４時間、ＰＨ約７〜１０の条件が用いられ
る。混合するアフィゲル−１０と抗体の量比は、アフィ
ゲル１ｍＱに対し抗体量が約５０■位迄は多ければ多い
程多くの抗体がつくのでアフィニティーカラムクロマト
グラフィーにおける精製効率を考慮して１ｍＱのアフィ
ゲルに対し約１０〜３０■の抗体が好都合に用いられる
。この様にしてできた抗体−担体結合物は１反応に用い
た緩衝液でよく洗った後、数日放置するか、もしくは最
終濃度約０．０５〜０．１０Ｍのエタノールアミン・塩
酸、グリシン等の一級アミンを有する化合物を加え約４
℃で約１〜４時間反応させる、あるいは１〜５％牛血清
アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）等のタンパク質を４℃−夜反
応させる等の方法により、残存する未反応の活性基をブ
ロックした後、適切なカラムにつめることにより、抗体
カラムとして使用できる。 上記した抗体カラムで精製するに際しては、たとえばポ
リペプチド（１）蛋白質含有試料を中性付近の緩衝液、
たとえばリン酸緩衝液やトリス・塩酸緩衝液に溶解して
抗体カラムに吸着させる。 次にカラムを同じ緩衝液で洗浄したのち、ポリペプチド
（Ｉ）を溶出する。溶出液としては、たとえば酢酸溶液
、ポリエチレングリコールを含む溶液、試料にくらべ抗
体により結合し易いペプチドを含む溶液、高濃度塩溶液
などおよびこれらを組み合せた溶液などが用いられ、ポ
リペプチド（１）の不活化をあまり促進しないものが好
ましい。 カラム溶出液は、常法により緩衝液で中和する。 必要により再度上記の抗体カラムによる精製操作を行な
うことができる。 さらに、種々の公知の精製手法を組合せることにより、
実質的にパイロジエンもエンドトキシンも含まない、実
質的に純粋なポリペプチド（１）が得られる。本発明の
実質的に純粋なポリペプチド（１）としては、ポリペプ
チド（１）を９０％（ｌｉｌ／ｌ）以上であるもの、さ
らに好ましくはポリペプチド（１）を９５％（Ｖ／Ｖ）
以上であるものが挙げられる。 ここで得られるポリペプチド（１）蛋白質溶液は透析に
付し、必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすること
ができる。凍結乾燥に際しては、ソルビトール、マンニ
トール、デキストロール、マルトース、グリセロールな
どの安定剤を加えることができる。 以上の様にして得られたポリペプチド（１）が活性を有
する場合には、そのまま使用し、活性を示さない場合に
は酵素的あるいは非酵素的方法で活性化して用いること
ができる。 このようにして得られたポリペプチド（１）は動物細胞
、特に神経細胞の分化、あるいは増殖の促進、Ｒ活性作
用等を示し、また種々の蛋白質、酵素等の誘導作用を有
するので、神経損傷その他の神経障害疾患に対して有効
な医薬品となることが期待される。 またポリペプチド（１）はＮＧＦと同様のもしくは類似
の作用を有することも期待される。 本発明のポリペプチド（１）は動物細胞の分化。 成長、増殖、生存維持などに関連する研究のための試薬
としても有用である。 該ポリペプチド（１）を医薬として用いるには、そのま
ま粉末として、または他の薬理学的に許容され得る担体
、賦形剤、希釈剤とともに医薬組成物（例、注射剤、錠
剤、カプセル剤、液剤、軟膏）として、温血哺乳動物（
例、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、犬、
ネコ）に対して非経口的または経口的に安全に投与する
ことができる。 注射剤の製剤化はたとえば生理食塩水またはブドウ糖や
その他の補助薬を含む水溶液を用い、常法に従って行な
われる０錠剤、カプセル剤等の医薬組成物も常法に従っ
て調製し得る。 該ポリペプチド（１）を上記した医薬として用いる場合
には、たとえば上記した温血哺乳動物に、投与ルート、
症状などを考慮して、１日量約１ｎｇないし１００μｇ
　／　ｋ　ｇの中から適当量を選んで投与される。 該ポリペプチド（Ｉ）を動物細胞の分化、成長、増殖、
賦活などに関連する研究のために用いるには、たとえば
ポリペプチド（１）を動物細胞培養用培地１ｍＱあたり
約０．１〜１，０００ｎ　ｇ　／　ｍ　Ｑ、さらに好ま
しくは約１〜１１００ｎとなる量を加えることが好まし
い、ポリペプチド（１）を添加された培地に動物細胞を
培養して、動物細胞の分化、成長、増殖、生存維持など
を測定することができる。 作１− ポリペプチド（１）もしくはその部分ペプチドに対する
抗体を用いることにより、ポリペプチド（１）の単離、
精製、定量を効率よく行なえるようにしたもので、ポリ
ペプチド（１）の医薬品への応用を計るものである。 なお、本明細書および図面において、塩基やアミノ酸な
どを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−Ｉ　Ｕ、Ｂ　Ｃ
ｏｍ５＋１ｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
　Ｎｏｎ＋ｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を次
にあげる。またアミノ酸に関して光学異性体がありうる
場合は。 特に明示しなければＬ体を示すものとする。 ＤＮＡ　　　デオキシリボ核酸 Ａ　　アデニン Ｃシトニジ Ｇ　　　グアニン Ｔ　　チミン Ａｌａ　　：アラニン Ａｒｇ　　：アルギニン Ａｓｎ　　：アスパラギン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　ニジスティン Ｇｉｎ　　：グルタミン Ｇ　ｌ　ｕ　　：グルタミン酸 Ｇｌｙ　　ニゲリシン Ｈｉｓ：ヒスチジン １１ｅ　　：イソロイシン Ｌｅｕ　　：ロイシン Ｌｙｓ　　：リジン Ｍｅｔ：メチオニン Ｐｈｅ　　：フェニールアラニン Ｐｒｏ　　ニブロリン Ｓｅｔ　　：セリン Ｔｈｒ　　：スレオニン Ｔｒｐ　　ニトリブトファン Ｔｙｒ　　：チロシン Ｖａｌ　　：バリン ＢｏＣ：ｔ−ブチルオキシカルボニル ＭｅＢｚｌ：ｐ−メチルベンジル Ｂｚｌ　　：ベンジル ーＰ　　：ペプチド固相合成用ポリスチレン樹脂ＰＡＭ
　　：Ｐ−オキシメチルフェニルアセトアミドメチル樹
脂 Ａ　ｃ　ＯＨ：酢酸 ０Ｂｚｌ：ベンジルエステル Ｔｏｓ　ニドシル Ｂｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニルｃｏ−
ｚ：２−クロロベンジルオキシカルボニル後述の参考例
１で得られた形質転換体エシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｍ　Ｖ　１１８４　／　ｐ
ＵＮＫ５は平成１年２月１０日から財団法人発酵研究所
（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦ０　１４８３２として寄託さ
れている。また該微生物は平成１年２月２２日に通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託
番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−２３０４として寄託されている。 後述の参考例８で得られた形質転換体エシェリヒア　コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｂ　Ｌ　２
１　（Ｄ　Ｅ　３　）／ｐＬｙｓｓ、ｐＥＮＧＦＴ１０
２は平成１年７月１４日から財団法人発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）に受託番号ＩＦＯ１４９０３として寄託されている
。 また該微生物は平成１年７月２６日に通商産業省工業技
術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−２５２９として寄託されている。 後述の実施例２（３）で得られたマウスＮ４−２細胞、
マウスＮ４６−３１細胞、マウスＮ８２−４細胞および
マウスＮ１４８−６２細胞はそれぞれ、平成２年４月２
５日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に、また平成２
年５月１５日か、ら通商産業省工業技術院微生物工業技
術研究所（ＦＲＩ）に次の受託番号として寄託されてい
る。 ＩＦＯＦＥＲＭ　ＢＰ ＭｏＡｂ　４−２　　　５０２４１　　　　２９０８Ｍ
ｏＡｂ　４６−３１　　５０２４２　　　　２９０９Ｍ
ｏＡｂ　８２−４　　５０２４３　　　　２９１０Ｍｏ
Ａｂ　１４８−６２　５０２４４　　　　２９１１去】
１殊 以下に、実施例、参考例を挙げて、本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでは
ない。 １　ポリペプチド　Ｉ　　ｃＤＮＡのクローニング Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｙ１０９０にヒトグリオーマ由来のλ
ｇｔ　　１１ｃＤＮＡライブラリー（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉａｓ、　Ｉｎｃ、）を感染させ
たのち、約６　Ｘ　１０’個のファージをＮＺＣＹＭ培
地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、＾Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２
に記載）にまき、３７℃で５時間培養した０次にナイロ
ン膜をプレート上にのせ、１分間放置後、プレートから
はずした。このナイロン膜を０．５Ｍ　Ｎ　ａ　０Ｈ−
１，５Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＱ、次いで１．５Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ
Ｑ　−０，５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　、　ｐ　Ｈ８゜０
に浸し、さらに２ＸＳＳＣ［モレキュラー　クローニン
グ　ア　ラボラトリ−マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ
ｕａｌ）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）参照〕に浸し、風乾
後、８０℃で２時間放置した。 ヒトβＮＧＦ（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３０３，
８２１（１９８３））をコードするＤＮＡ　（約０．３
８ｋｂ）を化学合成し、ニックトランスレーションによ
って〔α−”Ｐ）ｄＣＴＰを用いてラベル化することに
よってプローブを作製した。 上記で得られたナイロン膜とプローブを用いてＭｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２に記載の方法に
従ってハイブリダイゼーションを行った。即ち、プロー
ブを含むハイブリダイゼーション溶液にナイロン膜を浸
し、６５℃で１６時間保温した。該ナイロン膜を室温に
おいて２ＸＳＳＣ−０，１％ＳＤＳで洗浄したのち、６
０℃においてｌＸ５ＳＣ−０，１％ＳＤＳで洗浄した０
次にオートラジオグラフィーによって陽性クローンを得
た。 このようにして得られたクローンλβＧＮ１３２１から
ＥｃｏＲＩでｃＤＮＡを切り出し、プラスミドｐＵｃ１
１８（宝酒造株式会社製）のＥｃｏＲ，１部位に挿入し
、プラスミドｐＵＮＫ５を得た。得られたプラスミドｐ
ＵＮＫ５を用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
　ＭＶ１１８４　（宝酒造株式会社から入手）を形質転
換し、形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　
ＭＶ１１８４／ｐＵＮＫ５　（ＩＦＯ１４８３２，ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ−２３０４）を得た。 このプラスミドｐＵＮＫ５に含まれるポリペプチド（１
）　　ｃＤＮＡを含む全長駒０．７３ｋｂのｃＤＮＡの
制限酵素地図を第１図に示す。第１図中の口は非翻訳領
域を、ｍはプロペプチドをコードする領域を、罪は式（
１）のアミノ酸配列のＣ末端にさらにスレオニン残基を
有するアミノ酸配列であるポリペプチドをコードする領
域をそれぞれ示す。 上記で得られたｃＤＮＡの塩基配列をジデオキシ法（Ｍ
ｅｓｓｉｎｇら、ヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎｕ
ｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、）、　９　、３０９（１
９８１））によって決定した。決定された塩基配列およ
びこれにより翻訳されたアミノ酸配列を第２図に示す、
第２図において、アミノ酸配列の−１からＮ末端側はプ
ロペプチドの一部であり、１から１１８または１から１
１９は式（１）のアミノ酸配列であるポリペプチドまた
は式（１）のアミノ酸配列のＣ末端にさらにスレオニン
残基を有するアミノ酸配列であるポリペプチドをそれぞ
れ示す。 上記により決定されたポリペプチド（Ｉ）のアミノ酸配
列をＵｌｌｒｉｃｈら、ネイチ’ｒ　−（Ｎａｔｕｒｅ
）、３０３゜８２１（１９８３）に示されたヒトβＮＧ
Ｆのアミノ酸配列と比較し第３図に示す、第３図におい
て、上段は本発明のポリペプチド（１）のうちの１１９
個のアミノ酸配列を、下段はヒトβＮＧＦのアミノ酸配
列をそれぞれ示す、同じアミノ酸残基の部分を四角で囲
った。また１図中−は単に結合手を示す。 該比較から明らかな如く、本発明のポリペプチド（１）
のうちの１１９個のアミノ酸配列は、上記ヒトβＮＯＦ
のアミノ酸配列と約６０％の相同性を有する。 さらに、上記により決定されたポリペプチド（１）のう
ちの１１９個のアミノ酸配列をＡｎｇｅｌｅｔｔｉら、
プロシージングスオブザナショナルアカデミーオブサイ
エンシズ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏ
ｎａＩＡｃ＋ｓｄｅｗ＊ｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、
ＵＳＡ）、　６８．２４１７（１９７１）；　５ｃｏｔ
ｔら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３０２．５３８（
１９８３）に示されたマウスβＮＧＦのアミノ酸配列と
比較すると約６０％の相同性を有する。 ２　ポリペプチド　Ｉ　　ｃＤＮＡの　クローニング 参考例１で得られたｐＵＮＫ５に含まれるポリペプチド
（Ｉ）ｃＤＮＡの５′末端側を含むＥｃ。 Ｒ１−ＡｈａｌＩＩ断片（約０．４４ｋｂ）をプローブ
として、ヒトグリオーマ由来のｃＤＮＡライブラリー（
Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎ
ｃ、）の中から参考例１と同様の方法でクローン化を行
った。得られた多くの陽性クローンの１つλＨＮＴ３１
からＥｃｏＲＩでｃＤＮＡを切り出し、プラスミドｐＵ
ｃ１１９（全酒造）のＥｃｏＲ１部位に挿入し、プラス
ミドｐＨＮＴ２を得た。ｐＨＮＴ２に挿入されているポ
リペプチド（１）ｃＤＮＡ　（約ｘ、ｔｋｂ）の制限酵
素地図を第４図に示す、第４図中のローはシグナルペプ
チドをコードする領域を、ｍはプロペプチドをコードす
る領域を、口は式〔１〕のアミノ酸配列のＣ末端にさら
にスレオニン残基を有するアミノ酸配列であるポリペプ
チドをコードする領域をそれぞれ示す。 上記で得られたｃＤＮＡの塩基配列をジデオキシ法によ
って決定した。決定された塩基配列およびこれにより翻
訳されるアミノ酸配列を第５図に示す、第５図において
、Ｓｉｇｎａｌをシグナルペプチドを、Ｐｒｏはプロペ
プチドを、Ｍａｔｕｒｅはポリペプ。 チド（Ｉ）（成熟蛋白）をそれぞれ示す。 参考例１で得られたプラスミドｐＵＮＫ５に挿入されて
いるポリペプチド（１）ｃＤＮＡには、ポリペプチド（
，１）のＮ末端の１１番目のチロシン残基をコードする
領域付近にＳｅａ　１部位が、ポリペプチド（１）の終
止コドンの５０塩基下流付近にＮ５ｉ１部位が存在する
（第２図、第４図、第５図参照）、そこでｐＵＮＫ５よ
り０．３ｋｂＳｃａｌ−Ｎｓｉｌ断片を単離し、これに
アダプターＮＧＦＴＥ−１（３５ｍｅｒ）　、ＮＧＦＴ
Ｅ−２（３３ｍｅ　ｒ）　、ＮＧＦＴＥ−３（７ｍｅ　
ｒ）、ＮＧＦＴＥ−４（１５ｍｅｒ）をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで連結したのち制限酵素ＮｄｅｌとＢａｍＨＩで処
理し、０．３ｋｂ　　ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た
（第６図参照）。 該アダプターを次に示す。 ＮＧＦＴＥ−１：５’　ＴＡＴＧＴＡＣＧＣＧＧＡＧＣ
ＡＴＡＡＧＡＧＴＣＡＣＣＧＡＧＧＧＧＡＧＴ　３’　
３５ｍｅｒＮＧＦＴＥ−２：５’　ＡＣＴＣＣＣＣＴＣ
ＧＧＴＧＡＣＴＣＴＴＡＴＧＣＴＣＣＧＣＧＴＡＣＡ　
３’　　３３ｍｅｒＮＧＦＴＥ−３：５’　ＴＧＣＣＡ
ＧＧ　３’　　　　　　　　　　　　　７ｍｅｒＮＧＦ
ＴＥ−４：５’　ＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＴＧＣＡ　３
’　　　　　　　　　１５ｍｅｒ一方、Ｔ７プロモータ
ーを有する発現ベクターｐ　Ｅ　Ｔ　−３Ｃ（Ｒｏｓｅ
ｎｂｅｒｇら、ジーン（Ｇｅｎｅ）ｔ　５６ｓ１２５（
１９８７））をＮｄｅｌとＢａｍＨＩで切断し、４゜４
ｋｂ　Ｎｄｅ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片を単離した。 上記で得られた４、４ｋｂ　Ｎｄ　ｅ　Ｉ−ＢａｍＨ１
断片を前記の０．３ｋｂのＮｄｅｌ−ＢａｍＨＩ断片と
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、Ｅ、　ｃｏｌｉ　
ＤＨｌに導入し、得られたアンピシリン耐性の形質転換
株（Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＨｌ　／　ｐ　Ｅ　ＮＧ　Ｆ　
Ｔ　１０２）がら単離したプラスミドをｐ　Ｅ　Ｎ　Ｇ
　Ｆ　Ｔ　１０２と命名した（第６図）。 考　４　　　　換　の　　および 参考例３で得られたポリペプチド（１）発現ベクターｐ
ＥＮＧＦＴ　１０２を用いてＥ、　ｃｏｌｉ　Ｂ　Ｌ　
２１　（ＤＨ３）（ジーン（Ｇｅｎｅ）、　５６，１２
５（１９８７））の形質転換体Ｅ、ｅｏｌｉ　ＢＬ２１
　（ＤＨ３）／ｐＥＮＧＦＴ１０２を得た。 Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＢＬ２１　　（ＤＨ３）／ＰＥＮＧＦ
Ｔ　　１０２を、５０μｇ　／　ｍ　Ｑアンピシリンお
よび０．２％グルコースを含む５ｍｊ２のＬＢ培地で試
験管で３７℃、１６時間培養した。得られた培養液の１
ｍＱを２０ｍＱの同じ培地を含む２００ｍ　Ｑ容フラス
コに移し、３７℃で培養し、Ｋｌｅｔｔ値が１７０〜２
００になった時工ＰＴＧを終濃度０．４ｍＭになるよう
に加え、さらに３時間培養した。得られた培養液の３０
μｐから集めた菌体を３０μＱのサンプル緩衝液（５０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ、ｐＨ６，８−２ｍＭ　ＥＤＴＡ
−１％５ＤＳ−１％メルカプトエタノール−８％グリセ
ロール−０，０２５％ブロムフェノールブルー〕に懸濁
し、１００℃、５分間加熱したのち０．１％ＳＤＳを含
む１６％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。泳動
後のゲルをクーマシーブリリアントブル−（Ｃｏｏｍａ
ｓｓｉｅ　ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅ）で染色した
ところ、前記ベクターｐＥＴ−３Ｃを用いてＥ、　ｃｏ
ｌｉ　Ｂ　Ｌ２１　（ＤＨ３）を形質転換して得られた
Ｅ、　ｃｏｌｉＢＬ２１　（ＤＨ３）／ｐＥＴ−３Ｃで
は認められなイ１５キロダルトン（ｋｄａ）の蛋白質が
Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　（ＤＨ３）／ＰＥＮＧＦＴ
　１０２では認められ、その生産量は全蛋白質の約１０
％であった。また該蛋白質は、ウサギ抗マウスＮＧＦ抗
体（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
　Ｉｎｃ、米国）を用いたウェスタンブロッティングで
も検出された。 参考例２で得られたプラスミドｐＨＮＴ２よりポリペプ
チド（１）ｃＤＮＡを含有する１、１ｋｂ　ＥｃｏＲＩ
断片を単離した。一方、発現ベクターｐＴＢ３８９（特
開昭６４−２５７２　（Ｅ　Ｐ−２５１，２４４Ａに対
応）に記載〕をＥｃｏＲＩで切断し、上記のポリペプチ
ド（１）ｃＤＮＡを含有する１、１ｋｂ　ＥｃｏＲｌ断
片とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結させ、Ｅ、　ｃｏｌｉ　
ＤＨｌ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、
　ｐ５０５（１９８２））の形質転換を行った。得られ
たアンピシリン耐性の形質転換体Ｅ、ｃｏｌｔ　ＤＨＩ
／ｐＮＴＫ２６からプラスミドを単離し、これをｐＮＴ
Ｋ２６と命名した。 プラスミドｐＴＢ５０５（特開昭６２−１７５１８２　
（ヨーロッパ特許公開２５５，７０１Ａに相当）に記載
〕よす二−ベルソンマウス白血病ウィルス（Ａ　−Ｍ　
ｕＬＶ）ＬＴＲ領域を含む１．１ｋｂ　Ｃ１ａ　ｌ−Ｈ
ｌ　ｎｄＩ［ｌ断片を単離した。一方、プラスミドｐ　
ＮＴＫ２６を制限酵素Ｃ１ａｌとＨｉｎｄｌ［Ｉで切断
して小さい断片を除去したのち上記のＡ−ＭｕＬＶ）Ｌ
ＴＲ領域を含む１．１ｋｂ　Ｃ１ａ　ｌ−Ｈｌ　ｎｄｌ
［ｌ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結させ、Ｅ、　　ｃ
ｏｌｉ　ＤＨｌの形質転換を行ない、アンピシリン耐性
の形質転換体Ｅ、　　ｃｏｌｉ　ＤＨ１／　ｐ　Ｎ　Ｔ
　Ｌｉ２Ｓを得た。 このようにして得られた形質転換体からプラスミドｐＮ
ＴＬ１４５を単離した（第７図）。 参考例２で得られたプラスミドｐＨＮＴ２よりポリペプ
チド（１）ｃＤＮＡ中のシグナルペプチド、プロペプチ
ドおよびポリペプチド（１）をコードする領域を含む０
．８６ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ａ　ｈ　ａ　ｍ断片を単離
した（ＡｈａＩ［Ｉについては第４図および第５図参照
）、得られた本断片の５′末端（ＥｃｏＲＩ）をＫｌｅ
ｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔで平滑化したのち、両末端に
Ｘｈｏｌリンカ−ｐＣＣＴＣＧＡＧＧをＴ４リガーゼで
連結し、Ｘｈｏｌで処−理して０．８６ｋｂ　　Ｘｈｏ
ｌ断片を得た。 一方、動物細胞用発現ベクターｐＫｓＶ−１０（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）を制限酵素Ｂｇｌｌｌで切断したのち、
Ｋｌｅｎｏｖ　Ｆｒａｇｍｅｎｔで両末端（Ｘｈｏｌ）
を平滑化した。これにＸｈｏｌリンカ−（前出）を付与
し、上記の０．８６ｋｂ　　Ｘｈｏｌ断片とＴ４ＤＮＡ
リガーゼで連結させ、　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＨＩの形質
転換を行った。得られたアンピシリン耐性の形質転換体
（Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨＩ／ｐＮＴｓ１０１）からプラス
ミドｐＮＴｓ１０１を単離した（第８図）。 サルＣ０８−７細胞をｌθ％胎児牛血清を含むＤＭＥＭ
培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａ
ｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｎ）（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）で単層培養したのち、同培地で培地交換
した。交換の４時間後に公知の方法（Ｇｒａｈａｍ　ｅ
ｔ、、ウィロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、５２，４５
６゜（１９７３））に従い、発現ベクターｐＴＢ３８９
，１０μｇのポリペプチド（１）発現ベクターＰＮＴＫ
２６またはｐＮＴＬ１４５を含むカルシウムホスフェー
トゲルを調製し、細胞に添加し、形質転換体Ｃ０８−７
／ｐＴＢ３８９．Ｃ０８−７／ｐＮＴＫ２６およびＣＯ
５−７／ｐＮＴＬ１４５をそれぞれ得た。この細胞を炭
酸ガス培養器中で４時間培養し、グリセロール処理（Ｇ
ｏｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）、２２１，５５１（１９８３））　シたのち、３日
間培養した。培養後の培養液を遠心分離して培養上清を
得た。 プレインリサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　
、１３３，３５０（１９７７）およびエクスペリメンタ
ルセルリサーチ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　、１４５，１７９（１９８３）
に記載されている方法に従って、上記で得られた培養上
清の存在下でＰＣ１２細胞を培養し・、神経突起が細胞
の直径の２倍以上に伸長した細胞の割合を計算した。そ
の結果を第２表に示す。 第２表 ベクター　　培養上清　　神経突起が細胞の直径の２倍
以上（μＱ）　　に伸長した細胞の割合（％）ｐＴ８３
８９　　　　４０　　　　　　　　　１１ｐＮＴＫ２６
　　　　４０　　　　　　　　　１７ｐＮＴＬ　１４５
　　　４０　　　　　　　　　２０上記と同様の方法で
得られた培養上清を用いて、初代培養中隔野および前脳
基底部神経細胞のアセチルコリン量に対する作用〔垣花
満、寿野正広。 神経化学、　２７，１６６（１９８ｇ））を調べた。 胎生１７日口のラット胎仔脳より中隔野および前脳基底
部を採取し、Ｈａｔａｎａｋａらの方法〔ディベロプメ
ントオブブレインリサーチ（Ｄｅｖｅｌｏｐ。 Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、）、３０，４７（１９８６））に
従い神経細胞を単離した。Ｐｏ１ｙ−Ｌ−ｏｒｎｉｔｈ
ｉｎｅ（１００ｐ　ｇ　／　ｍ　Ｑ　）で前処理した４
　８−ｗｅｌｌプレートに約Ｉ　Ｘ　１０’ｃｅｌｌｓ
／ｃｉ／ｗｅｌｌの割合でｓｅｅｄｉｎｇ　した、無血
清のＤＭＥ／Ｆ１２／Ｎ２培養液（５００μＱ）で２４
時間培養した。培地を吸引除去後ＤＭＥ／Ｆ１２／ｌＯ
％ＦＣ８（５００μａ）および検体の培養上清を添加し
た。２日後培養液を同培養液７５０μＱへ変え再度培養
上清を添加し、さらに２日間培養した。培養上清の添加
は２種類の方法で行った。培養上清を最終濃度が１０％
となるように前半の２日間は５０μａを、後半の２日間
は７５μＱを添加した。 和光純薬より購入したマウスＮＧＦ　（７５−ＮＧＦ）
を用いるときは、０．１％ｏｖａｌｂｕｍｉｎ／　Ｐ　
Ｂ　Ｓで希、釈し、そのｌＯμ０を添加した。 培養上清添加４日後培養液を吸引除去し、冷却した０、
３Ｎ　ＰＣＡ５００μｉおよびＡＣｈ測定用の内＠ＥＨ
Ｃを２Ｏ−６０ｐ　ｍｏｌ／　２０　ｐ　ｆｌ添加した
。穏やかに撹拌後、５００μａをエッペンドルフマイク
ロチューブに移した。以後既報にしたがい操作し、ＨＰ
ＬＣ／ＥＣＤを用いてＡＣｈ量を測定した。 ＡＣｈ抽出後の細胞をＩＮ　ＮａＯＨ５００μ４１に溶
解しタンパク量の測定を行った（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ａｙ）、統計処理にはＤｕｎｎｅｔ
ｔ’、ｓ　ｔ−ｔｅｓｔを用いた。 得られた結果を第３表に示す。 第３表 実験 サンプル １−マウスＮＧＦ　　Ｏｎｇ／ａＱ マウスＮＧＦ　　０．１ｎｇ／ｍ（１ マウスＮＧＦ　　１　　ｎｇ／ｖ＊Ｑ マウスＮＧＦ　１０　ｎｇ／ｍＱ アセチルコリンＩ （ｐ　ｍｏｌ／ｍｇ蛋白） ４９２±３１ ５２６±１４ ６００±３１ ７７５±２９ 参考例３で得られたポリペプチド（，１）発現ベクター
ｐＥＮＧＦＴ１０２およびＴ７リゾチーム発現ベクター
ｐＬｙｓｓを用いて、　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　（
ＤＥ３）（ジーン（Ｇｅｎｅ）　、５６，１２５（１９
８７）〕の形質転換を行い、形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ　
Ｂ　Ｌ　２１　　（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ、、ｐＥＮＧ
ＦＴ１０２　（ＩＦＯ１４９０３，ＦＥＲＭ　ＢＰ−２
５２９）を得た。 形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｂ　Ｌ　２１　（ＤＥ　３）
　／　ｐ　Ｌｙｓｓ、ｐＥＮＧＦＴ１０２を５０μｇ／
ｍＱのアンピシリン、　１０μｇ　／　ｍ　Ｑのクロラ
ムフェニコール、０．２％グルコースを含むＬＢ培地〔
１％トリプシン（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、
０．５％ＮａＣ１）で３７℃、１６時時間上う下で培養
した。得られた培養液１２．５ｍ　Ｑを２５０ｍ　Ｑの
同じ培地を含むＩＱ容エーレンマイヤ−（Ｅｒｌｅｎｍ
ｅｙｅｒ）フラスコに移し。 ３０℃で３時間振とう下で培養すると培養液のＫｌｅ１
１値は１７０になった。この培養液にイソプロピル−β
−Ｄ（−）−チオガラクトビロノシドを最終０゜１ｍＭ
になるように添加し、さらに３０℃で３時間振どう下で
培養した。得られた培養液３０μＱから集めた菌体を２
倍濃度のｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｅａ＋ｕ＋＋
１ｉ。 ネイチ’ｒ　−（Ｎａｔｕｒｅ）　、２２７，６８０（
１９７０））（３０μＤ　）に懸濁し、１００℃で５分
間加熱したのち０．１％ＳＤＳを含む１６％ポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動を行った。Ｂｕｒｎｅｔｔｅの
方法〔アナリテイカルバイオケミストリー（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ■１ｓｔｒｙ）　。 １１２．１９５（１９８１））に従ってゲル上の蛋白を
ニトロセルロースフィルターに移し、ウサギ抗マウスＮ
ＧＦ抗体（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ）とアフィニティー精製ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＬ
ｇＧ　（バイオ・ランド、米国）とを用いた１ｌｅｓｔ
ｅｒｎブロツテイングを行った結果、１５キロダルトン
（にＤａ）のポリペプチド（１）が認められた。 上記と同様の方法で得られた泳動後のゲルをクーマシー
ブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｒｉｌｌ
ｉａｎｔ　ｂｌｕｅ）で染色したところ、ポリペプチド
（１）に相当する１５ＫＤａの蛋白が認められ、その生
産量は全蛋白の約１０％と概算された。 ９　ポリペプチド　■　の　離 参考例８で得られたＥ、ｃｏｌｉ　Ｂ　Ｌ　２１　（Ｄ
Ｅ　３）／ｐＬｙｓｓ、ｐＥＮＧＦＴ１０２の培養液３
．７５Ωを遠心分離し、菌体１７　ｇ　（ｗｅｔ）を得
た。この菌体を３７５ｍ　Ａの５０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　
５−ＨＣｌ　　（ｐＨ８゜０）に懸濁し、凍結、融解し
たのち超音波処理（海上電気、２Ａ、２分）を３回行っ
た。この処理液を遠心分離し、その沈殿を６０ｍＭの５
Ｍ塩酸グアニジン−５ｍＭ　ＥＤＴＡ−１ｍＭ　ＰＭＳ
Ｆ−０，１ｍＭ　ＡＰＭＳＦ−２０’ｍＭジチオスレト
イール（ＤＤＴ）−５０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液（
ｐ　Ｈ６，０）に溶解した。得られた溶液を２Ｍ塩酸グ
アニジン−５ｍＭ　ＥＤＴＡ−０，１ｍＭ　ＡＰＭＳＦ
−５ｍＭＤＤＴ−２５ｍＭナトリウムリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６゜０）で平衡化させた５ｅｐｈａｃｒｙ　ＩＳ−２
００でゲルろ過し、Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティング（前
出）によってポリペプチド（１）が検出されたフラクシ
ョンを集め、溶８液（３００ｍ　Ａ　）を得た。この溶
出液をＹＭ５メンブレン（アミコン社）を装着した限外
ろ過装置を用いて濃縮し、得られた濃縮液５０ｍＱを上
記と同様の方法でゲルろ過し、３２８ｍ　ｇの精製ポリ
ペプチド（１）を含有する溶液１６４ｍ　Ｑを得た。 ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で純度を調べ
た結果、得られたポリペプチド（１）精製標品はほぼ単
一であった。 上記の精製ポリペプチド（１）を含有する溶液をＵｌｔ
ｒａｐｏｒｅ　ＲＰ　Ｓ　Ｃカラム（０，４６Ｘ７．５
ｃｍ。 ＡＬＴＥＸ社）に負荷し、トリフルオロ酢酸−アセトニ
トリル系を溶出溶媒とする高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）を行って、単一なポリペプチド（１）のＮ
末端アミノ酸配列を気相プロテインシークヱンサー（ア
プライドバイオシステム　モデル４７０Ａ）を用いて決
定した。その結果、精製ポリペプチド（１）のＮ末端ア
ミノ酸配列はＮ末端にメチオニンが付加されていること
のほかはｃＤＮＡの延期配列から推定したポリペプチド
（１）のＮ末端アミノ酸配列と一致した（第４表）。 第４表　Ｎ末端アミノ酸配列 推定した配列 上記で得られた精製標品のアミノ酸組成をニンヒドリン
法で求めた。その結果、精製標品の実測値はＮ末端にメ
チオニンが付加されたポリペプチド（１）から計算した
理論値とほぼ一致した。 第５表　　アミノ酸組成 １）Ｇｌｕを１１として計算した。 ２）ポリペプチド（Ｉ）のＮ末端にメチオニンが付加さ
れたものとして計算した。 上記の精製ポリペプチド（１）を含有する溶液（蛋白濃
度２ｍｇ／ｍｌ１）を蛋白濃度が１０μｇ／ｍＱになる
ように２Ｍ塩酸グアニジン−５ｍＭＥＤＴＡ−０，１ｍ
Ｍ　ＡＰＭＳＦ−５ｍＭ　ＤＴＴ−２５ｍＭナトリウム
リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で希釈し、５０倍量の１ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ−５０ｍＭ　　ＮａＨＣＯ，−Ｎ　８２
Ｇ　Ｏ，（Ｐ　Ｈｌｏ、０）に対して４℃で１６時間透
析し、さらに同じｂｕｆｆｅｒに対して４時間透析した
。得られた透析内液のＰＣ１２細胞に対する作用をプレ
イン　リサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）。 １３３．３５０（１９７９）およびエクスペリメンタル
セルリサーチ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１４５，１７９（１９８３）に記
載されている方法に従って調べた。 その結果、該透析内液の添加によって、ＰＣ１２細胞の
６％に神経突起が観察され、２％が細胞体の直径の２倍
以上の長さの神経突起を有していた。 一方、対照となる１ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡ−５０ｍＭ　Ｎ　
ａＨＣＯ３−Ｎａ、ＣＯ，（ＰＨＩＯ，Ｏ）では神経突
起を有する細胞は０．５％以下であった。 去ＪＩＬＬ−久蓋− ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀８週令）に対しフロイント完全
アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）０，４ｍｆｆ１に溶解
させた１０μｇの抗原ポリペプチド（Ｉ）（参考例９で
得られたもの）を皮肉に注射した。３週間後に、プロイ
ンド完全アジュバント０．４ｍ　Ｑにとかした１０μｇ
の抗原ポリペプチド（夏）を皮肉に再投与した。更に３
週間後に同様の追加免疫を行い、その２週間後に生理食
塩水に溶かした１０μｇのポリペプチド（，１）を静脈
内に接種した。 失胤槻１ （１）細胞融合 実施例１で示した免疫マウスより、抗原最終投与の３８
後脾臓を摘出し、細胞融合に用いる細胞を得た。この細
胞は、イスコツ培地とハムＦ−１２培地をｌ：１の比率
で混合した培地（以下ＩＨ培地と略す）に懸濁した。 マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ・８ＵＩは、
ｌＯ％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ　　１６４０培地で
５％炭酸ガス、９５％空気の条件で継代培養した。 細胞融合は、ケーラーおよびミルスタインらが確立した
方法〔ケーラー、Ｇ、およびミルスタイン、Ｃ１：ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）２５６，４９５（１９７５））
に準じて行った。上記ミエローマ細胞２．９Ｘ　１０’
個と上述した方法で得られた免疫されたリンパ球１゜５
Ｘ１０”個を混合し、遠沈し、４５％の０．３ｍ　Ｑの
ＩＨ培地に溶解したポリエチレングリコール６０００（
以下Ｐ　Ｅ　０６０００）を滴下した。ＰＥＧ６０００
溶液は、予め３７℃に温め、ゆっくりと滴下した。５分
後３７℃に予湿したＩＨ培地１分間に０．５ｍ　Ｄずつ
加えｌｏｍ　ＩＩとした後、室温で６００回転１５分遠
心し上清を除去した。この細胞沈殿物を２０％仔牛血清
を含むＩＨ培地２００ｍ　Ｑに懸濁し、９６穴マイクロ
プレート（ヌンク社）に１００μΩずつ植え付けた。１
日後、ＨＡＴ　（ヒポキサンチンｌＸｌ０−’Ｍ、アミ
ノプテリン４　Ｘ　１０−’Ｍ　、チミジン１゜６Ｘｌ
Ｏ″″＆Ｍ）を含んだＩＨ培地（２０％仔牛血清含有）
　（以下、ＨＡＴ培地と称する。）を各ウェルに１００
μΩずつ添加し、さらに３日おきに、培地の１７２量を
ＨＡＴ培地と交換した。このようにして生育した細胞は
雑種細胞である。 （２）抗体生産細胞の検索 予め、ポリペプチド（１）を固定したポリスチレン製９
６六マイクロタイタープレートに、雑種細胞培養上清を
１００μΩずつ加え３７℃で１時間インキュベートした
。培養上清を除去、洗浄後２吹拭体として西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マススＩｇＧヤギ抗体
（カッベル社）を加え３７℃で１時間インキュベートし
た。２吹拭体を除去し、よ〈ウェル洗浄した後１反応基
質を加えた呈色反応を行った（ＥＩＡ法）、この方法に
より４つのウェルに強い結合価がＭＩＭされた。 （３）雑種細胞のクローニング これらのウェル中の細胞を、１ウエルあたり０゜５個と
なるように、予め１０４個／ウェルのマウス胸腺細胞を
栄養細胞としてまいておいた９６六マイクロタイタープ
レートにまき、クローニングを行った。その結果、４つ
のクローン、Ｍ　ｏ　Ａ　ｂ　４−２細胞（ＩＦＯ５０
２４１，ＦＥＲＭ　ＢＰ−２９０８）　、　Ｍ　ｏ　Ａ
　ｂ　４６−３１細胞（ＩＦＯ５０２４２、Ｆ　Ｅ　Ｒ
Ｍ　Ｂ　Ｐ　−２９０９）　、　Ｍ　ｏ　Ａｂ８２−４
細胞（ＩＦＯ５０２４３，ＦＥＲＭＢＰ−２９１０）、
ＭｏＡｂ１４８−６’２細胞（ＩＦＯ５０２４４，ＦＥ
ＲＭ　ＢＰ−２９１１）を得た。 これらの細胞上清中の抗体価測定結果を第６表に示す。 第６表 クローニングされた細胞は、２０％仔牛血清を含むＩＨ
培地に１０％となるようにジメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）を加え液体窒素内に貯蔵した。 ３　モノクローナル　　の　　グロブリンクラス 実施例２で得られたマウス抗体をサブクラス検出キット
（バイオランド社）により各種標品免疫グロブリンと反
応させた。その結果を第７表に示す。 第７表 表中、＋は反応陽性を、−は反応陰性を示す。 第７表より、Ｍ　ｏ　Ａ　ｂ　４−２　、　Ｍ　ｏ　Ａ
　ｂ　４６−３１の生産する抗体はいずれも免疫グロブ
リンクラスがＩｇＧ２ｂに属することがわかる。そして
、ＭｏＡｂ８２−４．ＭｏＡｂ　１４８−６２の生産す
る抗体はいずれも免疫グロブリンクラスがＩｇＧ１に属
することがわかる。 ４　　クローン　　　　む　　の バイブリド−７ＭｏＡｂ４−２．ＭｏＡｂ４６−３１．
ＭｏＡｂ８２−４．ＭｏＡｂ１４８−６２について、そ
れぞれ２Ｘ１０”個の細胞を予めミネラルオイルを０．
５ｍ　ｍ腹腔内に投与しておいたマウスに接種した。１
０日後、１匹あたり２〜４ｍＱの腹水を採取し、それぞ
れのハイブリドーマよりモノクローナル抗体ＭｏＡｂ４
−２．Ｍ。 Ａｂ４６−８１．ＭｏＡｂ８２−４．ＭｏＡｂ１４８−
６２を得た。 ５　　　からの　　の 実施例４の方法によりモノクローナル抗体ＭｏＡｂ４−
２．ＭｏＡｂ４６−３１．ＭｏＡｂ８２−４．ＭｏＡｂ
１４８−６２を各々マウス５匹ずつに接種し、腹水液２
０〜３０ｒｎＱを得た。腹水液は２０００ｒ　ｐ　ｍ　
（日立冷却）遠心機で遠心し、細胞などを除去した後、
スピンコ５Ｗ２８０−タ（ベックマン社、米国）で２３
００Ｏｒ　ｐ　ｍで４℃、２時間遠心し、不溶性タンパ
クや脂肪等を除いた。上清に対し、４０％飽和になるよ
うに硫酸アンモニウムを加え、水中、１時間、穏やかに
撹拌した。沈殿をサーバ用８８３４０−ター（デュポン
、米国）を用い、４℃、１５０００　ｒ　ｐ　ｍで３０
分間遠心し１回収後、バッファー（１０ｍＭリン酸カリ
ウム（ｐＨ６，８）　）に溶かし、ハイドロキシアパタ
イトカラム（ＨＣＡ−カラム）によって精製した。この
時。 開始バッファーとして１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６
，８）を用い、溶出バッファーとしては５００ｍＭリン
酸ナトリウムバッファーを用いた。溶出は。 開始バッファーから溶出バッファーへの直線的濃度勾配
により行った。溶出抗体は、４℃に保存した。 ６　　ＨＲＰ標　　　の　製 （１）実施例５で得られたモノクローナル抗体Ｍ　ｏ　
Ａ　ｂ　４−２を２ｍｇ／ｍ（１以上になるように濃縮
し、次いで０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，０）に
対して透析した＊４．９ｍｇ／ｍＱモノクローナル抗体
ＭｏＡｂ４−２０．’１ｍＱに対し、１１．５ｍｇ　／
　ｍ　ＱとなるようにＮ、Ｎ’　−ジメチルホルムアミ
ド（ＤＭＦ）に溶解したＳ−アセチルメルカプトサクシ
ニックアンヒドリド（Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）を５０
μＱ加えた０反応器の空気を窒素ガスに置換し、密栓後
、室温で一時間撹拌し、ＳＨ基を導入した。未反応のＳ
−アセチルメルカプトサクシニックアンヒドリドを１３
０μａの０．２Ｍ　Ｔ　ｒ　１ｓ−ＨＣｌ　　（ｐＨ７
，０）　、　１３ｐ　Ｑの０．２ＭＥＤＴＡ、１３０．
Ｑ（１）２Ｍヒドロキシアミン（ｐＨ７，０）を加え室
温１０分処理し、不活性化した。モノクローナル抗体Ｍ
　ｏ　Ａ　ｂ　４−２は、セファデックスＧ−２５（径
１３　Ｘ　８０ｄｌ　、ファルマシア社、スエーデン）
を充填したゲルろ過カラムにより分散した（流速２０ｍ
ｆｆ１／ｈ）。 （２）西洋ワサビパーオキシダーゼ（以下ＨＲＰ。 ベーリンガーマンハイム社、西ドイツ、　Ｇｒａｄｅ　
Ｉ　）１０ｍ　ｇを１．４ｍ　ｍの０．１Ｍリン酸バッ
フｙ−（ｐＨ６，８）に溶解した。Ｎ−（４−カルボキ
シシクロヘキシルメチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル１４ｍ　ｇを３３５μΩのＤＭ
Ｆに溶解し、このうち１００μＱｔｔＨＲＰ溶液に加え
た０反応器の空気を窒素置換し、密栓後、室温で１時間
撹拌した。その後、セファデックスＧ−２５を充填した
ゲルろ過カラム（前出）により、マレイミド基を導入し
たＨＲＰ画分を分取した。 （３）上記（１）においてＳＨ基を導入した抗体Ｍ　ｏ
　Ａ　ｂ　４−２画分６ｍｇと上記（２）においてマレ
イミド基を導入したＨＲＰ画分２ｍｆｉを混合し、コロ
ジオンバッグ（ザルトリウス社製、西ドイツ）を用いて
減圧下、１ｍｆｉに濃縮し、４℃、２０時間反応させた
。反応後ＨＲＰが導入された抗体をウルトロゲルＡｃＡ
４４　（ＬＫＢ社製、スエーデン、径１　＞　Ｘ　８０
ａｎ　）にかけ分離した（流速１０ｍＱ／ｈ）、溶出ピ
ーク画分のうち抗体１分子あたりのＨＲＰ数が最も多い
両分は、２．４ＨＲＰ／抗体であった。 実施例５で得られたモノクローナル抗体Ｍ　ｏ　Ａｂ８
２−４を１０μｇ　／　ｍ　Ｑとなるように炭酸緩衝液
（ｐＨ９，６）で希釈し、イムノプレート（ヌンク社、
デンマーク）に１００μΩ／ウエル注入し、４℃、−夜
装置することにより吸着させた。吸着しなかった抗体を
除去した後、ＰＢＳで３回洗浄し、０゜０１％メルチオ
レート、５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ
を３００μＱ／ウエルを加え４℃−夜放置した。 参考例９で得られたポリペプチド（１）を１％ＢＳＡを
含むＰＢＳで希釈した。上記で作成したプレートよりＢ
ＳＡ溶液を取り除き、ＰＢＳで５回洗浄後、希釈したポ
リペプチド（１）を１００μＱ／ウェル加え、４℃−夜
吸着を行った。未反応のポリペプチド（１）を除去後、
ＰＢＳで５回洗浄し、実施例６で作製したＨＲＰ結合抗
体（ＨＲＰ　−Ｍ　ｏ　Ａ　ｂ　４−２　）を１％ＢＳ
Ａで１／１０００希釈し、１００μＱ／ウェル加え、室
温で２時間反応させた。抗体含有液を除去後、ＰＢＳで
１０回洗浄し、パーオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ社、
米国）を１００μＱ／ウェル加え、発色、比較定量した
。 第９図はポリペプチド（１）の検出曲線を示している。 横軸は、加えたポリペプチド（１）濃度。 縦軸はＨＲＰ　−Ｍ　ｏ　Ａ　ｂ　４−２によって発色
した吸光度をあられす。この図より、０．５ｎ　ｇ　／
　ｍ　Ｑの濃度のポリペプチド（Ｉ）を検出できること
がわかった。 ８の 実施例４において精製した４抗体の抗原認識部位を競合
的結合阻止実験により検討した。 競合物として、合成ペプチドｐｅｐｌ：Ｔｙｒ−Ａｌａ
−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ、ｐ
ｅｐ２：Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌ
ｙｓ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを用いた。 合成ペプチドは、１００μｇ　／　ｍ　Ｑあるいは０．
３９μｇ　／　ｍ　Ｑの濃度に調製し、５％ＢＳＡを含
むＰＢＳ溶液希釈を行った。抗体量が吸光度４９３ｎｍ
で１．０〜０．７となるように実施例４で得た精製モノ
クローナル抗体について、　Ｍ　ｏ　Ａ　ｂ　４−２　
、　Ｍ　。 ａｂ４６−３１にツイては０．０５μｇ／ｍＱに、Ｍｏ
Ａｂ８２−４にツイては１２．５μｇ　／　ｍ　１４に
、Ｍｏａｂ１４８−６２については０．７８μｇ／ｍＱ
に希釈した。希釈液としては、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ
溶液を用いた。希釈抗体液に希釈した競合物を加え、撹
拌後３７℃、３０分保温した。 この液中に含まれる未結合の抗体量を実施例７に示すＥ
ＩＡ法によって測定した。 合成ペプチドを用いた場合の結果を、第１０図、第１１
図、第１２図、第１３図に示す。 第１０図はモノクローナル抗体Ｍ　ｏ　Ａ　ｂ　４−２
についての結果を、第１１図はモノクローナル抗体Ｍ　
ｏ　Ａ　ｂ　４６−３１にツイて・の結果を、第１２図
はモノクローナル抗体Ｍ　ｏ　Ａ　ｂ　８２−４につい
ての結果を、第１３図はモノクローナル抗体ＭＯＡｂ１
４８−６２についての結果を示す。なお、これらの図に
おいて・・・０・・・はｐｅｐｌを、−・−はｐｅｐ２
をそれぞれ競合物として用いた結果を示す。また、図に
おいて、縦軸は発色剤の吸光（波長４９３ｎｍによる）
を示す。 第１０図および第１１図から、モノクローナル抗体Ｍ　
ｏ　Ａ　ｂ　４−２およびＭ　ｏ　Ａ　ｂ　４６−３１
は、ｐｅｐｌにより競合的結合阻害を受けた。このこと
から、モノクローナル抗体ＭｏＡｂ４−２およびＭ　ｏ
　Ａ　ｂ　４６　＝　３１はポリペプチド（１）のＮ末
端アミノ酸１−１４番目の領域を認識していることが分
かった。 第１２図、第１３図からＭｏＡｂ８２−４．ＭｏＡｂ１
４８−６２は、これらの合成ペプチドによって阻害を受
けないことが分かった。このことからＭｏＡｂ８２−４
．ＭｏＡｂ　１４８−６２は、Ｎ末端アミノ酸１−１４
番目の領域と、Ｃ末端１−９番目の領域以外のアミノ酸
を認識することが分かった。 上記したことから、４種のモノクローナル抗体の認識部
位については次の第８表のようにまとめられる。 第８表 表中“＋”は競合阻害のあったもの、′−”はなかった
ものを示す。 参考例９記載の方法で得たポリペプチド（１）を１５％
アクリルアミドゲル電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ。 Ｋ、　（１９７０）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２２
７，６８０−６８５）　シた後、ザルドブロット（ザル
トリウス社、西独）を用い、ニトロセルロース膜上にト
ランスファーした（　Ｋｙｓｈｓｅ−Ａｎｄｅｒｓｏｎ
　、Ｊ、ジャーナル・オブ・バイオケミカル・アンド・
バイオフィジカル・メンツズ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏ
ｆ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓｉｅａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、１０，２０３−
２０９（１９８４））　、この膜をＴＢＳ（２０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、０．５Ｍ　ＮａＣ１
）で５分ずつ２回洗い、５％ＢＳＡを含むＴＢＳ中で室
温１時間放置し、膜上の未反応部分をブロックした。０
゜０５％トウイーン２０を含むＴＢＳ　（ＴＴＢＳ）で
５分ずつ３回洗った。実施例４で得たモノクローナル抗
体Ｍ　ｏ　Ａ　ｂ　４−２　、　Ｍ　ｏ　Ａ　ｂ　４６
−３１　、　ＭｏＡｂ８２−４．またはＭ　ｏ　Ａ　ｂ
　１４８−６２を、５％ＢＳＡを含む、ＴＴＢＳで１０
００倍希釈した液に、上記のニトロセルロース膜を入れ
、室温で１時間反応させた０反応液を取り除き、ＴＴＢ
Ｓで５分ずつ３回膜を洗い、その後５％ＢＳＡを含む。 ＴＴＢＳで２０００倍に希釈した２吹拭体、アルカリホ
スファターゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ血清（バイオラッ
ド社、米国）を加え、室温で１時間反応を行った。膜を
ＴＴＢＳで５分ずつ３回洗浄し。 さらにＴＢＳで５分ずつ２回洗い、その後、発色剤とし
てＮ　Ｂ　Ｔ　（ｎｉｔｒｏ　ｂｌｕｅ　ｔｅｔｒａｚ
ｏｌｕ謹、　５０＋ｍｇ／ｍｌ　　ｉｎ　　７０％　ｄ
ｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）　　６６ｐ　　ｌ
　　、　　Ｂ　　ＣＩ　Ｐ　（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃ
ｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
。 ５０Ｂ／鵬１　ｉｎ　ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉ
ｄｅ）３３ｐ　ｌ　　（プロメガ社、米国）をＡＰバッ
ファ　−（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ。 ｐＨ９，５，１００ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＭｇＣ１
，）に溶解し、室温で１５分間反応を行なった。第１５
図にモノクローナル抗体ＭｏＡｂ４−２を１吹拭体とし
て用いた時のウェスタンブロッティングの結果を示す。 レーン１には５００ｎｇのポリペプチド（１）を、２に
は２５０ｎＨのポリペプチド（１）を、３には１２５ｎ
ｇのポリペプチド（Ｉ）を、４には６２．５ｎ　ｇのポ
リペプチド（１）をそれぞれ泳動し、トランスファーし
ている０Ｍはマーカーを表わし、左側の数字はその分子
量である。 なお、上記ＭｏＡｂ４−２の代りにＭ　ｏ　Ａ　ｂ４６
−３１．８２−４，１４８−６２を用いた場合もポリペ
プチド（１）を検出することができた。 １０　　　Ｎ　　ペプチド　　の （１）Ｎ末ペプチドの合成 本ペプチドの合成は自動ペプチド合成機４３０Ａ（アプ
ライド・バイオシステムズ社製）を用いた固相合成法に
て行なった。プログラムは「スタンダード−１」を用い
た。基本的な合成過程等は、メリーフィールドアールビ
ー（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｂ。 ）（１９６９）アドバンスオブエンザイモロジー（Ａｄ
ｖ。 Ｅｎｚｙｍｏｌ、）　３２．２２１−２９６の方法に準
じている。レジンにはＢｏａ−Ｃｙｓ　（ＭｅＢｚ　ｌ
）　・ＰＡＭ−Ｐ　（０，５ｍｍｏｌ／　ｇ　）を用い
、カルボキシル末端から順次合成した。Ｂｏｃ−アミノ
酸としてＢ。 ｃ−Ｖａｌ、Ｂｏａ−８ｅｒ　（Ｂｚｌ）、Ｂｏａ−Ｔ
ｙｒ　（Ｂｒ−Ｚ）、Ｂｏａ−Ｇｌｕ　（ＯＢｚｌ）、
Ｂｏａ−Ｇｌｙ、Ｂｏａ−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ
−Ｈｉｓ　　（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃ１−Ｚ）
、Ｂｏｃ−Ａｌａを用いた。アミノ末端Ｔｙｒまで合成
したのち、ペプチドレジンを合成機から取り出し、乾燥
した。 ペプチドレジン１ｇに１．５ｍ　ｍのｐ−クレゾールお
よび０．５ｍ　Ｑの１．゛２−エタンジチオールを加え
、さらに約８ｍｆｉの液体フッ化水素を加えて、０℃で
２時間反応させた０反応終了後、デシケーター中でフッ
化水素を減圧除去し、０．１％の２−メルカプトエタノ
ールを含むジエチルエーテルで、続いてジエチルエーテ
ルで洗い、大部分の混在試薬を除去した。ペプチドを１
０ｍ　Ｑの３％酢酸で抽出し、ろ過により抽出液中に混
入しているレジンを除いた。ろ液をセファデックス（Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−２５を用いるゲルろ過により
精製した。ゲルろ過条件は、カラムサイズ２．８Ｘ６０
ｍ；検出波長２８０ｎｍ；溶媒３％酢酸；流速４０ｍ　
Ｑ　／ｈｒであった。 ペプチドを含むフラクションを集めて凍結乾燥し、得ら
れた粉末標品について逆相高速液体クロマトグラフィー
によりさらに精製した。カラムＭＭＣパック、Ａ　−３
２４０ＤＳ　１０Ｘ２５０■；カラム温度２５℃；溶出
溶媒Ａ　Ｏ，１％−トリフルオロ酢酸−９９，９％蒸留
水；溶出溶媒Ｂ　Ｏ，１％−トリフルオロ酢酸−９９，
９％アセトニトリル；、溶出プログラム　０分（９０％
Ａ＋１０％Ｂ）、３０分（６０％Ａ＋４０％Ｂ）；溶出
速度２ｍＡ／分、検出波長２３０ｎｍ。本条件下で保持
時間２３．０分に溶出された主ピーク画分を集めて、バ
イオラッドＡ　Ｇ　Ｉ　Ｘ　８　（ＡｃＯＨ型、１，８
Ｘ５ａｍ）のカラムに通し、洗液も集め、アセトニトリ
ルを留去した後、凍結乾燥した。白色粉末５６ＩＩ１ｇ
を得た。得られた目的物は上記高速液体クロマトグラフ
ィーと同一条件で２３．０分に鋭い単一のピークを示し
た。エルマンジーエル（Ｅｌｍａｎ、Ｇ、Ｌ、）　（１
９５９）アーキテクチュアルバイオケミストリーアンド
バイオフイジクス（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、）８２．７０−７７法による遊離のＳＨ
基の定量：１１４％。 アミノ酸分析値　　Ｓｅｔ　１．６５（２）；　Ｇｌｕ
　２．１３（２）：Ｇｌｙ　１．００（１）：　Ａｌａ
　１．０４（１）；　１／２Ｃｙｓ　Ｏ，８２（１）；
Ｖａｌ　１．０３（１）；　Ｔｙｒ　１．９７（２）；
　Ｌｙｓ　Ｏ，９５（１）；）１ｉｓ　１．７２（２）
、　Ａｒｇ　１．００（１）。回収率　７４％。 １　／　２　Ｃｙ　ｓは過ギ酸酸化法により定量した。 カッコ内は理論値を示す。 （２）Ｎ　ペプチドとヘモシアニンとの　八　の作１− 上記（１）で得られたＮ末ペプチド（５■）とヘモシア
ニン（１０■）とを４ｍＱの０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，３）に溶解し、氷水中で冷却した２、５％ゲルタ
ールアルデヒド４００μΩをｌｌづつ撹拌しながら加え
た。水冷下で３時間撹拌後、蒸留水に対して透析し、Ｎ
末ペプチドとヘモシアニンとの複合体を得た。 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１３２■）を３ｍ１ｌ
の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解した（Ａ
液）　、　１１．２■のＮ−（γ−マレイミドブチルオ
キシ）サクシンイミド（ＧＭＢＳ）を２００μＱのジメ
チルホルムアミド溶液で溶解した（Ｂ液）。 スタージーで撹拌しながらＡ液にＢ液を滴下し、混合液
を３０℃で３０分間反応させたのち、０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ６，５）−０，ＩＭ　Ｎ　ａ　ＣＱを溶出液
とした５ｅｐｈａｄａｘＧ−２５（１，５ｃｍ　Ｘ　２
０Ｑｍ　）で精製し、マレイミド基を導入したウシ血清
アルブミンを得た。 （１）で得られたペプチド（５＋ｇ）を０．１ＭＩＪン
酸緩衝液−５ｍＭ　ＥＤＴＡに溶解し、これにマレイミ
ド基を導入したウシ血清アルブミン（２０■）を加え（
全容量５ｍＪ２以下）、３０℃で６０分間反応を行った
。これにＰＢＳを加えて１２ｍ　ｍにし、Ｎ末ペプチド
とウシ血清アルブミンとの複合体を得た。 （４）　ポリペプチド　！　Ｎ末ペプチド　　の上記（
２）で得られたＮ末ペプチドとヘモシアニンとの複合体
をＦｒｅｕｎｄのｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ
とよく混合し、その混合物をウサギの皮下に注射した。 以後、２週問おきに上記（３）で得られたＮ末ペプチド
とウシ血清アルブミンとの複合体をＦｒｅｕｎｄのｉｎ
ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔと混合し、その混
合物を同じウサギに注射した。 上記の方法で免疫したウサギから採取して得られた血液
を遠心分離し、抗ポリペプチド（１）Ｎ末ペプチド抗体
を得た。 １１　　　Ｃ末ペプチド　　の （１）Ｃ末ペプチド 実施例１０と同様な方法で合成した。 Ｂｏａ−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）　　・ＰＡＭ−Ｐ（０，５
ｍ■ｏｌ／　ｇ　）を用い、カルボキシル末端から順次
合成した＊　Ｂｏａ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−１１ｅ、Ｂ。 ｃ−Ｌｙｓ　（Ｃ１−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ａｒｇ　（Ｔ。 ｓ）　、Ｂｏｃ−８ｅｒ　（Ｂｚｌ）、Ｂｏａ−Ｌｅｕ
、Ｂｏａ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ　（ＭｅＢｚｌ）を
用いた。実施例１Ｏと同様にフッ化水素処理および精製
をして、目的物の白色粉末２００■を得た。このペプチ
ドは実施例１０に記載した高速液体クロマトグラフィー
の条件で、１２．６分に鋭い単一のピークとして溶出さ
れた。エルマンジーエル（Ｅｌｍａｎ、Ｇ、Ｌ、）（１
９５９）アーキテクチュアルバイオケミストリーアンド
バイオフィジクス（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、）８２，７０−７７法による遊離のＳＨ
基の定量：１０６％。 アミノ酸分析値　　Ｓｅｒ　Ｏ，８６（１）；　Ｇｌｙ
　Ｏ，９６（１）；Ａｌａ　１．００（１）；　Ｉｌｅ
　１．００（１）；　Ｌｅｕ　１．０１（１）：Ｌｙｓ
　１．０５（１）：　Ａｒｇ　２．０６（２）。回収率
　６８％。 （２）Ｃ末ペプチドとヘモシアニンとの複合体の作ｌ 上記（１）で得られたＣ末ペプチドを用いて、実施例１
０（２）と同様の方法でＣ末ペプチドとヘモシアニンと
の複合体を得た。 上記（１）で得られたＣ末ペプチドを用いて、実施例１
０（３）と同様の方法でＣ末ペプチドとウシ血清アルブ
ミンとの複合体を得た。 （４）　ポリペプチド　ＩＣペプチド　　の務ｌ 上記（２）で得られたＣ末ペプチドとヘモシアニンとの
複合体をＦｒｅｕｎｄのｃｏｉｌｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕ
ｖａｎｔとよく混合し、その混合物をウサギの皮下に注
射した。以後、２週問おきに上記（３）で得られたＣ末
ペプチドとウシ血清アルブミンとの複合体をＦｒｅｕｎ
ｄのｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔと混合し
、その混合物を同じウサギに注射した。この方法で免疫
したウサギから採取して得られた血液を遠心分離し、抗
ポリペプチド（Ｉ）Ｃ末ペプチド抗体を得た。 見艶＠夏果 本発明ではポリペプチド（１）もしくはその部分ペプチ
ドに対する抗体を用いてポリペプチド（１）を容易に精
度高く分離、精製することができ、ポリペプチド（１）
の作用機序の解明、ひいてはその医薬への応用の途を開
くものであり、その産業上の効果は大である。また本発
明においては、ポリペプチド（Ｉ）の部分ペプチドを抗
原の一部として用いて抗体を得ることができるが、この
場合には部分ペプチドであるため化学合成等、簡単な方
法で原料の調達が出来、その単離・精製自体が煩雑なポ
リペプチド（Ｉ）全蛋白質を用いる場合に比べてより簡
便にポリペプチド（１）もしくはその部分ペプチドに対
する抗体が製造でき、ひいてはより簡便なポリペプチド
（１）の検出・定量法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例１で得られた、プラスミドｐＵＮＫ５に
含まれるポリペプチド（１）ｃＤＮＡを含むＤＮＡの制
限酵素地図を示す。 第２図は参考例１で得られた、プラスミドｐｕＮＫ５に
含まれるポリペプチド（Ｉ）ｃＤＮＡの塩基配列および
これから翻訳されるアミノ酸配列を示す。 第３図は、参考例１で述べた、本発明のポリペプチド（
１）のアミノ酸配列（上段）とヒトβＮＧＦのアミノ酸
配列（下段）との比較を示す。 第４図は参考例２で得られた、プラスミドｐＨＮＴ２に
含まれるポリペプチド（Ｉ）ｃＤＮＡを含むＤＮＡの制
限酵素地図を示す。 第５図は参考例２で得られた、プラスミドｐＨＮＴ２に
含まれるポリペプチド（１）ｃＤＮＡを含有するＤＮＡ
の塩基配列およびこれから翻訳されるアミノ酸配列を示
す。 第６図は、参考例３で得られた、大腸菌用のポリペプチ
ド（１）発現ベクターｐＥＮＧＦＴ１０２の構築図を示
す。 第７図は、参考例５で得られた、動物細胞用のポリペプ
チド（１）発現ベクターｐＮＴＫ２６およびｐＮＴＬ１
４５の構築図を示す。 第８図は、参考例６で得られた、動物細胞用のポリペプ
チド（１）発現ベクターｐＮＴｓ１０１の構築図を示す
。 第９図は実施例５で得られたモノクローナル抗体ＭｏＡ
ｂ８２−４と実施例６で得られたＨＲＰ−ＭｏＡｂ４−
２を用いて、実施例７で得られたＥＩＡによるポリペプ
チド（１）の定量結果を示す。 第１０図は実施例８で得られた各種ペプチドのモノクロ
ーナル抗体ＭｏＡｂ４−２に対する競合的結合阻害の結
果を示す。 第１１図は実施例８で得られた各種ペプチドのモノクロ
ーナル抗体ＭｏＡｂ　　４６−３１に対する競合的結合
阻害の結果を示す。 第１２図は実施例８で得られた各種ペプチドのＭｏＡｂ
８２−４に対する競合的結合阻害実験の結果を示す。 第１３図は実施例８で得られた各種ペプチドのモノクロ
ーナル抗体ＭｏＡｂ　　１８４−６２に対する競合的結
合阻害の結果を示す。 第１４図は実施例５で得られたモノクローナル抗体Ｍｏ
Ａｂ４−２を用いたウェスタンブロッティングの結果を
示す。

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）式（１） 【遺伝子配列があります】 で表わされるアミノ酸配列のうちの連続した少なくとも
   ８個のアミノ酸を含有するペプチドに対する抗体。
2. （２）ポリクローナル抗体である、請求項１記載の抗体
   。
3. （３）モノクローナル抗体である、請求項１記載の抗体
   。
4. （４）式（１）で表わされるアミノ酸配列のうちの連続
   した少なくとも８個のアミノ酸を含有するペプチドとキ
   ャリア蛋白質との複合体を免疫原として得られる請求項
   １、２または３記載の抗体。
5. （５）ペプチドが式（１）で表わされるアミノ酸配列を
   含有するポリペプチド（Ｉ）である請求項１もしくは４
   記載の抗体。
6. （６）ペプチドが式〔２〕【遺伝子配列があります】で
   表わされ る配列のうちの連続した１２〜１４個のアミノ酸からな
   るポリペプチド（Ｉ）の部分ペプチド、あるいは式〔３
   〕【遺伝子配列があります】 で表わされる配列のうちの連続した８〜９ 個のアミノ酸からなるポリペプチド（Ｉ）の部分ペプチ
   ドである請求項１もしくは４記載の抗体。
7. （７）式（１）で表わされるアミノ酸配列のうちの連続
   した少なくとも８個のアミノ酸を含有するペプチド、ま
   たはこれらとキャリア蛋白質との複合体で哺乳動物に免
   疫し、ポリクローナル抗体を生成させ、これを採取する
   ことを特徴とする、請求項２記載のポリクローナル抗体
   の製造法。
8. （８）式（１）で表わされるアミノ酸配列のうちの連続
   した少なくとも８個のアミノ酸を含有するペプチド、ま
   たはこれらとキャリア蛋白質との複合体で免疫した哺乳
   動物の脾臓細胞と、該哺乳動物のリンパ球様細胞とから
   なるクローン化されたハイブリドーマを液体培地中また
   は哺乳動物の腹腔内で増殖し、モノクローナル抗体を生
   成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする、請
   求項３記載のモノクローナル抗体の製造法。
9. （９）式（１）で表わされるアミノ酸配列のうちの連続
   した少なくとも８個のアミノ酸を含有するペプチド、ま
   たはこれらとキャリア蛋白質との複合体で免疫した哺乳
   動物の脾臓細胞と、該哺乳動物のリンパ球様細胞とから
   なるクローン化されたハイブリドーマ。
10. （１０）式（１）で表わされるアミノ酸配列のうちの連
    続した少なくとも８個のアミノ酸を含有するペプチド、
    またはこれらとキャリア蛋白質との複合体で免疫した哺
    乳動物の脾臓細胞と、該哺乳動物のリンパ球様細胞とを
    細胞融合し、クローニングすることを特徴とする該脾臓
    細胞と該リンパ球様細胞とからなるクローン化されたハ
    イブリドーマの製造法。
11. （１１）式〔２〕【遺伝子配列があります】で表わされ
    る配列の うちの連続した１２〜１４個のアミノ酸からなるポリペ
    プチド（Ｉ）の部分ペプチド。
12. （１２）式〔３〕【遺伝子配列があります】で表わされ
    る配列のうちの連続した８〜９ 個のアミノ酸からなるポリペプチド（Ｉ）の部分ペプチ
    ド。
13. （１３）式（１）で表わされるアミノ酸配列のうちの連
    続した少なくとも８個のアミノ酸を含有するペプチドと
    キャリア蛋白質との複合体。
14. （１４）ペプチドが式（１）で表わされるアミノ酸配列
    を含有するポリペプチド（Ｉ）である請求項１３記載の
    複合体。
15. （１５）ペプチドが請求項１１または１２記載の部分ペ
    プチドである、請求項１３記載の複合体。
16. （１６）請求項１、３、４、５または６記載の抗体を用
    いることを特徴とする、ポリペプチド（Ｉ）の精製法。
17. （１７）請求項１、３、４、５または６記載の抗体を用
    いることを特徴とする、ポリペプチド（Ｉ）の検出・定
    量法。