DE69031726T2

DE69031726T2 - Antikörper, ihre Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE69031726T2
Application number: DE69031726T
Authority: DE
Inventors: Tsunehiko Fukuda; Tsutomu Kurokawa; Ken-Ichi Kuroshima; Kazuo Nakahama
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1989-08-28
Filing date: 1990-08-24
Publication date: 1998-03-12
Anticipated expiration: 2010-08-25
Also published as: DE69031726D1; CA2024063A1; ATE160288T1; EP0418590B1; ES2109225T3; DK0418590T3; CA2024063C; JPH04128298A; EP0418590A1; GR3025835T3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Antikörper gegenüber einem Peptid, das wenigstens 8 aufeinanderfolgende Aminosäuren einer Aminosäuresequenz enthält, die durch die nachstehend beschriebene Formel [1] dargestellt wird, und sie bezieht sich auf Hybridome, Verfahren zum Herstellen derselben und deren verwendungen.
Seit der Entdeckung des Epidermiswachstumsfaktors (hierin nachstehend als EGF bezeichnet) und des Nervenwachstumsfaktors (hierin nachstehend als NGF bezeichnet) sind viele Zellwachstumsfaktoren isoliert worden und ihre Strukturen sind aufgeklärt worden.
Zellwachstumsfaktoren sind zur Aufklärung des Zelldifferenzierungsmechanismus und des Zellvermehrungsmechanismus nützlich und von einigen davon einschließlich des Human-EGF wird erwartet, daß sie als Arzneimittel nützlich sind. Deshalb haben sich in den letzten Jahren Untersuchungen darüber zunehmend ausgeweitet.
Was Human-NGF betrifft, ist seine Genom-DNA isoliert worden, aber nicht in einer Wirtszelle exprimiert worden. Somit haben die Untersuchungen zum Herstellen von Human-NGF in großen Mengen und zur Verwendung desselben keinen Fortschritt erlebt. Weiter ist die Herstellung monoklonaler, Antikörper gegen NGF aus A. Cattaneo et al. (1988), Chem. Abstracts 108,. 504, Zusammenfassung Nr. 165843p, bekannt.
Die Erfinder klonierten eine cDNA-Sequenz, die für ein Polypeptid (I) kloniert, das zu Human-NGF aus Human-Gliom-cDNA-Banken (die japanische ungeprüfte Patehtanmeldung Nr. 1-193654/1989, die der EP-A-0 386 752 entspricht, bezieht sich auf Fig. 1 bis 4) etwa 60% Homologie zeigte.
Das Polypeptid (I) enthält im Molekül die folgende Aminosäuresequenz:
Von dem Polypeptid (I) wird angenommen, daß es eine Wirkung ähnlich derjenigen von NGF besitzt und in vivo wie etwa bei der Verstärkung der Differenzierung, des Wachstums und der Vermehrung tierischer Zellen, der verstärkten Genexpression und Induktion von Proteinen und Enzymen eine wichtige Rolle spielt. Es besteht daher in hohem Maße die Möglichkeit, daß dieses als Arzneimittel verwendet werden kann.
Grundlegende Informationen bezüglich des Polypeptids (I) wie etwa dessen Verteilung in vivo, dessen Produktionsweise oder des Mechanismus der Aktivitätsexpression begünstigen die Entwicklung von Polypeptid (I) als Arzneimittel.
Es ist ferner wichtig, die Menge an Polypeptid (I) genau zu kennen, wenn dieses Protein aus einer Genrekombinante gereinigt wird.
Früher ist die NGF-Menge durch Bestimmen der Wirküng auf das Neuritenwachstum gegenüber PCl2-Zellen berechnet worden. Ferner ist die Wirkung auf das Neuritenwach-stum bei Vogeldorsalwurzelganglien zum Berechnen der NGF-Menge verwendet worden. Diese Bestimmungen haben jedoch den Nachteil, daß, außer daß eine lange Zeit zum Erhalten des Ergebnisses erforderlich ist, ein umständliches Verfahren erforderlich ist und der Meßfehler groß ist. Aus diesen Gründen hat man das Entwickeln von Mitteln zum einfachen und genauen Bestimmen von Polypeptid (I) gewünscht.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb das Bereitstellen von Mitteln zum einfachen und genauen Bestimmen von Polypeptid (I). Andere Gegenstände werden aus der folgenden Beschreibung und den angefügten Zeichnungen deutlich.
Die vorliegende Erfindung stellt bereit:
(1) einen Antikörper gegen ein partielles Peptid eines Polypeptids (I), das die Aminosäuresequenz enthält, die durch Formel [1] dargestellt wird:
wobei das partielle Peptid des Polypeptids (I) 12 bis 14 aufeinanderfolgende Aminosäuren einer sequenz, die durch Formel [2] dargestellt wird:
Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys,
oder 8 bis 9 aufeinanderfolgende Aminosäuren einer Sequenz enthält, die durch Formel [3] dargestellt wird:
Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg
(2) den vorstehend in (1) beschriebenen Antikörper, wobei der Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist,
(3) den vorstehend in (1) beschriebenen Antikörper, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist,
(4) den vorstehend in (1), (2) oder (3) beschriebenen Antikörper, wobei der Antikörper durch Verwenden eines Konjugats des vorstehend in (1) definierten partiellen Peptids mit einem Trägerprotein als Immunogen erhalten wird,
(5) ein Verfahren zum Herstellen des in (2) beschriebenen polyklonalen Antikörpers, das das Immunisieren eines Säugers mit einem vorstehend in (1) definierten partiellen Peptid oder mit einem Konjugat dieses partiellen Peptids mit einem Trägerprotein unter Bildung des polyklonalen Antikörpers und dann das Gewinnen des polyklonalen Antikörpers umfaßt,
(6) ein Verfahren zum Herstellen des in (3) beschriebenen monoklonalen Antikörpers, das das Vermehren eines klonierten Hybridoms, das aus einer Milzzelle eines Säugers und einer Lymphoidzelle des Säugers besteht, in einem flüssigen Kulturmedium oder in der Bauchhöhle des Säugers, so daß der monoklonale Antikörper gebildet und angereichert wird, wobei die Milzzelle des Säugers mit einem vorstehend in (1) definierten pärtiellen Peptid oder mit einem Konjugat dieses partiellen Peptids mit einem Trägerprotein immunisiert ist, und dann das Gewinnen des monoklonalen Antikörpers umfaßt,
(7) ein kloniertes Hybridom, das aus einer Milzzelle eines Säugers und einer Lymphoidzelle des Säugers besteht, wobei die Milzzelle des Säugers mit einem vorstehend in (1) definierten partiellen Peptid oder mit einem Konjugat diesea partiellen Peptids mit einem Trägerprotein immunisiert ist,
(8) ein Verfahren zur Herstellung eines klonierten Hybridoms, das aus einer Milzzelle eines Säugers und einer Lymphoidzelle des Säugers besteht, das das Verschmelzen der Milzzelle des Säugers mit dessen Lymphoidzelle unter Bildung einer verschmolzenen Zelle, wobei die Milzzelle des Säugers mit einem vorstehend in (1) definierten partiellen Peptid oder mit einem Konjugat dieses partiellen Peptids mit einem Trägerprotein immunisiert ist, und dann das Klonieren der verschmolzenen Zelle umfaßt,
(9) ein partielles Peptid des vorstehend in (1) definierten Polypeptids (I), wobei das partielle Peptid aus 12 bis 14 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der Sequenz besteht, die durch die Formel [2] dargestellt wird:
Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys,
(10) ein partielles Peptid des vorstehend in (1) definierten Polypeptids (I), wobei das partielle Peptid aus 8 bis 9 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der Sequenz besteht, die durch die Formel [3] dargestellt wird:
Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg
(11) ein Konjugat eines vorstehend in (9) und (10) definierten partiellen Peptids mit einem Trägerprotein,
(12) ein Verfahren zur Reinigung des Polypeptids (I), das das Verwenden des vorstehend in (1), (3) oder (4) beschriebenen Antikörpers umfaßt, und
(13) ein Verfahren zum Nachweisen und Bestimmen von Polypeptid (I), das das Verwenden des vorstehend in (1), (3) oder (4) beschriebenen Antikörpers umfaßt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine Rest, riktionsenzymkarte einer DNA, die eine Polypeptid-(I)-cDNA umfaßt, die in dem in Bezugsbeispiel 1 erhaltenen Plasmid pUNK5 enthalten ist;
Fig. 2 zeigt eine Nukleotidsequenz der DNA, die eine Polypeptid(I)-cDNA enthält, die in dem in Bezugsbeispiel 1 erhaltenen Plasmid pUNK5 enthalten ist, und eine daraus translatierte Aminosäuresequenz;
Fig. 3 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenz (obere Reihe) des in Bezugsbeispiel 1 beschriebenen Polypeptids (I) mit einer Aminosäuresequenz (untere Reihe) von Human-NGF;
Fig. 4 ist eine Restriktionsenzymkarte einer DNA, die eine Polypeptid-(I)-cDNA umfaßt, die in dem in Bezugsbeispiel 2 erhaltenen Plasmid pHNT2 enthalten ist;
Fig. 5 zeigt eine Nukleotidsequenz der DNA-Sequenz, die die Polypeptid-(I)-cDNA umfaßt, die in dem in Bezugsbeispiel 2 erhaltenen Plasmid pHNT2 enthalten ist, und eine daraus translatierte Aminosäuresequenz;
Fig. 6 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau des in Bezugsbeispiel 3 erhaltenen Polypeptid-(I)-Expressionsvektors pENGFT102 für Escherichia coli zeigt;
Fig. 7 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau der in Bezugsbeispiel 5 erhaltenen Polypeptid-(I)-Expressionsvektoren pNTK6 und pNTL145 für tierische Zellen zeigt;
Fig. 8 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau des in Bezugsbeispiel 6 erhaltenen Polypeptid-(I)-Expressionsvektors pNTS101 für tierische Zellen zeigt;
Fig. 9 ist eine graphische qarstellung, die die Ergebnisse der Bestimmung von Polypeptid (I) durch EIA in Beispiel 7 mittels des in Beispiel 5 erhaltenen monoklonalen Antikörpers MoAb82-4 und in Beispiel 6 erhaltenen HRP-MoAb4-2 zeigt;
Fig. 10 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der kompetitiven Hemmung der Bindung verschiedener Peptide an den in Beispiel 8 erhaltenen monoklonalen Antikörper MoAb4-2 zeigt;
Fig. 11 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der kompetitiven Hemmung der Bindung verschiedener Peptide an den in Beispiel 8 erhaltenen monoklonalen Antikörper MoAb46-31 zeigt;
Fig. 12 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der kompetitiven Hemmung der Bindung verschiedener Peptide an den in Beispiel 8 erhaltenen monoklonalen Antikörper MoAbB2-4 zeigt;
Fig. 13 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der kompetitiven Hemmung der Bindung verschiedener Peptide an den in Beispiel 8 erhaltenen monoklonalen Antikörper MoAbB4-62 zeigt und
Fig. 14 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse der Western-Blotting-Analyse mittels des in Beispiel 5 erhaltenen monoklonalen Antikörpers MoAb4-2 zeigt.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

Wenn die Antikörper der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, können die partiellen Peptide [2] und [3] als Immunogene verwendet werden.
Das Polypeptid (I) schließt ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von Formel [1] und ein Polypeptid ein, das am C-Terminus der Aminosäuresequenz von Formel [1] weiter einen Threoninrest aufweist. Weiter schließt das Polypeptid (I) ein Polypeptid mit mehreren an den N-Terminus und/oder den C-Terminus der Aminosäuresequenz von Formel [1] angefügten Aminosäureresten ein.
In den nachstehend beschriebenen Bezugsbeispielen wurde das Polypeptid [I] mit der folgenden, durch Formel [1'] dargestellten Aminosäuresequenz, worin Thr dem C-Terminus der durch Formel [1] dargestellten Aminosäuresequenz hizugefügt wurde, durch Expression in Escherichia coli hergestellt;
Weiter wird angenommen, daß in den nachstehend beschriebenen Bezugsbeispielen das in tierischen Zellen exprimierte Polypeptid (I) die durch Formel [1] oder [1'] dargestellte Aminosäuresequenz besitzt.
Außer den vorstehend beschriebenen Polypeptiden enthält das Polypeptid (I) Teile der vorstehenden Polypeptide, die dieselbe Aktivität wie die vorstehenden Polypeptide besitzen, und Polypeptide, bei denen Teile der vorstehenden Aminosäuresequenzen durch eine oder mehrere verschiedene Aminosäuren- oder Aminosäuresequenzen ersetzt sind oder bei denen eine oder mehrere verschiedene Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen den vorstehenden Aminosäuresequenzen hinzugefügt sind oder in sie inseriert sind und die dieselbe Aktivität wie die vorstehenden Polypeptide haben.
Wenn das Polypeptid (I) mittels rekombinanter Gentechniken hergestellt wird, kann ein Methioninrest, der dem Startkodon ATG stromaufwärts eines für das Polypeptid (I) kodierenden Gens entspricht, dem N-Terminus von Polypeptid (I) hinzugefügt werden.
Das Polypeptid (I) wird zum Beispiel durch Einführen eines Expressionsvektors, der eine für das Polypeptid (I) kodierende DNA enthält, in einen entsprechenden Wirt und anschließend Kultivieren der sich daraus ergebenden Transformante erhalten.
Der vorstehende Expressionsvektor, der eine für das Polypeptid (I) kodierende Nukleotidsequenz enthält, kann zum Beispiel durch das folgende Verfahren erhalten werden:
(a) Für Polypeptid (I) kodierende RNA wird isoliert.
(b) Einzelsträngige, komplementäre DNA (cDNA) wird aus der RNA synthetisiert, gefolgt von der Synthese doppelsträngiger DNA.
(c) Die komplementäre DNA wird in ein Plasmid eingeführt.
(d) Eine Wirtszelle wird mit dem auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid transformiert.
(e) Nach dem Kultivieren der auf diese Weise erhaltenen Transformanten wird das die gewünschte DNA enthaltende Plasmid durch ein entsprechendes Verfahren wie etwa Koloniehybridisierung mittels einer DNA-Sonde aus den Transformanten isoliert.
(f) Die gewünschte klonierte DNA wird aus dem Plasmid ausgeschnitten.
(g) Die klonierte DNA wird stromabwärts eines Promotors in dem Vektor ligiert.
Die für das Polypeptid (I) kodierende RNA kann aus verschiedenen, Polypeptid (I) produzierenden Zellen, zum Beispiel Human- Gliomzellen, Pituizyten und Fibroblasten, erhalten werden.
Der auf diese Weise erhaltene Expressionsvektor wird in entsprechende Wirtszellen (wie etwa Escherichia coli, Bacillus subtilis, Hefe- und tierische Zellen) eingeführt und die sich daraus ergebenden Transformanten werden kultiviert, wodurch das Polypeptid (I) hergestellt werden kann.
Partielle Peptide, die N-terminale partielle Peptide enthalten, die aus 12 bis 14 aufeinanderfolgenden Aminosäuren einer durch Formel [2] dargestellten Sequenz bestehen:
Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys,
und C-terminale partielle Peptide, die aus 8 bis 9 aufeinanderfolgenden Aminosäuren einer durch Formel [3] dargestellten Sequenz bestehen:
Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg
können als Immunogene verwendet werden.
Die vorstehenden partiellen Peptide können durch in der Technik bekannte Peptidsyntheseverfahren hergestellt werden, die irgendeines der bekannten Festphasen-Syntheseverfahren oder Flüssigphasen-Syntheseverfahren sein können. Beispiele derartiger Peptidsyntheseverfahren schließen die in Schroder und Lubke, The Peptide, Bd. 1, Academic Press, New York, USA (1966), Izumiya et al., Peptide Synthesis, Maruzen (1975), und Izumiya et al., Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen (1985) beschriebenen Verfahren ein.
Die partiellen Peptide können durch Spalten von Polypeptid (I) mit entsprechenden Enzymen hergestellt werden. Derartige Verfahren schließen zum Beispiel das in Course of Biochemical Experiments 1, Chemistry of Proteins, Seite 255 bis 332, herausgegeben von der Biochemischen Gesellschaft von Japan, Tokyo Kagaku Dojin (1976), beschriebene Verfahren ein.
Wenn die vorstehenden partiellen Peptide zur Immunisierung verwendet werden, können sie als Konjugate mit Trägerproteinen verwendet werden.
Beispiele der Trägerproteine schließen Rinderserumalbumin, Rinderthyroglobulin, Rinder-γ-globulin, Hämocyanin und Freundsches komplettes Adjuvans (Difco) ein.
Die vorstehenden partiellen Peptide können durch in der Technik bekannte Verfahren an die Trägerproteine gekoppelt sein. Zur Kopplung verwandte Reagenzien schließen zum Beispiel Glutaraldehyd und wasserlösliches Carbodiimid ein. Das Gewichtsverhältnis des Peptids zum Trägerprotein ist geeigneterweise 1:1 bis 1:30, vorzugsweise 1:15 bis 1:20, bevorzugter 1:1 bis 1:4. Wenn die Reaktion bei einem pH um den Neutralpunkt, insbesondere ungefähr 7,3, ausgeführt wird, werden in vielen Fällen gute Ergebnisse erhalten. Die für die Reaktion erforderliche Zeit ist in vielen Fällen vorzugsweise 2 bis 6 Stunden, bevorzugter 3 Stunden. Die auf diese Weise hergestellten Konjugate werden durch herkömmliche Verfahren bei etwa 4ºC gegen Wasser dialysiert. Die sich daraus ergebenden Produkte können gefroren oder lyophilisiert aufbewahrt werden.
Zum Herstellen der polyklonalen Antikörper werden warmblütige Tiere mit den wie vorstehend beschrieben hergestellten Immunogenen beimpft. Beispiele zur Herstellung der vorstehenden Antikörper verwandter warmblütiger Tiere schließen warmblütige Säuger (wie etwa Schafe, Ziegen, Kaninchen, Rinder, Ratten, Mäuse, Meerschweinchen, Pferde und Schweine) und Vögel (wie etwa Hühner, Tauben, Enten, Gänse und Wachteln) ein. Die Immunogene werden in die warmblütigen Tiere in zur Antikörperherstellung wirksamen Mengen eingeimpft. Zum Beispiel wird 1 mg Immunogen je Impfang mit 1 ml physiologischer Kochsalzlösung und Freundschem komplettem Adjuvans emulgiert und alle 4 Wochen, insgesamt 5 Mal, subkutan in den Rücken und die Hinterpfote eingeimpft, wodurch in vielen Fällen der Anikörper produziert wird. Die auf diese Weise in den warmblütigen Tieren gebildeten Antikörper werden gesammelt. Zum Beispiel wird das Blut im Falle der Kaninchen üblicherweise 7 bis 12 Tage nach der letzten Impfung aus der Ohrvene abgenommen und dem Zentrifugieren unter Erhalten des Antikörpers als Serum unterzogen. Das sich daraus ergebende Antiserum wird üblicherweise unter Gewnnen adsorbierter Fraktionen der Affinitätschromatographie mittels eies Trägers unterzogen, der jeweils ein Antigenpeptid trägt, wodurch der polyklonale Antikörper gereinigt werden kann.
Zum anderen kann auch der monoklonale Antikörper verwendet werden, der durch ein dem von Milstein et al. [Nature 256, 495 (1975)] ähnliches Verfahren erhalten wird. Die einen monoklonalen Antikörper produzierenden Hybridomzellen der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden aus den warmblütigen Tieren, zum Beispiel Mäuse, die durch das vorstehende, Verfahren zum Herstellen des polyklonalen Antikörpers ähnlich immunisiert wurden, durch Selektieren von Individuen, die einen hohen Antikörpergehalt zeigen, Sammeln von Milzen oder Lymphkörperchen daraus nach 2 bis 5 Tagen seit der letzten Immunisierung und Verschmelzen darin enthaltener Antikörper-produzierender Zellen mit Myelomzellen. Das Verschmelzungsverfahren kann gemäß in der Technik bekannten Verfahren, zum Beispiel dem Verfahren von Kohler und Milstein, [Nature 256, 495 (1975)], ausgeführt werden. Verschmelzungsbeschleuniger einschließlich Polyethylenglykol (PEG) und Sendai-Virus können verwendet werden. Insbesondere wird bevorzugt PEG verwendet. Beispiele der Myelomzellen schließen NS-1, P3U1 und SP2/0 ein und besonders bevorzugt wird P3U1 verwendet. Das Verhältnis der Zahl der Antikörper-produzierenden Zellen zur Zahl f der Myelomzellen ist vorzugsweise 1:1 bis 20:1. PEG (bevorzugt PEG 1000 bis PEG 6000) wird in einer Konzentration von 10 bis 80% hinzugesetzt, gefolgt von 1 bis 10 Minuten Inkubation bei 20 bis 40ºC, bevorzugt 30 bis 37ºC, wodurch eine Zellverschmelzung wirkungsvoll ausgeführt werden kann.
Zum Erhalten der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, Ratten oder Mäuse zur Immunisierung zu verwenden. Wenn Mäuse immunisiert werden, werden bevorzugt zum Beispiel subkutane, intraperitoneale oder intravenöse Injektionen verwendet. Insbesondere ist die subkutane Injektion bevorzugt. Das Immunisierungsintervall und die Immunisierungsdosis sind breit veränderbar und es stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Zum Beispiel werden häufig Verfahren verwendet, bei denen die Immunisierung 2 bis 6 Mal in Intervallen von 2 Wochen durchgeführt wird und Milzzellen. nach 1 bis 5 Tagen, bevorzugt 2 bis 4 Tagen seit der letzten Immunisierung entnommen werden.
Als Immunisierungsdosis ist es bevorzugt, 0,1 µg oder mehr, vorzugsweise 10 bis 300 µg Peptid je Immunisierung zu verwenden. Weiter ist es erwünscht, das Verschmelzungsverfahren unter Verwenden der Milzzellen nach der Bestatigung der Zunahme des Antikörpergehalts im Blut durch Sammeln einer Menge Blut vor der Entnahme der Milzen durchzuführen.
Die vorstehenden Milzzellen werden mit Lymphzellen verschmolzen. Zum Beispiel werden die den Mäusen entnommenen Milzzellen mit Lymphzellenstämmen wie etwa geeigneten Myelomzellen [zum Beispiel P3-X-63-Ag 8UI (Ichimori et al., J. Immun. Method 80, 55 (1985))] derselben Art oder einer unterschiedlichen Art (vorzugsweise derselben Art) mit Markern wie etwa dem mit einem Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferasemangel (HGPRT) und dem mit einem Thymidinkinasemangel (TK) verschmolzen. Die verschmolzenen Zellen werden zum Beispiel gemäß dem Verfahren von Kohler und Milstein [Nature 256, 495 (1975)] hergestellt. Zum Beispiel werden Myelomzellen und Milzzellen in einem Verhältnis von 1:5 in einem Medium suspendiert (nachstehend als IH-Medium bezeichnet), das durch Mischen von Iscove-Medium und Ham-F-12- Medium im Verhältnis 1:1 hergestellt wurde, und es wird ein Verschmelzungsbeschleuniger wie etwa Sendai-Virus oder Polyethylenglykol (PEG) hinzugesetzt. Es ist selbstverständlich möglich, andere Verschmelzungsbeschleuniger wie etwa Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzuzusetzen. Der Polymerisationsgrad von PEG ist üblicherweise 1000 bis 6000, die Verschmelzungszeit ist 0,5 bis 30 Minuten und die Konzentration der Suspension ist 10 bis 80%. Unter bevorzugten Bedingungen werden die Myelomzellen und die Milzzellen mittels PEG 6000 miteinander 4 bis 10 Minuten in einer Konzentration von 35 bis 55% verschmolzen, was eine wirkungsvolle Verschmelzung zur Folge hat. Die verschmolzenen Zellen können mittels Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-Medium (HAT- Medium) [Nature 256 495 1975] selektiv vermehrt wärden.
Der Kulturüberstand der vermehrten Zellen wird anschließend auf die gewünschte Antikörperproduktion durchmustert. Das Durchmustern auf den Antikörpergehalt kann in der folgenden Weise durchgeführt werden. Zuerst wird die Anwesenheit oder Abwesenheit des durch die Peptidimmunisierung produzierten Antikörpers durch Radioimmuntests (RIA) oder Enzymimmuntests (EIA) untersucht. Für diese Verfahren stehen auch verschiedene modifizierte Verfahren zur Verfügung. Als bevorzugtes Testbeispiel wird hierin nachstehend ein Verfahren unter Verwenden des EIA beschrieben. Ein Kaninchen-anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper wird mit einem Träger wie etwa Cellulosekugeln gemäß herkömmlichen Verfahren gekoppelt und anschließend wird ein zu testender Kulturüberstand oder Mausserum hinzugesetzt, gefolgt von der Reaktion bei konstanter Temperatur (4 bis 40ºC, dasselbe trifft nachstehend zu) über eine definierte Zeit. Nachdem das Reaktionsprodukt gründlich gewaschen worden ist, wird ein enzymmarkiertes Peptid (ein Peptid wird gemäß herkömmlichen Verfahren mit einem Enzym gekoppelt, gefolgt von der Reinigung) hinzugesetzt, gefolgt von der Reaktion bei konstanter Temperatur über eine definierte Zeit. Nachdem das Reaktionsprodukt gründlich gewaschen worden ist, wird ein Enzymsubstrat hinzugesetzt, gefolgt von der Reaktion bei konstanter Temperatur über eine definierte Zeit. Anschließend wird die Absorption oder Fluoreszenz des gefärbten Produkts gemessen.
Es ist erwünscht, daß die Zellen in Näpfchen, die eine Vermehrung in eänem Selektionsmedium und eine Antikörperaktivität gegenüber dem zur Immunisierung verwendeten Peptid zeigen, durch Grenzverdünnungsanalyse kloniert werden. Der Überstand der klonierten Zellen wird unter Zunahme der Zellen in den Näpfchen, die einen hohen Antikörpergehalt zeigen, ähnlich durchmustert, wodurch monoklonale Antikörper produzierende Hybridomklone erhalten werden können, die eine Reaktivität mit dem immunisierten Peptid zeigen.
Die auf diese Weise klonierten Hybridomzellen werden in einem flüssigen Medium vermehrt. Insbesondere werden die Hybridomzellen zum Beispiel in einem flüssigen Medium wie etwa, einem Medium, das durch Zusetzen von 0,1-40% Rinderserum zu RPMI-1640 hergestellt wurde [G. E. Moore et al., J. Am. Med. Assoc. 199, 549 (1967)], 2 bis 10 Tage, bevorzugt 3 bis 5 Tage, kultiviert, wodurch der monoklonale Antikörper aus der Kulturlösung erhalten werden kann. Der Antikörper kann weiter durch intraperitoneales Beimpfen von Säugern mit den Hybridomzellen, wodurch die Zellen vermehrt werden, und anschließend Sammeln des Aszites erhalten werden. Im Falle der Maus werden zum Beispiel 1 x 10&sup4; bis 1 x 10&sup7;, bevorzugt 5 x 10&sup5; bis 2 x 10&sup6;, Hybridomzellen intraperitoneal in eine Maus wie etwa BALB/c eingeimpft, die zuerst mit Mineralöl beimpft wurde, und der Aszites wird nach 7 bis 20 Tagen, bevorzugt nach 10 bis 14 Tagen, gesammelt. Der im Aszites gebildete und angereicherte monoklonale Antikörper kann durch Ammoniumsulfatfraktionierung oder DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie leicht als reines Immunglobulin isoliert werden.
Die monoklonalen Antikörper, die spezifisch an das Peptid binden, das wenigstens 8 aufeinanderfolgende Aminosäuren der durch Formel [1] dargestellten Aminosäuresequenz enthält, werden auf diese Weise erhalten.
Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung binden spezifisch an Immunogene, das Peptid, das wenigstens 8 aufeinanderfolgende Aminosäuren der durch Formel [1] dargestellten Aminosäuresequenz enthält.
In einigen Fällen binden die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung an das Peptid das wenigstens 8 aufeinanderfolgende Aminosäuren einer durch Formel [1] dargestellten Aminosäuresequenz enthält, daß von dem Peptid verschieden ist, das als Immundgen verwendet wird, wenn die Antikörper hergestellt werden.
Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sind monoklonale Antikörper gegenüber Peptiden, die wenigstens 8 aufeinanderfolgende Aminosäuren einer Aminosäuresequenz enthalten, die durch Formel [1] dargestellt wird und die immunogene Peptide sind.
Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung haben die Eigenschaft, spezifisch an das Peptid zu binden, das wenigstens 8 aufeinanderfolgende Aminosäuren einer durch Formel [1] dargestellten Aminosäuresequenz enthält.
Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung haben ein Molekulargewicht von 140 bis 16 Kilodalton und gehören der IgModer IgG-Immunglobulinklasse an.
Die Moleküle der vorstehenden Antikörper können Fraktionen davon sein, wie etwa F(ab')&sub2;, Fab' oder Fab. Als Molekül, an das ein nachstehend beschriebenes Markierungsmittel direkt gebunden ist, ist Fab' bevorzugt.
Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sind als Reagenzien zum Bestimmen von Polypeptid (I) sehr nützlich, da sie an Polypeptid (I) spezifisch binden. Unter dem Gesichtspunkt des Erhaltens grundlegender Informationen (wie etwa die Invitro-Verteilung) das Polypeptid (I) betreffend, ist es ferner sehr nützlich, das Bestimmen von Polypeptid (I) in lebenden Organen und im Gewebe zu erleichtern. Zum Nachweisen von Polypeptid (I) in lebenden Organen und im Gewebe werden üblicherweise Enzymimmuntests (ELA), Verfahren mit fluoreszierenden Antikörpern und Radioimmuntests (RIA) eingesetzt. Die Western-Blotting Analyse kann zur Größenbestimmung von Polypeptid (I) in diesen Organen und Geweben verwendet werden. Bei diesem Verfahren werden aus den Organen oder Geweben stammende rohe Extrakte oder teilweise gereinigte Proben davon der Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterzogen, gefolgt von der Überführung auf Membränfilter zum Nachweisen von Polypeptid (I) mit HRP-gebundenen Antikörpern.
Bei Antikörpern mit einer neutralisierenden Aktivität ist es auch möglich, die Funktion von Polypeptid (I) durch Neutralisieren der Aktivität von.Polypeptid (I) in vivo zu verfolgen.
Es ist weiter möglich, als Reagenzien zum Reinigen des Polypeptids (I) Antikörper-Affinitätssäulen zu verwenden, die durch Ausnutzen der Bindungsfähigkeit der Antikörper an das Polypeptid (I) hergestellt werden.
Der zum Nachweisen und Bestimmen von Polypeptid (I) verwendete EIA oder RIA wird zum Beispiel in der folgenden Weise durchgeführt. Der gereinigte Antikörper wird in einer Menge von 0,1 bis 10 µg/Näpfchen an einen Träger wie etwa eine 96-Näpfchen- Plastikplatte (zum Beispiel Immunoplate, Nunc, Dänemark), Glaskugeln oder Plastikkugeln fixiert. Im Falle der Plastikplatte oder der Plastikkugeln wird der Antikörper durch Reaktion bei 4ºC über Nacht oder bei Raumtemperatur während 0,5 bis 4 Stunden fixiert. Im Falle der Glaskugeln wird der Antikörper zum Beispiel durch ein in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 3513-3516 (1983), beschriebenes Verfahren fixiert. Verschiedene andere im Handel erhältliche Platten zur Fixierung von Antikörpern können ebenfalls verwendet werden.
Eine das antigene Polypeptid (I) enthaltende Lösung wird der Platte mit den Kugeln zugesetzt, an die der Antikörper auf diese Weise fixiert ist, gefolgt von einer Adsorptionsreaktion. Die Adsorptionsreaktion wird manchmal 0,2 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur ausgeführt, wird jedoch bevorzugt über Nacht bei 4ºC ausgeführt
Nach der Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion wird ein Antikörper, an den ein Markierungsmittel gebunden ist, zugesetzt, gefolgt von der Adsorptions reaktion. Die Markierungsmittel schließen Radioisotope, Enzyme, fluoreszierende Substanzen und lumineszierende Substanzen ein. Es ist jedoch bevorzugt, Enzyme zu verwenden. Als Enzyme)/devorzugsweise stabil und von hoher spezifischer Aktivität sind, können Peroxidasen, alkalische Phosphatasen, β-D-Galactosidasen und, Glucoseoxidasen verwendet werden. Insbesondere weyden berzugt Peroxidasen verwendet. Peroxidasen verschiedenen Ursprungs könne verwendet werden. Beispiele derartiger Peroxidaen schließen Peroxidasen ein, die aus Meerrettich, Ananas, Feigen, Süßkartoffeln, breiten Bohnen und Tannenzapfen erhalten wurden. Insbesondere ist aus Meerrettich extrahierte Meerrettichperoxidase (HRP) bevorzugt.
Beim Binden von Peroxidase an den Antikörper wird die Thiolgruppe von Fab' als Antikörpermolekül verwendet. Aus diesem Grund wird bequemerweise eine Peroxidase verwendet, in die zuvor eine Maleimidgruppe eingeführt wurde.
Wenn eine Maleimidgruppe in Peroxidase eingeführt wird, kann eine Maleimidgruppe über eine Aminogruppe der Peroxidase eingeführt werden. Zu diesem Zweck können N-Succinimidylmaleimidcarboxylatderivate verwendet werden. N-(γ-Maleimidobutyloxy) succinimid (hierin nachstehend kurz als GMBS bezeichnet) wird bevorzugt verwendet. Eine bestimmte Gruppe kann sich deshalb zwischen der Maleimidgruppe und der Peroxidase befinden.
GMBS wird mit Peroxidase in einer Pufferlösung mit einem pH von 6 bis 8 bei 10 bis 50ºC 10 bis 24 Stunden umgesetzt. Die Pufferlösungen schließen zum Beispiel 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7, 0) ein. Die auf diese Weise erhaltene maleimidierte Peroxidase kann zum Beispiel durch Gelchromatographie gereinigt werden. Beispiele in der Gelchromatographie verwendeter Träger schließen Sephadex G-25 (Pharmacia Fine Chemicals, Schweden) und Biogel P- 2 (Bio RAD Laboratories, USA) ein.
Die maleimidierte Peroxidase kann mit einem Antikörpermolekül in einer Pufferlösung 1 bis 48 Stunden bei 0 bis 40ºC umgesetzt werden. Die Pufferlösungen enthalten zum Beispiel 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0), der 5 mM Natriumethylendiamintetraacetat enthält. Der auf diese Weise erhaltene Peroxidase-markierte Antikörper kann zum Beispiel durch Gelchromatographie gereinigt werden. Beispiele in der Gelchromatographie verwendeter Träger schließen Sephadex G-25 (Pharmacia Fine Chemicals, Schweden) und Biogel P-2 (Bio RAD Laboratories USA) ein.
Eine Thiolgruppe kann in die Peroxidase unter Reagieren mit dem maleimidierten Antikörpermolekül eingeführt werden.
Andere Enzyme als Peroxidasen können ähnlich den Verfahren des Bindens der Peroxidasen direkt an die Antikörper gebunden werden und bekannte Verfahren, die ein derartiges Binden zustande bringen, schließen zum Beispiel das Glutaraldehydverfahren, das Periodsäureverfahren und das Verfahren mit einem wasserlöslichen Carbodiimid ein.
Bei den enzymmarkierten Antikörpern werden zum Entwickeln einer Färbung im Falle von HRP Reaktionssubstrate wie etwa 2,2'-Diadino-di[3-ethylbenzothiazolinsulfonat (6)] zugesetzt, wodurch die Absorption gemessen wird. Was die radiomarkierten Antikörper betrifft, wird die Radioaktivität der nicht an Polypeptid (I) gebundenen Antikörper durch einen Szintillationszähler gemessen. Die Absorption oder die Radioaktivität der Proben werden mit den Werten für eine bekannte Menge Polypeptid (I) verglichen, wodurch das Polypeptid (I) bestimmt werden kann.
Außer Sandwich-EIA, bei denen ein Antigen zwischen zwei Arten Antikörper angeordnet ist und die später beschrieben werden, werden kompetitive EIA und indirekte EIA durchgeführt, die wohlbekannt sind. Bei den kompetitiven EIA ist der Antikörper an einen Träger fixiert und das enzym- oder radiomarkierte antigene Polypeptid (I) und eine Probe werden hinzugesetzt, gefolgt von der Reaktion und Bestimmung von Polypeptid (I). Die Reaktion und Bestimmung des markierten Antigens werden unter Bedingungen ähnlich den oben beschriebenen ausgeführt. Bei den indirekten EIA wird eine Testprobe mit dem Antikörper umgesetzt, der nicht an einen Träger fixiert ist, und der Antikörper, der nicht absorbiert ist, wird mit einer Platte, an die der Antikörper fixiert ist, und einem anti-Maus-markierten Antikörper bestimmt. Die Reaktion und die Messung der Radioaktivität werden unter Bedingungen ähnlich den oben beschriebenen ausgeführt.
In dem Testsystem wie etwa dem Nachweis und der Bestimmung des Polypeptids (I) der vorliegenden Erfindng verwendete Testproben schließen Körperflüssigkeiten wie etwa Urin, Serum, Plasma und Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit, Extrakte tierischer Zellen und Kulturüberstände davon ein.
Als Beispiel einer Bestimmung der vorliegenden Erfindung wird hierin nachstehend ein Fall genau beschrieben, bei dem Peroxidase als Markierungsmittel verwendet wird, die vorliegende Erfindung ist aber nicht auf die Peroxidase beschränkt.
(1) Zuerst wird eine das zu bestimmende Polypeptid (I) enthaltende Testprobe dem auf einem Träger festgehaltenen Antikörper unter Ausführen einer Antigen-Antikörperreaktion zugesetzt und anschließend wird das Konjugat der Peroxidase mit dem oben erhaltenen Antikörper hinzugesetzt, gefolgt von der Reaktion.
In diesem Testsystem verwendete Testproben schließen Körperflüssigkeiten wie etwa Urin, Serum, Plasma und Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit, Extrakte tierischer Zellen und Kulturüberstände davon ein.
Die Träger, auf denen der Antikörper bei den Bestimmungen von Polypeptid (I) festgehalten wird, schließen zum Beispiel Gelteilchen wie etwa Agarosegele [zum Beispiel Sepharos 48 und Sepharose GB (Pharmacia Fine Chemical, Schweden)], Dextrangele [zum Beispiel Sephadex G-75, Sephadex G-100 und Sephadex G-200 (Pharmacia Fine Chemical, Schweden)] und Polyacrylamidgele [zum Beispiel Biogel P-30, Biogel P-60 und Biogel P-100 (Bio RAD Laboratories, USA)]: Cellulosederivate wie etwa Avicel (Asahi Chemical Industry, Japan) und Ionenaustauschcellulose (zum Beispiel Diethylaminoethylcelrulose und Carboxymethylcellulose), physikalische Adsorbentien wie etwa Glas (zum Beispiel Glaskugeln, Glasstäbe, Aminoalkylglaskugeln und Aminoalkylglasstäbe), Silikonstücke, Styrolharz (zum Beispiel Polystyrolkugeln und Polystyrolteilchen) und Platten für den Immuntest (zum Beispiel Nunc, Dänemark) und Ionenaustauschharze wie etwa saure Kationenaustauschharze [zum Beispiel Amberlite IRC-50 (Rohm & Haas, USA) und Zeocurve 226 (Permutit, Westdeutschland)] und, alkalische Anionenaustauschharze [zum Beispiel Amberlite IR-48 und Dowexe (Dow Chemical, USA)] ein.
Zum Festhalten des Antikörpers auf dem Träger werden in der Technik bekannte Verfahren angewandt. Beispiele derartiger Verfahren schließen das Bromcyanverf ahren und das Glutardialdehydverfahren ein, die in Metabolism 8, 696 (1971), beschrieben werden. Bei einem einfacheren Verfahren kann der Antikörper auf der Trägeroberfläche adsorbiert sein.
(2) Das Substrat der Peroxidase wird dem in (1) erhaltenen Reaktionsprodukt zugesetzt und anschließend wird die Absorption oder die Fluoreszenzintensität der sich daraus ergebenden Substanz gemessen, wodurch die Enzymaktivität des vorstehenden Reaktionsproduktes bekannt wird.
(3) Die in (1) und (2) beschriebenen Verfahren werden zuerst für eine Standardlösung einer bekannten Menge Polypeptid (I) durchgeführt, um eine Standardkurve herzustellen, die die Beziehung zwischen der Menge Polypeptid (I) und dessen Absorption oder Fluoreszenzintensität zeigt.
(4) Die für die eine unbekannte Menge Polypeptid (I) enthaltende Testprobe erhaltene Absorption oder Fluoreszenzintensität wird zum Bestimmen der Menge Polypeptid (I) in der Testprobe auf die Standardkurve angewandt.
Der vorstehende Antikörper kann zum Nachweis und zur Bestimmung von Polypeptid (I) durch Western-Blotting [W. N. Burnette, Analytical Biochemistry 112, 195 (1981)] benützt werden.
Ein spezielles Beispiel des Western-Blotting wird nachstehend beschrieben.
Eine das Polypeptid (I) enthaltende Pibbe wird zum B,ei spiel in Probenpuffer [U. K. Laemmli, Nature 227, 680 (1970)] gelöst. In diesem Falle wird 2-Mercaptoethanol entweder als Reduktionsmittel (unter reduzierenden Bedingungen) oder nicht (unter nicht-reduzierenden Bedingungen) hinzugesetzt. Jede dieser Bedingungen kann verwendet werden. Die sich daraus ergebende Lösung wird 5 Minuten auf 100ºC erhitzt und anschließend der Elektrophorese unterzogen. Jede Elektrophorese kann verwendet werden, solange das Protein getrennt werden kann. Spezielle Beispiele einer derartigen Elektrophorese schließen die SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese ein. Das Protein wird nach der Elektrophorese aus dem Gel auf eine Nitrocellulosemembran überführt. Dieses Verfahren ist in der Technik wohlbekannt und schließt zum Beispiel das Verfahren von Burnette [Analytical Biochemistry 112, 195 (1981)] ein. Anschließend wird das Polypeptid (1) auf der Nitrocellulosemembran durch ein immunologisches Verfahren nachgewiesen. Die Nitrocellulosemembran wird zum Beispiel mit einer 3%igen Gelatinelösung blockiert, gefolgt von einer ersten Antikörperreaktion Ein als erster Antikörper verwendeter Antikörper kann entweder ein Antiserum oder ein gereinigter Antikörper sein. Der gereinigte Antikörper ist jedoch bevorzugter. Was die Bedingungen der ersten Antikörperreaktion nach dem Blockieren betrifft, kann jeder Satz Bedingungen angewandt werden, solange das Polypeptid (I) auf der Membran an den ersten Antikörper gebunden werden kann. Die erste Antikörperreaktion wird zum Beispiel etwa 4 bis 16 Stunden bei Raumtemperatur ausgeführt. Nach der ersten Antikörperreaktion wird eine zweite Antikörperreaktion durchgeführt. Was den zweiten verwendeten Antikörper angeht, kann jeder Antikörper verwendet werden, solange er an den ersten Antikörper gebunden werden kann und nachweisbar ist. Beispiele derartiger Antikörper schließen mit einem Markierungsenzym gekoppeltes IgG ein. Spezielle Beispiele von Markierungsenzymen schließen Meerrettichperoxidase (HRP) und alkalische Phosphatase ein. Was die Bedingungen der ersten Antikörperreaktion angeht, können alle Bedingungen angewandt" werden, solange der zweite Antikörper an den ersten Antikörper binden kann. Die zweite Antikörperreaktion wird zum Beispiel 1 Stunde bei Raumtemperatur ausgeführt. Nach der vorstehenden zweiten Antikörperreaktion entwickelt sich eine Färbung und die Bande von Polypeptid (I) wird auf der Nitrocellulosemembran nachgewiesen. Gemäß dem vorstehenden Western-Blotting ist das Polypeptid (I) nachweisbar, falls es in einer Menge von 50 ng oder mehr vorliegt. Das Polypeptid (I) kann in der Testprobe durch Vergleichen der Dichte der Bande der Testprobe mit der Dichte der Banden einer bekannten Menge Polypeptid (I) bestimmt werden. Anstelle des vorstehenden ersten Antikörpers kann zum Beispiel das Konjugat des Antikörpers mit HRP verwendet werden.
-Zum Reinigen von Polypeptid (I) wird der gereinigte Antikörper mit einem geeigneten Träger wie etwa aktivierten Agarosegelkugeln gemäß herkömmlicher Verfahren gekoppelt und in eine Säule gepackt. Anschließend wird die Antikörpersäule mit einer das Polypeptid (I) enthaltenden Probe wie etwa einem Kulturüberstand oder aufgebrochenen Zellen beladen, um die Probe dadurch adsorbieren zu lassen, gefolgt vom Waschen. Anschließend wird die Elution mit einem chaotropen Reagenz wie etwa Kaliumthiocyanat (KSCN) oder unter derart sauren Bedingungen durchgeführt, daß das Polypeptid (I) nicht inaktiviert wird. Auf diese Weise kann das Polypeptid (I) wirksam gereinigt werden.
Die Antikörpersäule kann durch Koppeln des monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung, der zum Beispiel aus Aszites oder anderen, mit den Hybridomzellen beimpften Körperflüssigkeiten gereinigt wurde, mit einem geeigneten Träger hergestellt werden.
Jeder Träger kann verwendet werden, solange das Polypeptid (I) nach dem Koppeln dadurch spezifisch und wirkungsvoll adsorbiert wird und danach eine geeignete Elution möglich ist. Als Beispiel werden Agarosegelkugeln, bei denen primäre Amine des Proteins aktiviert sind, so daß sie leicht gebunden werden können, wie etwa Affi-Gel 10 (Bio RAD); bequem gemäß dem folgenden Verfahren verwendet. Der Antikörper wird mit Affi-Gel 10 in einer Pufferlösung wie etwa einer Bicarbonatlösung mit einer Konzentration von 0,001 bis 1 M, vorzugsweise 0,1 M, umgesetzt. Die Reaktion wird bei 0 bis 20ºC in einem breiten pH-Bereich 10 bis 24 Stunden, vorzugsweise bei 4ºC bei einem pH von 7 bis 1,0 4 Stunden ausgeführt. Bezüglich des Mischungsverhältnisses des Antikörpers zu Affi-Gel 10 ist, je größer die Menge des mit Affi-Gel 10 gemischten Antikörpers ist, desto größer die Antikörpermenge, die daran gebunden wird. Es können bis zu 50 mg Antikörper an 1 ml Affi-Gel 10 gebunden sein. Unter Berücksichtigung der Reinigungswirkung der Affinitätschromatographie werden daher bequem 10 bis 30 mg Antikörper verwendet. Das auf diese Weise gebildete kombinierte Antikörper-Träger-Material wird mit der für die Re-aktion verwendeten Pufferlösung gründlich gewaschen. Anschließend werden die restlichen unumgesetzten aktiven Gruppen blokkiert, indem man das gewaschene Material mehrere Tage stehen läßt, indem eine Verbindung, die ein primäres Amin wie etwa Ethanolamin-Salzsäure oder Glycin enthält, auf eine Endkonzentration von 0,05 bis 0,10 M hinzugesetzt wird, gefolgt von 1 bis 4 Stunden Reaktion bei 4ºC oder durch Umsetzen mit einem Protein wie etwa 1 bis 5% Rinderserumalbumin (BSA) über Nächt bei 4ºC. Das auf diese Weise behandelte kombinierte Material wird unter Bilden der Antikörpersäule in eine geeignete Säule gepackt.
Zum Reinigen einer Probe mit der vorstehenden Antikörpersäule wird die das Polypeptid-(I)-Protein enthaltende Probe in einer Pufferlösung mit einem etwa neutralen pH wie etwa Phosphatpuffer oder Tris-Salzsäure-Puffer gelöst, gefolgt von der Adsorption durch die Antikörpersäule. Anschließend wird die Säule mit demselben Puffer gewaschen und anschließend wird d&s Polypeptid (I) eluiert. Als Elutionsmittel werden gemeinhin die folgenden Lösungen verwendet: Essigsäurelösungen, Polyethylenglykol enthaltende Losungen, Losungen, die Peptide enthalten&sub1; die leichter als die Probe an den Antikörper binden, hochkonzentrierte Salzlösungen und ihre kombinierten Lösungen. Lösungen, die die Inaktivierung von Polypeptid (I) nicht fördern, sind bevorzugt.
Das Ausfließende wird durch in der Technik bekannte Verfahren mit Pufferlösungen neutralisiert. Das vorstehende Reinigungsverfahren kann bei Bedarf wiederholt werden.
Weiter kann das im wesentlichen reine, im wesentlichen pyrogen- und endotoxinfreie Polypeptid (I) durch Kombinieren verschiedener, in der Technik bekannter Reinigungstechniken erhalten werden. Das im wesentlichen reine Polypeptid (I) der vorliegenden Erfindung enthält das Polypeptid (I) in einer Konzentration von 90% (Gew./Gew.) oder mehr bevorzugt 95% (Gew./Gew.) oder mehr.
Die hier erhaltene Polypeptid-(I)-Proteinlösung wird der Dialyse unterzogen und kann bei Bedarf durch Lyophilisierung pulverisiert werden. Beim Lyophilisieren können Stabilisierungsmittel wie etwa Sorbit, Mannit, Dextrol, Maltose und Glycerin zugesetzt werden.
Wenn das auf diese Weise erhaltene Polypeptid (I) eine ausreichende Aktivität aufweist, wird es so verwendet wie es ist. Wenn es keine ausreichende Aktivität aufweist, kann es durch enzymatische Verfahren oder nichtenzymatische Verfahren ausreichend aktiviert werden. Das auf diese Weise erhaltene Polypeptid (I) zeigt eine Stimulierung der Differenzierung oder Vermehrung tierischer Zellen, insbesondere Nervenzellen, und weist bei verschiedenen Proteinen und Enzymen eine induzierende Aktivität auf. Von Polypeptid (I) wird deshalb erwartet, daß es zum Behandeln die Nerven betreffender pathologischer Zustände wie etwa Nervenläsionen verwendet wird.
Weiter wird von Polypeptid (I) erwartet, daß es dieselbe Wirkung wie NGF oder eine Wirkung ähnlich der von NGF hat.
Das Polypeptid (I) der vorliegenden Erfindung ist als Reagenz für Untersuchungen brauchbar, die sich auf die Differenzierung, das Wachstum, die Vermehrung ünd das Überleben tierischer Zellen beziehen.
Wenn das Polypeptid (I) als Arzneimittel verwendet wird, kann es an warmblütige Säuger (wie etwa menschen, Mäuse, Ratten, Hamster, Kaninchen, Hunde und Katzen) in Pulverform als solches oder als pharmazeutische Zubereitung zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Arzneimittelträgern oder Verdünnungsmitteln sicher parenteral verabreicht werden.
Injektionen des Polypeptids (I) werden zum Beispiel unter Verwenden von physiologischer Kochsalzlösung oder wäßriger Lösungen, die Glucose oder andere Hilfsstoffe enthalten, durch in der Technik bekannte Verfahren hergestellt. Pharmazeutische Zubereitungen wie etwa Tabletten und Kapseln können ebenfalls hergestellt werden.
Wenn das Polypeptid (I) als vorstehendes Arzneimittel verwendet wird, wird es zum Beispiel den vorstehenden warmblütigen Tieren in einer von 1 ng/kg bis 100 µg/kg täglich reichenden geeigneten Menge verabreicht, wobei der Verabreichungsweg und die Symptome in Betracht gezogen werden.
Wenn das Polypeptid (I) als Reagenz für Untersuchungen verwendet wird&sub1; die die Differenzierung, das Wachstum, die Vermehrung und Aktivierung tierischer Zellen betreffen, wird es einem Kulturmedium für tierische Zellen vorzugsweise in einer Menge von 0,1 bis 1000 ng je Milliliter Medium, bevorzugter 1 bis 100 ng je Milliliter Medium zugesetzt. Die Differenzierung, das Wachstum, die Vermehrung und das Überleben tierischer Zellen kann durch Inkubieren tierischer Zellen in dem Medium, dein,das Polypeptid (I) zugesetzt wurde, getestet werden.
Durch Verwenden der Antikörper gegen das Polypeptid (I) oder seine partiellen Peptide können die Isolierung, Reinigung und Bestimmung von Polypeptid (I) wirkungsvoll durchgeführt werden und die Anwendung von Polypeptid (I) wird erreicht.
Wenn Basen, Aminosäuren und so weiter durch Abkürzungen in dieser" Beschreibung und den Zeichnungen bezeichnet werden, werden die &sub1;durch die IUPAC-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur eingeführten oder gemeinhin in der Technik verwendeten Abkürzungen eingesetzt. Es werden, zum Beispiel die-folgenden Abkürzungen verwendet. Wenn bei Aminosäuren ein optisches Isomer vorliegen kann, wird solange nicht anders ängegeben die L-Form dargestellt. Tabelle 1
Die im nachstehend beschriebenen Bezugsbeispiel 1 erhaltene Transformante Escherichia coli MV1184/pUNK5 wurde am 10. Februar 1989 beim Fermentationsinstitut, Osaka, Japan (IFO), unter der Zugangsnummer 14832 hinterlegt. Dieser Mikroo,rganismus wurde am 22. Februar 1989 auch beim Fermentationsforschungsinstitut, Amt für industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für internationalen Handel und Industrie, Japan (FRL), unter der Zugangsnummer FERM BP-2304 hinterlegt.
Die im nachstehend beschriebenen Bezugsbeispiel 8 erhaltene Transformante Escherichia coli BL21(DE3)/pLysS, pENGFT102 wurde am 14. Juli 1989 beim Fermentationsinstitut, Osaka, Japan (IFO), unter der Zugangsnummer 14903 hinterlegt. Dieser Mikroorganismus wurde am 26. Juli 1989 auch beim Fermentationsforschungsinstitut, Amt für industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für internationalen Handel und Industrie; Japan (FRL), unter der Zugangsnummer FERM BP-2529 hinterlegt.
Im nachstehend beschriebenen Beispiel 2(3) erhaltene Maus-N4-2- Zellen, Maus-N46-31-Zellen, Maus-N82-4-Zellen und Maus-N148-62- Zellen wurden am 25. April 1990 beim Fermentationsinstitut, Osaka, Japan (IFO) und am 15. Mai 1990 beim Fermentationsforschungsinstitut, Amt für industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für internationalen Handel und Industrie, Japan (FRI), unter den folgenden Zugangsnummern hinterlegt:
Die vorliegende Erfindung wird hierin nachstehend mit den folgenden Bezugsbeispielen und Beispielen genäu beschrieben. Es versteht sich selbstverständlich, daß diese Bezugsbeispiele und Beispiele nicht dazu bestimmt sind, den Umfang der Erfindung einschränken.

Bezugsbeispiel 1 (Klonieren von Polypeptid-(I)-cDNA)

E. coli Y1090 wurde mit den aus einem menschlichen Gliom stammenden λgtll-cDNA-Banken (dontech Laboratories Inc.) infiziert und anschließend wurden etwa 6 x 10&sup5; Phagen auf einer Agarplatte ausgestrichen, die in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), beschriebenes NZCYM-Medium enthielt, gefolgt von 5 Stunden Kultivierung bei 37ºC. Anschließend wurde eine Nylonmembran auf die Platte gelegt und nach 1 Minute Stehen entfernt. Diese Nylonmembran wurde in 0,5 M NaOH - 1,5 M NaCl, dann in 1,5 M NaCl - 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) und weiter in 2 X SSC [siehe Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] eingeweicht. Nach dem Lufttrocknen ließ man die Membran 2 Stunden bei 80ºC stehen.
Eine für Human-βNGF [Nature 303, 821 (1983)] kodierende DNA (etwa 0,38 kb) wurde chemisch synthetisiert und durch Nick- Translation mit [α-³²P]dCTP markiert, wodurch eine Sonde hergestellt wurde.
Mittels der Nylonmembran und der vorstehend erhaltenen Sonde wurde gemäß dem in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), beschriebenen Verfahren eine Hybridisierung durchgeführt. Auf diese Weise wurde die Nylonmembran in einer die Sonde enthaltenden Hybridisierungslösung eingewicht und 16 Stunden bei 65ºC gehalten. Die Nylonmembran wurde bei Raumtemperatur mit 2 X SSC-0,1% SDS und anschließend bei 60ºC mit 1 X SSC-0,1% SDS gewaschen. Danach wurden durch Autoradiographie positive Klone nachgewiesen.
Ein cDNA-Abschnitt wurde mit EcoRI aus dem auf diese Weise erhaltenen Klon γβGN1321 ausgeschnitten und unter Erhalten des Plasmids pUNK5 in die EcoRI-Stelle des Plasmids pUC118 (Takara Shuzo) inseriert. Mittels des auf diese Weise erhaltenen Plasmids pUNK5 wurde E. coli MV1184 (Takara Shuzo) unter Erhalten der Transformante E. coli MV1184/pUNK5" (IFO 14832, FERM BP-2304) erhalten.
Fig. 1 zeigt die Restriktionsenzymkarte des cDNA-Abschnitts einschließlich der im Plasmid pUNK5 enthaltenen Polypeptid-(I)- cDNA mit einer Gesamtlänge von etwa 0,78 kb. In Fig. 1 zeigt eine nicht translatierte Region, zeigt eine Propeptidcoderegion und zeigt eine Region, die für ein Polypeptid kodiert, das am C-Terminus der Aminosäuresequenz der Formel [1] weiter einen Threoninrest aufweist.
Die Nukleotidsequenz des vorstehend erhaltenen cDNA-Abschnitts wurde durch das Didesoxyverfahren [Messing et al., Nucl. Acid. Res. 9, 309 (1981)] bestimmt. Fig. 2 zeigt die bestimmte Nukleotidsequenz und die dadurch translatierte Aminosäuresequenz In Fig. 2 ist die sich von Position 1 zum N-Terminus der Aminosäuresequenz erstreckende Region ein Abschnitt des Propeptids und die Region von Position 1 bis 118 und Position 1 bis 119 zeigt das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der Formel [1] beziehungsweise das Polypeptid, das am C-Terminus der Aminosäuresequenz der Formel [1] weiter einen Threoninrest aufweist.
Fig. 3 zeigt die durch das vorstehende Verfahren bestimmte Aminosäuresequenz des Polypeptids (1) im Vergleich mit der bei Ullrich et al., Nature 303, 821 (1983), beschriebenen Aminosäuresequenz des Human-βNGF. In Fig. 3 zeigt die obere Reihe die Sequenz von 119 Aminosäuren des Polypeptids (1) und die untere Reihe zeigt die Aminosäuresequenz des Human-βNGF. Gleiche Aminosäureabschnitte sind eingerahmt. In der Abbildung zeigt "-" nur eine chemische Bindung an.
Wie aus diesem Vergleich offensichtlich ist, weist die Sequenz von 119 Aminosäuren des Polypeptids (I) der vorliegenden Erfindung eine Homologie von etwa 60% mit der Aminosäuresequenz des vorstehenden Human-ßNGF auf.
Wenn weiter die oben bestimmte Sequenz von 119 Aminosäuren des Polypeptids (I) mit der Aminosauresequenz des bei Angeletti et al., Proceedings of National, Academy of Sciences, U.S.A. 68, 2417 (1971), und Scott et al., Nature 302, 538 (1983), dargestellten βNGF verglichen wird, weist sie eine Homologie von etwa 60% auf.

Bezugsbeispiel 2 (Reklonieren von Polypeptid-(I)-cDNA)

Mittels des EcoRI-AhaIII-Fragments, das die 5'-terminale Seite des Polypeptid-(I)-cDNA-Abschnitts enthält, der in dem in Bezugsbeispiel 1 erhaltenen pUNK5 enthalten ist, als Sonde wurde eine der aus einem menschlichen Gliom stammenden cDNA-Banken (Glontech Laboratories, Inc.) in einer zu der von Beispiel 1 ähnlichen Weise kloniert. Ein cDNA-Abschnitt wurde mit EcoRI aus einem von vielen positiven Klonen ausgeschnitten. Auf diese Weise erhaltenes λHNT3I wurde unter Erhalten von Plasmid pHNT2 in die EcoRI-Stelle von Plasmid pUC119 (Takara Shuzo) inseriert. Fig. 4 zeigt die Restriktionsenzymkarte einer in das Plasmid pHNT2 inserierten Polypeptid-(I)-cDNA (etwa 1,1 kb). In Fig. 4 stellt eine Signalpeptidcoderegion dar, stellt eine Propeptidcoderegion dar und stellt eine für ein Polypeptid kodierende Region dar, das am C-Terminus der Aminosäuresequenz von Formel [1] weiter einen Threoninrest aufweist.
Die Nukleotidsequenz des im vorstehenden erhaltenen cDNA-Abschnitts wurde durch das Didesoxyverfahren bestimmt. Fig. 5 zeigt die bestimmte Nukleotidsequenz und die dadurch t,ranslatierte Aminosäuresequenz In Fig. 5 zeigt "Signal" das Signalpeptid zeigt "Pro" das Propeptid und zeigt "Mature" das Polypeptid (I) (reifes Protein) an.

Bezugsbeispiel 3 (Aufbau des Polypeptid-(I)-Expressionsvektors für Escherichia coli)

Die in das in Bezugsbeispiel 1 erhaltene Plasmid pUNK5 inserierte Polypeptid-(I)-cDNA weist in der Nähe der für den 11. Tyrosinrestes vom N-Terminus von Polypeptid, (I) aus kodierenden Region eine Scai-Stelle und eine NsiI-Stelle 50 Basen stromabwärts eines Terminierungskodons "von Polypeptid (I) auf (siehe Fig. 2, 4 und 5). Ein ScaI-NsiI-segment mit 0,3 kb wurde aus dem Plasmid pUNK5 isoliert und die, Adaptoren NGFTE-1 (35mer), NGFTE- 2 (33mer), NGFTE-3 (7mer) und NGFTE-4 (ismer) wurden mit T4-DNA--
Ligase dazuligiert, gefolgt von der Behandlung mit den Restriktionsenzymen NdeI und BamhI. Auf diese Weise wurde ein NdeI- BamHI-Fragment mit 0,3 kb erhalten (siehe Fig. 6).
Diese Adaptoren sind wie folgt:
Der Expressionsvektor pET-3C mit einem T7-Promotor [Rosenberg et al., Gene 56, 125 (1987)] wurde mit NdeI und BamhI unter Isolieren eines NdeI-BamHI-Fragments mit 4,4 kb ähnlich gespalten.
Das oben erhaltene NdeI-BAMHI-Fragment mit 4,4 kb wurde mit T4- DNA-Ligase mit dem Ndei-BamHI-Fragment mit 0,3 kb ligiert und anschließend wurde das ligierte Fragment unter Herstellen einer Transformante in E. coli DH1 inseriert. Ein aus dem sich daraus ergebenden ampicillinresistenten Transformantenstamm [E. coli DH1/pENGFT102] isoliertes Plasmid wurde pENGFTIO2 (Fig. 6) genannt.

Bezugsbeispiel 4

(Herstellung und Expression der Transformanten)

Mittels des in Bezugsbeispiel 3 erhaltenen Polypeptid-(I)-Expressionsvektors pENGFT102 wurde E. coli BL21(DE3) [Gene 56, 125 (1987)] unter Erhalten der Transformante E. coli BL21(DE3)/- pENGFT102 transformiert.
Die Transformante E. coli BL21(DE3)/pENGFT102 wurde auf 5 ml LB- Kulturmedium, das 50 µg/ml Ampicillin und 0,2% Glucose enthielt, in einem Teströhrchen 16 Stunden auf 37ºC, erhitzt. 1 ml der sich daraus ergebenden Kultur wurde in einen 200-ml-Kolben, überführt, der 20 ml desselben Mediums enthielt, und wurde bei 37ºC kultiviert. Als der Klett-Wert 170 bis 200 erreichte, wurde IPTG unter Ergeben einer Endkonzentration von 0:4 mM hinzugesetzt und die Kultivierung wurde 3 Stunde,n weiter fortgesetzt. Aus 30, µl der sich daraus ergebenden Kultur gesammelte Zellen wurden in 30 µl Probenpuffer [50 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2 mM EDTA, 1% SDS, 1% Mercaptoethanol, 8% Glycerin, 0,025% Bromphenolblau] suspendiert und 5 Minuten erhitzt, gefolgt von der Elektrophorese an 0,1% SDS enthaltenden 16% Polyacrylamidgelen. Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit Coomassie-Brilliantblau angefärbt. Als Ergebnis wurde ein Protein mit 15 Kilodalton (kDa) in E. coli BL21(DE3)/pENGFT102 nachgewiesen, das in E. coli BL21(DE3)/pET- 3C, die durch Transformieren von B. coli BL21(DE3) durch den vorstehenden Vektor PET-30 erhalten wurde, nicht nachgewiesen wurde. Die erzeugte Menge Protein mit 15 kDa betrug etwa 10% der Gesamtproteine. Dieses Protein wurde auch durch das Western- Blotting-Verfahren unter Verwenden von Kaninchen-anti-Maus-NGF- Antikörper (Collaborative Research, Inc., USA) nachgewiesen.

Bezugsbeispiel 5 (Aufbau des Polypeptid-(I)-Expressionsvektors für tierische Zellen)

Ein EcoRI-Fragment mit 1,1 kb, das die Polypeptid-(I)-cDNA enthielt, wurde aus dem in Bezugsbeispiel 2 erhaltenen Plasmid pHNT2 isoliert. Der Expressionsvektor pTB389 (beschrieben in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung (offengelegt) Nr. 64-2572/1989, die der EP-A-251 244 entspricht) wurde mit EcoRI ähnlich gespalten. Das sich daraus ergebende Fragment wurde mit T4-DNA-Ligase mit dem vorstehenden, die Polypeptid-(I)-cDNA enthaltenden EcoRI-Fragment mit 1,1 kb ligiert und anschließend wurde das Ligierungsgemisch zur Transformation von E. coli DH1 (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Gold Spring Harbor Laboratory, S. 505, 1982) verwendet. Aus der sich daraus ergebenden ampicillinresistenten Transformante coli DH1/pNTK26] wurde ein Plasmid isoliert und dieses Plasmid wurde pNTK26 genannt.
Ein ClaI-HindIII-Fragment mit 1,1 kb, das eine Abelson-Maus- Leukämievirus-LTR-Region- (A-MuLV), besaß, wurde aus dem Plasmid pTB505 (beschrieben in der japänischen ungeprüften Patentveröffentlichung (offengelegt) Nr. 62-175182/1987, die der EP-A-225 701 entspricht) isoliert. Das, Plasmid pNTK26 wurde mit den Restriktionsenzymen ClaI und HindIII ähnlich gespalten und das kleinere Fragment wurde entfernt. Anschließend wurde das sich daraus ergebende Fragment mit dem vorstehenden ClaI-HindIII- Fragment mit 1,1 kb, das die A-MuLV-LTR-Region enthielt, mit T4- DNA-Ligase ligiert und das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von R. coli DH1 unter Ergeben der ampicillinresistenten Transformante E. coli DH1/pNTL145 verwendet. Das Plasmid pNTL145 wurde aus der auf diese Weise erhaltenen Transformante (Fig. 7) isoliert.

Bezugsbeispiel 6 (Aufbau des Polypeptid-(I)-Expressionsvektors für tierische Zellen)

Ein EcoRI-AhaIII-Fragment mit 0,86 kb, das die für das Signalpeptid, das Propeptid und das Polypeptid (I) kodierenden Regionen in der Polypeptid-(I)-cDNA enthielt, wurde aus dem in Bezugsbeispiel 2 erhaltenen Plasmid pHNT2 isoliert (zum Ort der Ahaill-Stelle siehe Fig. 4 und 5). Der 5'-Terminus (EcoRI) des sich daraus ergebenden Fragments wurde mit Klenow-Fragment geglättet und anschließend wurde der XhoI-Linker pCCTCGAGG mit T4-Ligase an jeden Terminus davon ligiert, gefolgt von der Behandlung mit XhoI. Auf diese Weise wurde ein XhoI-Fragment mit 0,86 kb erhalten.
Der Expressionsvektor PKSV-10 (Pharmacia) für tierische Zellen wurde mit dem Restriktionsenzym BglII gespalten und anschließend wurden beid=e Enden (XhoI) des sich daraus ergebenden Fragments mit Klenow-Fragment geglättet. Der XhoI-Linker (zuvor beschrieben) wurde hinzugesetzt und dieses Fragment wurde mit T4-DNA- Ligase mit dem vorstehenden XhoI-Fragment mit 0,86 kb ligiert. Das ligierte Fragment, wurde zum Transformieren von E. coli DH1 verwendet. P'asmid pNTS101 wurde aus der sich daraus ergebenden ampicillinresistenten Transformante E. coli DH1/pNTS101 (Fig. 8) isoliert.

Bezugsbeispiel 7 (Expressionvon Polypeptid-(I)-cDNA in tierischen Zellen)

Affen-COS-7-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle- Medium (DMEM-Medium) (Flow Laboratories), das 10% fetales Kälberserum enthielt, in Monoschicht kultiviert, gefolgt vom Austausch des Mediums gegen dasselbe Medium. 4 Stunden nach dem Austausch wurden gemäß dem in der Technik bekannten Verfahren [Graham et al., Virology 52, 456 (1973)] Calciumphosphatgele hergestellt, die den Expressionsvektor pTB389, 10 µg Polypeptid- (I)-Expressionsvektor pNTK26 beziehungsweise Polypeptid-(I)- Expressionsvektor pNTL45 enthielten, und wurden unter Erhalten der Transformanten COS-7/pTB389, COS-7/pNTK26 beziehungsweise COS-7/pNTL145 Zellen zugesetzt. Diese Zellen wurden 4 Stunden in einem Kohlendioxidinkubator kultiviert und anschließend mit Glycerin behandelt [Gorman et al., Science 221, 551 (1983)], gefolgt von 3 Tagen Kultivierung. Die Kulturen wurden nach der Kultivierung unter Erhalten von Kulturüberständen zentrifugiert. PCl2-Zellen wurden in Anwesenheit der entsprechenden Überstände gemäß dem in Brain Research 133, 350 (1977), und Experimental Cell Research 145, 179 (1983), beschriebenen Verfahren kultiviert und die Anteile der Zellen, deren Neunten auf wenigstens den zweifachen Zelldurchmesser heranwuchsen, wurden berechnet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2
Unter Verwenden eines Kulturüberstandes, der durch ein dem oben beschriebenen ähnliches Verfahren erhalten wurde, wurde die Wirkung auf den Acetylcholingehalt (ACh) mittels co-kultivierter Vorhirnhaut- und -basisneuronen untersucht [M. Kakihana und M. Suno, Nerve Chemistry 27, 166 (1988)].
Vorhirnhaut und -basis wurden aus den Gehirnen 17 Tage alter fetaler Ratten herausgeschnitten und Nervenzellen wurden daraus gemäß dem Verfahren von Hatanaka et al. [Develop. Brain Res. 30, 47 (1986)] isoliert. Die Zellen wurden auf eine 48-Näpfchen- Platte, die mit 100 µg/ml Poly-L-ornithin vorbehandelt worden war, in einer Dichte von etwa 1 x 10&sup6; Zellen/cm²/Näpfchen eingesät und in 500 µl serumfreiem DME/F12/N2-Medium 24 Stunden kultiviert. Nach dem Entfernen des Mediums durch Absaugen wurden 500 µl DME/F12/10% FCS und der Probenüberstand zugesetzt. Nach 2 Tagen wurde das Medium gegen 750 µl desselben Mediums ausgetauscht und der Überstand wurde erneut zugesetzt, gefolgt von 2 Tagen Kultivierung. Der Überstand wurde hintereinander zugesetzt. 50 µl Überstand wurde während der ersten beiden Tage zugesetzt und 75 µl desselben wurden während der letzten beiden Tage unter Ergeben einer Endkonzentration von 10% zugesetzt. Als von Wako Pure Chemical Industries erworbener Maus-NGF (7S-NGF) verwendet wurde, wurde er mit 0,1% Ovalbumin/PBS verdünnt und es wurden 10 µl davon hinzugesetzt.
4 Tage nach dem Zusatz des Überstandes wurde das Medium durch Absaugen entfernt und zur Ach-Messung wurden 500 µl gekühltes PCA und 20 bis 60 pMol/20 µl Ethylhomocholin (EHC) hinzugesetzt. Nach gelindem Rühren wurden 500 µl der Lösung in ein Eppendorf- Mikroröhrchen überführt. Die nachfolgenden Arbeitsschritte wurden gemäß den vorstehend mitgeteilten Verfahren durchgeführt und die ACh-Menge wurde durch Verwendung eines Hochleistungsflüssigkeit schromatographie/elektrochemischen Detektorsystems (HPLC/ECD) gemessen. Nach der ACh-Extraktion wurden die Zellen in 500 µl 1N NaOH gelöst und die Proteinmenge wurde bestimmt (Bio-RAD-Proteintest). Dunnetts t-Test wurde für die statistische Behandlung verwendet.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3

Bezugsbeispiel 8 (Produktion von Polypeptid (I) durch Escherichia coli)

Escherichia coli BL21(DE3) [Gene 56, 125 (1987)] wurde durch den in Bezugsbeispiel 3 erhaltenen Polypeptid-(I)-Expressionsvektor pENGFT102 und den T7-Lysozym-Expressionsvektor plyss unter Erhalten der Transformante Escherichia coli BL21(DE3)/pLysS, pENGFT102 ((IFO 14903, FERM BP-2529) transformiert.
Die Transformante E. coli BL21(DE3)/plyss, pENGFT102 wurde in LB-Medium [1% Trypton (Difco), 0, 5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl], das 50 µg/ml Ampicillin, 10 µg/ml Chloramphenicol und 0,2% Glucose enthielt, unter Schütteln 16 Stunden bei 37ºC kultiviert. Die Kultur (12,5, ml) wurde in einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben überführt, der 250 ml desselben Mediums ethielt, und unter Schütteln 3 Stunden bei 30ºC kultiviert. Darauf erreichte der Klett- Wert der Kultur 170. Dieser Kultur würde Isopropyl-β-D-(-)- thiogalactopyranosid in einer Endkonzentration von 0,1 mM zugesetzt und die sich daraus ergebende Lösung wurde unter Schütteln 3 Stunden bei 30ºC kultiviert. Aus 30 µl der auf diese
Weise erhaltenen Kulturlösung gesammelte Zellen wurden in 30 µl Probenpuffer [Laemmli, Nature 227, 680 (1970)] suspendiert und 5 Minuten auf 100º0 erhitzt, gefolgt von der Elektrophorese an 16% Polyacrylamidgelen&sub1; die 0,1% SDS enthielten. Die Proteine auf den Gelen wurden gemäß dem Verfahren von Burnette [Analytiaal Biochemistry 112, 195 (1981)] auf eine Nitrocellulosemembran überführt und anschließend wurde ein Western-Blotting unter Verwenden des Kaninchen-anti-Maüs-NGF-Antikörpers (Collaborative Research Inc., USA) und des affinitätsgereinigten HRP-verknüpften Ziege-anti-Kaninchen-IGG (Bio RAD, USA) durchgeführt. Als Ergebnis wurde das Polypeptid (I) mit einem Molekulargewicht von 15 Kilodalton (kDa) nachgewiesen.
Als Gele, die in einer zu der oben beschriebenen ähnlichen Weise erhalten und der Elektrophorese unterzogen wurden, mit Coomassie-Brilliantblau angefärbt wurden, wurde ein Polypeptid (I) entsprechendes Protein mit 15 kDa nachgewiesen und die Menge des Proteins mit 15 kDa wurde zu etwa 10% der gesamten Proteine abgeschätzt.

Bezugsbeispiel 9 (Isolierung von Polypeptid (I))

Die in Bezugsbeispiel 8 erhaltene Kultur (3,75 Liter) der Transformanten E. coli BL21(DE3)/pLysS, pENGFT102 wurde unter Ergeben von 17 g (feucht) Zellen zentrifugiert. Die Zellen wurden in 375 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) suspendiert, eingefroren und wieder aufgetaut, gefolgt von der dreimaligen Behandlung mit einem Schalloszillator (Kaijo Denki, 2A, 2 Minuten). Die Suspension äufgebrochener Zellen wurde zentrifugiert und der sich daraus ergebende Niederschlag wurde in 60 ml 5 M Guanidinhydrochlorid 5 mM EDTA - 1 mM PMSF - 0,1 mM APMSF - 20 mM Dithiothreit (DTT) - 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) gelöst. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde auf eine Sephacryl-S-200-Säule aufgebracht, die mit 2 M Guanidinhydrochlorid - 5 mM EDTA - 0,1 mM APMSF - 5 mM DTT - 25 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) äquilibriert worden war, und die Fraktionen, bei denen das Polypeptid (I) durch das Western-Blotting-Verfahren (zuvor beschrieben) nachgewiesen wurde, wurden gesammelt (Volumen = 300 ml). Diese Lösung wurde durch die Verwendung eines mit einer YM5-Membran ausgerüsteten Ultrafilters (Amicon) eingeengt und 50 ml der sich daraus ergebenden konzentrierten Lösung wurden auf die oben beschriebene Sephacryl-200-Säule aufgebracht. Auf diese Weise wurden 164 ml einer 328 mg gereinigtes Polypeptid (I) enthaltenden Lösung erhalten. Die Reinheit wurde durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese untersucht. Als Ergebnis wurde bestatigt, daß das sich daraus ergebende gereinigte Polypeptid (I) im wesentlichen homogen war.
Eine Ultrapore-RPSC-Säule (0,46 )( 715 cm, Altex) wurde mit einer das vorstehende gereinigte Polypeptid (I) enthaltenden Lösung beladen und mit einem Trifluoressigsäure-Acetonitril-Elutionslösungsmittelsystem unter Erhalten des homogenen Polypeptids (I) chromatographiert. Die N-terminale Aminosäuresequenz des sich daraus ergebenden Polypeptids (I) wurde mit einem Gasphasen- Proteinsequenzierer (Modell 470A, Applied Biosystems) bestimmt. Demzufolge stimmte die N-terminale Aminosäuresequenz des gereinigten Polypeptids (I) mit der N-terminalen Aminosäuresequenz von Polypeptid (I), die aus der Nukleotidsequenz der cDNA abgeleitet wurde, überein, außer daß dem N-Terminus ein Methioninrest hinzugefügt worden war (Tabelle 4). Tabelle 4 N-Terminale Aminosäuresequenz
Die Aminosäurezusammensetzung der oben erhaltenen gereinigten Probe wurde durch das Ninhydrinyerfahren bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die beobachteten Werte im wesentlichen mit den theoretischen Werten übereinstimmen, die aus dem Polypeptid (I) berechnet wurden, dessen N-Terminus ein Methioninrest hinzugefügt worden war (Tabelle 5). Tabelle 5 Aminosäurezusammensetzung
1) berechnet unter der Annahme von Glu als 11
2) berechnet mit einem dem N-Terminus, von Polypeptid (I) hinzugefügten Methioninrest
Eine das vorstehende gereinigte Polypeptid (I) enthaltende Lösung (Proteinkonzentration: 2 mg/ml) wurde mit 2 M Guanidinhydrochlorid - 5 mM EDTA - 0,1 mM APMSF - 5 mM DTT - 25 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) so verdünnt, daß sich eine Proteinkonzentration von 10 ijg/ml ergab. Die verdünnte Lösung wurde gegen die Sofache Menge 1 mM EDTA - 50 mM NaHCO&sub2; - Na&sub2;CO&sub3; (pH 10,0) 16 Stunden bei 4ºC dialysiert und gegen denselben, frisch zugeführten Puffer 4 Stunden erneut dialysiert. Die Wirkung der sich daraus ergebenden dialysierten Flüssigkeit auf PCl2-Zellen wurde gemäß dem in Brain Research 133, 350 (1979), und Experimental cell Research 1L5, 179 (1983), beschriebenen Verfahren untersucht. Als Ergebnis wurde beobachtet, daß 6% der PCl2-Zellen durch den Zusatz der inneren dialysierten Lösung Neunten aufwiesen und 2% davon Neunten mit einer Länge von wenigstens dem zweifachen Durchmesser des Zellkörpers besaßen. Andererseits wiesen bei 1 mM EDTA - 50 mM NAHCQ - Na&sub2;CO&sub3; (pH 10,0) als Kontrolle nicht mehr als 0,5%. der Zellen Neunten auf.

Beispiel 1 (Immunisierung)

BALB/c-Mäusen (weiblich, 8 Wochen alt) wurden 10 µg des antigenen Polypeptids (I) (in Bezugsbeispiel 9 erhalten), das in 0,4 ml Freundschem komplettem Adjuvans (Difco) gelöst war, intradermal injiziert. Drei Wochen später wurden den Mäusen erneut 10 µg in 0,4 ml Freundschem komplettem Adjuvans gelöstes antigenes Polypeptid (I) verabfolgt. 3 Wochen später wurde eine weitere ähnliche Immunisierung durchgeführt. Zwei Wochen nach der weiteren Immunisierung wurden die Mäuse 10 µg in physiologischer Kochsalzlösung gelöstem Polypeptid (I) intravenös beimpft.

Beispiel 2

(I) Zellfusion

Drei Tage nach der letzten Beimpfung wurden die Milzen aus den in Beispiel 1 immunisierten Mäusen unter Erhalten von Zellen entnommen, die zur Zellfusion verwendet wurden. Diese Zellen wurden in einem Medium suspendiert, das durch Mischen von Iscove-Medium mit Ham-F-12-Medium im Verhältnis 1:1 hergestellt wurde. Dieses gemischte Medium wird hierin als IH-Medium bezeichnet.
Die Maus-Myelomzellen P3-X63-Ag 8UI wurden in 10% fetales Kälberserum enthaltendem RPMI-1640-Medium in einer Atmosphäre aus 5% Kohlendioxid und 95% Luft subkultiviert.
Die Zellfusion wurde gemäß dem von Kohler und Milstein [G. Kohler und C. Milstein, Nature 256, 495 (1975)] begründeten Verfahren durchgeführt. Die vorstehenden Myelomzellen (2,9 x 10&sup7; Zellen) wurden mit den durch das vorstehende Verfahren erhaltenen immunisierten Lymphozyten (5 x 10&sup8; Zellen) gemischt und das Gemisch wurde zentrifugiert. Anschließend wurden 0,3 ml 45% Polyethylenglykol 6000 (hierin nachstehend als PEG 6000 bezeichnet), das in IH-Medium gelöstes war, tropfenweise hinzugesetzt-. Die PEG-6000-Lösung wurde auf 37ºC vorerhitzt und langsam zugesetzt. Nach 5 Minuten wurde das auf 37ºC vorerhitzte IH-Medium mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min zugesetzt, bis das Gesamtvolumen 10 ml betrug. Die Lösung wurde anschließend unter Entfernen eines Überstandes 15 Minuten bei Raumtemperatur und 600 Upm zentrifugiert. Der sich daraus ergebende Zellniederschlag wurde in 200 ml 20% Kälberserum enthaltendem IH-Medium suspendiert. Die Suspension wurde in einer Menge von 200 µl/Näpfchen in eine 96-Näpfchen-Mikrotiterplatte (Nunc) eingesät. Einen Tag später wurde der Mikrotiterplatte mit HAT (1 x 10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin, 4 x 10&supmin;&sup7; M Aminopterin, 1,6 x 10&supmin;&sup5; M Thymidin) ergänztes IH-Medium (das 20% Kälberserum enthielt) in einer Menge von 100 µl/Näpfchen zugesetzt. Das mit HAT ergänzte IH-Medium wird hierin nachstehend als HAT-Medium bezeichnet. Alle weiteren drei Tage wurde die Hälfte der Menge des Mediums gegen HAT- Medium ausgetauscht. Die auf diese Weise wachsenden Zellen waren Hybridzellen.

(2) Durchmustern auf Ant,i,körper produzierende Zellen

Zuerst wurde einer 96-Napfchen-Polystyrolmikrotiterplatte, an die Polypeptid (I) fixiert worden war, ein Hybridzellen-Kulturüberstand in einer Menge von 100 µl/Näpfchen zugesetzt und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Nach Entfernung des sich daraus ergebenden Überstandes und Waschen wurde- mit Meerrettichperoxidase (HRP) markierter Anti-Maus-IgG-Ziege-Antikörper (Kappel) als zweiter Antikörper hinzugesetzt und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Nachdem der zweite Antikörper entfernt worden war und die Zellen gründlich gewaschen worden waren, wurde durch Zusetzen eines Reaktionssubstrates eine Farbreaktion ausgeführt (EIA- Verfahren). Durch dieses Verfahren wurde in 4 Näpfchen ein hoher Antikörpergehalt beobachtet.

(3) Klonieren von Hybridzellen

Die Zellen in diesen Näpfchen wurden auf einer 96-Näpfchen- Mikrotiterplatte, auf der zuerst 10&sup4; Zellen/Näpfchen Mausthymozyten als Wachstumszellen ausgestrichen worden waren, zu 0,5 Zellen je Näpfchen ausgestrichen und es wurde ein Klonen durchgeführt. Als Ergebnis wurden 4 Klone, MoAb4-2-Zellen (IFO 50241, FERM BP-2908), MoAb46-31-Zellen (IFO 50242, FERM BP-2909), MoAb82-4-Zellen (IFO 50243, FERM BP-2910) und MoAb148-62-Zellen (IFO 50244, FERM BP-2911), erhalten.
Tabelle 6 zeigt die Meßergebnisse des Antikörpergehalts in den Überständen dieser Zellen. Tabelle 6 Kulturüberstand
In Tabelle 6 zeigen die Werte die Absorption bei einer Wellenlänge von 492 nm.
Die klonierten Zellen wurden in flüssigem Stickstoff aufbewahrt, wobei 20% Kälberserum enthaltendem IH-Medium Dimethylsulfoxid auf eine Konzentration von 10% zugesetzt wurde.

Beispiel 3 (Immunglobulinklasse der monoklonalen Antikörper)

Die in Beispiel 2 erhaltenen Maus-Antikörper wurden mit verschiedenen Immunglobulinproben durch einen Nachweiskit für Unterklassen (Bio RAD) umgesetzt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7
In Tabelle 7 zeigt "+" an, daß die Reaktion positiv ist und zeigt "-" an, daß die Reaktion negativ ist.
Tabelle 7 zeigt, daß die durch MoAb4-2 und MoAb46-31 produzierten Antikörper Immunglobulin IgG2b angehören und daß die durch MoAb82-4 und MoAb148-62 produzierten Antikörper Immunglobulin IgGl angehören.

Beispiel 4 (Herstellung monoklonaler Antikörper enthaltenden Aszites)

Für jedes Hybridom MoAb4-2, MoAb46-31, MoAbB2-4 und MoAb148-62 wurden 2 x 10&sup6; Zellen in Mäuse injiziert, denen zuerst 0,5 ml Mineralöl intraperitoneal verabreicht worden war. Nach 10 Tagen wurden 2 bis 4 ml Aszites je Maus gesammelt. Aus den entsprechenden Hybridomen wurden die Monoklonalen Antikörper MoAb4-2, MoAb46-31, MoAbB2-4 und MoAb148-62 erhalten.

Beispiel 5 (Reinigung der Antikörper aus Aszites)

Gemäß dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren wurde jeder monoklonale Antikörper MoAb4-2, MoAb46-31, MoAbB2-4 und MoAb148- 62 unter Erhalten von 20 bis 30 ml Aszites in 5 Mäuse injiziert. Der Aszites wurde unter Entfernen von Zellen 10 Minuten in einer Zentrifuge (Hitachi, Japan) bei 2000 Upm zentrifugiert und anschließend unter Entfernen unlöslicher Proteine und Fette 2 Stunden bei 4ºC und 22000 Upm in einer Spinco-SW28-Zentrifuge (Beckman, USA) zentrifugiert. Dem Überstand wurde Ammoniumsulfat bis zur Sättigungskonzentration von 40% zugesetzt, gefolgt von 1 Stunde gelindem Rühren in Eis. Der Niederschlag wurde mit einer Serval-SS34-Zentrifuge (Du Pont, USA) 30 Minuten bei 4ºC und 15000 Upm zentrifugiert. Nach der Isolierung wurde der Niederschlag in 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,8) gelöst und mittels einer Hydroxyapatitsäule (HCA-Säule) gereinigt. In diesem Fall wurde 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,8) als Startpuffer verwendet und 500 mM Natriumphosphatpuffer wurde als Elutionspuffer verwendet. Die Elution wurde durch einen linearen Gradienten vom Startpuffer zum Elutionspuffer ausgeführt. Die eluierten Antikörper wurden bei 4ºC aufbewahrt,.

Beispiel 6 (Herstellung HRP-markierter Antikörper)

(1) Der in Beispiel 5 erhaltene monoklonale Antikörper MoAb4-2 wurde auf 2 mg/ml oder mehr eingeengt und anschließend gegen 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert Eine N,N'-Dimethylformamidlösung (DMF) von S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid (Aldrich, USA) wurde in einer Menge von 50 µl bis 0,7 ml 4,9 mg/ml monklonalem Antikörper MoAb4-2 unter Ergeben einer Konzentration von 11,5 mg/ml zugesetzt. Die Luft im Reaktionsgefäß wurde durch Stickstoffgas ersetzt. Das Gefäß wurde verschlossen, gefolgt von 1 Stunde Rühren bei Raumtemperatur unter Einführen einer SH-Gruppe oder von SH-Gruppen in den monoklonalen Antikörper. Unumgesetztes S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid wurde durch 10 Minuten Behandlung mit 130 µl 0,2 M Tris-HCl (pH 7,0), 13 µl 0,2 M EDTA und 130 µl 2 M Hydroxylamin (pH 7,0) bei Raumtemperatur inaktiviert. Der monoklonale Antikörper MoAb4-2 wurde der Gelfiltration mittels einer Sephadex -G25-Säule (1 cm Durchmesser x 80 cm, Pharmacia, Schweden) (Fließgeschwindigkeit: 20 ml/Stunde) unterzogen.
(2) In 1,4 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8) wurden 10 mg Meerrettichperoxidase (HRP, Qualität I, Boehringer-Mannheim, Westdeutschland) gelöst. Gleichzeitig wurden 14 mg N-(4-Carboxycyclohexylmethyl)maleimid-N-hydroxysuccinimidester in 335 µl DMF gelöst und 100 µl der sich daraus ergebenden Lösung wurden der HRP-Lösung zugesetzt. Die Luft in dem Reaktionsgefäß wurde durch Stickstoffgas ersetzt. Das Gefäß wurde verschlossen, gefolgt von 1 Stunde Rühren bei Raumtemperatur. Anschließend wurden die Fraktionen mit HRP, in die Maleimidgruppen eingeführt wurden, durch Gelfiltration mittels der (zuvor beschriebenen) Sephadex - G25-Säule abgetrennt.
(3) 6 ml der in (1) erhaltenen Fraktionen mit dem Antikörper MoAb4-2, in den SH-Gruppen eingeführt wurden, und 2 ml der in (2) erhaltenen Fraktionen mit HRP, in die Maleimidgruppen eingeführt wurden, wurden miteinander vermischt. Das Gemisch wurde unter vermindertem Druck mittels eines Kollodiumbeutels (Sartorius, Westdeutschland) auf 1 ml eingeengt, gefolgt von 20 Stunden Reaktion bei 4c0. Nach der Reaktion wurde derantikörper, in den HRP eingeführt wurde, zur Fraktionierung auf eine Ultrogel- ACA44-Säule (1 cm Durchmesser x 80 cm, LKB, Schweden) aufgebracht (Fließgeschwindigkeit: 10 ml/Stunde). Von den eluierten Peakfraktionen zeigten die Fraktionen mit der höchsten HRP-Zahl je Antikörpermolekül 2,4 HRP/Antikörper.

Beispiel 7 (Polypeptid-(I)-Bestimmung durch EIA mittels eines monoklonalen Antikörpers)

Der in Beispiel 5 erhaltene monoklonale Antikörper MoAbB2-4 wurde mit Carbonatpuffer (pH 9,6) auf 1,0 µg/ml verdünnt und der vorstehende verdünnte Antikörper wurd ein einer Menge von 100 µl/Näpfchen auf eine Immunoplatte (Nunc, Dänemark) gegossen, gefolgt vom Stehen über Nacht bei 4ºC unter Adsorbieren des monoklonalen Antikörpers auf der Platte. Nach dem Entfernen des unumgesetzten Antikörpers wurde die Platte 3 mal mit PBS gewaschen und 0,01% Merthiolat und 5% Rinderserumalbumin (BSA) enthaltende PBS wurde in einer Menge von 300 µl/Näpfchen hinzugesetzt, gefolgt vom Stehen bei 4ºC über Nacht.
Das in Bezugsbeispiel 9 erhaltene Polypeptid (I) wurde mit 1% BSA enthaltender PBS verdünnt. Die BSA-Lösung wurde von der vorstehend erhaltenen Platte entfernt und gleichzeitig wurde die Platte 5 mal mit PBS gewaschen. Anschließend wurde das vorstehende verdünnte Polypeptid (I) in einer Menge von 100 µl/Näpfchen hinzugesetzt, um das Polypeptid (I) über Nacht bei 4ºC an der Platte zu adsorbieren. Nach dem Entfernen von unumgesetztem Polypeptid (I) wurde die Platte 5 mal mit PBS gewaschen. Der in Beispiel 6 erhaltene, mit HRP verknüpfte Antikörper (HRP-MoAb4- 2) wurde mit 1% BSA 1:1000 verdünnt und die verdünnte Antikörperlösung wurde der Platte in einer Menge von 100 µl/Näpfchen zugesetzt, gefolgt von 2 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur. Nach dem Entfernen der Antikörperlösung wurde die Platte 10 mal mit PBS gewaschen und für einen Vergleichstest wurde ein Peroxidasesubstrat (Sigma) unter Entwickeln einer Färbung in einer Menge von 100 µl/Näpfchen hinzugesetzt.
Fig. 9 zeigt eine Nachweiskurve von Polypeptid (I). In dieser graphischen Darstellung wird die Konzentration von Polypeptid (I) als Abszisse und die Absorption der mit HRP-MoAb4-2 entwikkelten Färbung wird als Ordinate aufgetragen. Diese graphische Darstellung zeigt, daß das Polypeptid (I) mit einer Konzentration von 0,5 ng/ml nachgewiesen werden kann.

Beispiel 8 (Bestimmung der Antigenerkennungsstellen)

Die Antigenerkennungsstellen der 4 in Beispiel 4 gereinigten Antikörper wurden durch Versuche zur konkurrierenden Bindung untersucht. Als konkurrierende Peptide wurden die synthetischen Peptide pep1:
Tyr-Ala-Glu-His-Lys-Ser-His-Arg-Gly-Glu-Tyr-ser-Val-Cys und
pep2: Cys-Ala-Leu-Ser-Arg-Lys-ILe-Gly-Arg verwendet.
Die synthetischen Peptide wurden mit einer 5% BSA enthaltenden PBS-Lösung auf eine Konzentration von 100 µg/ml oder 0,39 µg/ml verdünnt. Die in Beispiel 4 erhaltenen gereinigten monoklonalen Antikörper MoAb4-2 und MoAb46-31 wurden auf 0,05 µg/ml verdünnt, MoAbB2-4 wurde auf 12,5 µg/ml verdünnt und MoAb148-62 wurde auf 0,78 µg/ml verdünnt, so daß die Antikörpermenge bei einer Absorption von 493 nm 0,7 bis 1,0 zeigte. Als Verdünnungsmittel wurde die 5% BSA enthaltende PBS-Lösung verwendet. Das verdünnte konkurrierende Peptid wurde der verdünnten Antikörperlösung zugesetzt. Nach dem Rühren wurde das Gemisch 30 Minuten bei 37ºC gehalten.
Die Menge des nicht gebundenen Antikörpers in dieser Lösung wurde durch den in Beispiel 7 dargestellten HIA bestimmt.
Die Ergebnisse, die erhalten wurden, als synthetische Peptide verwendet wurden, werden in Fig. 10 bis 13 dargestellt. Fig. 10 bis 13 zeigen die Ergebnisse für die monoklonalen Antikörper MoAb4-2, MoAb46-31, MoAbB2-4 beziehungsweise MoAb148-62. Unter Bezug auf diese Figuren wurde bei offenen Kreisen (-o-) pep1 verwendet und bei geschlossenen Kreisen (- -) pep2 verwendet. In diesen Figuren wird die Absorption (bei, der Wellenlänge 493 nm) eines Farbkupplers als Ordinate aufgetragen.
Fig. 10 und 11 zeigen, daß die monoklonalen Antikörper MoAb4-2 und MoAb46-31 die Region der 1. bis 14. N-terminalen Aminosäure von Polypeptid (I) erkennen.
Fig. 12 und 13 zeigen, daß die monoklonalen-Antikörper MoAbB2-4 und MoAb148-62 nicht an einer Hemmung durch diese synthetischen Peptide leiden. Dies zeigt, daß die monoklonalen Antikörper MoAbB2-4 und MoAb148-62 andere Aminosäüren erkannten, als die Region der 1. bis 14. N-terminalen und die Region der 1. bis 9. C-terminalen Aminosäure.
Aus dem Vorstehenden werden die Erkennungsstellen der 4 monoklonalen Antikörper wie in Tabelle 8 dargestellt zusammengefaßt. Tabelle 8
In Tabelle 8 zeigt "+" daß eine konkurrierende Hemmung auftrat, und "-" zeigt, daß keine konkurrierende Hemmung auftrat.

Beispiel 9 (Nachweis von Human-Polypeptid (I) durch Western- Blotting)

Das gemäß dem in Bezugsbeispiel 9 beschriebenen Verfahren erhaltene Polypeptid (I) wurde der Elektrophorese an 15% Acrylamidgel [U. K. Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)] unterzogen und anschließendd mittels Sartblot (Sartonus) auf eine Nitrocellulosemembran überführt [J. Kyshse-Anderson, Jöurnal of Biochemical and Biophysical Methods 10, 203-209 (1984)]. Diese Membran wurde zweimal jeweils 5 Minuten mit TBS [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 M NaCl] gewaschen und anschließend 1 Stunde bei Raumtemperatur in 5% BSA enthaltender TBS unter Blockieren unumgesetzter Anteile auf der Membran stehengelassen. Die Membran wurde anschliessend 3 mal jeweils 5 Minuten mit TBS gewaschen, die 0,05% Tween 20 (TTBS) enthielt. Der in Beispiel 4 erhaltene monoklonale Antikörper MoAb4-2, MoAb46-31, MoAb82-4 oder MoAb148-62 wurde mit 5% BSA enthaltender TTBS verdünnt, worin die vorstehende Nitrocellulosemembran eingetaucht wurde. Anschließend wurde die Reaktion 1 Stunde bei Raumtemper?tur ausgeführt. Die Reaktionslösung wurde entfernt und die Membran wurde 3 mal jeweils 5 Minuten mit TTBS gewaschen. Anschließend wurde ein zweiter Antikörper, mit alkalischer Phosphatase markiertes Anti-Maus- IgG-Ziegenserum (Bio RAD, USA), das mit 5% BSA enthaltender TTBS 2000fach verdünnt war, hinzugesetzt, gefolgt von 1 Stunde Reaktion bei Raumtemperatur. Die Membran wurde 3 mal jeweils 5 Minuten mit TTBS 3 und weiter 2 mal jeweils 5 Minuten mit TBS gewaschen. Anschließend wurde die Membran bei Raumtemperatur 15 Minuten mit in AP-Puffer [100 mM Tris-HCl (pH 9,5), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl&sub2;] gelösten 66 µl NBT (Nitrotetrazoliumblau, 50 mg/ml in 70% Dimethylformamid) und 33 µl BCIP (5-Brom-4-chlor-3- indolylphosphat, 50 mg/ml in Dimethylformamid) (Promega, USA) als farbbildende Mittel umgesetzt. Fig. 15 zeigt die Ergebnisse des Western-Blotting, wenn der monoklonale Antikörper MoAb4-2 als erster Antikörper verwendet wurde. 500 ng Polypeptid (I) wurden der Elektrophorese unterzogen und auf Bahn 1, 250 ng Polypeptid (I) auf Bahn 2, 125 ng Polypeptid (I) auf Bahn 3 und 62,5 ng Polypeptid (I) auf Bahn 4 überführt. "MI" stellt einen Marker dar und die Zahlen auf der linken Seite stellen sein Molekulargewicht dar.
Wenn anstelle des vorstehenden MoAb4-2 MoAb46-31, MoAbB2-4 und MoAb148-62 verwendet wurden, wurde Polypeptid (I) ebenfalls nachgewiesen.

Beispiel 10 (Herstellung des Anti-N-terminales-Peptid-Antikörpers)

(I) Synthese des N-terminalen Peptids

Synthese von H-Tyr-Ala-Glu-His-Lys-Ser-His-Arg-Gly-Glu-Tyr-Ser- Val-Cys-OH

Dieses Peptid wurde durch ein Festphasen-Syntheseverfahren mittels eines automatischen Peptidsyntlietisierers (Modell 430A, Applied Biosystems, USA) synthetisiert. "Standard-1" wurde als Programm verwendet. Der grundlegende Syntheseweg lehnte sich an das bei R. B. Merrifield, Adv. Enzymol. 32, 221-296 (1969), beschriebene Verfahren an. Boc-Cys(MeBzl) PAM-P (0,5 mMol/g) wurde als Harz verwendet und die Synthese wurde nacheinander vom Carboxylterminus aus ausgeführt. Die folgenden Boc-Aminosäuren wurden verwendet: Boc-Val, Boc-Ser(Bzl), Boc-Tyr(Br-Z), Boc- Glu(OBzl), Boc-Gly, Boc-Arg(Tos), Boc-His(Tos), Boc-Lys(Cl-Z) und Boc-Ala. Nachdem das Peptid bis zum Aminoterminus Tyr synthetisiert worden war, wurde das Peptidharz aus dem Synthetisierer herausgenommen und getrocknet.
1 g Peptidharz wurden 1,5 ml p-Kresol und 0,5 ml 1,2-Ethandithiol zugesetzt und etwa 8 ml flüssiger Fluorwasserstoff wurden weiter hinzugesetzt, gefolgt von 2 Stunden Reaktion bei 0ºC. Nach Abschluß der Reaktion wurde der Fluorwasserstoff in einem Exsikkator unter vermindertem Druck entfernt. Das Peptidharz wurde mit 0,1% Mercaptoethanol enthaltendem Diethylether und nachfolgend mit Diethylether unter Entfernen fast aller enthaltener Reagenzien gewaschen. Das Peptid wurde mit 10 ml 3% Essigsäure extrahiert und das in dem Extrakt enthaltene Harz wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde durch Gelfiltration mittels einer Sephadex -G-25-Säule (2,8 x 60 cm) gereinigt (Nachweiswellenlänge: 280 nm, Lösungsmittel: 3% Essigsäure, Fließgeschwindigkeit: 40 ml/Stunde)
Die das Peptid enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert. Die sich daraus ergebende pulverige Probe wurde durch Urnkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter den folgenden Bedingungen weiter gereinigt:
Säule YMC-Pack, A-324 ODS 10 x 2.50 mm
Säulentemperatur: 25ºC
Elutionsmittel A: 0,1% Trifluoressigsäure - 99,9% destilliertes Wasser
Elutionsmittel B: 0,1% Trifluoressigsäure - 99,9% Acetonitril
Elutionsprogramm: 0 Minuten (90% A + 10% B)
30 Minuten (60% A + 40% B)
Fließgeschwindigkeit 2 ml/Minute
Nachweiswellenlänge: 230 nm
Die unter diesen Bedingungen bei einer Retentionszeit von 23,0
Minuten eluierten Hauptpeakfraktionen wurden gesammelt und durch eine Bio-RAD-AG1X8-Säule (ACOH-Typ, 1,8 x 5 cm) geführt. Die Waschflüssigkeiten wurden ebenfalls gesammelt und das Acetonitril wurde durch Destillation entfernt, gefolgt von der Lyophilisierung. Auf diese Weise wurden 56 mg eines weißen Pulvers erhalten. Das auf diese Weise erhaltene gewünschte Peptid zeigte unter denselben Bedingungen wie bei der vorstehenden Hochleistungsflüssigkeitschromatographie einen einzelnen Peak bei 23,0 Minuten.
Bestimmung der freien SH-Gruppen durch das Verfahren von Elman [G. L. Elman, Arch. Biochem. Biophys. 82, 70-77 (1959)]: 114%.
Aminosäurenanal.: Ser 1.65(2); Glu 2.13(2);
Gly 1.00(1); Ala 1.04(1);
1/2Cys 0.82(1); Val 1.03(1);
Tyr 1.97(2); Lys 0.95(1);
His 1.72(2); Arg 1.00(1)
Ausbeute: 74%
½Cys wurde durch das Perameisensäureoxidationsverfahren bestimmt. Die Werte in Klammern zeigen die theoretischen Werte.

(2) Herstellung eines Koniugats des N-terminalen Peptids mit Hämocyanin

Das in (I) erhaltene N-terminale Peptid (5 mg) und Hämocyanin (10 mg) wurden in 4 ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,3) gelöst und 400 µl in Eiswasser gekühlter 2,5%iger Glutaraldehyd wurde tropfenweise unter Rühren zugesetzt. Nach 3 Stunden Rühren unter Eiskühlen wurde eine Dialyse gegen destilliertes Wasser unter Erhalten eines Konjugats des N-terminalen Peptids mit Hämocyanin durchgeführt.

(3) Herstellung eines Konhugats des N-terminalen Peptids mit Rinderserumalbumin

Rinderserumalbumin (BSA) (132 mg) wurde in 3 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) gelöst (Lösung A).
Gleichzeitig wurden 11,2 mg N-(y-Maleimidobutyloxy)succinimid (GMBS) in 200 µl Dimethylformamid gelöst (Lösung B). Lösung B wurde Lösung A unter Rühren mit einem Rührer tropfenweise zugesetzt und das Lösungsgemisch wurde 30 Minuten der Reaktion bei 30ºC unterzogen. Anschließend wurde das Reaktionsprodukt durch eine Sephadex -G-25-Säule (1,5 x 20 cm) mittels 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5) - 0,1 M NaCl als Elutionsmittel unter Erhalten von Rinderserumalbumin gereinigt, in das Maleimidgruppen eingeführt wurden.
Das in (1) erhaltene Peptid (5 mg) wurde in 0,1 M Phosphatpuffer - 5 mM EDTA gelöst und das Rinderserumalbumin (20 mg), in das Maleimidgruppen eingeführt wurden, wurde hinzugesetzt (Gesamtvolumen 5 ml oder weniger), gefolgt von 60 Minuten Reaktion bei 30ºC. PBS wurde unter Erhalten eines Konjugats des N-terminalen Peptids mit dem Rinderserumalbumin auf ein Gesamtvolumen von 12 ml hinzugesetzt.

(4) Herstellung des Anti-Polvoedtid- (I) -N-terminales-Peptid- Antikörpers

Das in (2) erhaltene Konjugat des N-terminalen Peptids mit Hämocyanin wurde gründlich mit Freund'schem komplettem Adjuvans gemischt und das sich daraus ergebende Gemisch wurde subkutan in Kaninchen injiziert. Danach wurde das in (3) erhaltene Konjugat des N-terminalen Peptids mit dem Rinderserumalbumin mit Freund'- schem inkomplettem Adjuvans gemischt und das sich daraus ergebende Gemisch wurde in Abständen von zwei Wochen in dieselben Kaninchen injiziert. Das aus den Kaninchen, die durch das vorstehend beschriebene Verfahren immuisiert wurden, gesammelte Blut wurde unter Erhalten eines Anti-Polypeptid-(I)-N-terminales-Peptid-Antikörpers zentrifugiert.

Beispiel 11 (Herstellung des Anti-C-terminales-Peptid-Antikörpers)

(1) Synthese des C-terminalen Peptids

Synthese von H-Cys-Ala-Leu-Ser-Arg-Lys-Ile-Gly-Arg-OH

Das C-terminale Peptid wurde in einer der in Beispiel 10 ähnlichen Weise synthetisiert.
Boc-Arg(Tos) PAM-P (0,5 mmol/g) wurde als Harz verwendet und die Synthese wurde nacheinander vom carboxylterminus ausgeführt. Als Boc-Aminosäuren wurden Boc-Gly, Boc-Ile, Boc-Lys(Cl-Z), Boc- Arg(Tos), Boc-Ser(Bzl), Boc-Leu, Boc-Ala und Boc-Cys(Mebzl) verwendet. Das sich daraus ergebende Peptidharz wurde mit Fluorwasserstoff behandelt und wie in Beispiel 10 unter Erhalten von 200 mg weißem Pulver, dem gewünschten Produkt, gereinigt. Dieses Peptid wurde unter den in Beispiel 10 beschriebenen Bedingungen der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie bei 12,6 Minuten als einzelner scharfer Peak eluiert.
Bestimmung der freien SH-Gruppen durch das Verfahren von Elman [G. L. Elman, Arch. Biochem. Biophys. 82, 70-77 (1959)]: 106%.
Aminosäurenanal.: Ser 0.86(I); Gly 0.96(1);
Ala 1.00(1); Ile 1.00(1);
Leu 1.01(1); Lys 1.05(1);
Arg 2.06(2)
Ausbeute: 68%

(2) Herstellung eines Konjugats des C-terminalen Peptids mit Hämocyanin

Unter Verwenden des in (I) erhaltenen C-terminalen Peptids wurde in einer zu der in Beispiel 10 (2) ähnlichen Weise ein Konjugat des C-terminalen Peptids; mit Hämocyanin erhalten.

(3) Herstellung eines Konjugats des C-terminalen Peptids mit Rinderserumalbumin

Unter Verwenden des in (I) erhaltenen C-terminalen Peptids wurde in einer der in Beispiel 10 (3) ähnlichen Weise ein Konjugat des C-terminalen Peptids mit Rinderserum erhalten.

(4) Herstellung des Anti-Polypeptid-(I)-C-terminales-Peptid- Antikörpers

Das in (2) erhaltene Konjugat des C-terminalen Peptids mit Hämocyanin wurde gründlich mit Freund'schem komplettem Adjuvans gemischt und das sich daraus ergebende Gemisch wurde den Kaninchen subkutan injiziert. Danach wurde das in (3) erhaltene Konjugat des C-terminalen Peptids mit dem Rinderserumalbumin mit Freund'schem inkomplettem Adjuvans gemischt und das sich daraus ergebende Gemisch wurde denselben Kaninchen in Abständen von zwei Wochen injiziert. Das aus den Kaninchen, die durch dieses Verfahren immunisiert wurden, gesammelte Blut wurde unter Erhalten eines Anti-Polypeptid-(I)-C-terminales-Peptid-Antikörpers zentrifugiert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Polypeptid (I) leicht und genau durch die Antikörper gegen das Polypeptid (I) oder seine partiellen Peptide isoliert und gereinigt werden. Die Antikörper können bei der Aufklärung des Funktionsmechanismus von Polypeptid (I) behilflich sein und bereiten den Weg für ihre Anwendung als Arzneimittel. Ihre industriellen Aussichten sind deshalb hoch. Weiter können die Antikörper in dieser Erfindung durch Verwenden der partiellen Peptide von Polypeptid (I) als Teil des Antigens erhalten werden. In diesem Fall können die Ausgangsmaterialien durch einfache Verfahren wie etwa die chemische Synthese erhalten werden, da ein Teil chemisch synthetisiert werden kann. Die Antikörper gegen das Polypeptid (I) oder seine partiellen Peptide können einfacher als das reife Protein des Polypeptids (I) hergestellt werden, dessen Isolierung und Reinigung ziemlich kompliziert sind. Es können somit einfache Verfahren zum Nachweisen und Bestimmen von Polypeptid (I) bereitgestellt werden.

Claims

1. Antikörper gegen ein partielles Peptid eines Polypepptids (I), das die Aminosäuresequenz enthält, die durch die Formel [1] dargestellt wird:

wobei das partielle Peptid des Polypeptids (I) 12 bis 14 aufeinanderfolgende Aminosäuren einer Sequenz, die durch die Formel [2] dargestellt wird:

Tyr Ala Alu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys, oder 8 bis 9 aufeinanderfolgende Aminosäuren einer Sequenz enthält, die durch die Formel [3] dargestellt wird:

Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg.

2. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gemäß Anspruch 1, bei dem es sich um einen polyklonalen Antikörper handelt, umfassend das Immunisieren eines Säugers mit einem partiellen Peptid des Polypeptids (I), wie es in Anspruch 1 definiert ist, oder mit einem Konjugat dieses partiellen Peptids mit einem Trägerprotein unter Bildung des polyklonalen Antikörpers und dann das Gewinnen des polyklonalen Antikörpers.

3. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gemäß Anspruch 1, bei dem es sich um einen monoklonalen Antikörper handelt, umfassend das Vermehren eines klonierten Hybridoms, das aus einer Milzzelle eines Säugers und einer Lymphoidzelle des Säugers besteht, in einem flüssigen Kulturmedium oder in der Bauchhöhle des Säugers, so daß der monoklonale Antikörper gebildet und angereichert wird, wobei die Milzzelle des Säugers mit einem partiellen Peptid des Polypeptids (I), wie es in Anspruch 1 definiert ist, oder mit einem Konjugat dieses partiellen Peptids mit einem Trägerprotein immunisiert ist, und dann das Gewinnen des monoklonalen Antikörpers.

4. Kloniertes Hybridom, das aus einer Milzzelle eines Säugers und einer Lymphoidzelle des Säugers besteht, wobei die Milzzelle des Säugers mit einem partiellen Peptid des Polypeptids (I), wie es in Anspruch 1 definiert ist, oder mit einem Konjugat dieses partiellen Peptids mit einem Trägerprotein immunisiert ist.

5. Verfahren zur Herstellung eines klonierten Hybridoms, das aus einer Milzzelle eines Säugers und einer Lymphoidzelle des Säugers besteht, umfassend das Verschmelzen der Milzzelle des Säugers. mit der Lymphoidzelle des Säugers unter Bildung einer verschmolzenen Zelle, wobei die Milzzelle des Säugers mit einem partiellen Peptid des Polypeptids (I), wie es in Anspruch 1 definiert ist, oder mit einem Konjugat dieses partiellen Peptids mit einem Trägerprotein immunisiert ist, und dann das Klonieren der verschmolzenen Zelle.

6. Partielles Peptid des Polypeptids (I), wie es in Anspruch 1 definiert ist, wobei das partielle Peptid aus 12 bis 14 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der Sequenz besteht, die durch die Formel [21 dargestellt wird:

Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys.

7. Partielles Peptid des Polypeptids (I), wie es in Anspruch 1 definiert ist, wobei das partielle Peptid aus 8 bis 9 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der Sequenz besteht, die durch die Formel [3] dargestellt wird:

Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg.

8. Konjugat eines partiellen Peptids, wie es in Anspruch 6 und 7 definiert ist, mit einem Trägerprotein

9. Verfahren zur Reinigung des Polypeptids (I), wie es in Anspruch 1 definiert ist, das das Verwenden des Antikörpers gemäß Anspruch 1 umfaßt.

10. Verfahren zum Nachweisen und Bestimmen eines Polypeptids (I), wie es in Anspruch 1 definiert ist, das das Verwenden des Antikörpers gemäß Anspruch 1 umfaßt.