DE68925365T2

DE68925365T2 - PEPTIDE, DIE EPITOPE AUF R-IFN-BETA REPRÄSENTIEREN, ANTIKöRPER DAGEGEN, UND IHRE ANWENDUNG

Info

Publication number: DE68925365T2
Application number: DE68925365T
Authority: DE
Inventors: Paul Hoeprich
Original assignee: Berlex Laboratories Inc
Current assignee: Berlex Laboratories Inc
Priority date: 1988-10-14
Filing date: 1989-10-04
Publication date: 1996-09-12
Anticipated expiration: 2009-10-05
Also published as: EP0440686B1; US5869603A; WO1990003982A1; EP0440686A1; CA2000420C; JP2717319B2; DE68925365D1; ATE132502T1; JPH07508494A; CA2000420A1

Description

Menschliche Interferone (IFN's) sind Mitglieder einer biologisch potenten Familie von Cytokinen. Bekannte Aktivitäten dieser Proteine umfassen jene, welche antiviral, antiproliferativ und immunmodulatorisch wirksam sind. Drei antigenisch unterschiedliche Typen von Interferonen sind bekannt: α (Leukocyten), β(Fibroblasten) und γ (Immun). Sie alle binden an Zelloberflächenrezeptoren mit hoher Affinität; α-IFN und β-IFN teilen einen Rezeptor, der sich von dem an IFN γ gebundenen unterscheidet. Die für die biologische Aktivität über die Rezeptorbindung hinaus verantwortlichen Ereignisse sind schwer zu verstehen. Hingegen waren kürzlich Studien ermutigend, die eine IFN-Wirksamkeit bei der Behandlung bestimmter Viruserkrankungen und Krebs zeigen. Diese klinischen Beobachtungen haben das Interesse an einem besseren Verständnis der molaren Basis der Aktivität geweckt. Hiefür hat eine Studie der genetisch konstruierten IFN's Einsicht in die Beziehung zwischen Struktur und Funktion geschaffen. Eine abgeänderte Form von Fibroblasteninterferon, rIFN-βser, ist ein solches Protein. Es ist ein rekombinantes Molekül, dessen Sequenz auf menschlichem Fibroblasteninterferon basiert. In diesem Protein wurde ein Cysteinrest an Position 17 durch Serin mittels stellenspezifischer Mutagenese ersetzt. Das entstehende Molekül ist voll aktiv und hat die gleichen biologischen Aktivitäten wie natürliches IFN-β, und es ist nun ein klinisch nützliches Proteintherapeuticum. In der vorliegenden Beschreibung wird IFN-β verwendet, um sowohl natürliche als auch rekombinante Formen von IFN-β zu bezeichnen. Bei der klinischen Anwendung wurde gefunden, daß einige Patienten Antikörper gegenüber IFN-β ausbilden, welche seine biologische Aktivität neutralisieren. Mit anderen Worten haben diese Antikörper die Befähigung, alle oder einige der nutzbringenden Aktivitäten von IFN-β zu hemmen. Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit der Auffindung von Peptiden, welche jene Stellen darstellen, an welchen sich neutralisierende Antikörper an IFN-β binden. Diese Peptide können die gleichen Epitope sein, die für die biologische Aktivität von IFN-β verantwortlich sind. Die Peptide der vorliegende Erfindung können zur Inhibierung des Neutralisierungseffektes der neutralisierenden Antikörper gegenüber IFN-β nützlich sein. Sie finden auch diagnostische Anwendung für die Feststellung von neutralisierenden Antikörpern. Gegen die zuvor erwähnten Peptide gebildete und mit einer spezifischen Bindungsaffinität für diese Peptide aufweisende Antikörper sind gleichfalls ein Teil dieser Erfindung, da sie verwendet werden können, um den IFN-β-Level bei Patienten während des Behandlungsverlaufes festzustellen und zu verfolgen.
Die vorliegende Erfindung offenbart synthetische Peptide, welche epitopische Stellen auf natürlichem wie auch auf rekombinantem HuIFN-β darstellen. In einem Aspekt der Erfindung stellen die epitopischen Peptide die Stelle(n) dar, wo neutralisierende Antikörper an IFN-β anbinden, wodurch deren Aktivität reduziert oder ausgeschaltet wird. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liefert einen diagnostischen oder prognostischen Assay, durch den ein Patient, der eine IFN-β- Therapie erhält, hinsichtlich der Ausbildung von IFN-β neutralisierenden Antikörpern bewertet werden kann. Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung liefert eine Methode zur Behandlung eines Patienten zur Verminderung oder Ausschaltung der Wirkung von neutralisierenden Antikörpern während einer IFN-β- Therapie. Ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung liefert eine Methode zum Detektieren von IFN-β-Gehalten in einer Probe. Die Peptide der vorliegenden Erfindung können auch für die Epitope stehen, die für die biologische Aktivität von IFN-β verantwortlich sind.
Figur 1 ist die Darstellung der erhaltenen Absorption in einem Antikörper bindenden ELISA-Test, wenn man einen neutralisierenden Antikörper mAb, in diesem Beispiel A1, mit dem Satz sequentiell überlappender synthetischer Octapeptide reagieren läßt, welche die Sequenz von rIFN-β abdecken, d.h. Peptid 1 enthält die Reste 1-8, Peptid 2 die Reste 2-9, usw. bis zu Peptid 157 mit einem Gehält an den Resten 157-164.
Die Figuren 2, 3, 4 und 5 erläutern die Bindung von neutralisierenden und nicht neutralisierenden mAb's an die Peptide IB, IC, IE bzw. an ein Kontrollpeptid.
Die Figur 6 stellt die Inhibierung einer mAb-Bindung an IFN-β in Gegenwart der Peptide IB, 10 und eines Kontrollpeptids dar.
Die Figur 7 erläutert die Bindung von polyklonalen Kaninchenantikörpern, die gegen die synthetischen Peptide IB und IC gebildet wurden, an IFN-β.
Es ist bekannt, daß einige Patienten während einer IFN-β- Behandlung neutralisierende Antikörper gegen dieses Cytokin entwickeln, wodurch potentiell dessen Wirksamkeit als Behandlungsform für virale und proliferative Erkrankungen verringert wird. Die vorliegende Erfindung offenbart Peptide, welche die Fähigkeit besitzen, mAb's zu stören, welche die Aktivität von IFN-β neutralisieren. Diese Antikörper wurden gegen rIFN-β gebildet und wurden auf ihre Fähigkeit, die biologischen Funktionen, die im allgemeinen mit diesem Cytokin verbunden sind, zu neutralisieren, gescreent. Die vorliegende Erfindung identifiziert das spezifische Epitop oder die spezifischen Epitope, an welche mAb's, die die Aktivität von IFN-β neutralisieren, anbinden. Diese Epitope wurden unter Anwendung der Geysen-Methode zum Epitopmapping ermittelt, welche eine vielfache Peptidsynthese an aktivierten Polyethylenstäben (Geysen, H.M., Meben, R.H., und Barteling, S.J. [1984], Proc. Natl. Acad. Aci Usa 81, 3998-4002) vorsieht. Die Geysen-Methode liefert eine gleichzeitige Synthese von hunderten Peptiden, welche dann auf ihre Antikörperbindung untersucht werden können. Basierend auf der Aminosäuresequenz von rIFN-β wurden 157 Octapeptide in zweifacher Ausfertigung synthetisiert, indem bei jedem Schritt jeweils um eine Aminosäure über die gesamte Sequenz von rIFN-β vorgerückt wurde. Die synthetisierten Peptide wurden dann mit den neutralisierenden mAb's umgesetzt, um eine Bindung zwischen ihnen festzustellen. Ein typisches Ergebnis wird in Figur 1 gezeigt. Die erste Klasse von Peptiden dieser Erfindung wird aus der folgenden Sequenz ausgewählt:

(I)

X - AA&sub1; - Pro - Glu - Glu -AA&sub2; - AA&sub3; - Gln AA&sub4; -Y,
worin X für NH&sub2; oder eine Aminosäuresequenz von bis zu 10 Aminosäuren Länge steht, in Sequenz ausgewählt aus der folgenden Sequenz:
Tyr-Cys-Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp.
Y ist COOH oder eine Aminosäuresequenz von bis zu 13 Aminosäuren Länge, in Sequenz ausgewählt aus der folgenden Sequenz:
Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala-Leu-Thr-Ile-Tyr;
AA&sub1; bedeutet Ile, Phe, Leu, Val, Arg, Tyr oder Norleu;
AA&sub2; bedeutet Ile, Leu, Arg, Val oder Norleu;
AA&sub3; bedeutet Lys, Ile, Leu, Arg, Val oder Norleu;
AA&sub4; bedeutet Leu, Phe, Tyr, Ile, Val, Arg oder Met
Stärker bevorzugt:
AA&sub1; steht für Ile, Phe oder Leu;
AA&sub2; steht für Ile, Leu oder Arg;
AA&sub3; steht für Lys, Ile oder Leu;
AA&sub4; steht für Leu, Phe oder Tyr.
Stärker bevorzugt sind die Peptide der vorliegenden Erfindung in einer der folgenden Sequenzen:

(IA)

X-Ile-Pro-Glu-Glu-Ile-Lys-Gln-Leu-Y,
worin X und Y gleich wie in der obenstehenden Formel I definiert sind. Am stärksten bevorzugt sind die Peptide in einer der folgenden Sequenzen:

(IB)

Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp-Ile-Pro-Glu-Glu-Ile-Lys-Gln-Leu

(IC)

Ile-Pro-Glu-Glu-Lys-Gln-Leu-Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala

(ID)

Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp-Ile-Pro-Glu-Glu-Ile-Lys-Gln- Leu-Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala

(IE)

NH&sub2;-Ile-Pro-Glu-Glu-Ile-Lys-Gln-Leu-COOH
Die am stärksten bevorzugten Peptide der vorliegenden Erfindung sind jene, die sich innerhalb der Reste 30-60 von rIFN- β finden und wenigstens die Sequenz einer der oben genannten Formeln I-IE aufweisen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die zu den Peptiden der obenstehenden Formeln I-ID gebildeten und Bindungsaffinität hiezu aufweisenden Antikörper.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können durch herkömmliche Verfahren zum Synthetisieren von Peptiden hergestellt werden; im spezielleren unter Anwendung von Verfahren, wie in Schroder und Lubke, The Peptides, Bd.1, herausgegeben von Academic Press, New York (1966), oder Izumiya et al., Synthesis of Peptides, herausgegeben von Maruzen Publishing Co., Ltd., (1975), beschrieben, auf welche beide hierin bezuggenommen wird. Es können beispielsweise ein Azidverfahren, ein Säurechloridverfahren, ein symmetrisches Anhydridverfahren, ein gemischtes Anhydridverfahren, ein DCC-Verfahren, ein Aktivesterverfahren (beispielsweise p-Nitrophenylester, N-Hydroxysuccinimidester oder Cyanomethylester), ein Carbodiimidazolverfahren, ein Oxidations-Reduktionsverfahren oder ein DCC/Additivverfahren angewendet werden. Für die zuvor genannten Verfahren sind sowohl Festphasen- als auch Lösungsphasensynthesen anwendbar.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung werden zweckmäßigerweise in Übereinstimmung mit den obigen Verfahren hergestellt, wie sie typischerweise bei der Peptidsynthese verwendet werden, im allgemeinen entweder durch ein sogenanntes stufenweises Verfahren, welches das Kondensieren einer Aminosäure an die endständige Aminosäure, eine nach der anderen, umfaßt, oder durch Kuppeln von Peptidfragmenten an die endständige Aminosäure. (Aminogruppen, die nicht in der Kupplungsreaktion verwendet werden, müssen geschützt sein, um ein Ankuppeln an einer unpassenden Stelle zu verhindern).
Im Falle der Anwendung einer Festphasensynthese wird die C-endständige Aminosäure über ihre Carboxylgruppe an einen unlöslichen Träger oder eine unlösliche Unterlage gebunden. Der unlösliche Träger ist nicht besonders beschränkt, solange er eine Bindungsfähigkeit an eine reaktive Carboxylgruppe aufweist. Beispiele für derartige unlösliche Träger umfassen Halogenmethylharze von Polystyrol, wie Chlormethylharz oder Brommethylharz; Hydroxymethylharze, Phenolharze, tert.Alkyloxycarbonyl-hydrazidierte Harze und dgl.
Eine an der Aminogruppe geschützte Aminosäure wird in Sequenz durch Kondensieren ihrer reaktiven Carboxylgruppe an die endständige Aminogruppe der wachsenden Kette gebunden. Nach dem Synthetisieren der vollständigen Sequenz wird das Peptid von dem unlöslichen Träger entfernt, um das Peptid freizusetzen. Dieser Festphasenweg wird von Merrifield et al. in J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-2156 (1963), generell beschrieben, worauf in der vorliegenden Erfindung bezuggenommen wird.
Im vorstehenden Verfahren wird bevorzugt, daß entsprechende Aminosäuren von Histidin, Tyrosin, Glutaminsäure, Lysin, Serin, Cystein, Threonin und Asparaginsäure an den funktionellen Seitenkettengruppen geschützt werden. Diese funktionellen Seitenkettengruppen werden mit gewöhnlichen Schutzgruppen geschützt, welche nach dem Abschluß der Endreaktion abgetrennt werden.
Beispiele für Schutzgruppen des Imidazolrestes umfassen: Benzyloxycarbonyl, Boc, tert.Amyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Adamantyloxycarbonyl, Trifluoracetyl, Phthalyl, Formyl, o-Nitrophenylsulfenyl, Diphenylphosphinothioyl und dgl.
Beispiele für Schutzgruppen für die Iminogruppe von Histidin umfassen: Tos, Bzl, DNP, Trityl und dgl.
Beispiele für Schutzgruppen für die Hydroxygruppe von Tyrosin umfassen: Bzl, Cl&sub2;-Bzl, BrZ, Benzyloxycarbonyl, Acetyl, Tos und dgl.
Beispiele für Schutzgruppen für die Aminogruppe von Lysin umfassen: Benzyloxycarbonyl, Cl-Z, Cl&sub2;-Bzl, Boc, Tos und dgl.
Einen Schutz für die Carboxylgruppen von Glutaminsäure und Asparaginsäure bilden: die Veresterung der Carbonsäuren mit Benzylalkohol, Methanol, Ethanol, tert.Butanol und dgl.
Beispiele für Schutzgruppen für den Hydroxrest von Serin umfassen: 0-Benzyl, O-tert.Butyl und dgl.
Beispiele für Schutzgruppen für Threonin umfassen: 0-Benzyl, 0-tert.Butyl und dgl.
Beispiele für Schutzgruppen für Cystein umfassen: Paramethoxybenzyl, Acetamidomethyl, S-Trityl, S-Butyl und dgl.
Beispiele für aktivierte Carboxylgruppen umfassen: die entsprechenden Säurechloride, symmetrische Anhydride, gemischte Anhydride, Azide und aktive Ester (Ester mit Pentachlorphenol, p-Nitrophenol, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxybenzotriazol, N- Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboxydiimid und dgl.).
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können auch nach DNA-Techniken hergestellt werden. Die Aminosäuresequenz des gewünschten Peptids wird verwendet, um die Codonsequenz für die Einzelstrang-DNA abzuleiten, wird unter Verwendung von herkömmlichen Synthesetechniken (einschließlich der Multipel-Gen-Kopiertechniken) synthetisiert, danach wird die Doppelstrang-DNA hergestellt und an einer geeigneten Stelle in ein Klonierungsvehikel, einen Vektor oder ein Plasmid eingeführt. Ein geeigneter Organismus, wie Bakterienzellen, Hefezellen oder Zellen von Säugetieren, wird transformiert, um die Expression des gewünschten Peptids zu erhalten.
Die hergestellten Peptide der vorliegenden Erfindung können aus dem Reaktionsgemisch durch Peptidabtrennung, beispielsweise durch Extrahieren, Gegenstromverteilung, Säulenchromatographie, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und dgl., isoliert und gereinigt werden.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung bilden Salze mit einer Vielfalt an anorganischen oder organischen Basen. Die nicht toxischen, pharmazeutisch annehmbaren Salze werden bevorzugt, obwohl auch andere Salze zum Isolieren oder Reinigen des Produktes nützlich sind. Solche pharmazeutisch annehmbare Salze umfassen Metailsalze, wie Natrium-, Kalium- oder Lithiumsalze, Erdalkalimetallsalze, wie von Calcium oder Magnesium, und von Aminosäuren stammende Salze, wie von Arginin oder Lysin. Die Salze werden durch Umsetzen der Säureform des Peptids mit einem Moläquivalent der Base erhalten, welches das gewünschte Ion in einem Medium liefert, in welchem das Salz ausfällt, oder in einem wäßrigen Medium und anschließendes Lyophilisieren.
In ähnlicher Weise bilden die Peptide Salze mit einer Vielzahl an anorganischen und organischen Säuren aus. Es werden wieder die nicht toxischen, pharmazeutisch annehmbaren Salze bevorzugt, obwohl andere Salze ebenso nützlich für das Isolieren oder Reinigen des Produktes sind. Solche pharmazeutisch annehmbaren Salze umfassen jene, die mit Chlorwasserstoffsäure, Methansulfonsäure Schwefelsäure, Maleinsäure, Essigsäure, Palmitinsäure und dgl. gebildet werden. Die Salze werden durch Umsetzen des Produktes mit einem Moläquivalent der Säure in einem Medium, worin das Salz ausfällt, erhalten.
Wie oben festgestellt, sind Antikörper, die gegen die Peptide der vorliegenden Erfindung gebildet werden, auch ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung. Beispielsweise können Antikörper oder Antikörperfragmente, z. B. F(ab')&sub2; oder Fab- Fragmente, gegenüber den Peptiden der Formeln I-ID in Immunoassays zur Detektierung des rIFN-β-Gehaltes in Körperflüssigkeiten von Patienten, die das Protein therapeutisch erhalten, nützlich sein. Demnach werden die Peptide der vorliegenden Erfindung, um die Herstellung von Antikörpern zu erleichtern, vorzugsweise in einer Weise, die ihre Antigenizität optimiert, behandelt oder hergestellt.
Antigenische Peptide können unter Verwendung der Peptide oder Peptidfragmente der vorliegenden Erfindung als Haptene und Umsetzen der Peptide oder Fragmente mit einem geeigneten Träger in Gegenwart eines Hapten-Träger-Bindemittels hergestellt werden. In diesem Fall können natürliche und synthetische Proteine mit einem hohen Molekulargewicht, welche herkömmlicherweise bei der Herstellung von Antigenen verwendet werden, als Träger eingesetzt werden, die an die Haptene gebunden werden sollen. Beispiele für derartige Träger umfassen: Albumine von Tierseren, Globuline von Tierseren, Thyroglobuline von Tieren, Hämoglobuline von Tieren, Hämocyanine von Tieren, wie Keyhole Limpet- Hämocyanin (KLH), aus Ascaris extrahierte Proteine, Polylysin, Polyglutaminsäure, Lysin-Glutaminsäure-Copolymere und Copolymere mit einem Gehalt an Lysin oder Ornithin.
Als Hapten-Träger-Bindemittel können die herkömmlicherweise bei der Herstellung von Antigenen verwendeten eingesetzt werden. Spezifische Beispiele dieser Mittel umfassen: Diazoniumverbindungen für das Verknüpfen von aromatischen Resten, ahphatische Dialdehyde zum Verknüpfen einer Aminogruppe mit einer Aminogruppe, Dimaleimidverbindungen zum Verknüpfen einer Thiolgruppe mit einer Thiolgruppe, Maleimid-N-hydroxysuccinimidester zum Verknüpfen einer Aminogruppe mit einer Thiolgruppe, und Mittel, die bei herkömmlichen Ausbildungsreaktionen von Peptidbindungen verwendet werden, wobei Amidbindungen aus einer Aminogruppe und einer Carboxylgruppe gebildet werden. Es ist auch möglich, als das Hapten-Träger-Bindemittel Diazoniumaryl carbonsäuren zu verwenden, wie p-Diazoniumphenylessigsäure, in Kombination mit herkömmlichen Peptidbindungs- Ausbildungsmitteln, wie den oben beschriebenen Dehydratierungs- und Kondensierungsmitteln.
Die Kupplungsreaktion zur Herstellung der antigenischen Formen der Peptide der vorliegenden Erfindung wird zweckmäßigerweise in einer wäßrigen Lösung oder einer herkömmlichen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7 bis 10, vorzugsweise in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 bis 9, bei Temperaturen im Bereich von etwa 0ºC bis 40ºC, vorzugsweise um etwa Raumtemperatur, durchgeführt.
Die Kupplungsreaktion ist im allgemeinen innerhalb von etwa 1 bis etwa 24 Stunden, vorzugsweise 3 bis 5 Stunden, abgeschlossen. Repräsentative Beispiele von Pufferlösungen, welche in dem obenstehenden Verfahren verwendet werden können, umfassen:
0,2 N Natriumhydroxid-0,2 M Borsäure - 0,2 M Kaliumchloridpufferlösung;
0,2 M Natriumcarbonat - 0,2 M Borsäure - 0,2 M Kaliumchloridpufferlösung;
0,05 M Natriumtetraborat - 0,2 M Borsäure - 0,05 M Natriumchloridpufferlösung; und
0,1 M Dihydrogenkaliumphosphat - 0,05 M Natriumtetraboratpufferlösung.
Die Anteile an Hapten, Hapten-Träger-Bindemittel und Träger können in angemessener Weise bestimmt werden, es wird jedoch bevorzugt, daß das Molverhältnis von Hapten zu Träger etwa 20 zu etwa 1 und das Molverhältnis von Bindemittel zu Hapten etwa 10 zu etwa 1 betragen. In der Kupplungsreaktion wird das Hapten an den Träger über das Hapten-Träger-Bindemittel gebunden, um ein aus einem Peptid-Trägerkomplex zusammengesetztes gewünschtes Antigen zu erhalten.
Nach Beendigung der Kupplungsreaktion kann das Antigen mittels Dialyse, Gelfiltration, fraktionierte Ausfällung und dgl. isoliert und gereinigt werden.
Der Antikörper oder die Antikörper der vorliegenden Erfindung, welche(r) gegen ein Peptid oder Peptide der vorliegenden Erfindung gebildet werden, können monoklonal oder polyklonal sein, wobei monoklonal bevorzugt wird. Im allgemeinen können Antikörper durch Injektion des gewünschten Immunogens oder Antigens in eine Vielzahl von Vertebraten gemäß herkömmlichen Techniken erhalten werden. Geeignete Vertebraten umfassen Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schafe und Ziegen, wovon Mäuse bevorzugt werden. Im allgemeinen wird den Tieren in regelmäßigen Abständen Blut abgenommen, wobei die aufeinanderfolgenden Blutabnahmen verbesserte Titer und eine verbesserte Spezifität aufweisen. Die Antigene können intramuskulär, intraperitoneal, subkutan usw. injiziert werden. Durch Gentechnik hergestellte chimäre Antikörper (Maus-Mensch-Hybride) werden in dieser Erfindung gleichfalls in Erwägung gezogen.
Polyklonale Antikörper werden durch Hyperimmunisierung des Tieres mit dem Antigen hergestellt. Dann wird das Blut des Tieres kurz nach den wiederholten Immunisierungen gesammelt, und das Gammaglobulin wird isoliert. Geeignete Methoden zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern werden in Handbook of Experimental Immunology, 3. Auflage (Ed. Weir, 1978), beschrieben, worauf hierin bezuggenommen wird.
Um monoklonale Antikörper zu erhalten, werden Milzzellen aus einem immunisierten Vertebraten, der die gewünschte Antikörperantwort aufweist, immortalisiert. Die Art der Immortalisierung ist nicht kritisch, die häufigste Methode ist jedoch die Fusion mit einem Myelom-Fusionspartner. Andere Immortahsierungstechniken umfassen eine EBV-Transformation, eine Transformation mit bloßer DNA, wie Cncogenen oder Retroviren, oder jede beliebige andere Methode, welche für eine stabile Aufrechterhaltung der Zell-Linie und der Ausbildung von monoklonalen Antikörpern sorgt. Das allgemeine Verfahren zur Gewinnung von monoklonalen Antikörpern wird von Kohler und Milstein in Nature, 256, 495-497 (1975) beschrieben, worauf hierin bezuggenommen wird. Monoklonale menschliche Antikörper können durch Fusion der Milzzellen mit einem geeigneten menschlichen Fusionspartner, wie WI-L2, beschrieben in der europäischen Patentanmeldung Nr. 82 301 103.6, auf deren relavante Teile hierin bezuggenommen wird, erhalten werden. Eine detaillierte Technik zur Schaffung von monoklonalen Maus x Maus-Antikörpern wird von Oi und Herzenberg in Selected Methods in Cellular Immunology, 351-372 (Herausgeber Mishel und Shiigi, 1980) gelehrt, worauf gleichfalls hierin bezuggenommen wird. Die entstehenden Hybridomen werden gescreent, um individuelle Klone zu isolieren, wovon jeder einzelne eine einzige Antikörperspezies sekretiert, die zum Erkennen des Antigens befähigt ist.
Die Peptide und/oder Antikörper können ohne Modifikation verwendet werden oder können auf vielfache Weise, beispielsweise durch Markieren, modifiziert werden. Markieren soll ein entweder kovalentes oder nicht-kovalentes Zufügen eines Restes bedeuten, der direkt oder indirekt ein Detektierungsmittel liefert. Eine Vielzahl von Markern ist bekannt und umfaßt: Radionuklide, Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, Fluoreszenzmittel, Chemilumineszenzmittel, Magnetpartikel und dgl.
Viele der Techniken zum Verknüpfen der Peptide mit geeigneten Markern beruhen auf der Anwendung ihrer Carboxylgruppen durch den Einsatz von Carbodiimid oder von aktiven Estern zur Ausbildung von Peptidbindungen; die Ausbildung von Sulfiden durch Umsetzung einer Mercaptogruppe mit einem aktivierten Halogen, wie Chlormethylstyrol oder einem aktivierten Olefin, wie Maleimid; die Ausbildung eines sekundären Amins durch Umsetzen einer Aminogruppe mit einem Dialdehyd wie Glutaraldehyd oder dgl., gefolgt von einer Reduktion mit Natriumcyanoborhydrid oder dgl.
Die Peptide und Antikörper der vorliegenden Erfindung können bei der Herstellung von diagnostischen Tests wie Immunoassays verwendet werden. Derartige diagnostische Tests umfassen beispielsweise den Enzymimmunassay (EIA), das enzymmultiplizierte Immunoassay-Verfahren (EMIT), den enzymverknüpften Immunosorbensassay (ELISA), den Radioimmunassay (RIA), den Fluoreszenzimmunassay, entweder Einzel- oder Doppelantikörpertechniken und andere Techniken, worin entweder die Peptide oder die Antikörper der vorliegenden Erfindung mit einer detektierbaren Markierung gekennzeichnet werden. Siehe allgemein Enzyme Immunoassay, von Maggio, CRC Press (1981). Vorzugsweise werden die Peptide der Formel I und die dazugehörigen Antikörper zum Detektieren von neutralisierenden Antikörpern gegen IFN-β bzw. zum Messen von IFN-β-Level verwendet.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können als therapeutische Mittel gegen eine durch Antikörper vermittelte Neutralisierung der IFN-β-Aktivität eingesetzt werden. Die Peptide der vorliegenden Erfindung können allein in geradkettiger oder cyklischer Ringform als ein Polymer verwendet werden, worin benachbarte wiederkehrende Polypeptideinheiten durch oxidierte Cysteinreste miteinander verbunden sind oder als ein Konjugat an einen Träger gebunden sind.
Die therapeutischen Formulierungen der neuen Peptide oder Fragmente oder Derivate können in jeder beliebigen herkömmlichen Dosierungsform verabreicht werden. Während es möglich ist, den aktiven Bestandteil allein zu verabreichen, wird es bevorzugt, ihn als pharmazeutische Formulierung anzubieten. Die Formulierungen umfassen wenigstens einen aktiven Bestandteil, wie oben definiert, zusammen mit einem oder mit mehreren akzeptierbaren Trägern hievon und gegebenenfalls mit anderen therapeutischen Mitteln. Jeder Träger muß "akzeptierbar" im Sinne von kompatibel mit den anderen Bestandteilen und für den Patienten unschädlich sein. Die Formulierungen umfassen jene, die zur oralen, rektalen, nasalen oder parenteralen (einschließlich subkutanen, intramuskulären, intravenösen und interdermalen) Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen können zweckmäßigerweise in Dosiseinheiten vorliegen und können nach jeder beliebigen, nach dem Stand der Pharmazie bekannten Methode hergestellt werden.

Beispiel 1

Peptidsynthese

Die bei der Peptidsynthese verwendeten Reagenzien wurden von den angeführten Quellen gekauft: Boc-Aminosäuren: Peninsula Laboratories, Belmont, CA; Diisopropylcarbodiimid und 1- Hydroxybenzotriazol: Aldrich, Milwaukee, WI; Kohlenstoff-14- markierte Aminosäuren: Amersham.
Alle Peptide wurden nach dem etablierten Merrifield-Festphasensyntheseverfahren (Erickson et al., (1976) Proteins 2, SS. 256-527 und Stewart et al., (1984) Solid Phase Peptide, Synthesis, Pierce Chemical Co. Rockford IL) unter Verwendung eines automatisierten Gerätes, Modell 9500, von Biosearch (San Rafael, CA) hergestellt. Die erste Aminosäure, d. h. der endständige Carboxylrest, wurde an chlormethyliertes Polystyrol- Divinylbenzolcopolymer (Bio-Rad, 1 % vernetzt, 1,34 Milliäquivalente/g), wie zuvor in Heoprich and Doolittle (1983) Biochemistry 22, S.2049, beschrieben, verestert. Die anschließenden Aminosäuren wurden zweimal unter Verwendung von Diisopropylcarbodiimid als Kupplungsmittel gekuppelt. Im allgemeinen wurde die Boc-Gruppe durch Behandeln der Peptidschutzgruppe während 20 Minuten mit 45 %iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan (V/V), gefolgt von zwei 5-minutigen Neutralisationen mit 5 %igem Dusopropylethylamin in Dichlormethan (VIV), abgetrennt. Das Harz wurde vor und nach jeder Deprotektions-, Neutralisations- und Kupplungsstufe mit geeigneten Lösungsmitteln gewaschen. Die Abtrennung der Boc-Gruppe und die Vollständigkeit der Kupplung wurde qualitativ mit einem Ninhydrin-Farbtest (Kaiser et al., 1970, Anal. Biochem. 34, S. 595), verfolgt. Die Kohlenstoff-14-hältigen Aminosäuren, z. B. Glycin, wurden anfänglich durch eine mit Diisopropylcarbodiimid vermittelte Reaktion und zweitens durch Anwendung eines vorgeformten 1-Hydroxybenzotriazolesters gekuppelt.
Alle Peptide wurden von dem Harz unter gleichzeitiger Abtrennung der Seitenkettenschutzgruppe durch Einwirkung von wasserfreiem Fluorwasserstoff während 40 Minuten bei 0-4ºC in Gegenwart von 10 % Anisol (V/V) abgespalten. Nach dem Abtrennen von Fluorwasserstoff durch Wasseraspiration wurde das Harz mit wasserfreiem Ethylether gewaschen, um das Anisol abzutrennen. Das Peptid wurde durch aufeinanderfolgende Waschungen mit Dimethylformamid, 50 % Dimethylformamid/10 % Essigsäure, 10 % Essigsäure und destilliertem Wasser von dem Harz gewaschen; die vereinigten Waschungen wurde lyophilisiert.
Die Reinigung der Peptide erfolgte mit einer Umkehrphasen- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Unter Anwendung einer präparativen Säule (Whatman, Partisil 10 ODS-3 Magnum 20, 2,2 x 50 cm) wurde das gewünschte Peptid während der Gradientenentwicklung des Chromatogramms eluiert; das Eluierungsprogramm lag im Bereich von 95 % Lösungsmittel A (0,1 % Trifluoressigsäure/5 % Acetonitril/Wasser) und 5 % Lösungsmittel B (0,1 % Trifluoressigsäure/CH&sub3;CN) bis 50 % A und 50 % B während 65 Minuten. Ein Teil jedes gereinigten Peptids wurde in 6,0N HCl (Pierce) bei 110ºC 24 Stunden lang hydrolysiert, und die Aminosäurezusammensetzungen wurden unter Verwendung eines Beckman-Aminosäureanalysiergerätes Modell 121M bestimmt.

Beispiel 2

Bindung von neutralisierenden mAb'ss an svnthetisclie Peptide aus IFN-β

Unter Anwendung der zuvor beschriebenen Geysen-Technik der Peptidsynthese wurden 157 Octapeptide zweifach auf Polyethylenstäben oder "pins" synthetisiert. Jedes Peptid stellt ein Octamer dar, das durch Verschieben um jeweils eine Aminosäure durch die rIFN-β-Sequenz hergestellt wurde. Eine Lösung von 175 µl jedes neutralisierenden mAb mit einer geeigneten Verdünnung wurde mit jedem der Peptidpins über Nacht bei 4ºC vermischt. Jeder Peptidpin wurde mit Ziegen-Antimaus IgG/Meerrettichperoxidase (HRP)-Konjugat vermischt und mit 1mM 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS)-Substrat entwickelt. Die Ergebnisse sind als vertikale Linie entsprechend der erhaltenen Absorption im Antikörper-Bindungs- ELISA-Test aufgezeigt, die über der Zahl der N-endständigen Aminosäure jedes Octamer-Peptids innerhalb der Sequenz von rIFN-β aufgetragen wurde. Diese Darstellung zeigt einen Peak der Bindung an Aminosäuren bei etwa 40 bis 47 (Siehe Abbildung 1).

Beispiel 3

Umsetzung von neutralisierenden und nicht neutralisierenden mAb's mit synthetischen Peptiden IB. IC und IE

Eine Reihe von enzymverknüpften Immunsorbens-Assays (ELISA) wurden durchgeführt, worin ein Satz von 3 neutralisierenden mAb's, bezeichnet als A1, A5 und A7 (entwickelt von Phil Redlich und Sid Grossberg am Medical College von Wisconsin) und ein einzelner, nicht neutralisierender mAb, identifiziert als B2b (erhalten vom Medical College von Wisconsin, P. Redlich und S. Grossberg) auf ihre Bindung an die synthetischen Peptide IB, IC, IE und ein Kontrollpeptid überprüft wurden. In jedem Fall wurde das Peptid in 0,05M Tris-Puffer, pH-Wert 9,5, gelöst und in 100 µl-Volumsteilen auf Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (Corning) mit einer Konzentration von 50 µg Peptid je Vertiefung verteilt. Die Platte wurde über Nacht in einen Vakuumexsikkator gestellt, um das Peptid an der Vertiefung anzutrocknen. Es wurde nach dem Kuppeln über Nacht nach den Standard-ELISA-Methoden vorgegangen, d. h. Blockierungsstufen, Waschungen, Inkubationsbedingungen und Farbentwicklung des entsprechenden Ziegen-Antimaus/Meerrettich-Peroxidase-Konjugats mit dem ABTS-Substrat. Der Tnab Al reagierte gut mit den Peptiden IB und IC, in geringerem Maße mit IE. Der mab A5 reagierte schwach mit den getesteten Peptiden. Der Antikörper A7 reagierte gut mit den Peptiden IB und IC, es war jedoch praktisch keine Aktivität mit dem Peptid IE festzustellen. Der nicht neutralisierende mab B2b reagierte mit den Peptiden IB und IC, jedoch nicht mit IE. In allen Fällen reagierten die mAb's, unabhängig von einer neutralisierenden oder nicht neutralisierenden Aktivität, schlecht mit einem Kontrollpeptid von vergleichbarer Größe und Zusammensetzung, jedoch ohne Bezug zu IFN-β. Während alle getesteten mAb's die synthetischen Peptide binden konnten, zeigten die neutralisierenden mAb's eine bevorzugte Bindung, im speziellen A1 an das Peptid IB und IC und A5 an das Peptid IE.

Beispiel 4

Inhibierung der Bindung von neutralisierendem mAb an IFN-β durch synthetische Peptide

Die Abbildung 6 zeigt das Ergebnis eines ELISA-Tests, worin die Bindung der neutralisierenden mAb's A1, A5 und A7 an IFN-β durch Präinkubation mit den synthetischen Peptiden IB und IC signifikant inhibiert wird. Die neutralisierenden mAb's wurden über Nacht bei 4ºC in PBS/Tween mit einem 10&sup4; molaren überschuß von Peptid inkubiert. Zum Vergleich wurde der nicht neutralisierende mAb B2b in einer identen Weise behandelt. Jeder mAb wurde in gleicher Konzentration verwendet, nämlich 1/5000 verdünnt aus einer 0,1 mg/ml Vorratslösung. Nach dem Inkubieren mit dem Peptid über Nacht wurde die Iriab/Peptidlosung in einem ELISA-Test gegen IFN-β in einer Konzentration von 50 ng/Vertiefung eingesetzt. Die Lösung wurde an der Oberfläche der Vertiefung im Vakuum wie zuvor beschrieben getrocknet, und der ELISA-Test wurde nach Standardmethoden entwickelt. Es kann aus Abbildung 6 ersehen werden, daß der neutralisierende mAb A1 durch das Peptid IC vollständig daran gehindert wurde, an IFN-β zu binden, und daß das Peptid IB zu 80 % eine Bindüng des mAb A1 blockierte. Die Bindung von mab A5 an IFN-β wurde praktisch durch Präinkubieren mit einem der beiden Peptide im Vergleich mit der Bindung bei Abwesenheit des Peptids ausgeschaltet. Die Bindung von Iriab A7 an IFN-β in Gegenwart der Peptide IB und IC wurde um 60 % verringert. Die Bindung des nicht neutralisierenden mAb B2b an IFN-β wurde um etwa 20 % durch Präinkubieren mit den Peptiden IB bzw. IC gesenkt.

Beispiel 5

Antikörper gegen synthetische Peptide IB und IC binden an IFN-β

Antikörper gegen die Peptiden IB und IC wurden in Kaninchen gezüchtet, die mit KLH/Peptid-Konjugaten immunisiert worden waren. Nach einer entsprechenden Zeitspanne wurde Blut abgenommen und ein Antiserum mit einem Gehalt an Ab's gegen jedes Peptid wurde erhalten. Eine weitere Reinigung jeder Antikörperpopulation wurde durch Ammoniumsulfatfraktionierung jeder Antiserumprobe erhalten. Die Ammoniumsulfatschnitte wurden mittels ELISA auf ihre Reaktivität gegenüber IFN-β geprüft. Die Abbildung 7 zeigt, daß die gegen jedes Peptid gezüchtete polyklonale Ab-Population ihr entsprechendes Immunogen, das andere verwandte Peptid und IFN-β erkannte. Das Peptid IB scheint stärker immunogen zu sein als IC, aber die gegen das letztere gezüchteten Ab's reagieren stärker mit IFN-β. Während beide IFN-β gut erkennen, könnte Anti-IC eine größere diagnostische Brauchbarkeit zum Messen von IFN-β-Gehalten aufweisen.

Claims

1. Peptide mit spezifischer Bindungsaffinität für IFN-β-neutralisierende Antikörper, mit der folgenden Aminosäuresequenz:

X - AA&sub1; - Pro - Glu - Glu - AA&sub2; - AA&sub3; - Gln - AA&sub4; - Y,

worin X für NH&sub2; oder eine Aminosäuresequenz von bis zu 10 Aminosäuren Länge steht, in Sequenz ausgewählt aus der folgenden Sequenz:

Tyr-Cys -Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp;

Y für COOH oder eine Aminosäuresequenz von bis zu 13 Aminosäuren Länge steht, in Sequenz ausgewählt aus der folgenden Sequenz:

Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala-Leu-Thr-Ile-Tyr;

AA&sub1; für Ile, Phe, Leu, Val, Arg, Tyr oder Norleu steht;

AA&sub2; für Ile, Leu, Arg, Val oder Norleu steht;

AA&sub3; für Lys, Ile, Leu, Arg, Val oder Norleu steht;

AA&sub4; für Leu, Phe, Tyr, Ile, Val, Arg oder Met steht.

2. Peptide nach Anspruch 1, worin

AA&sub1; für Ile, Phe oder Leu steht;

AA&sub2; für Ile, Leu oder Arg steht;

AA&sub3; für Lys, Ile oder Leu steht;

AA&sub4; für Leu, Phe oder Tyr steht.

3. Peptide nach Anspruch 1, worin

AA&sub1; für Ile steht;

AA&sub2; für Ile steht;

AA&sub3; für Lys steht und

AA&sub4; für Leu steht.

4. Peptide nach Anspruch 3, worin

X für NH2 steht und

Y für Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala steht.

5. Peptide nach Anspruch 3, worin

X für Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp steht und

Y für COOH steht.

6. Peptide nach Anspruch 3, worin

X für Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp und

Y für Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala steht.

7. Gegen Peptide mit der folgenden Aminosäuresequenz

X - AA&sub1; - Pro- Glu - Glu - AA&sub2; - AA&sub3; - Gln - AA&sub4; - Y

gebildete und Bindungsaffinität für diese Peptide aufweisende Antikörper, in welcher Aminosäuresequenz X für NH&sub2; oder eine Aminosäuresequenz von bis zu 10 Aminosäuren Länge steht, in Sequenz ausgewählt aus der folgenden Sequenz:

Tyr-Cys-Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp;

Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala-Leu-Thr-Ile-Tyr;

AA&sub1; für Ile, Phe, Leu, Val, Arg, Tyr oder Norleu steht;

AA&sub2; für Ile, Leu, Arg, Val oder Norleu steht;

AA&sub3; für Lys, Ile, Leu, Arg, Val oder Norleu steht;

AA&sub4; für Leu, Phe, Tyr, Ile, Val, Arg oder Met steht.

8. Antikörper nach Anspruch 7, worin

AA&sub1; für Ile, Phe oder Leu steht;

AA&sub2; für Ile, Leu oder Arg steht;

AA&sub3; für Lys, Ile oder Leu steht;

AA&sub4; für Leu, Phe oder Tyr steht.

9. Antikörper nach Anspruch 7, worin

AA&sub1; für Ile steht;

AA&sub2; für Ile steht;

AA&sub3; für Lys steht und

AA&sub4; für Leu steht.

10. Antikörper nach Anspruch 7, worin

X für NH&sub2; steht und

Y für Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala steht.

11. Antikörper nach Anspruch 9, worin

X für Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp steht und

Y für COOH steht.

12. Antikörper nach Anspruch 9, worin

X für Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp steht und

Y für Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala steht.

13. Verfahren zum Detektieren des Vorliegens von neutralisierenden Antikörpern gegen IFN-β, welches Verfahren umfaßt:

A) Inberührungbringen einer Probe von Körperflüssigkeit aus dem Wirt, von welcher Flüssigkeit vermutet wird, daß sie diese neutralisierenden Antikörper enthält, mit einem Peptid mit der Formel:

X - AA&sub1; - Pro - Glu - Glu - AA&sub2; - AA&sub3; - Gln - AA&sub4; - Y,

Tyr-Cys-Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp;

Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala-Leu-Thr- Ile-Tyr;

AA&sub1; für Ile, Phe, Leu, Val, Arg, Tyr oder Norleu steht;

AA&sub2; für Ile, Leu, Arg, Val oder Norleu steht;

AA&sub3; für Lys, Ile, Leu, Arg, Val oder Norleu steht;

AA&sub4; für Leu, Phe, Tyr, Ile, Val, Arg oder Met steht;

B) Bestimmen des Ausmaßes der Bindung des Peptids an die in der Körperflüssigkeit enthaltenen neutralisierenden Antikörper, als Diagnostikum auf das Vorliegen von IFN-β-neutralisierenden Antikörpern in dem Wirt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin

AA&sub1; für Ile steht;

AA&sub2; für Ile steht;

AA&sub3; für Lys steht und

AA&sub4; für Leu steht.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin

X für NH&sub2; steht und

Y für Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala steht.

16. Verfahren nach Anspruch 14, worin

X für Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp steht und

Y für COOH steht.

17. Verfahren nach Anspruch 14, worin

X für Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp steht und

Y für Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala steht.

18. Verfahren zum Detektieren von IFN-β, welches Verfahren umfaßt:

A) Inberührungbringen einer Probe von Körperflüssigkeit aus dem Wirt mit Antikörpern, die gegen Peptide mit der folgenden Aminosäuresequenz

X - AA&sub1; - Pro - Glu - Glu - AA&sub2; - AA&sub3; - Gln - AA&sub4; - Y

gebildet sind und Bindungsaffinität für diese Peptide aufweisen, in welcher Aminosäuresequenz X für NH&sub2; oder eine Aminosäuresequenz von bis zu 10 Aminosäuren Länge steht, in Sequenz ausgewählt aus der folgenden Sequenz:

Tyr-Cys-Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp;

Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala-Leu-Thr-Ile-Tyr;

AA&sub1; für Ile, Phe, Leu, Val, Arg, Tyr oder Norleu steht;

AA&sub2; für Ile, Leu, Arg, Val oder Norleu steht;

AA&sub3; für Lys, Ile, Leu, Arg, Val oder Norleu steht;

AA&sub4; für Leu, Phe, Tyr, Ile, Val, Arg oder Met steht;

B) Bestimmen des Ausmaßes der Bindung dieser Antikörper an IFN-β als Diagnostikum für das Vorliegen von IFN-β.

19. Verfahren nach Anspruch 18, worin

AA&sub1; für Ile steht;

AA&sub2; für Ile steht;

AA&sub3; für Lys steht und

AA&sub4; für Leu steht.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin

X für NH&sub2; steht und

Y für Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala steht.

21. Verfahren nach Anspruch 19, worin

X für Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp steht und

Y für COOH steht.

22. Verfahren nach Anspruch 19, worin

X für Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp und

Y für Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala steht.

23. Eine wirksame Menge eines Peptids nach Anspruch 1 zur Verwendung in der Verhütung einer Neutralisation von IFN-β-Aktivität in einem Wirt.

24. Eine wirksame Menge eines Peptids nach Anspruch 3 zur Verwendung in der Verhütung einer Neutralisation von IFN-β-Aktivität in einem Wirt.

25. Therapeutisch wirksame Menge eines Peptids nach Anspruch 1 zur Verwendung in der Behandlung einer Person mit vermindertem Gehalt an aktivem IFN-β infolge einer Immunantwort hierauf.

26. Therapeutisch wirksame Menge eines Peptids nach Anspruch 3 zur Verwendung in der Behandlung einer Person mit vermindertem Gehalt an aktivem IFN-β infolge einer Immunantwort hierauf.

27. Therapeutisch wirksame Menge eines Peptids nach Anspruch 4 zur Verwendung in der Behandlung einer Person mit vermindertem Gehalt an aktivem IFN-β infolge einer Immunantwort hierauf.

28. Therapeutisch wirksame Menge eines Peptids nach Anspruch 5 zur Verwendung in der Behandlung einer Person mit vermindertem Gehalt an aktivem IFN-β infolge einer Immunantwort hierauf.

29. Therapeutisch wirksame Menge eines Peptids nach Anspruch 6 zur Verwendung in der Behandlung einer Person mit vermindertem Gehalt an aktivem IFN-β infolge einer Immunantwort hierauf.

30. Diagnosekit, umfassend:

A) ein Peptid mit spezifischer Bindungsaffinität für IFN-β- neutralisierende Antikörper, mit der folgenden Aminosäuresequenz:

X - AA&sub1; - Pro - Glu - Glu - AA&sub2; - AA&sub3; - Gln - AA&sub4; - Y,

Tyr-Cys-Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp;

Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala-Leu-Thr-Ile-Tyr;

AA&sub1; für Ile, Phe, Leu, Val, Arg, Tyr oder Norleu steht;

AA&sub2; für Ile, Leu, Arg, Val oder Norleu steht;

AA&sub3; für Lys, Ile, Leu, Arg, Val oder Norleu steht;

AA&sub4; für Leu, Phe, Tyr, Ile, Val, Arg oder Met steht;

B) ein eine Immunreaktion detektierendes Reagens.