DE3855471T2 - Oligopeptide und ihre Anwendung zu Diagnose- und Impfzwecken für AIDS und ARC - Google Patents
Oligopeptide und ihre Anwendung zu Diagnose- und Impfzwecken für AIDS und ARCInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft Oligopeptide, die für die Diagnose von und die Impfung gegen AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrom - Erworbene Immunschwäche) und ARC (AIDS-Related Complex - der AIDS-verwandte Formenkreis) geeignet sind, und zusätzlich zu diesen neuen Oligopeptiden selbst deren Verwendung zu Diagnosezwecken und Impfzubereitungen, die die neuen Oligopeptide enthalten.
- Es ist bekannt, daß AIDS und ARC durch Retroviren verursacht werden und daß es viele Varianten dieser Viren gibt. Für den Virus werden verschiedenste Namen verwendet wie HTLV- III (human T lymphotrophic virus type III - humaner T-lymphothropher Virus vom Typ III), HIV (Human Immunodeficiency Virus - Humanimmunschwächevirus), LAV (lymphadenopathyassociated virus - der mit der Lymphadenopathie assozijerte Virus) und ARV (AIDS-associated retrovirus - AIDS begleitender Retrovirus). Es hat sich herausgestellt, daß viele Patienten mit AIDS oder ARC spezifische Antikörper gegen Proteine des Virus, insbesondere gegen antigene Determinanten auf dem Hüllglykoprotein gp120 bilden. Der Virus erwies sich jedoch offensichtlich dazu befähigt, dem Virus neutralisierenden Effekt der Antikörper zu entgehen, indem er bestimmte Teile des gp120 veändert. Im Hüllprotein gp120 konnten 5 Zonen gefunden werden, die große Abweichungen der Aminosäuresequenz zwischen den einzelnen Virusvarianten aufweisen. Was diese Abweichungen angeht, wird auf "Human Retroviruses and AIDS, A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences", Hrsg.: Myers, Josephs, Rabson, Smith (1987) verwiesen.
- Nach der Infektion mit dem AIDS-Virus entwickeln Menschen und auch im Experiment infizierte Schimpansen Antikörper gegen das Protein gp120 der Außenhülle. Diese Antikörper lassen sich kurz nach der Infektion nachweisen und bleiben unabhängig von der klinischen Situation im Blut vorhanden. Den Prototyp des AIDS-Virus HTLV-III neutralisierende Antikörper, die mit Hilfe eines Inhibitonstests der CD-4 abhängigen Zellfüsion gemessen werden, treten bis zu einem späteren Stadium nicht auf. Personen, die diese Virus neutralisierenden Antikörper entwickeln, scheinen für längere Dauer gesund zu bleiben als Personen, die dies in geringerem Maße tun. Die Erkennung eines Teil des gp120 durch Immunglobuline des Menschen geht mit der Kapazität solcher Seren, den Virus zu neutralisieren, einher. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, daß gegen das rekombinante Protein PBI (DNS-Sequenz des PvuII - 2d BglII-Restriktionsorte) gerichtete Ziegenseren das homologe Virus neutralisieren (Putney et al., Science 234, (1986) 1392-1396) und daß Mäuseseren gegen zwei in diesem rekombinanten Protein angeordnete synthetische Peptide (die Aminosäuren 458 - 484 / 503 - 532 und 298 - 314) ebenfalls eine Virus neutralisierende Aktivität aufweisen (Ho et al., J.Virol. 61 (1987) 2024 - 2028). Es sind jedoch keine Oligopeptide des gp120 beschrieben worden, die im natürlichen oder experimentellen Wirt (Mensch und Schimpanse) immunogen wirken und die eventuell mit einer möglichen Induktion der Virusneutralisation assoziiert sind. Die Kenntnis solcher kurzer Aminosäuresequenzen ist für die Entwicklung von Diagnostika und Impfstoffen von Bedeutung.
- In J.Virol 61(2), Feb.1987, S.570 - 578, geben Modrow et al. die Position potentiell antigener Orte auf den Proteinen gp120 und gp41 an, wie sie sich aus der Computeranalyse vorhersagen lassen. Das Ergebnis der Computeranalyse, die beruhend auf Werten der Hydrophobizität, Flexibilität, Oberflächenwahrscheinlichkeit und Glykosylierung eine Proteinsekundärstruktur voraussagt, zeigt insgesamt 11 potentiell antigene Orte, 9 beim gp120 und 2 beim gp41. Bei einem der 9 potentiell antigenen Orte des gp120 handelt es sich um das Epitop IV in der V3-Region. Dieses Epitop umfaßt die Aminosäuren 300 bis 320 (Numerierung des Isolats WMJ1).
- Würde man annehmen, daß diese Epitopdaten Oligopeptide nahelegen, wiesen diese eine Länge von 21 oder 22 Aminosäure auf (das Epitop IV umfaßt die Aminosäuren 300 - 321 im BH10, d.h. 22 Aminosäuren). Darüber hinaus läge die β-Turnsequenz GPGR in den von Modrow et al. nahegelegten, auf dem Epitop IV beruhenden Oligopeptiden sehr dicht an einem Ende (das rechte Ende des Epitops ist GPGRA).
- Modrow et al. sagen lediglich Antikörper-Bindungsstellen (Epitope) auf gp120 und gp41 vorher. Sie zeigen nicht, welche Epitope bei der Induktion oder der Bindung von Virus neutralisierenden Antikörpern und bei schützenden Immunantworten eine Rolle spielen.
- Die internationale Patentanmeldung WO 87/02775 offenbart auf der Aminosäuresequenz der 9p41- und gp120 Untereinheiten des gp160 Hüllenglycoproteins des HIV-Virus beruhende Oligopeptide. Die Peptide basieren auf Ergebnissen eines Computermodells der Strukturen der Untereinheiten gp120 und gp41. Auf Basis dieses Computermodells wurden sechs Sequenzen für die Herstellung synthetischer Peptide ausgewählt. Diese Peptide wurde zur Herstellung von Antikörpern verwendet, die native, mit dem HIV-Virus assozijerte Proteine erkennen können.
- Nur eines der sechs dargestellten Peptide (Peptid Nr.2) beruht auf der V3-Region von gp120. Dieses Peptid weist die folgende Aminosäuresequenz auf (unter Verwendung des Einbuchstabencodes): TRPNNNTRKSIRIQRGPG. Das Peptid ist 18 Aminosäure lang und die β-Turnsequenz liegt am Ende (bei den letzten drei Aminosäure handelt es sich um Gly - Pro - Gly, d.h. GPG).
- Es wird nicht gezeigt, welche Peptide, falls überhaupt, Antikörper induzieren, die die viralen verursachenden Elemente von AIDS und ARC neutralisieren können und tatsächlich weist keines von ihnen die Eigenschaft auf, neutralisierende Antikörper zu induzieren.
- Die internationale Anmeldung WO 86/02383 offenbart Hüllantigene des mit der Lymphadenopathie assoziierten Virus (LAV), die ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 110.000 und spezifische, davon abgeleitete Peptide einschließen. Eines diese Peptide ist von den Aminosäure 300 - 327 des Glycoproteins abgeleitet und besteht aus der Aminosäuresequenz (unter Verwendung des Einbuchstabencodes): INCTRPNNNTRKSIRIQRGPGR. Es besteht aus 28 Aminosäureresten und weist die β-Turnsequenz am Ende auf.
- Unter Verwendung des PEPSCAN-Verfahrens von Geysen et al. (Proc.Nafl.Acad.Sci. USA 81 (1984) 3998 - 4002, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82 (1985) 178 - 182; "Synthetic peptides as antigenes" 1986, S.130 - 149, Wiley; WO 84/03506 und WO 84/03564) sowie von polyklonalen Seren HIV-infizierter Menschen und Schimpanzen haben wir nun die Sequenz 305 - 321 (in der Aminosäurenumerierung des HTLV IIIB (BH10)) auf dem gp120 des Virus in der variablen Region V&sub3; lokalisiert. Es wurde gefünden, daß es sich bei dieser Sequenz um ein immunodominantes Epitop zum Neutralisieren der Antikörper von infizierten Menschen und Schimpansen also der natürlichen Wirte handelt und daß diese durch eine bestimmte Virusvariante wie der BH 10- Variante erzeugten Antikörper mit der BH10-Sequenz 305 - 321 reagieren, nicht jedoch mit den entsprechenden Sequenzen anderer Varianten wie der RF-Variante, und vice versa.
- Die angesprochene Sequenz umfaßt die Aminosäuresequenz GPG oder GPGR, die für einen β-Turn in der Proteinstruktur verantwortlich zeichnet. Diese β-Turnsequenz ist flir die Proteinstruktur notwendig und demzufolge hoch konserviert; anbetracht der Tatsache, daß beispielsweise für BH10 spezifische Seren nicht mit z.B. RF reagieren und umgekehrt, ist sie jedoch nicht für die Immunogenität verantwortlich; Kreuzreaktionen treten nicht auf. Die spezifische Immunogenität beruht daher offensichtlich auf den flankierenden Aminosäuresequenzen.
- Erfindungsgemäß wird diese Erkenntnis eingesetzt, indem Oligopeptide bereitgestellt werden, die aus 8 - 17 Aminosäuren mit einer Sequenz bestehen, die der in der variablen Region V&sub3; des Hüllproteins gp120 eines AIDS- oder ARC-verursachenden oder -verwandten Virus auftretenden Sequenz entspricht, welche die Aminosäuresequenz GPG oder GPGR des β-Turns in den Positionen 312 - 314 bzw. 312 - 315 in der Aminosäurenumerierung von HTLV-IIIB (BH10) sowie flankierende Aminosäuresequenzen in der Länge von mindestens einer Aminosäure und vorzugsweise von mindestens 2 Aminosäuren umfaßt, sowie Varianten, in denen die GPG- oder GPGR-Sequenz durch eine andere β-Turnsequenz ersetzt worden ist, und Varianten, in denen die freie Aminogruppe der aminoterminalen Aminosäure und/oder die freie Carboxylgruppe der carboxyterminalen Aminosäure blockiert oder anders modifiziert worden ist.
- Diese Oligopeptide können für diagnostische Zwecke eingesetzt werden, insbesondere zum Nachweis einer Infektion mittels einer Körperflüssigkeit wie dem Serum von Säugern wie dem Menschen oder Schimpansen mit einem AIDS- oder ARC-verursachenden oder verwandten Virus und zum Nachweis der Variante oder der Varianten des Virus, mit dem der Säuger infiziert ist bzw. die sich im Verlauf der Infektion gebildet haben, unter Anwendung ansich zum Nachweis der Bindung eines in der getesteten Probe anwesenden Antikörpers an das Oligopeptid bekannter Verfahren. Außerdem können die neuen erfindungsgemäße Oligopeptide zur Herstellung von Impfzubereitungen gegen die AIDS- oder ARC-verursachenden oder verwandten Viren verwendet werden.
- In der Beschreibung werden die Aminosäuren entsprechend dem Einbuchstabencode bezeichnet, d.h. G steht beispielsweise für Glycin, P für Prolin und R für Arginin usw..
- Als β-Turn ist die Sequenz GPG oder GPGR nur für die Proteinstruktur und nicht für die spezifische Immunogenität von Bedeutung; die erfindungsgemäßen Oligopeptide können anstelle der natürlichen Sequenz GPG oder GPGR eine andere β-Turnsequenz enthalten. Beispiele für andere β-Turnsequenzen sind GLGQ und GLGK, die im gp120 verschiedener afrikanischer HIV-1- Stämme auftreten. Derartige Varianten sind daher von der Erfindung umfaßt.
- Im Hinblick auf die beabsichtigten Verwendungen kann es außerdem wünschenswert sein, daß die terminalen Aminosäuren modifiziert sind. Möglichkeiten stellen in diesem Zusammenhang das Blockieren der terminalen freien Amino- und Carboxylgruppen oder die anderweitige chemische Modifikation dieser Gruppen dar. Zum Beispiel kann die freie Aminogruppe der aminoterminalen Aminosäure acetyliert und die freie Carboxylgruppe der carboxyterminalen Aminosäure amidiert werden. Derartige Varianten werden dementsprechend von der Erfindung umfaßt.
- Die erfindungsgemäßen Oligopeptide haben eine Länge von 8 - 17 Aminosäuren, vorzugsweise 9 - 15 und am meisten bevorzugt 10-13 Aminosäuren. Die β-Turnsequenz wird von Aminosäuresequenzen mit einer Länge von je mindestens einer und vorzugsweise je mindestens zwei Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 3 Aminosäuren und am meisten bevorzugt mindestens 4 Aminosäuren flankiert.
- Beispiele für die erfindungsgemäßen Oligopeptide mit 17 Aminosäuren sind:
- Beispiele für kürzere erfindungsgemäße Oligopeptide sind:
- Verfahren zur Herstellung von Oligopeptiden sind allgemein bekannt, so daß ihre Herstellung hier nicht im Detail beschrieben werden soll.
- Die neuen erfindungsgemääßen Oligopeptide können zu diagnostischen Zwecken eingesetzt werden. Eine Möglichkeit besteht insbesondere in der Untersuchung von infizierten Human- oder Schimpansenseren mittels eines Sets von erfindungsgemäßen Oligopeptiden, um zu bestimmen, welche Virusvariante die Infektion verursacht hat und/oder welche neuen Varianten sich im Verlauf der Infektion gebildet haben. Ein Einblick in diese Dinge ist von diagnostischem, pprognostischem und therapeutischem Interesse. Für solche Untersuchungen geeignete Verfahren sind bekannt. Beispielsweise lassen sich hier ELISA's, RIPA's, dot-blots usw. anführen. Gemäß einem konkreteren Beispiel kann das Serum eines infizierten Patienten mit einem Nitrocellulosestreifen in Kontakt gebracht werden, auf dem verschiedene erfindungsgemäße Oligopeptide angeordnet wurden. Durch Waschen, Zugabe eines an Peroxidase gekoppelten Antihuman-Ig-Antikörpers, erneutes Waschen und die Zugabe von Peroxidasesubstrat läßt sich eine Farbbildung an der Stelle desjenigen Oligopeptids erhalten, mit dem der in der Probe vorhandene Antikörper reagiert.
- Die erfindungsgemäßen neuen Oligopeptide eröffnen auch die Möglichkeit für Impfstoffe gegen AIDS und ARC, insbesondere für multivalente Impfstoffe oder Impfstoffcocktails, die gegen eine Vielzahl von Virusvarianten gerichtet sind. Die erfindungsgemäßen Impfstoffzubereitungen enthaltenen ein oder (vorzugsweise) eine Vielzahl von erfindungsgemäßen Oligopeptiden zusammen mit einem oder einer Vielzahl von für Impfzwecke geeigneten Träger- und/oder Hilfsstoffen. Zu Impfzwecken geeignete Träger und Hilfsstoffe sind ansich bekannt. Beispielsweise sei die Möglichkeit angeführt, die Oligopeptide mit Hilfe eines geeigneten Kupplungsmittels an KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin - Nacktschneckenhämocyanin) oder BSA (Bovin Serum Albumin - Rinderserumalbumin) zu kuppeln. Toxine und Liposomen stellen ebenfalls geeignete Träger dar wie auch Poly-L-lysin, Poly-L-glutarsäure, Muramyldipeptid, Murabutidin usw.. Geeignete Hilfsstoffe (Adjuvanzien) sind z.B. Aluminiumhydroxid und andere Adjuvanzien. Für die Verabreichung des Impfstoffs geeignete Verdünnungsmittel wie destilliertes Wasser, phosphatgepufferte Kochsalzlösung und Pufferlösungen (wie Citratpuffer) sind ebenfalls als solche bekannt.
- Die spezifischen Eigenschaften der erfindungsgemaßen Oligopeptide und so deren besondere Eignung für die Verwendung zu obigen Anwendung sind durch die Ergebnisse einer großen Zahl von Experimenten bestätigt worden. So wurde bei einer Untersuchung monoklonaler Antikörper, von denen nachgewiesen wurde, daß sie den HIV-1-Stamm HTLV-IIIB neutralisieren, gefunden, daß alle untersuchten Antikörper die erfindungsgmäßen Oligopeptide binden. Ein monoklonaler Antikörper mit einer guten Fähigkeit zur Virusneutralisation band ein Oktapeptid IQRGPGRA und ein anderer monoklonaler Antikörper mit ausgeprägtem Virusneutralisationsvermögen band das Oktapepitd QRGPGRAF.
- In einer Untersuchung banden beispielsweise polyklonale Antikörper, die in einer Immunantwort der Ziege gegen im Baculovirus exprimiertes rekombinantes gp160 von HTLV-IIIB und HTLV-IIIRF erzeugt worden waren, am stärksten das Nonapeptid ITKGPGRVI der V&sub3;-Region von HTLV-IIIRF, wogegen sie das entsprechende Nonapeptid IQRGPGRAF von HTLV-IIIB nicht banden.
- Vergleichbare Ergebnisse wurden mit polyklonalen Antikörpern erzielt, die in einem Kahinchen als Reaktion auf den carboxyterminalen Teil von in E.Coli exprimiertem gp120 erzeugt worden waren. Es stellte sich heraus, daß alle den homologen Stamm neutralisierenden polyklonalen Antikörper ein erfindungsgemäßes Oligopeptid banden.
- Zusammengenommen rechtfertigen alle diese Untersuchungen den Rückschluß, daß Antikörper, die über die Immunisierung von z.B. Mäusen, Kaninchen und Ziegen mit jeder Art von potentiellen, vom HIV-1-Hüllproteinvorläufer gp160 oder vom externen Hüllprotein gp120 abgeleiteten Impfprodukten erzeugt wurden und die in vitro eine Stamm-spezifische Neutralisation von HIV-1 zeigen, immer um die β-Turnsequenz herum, d.h. an ein erfindungsgemäßes Oligopeptid binden. Auch die neutralisierenden Seren von Schimpanse und Mensch binden im fraglichen Bereich, wie ebenfalls mit Hilfe von Experimenten nachgewiesen wurde.
- Die Experimente wurden nicht nur mit Okta- und Nonapeptiden ausgeführt, sondern beispielsweise auch mit dem 17 Aminosäuren langen HTLV-IIIB-Oligopeptid KSIRIQRGPGRAFVTIG, das von die Zellfusion inhibierenden und zellfreien Virus neutralisierenden Humanseren gebunden wurde; es band auch an Ziegenantikörper gegen gp120 und gegen den carboxyterminalen Teil des gp120, die neutralisierend wirkten und die Zellfusion inhibieren konnten. Kaninchenantikörper gegen dieses Oligopeptid banden an das HTLV-IIIB gp120 und dessen Vorläufer gp160, wobei sie gleichzeitig HTLV-IIIB neutralisierten und die Zellfusion inhibierende Eigenschaften besaßen.
- Die durchgeführten Experimente betrafen nicht nur Oligopeptide verschiedener Länge, sondern auch Oligopeptide mit stark variierenden Aminosäuresequenzen, wie die Nonapeptide mit den folgenden Sequenzen:
- Die Kodierung in Klammern gibt die Virusstämme an, aus denen die Sequenzen abgeleitet wurden. Es zeigte sich, daß in Europa entnommene Seren besonders von europäischen Stämmen abgeleitete Nonapeptide erkannten, während von afrikanischen Stämmen (ELI, MAL, Z3 und Z6) und hawaijanischen Stämmen (RF) abgeleitete Peptide in geringerem Ausmaß erkannt wurden. In Afrika gesammlte Seren erkannten andererseits die von afrikanischen Stämmen abgeleiteten Peptide besser. Es erwies sich, daß jedes getestete Individuum ein anderes, individuelles Muster der Oligopeptiderkennung aufwies.
- Die Experimente bestätigten auch die Eignung der erfindungsgemäßen Peptide als Bestandteile von Impfstoffcocktails Tatsächlich erkannten scheinbar alle untersuchten Seren mindestens ein erfindungsgemäßes Oligopeptid. Durch die Bestimmung der Aminosäuresequenz des gp120 oder mindestens von dessen relevanten Teil in der V3-Region bei Mutanten des Virus, lassen sich wertvolle neue Komponenten derartiger Impfstoffcocktails maßschneidern. Obwohl die Länge der zu verwendenden Oligopeptide zwischen 8 oder 9 bis 17 Aminosäuren schwanken kann, wird man gewöhnlich eine Länge von etwa 12 Aminosäuren wählen, da diese Länge anscheinend ein Optimum der Spezifität sowie der Virus neutralisierenden Wirkung ergibt.
- Die Experimente bestätigen darüber hinaus die Eignung der erfindungsgemäßen Oligopeptide flir diagnostische Zwecke. Dementsprechend kann die Erfindung in Form von ELISA-Platten mit einer Reihe von darauf angeordneten erfindungsgemäßen Oligopeptiden angewandt werden, um die Verbreitung von HIV-Stämmen mit einer Variation im Neutralisationsepitop zu verfolgen, indem man die Reaktivität des Serums eines infizierten Individuums bestimmt. Die Erfindung kann auch in Form eines Sets von Antiseren gegen eine Reihe von erfindungsgemäßen Oligopeptiden angewandt werden, so daß die Viren mit Hilfe des RIPA typisiert werden können.
- Die Lösungsmittel und Reagenzien hatten pa-Qualität und wurden von Merck, Darmstadt Deutschland bezogen. Sie wurden ohne zusätzliche Reinigung eingesetzt; Dichlormethan wurde auf einer Säule aus aktiviertem Aluminiumoxid gereinigt. Boc-Aminosäuren, 4-Methylbenzhydrylamin-(MBHA)-Harz und Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorphosphat (BOP, Castro's Reagenz) wurden von Novabiochem, Laufelfingen, Schweiz, bezogen. Die Seitenkette des Arginins wurde mit einer Tosylgruppe geschützt. Die Umsetzungen erfolgten in einem Glasgefäß mit Glastritte in einem mechanischen Schüttler. Die Routineflüssigvolumina betrugen 7 ml.
- Die Aminosäureanalyse wurde mit einem Waters Pico-tag-Aminosäureanalysesystem, nach einstündiger Hydrolyse des Peptids in 1 % Phenol in 6 N HCl bei 150 ºC, durchgeführt. Die HPLC erfolgte auf einer analytischen Umkehrphasensäule (Polygosil 60-10C18, 250 x 4 mm) unter Verwendung eines Waters-HPLC-Systems, das aus einer Gradientenkontrolleinheit, Modell 680, zwei Pumpen des Modells 510 und einer automatischen Injektionseinheit (Modell WISP 712) bestand. Unter Verwendung eines aus Elutionsmittel A, 20 % Methanol/Wasser (Vol./Vol.) mit 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA), und Elutionsmittel B, 80 % Methanol/Wasser mit 0,1 % TFA, bestehenden Lösungsmittelsystems und einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/min wurde das Peptid unter Anwendung eines Spectroflow 757 Spektrophotometers bei 210 nm nachgewiesen.
- Nach 24-stündigem Quellen in DCM wurde das MBHA-Harz (1 % DVB, 0,5 mäÄq/mg, 600 mg) nacheinander mit DCM, 50 % TFA/DCM (Vol./Vol.), DCM, 7 % Diisopropylethylamin (DIEA/DCM Vol /Vol.) und Dimethylformamid gewaschen.
- Kupplungsverfahren: Zu dem in einer Mmimalmenge DMF suspendierten MBHA-Harz wurden 1 mMol Boc-Phe in 1 ml DMF zugegeben. Dann wurde das Boc (1 mMol in 1 ml DMF) direkt gefolgt von DIEA (3 nimol) zugefügt. Nach einer Stunde wurde das Harz nacheinander mit DMF (3 x 2 min), Isopropanol (3 x 2 min) und DCM (3 x 2 min) gewaschen. Die Vollständigkeit der Kupplung wurde mit Hilfe des Kaisertests untersucht (Anal. Biochem. 34, 1970, 594 - 598). War die Umsetzung unvollständig, wurde das Vorgehen wiederholt. War die Umsetzung vollständig, wurde die Boc-Gruppe durch Umsetzung des Harzes mit 50 % TFA/DCM (5 min), 50 % TFA/DCM (20 min) gefolgt von Waschen mit DCM (3 x 2 min), 7 % DIEA/DCM (3 x 4 min) und DMF (3 x 2 min) entfernt. Anschlißend wurde die nächste Boc-Aminosäure angekuppelt. Am Ende der Synthese wurde die N-terminale Aminogruppe mit Essigsäureanhydrid (1 ml in 3 ml DMF und 0,5 ml Triethylamin) für 30 Minuten acetyliert. Ausbeute: 908 ml. Entschützen: Ein Teil des Peptidharzes (523 mg) wurde mit 10 ml 10 % Anisol enthaltender wasserfreier HF eine Stunde lang bei 0 ºC behandelt. Nach Entfernen der HF im Vakuum wurde das rohe Reaktionsprodukt in 5 ml 10 %iger Essigsäure gelöst und die Fluoridionen auf einem Ionenaustauscherharz (BioRad AH 2-X8, 3 x 1 cm, Acetatform) entfernt. Das Produkt wurde aus 1 % Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 154 mg.
- Aminosäureanalyse; Glu 0.96; Gly 2,00; Arg 2,23; Ala 0,96; Pro 0,95; Ile 0,83; Phe 0,91. Reinheit gemäß HPLC: 70 %.
- Das aus den Aminosäuren 305 - 321 des Hüllproteins gp120 des Klons BH10 HTLV-IIIB bestehende Peptid KSIRIQRGPGRAFVTIG (Neu21) wurde gemäß der Merrifield-Festphasensynthese hergestellt.
- Die Anwesenheit von Antikörpern wurde unter Verwendung eines direkten, nicht-kompetitiven Festphasenimmunoassays bestimmt. Näpfe von Mikrotiterplatten wurden mit 0,1 mol/l NaH&sub2;PO&sub4; (pH 5,0) und 0,2 % (Vol./Vol.) Glutardialdehyd (Merck, Meppel, Niederlande) in einem Volumen von 100 µl pro Napf für vier Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Platten 3 mal je 10 Minuten mit 0,1 mol/l NaH&sub2;PO&sub4; (pH 5,0) gewaschen, Dann wurden 10 ng Peptid pro Napf mit 0,1 mol/l NaH&sub2;PO&sub4; (pH 8,0), 100 µl pro Napf, für sechzehn Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Überziehen wurden die Näpfe zehnmal mit PBS/ Tween- 20 (0,1 % Vol./Vol.) gewaschen. Nichtspezifische Bindungsstellen wurden durch einstündige Inkubation bei 37 ºC unter Anwendung eines 4 %igen normalen Ziegenserums (normal goat serum - NGS) in PBS - Tween-20 blockiert. Die zu testenden Seren wurde 1:100 mit PBS - Tween-20, 4 % NSG verdünnt und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurden mit Meerrettichperoxidase markierte Konjugate (Ziegen-Antihuman-IgG, KPL, Gaitersburg, Maryland, USA) zugegeben, die 1:500 in PBS - Tween-20 mit 4 % NGS verdünnt waren. Gebundene Antikörper wurden unter Verwendung von o-Phenylendiamin sichtbar gemacht und die Reaktion mit 1 N H&sub2;SO&sub4; abgestoppt. Die optische Dichte wurde über die Absorption bei 405 nm abgelesen.
- Die Schwankungen zwischen den einzelnen Tests wurde überwacht, indem man eine Verdünnungsreihe eines positiven menschlichen Kontrollserums auf jeder Platte mitlaufen ließ. Die mittlere optische Dichte von 149 HIV-1 seronegativen Proben plus viermal der Standardabweichung wurde als Ausschlußgrenze angesetzt.
Claims (9)
1. Oligopeptide aus 8 - 17 Aminosäuren mit einer Sequenz, die der in der variablen Region V&sub3;
des Hüllproteins gp120 eines AIDS- oder ARC-verursachenden oder -verwandten Virus
auftretenden Sequenz entspricht, welche die Aminosäuresequenz GPG oder GPGR des β-Turns
in den Positionen 312 - 314 bzw. 312 - 315 in der Aminosäurenumerierung von HTLV-IIIB
(BH10) sowie flankierende Aminosäuresequenzen in der Länge von mindestens einer
Aminosäure und vorzugsweise von mindestens 2 Aminosäuren umfaßt, sowie Varianten, in
denen die GPG- oder GPGR-Sequenz durch eine andere β-Turnsequenz ersetzt worden ist,
und Varianten, in denen die freie Aminogruppe der aminoterminalen Aminosäure und/oder die
freie Carboxylgruppe der carboxyterminalen Aminosäure blockiert oder anders modifiziert
worden ist.
2. Oligopeptide gemäß Anspruch 1 aus 9 bis 15 Aminosäuren.
3. Oligopeptide gemäß Anspruch 1 aus 10 bis 13 Aminosäuren.
4. Oligopeptide gemäß Anspruch 1, welche die β-Turnsequenzen GPG oder GPGR und
flankierende Aminosäuresequenzen in der Länge von mindestens 3 Aminosäuren enthalten.
5. Oligopeptide gemäß Anspruch 1, welche die β-Turnsequenzen GPG oder GPGR und
flankierende Aminosäuresequenzen in der Länge von mindestens 4 Aminosäuren enthalten.
6. Antikörper (monoklonale und polyklonale), die gegen ein Oligopeptid gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 5 gezogen wurden.
7. Verwendung von einem oder mehreren Oligopeptiden gemäß Anspruch 1 oder von einem oder
mehreren der gegen die Oligopeptide gemäß Anspruch 1 gezogenen Antikörper zum Nachweis
einer Infektion von Säugern wie dem Menschen oder Schimpansen mit einem AIDS- oder
ARC-verursachenden oder verwandten Virus mittels einer Körperflüssigkeit wie dem Serum
und zum Nachweis der Variante oder der Varianten des Virus, mit dem der Säuger infiziert
ist bzw. die sich im Verlauf der Infektion gebildet haben, unter Anwendung ansich zum
Nachweis der Bindung eines in der getesteten Probe anwesenden Antikörpers an das
Oligopeptid oder der Bindung des in der Probe vorhandenen gp120 an den Antikörper
bekannter Verfahren.
8. Impfzubereitung zum Schutz von Säugern wie dem Menschen oder Schimpansen gegen
AIDS- oder ARC-verursachende oder verwandte Viren, die eine oder mehrere der Oligopeptide
gemäß Anspruch 1 und eine oder mehrere für die Zwecke der Impfung geeignete Träger
und/oder Hilfsstoffe enthält.
9. Diagnositzierhilfe zur Verwendung beirn Testen auf HIV-Kontaminationen und/oder zum
Typisierung von AIDS- oder ARC-verursachenden oder verwandten Viren, die ein oder
mehrere Oligopeptide gemäß Anspruch 1 oder ein oder mehrere gegen die Oligopeptide
gemäß Anspruch 1 induzierte Antikörper enthält.
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