JPH03501968A - オリゴペプチド、及びａｉｄｓまたはａｒｃの診断及びワクチン接種を目的としたそれらの用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

オリゴペプチド、及びＡＩＤＳまたはＪＲＣの診断及びワクチン接種を目的とし たそれらの用途本発明はエイズ（ＡＩＤＳ）（後天性免疫不全症症候群）及びア ーク（ＡＲＣ）　（エイズ関連症候群）の診断及びそれらに対するワクチン接種 における使用に適したオリゴペプチドに関するものである０本発明はまた、その 新規オリゴペプチド自身に加え、ワクチン接種組成物に関するものである。 ＡＩＤＳやＡＲＣがレトロウィルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）によって引き起こ されること、及びそのウィルスに多くの変異体のあることはよく知られている。 例えば、ＨＴＬＶ−ｍ　［ｈｕ＊ａｎ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏ−ｔｒｏｐｈｉｃ　ｖ ｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　ｍ（ヒトＴリンパ球好性つィルス■型月、ＨＩＶ　（ｈｕ ＋＊ａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　（ヒト免疫不全ウ ィルス）】、ＬＡＶ（ｌｙ餓ｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ 　ｖｉｒｕｓ（リンパ筋腫症候群）］及びＡＲＶ（ＡＩＤＳ−ａｓｓｏｃｉａｔ ｅｄ　ｒｅｃｒｏｖｉｒｕｓ　（ｘイズ関連ウィルス）〕などの種々の名がその ウィルスに対して用いられている。ＡＩＤＳまたはＡＲＣの患者の多くは、この ウィルスのタンパクに対して特異的抗体を形成している、特に、エンベロープ糖 蛋白（ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）　ｇ　ｐ＋２０上に局在 する抗原決定基に対する特異的抗体を形成していることが見出されている。しか し、このウィルスは、ｇｐ１２０のある部分を変化させることによって抗体のウ ィルス中和作用を回避できることが明らかになっている。エンベロープ蛋白ｇｐ １２０において、種々のウィルス変異体間でアミノ酸配列の著しい変異を示す５ つの領域が明らかにされている。これらの変異に関しては、「ヒト　レトロウィ ルスとＡＩＤＳ、核酸及びアミノ酸配列の編集と分析Ｊ（Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒ ｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　ＡＩＤＳ、　Ａ　Ｃｏｍｐｉ−Ｉａｔｉｏｎ　ａｎ ｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏＣＮｕｃｌｅｉｃ　ｆｉｃｉｄ　ａｎｄ　Ａｍ１ｎｏ 　Ａｃ１ｄＳｅｑｕｅｎｃｅｓ）、編集者マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）、ジョセフ ス（Ｊｏｓｅｐｈｓ）、ラブソン（Ｒａｂｓｏｎ）、スミス（Ｓｗｉｔｈ）　（ ＋９８７）に言及されている。 ＡＩＤＳウィルスに感染した後、ヒト及び実験的に感染させたチンパンジーも外 皮蛋白（ｅＸｔｅｒｉｏｒ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）ｇｐ１２０に 対する抗体を生じる。これらの抗体は感染後すぐに現われ、臨床症状に関係なく 循環し続ける。ＣＤ４−依存性細胞融合抑制試験（ＣＤ４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ 　ｃｅｌｌ　ｆｕｓｉｏｎ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ）や旧Ｖ複製抑制 試験（ｔ（ＩＶ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏＩ！１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ） によって測定すると、始原性ＡＩＤＳウィルス１（ＴＬＶ−ｍを中和する抗体は 、ずっと後まで生じない。これらのウィルス中和抗体が生じている人は、その抗 体の生じる度合の小さい人に比べ長い期間健康のままである。ヒトの免疫グロブ リンにょるｇｐ１２０の部分のｉＩｇ識は、このような血清のウィルス中和能力 に関連している。これに関連して、組換えタンパクＰＢｌ　（ＤＮＡ配列Ｐｖｕ 　Ｕ　−２ｄ　Ｂｇｌ　ＩＩ制限部位）に対するヤギの血清が、相同ウィルスを 中和すること〔ブトニイー等（Ｐｕｔｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、）　：サイエンス（ Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３４、（１９８６）　１３９２−１３９６）　、及びこの 組換えタンパク中に局在する２つの合成ペプチド（アミノ酸４５８−４８４１５ ０３−５３２と２９８−３１４）に対するマウスの血清もまた、ウィルス中和活 性を有している〔ホウ等（Ｈａ　ｅｔ　ａｌ、）　：ジェ、パイロル（Ｊ、Ｖｉ ｒｏｌ）６１（＋９８７）２０２４−２０２８）ことが明らかにされている。 しかし、自然あるいは実験上の宿主（ヒト及びチンパンジー）において免疫原性 を有しておりウィルス中和の誘導との関連性が明らかでないところのｇｐ１２０ のオリゴペプチドはこれまでどの文献にも記載されていない、このような短いア ミノ酸配列を知ることは、診断用薬及びワクチンの開発にとって興味あることで ある。 ジェイスン（Ｇｅｙｓｅｎ）らのペプスカン（ＰＥＰＳＣＡＭ）法（プロシーデ イングスナショナルアカデミックサイエンスユーエスｘ−（Ｐｒａｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、８１、（１９８４）、３９９８−４００２；（ プロシーディングスナショナルアカデミックサイエンスユーエスエー（Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、８２、（１９８５）、＋７８−１８ ２　；　“抗原としての合成ペプチド”　〔“５ｙｎｔｅｈＬｉｃｐｅｐｔｉｄ ｅｓ　ａｓ　ａｎｔｉｇｅｎｓ″）、１９８６、＋３０−１４９、ウィリイー（ Ｗｉｌｅｙ）　；　ＷＯ３４１０３５０６及びｌＩ！０８４１０３５６４）、及 び［Ｖ感染ヒト及びチンパンジーのポリクロナール血清を用いて、本発明者らは 、アミノ酸配列第３０５−３２１番［ＨＴＬＶ−１１１８（ＢＨＩＯ）　（７） 　７　ミ／　階番号〕をウィルスのｇｐ１２０における可変領域Ｖ、において位 置づけた。この配列が、感染したヒトやチンパンジー、すなゎち、自然の宿主の 抗体を中和するための免疫決定基であること、及びＩＩＩＩＩＯ変異体などのウ ィルスの成る変異体によって生じる抗体は、Ｂｌ＋ＩＯのアミノ酸配列第３０５ −３２１番と反応するが、ＲＦ変異体などの他の変異体の対応するアミノ酸配列 とは反応しないこと、また逆の場合もそうであることが知見された。 このアミノ酸配列は、タンパク構造におけるβターンの原因となるアミノ酸配列 ＧＰＧあるいはＧＰＧＲを含有する。このβターン配列はタンパク構造に必要で あり、それ故、高度に保護されているが、しかし、例えばＢＨＩＯに対して特異 的な血清は例えばＲＦと反応しないしまたこの逆の場合もそうであり、かつ交差 反応が起こらないという事実を考慮すると、βターンは免疫原性の原因にはなら ない。それ故、上記の特異的免８２原性が隣接するアミノ酸配列によって生じて いることは明らかである。 この知見に基づき、本発明は、ＡＩＤＳやＡＲＣの原因ウィルスまたはその関係 ウィルスのエンベロープ蛋白であるｇｐ１２０における可変領域Ｖ、に生じる配 列に対応する配列中の８乃至１７個のアミノ酸から成るオリゴペプチドであって 、ＨＴＬＶ−Ｊｕｌ　Ｂ　（ＢＨｌｏ）のアミノ酸番号第３１２−３１４または ３１２−３１５番の位置にあるβターンアミノ酸配列ＧＰＧまたはＧＰＧＲ及び それに隣接する少なくとも１個の、好ましくは少なくとも２個のアミノ酸の長さ を有するアミノ酸配列を含有するオリゴペプチド；または異なったβターン配列 によってＧＰＧやＧＰＧＲ配列が置換されている該オリゴペプチドの変異体；あ るいは、アミノ末端アミノ酸の遊離アミノ基及び／又はカルボキシ末端アミノ酸 の遊離カルボキシル基がブロックされているか又は他の方法で修飾されている該 オリゴペプチドの変異体を提供するものである。 これらのオリゴペプチドは、検査試料中に存在する抗体とオリゴペプチドとの結 合を検出するための公知の方法によって、診断目的のために用いることができる 。特に、ヒトやチンパンジーなどの哺乳類の、例えば、血清などの体液によって 、ＡＩＤＳやＪＲＣの原因ウィルスまたはその間゛係つィルスとの感染を検査す るため、及び該補乳、類が感染した該ウィルスの変異体またはそ［の感染中に形 成された該ウィルスの変異体を検出するために用いることができる。また、本発 明の新規オリゴペプチドは、ＡＩＤＳやＡＲＣの原因ウィルスまたはその関係ウ ィルスに対して保護するためのワクチン製剤を調製するためにも用いることがで きる。 している０例えば、Ｇはグリシンを意味し、Ｐはプロリンを意味し、Ｒはアルギ ニンを意味する。 βターン配列ＧＰＧあるいはＧＰＧＲは、タンパク構造のために０み重要であっ て、特異的免、ｇ！５原性・にとりては重要でないので、本発明・のオリゴペプ チｊ）′１ま、自然配列のｉＧＦ”ＧやＣＦ’、Ｇ・Ｒとは異なったβターン配 列より成ると考えられる。他のβターン配列の例は、種々のアフリカ旧Ｖ−１株 のｇｐ１２０に存在するＧＬＧＱとＧＬ（Ｊである。それ故、このような変異体 も本発明に包含される。 本発明において意図した用途のためには、末端アミノ酸を修飾することが更に望 ましい。その可能性のあるやり方としては、末端の遊離アミノ基やカルボキシル 基をブロックするか、あるいはこれらの基を別の方法で化□学的に修飾すること である。例えば、アミノ末端アミノ酸の遊離アミノ基のアセチル化とカルボキシ 末端アミノ酸のカルボキシル基のアミド化である。それ故、この−ような変異体 もまた本発明に包含される。 本発明のオリゴペプチドは、８から１７個、好ましくは９から１５個、さらに好 ましくはＩＯから１３個のアミノ酸の長さを有する。βターン配列には、少なく とも１個、好ましくは少なくとも２個、さらに好ましくは少なくとも３個、特に 好ましくは少なくとも４個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列が隣接する。 本発明の１７個のアミノ酸より成るオリゴペプチドの例は、次の通りである。 ＫＳＩＲＪＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧ ＫＫＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧ ＶＲＫＳＩ丁１（ＧＰＧＲＶＩＹＡＴＧＩＳｑＳ’ｌ’Ｒ１℃ＰＧＩＥＷＹ、ｆ ｉ’に、ＧＶＲＲ５ＬＳＩＧＰＧＲＡＦＲＴＲＥ ＲＲＲＩＩＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＧＥＡＲＲＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＧＫ ＶＲＫＳＩＹＩＧＰＧＲＡＦＨＴＴＧ ＲＫＳＩＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧ これより短い本発明のオリゴペプチドの例は、次の通りである６ ＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧ ＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧ ＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴ ＩＴＫＧＰＧＲＶＩＹＡＴＧ ＩＴＫＧＰＧＲＶＩＹ ＩＴＫＧＰＧＲＶＩ ＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶ Ｉ　ＲＩ　ＱＲＧＰＧＲＡ　Ｆ ＴＫＧＰＧＲＶＩＹＡ 方法をここでは詳細には記述しない。 本発明の新規オリゴペプチドは診断用に用いることができる。特に、ひとつの可 能性は、ウィルスのどの変異体が感染を引き起こしたかを調べるため、及び／又 はどのような新しい変異体がその感染の間に形成されたかを調べるために本発明 の一組のオリゴペプチドを用いて、感染した人やチンパンジーの血清を検査する ことである。これについて洞察することは、診断上、予後上、及び治療上重要な ことである。このような検査に適した技術は公知である。例として、エリザ（Ｅ ＬＩＳＡ）、リバ（ＲＩＰＡ）、ドツト−プロット（ｄｏｔ−ｂｌｏｔｓ）等が 挙げられる。さらに具体的な例として、感染した人の血清を本発明の種々の異な ったオリゴペプチドを配設（ａｒｒａｎｇｅ）　Ｌｔたニトロセルロース片と接 触させることである。接触後、これを洗浄し、ペルオキシダーゼに結合した抗ｈ １ｇ抗体を加え、再洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を加えると、試料中に存在す る抗体とオリゴペプチドが反応して該オリゴペプチドの位置に発色が起きるので 、それにより検査する方法である。 本発明の新規オリゴペプチドはまた、ＡＩＤＳやＪＲＣに対するワクチン、特に 多価ワクチンあるいは複数のウィルス変異体に対するワクチン合剤の道を開くも のである。本発明のワクチン組成物は、本発明の一種または（好ましくは）複数 のオリゴペプチド、及びワクチン接種に適した１種または複数の担体及び／又は アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔｓ）を含有する。ワクチンに適した担体やアジ ュバントは公知である。例として、適当な結合剤によって、オリゴペプチドをＫ ＬＨ［キーホールリムペットヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｋ　Ｌｉ＋ｌ１ｐｅｔ　 Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ月やＢＳＡ

【ボバインセーラムアルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ 　Ｓｅｒｕｍ　Ａ１ｕｂｕ＋１ｉｎｅｌに結合する可能性が挙げられる。トキソ イド（Ｔｏｘｏｉｄｓ）やすボソーム（１ｉｐｏｓｏｍｅ）もまた適当な担体で あり、ポリーＬ−リジン（ｐｏｌｙ−Ｌ−１ｙｓｉｎｅ）、ポリ−Ｌ−グルタミ ン酸（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）、ムラミルジペプチド（ｍｕ ｒａｍｙｌ　ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）、ムラブチジン（ｍｕ　ｒａｂｕ　Ｌ　ｉ　 ｄ　ｉ　ｎｅ）等も適当な担体である。適当なアジュバントは、例えば、水酸化 アルミニウムあるいは他の公知のアジュバントである。蒸留水、リン酸緩衝生理 食塩水あるいは（クエン酸緩衝液などの）緩衝溶液などワクチンの投与に適した 希釈剤もまた公知である。 本発明のオリゴペプチドの特性、及び上記の用途に用いる場合の特有の適合性は 、多くの実験によって確かめられた。 例えば、ＨＩＶ−１株＋１ＴＬＶ−ＩＩＩ　Ｂを中和することが明らかにされて いるモノクロナール抗体の研究において、調べた抗体の全てが本発明のオリゴペ プチドに結合することが見出された。良好なウィルス中和能力を有するモノクロ ナール抗体が、オクタペプチドＩＱＲＧＰＧＲＡに結合することが見出されてい る。著しいウィルス中和能ツノを有するもう一つのモノクロナールもオクタペプ チドＱＲＧＰＧＲＡＦに結合することが見出されている。 バキュロウィルス（ｂａｃｕｌｏ　ｖｉｒｕｓ）中で発現されたＨＴＬＶ−ｍ　 ＢやＨＴＬＶ−ＩＩＩ　ＲＦの組換え体ｇｐ＋６０に応答してヤギで作られるポ リクロナール抗体の研究において、例えば、組換え体ｇｐ１６０１１１ＲＦに対 する抗血清が、ＩＩＴＬＶ−１１１ＲＦのＶ、領域に由来するノナペプチド１Ｔ ＫＧｒ’ＧＲＶＩに非常に強く結合することが見出された。 しかし、この抗血清はＩＩＴＬＶ−ＩＩＩ　［３の対応するノナペプチドＩＱＲ ＧＰＧＲＡＦには結合しなかった。同様の結果が、旦、Ｃｏ１１中で発現された ｇｐ＋２０のカルボキシ末端部位に応答してウサギで作られるポリクロナール抗 体について得られている。相同のウィルス株を中和するポリクロナール抗体のす べてが、本発明のオリゴペプチドに結合することが見出された。 共に行なわれたこれらの研究の全てが、ＨＩＶ刊エンベロープ前駆体ｇｐ１６０ またはエクスターナルエンベロープ（ｅｘｔｅｒ−ｎａｌ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ） 　ｇｐ１２０に由来するあらゆる種類の潜在的なワクチン生成物で、例えばマウ スやウサギやヤギを免疫化することによって得られ且つｉｎ　ｖｉｔｒｏで株特 異性のＩＩＩＶ−１中和作用を示す抗体が、いつも、βターン配列のまわりに結 合する、すなわち、本発明のオリゴペプチドに結合するという結論の正しさを証 明している。チンパンジーやヒトの中和作用を有する血清もまた当該領域に結合 することが実験によって確認されている。 実験はオクタペプチドやノナペプチドによってだけでなく、例えば、１７個のア ミノ酸の長いＨＴＬＶ−ＩＩＩ　ＢオリゴペプチドＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦ ＶＴＩＧによっても行なわれた、そのオリゴペプチドは、細胞融合を抑制し且つ 無細胞ウィルスを中和するヒトの血清に結合し、またｇｐ＋２０やｇｐ１２０の カルボキシ末端部分に対する抗体であって中和作用や細胞融合抑制作用能力を有 するヤギの抗体にも結合した。このオリゴペプチドに対するウサギ抗体は、ＨＴ ＬＶ−ｍ　Ｂ　ｇ　ｐ１２０及びソノ前駆体ｇｐ１６０Ｇ、：結合し、それらは また、ＨＴＬＶ−ＩＩ！　Ｂを中和し、細胞融合抑制特性を示した。 実施した実験に用いたオリゴペプチドには、種々の長さのオリゴペプチドだけで なく、極めて多種類のアミノ酸配列を有するオリゴペプチド、例えば、以下の配 列を有するノナペプチドなどのオリゴペプチドが含まれる。 ＩＱＲＧＰＧＲＡＦ（ＬＡＶ−１） ＩＩＧＰＧＲＡＦ（ＳＦ−２） ＩＴＫＧＰＧＲＶ　Ｉ　（ＲＦ） ＩＡＩＧＰＧＲＴＬ（ＮＹ−５） ＶＴＬＧＰＧＲＶＷ（ＣＤＣ−４） ＩＨＦＧＰＧＱＡＬ（Ｍ＾し） ＩＲＩＧＰＧＫＶＦ（Ｚ３） ＴＰＩＧＬＧＱＡＬ（Ｚ６） ＴＰＩＧＬＧＱＳＬ（ＥＬＩ） カッコの中のコードは、アミノ酸配列の由来するウィルスの株を示している。ヨ ーロッパで集められたヒト血清は、ヨーロッパ系株に由来するノナペプチドを特 に認識することが分かったが、アフリカ系株（ＥＬＩ、ＭＡＬ％Ｚ３、Ｚ６）や ハイチ系株（ＲＦ）に由来するペプチドは、はとんど認識されなかった。 一方、アフリカで集められた血清は、アフリカ系株に由来するペプチドをよく認 識した。調べた個体それぞれが、オリゴペプチドの認識止具なった個々のパター ンを持つことがわかつた・ 実験によって、本発明のオリゴペプチドのワクチン合剤の成分としての適合性も 確認された。事実、調べた血清のほとんどすべてが、本発明の少なくともひとつ のオリゴペプチドをｖ３識することがわかった。ウィルスの突然変異体のｇｐ１ ２０あるいはＶ、領域における少なくともそれに関連した部分のアミノ酸配列を 調べることによって、このようなワクチン合剤の貴重な新規成分をデザインする ことができる。使用されるオリゴペプチドの長さは８個あるいは９個から１７個 の範囲でアミノ酸まで変えることができるが、最良の特異性とウィルス中和活性 を与えるという理由から一般には約１２個のアミノ酸の長さが選ばれる。 実験によって、本発明のオリゴペプチドの診断を目的とした用途への適合性も確 認される。本発明では、本発明のオリゴペプチドのパネルを有するＥＬＩＳＡプ レートの形で用いることができ、それにより感染した個体の血清の反応性を調べ て種々の中和抗原決定基を有するＩＩＩＶ−系株の広がりを調べることができる ０本発明ではまた、本発明のオリゴペプチドのパネルに対する一組の抗血清の形 でも用いることができ、ＲＩＰＡによってウィルスの型を調べることができる。 流側１　アセチル−１ｉｅ−Ｇｉｎ−Ａｒ　−Ｇｌ　−Ｐｒｏ−Ｇｌ　−Ａｒ　 −Ａｌａ一点旦」馬！とＬ炙 溶媒と試薬は、準分析用（ｐｒｏ−ａｎａｌｙｓｅ　ｇｒａｄｅ）のものをメル ク（Ｍｅｒｃｋ）、ダルムスタッド（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）　、ジ−エフアール （ＧＦＲ）社から購入した。それらをさらに精製することなく用いたが、ジクロ ロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏ＋＊ｅｔｈａｎｅ）　（ＤＣＭ）は、活性酸化アル ミニウムのカラムによって精製した。ＢｏＣ−アミノ酸、４−メチルベンズヒド リルアミン（４−ｍｅＬｈｙｌｂｅｎｚｈｙｄｒｙｌａ＋ａｉｎｅ）（ＭＢＨＡ ）樹脂、及びベンゾトリアゾール−１−ｙｌ−オキシ−トリス（ジメチルアミノ ）−ホスホニウム−へキサフロロフォスフェート［ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ −１−ｙｌ−ｏｘｙ−ｔｒｉ　ｓ−（ｄ　１ＩＩｅＬｈｙ　ｌａｗ　ｉ　ｎｏ） 　−ｐｈｏｓ−ｐｈｏｎｉｕ＋１−ｈｅｘａ　ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ］　［ＢＯＰ、カスドロ試薬（ｃａｓｔｒｏ’ｓ　ｒｅａｇｅｎｔ））は、ノバ バイオケム（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）　Ｃラウフェルフインゲン（Ｌａｕｆｅ ｌｆｉｎｇｅｎ）、スイス］から購入した。 アルギニンの側鎖はトシル基（Ｔｏｓｙｌ　ｇｒｏｕｐ）によって保護されてい る０反応は、ガラス球と一緒にガラス容器内で自動振とう機にかけて行なった。 液態は７＋ｍ（ＩＩとした。 アミノ酸分析は、１２フエノール含有６規定塩酸中で１５０℃で１時間ペプチド を加水分解した後、ウォーターズビニータグアミノ酸分析システム（Ｗａｔｅｒ ｓ　Ｐｉｃｏ−ｔａｇ　ａ＋ａｉｎｏ　ａｃｉｄ　ａｎＰＬＣ）を、分析用逆相 カラム【ボリゴシル６Ｏ−１０ｃＩ８　（ｐｏｌｙ−ｇｏｓｉｌ　６Ｏ−１０Ｃ Ｉ８）、２５０Ｘ４ｍｎ＋）上で、６８０型グラジエント　コントローラー（ａ 　ｍｏｄｅｌ　６８０　ｇｒａｄｉｅｎｕ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）、２台の５ １０型ポンプ及び％１ＩＩＳＰ７１２型オートインジェクター（ａ　ｍｏｄｅｌ 　ＷＩＳＰ７１２　ａｕｔｏｍａｔｉｃ　１ｎｊｅｃｔｏｒ）より構成されてい るウォーターズのＨＰＬＣシステムを用いて行なった。溶離液Ａ、すなわち、０ ．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有２０％（Ｖ／Ｖ）メタノール水溶液と、 溶離液Ｂ、すなわち、０．１％ＴＦＡ含有８０％メタノール水溶液より成る溶媒 システムを使って、１ｒａＱ／分の流速で、スペクトロワローフ５フ分光光度肝 （Ｓ、ｐｅｃｔｒｏｆｌｏｗ　７５７　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ） を用いて２１０ｎ＋＋＋でペブチ゛ドを検出した。 ＤＣＭ中で２４時間膨張後、ＭＢ）ＩＡ樹脂（１％ＤＶＢ、　０．５＋＋ｅｑ／ ｑ、６００■）ヲＤＣＭ、５０％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ／ＤＣＭ、ＤＣＭ、７％（Ｖ ／Ｖ）ジイソプロピルエチルアミン（ｄｉ　１ｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａ＋ ｗｉｎｅ）　（ＤＩＥＡ）／ＤＣＭ、及びジメチルフォルムアミド（ｄｉ＋Ｉｌ ｅｔｈｙｌｆｏｒｍａ＋ｗｉｄｅ）　（ＤＭＦ）で順次洗浄した。 結合方法：小量のＤＭＦに懸濁させたＭＤＩＩＡ樹脂に、Ｉｙｎｒａｏ　Ｑ　Ｂ ｏａ−Ｐｈｅ含有ＤＭＦｂａ　Ｑを加えた。　ＢＯＰ（ＤＭＦ　ｌ　ｙａ　Ｑ中 １　ｉｍｏ　Ｑ　）を加え、その後直ぐにＤＩＥＡ（３ｎ＋ｍｏｌ　）を加えた 。１時間後、その樹脂を、ＤＩＥＡ（２分間、３回）、イソプロパツール（２分 間、３回）、及びＤＣＭ（２分間、３回）で順次洗浄した。結合の完了は、カイ ザーテスト（Ｋａｉｓｅｒ　ｔｅｓｔ）　（アナル、バイオケム、（＾ｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）３４．１９７０．５９４−５９８３で調べた。反応が完了し ていなければ、結合処理を繰り返した０反応が完了していれば、樹脂を５０％Ｔ ＦＡ／ＤＣＭ　（５分間）及び５０％ＴＦＡ／ＤＣＭ　（２０分間）と反応させ 、続いてＤＣＭ（２分間、３回）、７％ＤＩＥＡ／ＤＣＭ　（４分間、３回）及 びＤＭＦ（２分間、３回）で洗浄することによりＢｏＣ基を除去した。その後、 次のＢｏｃアミノ酸を結合した０合成の最後に、Ｎ末端アミノ基を無水酢酸ＣＤ Ｆ４Ｆ３ｍ　Ｑとトリエチルアミン０．５＋＋ＩＱに対してＩｍＱ含有する混合 液）で３０分間アセチル化した。収量は９０８ｔａ　Ｑであった。脱保護は次の ようにして行なった。すなわち、ペプチド樹脂（５２３■）の一部を１０％アニ ソール含有１０＋＋＋８無水ＨＦで１時間０℃で処理した。真空中でＩＩＦを除 去した後、その粗反応生成物をｌＯχ酢酸酢酸５仁Ｑ解し、フッ化物イオンをイ オン交換樹脂【バイオラッドＡＧ（ＢｉｏＲａｄ　ＡＧ）　２−Ｘ８．３％１ｃ ｍ、酢酸エステル体）Ｊでイオン交換した。その生成物を１％酢酸から凍結乾燥 した。収量は１５４１１１ｇであった。アミノ酸分析は次の通りである。すなわ ち、Ｇｌｕ　Ｏ，９６、ｃｘｙ　２．００、＾ｒｇ　２．２３、Ａｌａ　Ｏ，９ ６、Ｐｒｏ　Ｏ，９５、Ｔｉｅ　Ｏ，８３、Ｐｈｅ　Ｏ，９１，純度は、７０％ （ＨＰＬＣによる）である。 流側ＩＩ　Ｎｅｕ２１に対する抗体の検出クロー　：／ＢＨＩＯＨＴＬＶ−ｍ　 Ｂ（７）　：Ｉ−ンベローブｇｐ１２０（７）第３０５番かうｆＪ４３２ｒ番ノ アミ／　酸カラ成ルヘフチＦＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧ（Ｎｅｕ２１ ）をメリイフィルド固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　５ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）によって合成した。 抗体の存在は、直接非競合性固相免疫検定法（ｄｉｒｅｃｔ　ｎｏｎ−ｃｏｍｐ ｅｔｉｔｉｖｅ　５ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）で調べた 。マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅ）のウェルに 、Ｏ０Ｉｍｏｌ／　ｎ　ＮａＨ，ＰＯ，（ｐＨ５，０）と０．２％（Ｖ／Ｖ）グ ルタルジアルデヒド【メルク（Ｍｅｒｃｋ）、メプル（Ｍｅｐｐｅｌ）、オラン ダ）】をウェル１個あたり１００μａ入れ、室温で４時間インキュベートした０ 次に、そのプレートを０．Ｉｍｏｌ／　Ｑ　ＮａＨ，ＰＯ，（ｐＨ５，０）で１ ｏ分間３回すすいだ、その後、ウェル１個あたり＋００μＣの０．Ｉｍｏｌ／Ａ Ｎａ、　ＨＰＯ，（ｐ）１８．０）加え、穴１個あたり１０ｎｇのペプチドを１ ６時間室温でインキュベートした。コーティングの後、ウェルを１０回ＰＢＳ− ツインー２０　（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０）　（０，１＄ｖ／ｖ）で洗浄した 。 ４ｚ正常ヤギ血清（ＮＧＳ）含有ＰＢＳ−ツイン−２０で３７℃で１時間インキ ュベーションすることによって非特異的結合部位をブロックした。検査用血清を ４ＸＮＧＳ含有ＰＢＳ−ツイン−２０で１００倍希釈し、３７℃で１時間インキ ュベートした。もう一度洗浄した後、ホースラディツシュペルオキシダーゼ（ｈ ｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒ−ｏｘｉｄａｓｅ）でラベルした接合体〔ヤギ抗 ヒトＩｇＧ、　ＫＰＬ、ガイザルスブルク（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリ ーランド（Ｍｅｒｙｌａｎｄ）、米国〕を加え、４１ＮＧＳを含有するＰＢＳ− ツイン−２０で５００倍希釈した。結合した抗体をオフェニレンジアミン（ｏｐ ｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）によって視覚化し、反応は１規定硫酸を用い て停止させた。光学濃度は４５０　ｎｍの吸収で測定した。 アッセイ間の変動は、各プレート上に陽性ヒト対照血清の段階希釈物を用いるこ とによってコントロールした。１４９ＨＩＶ−１の血清陰性試料の平均光学濃度 にその標準偏差の４倍を加えたものをカットオフ値として用いた。 国際調査報告 ｍ−−ｅ−−＋　Ｊｖ＃ｍｈｍ　ｌｌｅ　？ＣＩ／；４Ｌ　ｌ！８１０００４０ 　−２−

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．ＡＩＤＳやＡＲＧの原因ウイルスまたはその関係ウイルスのエンベローブ蛋 白であるｇｐ１２０における可変領域Ｖ，に生じる配列に対応する配列中の８乃 至１７個のアミノ酸から成るオリゴペプチドであって、ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ（Ｂ Ｈ１０）のアミノ酸番号第３１２−３１４または３１２−３１５番の位置にある βターンアミノ酸配列ＧＰＧまたはＧＰＧＲ及びそれに隣接する少なくとも１個 の、好ましくは少なくとも２個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を含有す るオリゴペプチド；または異なったβターン配列によってＧＰＧやＧＰＧＲ配列 が置換されている該オリゴペプチドの変異体；あるいは、アミノ末端アミノ酸の 遊離アミノ基及び／又はカルボキシ末端アミノ酸の遊離カルボキシル基がブロッ クされているか又は他の方法で修飾されている該オリゴペプチドの変異体。
2. ２．９乃至１５個のアミノ酸から成る請求項１記載のオリゴペプチド。
3. ３．１０乃至１３個のアミノ酸から成る請求項１記載のオリゴペプチド。
4. ４．βターン配列ＧＰＧまたはＧＰＧＲと、それに隣接する少なくとも３個のア ミノ酸の長さを有するアミノ酸配列より成る請求項１記載のオリゴペプチド。
5. ５．βターン配列ＧＰＧまたはＧＰＧＲと、それに隣接する少なくとも４個のア ミノ酸の長さを有するアミノ酸配列より成る請求項１記載のオリゴペプチド。
6. ６．請求項１乃至５のいずれかに記載のオリゴペプチドに対して生成するモノク ロナール抗体またはポリクロナール抗体。
7. ７．請求項１記載の１種以上のオリゴペプチドあるいは請求項１記載のオリゴペ プチドに対して生成する１種以上の抗体を用いて公知の方法により検査試料中に 存在する抗体と該オリゴペプチドとの結合あるいは試料中に存在するｇｐ１２０ と該抗体との結合を検出することにより、ヒトまたはチンパンジーなどの哺乳類 の血清などの体液中のＡＩＤＳやＡＲＣの原因ウイルスまたはその関係ウイルス の感染の検査あるいは該哺乳類が感染した該ウイルスの変異体またはその感染中 に形成された該ウイルスの変異体の検査を行なう方法。
8. ８．請求項１記載の１種以上のオリゴペプチドと１種以上の担体および／又はワ クチン接種に適したアジユバントより成る、ＡＩＤＳやＡＲＣの原因ウイルスま たはその関係ウイルスからヒトやチンパンジーなどの哺乳類を保護するためのワ クチン組成物。
9. ９．請求項１記載の１種以上のオリゴペプチドあるいは請求項１記載のオリゴペ プチドに対して生成する１種以上の抗体より成る、ＨＩＶ汚染の検査及び／又は ＡＩＤＳやＡＲＣの原因ウイルスまたはその関係ウイルスの型の検査に用いるた めの診断補助剤。