JPH05508837A

JPH05508837A - Ｈｉｖ抗体検出用の合成ペプチドとその混合物

Info

Publication number: JPH05508837A
Application number: JP91511311A
Authority: JP
Inventors: ラクロワ，マーシャル
Original assignee: バイオケム・イムノシステムズ・インコーポレイテッド
Priority date: 1990-07-09
Filing date: 1991-07-08
Publication date: 1993-12-09
Anticipated expiration: 2019-05-31
Also published as: PT98249B; ZA915286B; CA2086922A1; ES2098359T5; JP3533214B2; US5241047A; IL98769A0; EP0538283A1; WO1992000997A1; DE69125161T2; ES2098359T3; AU8189591A; CS209691A3; CA2086922C; DE69125161T3; ATE150031T1; MX9100115A; NZ238856A; DE69125161D1; EP0538283B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＩＶ　のム　ペプチド　ｔへ１会豊本願は、１９８８年１月２７日出願の米国特許出願第０７７１４８．８２１号、１９８８年４月２２日出願の米国特許出願第０７７１８５，５１８号および１９８８年１２月８日出願の米国特許出願第０７／２８１．２０５号の一部継続出願である。

及豆立立里本発明は、■＋ｙ抗体を検出するために用いる新規な環状ペプチドとその組合せ物、および線状ペプチドと環状ペプチドの組合せ物に関する。

及尻旦冑１後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）　、エイズ関連症候群（ＡＲＣ）およびプレエイズ（ｐｒｅ−ＡＩＤＳ）は、レトロウィルスであるヒト免疫不全ウィルス（Ｂｍによって起こると考えられている。

最初のエイズ関連ウィルスである［ＩＩＶ−１（ＩＩＩＴＬＶ−ｍ、ＬＡＹ−１およびＡＲＶとして知られている）は充分に特性決定がなされている。

旧Ｖ−２と命名された（以前はＬＡＹ−２と命名）もうひとつの病原性ヒトレトロウィルスが、現在西アフリカのエイズ患者から単離されている。（例えば、国際公開番号第ＷＯ３７１０４４５９号参照のこと）。ＨＩＶ−２は、いくつかの保存配列が、ＨＩＭ−１およびサル免疫不全ウィルス（Ｓｍと共通していることが最近明らかになった（　Ｇｕｙａｄｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、　３２６巻、６６２−６６９頁、１９８７年）当該技術分野では他のナンバリングシステムが用いられているが、理解と比較が容易なことから、本願では、旧Ｖ−１タンパク質に対してはＲａｔｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、　３１３巻、２７７〜２８４頁、１９８５年のアミノ酸ナンバリングシステムを採用し、ＨＩＭ−２タンパク質に対してはＧｕｙａｄａｒら、Ｎａｔｕｒｅ、　３２６巻、６６２〜６６９頁、１９８７年のシステムを採用しな。本発明のペプチド中のアミノ酸は内の孝うに一名字コードで命名する。すｔわち、ａｌａ＝Ａ。

ａｒｇｇＲｓ　ａｓｎ＊Ｎｓ　ａ＠ｐｌＩＤ１１ｃｙｓ弓、ｇｌｎｓＱ１１ｇｌｕ４ｓ　ｇｌｙ＝Ｇｓ　ｈｉｓｓＨ１ｉ１ｅ＝１．１ｅｕ＝Ｌ、　１ｙｓ＝に、　ｍｅｔ＊Ｍ％ｐｈｅ＝Ｆｂ　ｐｒｏ＝ＰＳｓｅｒ＝ｓｓ　ｔｂｒ＝Ｔｓｔｒｐ４．　ｔｙｒ＊Ｙおよびｖａｌ＝Ｖである。

ＨＩＶ−１に感染した患者の血清中の抗体を検出する一免疫診断試験法の初期の方法では、抗原としてウィルス全体を利用した。

第２世代の試験法では組換えＤＮＡ法で得たポリペプチドの配列が利用されたが、例えば、Ｃａｂｒａｄｉ　１１ａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

４巻、１２８〜１３３頁、１９８５年およびＣｈａｎｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　３巻、９０５〜９０９頁、１９８５年はそれぞれ、８２と１０２のアミノ酸残基の、細菌を用いて合成されたウイルスタンノ（り質のフラグメントに言及している。ヨーロッパ特許出願第２０２３１４号と同第１１４２４３号は、単独もしくは混合物で免疫反応性であるｇｐ４１とｇｐｔｚｏの領域にまたがる組換えポリペプチドについて述べて−）る。Ｓｈｏｅｍａｎら；　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｅｈｅｔ、１６１巻、３７０〜３７９頁、１９８７年は、ＨｒＶ−１に感染した患者由来の血清中に存在する抗体と免疫反応性であるｇｐ４１由来のいくつかのポリペプチドに言及している。しかし、上記の検定法はすべてが容認できるわけではない。その検定法は感度が不足していることが重大な欠点である。そのため、ウィルス含有の血液が検出を逃れて、血液製剤利用者に感染し、エイズと診断されないキャリアによる感染が続（ことがある。特異性に欠くこと（偽陽性）も問題であり、健康な個体がエイズであるといわれることがある。

このような偽陽性は不純物で起こることがある。また偽陽性は、これらの抗原製剤中に存在するエイズに無関係のウィルスが共有しているエピトープで起こることもある。これについて、Ｇａ１ｌａｂｅｒ、　Ｃｅ１ｌ、　５０巻、３２７〜３２Ｂ頁、１９８７年には、ＩＩＩＶ−１のｇｐ４１の領域では、５つの隣接するアミノ酸残基の配列をＲＳウィルスに共通していて、かつ、はしかウィルスＦ１の糖タンパク質の４つの等しく分布したアミノ酸の配列とも共通していることを報告している。したがって、この領域もしくは今後発見される他の共通の領域を含有する組換えポリペプチドは、たとえ高度に精製されていても、偽陽性および付随物の容認できない特異性をもたらす可能性がある。最後に、これらの従来技術の検定法は非常に低いレベルのＨＩＶ抗体を検出することができない。このことから、エイズの感染を非常に早い段階で検出する性能について、これらの検定法が不利であり、そのため治療の開始が遅れ、エイズ感染を有効に検出する前に、血液試料などの体液によって感染が広がるのを許してしまうことになる〇これらの問題を解決する試みとして、より短いＨＩＶ抗原を用いる診断手段と方法が現在開発されつつある。■！Ｖウィルス１こ固有で高度に保存性のエピトープに対応するペプチド配列を同定する経験法も現在利用できる。これらの方法は、例えば、未変性のタンパク質の表面上で一層暴露され易いので検定の手段として有用な短いアミノ酸配列を選択する際の助けになる（概要については、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍａｔ、。

８８巻、１−１８頁、１９８６年参照のこと）。これらの方法は−１くぶん有用ではあるが、表示的であるにずぎない。それにもかかわらず、これらの方法は、エイズの原因であるウィルスの表面に存在するエピトープを同定するために利用されて−する。

例えば、米国特許第４．６２９．７１１３号、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳｌ１６１００８３１号オー１−　ｄ　ヨｏ　フハ特許出願！３０３２２４号は、ｐ１８、ｐ２５．ｇｐ４１およびｇｐ１２０のタンパク質由来の各種合成ペプチドに言及している。これらのペプチドは比較的容易にかつ低０経費で製造できることと、さらにより重要なのは、不純物もしく叫エイズとは無関係の′ウイルスタンノイク質に共通しているエピトープの存在が原因で偽陽性になる危険性が少なくなることから有利である。

これらの小さなペプチドは特異性については、エイズ感染の診断に対する初期の組み換えポリペプチドおよびウィルス全体を使ったアプローチよりも有利であるが、全感度につ（１では満足すべきものではない。というのは恐らく、合成されタエビトープがエイズ抗体が認識するコン：ｈｌ−シｗ７’に呈し、維持することができないからである。これらの各場合に試験される血清試料の数は非常に限られているが、特異性（偽陽性がほとんどない場合）は、小さな合成ペプチドの場合には非常に高いが（９５〜１００％）、全感度は８０〜１００％の間を変動することが見出された。実際に１００％の感度が得られた唯一の試料では、１０の試料を試験したにすぎない。例えば、５ｓｉｔｈら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、、２５巻、１４９４〜１５０４頁、１９８７年には２つの重複したペプチドＥ３２とＥ３４が非常に免疫反応性であることが記載されている。

そのペプチドは、２４ｏのセロネガティブ試料から偽陽性は全くでなかったが、＄２２のセロポジティブ試料から３つの試料を見逃してしまった（感度９９．１％）。Ｗａｎｇら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、、８３巻、６１５９〜＄１６３頁、１９８６年）は、一連の重複ペプチド（ＳｍｉｔｈのＥ３２とＥ３４のペプチドを含む）に言及しており、これらのペプチド中の１つの２１量体のペプチドは１０ｏｚの特異性と９８％の感度（エイズ患者から採取した２２８のセロポジティブ試料の内の２２４が上記のペプチドによって陽性であることが分かった）を示した。１９８７年１１月１３日に出願した米国特許出願第１２０．０２７号には、ｇｐ４１　（ＨＩＶ−１）　ｃＤ、６０６〜６２０ノ残基＋：　：ｉ：　タカル短い合成ベブｆ　）’　（ＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳ）について述べられている。このペプチドは、エイズウィルスに感染した患者の抗体に対して免疫反応性であるといわれている。その特異性は優れていたが（６３７６３）　、陽性であると確認された５７の試料から６つのセロポジティブ試料を検出できなかった（感度８９％）。

さらに、Ｇｎａｎｎら（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　、　６１巻、２６３９〜２６４１頁、１９８７年およびＪ、　Ｉｎｆｅｃ、　Ｄｉｓ　１５５巻、２６１〜２６７頁、１９８７年）は、ｇｐ４１　（ＨＩＴ−１）の免疫優性領域（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ　ｒｅｇｉｏｎ）と思われる領域由来の一連の重複ペプチドに言及している。Ｇｎａｎｎらは、ａｙｓ−６０５が、ｇｐ４１−　（ＢＩＶ−１）タンパク質のそのセグメントの免疫反応性に対して必須であると結論した。彼等は、配列ＳＧ［ＬＩＣ（６Ｈから６１１）を有するペプチドは、試験された２２のＨＩ　Ｖ−１陽性血清のいずれとも免疫反応性でなかったが、Ｎ末端にシスティン残基を付加すると、フ量体のペプチドと反応させた４４の血清のうち２１かい（らかの免疫反応を回復した（４８％の感度）と報告した。

さらに、Ｇｎａｎｎら（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）は、ｇｐｔｔ　（ＨｒＶ−１）の６０５と６１１の位置のシスティン残基が、恐らくジスルフィド結合によって環状構造を生成することによってこの領域の抗原性コンホメーシ１ンで１つの役割を演じると考えた。しかしＧｎａｎｎらは、２つのシスティン基がジスルフィド結合で連結された合成ペプチドを得たということを全（実証していない。

Ｇｎａｎｎらは、ＩＩＩＶ−１の抗体を同定するのに有用なペプチドについて述べているが、そのペプチドでさえも感度が１００％ではない。例えば、ｃｎａｎｎら（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、６１巻、　２６３９から２６４１頁、１９８７年）は、その６００〜６１１のアミノ酸配列は２２の陽性血清から２２を検出したことを報告しているが、また彼等は、米国、ジツージア州、アトランタのＣｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌで同じ１２のアミノ酸配列（６００〜６１１）について同様の試験を実施したところ、７９の陽性血清の中１つが見逃されたとも報告している。モしてＧｎａｎｎは、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｊ、　Ｄｉｓ、　１５６巻、２６１〜２６７頁、１９８７年で、同じ１２のアミノ酸配列が、米国のＨＨ−１感染患者１３２のうち１３１と反応性であったと報告した。

Ｇｎａｎｎら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３７巻、１３４６〜１３４９頁、１９８７年には、ｇｐ４１　（ＢＩＶ−１）の６０５〜６１１領域と相同の領域に２つのシスティンを含有する、ｇｐ４２　（ＨＩＶ−２）　ノ５９２〜６０３７７）残基にまたがる短い線状合成ペプチドが報告されている。このペプチドは、ＨＪＶ −２感染患者から採取した５つの血清のうち５つと反応した。

（■ＩＶ−１）のｇｌ）４１のアミノ酸６０５〜６１１を含有する他のペプチドも当該技術分野で言及されている。国際公開番号第ＷＯ８６１０６４１４号は、約ｂｐ７５１６からｂｐ７５９３までの領域でコードされるペプチドＸ（３９）と、約ｂｐ７５４３からｂｐ７５９３Ｅ＊ｌｆルＱｆｉテ＝ｌ　−ドされるペプチドＸｍ　（７９）について言及し、両者ともに７つのアミノ酸配列６０５〜６１１を含有している。これらのペプチドは線状であると報告されており、環状構造の生成は全く示唆されていない。国際公開番号第ＷＯ３７１０６００５号は、旧Ｖ−１のエンベロープの糖タンパク質（ｇｐ４１）のＣｙｓ（ＳＯ５）　〜Ｃｙｓ（Ｓｉｔ）残基を包含する一連の合成ペプチドが、中性もしくは塩基性の水性緩衝液中で可溶化されるときに、一連の自然酸化的変換を受けることを報告している。その結果、そのペプチドは、ＥＬＩＳＡで使用すると、線状モノマー、環状モノマー、線状もしくは環状の二量体、および各種の長さの線状ポリマーのランダム混合物になると考えられる。本願では、環状成分の存在を実際に証明せず、かつ存在している可能性がある他の各種の二量体とポリマーの特性を決定しなかった。さらに、そのポリマー形はＥＬＩＳＡ反応性についての最も重要な成分であると考えられる。

恐らく、上記の従来技術のペプチドは、そのペプチドの各種の酸化型の複合混合物であるのに加えて、所望するほどにエイズ感染を早期に検出することはできない。例えば、Ｇｎａｎｎら（Ｊ、Ｖｌｒｏｌ、）は、ＩＩＩＶ−１陽性血清を５００倍以上希釈すると、これらの希釈された血清のいくつかは陰性になることが見い出され、このことはそのペプチドがＢＩＶを早期に検出する感度が低いことを示していると報告している。

これらの問題は、化学的に環状化して関連のシスティン間にジスルフィドの架橋が形成されたペプチドを用いることによって検討されている（例えば、Ｍ、　Ｌａｃｒｏｉｘら、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｙｃｌｉｃ　Ｖｅｒｓｕｓ　Ｌｉｎｅａｒ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　Ｉｎ　ＡｎＥＬＩＳＡ　Ｆｏｒ　ＨＪＶ−Ｉ　Ａｎｄ　ＨｒＶ−２５ｐｅｅｆｆｉｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｆｅｓ、　Ｎｏ、３１４７、１９８９年６月ＡＩＤＳ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、　Ｍｏｎｔｒｅａｌ、　Ｃａｎａｄａ：および国際公開番号系ＷＯ３９１０３３４４号）。本発明はこのような環状ペプチドの改良に関する。

良匪旦！且本発明は、特に、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の抗体を１００％検出するのに適切で、かつこれらの抗体が血清中に非常に低いレベルで存在する場合でもこれら抗体を検出できる一連の新規なペプチドを提供するものである。

さらに詳しくは、本発明の新規なペプチドは、下記式（Ｉ）あるいは（ｎ）で表される実質的に純粋なペプチドから選択される。

Ｘは、ｇｐ４１−ＨＩＭ−１のアミノ酸配列の下記アミノ酸配列類似体の１つ、Ｋ工ＬＡｖＥＲｙＬＫＤｑｇＬＬＧｘｈｃ二　（５８６−６０４）意工ＬＡＶＥ ’ＲＹＬＸＤＱＱＩ、ＬＧ工ＷＧ−（５８５−６０４）。

その配列に対応して他の旧ソ−１分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸配列、および保存的置換のために上記配列とは異なるアミノ酸から独立して選択され、そのアミノ酸配列が、５８６位に少なくとも１つのりシンを存するか、または５８５位と５８６位の両方にリシンを有することを特徴とし、ｙは、存在する場合には、一丁 −Ｔ丁一７７λ ７１１ＡＶＴＴＡＶＰ −ＴＴＡＶＰ讐 −ＴＴＡＶＰＷ −’ＩＴＡＶＦＷ’Ｎ入 −ＴＴ入ＶＰＷＮＡＳ −ＴＴＡＶＰＷＮＡ５Ｗ −’ＸＴＡＶＰＷＡ５Ｗ５ −ＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳＮ −ＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳドに −ＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳＮＸＳ −Ｔ’！’ＡＶＰＷＡＳＷＳ）ｒＫｓＬ−ＴＴＡＶＰＭＡ５Ｗ５ＮＸ５ＬＥ −ＴＩ’入Ｖ？ＷＮＡＳＷＳＮＸＳｒ、ＥＱ上記配列に対応して他の旧ソ−１分離株の相同領域から誘導されたアミノ酸配列、および保存的置換の結果上記配列 ′とは異なるアミノ酸配列からなる群から独立して選択され；ｅとｆは、存在する場合には、旧Ｖ−１のｇｐ４１のアミノ酸５８６から６２９にまたがる領域のエピトープもしくはＨＩＴ−２のｇｐ３６のアミノ酸配列５７８から６１３にまたがる領域のエピトープの任意のアミノ酸配列、その配列に対応して他の■ＩＶ −１もしくはＨＩＶ−２の分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸配列、保存的置換の結果上記配列とは異なるアミノ酸配列、およびこれらのエピトープの組合わせからなる群から独立して選択され；ａは、カブプリング因子として有効な、および／またはペプチドをその抗原特性を変えることな（免疫診断試薬としてより有用にするのに有効なアミノ末端もしくは置換基：ならびにｂは、カップリング因子として有効な、および／またはペプチドをその抗原特性を変えることなく免疫診断試薬としてより有用にするのに有効なカルボキシ末端もしくは置換基：ならびに式（■）：式中、ｘｌは、ｇｐ３６−ＨＩＶ−２のアミノ酸配列の下記アミノ酸配列類似体の１つ、ＫｖＴＭ口ＣＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧ　（５７１５−５９６）にＸｖＴ入工ＥＸＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧ　（５７７−５９６）。

その配列に対応して他の旧ソ−２分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸配列、および保存的置換の結果上記配列とは異なるアミノ酸配列から独立して選択され、そのアミノ酸配列が、５７８位に少なくとも！つのりシンを有するか、または５７７位と５７８位の両方にリシンを有することを特徴とし、ｙｌは、存在する場合には、ＨＨＴＨＴＴＨＴｒｖ −眉Ｔｎ −ＩＴ！’Ｖ’ＰＷ −湘ＴりＷ −ＨＴＴＶＰＷＨ −ｊＴ庄Ｗ■ −ＨＴＴＶＰＷＶＮＤＳ　Ｉ上記配列に対応して他のＨＩＶ−２分離株の相同領域から誘導される配列、および保存的置換の結果上記の配列とは異なるアミノ酸配列からなる群から独立して選択され、ならびにｅｓ　ｆ％ａおよびｂは前記定義と同じ。

他の実施態様において、本発明の新規なポリペプチドは、下記式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）で表される実質的；：純粋なペプチドから選択される。

式中、ｘ２は、存在する場合には、Ｇ− ｗＧ− Ｇ工ＷＧ− ｆ工ｗＧ− ニ藷Ｇ− ＱＬＬＧ工ＷＧ− ）ＣＤＱＱニエＷＧ− ＬＫＤＱＱＬＬｆＪＷＧ− ＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧｆｆＧ− Ｒ工ＬＡＶＥＲＹＬＸＤＱＱＬＬＧＩＷＧ−。

上記配列に対応して他のＨＩＶ−１分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸配列、および保存的置換の結果上記配列とは異なるアミノ酸配列からなる群から独立して選択され；ならびに、ｙ％ｅ、　ｆ％ａおよびｂは前記定義と同じで、Ｃまたはｆの一方もしくは両方が存在している）；ならびに式中ｘ３は、存在する場合には、一Ｇ− ５賀Ｇ− ５ＷＧ− ゴＳｗＧ− ＲＬＮＳＷＧ− 人ＲＬＮＳＷＧ− −ＱＡＲＬＮＳＷＧ− 、ＤＱ腿ココ５ＷＧＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧ− ＬＱＤＱＡＲＬＮＳＩＱ− ＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧ− ＫＹＩ何〜絋び鉱ＮＧ− ＴＡ工ｒｌＸＹＬＯＤＱ　入ＲＬＮＳＷＧ−ｖ’ｒ入ＩＥＫＹＬＱｕＱＡＲＬＮＳＷＧ−ＲＶＴ入工■’＋’ＬＱＤＱ入ＲＬＮＳＷＧ−。

上記配列に対応して他のＨＩＶ−２分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸配列、゛および保存的置換の結果上記配列とは異なるアミノ酸配列からなる群から選択され、ならびにＦ’％　ｅｓ　ｒｓ　、＆およびｂは前記定義と同じで、ｅまたはｆの１つもしくは両方が存在している。

式（Ｉ）の特に好ましいペプチドは下記配列を有するＢＣＩ［−４０８である。

このペプチドは、　ｆｒＩＶ−１のｇｐ４１の６０６〜６１０位に位置するエピトープのアミノ酸配列（ＳＧ［ＬＩ）をｆの６１９位に、およびリジンを５８６位に組み込んでいる。

式（ｎ）の特に好ましいペプチドは下記配列を有するＢＣＨ−４１このペプチドは、ＨＩＶ−２のｇｐ３６の５９８〜６０２位に位置するエピトープのアミノ酸配列（ＡＰＲＱＶ）をｆの６１３位に、およびリジンを５７８位に組込んでいる。

主皿迎Ｊ１１豪艮咀Ａ　るペプチドの本発明のペプチドは［ｚｖ−１とＨＩＶ−２の公表されたアミノ酸配列に基づいて合成した。しかし他のＨＩＶ−１もしくは■ＩＶ−２分離株の相同領域から誘導される配列は本発明の適用範囲から逸脱することなく使用することができると解すべきである。

ポリペプチドのどの部分が最も表面配向しているのか、したがって最も免疫原性なのかを予測するのを助ける各種の物理化学的原理を用いて、上記の未変性配列中のエピトープを、本発明のペプチド中のｅｌ！−ｆとして使用するために選択した。

これらの原理としては、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓの親水性の図表（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、、　７８巻、３８２４〜３８２１１頁、１９８１年）ならびにｌ：ｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅによる類似の方法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

１５７巻、１０５〜１３２頁、１９８２年）がある。さらに、タンパク質のコンホーメーシｇンの経験的予想法（ＣｈｏｕとＦａｓｍａｎ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　４）巻、２５１〜２７６頁、１９７８年）は、ポリペプチドのどの部分が免疫原性なのかを予測する有用な指標である。

本発明はペプチドのｅとｆのエピトープには、限定されないが−ＷＧＣＡＦ（Ｎｏｒｒｂｙら、ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅ３，５巻、５号、１９８９年によって同定された）；にＤＳＳＧＫＬおよびＬＥＤＱ（Ｎｏｒｒｂｙら、ＡＩＤＳ、　３巻、１号、１．９８９年によって同定された）；　ＬｒＤＱ％ＣＳＧにＬｒおよびＩＷＧＣＭａｔｈｉｅｓｅｎら、Ｉｍｒａｕｎｏｌｏｇｙ、　６７巻、ｌ−７頁、１９８９年で同定された）：ならびニＡＲＩＩ、ＡＶＥＲＹＩＪＤおよび５ＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳ（Ｄｏｐｅｌら、Ｊｏｌ、　ｏｆ　Ｖｉｒ−Ｍｅｔｈ、、　２５巻、１６７〜１７ｇ頁、１９１１９年によって同定された）が含まれる。

本発明のペプチドを、その抗原としての特性を変化させることな（免疫診断試薬としてより有用にするために、改変することは本発明の適用範囲内にある。上記の変更には次のものが含まれる。

一スルホスクシンイミジルー４（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラードのような異種二官能性架橋剤（このような結合を行うのに好ましい薬剤）によってペプチドを担体タンパク質に連結しやす（するために、システィン残基をアミノ末端もしくはカルボキシ末端に付加すること； −支持体もしくはより大きなペプチドとの連結またはペプチドの物理的もしくは化学的特性の改変を行うのに、ペプチドを互いに連結しやすくするためにアミノ末端もしくはカルボキシ末端にある種のアミノ酸を付加すること。このような変更は、エステル化反応によってリンカ−として利用できる、例えばチロシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸の付加、およびシッフ塩基もしくはアミド生成によって接続できるリシンの付加によって行うことができる；ならびによびカルボキシ末端のアミド化、例えば、アンモニア、メチルアミンの使用による誘導体化。これらの改変はペプチドの実効電荷の変化をもたらし、ペプチドの固体支持体、担体または他のペプチドとの共有結合を容易にすることができる。

これらの改変はペプチドの免疫反応性の変化を起こさないようである。

本発明のペプチドは、保存的もしくは非保存的な各種の変更、例えば挿入、欠失および置換によって、これらの変更がある種の利点を提供する場合には、改変してのよい。これらの変更には、好ましいものとして次のような保存的変更すなわちｑｌ、ｙ。

ａｌａ；　Ｖａｌｔ　ｉＸｅ、ｌｅｕ；　ａｓｐｔ　ｇｌｕ、　ａｓｎＬ　９１ｒｌ；　Ｂ＠ｒｅ　を泣ｐ　ＩＹ’ｐａｒｇ；　ｐｈｅ、　ｔｙｒ；　ａｌａ、　ｓｅｒ；　ａｌａ、　ｔｈ青ａｌａ、　ｖａｌ；　ａｌａ、　ｐｒｏ；ａｌａ、　ｇｌｕ；　ｌｅｕ、　ｇｌｎ；　ｇｌｙ、　ｐｈｅ；　ｉｌｅ、　ｓｅ喀ａｎｄ　ｉｌａ、　ｍａｔが含まれる。

メチオニンは、自然酸化を行う傾同を有するアミノ酸であるが、通常、抗原性を変化させることなくノルロイシンで置換することができる。

本発明のペプチドに、小数（１〜１０）の疎水性アミノ酸で構成された「テール」を付加することも便利である。このようなテールによって、ペプチドの固体支持体への受動吸着が容易になる。この改変は、カルボキシ末端またはアミノ末端に実施することができる。好ましい付加物はｐｈｅ−ａｌａ−ｐｈｅ−ａｌａ− ｐｈｅである。

本発明によれば、式（＋）の好ましい環状ペプチドは下記のように定義されたＸＳＹ、、　ｅおよびｆを有する環状ペプチドである。

ｘ：ＫＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧ、　ｙ：ＴＴＡＹＰｆＮＡＳ、およびｅとｆは存在しないＣＢＣＭ−８７ｃｋ）　；Ｘ：にＫＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧ、　ｙ：ＴＴＡＶＰＷＮＡｓ、およびｅとｆは存在しない＜ＢＣＨ−２６６）　：ならびにｘ：ＫＩＬＡｖＥＲＹＩＪＤＱＱＬＬＧＩＷＧ％ｙ：ＴＴＡＶＰＷＮＡ。

ｆ：ｓＧにＬ！、およびｅは存在しないＣＢＣＢ−４０１１）、これらのうちＢＣ！！−４０８が最も好ましい。

式（ＩＩ＞の好ましい環状ペプチドは下記定義のｘｌ、ｙｌ、ｅおよびｆを有する環状ペプチドである。

−ｘ’：ＫＶＴＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧ、、ｙ’：　ＨＴＴＶＰＷＶＮＤＳ、およびｅとｆｉ１存在しない（ＢＣＨ−２０２ｃｋ）　；ｘ’：ＫＩＶＴＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳｆＧ、、ｙ’：　ＨＴＴＶＰｎＮＤＳ、およびｅとｆは存在しない（ＢＣＨ−２５５）　；ならびにｘ’：ＫＶＴＡｒＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＩＦＣ，ｙ’：　ＨＴＴＶＰｎＮＤＳ、およびｆ：ＡＰＲＱＶ−およびεは存在しない（ＢＣＨ−４１７）、これらの中で最も好ましいのはＢＣＨ−４１７である。

表１はこれらの好ましいペプチドの全アミノ酸配列を示す（可能なａとｂは無視する）。

（以下余白）表１　ペプチド配列本発明のペプチドは、通常の固相合成法を用−）て製造するのが好ましい。しかし他の公知のペプチド合成法も帛Ｊ用できる。樹脂の支持体は、ポリペプチドの固相合成１こ当該技術分野で通常用いられる適切な樹脂であり、ｐ−ベンジルオキシアルコールポリスチレンおよびｐ−メチルベンズヒトＩＪ　）レアミンされたアミノ酸を樹脂支持体にカップリングさせてから、そのアミノ保護基を、面相ペプチド合成の技術分野で通常用（１られる標準的な方法で除去する。アミノ保護基を除いてから、残りのα−アミノ基が保護され、および必要に応じて側鎖が保護されたアミノ酸を、続けて所望の順にカップリングさせて生成物が得られる。あるいは、多数のアミノ酸基を、溶液法を用いてカブプリングしてから、樹脂に支持されたアミノ酸配列とカップリングさせてもよい。

適切な力、ブリング剤の選択は、確立された従来技術にしたがって行う。例えば、適切なカブプリング剤は、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロビリカルボジイミドまたはＮ、　Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）であり、これらは単独で用いるか、または好ましくは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下で用いられる。他の有用なカップリング方法では、保護されたアミノ酸の予め形成された対称形無水物が用いられる。

成長中のポリペプチド連鎖に導入される各アミノ酸に用いられる必要なα−アミノ保護基としては９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆ璽ＯＣ）が好ましいが、他の適切な保護基が、カップリング条件下で分解せずかつ成長分子中にすでに存在している他の保護基の存在下で選択的に容易に除去できる限り、その保護基を利用できる。

側鎖のアミノ酸に対する保護基を選択する際の基準は、（ａ）合成の各工程において、α−アミノ保護基を除去するために選択される反応条件下で、該保護基が各種の薬剤に対して安定であること；（ｂ）該保護基の重要な特性が保持されること（すなわち、力、ブリング条件下で分解されないこと）：および（ｅ）ポリペプチド合成を完了する際、およびポリペプチド構造に別の仕方で作用１．ない条件下で保護基を除去できることである。

充分に保護され、樹脂に支持されたペプチドは、アニソール、ヂオアニソール、エチルメチルスルフィド、１．２−エタンジオチオールおよび類縁試薬のような適切なスカベンジャーの存在下、室温で１〜６時間、塩化メチレンによるトリフルオロ酢Ｍのｓｏ〜６０％溶液で処理することによって、ｐ−ベンジルオ牛ジアルコール樹脂から開裂される。同時に、はとんどの酸に対して弱い側鎖の保護基は除去される。より耐酸性の保護基はＨＦによる処理で除去される。

本発明の環状ペプチドは、ペプチド台底の技術分野で広く知られている方法に１、たがって、保護されているかまたは保護されていないＳＨ基を直接酸化的変換反応に付してジスルフィど結合にするこ、Ｊ＝Ｊこよって製造される。好ましい方法としては、遊離のＳＲ基をフェリシアン化カリウムで直接酸化する方法がある。このような環状ペプチドは、旧Ｖ抗体との結合を容易にするより堅固なコンホメーシＩ！二ノをもっていると考えられる。

ペプチド　ム　とポリマー本発明の１つ以上のペプチドを共有結合させることによって製造したより大きなペプチドも本発明の適用範囲に入る。

これらのペプチドのポリマ〜（ホモポリマーおよびコポリマーの両者）も考えられる。

本発明の他の環状ペプチドおよびその環状ペプチドの混合物、ならびに他の環状および線状のＩＨＶ由来のペプチドも本発明の適用範囲に入る。これらの混合物は、予想外のことであるが、連続的に希釈された血清試料中およびセロコンバージョンパネル（旧Ｖ−１）中に存在する旧Ｖ−１と旧ｖ−２の抗体を高感度で検出することが見出されたのである。また、これらの混合物は高レベルの特異性をもたら１７、偽陽性の数が最ｌＪ這こなることが見出された。

上記の混合物は、式（＋）もしくは（１目）の少なくとも１つの環状ペプチド（好ましくはＢＣｌ（−８７ｅｋＳＢＣＨ−２６６もしくはＢＣト４０８であり、より好ましくはＢＣＨ−４０８である）を、式（ＩＩ）もしくは（ＩＶ）の少なくとも１つの環状ペプチド（好ましくはＢＣＨ−２０２ｃｋ、　ＢＣＨ−２６５もしくはＢＣト４１７であり、より好ましくはＢＣＨ−４１７である）と組み合わせて含有している。

■」餡１弘捻」本発明のペプチドおよびペプチド混合物は、当該技術分野で公知の方法によって、エイズ関連抗体を検出するのに用いる診断試薬として有用である。これらの方法としてはＥＬＩＳＡ法、血球凝集法、シングルドツトおよびマルチドツト法と検出法がある。エイズに対する抗体を決定する際の本発明のペプチドの主な利点は、その特異性と高い感度、および特に今まで用いられている公知の抗原と比較して、非常に低いレベルのエイズ感染の存在を検出できる性能である。

ＨＩＶ−１もしくは旧Ｖ−２に対する抗体を決定する１つの方法にしたがって、いわゆるｒＷｅｓｔｅｒｎ　ＢｌｏｔｔｉｎｇＪ分析方法が用いられる（　Ｔｏｍｂ　ｉ　ｎ、■、、　５ｔａｅｈｅｌｉｎ、　Ｔ、およびＧｏｒｄｏｎ、Ｊ、、　Ｐｒ。

ｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ７６巻、　４３５０−４３５４頁、　１９７９年）。この方法によれば、本発明の単一もしくは複数のペプチドがニトロセルロースペーパーに塗布される。そのニトロセルロースペーパーが被験血清で飽和されて処理される。洗浄後、ニトロセルロースペーパーを、酵素で標識を付けた抗ヒトＩｇＧで処理する。次にその酵素活性を適切な基質で測定する。勿論、放射能標識もしくは蛍光標識のような他の標識を用いることができる。

本発明のペプチドもしくはペプチド混合物を用いてＨＩＶ−１とＨＩＶ−２に対する抗体を測定するのに好ましい便利で古典的な方法は、酵素結合免疫検定法（ＥＬ　ｌ５Ａ）である。この検定法では、例えば、本発明のペプチド、ペプチド混合物を、マイクロタイタープレートのウェルに吸着させるかまたは共有結合させる。次にそのウェルを、試験される血清もしくは被検体で処理させる。洗浄後、ペルオキシダーゼで標識が付けられた抗ヒトＩｇＧもしくは抗ヒトＩｇＭをそのウェルに添加する。そのペルオキシダーゼ測定は、対応する基質、例えば０− フィニレンジアミンで行われる。上記の検定法の有用性から逸脱することなく他の標識、例えば放射能、蛍光化学発光もしくは赤外線発光の標識で、ペルオキシダーゼを交換することができる。

ＥＬＩＳＡ試験法には、個々のペプチドもしくはその組合せ物を用いることができる。後者は、抗体を検出し、同時に偽の応答に関与するものを排除するのに最も有効なペプチドを組合わせることができるので好ましい。これらの研究の過程で、いくつかの血清試料がペプチドの混合物によって正しい陽性の結果を与えるが、一方抗原として個々のペプチドによって不明確な応答を与えられることが見出された。したがって、１’１ｌＶ−１とＨＩＶ−２の抗体の最も好ましい試験法は、ペプチド抗原の組合わせ物を用いるこの発明によって達成される。

本発明のペプチドまたはペプチド混合物で、ＨＩＶ−１もしくは■ｒＶ−２に対する抗体を測定する他の方法は、いわゆる「二抗原サンドイッチ法」による酸素免疫試験法である。この方法は、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　２０巻、　２５−３４頁、　１９７８年に記載されているＭａｉｏｌｉｎｉの研究に基づいた方法である。この方法によれば、試験される血清などの被検体を、本発明のペプチドもしくはペプチド混合物でコートされた固相（捕捉相）およびペルオキシダーゼで標識付けされている本発明のペプチドもしくはペプチド混合物（プローブ相）と接触させる。免疫反応は１つのもしくは２つのステップで行うことができる。免疫反応が２つのステップで行われる場合、洗浄のステップは２つのインキコベーシｊンの間で行うのが好ましい。単一もしくは複数の免疫反応の後に洗浄工程を実施してもよい。次いで、ペルオキシダーゼを、基質、例えば０−７エニレンジアミンで測定する。すでに述べたものを含む他の酵素と色素産生菌もこの検定法に用いることができる。

適切な固相は、有機と無機のポリマー例えば、アミラーゼ類、デキストラン類、天然のもしくは改変されたセルロース類、ポリエチレン類、ポリスチレン類、ポリアクリルアミド類、アガロース類、磁鉄鉱類、多孔性ガラス粉末、ポリビニリデンフルオライド（ｋｙｎａｒ）およびラテックス；試験容器の内壁、例えば試験萱、タイタープレート、または人工材料製のキュベツトの内壁；ならびに固体の表面、例えばガラスおよび人工材料製の口、ド、末端を太くしたロッド、末端にローブもしくはラメラを有するロッドの表面である。ガラスおよび人工材料製の球体が特に適切な固相担体である。　本発明のペプチドとペプチド混合物は、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＴ−２に対スる抗体を測定するのに有用であるのみならず、自由に重合させるかまたは適切な担体に接合させたこれらのペプチドは、ＨＩＴ−１もしくはＨＩＴ−２に対する抗体の特にモノクローナル抗体を引き出すのに有効なので、　ＨＩＴ−１もしくはＨＩＶ−２それ自体を間接的に測定するのに有用である。このような抗体は、本発明のペプチドもしくはペプチド混合物の充分な量を哺乳類もしくは鳥類の動物に注射し、次いでその動物の血清から前記の抗体を回収することによって製造することができる。抗体を引き出すのに適切な宿主動物には、ウサギ、馬、ヤギ、モルモット、う・ｙト、マウス、ウシ、ヒツジなどのような哺乳類が含まれる。

本発明のペプチドもしくはその混合物を用いて、ＨＩＭ−１もしくはＨＩＶ−２の感染を定量的に測定するのに、広く知られている各種の方法を利用することができる。このような一方法では、検定される血清試料、本発明の放射能標識を付けた環状ペプチドもしくはその混合物、および本発明の標識なしのペプチドもしくはその混合物の既知量をともに混合して反応させる。

生成した抗体／抗原複合体を、当該技術分野で公知の方法、例えば硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール、過剰の第２の抗体か、または不溶性支持体やデキストランをコート・Ｌ？木炭などに結合させた第２の抗体で処理することによって未結合の試薬から分離する。本発明の標識をつけたベプチ１Ｆ″もしくはペプチド混合物の濃度を結合相もしくは未結合相で１測定し、次に、標識を付けられた成分の測定されたレベルを、それ自体公知の方法で、標準曲線と比較することによつて、試料のＨＩＶ−１もしくは■ＩＶ−２の含量を測定することができる。

もう１つの適切な定量分析法は「二抗体サントイフチ検定法」である。この検定法によれば被検試料は、異なる動物、例えばヒツジもしくはウサギを用いて本発明のペプチドまた１はそ−の混合物に対して生成させた２つの異なる２つの抗体で処理される。あるいは、モノクローナル抗体は公知のＫｏｅｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｓｔｅｉｎのモノクローナル抗体製造法を用いて製造することができる。

同じ抗原に対して生成するが、異なるエピトープに対して生成するモノクローナル抗体を区別するためにＳｔ：１ｈｌｉらの方法（Ｊ、ｏｆ　Ｉｕ＋ｕｎｏｌｏｇｆｃｉｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、３２巻、２９７〜３０４頁、１９８０年）を使用することができる。ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体を使うことも適切なことである。

これらの抗体のうち一方に標識を付け、他方は固相にコートされる。適切な固相は本願の最初の方に記載した固相である。適切な標識は、ペルオキシダーゼのような酵素、放射能標識もしくは蛍光標識である。好ましい固相はプラスチックビーズであり、好ましい標識は西洋ワサビベルオキシダーザである。

次に血清試料は固相上の抗体および標識をつけた抗体とともにインキュベートされる。試料を最初に固相上の抗体で処理し、洗浄した後試料を標識を付けた抗体で処理してもよい。

しかし、試料を最初に固相上の抗体で処理し、所定時間経過した後、標識を付けた抗体で処理してもよい。試料は、固相上の抗体および標識を付けた抗体とともに処理するのが好ましい。

免疫反応を行った後、洗浄工程を実施する。洗浄後、標識を当該技術分野で公知の方法によって測定する。ペルオキシダーゼを標識として用いる場合、その測定は、例えば０−フェニレンジアミンもしくはテトラメチルベンジジンのような基質を用いて行われる。８Ｗ識を付けた成分の量は試料中に存在する抗原の量に比例している。

ＨＩＶ−１、ＨｒＶ−２、またはＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２ニ対する抗体を測定および定量する上記の方法と検定は、容器の中に、本発明の環状ペプチド、そのペプチド混合物もしくはその組合せ物、または本発明の環状ペプチドもしくは環状と線状のベプチどの混合物で引出される旧ｖ−１もしくは旧Ｖ−２に対する抗体を入れた適切な試験用キットで実施することができる。

さらに、本発明のペプチドおよびその混合物と組合わせ物は、！ｆｌＶ−１と旧Ｖ−２のウィルスに感染しやすい宿主内に、■ＩＶ−１と旧Ｖ−２に対する防御免疫性を誘発させることができるワクチンの活性成分としても有用である。投与経路、抗原の投与量、注射の数と頻度は個体ごとに変化し、他のウィルス感染症に対して免疫性を与えるのに現在用いられている方法に類似している。例えばそのワクチンは、本発明の少な（とも１つのペプチド、その類似体もしくはその混合物もしくはその組合せ物を含有する薬学的に受容可能な組成物であって、該含有成分は、その組成物で治療されるヒトを含む哺乳類に、所定の期間、ＨＩＶ− １もしくはＨＩＹ−２による感染から該哺乳類を防御するのに充分な抗体を生成させるのに有効な量で含有されている。

ワクチンは公知の方法で製造される。本発明のワクチン組成物は、生理的に受容可能な担体材料、例えば医薬等級の食塩水、破傷風トキソイドおよびキーホールリンペットヘモシアニンと通常、簡便に組合わされる。また本発明のワクチン組成物は、アジニバントなどの免疫応答のエンハンサ−１例えばミョウバン製剤、リポソームもしくは免疫調製剤を含有させてもよい。さらにこれらのワクチン組成物は、ＨＩＶ−１とＢＩＶ−２ニ加えて、他ノウイルス（例えば、ＨＴＬＶ− １とＩＩＴＬＶ−［１７）　ウィルス、サイトメガロウィルス（ｃｙｔｏｍｅｇｌｏ　ｖｉｒｕｓン）もしくは病原体に対する免疫性を与える他の抗原を含有してもよい。

これらの他の抗原の量は、やはり治療される哺乳類および疾患の推移によって決まる。しかし、抗原は、治療される哺乳類をその病原体もしくはウィルスから所定の期間防御するのに充分な抗体を生成するのに有効な量で存在していなければならない。

テスト　°のパネル本発明のペプチドの驚くべき感度、および特異性を示すために、血清のパネルを、特徴を育するペプチドによりテストした。

光学濃度を４５０　ｎｍで得、試料希釈緩衝液によって測定したブランク値は差し引かなかった。

試料ＮＥ　ＩＡ−２°２、ＢＢＩ−１−１６２から１６８．８７Ｂ１４０．１１７Ｌ１３９．８７ｖ１０３はすべて旧Ｖ抗体に関して陰性である。試料ＬＳＰＱ −Ｓ９−１は、初期ノセロコンハーター（旧ｖ−１）である。ＣＡＰ−１１３からＣＡＰ−１２０と標識された一連の血清は、ＨＩＶ陰性血漿によって連続的に希釈された７個のＩＩＩＶ−１陽性血漿試料のプールに対応する。ＣＡＰ−１１３は、旧Ｖ陰性血漿によって５０倍に希釈されたプールであり；　ＣＡＰ−１１４は１００倍に希釈され、　ＣＡＰ−１１５は２００倍に希釈されているなどである。同様に、ＣＡＰ−２２２からＣＡＰ−２３０と標識された一連の血清は、７つの■１ｖ−２のプールに対してセロポジティブであることが確認されている血漿試料に対応する。ＣＡＰ−２２２は、ＨＩＶ陰性血漿によって５０倍に希釈され：　ＣＡＰ−２２３は１００倍に希釈されているなどである。アッセイを実行する前に、一連のＣＡＰを含む各々の試料を、試料希釈緩衝液によってさらに５０倍に希釈する。これらのテストにおいて、セロボジティビティーのカプトオフは、試料ＮＥＩＡ−２°２の光学濃度に０．１００を加えた合計であると定義する。

■ 本発明の環状ペプチドをコートし、上記したようにＥＬＩＳＡテストによってテストした。表２は、血清試料中の体体の希釈度を上昇させながら１．ペプチドＢ、ＣＨ−１ｊ７ｃ（５６６（アルギニン））の感度を、ペプチド混合物８７ｅ、ｋ　（５８６（リシン））およびペプチド基■−２６５（５８６（リジン）−５８５，ｊ（リジン））の感度に比較している。アミノ酸５８６位においてアルギニンをリシンに置換すると、ＢＩＶ−１抗体を検出する感度が上昇するということを発見した。５８５位においてリシンを追加することにより、感度のさらなる上昇を得た。表３は、希釈度を上昇させながら、ＢＣＨ−８７ｃ、　ＢＣＨ−８７ｃｋ％ＢＣト２６６およびＢＣト４０！１の活性を比較している。表３より、６０６−６１０位（ＳＧにＬｌ）に位置する重要なエピトープがそのＣ末端において反復するペプチドＢＣＨ−４０８が、他のペプチドに比較して優れた感度を有するということが明かである。

アミノ酸５７８位においてアルギニンをリシンに置換すると、旧Ｖ−２抗体を検出する感度が上昇するということを、ＨＩＶ−２ペプチドによって発見した。５７７位において、リジンを追加することにより、感度のさらなる上昇を得た。表４は、血清試料中の抗体の希釈度を上昇させながら、ペプチドＢＣＨ−２０，２ｃ（５７８（アルギニン））の感度を、ペプチドＢＣＨ−２０２ｃｋ（５７８（リジン））およびペプチドＢＣ１１−２６６（５９ｇ（リジン）−５７７（リシン））の感度に比較している。

旧ｖ−１およびＨＩＶ−２抗体の混合物を検出するために、ペプチド混合物をも生成した。表５は、ＢＣＨ−８７ｃとＢＣト２０２Ｃ（共にアルギニン）との混合物であるペプチド混合物の感度、および、ＢＣト８７ｃｋとＢＣＨ−２０２ｃｋ（共にリシン）との混合物であるペプチド混合物の感度を比較している。アルギニンをリジンに置換したペプチドを含んだペプチド混合物は、旧Ｖ抗体を検出することにおいて、より高い感度を有する。

（以下余白） −り上−心！子スト３１４　、、Ｌ　Ｏｎ＊１ｍ１ｌ−１６２０，０１００，ｏｔｓ　ｏ＋ｏｚａ“１゛１°１６９　０．Ｏ？５　０．Ｏ９００，ｌ５ａＩＩＩ°１−１７２　０．０１２　０．Ｏ１２０，０３ＯＣＡＰ−１１３＞２．８　＞１．ａ　）ＺＪ−・１１＆　）２．６　＞２．Ｊｌ　シ２．ａｕ−１１５　１＋９！５　２．５Ｆ！　＞ｚ、５ＣＡＰ−１１６１，２７５ｔＪ７１　２．３７６ＣＡＰ・１１７　０．７３９　１ｊ５８　１．５６９ＣＡＰ−１１１０，４３３０，６７９ロ、側μＪ・１１９　ロ、ツ１　０．３９２　０．５４７ｗ−１ｔｕ　Ｏ＋１１７　０＋２２９　０．３７６ｃａｐ・２２２　０．０５？　０．０＆９　０．０９５【＾ｐ−ｚｚｓ　ｏ−ロ５３　（１，Ｑ＆０　０．ロア５ＣＡＰ−２２４０，０５１０，０５４ｏ、ｍｃａｐ −ｚｚｓ　ロバ＋４９　０．０５０　０．１３５ＣＡＰ−２２６０，０４６０，０５０ｏ、ｔａ。

（ＡＰ−２２７Ｇ、Ｃ１６１０，０４３０ｊ）ａｓＣＡＰ−２２＋１　ｏ、ｏｓａ　Ｏ，０４２Ｃ１，０９１ｃａｐ−ｚｓ心　ロ、銅５　０．０４？　ｇｌ、１２３（払下ｉｅ３）ｋＬＬ」ｌＬ！ｖｉｓａ−ｍ　＠、ｌ＄２？　０．ａ　ｏ、Ｃ２３ｏ、１ｏｓＪ−ｊＦ−Ｖ−ｆａ＠、ａＭＩ＠、０１５０．（１２ＣＩ０．０１４２−１７−Ｌ−１３９（１，ｆｆｕ　Ｏ，＆Ｄ９　（１，ｆ４７　ｔｌ、０２５書や・団ア００ロ２６００ロ２２ｏ、ロエ□ｏ、ｏｚ’ｐ・ｃａｐ−ｔｔ　）２Ｊ　＞２Ｊ　＞２．８　ｈｌ、Ｒζ＾＃−１２２，４工２　２．７ゴＳ　ｍｌ＋暮　、２．１ｅＡＰ−１３１，１Ｍ　１．６７４　２．ＲＩ　Ｚ、３ｔ？ＣＡｊｌ−１４０，＆Ｍ　１．Ｏａ９　１　＋２１Ｊ　１．０！り」・ｔｓ　ａ、＜４９　Ｇ関　０」−ゐ　。、ａ５５ｕ−１４０，２ｂ２　０．２Ｘ　ＯＪ＆６　０．４５５ＣＡＰ−１７０＋１４１　０＋１９１　ＬｊＮ　０．２＆４の・１８　０．０９’Ｉ　Ｏ，＋１＆　０．１１６　０．１ｓ６−・１９ｏ、（転）　０．０５３　０．０％６　０．１（１ｍｋｃ−ヱ一鴫シＰ２　＠、−◎、ｏｚｙ　＠、心、１１１−１−１７２　０．０１９　ロー０２＆　ａ、０５ａＷ−１１１＋ｍ　ｈｌ、ｍ　ｈｌ、ａＣＩＩＰ−１％　１．０７０　２．０１５　２．１３４Ｃ＃−’ｔｆｆｓ　０４１１　１．１９５　ｔ、り０ＯＦ−ｍ＄７　ｇｌ、１Ｘ　１１＋３４ｓ　０．６１０−ム上Δ二Ｚ　／Ｉ　＊　ｈｌ　＋ｔ＝　を１貰りし１子スト　３１０　ｇ　ｐｍ以下に、本発明のペプチド合成および利用の一般的工程を述べる。

工程１：Ｎα−ＦＭＯＣ保護アミノ酸残基を有する樹脂の調製塩化メチレン（ＣＨ２Ｃ１２）とジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）との混合液（４：１）中の所望のＮα−ＦＭＯＣ保護アミノ酸残基を、０℃で、ｐ−ベンジルオキシアルコール樹脂のＣＨ２Ｃｌ２二ＤＭＦ（４：１）Ｍ濁ｍｉ：添加した。混合液を手で数秒間攪拌し、その後、Ｎ、　Ｎ’−ジシクロへ牛ジルカルボジイミド（ＤＣＣ）　Ｊこより処理し、続いて、触媒作用を有する量の４−（ジメチルアミ／）ピリジンにより処理した。混合液を０℃でさらに３０分間攪拌し、その後、室温で一晩攪拌した。濾過した樹脂を、ＣＨ２Ｃｌ２、ＤＭＦおよびインプロパツールにより連続して洗浄しく各３回）、最後にｓ　ＣＨ２Ｃｌ２により洗浄した。樹脂を、ＣＨ２Ｃｌ２に懸濁し、水槽中で冷却し、再蒸留したピリジンを攪拌した懸濁液に添加し、その後、塩化ベンゾイルをも添加した。攪拌を０℃で３０分間続け、その後、室温で６０分間続けた。濾過後、樹脂を、ＣＨ２Ｃｌ２、ＤＭＰおよびインプロパツールにより連続して洗浄しく各３回）、最後に、石油エーテルにより洗浄しく２回）、その後、重量が一定になるまで高減圧下で乾燥させた。Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒら（Ｉｎｔ、　Ｊ。

、Ｐｐｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｆｎ　Ｒｅｓ、、　ｕ、　３５．１９７９）による置換の分光測定は、樹脂に対する置換の度合を示している。

工程２：後続アミノ酸の結合Ｎα−ＦＭＯＣ保護第１アミノ酸残基を有する樹脂を、バイオリサーチ製９６００ペプチド合成器（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　９６００　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｆｚｓｒ）の反応容器中に入れ、以下のように処理した：１　）　ＤＭＦにより洗浄した（各２０秒間ずつ４回）２）ＤＭＦ中のピペリジン３０％溶液により予備洗浄した（３分間）３）ＤＭＦ中のピペリジン３０％溶液により脱保護した（７分間）４）ＤＭＦにより洗浄した（各２０秒間ずつ８回）５）遊離アミノ基を調べた一Ｋａｉｓｅｒ　（カイザー）テスト（陽性でなければならない）６）その後、ペプチド樹脂を、１６当量の４−メチルモルホリンを含む、脱水再蒸留ＤＭＦ中にすべて溶解した、所望のＦＭＯＣ保護アミノ酸の８当量、モして１−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムへキサフルオロホスフェートにより、１時間または２時間穏やかに振った。

？）ＤＭＰＪこより洗浄した（各２０秒間ずつ６回）。

ステップ７の後、ニンヒドリンテストのために一部を取った。テストが陰性′であった場合は、ステップ１に戻って次のアミノ酸を結合する。テストが陽性または少し陽性であった場合は、ステップ６および７を反復すべきである。

本発明によるペプチドのアミノ酸の各々を結合させるために、上記の方法を使用し得る。合成工程を通じて、残りのアミノ酸の各々に、ＦＭＯＣによるＮα保護をも使用し得る。

上記のカップリングプロトコルを用いてトリチウム化したアミノ酸を組み込むことにより、放射性同位元素標識のペプチドを調製し得る。

最後のアミノ酸を追加した後、上記工程のステ・１ブ１−７に戻ることにより、Ｎ末端残基のＮａ−ＦＭＯＣを除去する。ペプチド樹脂をＣＨ２Ｃｌ２により洗浄し、減圧下で乾燥させることにより、粗保護ペプチドを生成する。　゛工程３：脱保護および樹脂からのペプチドの切断保護ペプチド−樹脂を、２．５％エタンジチオールおよ゛び２．５％アニソールを含む、Ｃ■２Ｃ１２中５５ｘト中ソ５ｘトリフルオロ酢酸溶液中に懸濁した。混合液をＮ２により洗い流し、室温で、１．５時間攪。

拌した。混合液を濾過し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２により洗浄した。樹　、脂を再びＣＨ２Ｃｌ２中２０％ＴＦＡ溶液により室温で５分間処理した。

混合液を濾過し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２中２ＣＩＸＴＦＡ溶液により洗浄し、その後、ＣＨ２Ｃｌ□により洗浄した。組み合わせた濾過水を３５℃より低い温度で減圧下でエバボレートシ、残留物を、乾燥ジメチルエーテルにより数回粉砕した。、固体を１０％酢酸水溶液中に溶解し、凍結乾燥して粗生成物を得た。

ａｒｇおよびｃｙｓ残基を含むペプチドを、アニソールおよびジメチルスルフィドの存在下において０℃で１時間ＨＦ処理を行うことにより、さらに脱保護する。１０％酢酸水溶液によりペプチドを抽出し、ジメチルエーテルにより洗浄し凍結乾燥して粗生成物を得た。

工程４：ペプチドの精製移動相のグラジェントによるＣＩｌ＋またはＣ４逆相Ｖｙｄａｃカラム（２，５ｘ　２５ｍｍ＞での調製ＦｆｌＨｐＬｃにより、粗ペプチドを精製した。

溶出物を２２０　ｎｉでモニターし、続いて分析用ＨＰＬＣにかけた。

関連の画分をプールし、蒸発させ、凍結乾燥した。合成ベブ＋Ｆ１７）ｌｊ４定を、分析用逆相クロマトグラフィーおよびアミノ酸分析により証明した。

工程５：ペプチドの環状化フェリシアン化カリウム溶液＜０．ＱＩＭ、　ｐＨ７、ｏ）を、線状ペプチドのｐＨＴ、ｏ希釈水溶液（０，５ｄ）にゆっくりと添加した。室温で２４時間保持した後、ｐＨを５．０まで低下させ、溶液を３０分間、イオン交換樹脂（Ｂｉｏ −Ｒａｄ　Ａｇ−３−Ｘ４ａ、　Ｃ１形態）により処理した。

懸濁液を濾過し、濾過液を凍結乾燥することにより、粗環状ペプチドを得た。ペプチドを調製用逆相ＨＰＬＣにより精製し、アミノ酸分析により特徴づけを行った。環状ペプチドの一部を還元して線状ペプチドに戻すこと、およびまた環状化後の遊離スルフヒドリル基の消失を観察すること（Ｅｌｌ■ａｎ’ｓ　ｔｓｓｔ）により、環状ペプチドのＨＰＬＣ移動度を、初期線状ペプチドと比較し、それによって、環状度の証明を得た。

工程６：ペプチドの、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンベットヘモシアニンへノ結合スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ− ＳＭＰＢ）、または、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロへ牛サンー１−カルボキシレート（スルホ−３ＭＣＣ）により前もって誘導体化されたＢＳＡまたはＫＬＨに、ペプチドを結合した〇スルホ−ＳＭＰＢまたはスルホ−３ＭＣＣ（Ｐｉｅｒｅｅ　Ｃｈｅ＋５ｉｃａｌｓ）の溶液の一部を、ＢＳＡまたはＩＬＨ＋７）０．０２　Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７，０）に添加した。混合液を室温で４５分間振り、活性化された担体を即時に、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）により４℃で平衡された５ｅｐｂａｄｅｘ　Ｇ−２５カラムに添加した。

活性化された担体に対応する第１のピークの吸光度（２８０ｎ謂）の画分を、丸底フラスコ内に合せ、前記丸底フラスコに、ペプチドの０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６，２）を添加した。混合液をＮ２により母金に洗い流し、室温で一部インキユベートした。３Ｈ標識ペプチドを用いること、および結合体のアミノ酸分析することにより、結合率をモニターした。

工程７：酵素結合イムノソルベントアブセイ（ＥＬ　ｌ５Ａ）　ニよる、ＨＩＶに対する抗体の検出マイクロタイタープレートの各々のウェルを、ペプチドまたはペプチドの混合物（５μｓ／ｍ　ｌ　）を含む溶液１００μｍにより飽和し、−晩装置する。ウェルを空にし、洗浄緩衝液（トリス、０．０４３Ｍ：　ＮａＣ１，０，５Ｍ：　チメロサール、Ｏ，０１％　ｖ／ｖ；　Ｔｗｅｅｎ　（）ウィーン）　２０％０．０５％　ｖ／ｖ：　ｐＨ７，４）により２回洗浄する。その後、ウェルを、０．３５　ｍｌの洗浄緩衝液により３７’Ｃで１時間飽和し、同一の緩衝液により１回洗浄する。分析すべき血清試料を標本緩衝液（洗浄緩衝液にカゼイン０．０５％マ／Ｖを加えたもの）により希釈する。ウェルを洗浄緩衝液により水洗し、その後、希釈血清試料（０，１ｍ１）に添加する。これらを室温で１時間インキュベートする。その後、ウェルを空にし、速やかに２回洗浄し、その後、２分間にわたって１回洗浄緩衝液により洗浄する。洗浄緩衝液中の、１％Ｖ／Ｖウシ血清アルブミンにより希釈された結合体溶液（標識ヒトＩｇＧベロキシダーゼに対するアフィニティー精製のヤギ抗体、ＳＯＷグリセロール５　ｍｌ中０．５■ｇ）を、各々のウェル（０，１ｍｌ）に添加し、室温で１時間インキ１ベートする。

その後、ウェルを空にし、洗浄緩衝液により２回速やかに洗浄し、その後、５回洗浄する。前記５回の洗浄において、緩衝液は１回の洗浄毎に２分間ウェルと接触Ｌ　ｒ　イた。基質溶液（３，３°、５．５°−テトラメチルベンジジン、ＤＮＳｏ　１　ｍｌにつき８　ｍｇ）を、０．１％ｖ／ｖの３０％Ｈ２０，を含む０．１Ｍクエン酸−酢酸緩衝液、ｐＨ５，６，１００容量により希釈し、各々のウェルに添加する（１ウエルにつき０．１ｍ１）。１０分後、各々のウェルの含有物を、２）ｌ　Ｈ２ＳＯ４０，１ｍｌにより処理し、４５０　ｒｕｓで光学濃度を読み取る。すべての測定を２回行う。

工程８；ペプチド混合物の調製２つのペプチド溶液を当量、１０μｇｅｍ　ｌずつ混合することにより、ペプチド混合物をｉｉ＃した。１つの混合物はペプチドＢＣＨ−８７ｃおよびＢＣト２０Ｚｃを使用し、他の混合物は、ＢＣＨ−ａ７ｃｋとＢＣＨ−２０２ｃｋとの混合物であった。各混合物を用いて、上記したように、２群のプレートをコートした。

要約書一般式（１）および（ＩＩＩ）の環状ペプチドであって、ここで、菫が、５８５位から６０４位（ｇｐ４１−旧ｖ−１）のアミノ酸配列を表１シ、このようなアミノ酸配列が、５８６位に少な（とも１つのりシンを有するか、または５８５位と５８６位の両方にリシンを有すル、コトヲ特徴トシ、ｘ２カ、ＳａＳ位から６０４位（ｇｐ４２−ＨＩＴ−１）　ノアミノ酸配列を表し、ｙが、６１２位から６２９位（ｇｐ４１−ＨＩＶ−１）のアミノ酸配列を表し、ｅおよびｆが、５８６位から６２９位（ｉｐ４１−ＨｌｔＶ−１）　、または５７８位から６１３位（ｇｐ３６−旧Ｖ−２）　ノア　２　／酸配列に含まれる１つまたはそれ以上のエピトープを表し、そして、１およびｂが、それぞれ、ペプチドを免疫診断試薬として、より有用なものにするために有効な、アミノ末端およびカルボキシ末端、ならびに置換基を表す、ペプチドが提供される。

式１１１のペプチドは、ｅおよびｆのうちの１つまたはその両方を有する。さらに、一般式（！りおよび（！Ｖ）のペプチドであって、ここで、ｘ’Ｍ、　５７７位から５９６位（ｇｐ３６−ＨＩＶ−２）のアミノ黴配列を表し、このようなアミノ酸配列が、５７８位に少なくとも１つのりシンを有するか、または５７７位と５７８位の両方にリジンを有することを特徴とし、ｘ３が、５７７位から５９６位（ｇｐ３６−ＨＩＶ−２）　ノア　４　／酸配列を表し、ｙｌが、６０４位から６１３位（６１３位（ｇｐ３６−ＨＩＶ−２）または５８６位から６２９位（ｇｐ４１−ＨＩｖ−Ｌ）のアミノ酸配列に含まれる１つまたはそれ以上のエピトープを表し、そして、３およびｂが、上記に定義された通りである、ペプチドが提供される。式（ｍのペプチドは、ｅおよびｆのうちの１つまたはその両方を有する。これらの環状ペプチドが単独で、または他のペプチドとの混合物が、分析物および血清における旧１１−１およびＩＨＶ−２抗体を検出するのに特に有用である。

国際調査報告＋１１１ｊｌ１ｗ１４Ｍｌ＾＊ｍｔａｂｍｓｇｏ、Ｏ「Ｔ／ｒＡＱｌノｎｎフ１１国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．以下の式で表される実質的に純粋なペプチドであって、【配列があります】ここで、ｘが独立して、【配列があります】（５８６−６０４）【配列があります】（５８５−６０４），この配列に対応して他のＨＩＶ−１分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸配列、および保存的アミノ置換のために、該アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなる群から選択され、該ペプチドが、５８６位に少なくとも１つのリシンを有するか、または５８５位と５８６位の両方にリシンを有することを特徴とし；ｙが、存在する場合には、独立して、【配列があります】，上記配列に対応して他のＨＩＶ−１分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸、および保存的アミノ置換のために、上記とは異なるアミノ酸配列からなる群から選択され；ｅおよびｆが、存在する場合には、独立して、ＨＩＶ−１のｇｐ４１の５８６位から６２９位にまたがるアミノ酸配列領域、またはＨＩＶ−２のｇｐ３６の５７８位から６１３位にまたがるアミノ酸配列領域の任意のエピトープのアミノ酸配列、これに対応して他のＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸配列、およびこれらのエピトープの任意の組み合わせからなる群から選択され；ａが、カップサング因子として有効な、および／または該ペプチドをその抗原特性を変えることなく、該ペプチドを免疫診断試薬としてより有用にするのに有効なアミノ末端または置換基であり；そして、ｂが、カップリング因子として有効な、および／または該ペプチドをその抗原特性を変えることなく、該ペプチドを免疫診断試薬としてより有用にするのに有効なカルボキシ末端または置換基である、ペプチド。
２．以下の式で表される実質的に純粋なペプチドであって、▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、ｘ′が独立して、【配列があります】（５７８−５９６）【配列があります】（５７７−５９６），この配列に対応して他のＨＩＶ−２分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸配列、および保存的アミノ置換のために、該アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなる群から選択され、該ペプチドが、５７８位に少なくとも１つのリシンを有するか、または５７７位と５７８位の両方にリシンを有することに特徴づけられ；ｙ′が、存在する場合には、独立して、【配列があります】，上記配列に対応して他のＨＩＶ−２分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸、および保存的アミノ置換のために、上記とは異なるアミノ酸配列からなる群から選択され；ｅおよびｆが、存在する場合には、独立して、ＨＩＶ−１のｇｐ４１の５８６位から６２９位にまたがるアミン酸配列領域、またはＨＩＶ−２のｇｐ３６の５７８位から６１３位にまたがるアミノ酸配列領域の任意のエピトープのアミノ酸配列、これに対応して他のＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸配列、保存的アミノ置換のために、上記とは異なるアミノ酸配列、およびこれらのエピトープの任意の組み合わせからなる群から選択され；ａが、カップリング因子として有効な、および／または該ペプチドをその抗原特性を変えることなく、該ペプチドを免疫診断試薬としてより有用にするのに有効なアミノ末端または置換基であり；そして、ｂが、カップリング因子として有効な、および／または該ペプチドをその抗原特性を変えることなく、該ペプチドを免疫診断試薬としてより有用にするのに有効なカルボキシ末端または置換基である、ペプチド。
３．ｘが【配列があります】であり、ならびにｙが【配列があります】であり、そしてｅおよびｆが存在しない、請求項１に記載のペプチド。
４．ｘが【配列があります】であり、ならびにｙが【配列があります】であり、そしてｅおよびｆが存在しない、請求項１に記載のペプチド。
５．ｘが【配列があります】であり、ならびにｙが【配列があります】であり、ｆがＳＧＫＬＩであり、そしてｅが存在しない、請求項１に記載のペプチド。
６．ｘ′が【配列があります】であり、ならびにｙ′が【配列があります】であり、そしてｅおよびｆが存在しない、請求項２に記載のペプチド。
７．ｘ′が【配列があります】であり、ならびにｙ′が【配列があります】であり、そしてｅおよびｆが存在しない、請求項２に記載のペプチド。
８．ｘ′が【配列があります】であり、ならびにｙ′が【配列があります】であり、ｆがＡＦＲＱＶであり、ｅが存在しない、請求項２に記載のペプチド。
９．以下の式で表される実質的に純粋なペプチドであって、▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、ｘ２が、存在する場合には、独立して、【配列があります】，この配列に対応して他のＨＩＶ−１分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸配列、および保存的アミノ置換のために、上記とは異なるアミノ酸配列からなる群から選択され；ｙが、存在する場合には、独立して、【配列があります】，上記配列に対応して他のＨＩＶ−１分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸、および保存的アミノ置換のために、上記とは異なるアミノ酸配列からなる群から選択され；ｅおよびｆが、独立して、ＨＩＶ−１のｇｐ４１の５８６位から６２９位にまたがるアミノ酸配列領域、またはＨＩＶ−２のｇｐ３６の５７８位から６１３位にまたがるアミノ酸配列領域の任意のエピトープのアミノ酸配列、これに対応して他のＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸配列、保存的アミノ酸のために、上記とは異なるアミノ酸配列、およびこれらのエピトープの任意の組み合わせからなる群から選択され、該ペプチド中にｅおよびｆの１つもしくは両方が存在し；ａが、カップリング因子として有効な、および／または該ペプチドをその抗原特性を変えることなく、該ペプチドを免疫診断試薬としてより有用にするのに有効なアミノ末端または置換基であり；そして、ｂが、カップリング因子として有効な、および／または該ペプチドをその抗原特性を変えることなく、該ペプチドを免疫診断試薬としてより有用にするのに有効なカルボキシ末端または置換基である、ペプチド。
１０．以下の式で表される実質的に純粋なペプチドであって、 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、ｘ３が、存在する場合には、独立して、【配列があります】，この配列に対応して他のＨＩＶ−２分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸配列、および保存的アミノ置換のために、上記とは異なるアミノ酸配列からなる群から選択され；ｙ′が、存在する場合には、独立して、【配列があります】，上記配列に対応して他のＨＩＶ−２分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸、および保存的アミノ置換のために、上記とは異なるアミノ酸配列からなる群から選択され；ｅおよびｆが、独立して、ＨＩＶ−１のｇｐ４１の５８６位から６２９位にまたがるアミノ酸配列領域、またはＨＩＶ−２のｇｐ３６の５７８位から６１３位にまたがるアミノ酸配列領域の任意のエピトープのアミノ酸配列、これに対応して他のＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸配列、保存的アミノ置換のために、上記とは異なるアミノ酸配列、およびこれらのエピトープの任意の組み合わせからなる群から選択され、該ペプチド中にｅ′およびｆ′の１つもしくは両方が存在し；ａが、カップリング因子として有効な、および／または該ペプチドをその抗原特性を変えることなく、該ペプチドを免疫診断試薬としてより有用にするのに有効なアミノ末端または置換基であり；そして、ｂが、カップリング因子として有効な、および／または該ペプチドをその抗原特性を変えることなく、該ペプチドを免疫診断試薬としてより有用にするのに有効なカルボキシ末端または置換基である、ペプチド。
１１．請求項１、２、９および１０のいずれかに記載のペプチドからなる群から選択される２つ以上のペプチドを含む、混合物。
１２．少なくとも以下のペプチド、【配列があります】（ＢＣＨ−４Ｃ８）この配列に対応して他のＨＩＶ−１分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸配列、および保存的アミノ置換のために、上記とは異なるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が、５８６位のリシンにより特徴づけられる、請求項１１に記載の混合物。
１３．少なくとも以下のペプチド、【配列があります】（ＢＣＨ−４■７）この配列に対応して他のＨＩＶ−２分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸配列、および保存的アミノ置換のために、上記とは異なるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が、５７８位のリシンにより特徴づけられる、請求項１１に記載の混合物。
１４．少なくとも以下のペプチド、【配列があります】（ＢＣＨ−８７Ｃ■），この配列に対応して他のＨＩＶ−１分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸配列、および保存的アミノ置換のために、上記とは異なるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が、５７８位のリシンにより特徴づけられる、請求項１１に記載の混合物。
１５．少なくとも以下のペプチド、【配列があります】（ＢＣＨ−２０２Ｃ■），この配列に対応して他のＨＩＶ− ２分離株の相同領域から誘導されるアミノ酸配列、および保存的アミノ置換のために、上記とは異なるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が、５７８位のリシンにより特徴づけられる、請求項１１に記載の混合物。
１６．請求項１から１０のいずれかに記載のペプチドまたは請求項１１から１５のいずれかに記載の混合物により特徴づけられる、分析物中のＨＩＶ−１抗体、ＨＩＶ−２抗体、およびその混合物からなる群から選択される抗体の存在を検出する、方法。
１７．分析物の一部を、請求項１から１０のいずれかに記載のペプチドまたは請求項１１から１５のいずれかに記載の混合物と接触させる工程を包含する、分析物中のＨＩＶ−１抗体、ＨＩＶ−２抗体、およびその混合物からなる群から選択される抗体の存在を検出する、方法。
１８．ＥＬＩＳＡ、血球凝集反応、およびシングルドットまたはマルチドットストリップ検定法からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
１９．請求項１から１０のいずれかに記載のペプチドおよびその混合物と免疫学的に交差反応する、抗体。
２０．前記抗体が、モノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の混合物である、請求項１９に記載の抗体。
２１．請求項１９または２０に記載の抗体により特徴づけられる、分析物中のＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ−２抗原、およびその混合物からなる群から選択される抗原の存在を検出する、方法。
２２．分析物の一部を、請求項１９または２０に記載の抗体と接触させる工程を包含する、分析物中のＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ−２抗原、およびその混合物からなる群から選択される抗原の存在を検出する、方法。
２３．請求項１から１０のいずれかに記載のペプチドまたは請求項１１から１５に記載のいずれかに記載の混合物を含む薬学的に受容可能な組成物であって、該ペプチドまたは該混合物が、該組成物で処置されたヒトを含む哺乳類において、該処置された哺乳類をＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２ウイルス感染から一定期間防御するのに十分な抗体を生じるのに有効な量で該組成物中に存在する、組成物。
２４．生理学的に受容可能な担体を含む、請求項２３に記載の薬学組成物。
２５．アジュバントまたは免疫応答エンハンサーを含む、請求項２３に記載の薬学組成物。
２６．ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２ウイルス以外の病原体に対する第２抗原を含む請求項２３に記載の薬学組成物であって、該第２抗原が、処置された哺乳類を該病原体による感染から一定期間防御するのに十分な抗体を生じるのに有効な量で存在する、薬学組成物。
２７．請求項２３から請求項２６のいずれかに記載の薬学組成物で哺乳類を処置する工程を包含し、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２による感染、またはＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２および他の病原体による同時感染から、ヒトを含む哺乳類を防御する、方法。