PT98249B - Peptidos sinteticos e suas misturas para a deteccao de anticorpos hiv - Google Patents
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Description
PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PÉPTIDOS SINTÉTICOS E SUAS MISTURAS PARA A DETECÇÃO DE ANTICORPOS HIV E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM
DOMÍNIO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a novos péptidos cíclicos e suas combinações isoladamente e com péptidos lineares e cíclicos para a detecção de anticorpos dos VIH.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Admite-se que a síndroma da imunodeficiência adquirida (SIDA), o complexo associado à SIDA (CAS) e a pré-SIDA sejam provocados por um retrovírus, o vírus da imunodeficiência humana (VIH). 0 primeiro vírus associado à SIDA, o VIH-1 (também conhecido como VLTH-III, VAL-1 e RVS) está bem caracterizado. Recentemente foi isolado outro retrovírus humano patogénico designado por VIH-2 (inicialmente designado por VAL-2) a partir de pacientes da África Ocidental com SIDA. Veja-se, por exemplo, a patente WO 87/04459.
«r
Demonstrou-se recentemente que o VIH-2 (Guyader et al. Nature 326 662-669, 1987) partilha diversas sequências específicas com o VIH-1 e com os vírus da imunodeficiência dos símios (VIS).
utilizados facilidade
Pese embora o facto de na especialidade serem outros sistemas de numeração, por razões de de compreensão e de comparação adoptou-se na presente memória descritiva o sistema de numeração dos aminoácidos segundo Ratner e colaboradores, Nature, 313, 277-284, 1985 para as proteínas do VIH-1 e o sistema segundo Guyader e colaboradores, Nature 326, 662-669 (1987) para as proteínas do VIH-2. Os aminoácidos nos peptidos da presente invenção são designados de acordo com os seguintes códigos de três letras: ala, arg, asn, asp, cys, gin, glu, gly, his, ile, leu, lys, met, phe, pro, ser, thr, trp, tyr e vai.
Os testes iniciais de imunodiagnóstico para a detecção dos anticorpos no soro de pacientes infectados com o VIH-1 utilizaram como antígeno o vírus integral. Os testes de segunda geração passaram a utilizar sequências peptídicas obtidas pela metodologia do ADN recombinante. Cabradilla et al. Bio/Technology 4 128-133 (1985) e Chang et al. Bio/Technology 3_, 905-909 (1985), por exemplo, referem-se a fragmentos protéicos virais sintetizados bacterianamente possuindo 82 e 102 resíduos aminoácidos, respectivamente. Os pedidos de patente europeia EPA 202314 e 114243 referem-se aos polipeptidos recombinantes que abrangem as regiões da gp41 e da gp120 que são imunorreactivos por si sós ou em misturas. Shoeman et al., Anal. Biochem. 161, 370-379 (1987) refere-se a vários polipeptidos da gp41 que são imunorreactivos com os anticorpos existentes nos soros provenientes de pacientes infectados com o VIH-1. Contudo, nenhum dos procedimentos de ensaio referidos antes é totalmente aceitável. A sua falta de sensibilidade constituí um defeito crítico. Eventualmente isso pode permitir que o sangue contendo o vírus escape à detecção fazendo com que haja a possibilidade de infecção dos recebedores do produto sanguíneo e fazendo com que haja uma infecciosidade continuada pelos portadores de SIDA não diagnosticados. A sua falta de especificidade (falsos positivos) constituí também um problema - eventualmente pode ser dito a indivíduos saudáveis que possuem SIDA. Esses falsos positivos podem ser originados por impurezas. Também podem ser provocados epítopes partilhados com vírus que não têm qualquer relação com a SIDA existentes nessas preparações de antígenos. A este respeito, Gallaher, Cell 50 327-328, 1987 descreveu que uma região da gp41 do VIH-1 partilha uma sequência de cinco resíduos aminoácidos adjacentes com o vírus sincicial respiratório e 4 aminoácidos igualmente distribuídos da glicoproteína F1 do vírus do sarampo. Sendo assim, mesmo os polipeptidos recombinantes altamente purificados que contêm esta região, ou que contêm outras regiões comuns que ainda venham a ser descobertas, podem potencialmente ser responsáveis por falsos positivos e pela concomitante especificidade não aceitável. Finalmente, esses testes de a detecção de . Estes factos termos da sua SIDA numa fase acordo com a técnica anterior não permitem níveis muito fracos de anticorpos dos VIH constituem desvantagens para os testes em capacidade para detectarem infecções de bastante precoce retardando consequentemente o início do tratamento e permitindo a possível disseminação da infecção através de amostras sanguíneas e através de outros fluídos corporais antes de se conseguir uma detecção concreta da infecção de SIDA.
Numa tentativa para a resolução desses problemas estão a ser desenvolvidos actualmente meios e métodos de diagnóstico que utilizam antígenos mais curtos do VIH. Actualmente existem também métodos empíricos para identificar as sequências peptídicas correspondentes a epítopes únicos e altamente estáveis dos VIH. A título de exemplo refere-se que esses métodos permitem auxiliar a selecção de sequências curtas de aminoácidos as quais são mais provavelmente expostas à superfície da proteína nativa e consequentemente são úteis como instrumentos de ensaio (para uma revisão veja-se Hopp and Woods, J. Immunol. Met. 88, 1-18, 1986). Embora esses métodos sejam úteis de alguma forma, não são mais do que métodos indicativos. Apesar de tudo foram aplicados para identificar os epítopes existentes à superfície dos vírus responsáveis pela SIDA. Por exemplo, a patente norte-americana nQ 4629783,
International Patent Appl. PCT/US86/00831 e o pedido de patente europeia EPA 303224 referem-se a diversos péptidos sintéticos provenientes das proteínas p18, p25, gp41 e gp120. Esses péptidos possuem a vantagem do seu menor custo e relativa facilidade com que podem ser preparados considerando -se também como factor bastante importante o risco reduzido de se vir a obter falsos positivos com esses péptidos devido à existência de impurezas ou devido à presença de epítopes partilhados com proteínas virais não relacionadas com a SIDA.
os polipeptidos o vírus integral tem-se verificado
Embora estes péptidos menores possuam a vantagem em termos de especificidade sobre recombinantes anteriormente utilizados e conduza à diagnose das infecções de SIDA, que são menos satisfatórios em termos de sensibilidade global, talvez devido ao facto de o epítope sintetizado não ser capaz de assumir e manter a conformação que é reconhecida pelos anticorpos da SIDA. Embora o número de amostras de soro testadas em cada um desses casos seja bastante limitado, descobriu-se que a especificidade (poucos ou mesmo nenhuns falsos positivos) era bastante elevada (95% - 100%) com os pequenos péptidos sintéticos mas a sensibilidade global variava entre 80 e 100%. Na realidade, no único exemplo em que se atingiu uma sensibilidade de 100% apenas foram testadas dez amostras. Por exemplo, Smith et al., J. Clin. Microbiol. 25 1498-1504, 1987 refere-se a dois péptidos sobrepostos, E32 e E34, os quais são altamente imunorreactivos. Não foram obtidos falsos positivos em 240 espécimes seronegativos, mas os péptidos falharam três amostras seropositivas em 322 (sensibilidade da ordem de 99,1%). Wang et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. 83, 6159-61 63, 1986) refere-se a uma série de péptidos sobrepostos (incluindo os resíduos aminoácidos dos péptidos E32 e E34 de Smith) entre os quais um péptido de 21 subunidades demonstrou 100% de especificidade e 98% de sensibilidade (em 228 amostras seropositivas obtidas a partir de pacientes com SIDA verificou-se que 224 eram positivas com este péptido). O pedido de patente norte americano na 120027 depositado em 13 de Novembro de 1987 refere-se a um curto péptido sintético abrangendo os resíduos 606 a 620 (ser-gly-lys-leu-ile-cys-thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser) da gp41 (VIH-1). Afirma-se que este péptido é imunorreactivo cora os anticorpos de paciente infectados pelos vírus da SIDA. A especificidade também foi excelente (63/63) mas não foi possível detectar 6 espécimes seropositivos em 57 confirmados como positivos (sensibilidade correspondente a 89%).
Gnann et al. (J.-Virol. 61_, 2639-2641 , 1987 e J. Infec. Dis 156, 261 -267, 1987) referem-se também a uma série de péptidos sobrepostos provenientes de uma presumível região imunodominante da gp41 (VIH-1). Gnann e seus colaboradores concluíram que o resíduo cys-605 foi essencial para a imunorreactividade desse segmento da proteína gp41-(VIH-1).
t
Referiram no seu trabalho que um péptido possuindo a sequência SGKLIC (606-611) não foi imunorreactivo com qualquer dos 22 soros positivos em VIH-1 que foram testados, ao passo que a adição do resíduo cisteína ao terminal N restabeleceu alguma imunorreactividade, tendo 21 dos 44 soros reagido com o péptido de 7 subunidades (48% de sensibilidade).
Gnann e seus colaboradores (J. Virol) especularam também sobre 605 e 611 da função na formação de dissulfeto. demonstraram a possibilidade do resíduo cisteína nas posições gp41 (VIH-1) puderem eventalmente desempenhar uma conformação antigénica desta região, talvez pela uma estrutura cíclica através de uma ponte Todavia, Gnann e seus colaboradores nunca que dispunham realmente de um péptido sintético em que os dois grupos cisteína estivessem ligados por pontes dissulfeto.
Embora Gnann e seus colaboradores descrevessem péptidos que são úteis para a identificação de anticorpos do VIH-1, verificou-se que mesmo assim esses péptidos não atingiam uma sensibilidade de 100%. Por exemplo, Gnann e seus colaboradores (J. Virol. 61, 2639-2641 , (1987)) afirmaram que enquanto a sua sequência de aminoácidos 600-611 detectava 22 em 22 soros positivos, se confirmava também o facto de testes idênticos efectuados nos centros de controlo da doença, Atlanta, Ga. com a mesma sequência de 12 aminoácidos (600-611) falhavam 1 em 79 soros positivos. Gnann e seus colaboradores na publicação J. Infect. Dis. 156, 261-267, 1987 descreveram que a mesma sequência de 12 aminoácidos era reactiva com 131 em 132 pacientes dos Estados Unidos infectados com o VIH-1.
Gnann e seus colaboradores na publicação Science 237, 1346-1349, 1987 descrevem um curto péptido linear sintético que abrange os resíduos 592 a 603 da gp42 (VIH-2) que contem dois resíduos cisteína numa região homóloga à região 605-611 da gp41 (VIH-1). Este peptido reagiu com 5 em 5 soros obtidos a partir de pacientes infectados com o VIH-2.
Também estão referenciados na especialidade outros péptidos que contêm os aminoácidos 605-611 da gp41 do VIH-1. A patente mundial WO 86/06414 refere-se ao peptido X(39) o qual é codificado pela região compreendida desde o pb 7516 até ao pb 7593 e o peptido XIII(79) o qual é codificado pela região que se estende desde o pb 7543 até ao pb 7593, contendo ambos a sequência de 7 aminoácidos 605-611. As referências a esses péptidos indicam que são lineares e não há qualquer sugestão sobre a formação de estruturas cíclicas. A patente mundial WO 87/06005 refere que uma série de péptidos sintéticos abrangendo os resíduos Cys(605)-Cys(611) da glicoproteína (gp41) da membrana do VIH-1 sofrem uma série de transformações oxidativas e espontâneas ao serem solubilizados em tampões aquosos neutros ou alcalinos. Nessa publicação admite-se como resultado que os péptidos ao serem utilizados de acordo com o protocolo ELISA constituam uma mistura aleetória de monómeros lineares, monómeros cíclicos, dímeros lineares ou cíclicos e polímeros lineares com diversos comprimentos. Na memória descritiva daquela patente não ficou realmente demonstrada a presença de componentes cíclicos e não foram caracterizados os diversos dímeros e polímeros diferentes possivelmente existentes. Além disso, ali se especula sobre o facto de as formas poliméricas constituírem os componentes mais importantes para a reactividade segundo o protocolo ELISA.
Para além da possibilidade de serem misturas complexas de diversas formas oxidativas do peptido, os pêptidos da técnica anterior referenciados antes não permitem a detecção precoce da infecção de SIDA conforme seria de desejar. Por exemplo, Gnann e seus colaboradores (J. Virol.) referem que no caso de os soros positivos em VIH-1 serem diluídos por um factor superior a 500, se verifica que alguns desses soros diluídos conduzem a resultados negativos indicando consequentemente uma fraca sensibilidade do peptido para uma detecção precoce dos VIH.
Esses problemas foram contornados utilizando pêptidos que foram quimicamente ciclizados de modo a formar-se uma ponte dissulfeto entre os resíduos cisteína relevantes. Veja-se por exemplo M. Lacroix et al., Comparative Performance of Cyclic Versus Linear Peptides In An ELISA For HIV-1 And HIV-2 Specific Antibodies, N2. 3147, June 1989 AIDS Conference, Montreal, Canada; e a patente WO 89/03344. A presente invenção visa diversos aperfeiçoamentos nesses pêptidos cíclicos.
SUMARIO DA INVENÇÃO
De acordo com a presente invenção proporciona-se uma nova série de pêptidos os quais são particularmente adaptados para a detecção a 100% dos anticorpos do VIH-1 e do
VIH-2 e os quais são capazes de detectar esses anticorpos mesmo quando apenas existam nos soros em níveis bastante fracos.
Mais presente invenção especificamente, os são seleccionados a novos pêptidos da partir de pêptidos praticamente puros de fórmulas gerais I ou II:
a-e-x-cys- ser -gly-lys-ile-cys-y-f-b (I)
605
611 em que:
x é seleccionado independentemente entre as seguintes sequências de aminoácidos análogas da sequência de aminoácidos da gp41-VIH-1:
lys-ile-leu-ala-vai-glu-arg-tyr-leu-lys-asp-gln-glnleu-leu-gly-ile-trp-gly(586-604) lys-lys-ile-leu -ala-vai-glu-arg-tyr-leu-lys-asp-gingln-leu-leu-gly-ile-trp-gly- (585-604), entre as sequências de aminoácidos que lhe correspondem, sendo essas sequências derivadas de regiões homólogas de outros isolados de VIH-1 e entre sequências de aminoácidos que diferem das anteriores devido a substituições conservadoras, caracterizando-se essas sequências de aminoácidos pelo facto de possuírem pelo menos um resíduo lisina na posição 586 ou um resíduo lisina em ambas as posições 585 e 586;
y, no caso de existir, é seleccionado independemente entre o grupo constituído por:
-thr
-thr-thr
-thr-thr-ala
-thr-thr-ala-val
-thr-thr-ala-val-pro
-thr-thr-ala-val-pro-trp
-thr-thr-ala-val-pro-trp-asn -thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala -thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser • -thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-trp -thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-trp-ser ¥
-thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-trp-ser-asn -thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-trp-ser-asn-lys -thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-trp-ser-asn-lys-ser -thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-trp-ser-asn-lys-ser-leu •thr·thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-trp-ser-asn-lys-ser-leu-glu -thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-trp-ser-asn-lys-ser-leu-glu-gln -thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-trp-ser-asn-lys-ser-leu-glu-gln-ile, entre as sequências de aminoácidos que lhe correspondem, sendo essas sequências derivadas de regiões homólogas de outros isolados de VIH-1 e entre sequências de aminoácidos que diferem das anteriores devido a substituições conservadoras;
e e f, no caso de existirem, são seleccionados independentemente entre o grupo constituído por sequências de aminoácidos de quaisquer dos epítopes da região que abrange os aminoácidos 586 a 629 da gp41 do VIH-1 ou da região que abrange a sequência de aminoácidos 578 a 613 da gp36 do VIH-2, entre as sequências de aminoácidos que lhe correspondem e que são derivadas de regiões homólogas de outros isolados de VIH-1 ou de VIH-2, entre sequências de aminoácidos que diferem das anteriores devido a substituições conservadoras e ainda qualquer combinação desses epítopes;
a representa uma terminação amino ou um substituinte eficaz como agente de acoplamento e/ou eficaz para fazer com que o peptido seja mais útil como reagente de imunodiagnóstico sem alteração das suas propriedades antigénicas: e b representa uma terminação carboxi ou um substituinte eficaz como agente de acoplamento e/ou eficaz para fazer com que o péptido seja mais útil como reagente de imunodiagnóstico sem alteração das suas propriedades antigénicas; e
I 1
1 a-e-x -cys-ala-phe-arg-gln-val-cys-y -f-b
597 603 (II) em que·.
x e seleccionado independentemente entre as seguintes sequências de aminoácidos análogas da sequência de aminoácidos da gp36-VIH-2:
lys-val-thr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-gln-alaarg-leu-asn-ser-trp-gly (578-596) lys-lys-val-thr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-glnala-arg-leu-asn-ser-trp-gly (577-596), entre as sequências de aminoácidos que lhe correspondem, sendo essas sequências derivadas de regiões homólogas de outros isolados de VIH-1 e entre sequências de aminoácidos que diferem das anteriores devido a substituições conservadoras, caracterizando-se essas sequências de aminoácidos pelo facto de possuírem pelo menos um resíduo lisina na posição 578 ou um resíduo lisina em ambas as posições 577 e 578;
y , no caso de existir, e seleccionado /“..Λ·?·*’— jr-~ independemente entre o grupo constituído por
-his
-his-thr
-his-thr-thr
-his-thr-thr-vai
-his-thr-thr-vai-pro
-his-thr-thr-vai-pro-trp
-his-thr-thr-vai-pro-trp-vai
-his-thr-thr-vai-pro-trp-vai-asn
-his-thr-thr-vai-pro-trp-vai-asn-asp
-his-thr-thr-vai-pro-trp-vai- asn-asp- ser, entre as sequências de aminoácidos que lhe correspondem, sendo essas sequências derivadas de regiões homólogas de outros isolados de VIH-1 e entre sequências de aminoácidos que diferem das anteriores devido a substituições conservadoras; e e, f, a e b possuem as significações definidas antes.
De acordo com outra variante, os novos peptidos da presente invenção são seleccionados entre peptidos praticamente puros de fórmulas gerais III e IV:
l-1 a-e-x -cys-ser-gly-lys-ile-cys-y-f-b (UI)
605 611 em que x , se existir, é seleccionado independentemente entre o grupo constituído por:
glytrp-glyile-trp-gly« gly-ile-trp-glyleu-gly-ile-trp-glyleu-leu-gly-ile-trp-glygln-leu-leu-gly-ile-trp-glygln-gln-leu-leu-gly-ile-trp-glyasp-gln-gln-leu-leu-gly-ile-trp-glylys-asp-gln-gln-leu-leu-gly-ile-trp-glytyr-lys-asp-gln-gln-leu-leu-gly-ile-trp-glyarg-tyr-lys-asp-gln-gln-leu-leu·gly-ile-trp-glyglu-arg-tyr-lys-asp-gln-gln-leu-leu-gly-ile-trp-glyval-glu-arg-tyr-lys-asp-gln-gln-leu-leu-çly-ile-trp-glyala-val-glu-arg-tyr-lys-asp-gln-gln-leu-leu-gly-ile-trp-glylys-ala-val-glu-arg-tyr-lys-asp-gln-gln-leu-leu-gly-ile-trp-glyile-lys-ala-val-glu-arg-tyr-lys-asp-gln-gln-leu-leu-çly-ile-trp-glyarg-ile-lys-ala-val-glu-arg-tyr-lys-asp-gln-glD-leu-leu-gly-ile-trp-glyentre as sequências de aminoácidos que lhe correspondem, sendo essas sequências derivadas de regiões homólogas de outros isolados de VIH-1 e entre sequências de aminoácidos que diferem das anteriores devido a substituições conservadoras; e y, e, f, a e b possuem as significações definidas antes, estando presentes um ou ambos os grupos representados por e ou f; e
1 a-e-x -cys-ala-phe-arg-gln-val-cys-y -f-b 597 603 (IV) em que x , se existir, é seleccionado independentemente entre o grupo constituído por:
gly· trp-glyser-trp-glyasn-ssr-trp-glylen-asn-ser-trp-glyarg-leu-asn-ser-trp-glyala-arg-leu-asn- ser- trp-glygln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-glyasp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-glygln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-glyleu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-glytyr-leu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-glylys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-glyglu-lys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-glyile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-glyala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-glythr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-glyval-thr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-glyarg-val-thr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-gly-, entre as sequências de aminoácidos que lhe correspondem, sendo essas sequências derivadas de regiões homólogas de outros isolados de VIH-1 e entre sequências de aminoácidos que diferem das anteriores devido a substituições conservadoras; e
Y z definidas antes, representados por
Um fórmula geral I é e, f, a e b possuem as significações estando presente um ou ambos os grupos e ou f.
peptido particularmente preferencial de o peptido BCH-408 o qual possui a sequência t
seguinte:
a-lys-ile-leu-ala-val-glu-arg-tyr-leu-lys-asp-gin-ginleu-leu-gly-ile-trp-gly-cys-ser-gly-lys-leu-ile-cys605 611 thr-thr- ala-vai-pro-trp-asn-ala-ser-gly-lys-leu-ile-b 619
Este péptido incorpora na posição f do aminoácido 619 a sequência de aminoácidos do epítope localizado na posição 606-610 (ser-gly-lys-leu-ile) da gp41 do VIH-1 e na posição 586 um resíduo lisina.
Um péptido particularmente preferencial de fórmula geral II é o péptido BCH-417 o qual possui a sequência seguinte:
a-lys-val-thr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala578 ,-, arg-leu-asn-ser-trp-gly-cys-ala-phe-arg-gln-val-cys597 603 hi s-thr-thr-vai-pro-trp-vai-asn-asp-ser-ala-phe-arg613 gln-val-b
Este péptido incorpora na posição f do aminoácido 613 a sequência de aminoácidos do epítope localizado na posição 598-602 (ala-phe-arg-gln-vai) da gp36 do VIH-2 e na posição 578 um resíduo lisina.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO
Selecção dos péptidos para síntese
Os péptidos da presente invenção foram sintetizados tomando como base as sequências publicadas dos aminoácidos do VIH-1 e do VIH-2. Contudo, faz-se observar que é possível utilizar sequências derivadas de regiões homólogas de outros isolados de VIH-1 ou VIH-2 sem que haja afastamento do âmbito da presente invenção.
foram f nos diversos
Os seleccionados péptidos da epítopes nessas sequências nativas para utilização como substitutos e e presente invenção utilizando-se princípios fisico-químicos que auxiliam a prever quais as porções de um polipeptido que mais provavelmente se orientam para a superfície e são consequentemente iraunogénicas. Isto engloba as parcelas de hidrofilicidade de Hopp e Woods (Proc. Natl. Acad. Sei. 78, 3824-3828, 1981), e uma abordagem semelhante efectuada por Kyte e Doolittle (J. Mol. Biol. 157,
105-132, 1982). Do mesmo modo também é útil a previsão empírica da conformação proteica (Chou and Fasman, Ann. Rev. Biochem. 47, 251-276, 1978) como guia para a previsão sobre quais as partes do polipeptido são provavelmente imunogénicas.
Os epítopes e e f dos péptidos da presente invenção englobam, sem que isso constitua qualquer limitação, WGCAF (identificado por Norrby et al., AIDS Research and Human
Retroviruses, Vol. 5, N2 5, 1989); lys-asp; ser-gly-lys-leu e peu-glu-asp-gln (identificado por Noreby et al., AIDS, vol. 3, ne 1 (19889); leu-lys-asp-gln, cys-ser-gly-lys-leu-ile, e iletrp-gly (identificado por Mathiesen et al., Immunology, 67 1-7 (1989); e ala-arg-ile-leu-ala-val-glu-arg-tyr-leu-lys-asp e ser-arg-lys-leu-ile-cys-thr-thr-ala-vai-pro-trp-asn-ala-ser (identificado por Dopei et al., Jol. of Vir. Meth., 25 167-178 (1989).
•e
Constituí também um invenção modificar os peptidos desta objectivo da invenção com o presente objectivo de fazer com que eles sejam mais úteis como imunodiagnóstico sem modificação das suas antigénicas. Essas modificações englobam:
a adição de um resíduo cisteína amino ou carboxi com o objectivo de facilitar o reagentes de propriedades à terminação acoplamento do sem reagentes butirato de peptido a uma proteína que constitua o veículo de interligação heterobifuncionais tais como o sulfossuceinimidil- 4(p-maleimidofenilo) que é um reagente preferencial para efectuar essas uniões;
a adição de alguns aminoácidos à terminação amino ou carboxi para facilitar a ligação dos peptidos uns aos outros, para acoplamento a um suporte ou a um peptido maior ou para modificar as propriedades físicas ou químicas do peptido. Essas modificações podem ser efectuadas, por exemplo, através de adições de tirosina, ácido glutãmico ou ácido aspártico, os quais podem ser utilizados como ligadores através de uma reacção de esterificação e utilizando lisina a qual pode ser ligada por formação de uma base de Schiff ou de uma amida; e transformação por acilação do terminal amino, amidaçao do ácido tioglicólico e amidação do terminal carboxi, por exemplo, utilizando amónia ou metilamina. Essas alterações originam variações da carga líquida do peptido e podem facilitar também a ligação covalente do peptido a um suporte sólido, a uma veículo ou a outro peptido. Não é provável que essas alterações originem modificações da imunorreactividade para o peptido.
Os péptidos da presente invenção também podem ser modificados por diversas alterações tais como inserções, supressões e substituições, de tipo conservativo ou não conservativo, sempre que essas alterações possam eventualmente proporcionar algumas vantagens na sua utilização. Essas alterações abrangem preferencialmente as seguintes alterações de tipo conservativo: gly, ala; vai, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; phe, tyr; ala, ser; ala, thr; ala, vai; ala, pro; ala, glu; leu, gin; gly, phe; ile, ser; e ile, met. A metionina, um aminoácido que é propenso a oxidação espontânea, também pode ser normalmente substituído por norleucina sem que haja alteração da antigenicidade.
Também pode ser eventualmente conveniente adicionar uma cauda constituída por um pequeno número (1-10) de aminoácidos hidrofóbicos aos péptidos da presente invenção. Essas caudas podem facilitar a adsorção passiva de um peptido a um suporte sólido. Esta modificação pode ser realizada em qualquer dos terminais COOH ou NH2. A adição preferencial é phe-ala-phe-ala-phe.
De acordo com a presente invenção, os péptidos cíclicos preferenciais de fórmula geral I são aqueles em que os símbolos x, y, e e f possuem as definições seguintes:
x: lys-ile-leu-ala-vai-glu-arg-tyr-leu-lys-asp-gingln-1eu-leu-arg-ile-trp-gly y: thr-thr-ala-vai-pro-trp-asn-ala-ser e e f não existem (BCH-87 ck);
x: lys-lys-ile-leu-ala-vai-glu-arg-tyr-leu-lys-asp gln-gln-leu-leu-arg-ile-trp-gly „ y: thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser e e f não existem (BCH-87 266); e x: lys-ile-leu- ala-vai-glu-arg-tyr-leu-lys-asp-glngln-leu-leu-arg-ile-trp-gly y: thr-thr-ala-vai-pro-trp-asn-ala-ser f: ser-gly-lys-leu-ile e não existe (BCH-408), sendo o peptido BCH-408 o mais preferencial.
Os péptidos cíclicos preferenciais de fórmula 1 1 geral II são aqueles em que os símbolos x , y , e e f possuem as definições seguintes:
x : lys-val-thr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-glnala-arg-leu-asn-ser-trp-gly y : his-thr-thr-val-pro-trp-val-asn-asp-ser e e f não existem (BCH-202ck) x : lys-lys-val-thr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-aspgln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-gly y : his-thr-thr-val-pro-trp-val-asn-asp-ser e e f não existem (BCH-265); e x : lys-val-thr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-glnala-arg-leu-asn-ser-trp-gly y : his-thr-thr-val-pro-trp-val-asn-asp-ser f: ala-phe-arg-gln-vai e não existe (BCH-417), sendo o peptido BCH-417 o mais preferencial.
QUADRO I proporciona as sequências completas dos aminoácidos dos peptidos preferenciais (desprezando os possíveis substitutos a e b).
QUADRO 1 - Sequências peptídicas *VIH-1 :
BCH-87ck: lys-ile-leu-ala-val-glu-arg-tyr-leu-lysasp-gln-gln-leu-leu-gly-ile-trp-gly-cys-ser-gly-lys-, leu-ile-cys-thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser
BCH-266: lys-lys-ile-leu-ala-val-glu-arg-tyr-leu-lysIasp-gln-gln-leu-leu-gly-ile-trp-gly-cys-ser-gly-lys-!
leu-ile-cys-thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser
BCH-408: lys-ile-leu-ala-val-glu-arg-tyr-leu-lyslasp-gln-gln-leu-leu-gly-ile-trp-gly-cys-ser-gly-lys-1 leu-ile-cys-thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-glylys-leu-ile
VIH-2
BCH-202ck: lys-val-thr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-aspIgln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-gly-cys-ala-phe-arg-gln-1 val-cys-his-thr-thr-val-pro-trp-val-asn-asp-ser
BCH-265: lys-lys-val-thr-ala-ile-rglu-lys-tyr-leu-gln-asp| gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-gly-cys-ala-phe-arg-glnval-cys-his-thr-thr-val-pro-trp-val-asn-asp-ser
BCH-417: lys-val-thr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-aspgln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-gly-cys-ala-phe-arg-glnvãl-cys-his-thr-thr-val-pro-trp-val-asn-asp-ser-alaphe-arg-gln-val
Preparação de péptidos lineares e cíclicos
Os péptidos da presente invenção são preparados preferencialmente utilizando-se o processo de síntese convencional de fase sólida. Contudo também é possível utilizar eventualmente outros métodos bem conhecidos para a síntese de péptidos. 0 suporte de resina é constituído por qualquer resina adequada convencionalmente utilizada na especialidade para a preparação de polipeptidos em fase sólida, de preferência uma resina de p-benziloxiálcool-polistireno e p-metilbenzidrilamina. Após o acoplamento do primeiro aminoácido protegido ao suporte de resina, remove-se o grupo de protecção por métodos normalizados convencionalmente utilizados na especialidade da síntese de péptidos em fase sólida. Após a remoção do grupo de protecção amino os aminoácidos restantes α-amino protegidos e, se necessário, de cadeia lateral protegida, são acoplados sequencialmente pela ordem desejada de modo a proporcionar o produto pretendido. Em alternativa, os múltiplos grupos de aminoácidos podem ser acoplados utilizando-se a metodologia de uma solução antes de se efectuar o acoplamento com a sequência de aminoácidos suportada pela resina.
A selecção de um reagente de acoplamento adequado efectua-se em conformidade com os preceitos da especialidade. A título de exemplo refere-se que os reagentes de acoplamento adequados são os compostos N,N'-di-isopropil-carbo-di-imida ou N, N1-diciclo-hexil-carbo-di-imida (DCC), utilizados isoladamente ou de preferência em presença do composto 1 -hidroxibenzotriazol. Existe outro procedimento útil de acoplamento o qual recorre à utilização de anidridos simétricos pré-formados derivados de aminoácidos protegidos.
necessário grupo de protecção α-amino utilizado para cada aminoácido introduzido na cadeia do polipeptido em crescimento é preferencialmente o grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), embora se possa utilizar eventualmente qualquer outro grupo de protecção adequado na medida em que não se degrade sob as condições de acoplamento e seja facilmente removível de modo selectivo em presença de quaisquer outros grupos de protecção já existentes na molécula em crescimento.
Os critérios para a selecção dos grupos de protecção para a cadeia lateral dos aminoácidos são: (a) a estabilidade do grupo de protecção em presença dos diversos reagentes nas condições de reacção selectivas para a remoção do grupo de protecção a-amino em cada passo da síntese; (b) retenção das propriedades estratégicas dos grupos de protecção (isto é, não serem cindidos sob as condições de acoplamento) e (c) possibilidade de remoção do grupo de protecção após conclusão da síntese do polipeptido e sob condições que de nenhuma forma afectem a estrututra do polipeptido.
Os péptidos totalmente protegidos suportados em resina são clivados a partir de uma resina de p-benziloxi- álcool com uma solução na concentração de 50 a 60% de ácido trifluoro-acético em cloreto de metileno durante um período de tempo compreendido entre 1 e 6 horas à temperatura ambiente e em presença de agentes purificadores adequados tais como o anisol, o tioanisol, o sulforeto de etil-metilo, o 1,2-etano-ditiol e reagentes do mesmo tipo. Simultaneamente podem ser também removidos os grupos de protecção da cadeia lateral mais instáveis aos ácidos. Os grupos de protecção mais resistentes aos ácidos são removidos por tratamento com HF.
Os peptidos cíclicos da presente invenção são preparados através da conversão oxidativa directa dos grupos SH protegidos ou desprotegidos originando uma ponte dissulfeto em conformidade com as técnicas seguintes geralmente conhecidas na especialidade da síntese dos peptidos. 0 método preferencial implica a oxidação directa dos grupos SH livres com ferricianeto de potássio. Admite-se que esses peptidos cíclicos assumam uma conformação mais rígida a qual pode favorecer a ligação aos anticorpos dos VIH.
Misturas e polímeros peptídicos
No âmbito da presente invenção encontram-se os peptidos maiores formados pela união de tipo covalente de um ou vários peptidos desta invenção. Também se consideram englobados os polímeros (homo e co) desses peptidos.
São também do âmbito da presente invenção outros peptidos cíclicos e misturas de peptidos cíclicos da presente invenção e outros peptidos cíclicos e lineares derivados dos VIH. Descobriu-se surpreendentemente que essas misturas proporcionam uma detecção de alta sensibilidade dos anticorpos do VIH-1 e do VIH-2 existentes em amostras de soro diluídas em série e em painéis de seroconversão (VIH-1). Descobriu-se também que essas misturas proporcionam um nível elevado de especificidade tendo como consequência um número mínimo de falsos positivos.
Essas misturas contêm pelo menos um peptido cíclico de fórmulas gerais I ou III (de preferência BCH-87ck, BCH-266 ou BCH-408 e mais preferencialmente BCH-408) em combinação com pelo menos um peptido cíclico de fórmulas gerais II ou IV (de preferência BCH-202ck, BCH-265 ou BCH-417 e mais preferencialmente BCH-417).
Detecção do anticorpo do VIH
Os peptidos e as misturas de peptidos da presente invenção são úteis como reagentes de diagnóstico para a detecção de anticorpos associados à SIDA em conformidade com métodos bem conhecidos na especialidade. Esses métodos e ensaios englobam o protocolo ELISA, o método da hemaglutinação, o método do ponto único e dos pontos múltiplos. A principal vantagem dos peptidos da presente invenção na determinação dos anticorpos contra a SIDA reside na sua especificidade e alta sensibilidade e em particular na sua capacidade para detectarem a presença de níveis muito baixos de infecção com SIDA, quando comparados com antígenos conhecidos até agora utilizados.
De acordo com um método para a determinação de anticorpos contra o VIH-1 ou contra o VIH-2, utiliza-se a análise designada por manchas de Western [Towbin, H., Staehelin, T. and Gordon, J., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 76, 4350-4354 (1979)]. De acordo com esta técnica aplica-se um peptido ou os peptidos da presente invenção sobre papel de nitrocelulose. Satura-se o papel de nitrocelulose e depois trata-se com o soro que se pretende testar. Após a lavagem trata-se o papel de nitrocelulose com uma anti-IgG humana marcada com uma enzima. Depois determina-se a actividade enzimática utilizando um substrato adequado. Como é evidente é possível utilizar eventualmente outras marcas identificadoras tais como as marcas radioactivas ou as marcas fluorescentes.
Uma técnica preferencial conveniente e clássica para a determinação dos anticorpos contra o VIH-1 ou contra o VIH-2 utilizando um peptido ou uma mistura de péptidos da presente invenção consiste num ensaio de imunoadsorvência ligada à enzima (ELISA). De acordo com este ensaio, por exemplo, um peptido ou uma mistura de péptidos ou uma sua combinação de acordo com a presente invenção é adsorvida pelas cavidades de uma placa de microtitulação ou é a elas covalentemente acoplada. Essas cavidades são depois tratadas com o soro ou com a amostra analítica que se pretende testar. Após a lavagem adiciona-se às cavidades anti-IgG humana ou anti-IgM humana marcada com peroxidase. Efectua-se a determinação da peroxidase com um substrato correspondente, por exemplo, com o-fenileno-diamina. Sem que haja qualquer afastamento em relação à utilidade do ensaio ilustrativo, a peroxidase pode ser substituída por outra marca identificadora, por exemplo, por uma marca radioactiva, por uma marca fluorescente por quimioluminescência ou por uma marca emissora de infra-vermelhos.
De acordo com o protocolo ELISA é possível utilizar péptidos individuais ou uma sua combinação. É preferível utilizar uma combinação uma vez que isso permite combinar os péptidos mais eficazes para a detecção dos anticorpos ao mesmo tempo que permite excluir aqueles que contribuem para respostas falsas. Descobriu-se durante estes estudos que algumas amostras de soro proporcionam resultados positivos correctos com misturas de péptidos ao passo que originam respostas equívocas quando se utiliza como antígeno péptidos individuais. Desta forma, o teste mais preferencial para os anticorpos contra o VIH-1 e contra o VIH-2 processa-se em conformidade com a presente invenção utilizando uma combinação de antígenos peptídicos.
Outro método para a determinação dos anticorpos contra o VIH-1 ou contra o VIH-2 com os péptidos ou com uma mistura de péptidos da presente invenção consiste num teste imunológico enzimático conhecido pela designação de Método da
Dupla Sanduíche de Antígenos. Este método baseia-se no trabalho de Maiolini descrito em Immunological Methods 20, 25-34 (1978). De acordo com este método faz-se contactar o soro ou outra amostra analítica que se pretende testar com uma fase sólida revestida com um péptido ou com uma mistura de péptidos da presente invenção (camada de captura) e com um péptido ou com uma mistura de péptidos da presente invenção marcados com peroxidase (camada sonda). A reacção imunológica pode ser efectuada em um ou dois passos. No caso de a reacção imunológica ser efectuada em dois passos então realiza-se preferencialmente um passo de lavagem entre a reacção ou também um passo de lavagem. A seguir determina-se a peroxidase com um substrato, por exemplo, com o-fenileno-diamina. Também é possível utilizar neste ensaio outras enzimas e cromogéneos incluindo os que foram já as duas reacções imunológicas é incubações. Após possível realizar descritos antes.
As fases sólidas adequadas são constituídas por polímeros orgânicos e inorgânicos tais como amilases, dextranos, celuloses naturais ou modificadas, polietilenos, polistirenos, poliacrilamidas, geloses, magnetites, pós de vidro poroso, fluoreto de polivinildieno (kynar) e latex, as paredes interiores dos recipientes de ensaio, por exemplo, dos tubos de ensaio, das placas de titulação ou dos cadinhos de vidro ou de um material artificial e também a superfície de corpos sólidos, por exemplo, varetas de vidro e de materiais artificiais, varetas de extremidade grossa, varetas com lobos ou lamelas terminais. As esferas de vidro e de materiais
* artificiais constituem veículos de fase sólida especialmente adequados.
Os peptidos e misturas de peptidos da presente invenção são úteis não só para a determinação dos anticorpos contra o VIH-1 ou contra o VIH-2, mas também são úteis indirectamente para a determinação dos próprios VIH-1 ou VIH-2 uma vez que esses peptidos tanto na sua forma livre, polimerizados ou conjugados com um veículo adequado são úteis para eliciar anticorpos, em particular os anticorpos monoclonais, contra o VIH-1 ou contra o VIH-2. Esses anticorpos podem ser produzidos injectando um mamífero ou uma ave com uma quantidade suficiente de um peptido ou de uma mistura de peptidos da presente invenção e recuperando esses anticorpos a partir do soro desses animais. Como animais hospedeiros adequados para eliciar os anticorpos refere-se os mamíferos tais como os coelhos, os equinos, os caprinos, as cobaias, os ratos, os murganhos, os bovinos, os ovídeos, etc..
É possível aplicar diversos métodos que são geralmente conhecidos utilizando os peptidos da presente invenção ou as suas misturas na determinação quantitativa de uma infecção de VIH-1 ou de VIH-2. Em conformidade com esses procedimentos mistura-se e deixa-se em repouso quantidades conhecidas de uma amostra do soro que se pretende testar, peptidos cíclicos radio identificados da presente invenção ou misturas desses peptidos e um peptido ou uma mistura de peptidos da presente invenção não marcados. Separa-se o complexo anticorpo/antígeno dos reagentes não ligados através de procedimentos conhecidos na especialidade, isto é, por tratamento com sulfato de amónio, polietileno-glicol, um segundo anticorpo que existe alternativamente em excesso ou ligado a um suporte insolúvel, carvão revestido com dextrano e semelhantes. A concentração do peptido ou da mistura de peptidos marcados da presente invenção determina-se alternativamente na fase ligada ou na fase não ligada e o conteúdo da amostra em VIH-1 ou VIH-2 pode ser determinado depois comparando o nível do componente marcado que foi observado com uma curva normalizada por um processo conhecido de per si.
Outro método quantitativo adequado é o Método da Dupla Sanduíche de Anticorpos. De acordo com este método submete-se a amostra que se pretende testar a um tratamento com dois anticorpos diferentes criados contra um peptido da presente invenção ou contra uma sua mistura utilizando animais diferentes, por exemplo, caprinos ou coelhos. Em alternativa é possível preparar os anticorpos monoclonais utilizando a bem conhecida técnica de Koehler e Milstein para a produção de anticorpos monoclonais. Para se conseguir distinguir os anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o mesmo antígeno, mas contra epítopes diferentes, é possível utilizar o método de Stahli e seus colaboradores [J. of Immunological Methods 32, 297-304 (1980)]. Também é adequado utilizar um anti-soro policlonal e um anticorpo monoclonal.
Um desses anticorpos é marcado e o outro vai revestir a fase sólida. As fases sólidas adequadas são as que foram referidas anteriormente na presente memória descritiva.
Como marcas identificadoras adequadas refere-se as enzimas, por exemplo, a peroxidase, as marcas radioactivas ou as marcas fluorescentes. A fase sólida preferencial é uma pequena esfera de plástico e a marca identificadora preferencial é a peroxidase do rábano.
A amostra dos soros é depois incubada com o anticorpo em fase sólida e com o anticorpo marcado. É possível tratar a amostra primeiro com o anticorpo em fase sólida e após a lavagem trata-se a amostra com o anticorpo marcado. Todavia também é possível tratar a amostra primeiro com o anticorpo em fase sólida e decorrido um certo período de tempo trata-se com o anticorpo marcado. De preferência trata-se a amostra simultaneamente com o anticorpo em fase sólida e com o anticorpo marcado.
Após as reacções imunológicas é eventualmente possível executar um passo de lavagem. Após a lavagem determina-se a marca identificadora de acordo com procedimentos bem conhecidos na especialidade. No caso de se utilizar peroxidase como marca identificadora efectua-se a determinação com o substrato, por exemplo, com o-fenileno-diamina ou com tetrametilbenzidina. A quantidade de componente marcado é proporcional à quantidade dos antígenos existentes na amostra.
Os métodos e ensaios para a determinação e quantificação do VIH-1, do VIH-2 ou dos anticorpos contra o VIH-1 ou contra o VIH-2, conforme descrito antes, podem ser executados em estojos de ensaio adequados contidos numa embalagem e suporte apropriados e os quais são constituídos por um péptido cíclico da presente invenção, misturas de péptidos ou uma sua combinação, ou por anticorpos contra o VIH-1 ou contra o VIH-2 eliciados por um péptido cíclico ou por uma mistura de péptidos cíclicos e lineares da presente invenção.
Os péptidos da presente invenção e suas misturas e combinações também são úteis como componentes activos para vacinas capazes de induzirem imunidade protectora contra o /
ί
V»,.
VIH-1 e contra o VIH-2 em hospedeiros susceptíveis de serem z: infectados com esses vírus. As vias de administração, as doses de antígenos, o número e a frequência das injecções variam de indivíduo para indivíduo e podem ser correspondentes ao que actualmente está em vigor e a ser utilizado para proporcionar imunidade contra outras infecções virais. Por exemplo, as vacinas são composições farmaceuticamente aceitáveis que contêm pelo menos um péptido da presente invenção, seus análogos ou suas misturas ou suas combinações, numa quantidade eficaz tal que um mamífero, incluindo um ser humano, tratado com essa composição desenvolve anticorpos suficientes para o proteger contra a infecção de VIH-1 ou de
VIH-2 durante um determinado período de tempo. As vacinas são preparadas de acordo com métodos conhecidos. As composições das presente invenção que constituem vacinas são conveniente e convencionalmente combinadas com veículos fisiologicamente aceitáveis tais como as soluções salinas de qualidade farmacêutica, anatoxina do tétano e hemocianina moluscos gastrópodes. As composições da presente invenção que constituem vacinas também podem conter adjuvantes ou outros agentes que aumentem a resposta imune tais como as preparações de alúmen, os lipossomas ou os iraunomoduladores. Além disso, essas vacinas podem incorporar outros antígenos para conferirem imunidade contra outros vírus (por exemplo, VLTH-I,
VLTH-II, citomegalovírus) ou contra outros patogéneos para além dos VIH-1 e VIH-2. A quantidade desses antígenos diferentes está também dependente do mamífero que se pretende tratar e do estado da doença. Contudo, o antígeno deve estar presente numa quantidade eficaz para desenvolver anticorpos suficientes que protegam o mamífero tratado contra esse patogéneo ou vírus durante um determinado período de tempo.
Painel dos Soros Testados
Para se demostrar a surpreendente sensibilidade e especificidade dos péptidos da presente invenção testou-se um painel de soros com os péptidos ilustrativos.
Os valores de densidade óptica (DO) foram obtidos a 450 nm e os valores em branco medidos com a amostra diluída em solução tampão não foram subtraídos.
As amostras NEIA-2*2, BBI-1-162 a 168, 87B140, 87L139, 87V103 originaram todas resultados negativos para os anticorpos contra os VIH. A amostra LSPQ-S9-1 é um seroconversor antigo (VIH-1). As séries marcadas CAP-113 a CAP-120 correspondem a um conjunto de sete amostras de plasma positivas em VIH-1 diluídas em série com um plasma negativo em VIH. A amostra CAP-113 é o elemento do conjunto diluído 50 vezes com plasma negativo em VIH; a amostra CAP-114 está diluída 100 vezes; a amostra CAP-115 está diluída 200 vezes; etc..De modo idêntico, as séries marcadas CAP-222 a CAP-230 correspondem a um conjunto de sete amostras de plasma confirmadas seropositivas em VIH-2. A amostra CAP-222 está diluída 50 vezes com um plasma negativo em VIH; a amostra CAP-223 está diluída 100 vezes; etc.. Antes de se efectuar o ensaio dilui-se ainda cada amostra, incluindo as amostras das séries CAP, 50 vezes com a solução tampão de diluição das amostras. Nesses testes, o valor de transição para a seropositividade é definido pela soma do valor DO para a amostra NEIA-2*2 mais 0,100.
Resultados
Com os péptidos cíclicos da presente invenção e BCH-202ck (lisina). A mistura de peptidos que contêm os peptidos em que se utilizou lisina em vez de arginina possuem uma sensibilidade superior para a detecção de anticorpos contra os VIH.
QUADRO 2 - VIH-1
| Teste 314 | D.O. a 450 nm | ||
| Amostra DI | BC-87c | BCH-87ck | BCH-266 |
| Tampão de diluição | 0,017 | 0,016 | 0,014 |
| NEIA-2*2 | 0,045 | 0,050 | 0,069 |
| BBI-1-162 | 0,010 | 0,015 | 0,028 |
| BBI-1-169 | 0,095 | 0,090 | 0, 138 |
| BBI-1 -172 | 0,012 | 0,019 | 0,030 |
| CAP-113 | > 2,8 | > 2,8 | > 2,8 |
| CAP-114 | > 2,8 | > 2,8 | > 2,8 |
| CAP-115 | 1,935 | 2,593 | > 2,8 |
| CAP-116 | 1,275 | 1,871 | 2,376 |
| CAP-117 | 0,739 | 1,158 | 1,569 |
| CAP-118 | 0,433 | 0,679 | 0,934 |
| CAP-119 | 0,231 | 0,392 | 0,567 |
| CAP-120 | 0,137 | 0,229 | 0,376 |
| CAP-222 | 0,059 | 0,069 | 0,095 |
| CAP-223 | 0,053 | 0,060 | 0,075 |
| CAP-224 | 0,051 | 0,054 | 0,084 |
| CAP-225 | 0,049 | 0,050 | 0, 135 |
| CAP-226 | 0,046 | 0,050 | 0, 140 |
| CAP-227 | 0,041 | 0,043 | 0,085 |
| CAP-228 | 0,038 | 0,042 | 0, 091 |
| CAP-230 | 0,043 | 0,049 | 0,123 |
QUADRO 3 - VIH-1
| Teste 350 | D.O. a 450 nm | |||
| Amostra Dl | BCH-87C | BCH-87ck | BCH-266 | BCH-408 |
| Tampão de diluição | 0,016 | 0,032 | 0,013 | 0,015 |
| NEIA-2*2 | 0,027 | 0,034 | 0,023 | 0,035 |
| 2-87-V-103 | 0,020 | 0,015 | 0,020 | 0,014 |
| 2-87-L-139 | 0, 158 | 0,409 | 0, 147 | 0,025 |
| 89-D-307 | 0,026 | 0,022 | 0,030 | 0,029 |
| CAP-10 | > 2,8 | > 2,8 | > 2,8 | > 2,8 |
| CAP-11 | > 2,8 | > 2,8 | > 2,8 | > 2,8 |
| CAP-12 | 2,432 | 2,735 | > 2,8 | > 2,8 |
| CAP-13 | 1,488 | 1,676 | 2,021 | 2,319 |
| CAP-14 | 0,866 | 1,089 | 1,248 | 1,433 |
| CAP-15 | 0,449 | 0,643 | 0,680 | 0,835 |
| CAP -1 6 | 0,262 | 0,274 | 0,366 | 0,455 |
| CAP-17 | 0, 141 | 0, 191 | 0, 1 98 | 0,244 |
| CAP-18 | 0,099 | 0,114 | 0,116 | 0, 156 |
| CAP-19 | 0,068 | 0,053 | 0,056 | 0, 102 |
QUADRO 4 - VIH-2
| Teste 226 Amostra DI | D.O. a 450 nm | ||
| BC-202C | BCH-202Ck | BCH-265 | |
| Tampão de diluição | 0,015 | 0,014 | 0,015 |
| NEIA-2*2 | 0,020 | 0,027 | 0,022 |
| BBI-1-162 | 0,018 | 0,033 | 0,059 |
| BBI-1-169 | 0,018 | 0,028 | 0,076 |
| BBI-1-172 | 0,019 | 0,024 | 0,050 |
| CAP-113 | 1,795 | > 2,8 | > 2,8 |
| CAP-11 4 | 1,070 | 2,015 | 2, 134 |
| CAP-115 | 0,611 | 1,195 | 1,330 |
| CAP-116 | 0,325 | 0,642 | 0,718 |
| CAP-117 | 0,174 | 0,365 | 0,410 |
| CAP-118 | 0,089 | 0,189 | 0,190 |
| CAP-119 | 0,057 | 0,082 | 0,117 |
| CAP-120 | 0,041 | 0,084 | 0,094 |
| CAP-222 | > 2,8 | > 2,8 | > 2,8 |
| CAP-223 | > 2,8 | > 2,8 | > 2,8 |
| CAP-224 | 2,313 | > 2,8 | > 2,8 |
| CAP-225 | 1,448 | 2,418 | 2,480 |
| CAP-226 | 0,758 | 1,436 | 1,674 |
| CAP-227 | 0,448 | 0,745 | 0, 960 |
| CAP-228 | 0,233 | 0,409 | 0,363 |
| CAP-230 | 0,139 | 0,279 | 0,272 |
QUADRO 5 - VIH-1
Dados comparativos de duas misturas de peptidos
| Teste 310 | D.O. a 450 nm | |
| BC-87c | BCH-87ck | |
| Amostra Dl | BC-202C | BCH-202ck |
| Tampão de diluição | 0,015 | 0,013 |
| NEIA-2*2 | 0,034 | 0,062 |
| BBI-1-162 | 0,044 | 0,034 |
| BBI-1-163 | 0,032 | 0,042 |
| BBI-1-164 | 0,052 | 0,077 |
| BBI-1-165 | 0,038 | 0,059 |
| BBI-1-166 | 0,045 | 0,081 |
| BBI-1-167 | 0,020 | 0,064 |
| BBI-1-168 | 0,031 | 0,041 |
| 87-B-140 | 0,005 | 0,015 |
| 87-L-139 | 0,025 | 0,068 |
| 87-V-103 | 0,022 | 0,035 |
| CAP-113 | > 2,8 | > 2,8 |
| CAP-114 | 2,634 | > 2,8 |
| CAP-115 | 1,720 | > 2,8 |
| CAP-116 | 0,965 | 2,459 |
| CAP-117 | 0,548 | 1,685 |
| CAP-118 | 0,302 | 1,036 |
| CAP-119 | 0, 158 | 0,609 |
| CAP-120 | 0, 104 | 0,341 |
| CAP-222 | > 2,8 | > 2,8 |
| CAP-223 | 2,470 | > 2,8 |
| CAP-224 | 1,709 | > 2,8 |
| CAP-225 | 1,003 | 2,441 |
| CAP-226 | 0,554 | 1,733 |
| CAP-227 | 0,289 | 1,001 |
| CAP-228 | 0,169 | 0,611 |
| CAP-230 | 0,086 | 0,343 |
| LSPQ-S9-1 | 0, 123 | 1,273 |
| BBI-A-01 | 0,067 | 0,078 |
| BBI-A-02 | 0,114 | 0,130 |
| BBI-A-03 | 0,180 | 1,069 |
| BBI-A-04 | 2,401 | > 2,8 |
| BBI-A-05 | > 2,8 | > 2,8 |
| BBI-A-06 | > 2,8 | > 2,8 |
| BBI-A-07 | > 2,8 | > 2,8 |
| BBI-A-08 | > 2,8 | > 2,8 |
| BBI-A-09 | > 2,8 | > 2,8 |
| BBI-C-20 | 0,019 | 0,050 |
| BBI-C-21 | 0,017 | 0,048 |
| BBI-C-22 | 0,030 | 0,121 |
| BBI-C-24 | 0,210 | 1,748 |
| BBI-C-25 | 0,372 | 2,452 |
| BBI-C-26 | 0,374 | 2,353 |
texto seguinte ilustra os procedimentos gerais para a síntese e para a utilização dos peptidos da presente invenção.
Procedimento 1: Preparação de resinas transportadoras do resíduo aminoácido com protecção Na-FMOC
Preparou-se o desejado resíduo aminoácido com protecçção Να-FMOC numa mistura de cloreto de metileno (CH2CI2) e de dimetilformamida (DMF) (4:1) e adicionou-se a uma suspensão de resina de p-benziloxi-álcool numa mistura de CH2Cl2:DMF (4:1) à temperatura de 0°C. Agitou-se a mistura manualmente durante alguns segundos e depois tratou-se com N, N'-diciclo-hexil-carbo-di-imida (DCC) seguindo-se a adição de uma quantidade catalítica de 4-(dimetilamino)-piridina. Agitou-se a mistura à temperatura de 0°C durante mais 30 minutos e depois agitou-se à temperatura ambiente durante a noite. Essa resina filtrada foi lavada sucessivamente com CH2CI2, DMF e isopropanol (3 lavagens com cada composto) e finalmente com CH2CI2. Com a resina preparou-se uma suspensão em CH2CI2, arrefeceu-se em banho de gelo e adicionou-se piridina bidestilada à suspensão agitada. Depois adicionou-se cloreto de benzoilo. Manteve-se a agitação à temperatura de 0°C durante 30 minutos e depois à temperatura ambiente durante 60 minutos. Após a filtração lavou-se a resina sucessivamente com CH2CI2, DMF e isopropanol (3 lavagens com cada composto) e finalmente com éter do petróleo (2 vezes) antes da secagem sob vácuo intenso até se obter um peso constante. A determinação espectrofotométrica da substituição de acordo com Meienhofer e colaboradores (Int. J. Peptide Protein Res., 1 3, 35, 1979) permitiu determinar o grau de substituição na resina.
Procedimento 2:
Acoplamento dos Aminoácidos Subsequentes
Colocou-se a resina transportadora do primeiro resíduo aminoácido protegido Να-FMOC num vaso de reacção de um sintetizador de peptidos de tipo Biosearch 9600 e tratou-se conforme a seguir se descreve:
| 1) | Lavagem com DMF (4 vezes i segundos de cada vez) | durante | 20 | ||
| 2) | Pré-lavagem com piperidina em DMF | uma solução (3 minutos) | a 30% | de | |
| 3) | Desprotecção piperidina em | com DMF | uma solução (7 minutos) | a 30% | de |
| 4) | Lavagem com | DMF | (8 vezes | durante | 20 |
segundos de cada vez)
5) Teste para verificação dos grupos amino livres - Teste de Kaiser (deve ser positivo)
6) Agitou-se depois a resina com os peptidos suavemente durante 1 ou 2 horas com 8 equivalentes do desejado aminoácido protegido FMOC e com hexafluorofosfato de 1-hidroxi-benzotriazol e benzotriazol-1-il-oxi-tris(dimetil-amino)fosfõnio estando tudo dissolvido em DMF bidestilada anidra contendo 16 equivalentes de 4-metil-morfolina.
7) Lavagem com DMF (6 vezes durante 20
segundos de cada vez).
Após o passo 7 recolheu-se uma aliquota para o teste da ninidrina. No caso de o teste ser negativo regressa-se ao passo 1 para acoplamento do aminoácido seguinte. No caso de o teste ser positivo ou ligeiramente positivo é necessário repetir os passos 6 e 7.
esquema anterior pode ser utilizado eventualmente para o acoplamento de cada um dos aminoácidos dos péptidos descritos na presente invenção. Também é possível utilizar a protecçao de tipo Να-FMOC com cada um dos aminoácidos restantes durante a síntese.
Os péptidos radio identificados podem ser preparados por incorporação de um aminoácidos tritiado utilizando o protocolo de acoplamento anteriormente descrito.
Após a adição do último aminoácido remove-se o grupo Να-FMOC do resíduo do terminal N retomando os passos 1-7 do esquema anterior. Lava-se a resina dos péptidos com CH2CI2 e seca-se no vácuo para proprocionar o péptido protegido impuro.
Procedimento 3:
Com preparou -s e uma trifluro-acético
Desprotecção e clivagem dos partir da resina péptidos a a resina contendo o péptido protegido suspensão numa solução a 55% de ácido (TFA) em CH2CI2 contendo 2,5% de etanoditiol e 2,5% de anisol. Purificou-se a mistura com azoto e agitou-se durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Filtrou-se a mistura e lavou-se a resina com CH2CI2. Tratou-se a resina
novamente com uma solução de TFA a 20% em CH2CI2 durante 5 minutos à temperatura ambiente. Filtrou-se a mistura e a resina com uma solução de TFA a 20% em CH2CI2 e depois lavou -se com CH2CI2. Procedeu-se à combinação dos filtrados e à sua evaporação no vácuo a uma temperatura inferior a 35°C e depois triturou-se o resíduo várias vezes com éter dimetílico seco. Dissolveu-se o sólido numa solução aquosa a 10% de ácido acético e liofilizou-se para proporcionar o produto impuro.
Os peptidos que continham os resíduos arg e cys foram ainda desprotegidos por tratamento com HF à temperatura de 0°C durante 1 hora em presença de anisol e de sulfureto de dimetilo. Procedeu-se à extracção dos peptidos com uma solução aquosa a 10% de ácido acético, lavou-se com éter dimetílico e liofilizou-se para proporcionar os peptidos impuros.
Procedimento 4: Purificação dos peptidos
Procedeu-se à purificação dos peptidos impuros por cromatografia em líquido de elevada pressão (CLEP) preparatória numa coluna Vydac (2,5 x 25 mm) de fase inversa C·] g ou C4 com um gradiente da fase móvel. Verificou-se o efluente a 220 nm e subsequentemente por CLEP analítica. Juntou-se as fracções relevantes, evaporou-se e liofilizou-se.
| Verificou-se a | identidade | dos | peptidos | de | síntese | por |
| cromatografia de | fase inversa analítica e | por | análise | dos | ||
| aminoácidos. | ||||||
| Procedimento 5: | Ciclização | dos | peptidos |
Lentamente adicionou-se uma solução de ferricianeto de potássio (0,01M; pH 7,0) a uma solução aquosa
Λ diluída (0,5 mM) do péptido linear para o valor de pH 7,0. Decorridas 24 horas à temperatura ambiente reduziu-se o valor do pH para 5,0 e tratou-se a solução com uma resina de permuta de iões (Bio-Rad Ag-3-X4a, Cl-form) durante 30 minutos.
Filtrou-se a suspensão e liofilizou-se o filtrado para proporcionar o péptido cíclico impuro. Purificou-se o péptido por CLEP de fase inversa preparatória e procedeu-se a sua caracterização através da análise dos aminoácidos. Obteve-se a prova da ciclicidade comparando a mobilidade do péptido cíclico da CLEP com o péptido linear inicial reduzindo uma aliquota do péptido cíclico de modo a originar novamente o péptido linear e observando também o desaparecimento dos grupos sulfidrilo livres (Teste de Ellman) após a ciclização.
Procedimento 6: Conjugação dos péptidos com albumina do soro de bovino (ASB) ou cora heraocianina de moluscos gastrópodes (HMG)
Efectuou-se a conjugação dos péptidos cora ASB ou com HMG previamente transformados com 4-(p-maleimidofenil)-butirato de sulfossuccinimidilo (Sulfo-SMPB) ou com 4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-1-carboxilato de
-sulfossuccinimidilo (Sulfo-SMCC).
Adicionou-se uma solução aquosa de sulfo-SMPB ou sulfo-SMCC (Pierce Chemicals) a uma solução de ASA ou HMG em tampão fosfato de sódio 0,02 M (pH 7,0). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 45 minutos e aplicou-se imediatamente o veículo activado a uma coluna Sephadex G-25 equilibrada com tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 6,0) à temperatura de 4°C.
As fracções do primeiro pico de absorvência
(280nm) correspondentes ao veículo activado foram combinadas num balão de fundo redondo no qual se introduziu uma solução do peptido em tampão fosfato de sódio 0,05 M (pH 6,2).
» Purificou-se a mistura muito bem com azoto e efectuou-se a sua incubação durante a noite à temperatura ambiente. Verificou -se a eficiência do acoplamento utilizando um peptido marcado com H e por analise dos aminoácidos do conjugado.
Procedimento 7: Detecção dos Anticorpos contra os VIH através de um ensaio de imunoadsorvência ligado à enzima (ELISA)
Saturou-se cada cavidade da placa de microtitulação com 100 μΐ de uma solução contendo um peptido ou uma mistura de péptidos ( 5 μg/ml) e deixou-se em repouso durante a noite. Procedeu-se ao esvaziamento das cavidades e efectuou-se a lavagem 2 vezes com uma solução tampão de lavagem (Tris, 0,043M; NaCl, 0,5M; timerosal, 0,01% p/v; Tween 20, 0,05% v/v; pH 7,4). As cavidades foram depois saturadas com 0,35 ml de tampão de lavagem durante 1 hora à temperatura de 37°C e efectuou-se a lavagem uma vez com a mesma solução tampão. As amostras de soro que se pretendia analisar foram diluídas com um tampão normalizado (tampão de lavagem mais caseína, 0,05% p/v). A seguir enxaguou-se as cavidades com o tampão de lavagem antes da adição da amostra de soro diluída (0,1 ml). Deixou-se incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. A seguir procedeu-se ao esvaziamento das cavidades, lavou-se duas vezes rapidamente e depois lavou-se uma vez durante 10 minutos com a solução tampão de lavagem. Diluiu-se a solução do conjugado (anticorpo da IgG humana conjugado na cabra e purificado por afinidade marcado com peroxidase, 0,5 mg em 5 ml de uma solução de glicerol a 50%) com uma solução a
1% p/v de albumina do soro de bovino em tampão de lavagem e adicionou-se a cada cavidade (0,1 ml) e efectuou-se a incubação durante 1 hora à temperatura ambiente. A seguir procedeu-se ao esvaziamento das cavidades e efectuou-se a lavagem duas vezes rapidamente com a solução tampão de lavagem e depois cinco vezes em que a solução tampão ficou em contacto com a cavidade durante 2 minutos por cada lavagem. Diluiu-se a solução do substrato (3,3',5,5'-tetrametil-benzidina, 8 mg por ml de DMSO) com 100 volumes de uma solução tampão acetato- citrato 0,1 M, pH 5,6, contendo 0,1% v/v de H2O2 a 30% e adicionou-se a cada cavidade (0,1 ml por cavidade). Decorridos 10 minutos tratou-se o conteúdo de cada cavidade com 0,1 ml de H2SO4 2N e efectuou-se a leitura da densidade óptica a 450 nm. Todas as determinações foram efectuadas em duplicado.
Procedimento 8:
Preparação de misturas de péptidos
Procedeu-se à preparação de misturas de péptidos misturando conjuntamente volumes iguais de duas soluções de péptidos cada uma delas na concentração de 10 p.g/ml. Uma das misturas utilizou os péptidos BCH-87c e BCH-202c e a outra mistura utilizou os péptidos BCH-87ck e BCH-202ck. Cada mistura foi utilizada para revestir duas séries de placas conforme anteriormente descrito.
Claims (26)
1.- Processo para a preparação de péptidos substancialmente puros de fórmula geral
I I .
a-e-x-cys-ser-gly-lys-leu-ile-cys-y-f-b (I)
605 611 na qual x representa um grupo escolhido, independentemente, entre :
lys-ile-leu-ala-val-glu-arg-tyr-leu-lys-asp-gln-gln-leu-leu-gly-ile-trp-gly (586-604) lys-lys-ile-leu-ala-val-glu-arg-tyr-leu-lys-asp-gln-gln-leu-leu-gly-ile-trp-gly (585-604) sequências de aminoácidos correspondentes a estas, as quais são derivadas das regiões homólogas de outros isolados de HIV-1 e sequências de aminoácidos que diferem das anteriores como resultado de substituições conservativas de aminoácidos, sendo tais péptidos carácter izados por comportarem pelo menos uma lisina na posição 586 ou uma lisina tanto na posição 585 como na posição 586;
γ, quando presente, representa um grupo escolhido entre:
-thr
-thr-thr
-thr-thr-ala
- thr - Chr - ala-vai
- thr - thr - ala-val-pro
- thr - thr - ala-vai-pro - crp
- thr-thr-ala-val-pro- trp-asn
- thr - thr - ala-vai - pro - crp - asn-ala
- thr - thr- ala-val-pro - crp - asn- ala- ser
- chr - thr- ala-vai - pro - crp - asn- ala- ser- crp
- chr - thr - ala-vai - pro - crp - asn-ala - s er - crp-ser
-thr-thr-ala-val-pro-crp-asn-ala-ser-crp-ser-asn
- thr - thr- ala-vai -pro - crp - asn- ala- ser - crp-ser-asn- lys ' thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-trp-ser-asn-lys-ser ~ chr- chr- ala-val- pro - tru - asn- ala- ser- crp - ser-asn- lys - ser- leu -thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-txp-ser-asn-lys-ser-leu-glu
- thr- thr - ala-val-pro- crp - asn- ala- ser- trp- ser-asn- lys - ser- leu- glu- gí-n
- thr - thr - ala-vai-pro - crp - asn-ala-ser - Crp - ser - asn-lys - ser-leu-glu-gin-ile, sequências de aminoácidos que correspondem a essas, as quais são derivadas de regiões homólogas de outros isolados de HIV e sequências de aminoácidos que diferem das anteriores por substituições conservativas de aminoácidos;
48, e e f, quando presentes, representam, independentemente, cada um, um grupo escolhido entre o grupo constituído por uma sequência de aminoácidos de um qualquer dos epitopes da região constituída pelos aminoácidos 586 a 629 de gp41 de HIV-1 ou da região com a sequência de aminoácidos de 578 a 613 de gp36 de HIV-2, sequências de aminoácidos correspondentes a esta e deri. vadas de regiões homologas de outros isolados de HIV-1 ou HIV-2, sequências de aminoácidos diferindo das anteriores como resultado de substituições conser vativas e qualquer associação destes epitopes; a representa um terminal amino ou um substituinte efectivo como agente de ligação e/ou para tornar o peptido mais útil como reagente para imunodiagnóstico sem alterar as suas propriedades antigénicas; e b representa um terminal carboxi ou um seu substituin te efectivo como agente de ligação e/ou para tomar o peptido mais útil como reagente para imunodiagnóstico sem modificar as suas propriedades antigénicas;
caracterizado pelo facto de se partir de um peptido que se subme te a uma operação de síntese ou a técnicas recombinantes apropriadas .
2.- Processo para a preparação de péptidos substancial mente puros de fórmula geral
I I a-e-x^-cys-ala-phe-arg-gln-val-cys-y^-f-b (II)
597 603 na qual representa um grupo escolhido independentemente entre :
lys-val-thr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-gly (578-596) lys-lys-val-thr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-gly (577-596) sequências de aminoácidos correspondentes a estes e sequências de aminoácidos derivadas das regiões homólogas de outros isolados de HIV-2 e sequências de aminoácidos que diferem das anteriores como resulta do de substituições conservativas de aminoácidos, sendo estes aminoácidos caracterizados por conterem nas sequências pelo menos uma lisina na posição 578 ou uma lisina tanto na posição 577 como na 578; y^, quando presente, representa independentemente um grupo escolhido entre:
-his
-his-thr
-his-tirc-thr
-his-thr-thr-vai
-his-thr-thr-val-pro'
-his-thr-thr-val-pro-trp
-his-thr-thr-val-pro-trp-val
-his-thr-thr-val-pro-trp-val-asir -his-thr-thr-val-pro-trp- val-asn-asp -his-thr-thr-val-pro-trp-val-asn-asp-ser, sequências de aminoácidos que correspondem a estas as quais são derivadas de regiões homólogas de outros isolados de HIV-2 e sequências de aminoácidos que diferem das anteriores como resultado de substituições conservativas de aminoácidos;
e e f, quando presentes, representam, cada um, indepen dentemente, um grupo escolhido entre o grupo constituí, do por uma sequência de aminoácidos de um qualquer dos epitopes da região da sequência de aminoácidos 586 a 629 de gp41 de HIV-1 ou da região de aminoácidos 578 a 613 de gp36 de HIV-2, sequências de aminoácidos que correspondem a estas e que são derivadas de regiões ho mólogas de outros isolados de HIV-1 ou HIV-2, sequên51 cias de aminoácidos que diferem das anteriores como resultado de substituições conservativas e qualquer associação desses epitopes;
a representa um terminal amino ou um substituinte efectivo como um agente de ligação e/ou para tornar o péptido mais útil como reagente para imunodiagnõs. tico sem modificar as suas propriedades antigãnicas; e b representa um terminal carboxi ou um substituinte efectivo como agente de acoplamento e/ou para tornar o péptido mais útil como um reagente para imunodiagnóstico sem modificar as suas propriedades antigénicas;
caracterizado pelo facto de se recorrer a técnicas de síntese apropriadas ou a tecnologia recombinante partindo de péptidos apropriados.
3.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri. zado pelo facto de x representar lys-lys-lys-lys-ile-leu-ala-val-glu-arg-tyr-leu-lys-asp-gln-gln-leu-leu-gly-ile-trp-gly e y representar thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser e e. e f estão ausentes.
4,- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado pelo facto de x representar lys-lys-ile-leu-ala-val-glu-arg-tyr-leu-lys-asp-gln-gln-leu-leu-gly-ile-trp-gly e y repre sentar thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser e _e e f estão ausen tes.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado pelo facto de x representar lys-ile-leu-ala-val-glu-arg-tyr-leu-lys-asp-gln-gln-leu-leu-gly-ile-trp-gly, y representar thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser, .f representar ser-gly-lys-leu-ile e e está ausente.
6. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteri zado pelo facto de x^ representar lys-val-thr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-gly e y^ represen tar his-thr-thr-val-pro-trp-val-asn-asp-ser e e. e f estão ausentes .
7. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteri zado pelo facto de x^ representar lys-lys-val-thr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-gly e y^ representar his-thr-thr-val-pro-trp-val-asn-asp-ser e e e f estão ausentes.
»
8. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteri. zado pelo facto de representar lys-val-thr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-gly e y^ represen tar his-thr-thr-val-pro-trp-val-asn-asp-ser, f representar ala-phe-arg-gln-val e e. está ausente.
9. - Processo para a preparação de peptidos substancialmente puros de fórmula geral
I 1 a-e-X2-cys-ser-gly-lys-ile-cys-y-f-b (III)
605 611 na qual
X£, quando presente, representa um grupo escolhido, in dependentemente, no grupo constituído por:
giytrp-glyila-trp-glygly-ile-crp-glyleu- gly- ile - trp - glyleu- leu- gly- ile - trp - glygin-leu- leu- gly- ile- trp - glygln- gin- leu- leu- gly - ile - trp - gly asp - gin- gin- leu- leu- gly- ile - trp - giylys - asp - gin- gln-leu- leu- gly- ile- trp- glytyr - lys - asp - gin- gin- leu- leu- gly- ile- trp- glyarg- tyr - lys - asp - gin- gin- leu- leu- gly- ile-trp - gly glu- arg- tyr-lys - asp- gin- gin- leu-leu- gly- ile- trp-glyval - glu- arg- tyr- lys - asp - gin- gin- leu- leu- gly- ile-trp - glyala- vai - glu- arg- tyr - lys - asp - gin- gin- leu- leu- gly- ile- trp - glylys-ala-val-glu-axg-tyr-lys-asp-gln-gln-leu-leu-gly-ile-trp-glyile-lys-ala-val-glu-arg-tyr-lys-asp-gln-gln-leu-leu-gly-ile-trp-glyarg-ile-lys-ala-val-glu-arg-tyr-lys-asp-gln-gln-leu-leu-gly-ile-trp-gly-, sequências de aminoácidos que correspondem a estas, as quais são derivadas de regiões homólogas de outros isolados de HIV-1 e sequências de aminoácidos que diferem das anteriores como resultado de substi tuições conservativas;
y, quando presente, representa, independentemente, um grupo escolhido no grupo constituído por:
,.χ· tf
-chx
-thr-thr
-Chr-thr-ala
-thr-thr-ala-val
- thr- thr- ala.- val-pro
- thr - thr - ala- vai - pr □ - trp
-thr-thr-ala-val-pro-trp-asn
-thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala
-thr-thr-ala-val-pro-crp-asn-ala-ser
-thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-trp
- thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-trp-ser
-thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-trp-sar-asn
- thr - thr - ala-vai - pro - trp - asn-ala-ser-trp - ser-asn-lys
-thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-trp-ser-asn-lys-ser
- thr-thr - ala-vai-pro-trp - asn-ala-ser-trp-ser-asn-lys - ser-leu
-thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-trp-ser-asn-lys-ser-leu-glu -thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-trp-ser-asn-lys-ser-leu-glu-gln -tbr-thr-alâ-val-pro-trp-asn-ala-ser-trp-ser-asn-lys-ser-leu-glu-gln-ile sequências de aminoácidos que correspondem a estas, as quais são derivadas de regiões homólogas de outros isolados de HIV-1 e sequências de aminoácidos que diferem das anteriores como resultado de substituições conservativas de aminoãcidos;
e. e f representam, cada um, independentemente, um grupo escolhido no grupo constituído por uma sequência de aminoãcidos de um qualquer dos epitopes da região constituída pela sequência de aminoácidos de 586 a 629 de gp41 de HIV-1 ou da região constituída pela sequência de aminoácidos de 578-613 de gp36 de HIV-2, sequências de aminoácidos que correspondem a estas e derivadas de regiões homólogas de outros isolados de HIV-1 ou HIV-2, sequências de aminoãcidos que diferem das anteriores como resultado de substituições conservativas e qualquer combinação des. tes epitopes podendo estar presentes nos péptidos um ou ambos os grupos representados por e_ e f a representa um terminal amino ou um substituinte eficaz como agente de ligação e/ou para tornar o peptido mais útil como reagente para imunodiagnóstico sem mo dificar as suas propriedades antigênicas; e b representa um terminal carboxi ou um substituinte efectivo como agente de ligação e/ou para tornar o peptido mais útil como reagente para imunodiagnóstico, sem modificar as propriedades antigênicas;
caracterizado pelo facto de submeter péptidos adequados a técnicas de síntese ou métodos recombinantes apropriados.
10,- Processo para a preparação de péptidos substancial, mente puros de fórmula geral a-e-x^-cys-ala-phe-arg-gln-val-cys-y^-f-b 597 603 na qual , quando presente, representa, independentemente, um grupo escolhido entre:
giytrp-glyser-trp-glyasn-ser-trp-glyleu-asn-ser-trp-glyarg-leu-asn-ser-trp-glyala-arg-leu-asn-ser-trp-glygln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-glyasp- gin- ala- arg- leu- asn- ser-trp-glygln- asp - gin- ala- arg- leu- asn- ser - tr? - glyleu- gin- asp - gin- ala- arg- leu- asn- ser- tip - glytyr-leu-gln-asp - gin-ala-arg-leu-asn-ser-crp-glylys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-glyglu- lys - tyr - leu- gin- asp - gin- ala- ar g- leu- asn- ser - trp - gly ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-glyala- ile - glu- lys - tyr - leu- gin-asp - gin- ala- arg- leu- asn-ser- trp - glythr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-glyval-chr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-glyarg-val-thr-ala-íle-glu-lys - tyr-leu-gln-asp-gln-ala-arg-leu-asn-ser-trp-gly sequências de aminoácidos correspondentes a estas as quais são derivadas de regiões homólogas de outros isolados de HIV-2 e sequências de aminoácidos
V., que diferem das anteriores como resultado de subs ti. tuições conservativas de aminoácidos; yp quando presente, é escolhido, independentemente no grupo constituído por:
-his
-his-thx
-his-thr-tàx
-his-thx-thx-val
-his-thx-thx-val-pro
-his-thr-thx-val-pro-txp
-his-thx-thx-val-pxo-txp-val
-his-thx-thx-val-pro-txp-val-asn
-his-thr-thx-val-pro-txp-val-asn-asp
-his-thx-thr-val-pro-txp-val-asn-asp-ser., sequências de aminoácidos correspondentes a estas as quais derivam de regiões homólogas de outros isolados de HIV-2 e sequências que diferem das anteriores como resultado de substituições conservativas de aminoácidos;
a representa um terminal amino ou um substituinte efec tivo, como agente de ligação e/ou para tornar o péptido mais util com reagente para imunodiagnóstico, sem modificar as propriedades antigénicas;
59.
&
b representa um terminal carboxi ou um substituinte efectivo, como agente de acoplamento e/ou para tornar o péptido mais útil como reagente de imunodiagnõs. tico sem modificar as suas propriedades antigénicas; e
e. e f sao escolhidos, índependentemente no grupo constituído por uma sequência de aminoácidos de um qualquer dos epitopes da região que contém a sequência de aminoácidos 586 a 629 de gpál de HIV-1 ou a região da sequência dos aminoácidos 578 a 613 de gp36 de HIV-2, sequências de aminoácidos que correspondem a estas e que são derivadas de regiões homólogas de outros isolados de HIV-1 ou HIV-2, sequências de aminoácidos que diferem das anteriores como resultado de substituições conservativas e qualquer associação destes epitopes, estando presentes um ou ambos e^ e nos péptidos citados;
caracterizado pelo facto de se submeterem péptidos iniciais apro. priados a técnicas de síntese e técnicas recombinantes adequadas .
11,- Processo para a preparaçao de uma mistura de dois ou mais péptidos preparados pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 2, 9 e 10, caracterizado pelo facto de se promover a solubilizaçào dos peptidos em questão e de se misturar depois as soluções de peptidos resultantes.
12. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de se utilizar pelo menos o peptido seguinte:
leu-leu-gly-ile-trp-gly-cys-ser-gly-lys-leu-ile-cys605 611
-thr-thr-ala-val-pro-trp-asn-ala-ser-gly-lys-leu-ile-b (BCH-408) 619 sequências de aminoácidos correspondentes a esta, as quais de rivam de regiões homólogas de outros isolados de HIV-1 e sequências de aminoácidos que diferem das anteriores como resul. tado de substituições conservativas de aminoácidos, sendo essas sequências de aminoácidos, caracterizadas por conterem uma lisina na posição 586.
13. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de se utilizar pelo menos o peptido seguinte :
f ϊ
í a-lys-val-thr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala578
I I
-arg-leu-asn-ser-trp-gly-cys-ala-phe-arg-gln-val-cys597 603
-his-thr-thr-val-pro-trp-val-asn-asp-ser-ala-phe-arg613
-gln-val-b (BCH-417);
sequências de aminoácidos que correspondem a esta, as quais derivam de regiões homólogas de outros isolados de HIV-2 e sequências de aminoácidos que diferem das anteriores por substituições conservativas de aminoácidos, sendo essas sequências de aminoácidos, caracterizadas por conterem uma lisina na posição 578.
14.- Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de se utilizar pelo menos o péptido seguinte :
a-lys-ile-leu-ala-val-glu-arg-tyr-leu-lys-asp-gln-gln586
-leu-leu-gly-cys-ser-gly-lys-leu-ile-cys-thr-thr-ala605 611
-val-pro-trp-asn-ala-ser-b (BCH-87ck)
620 sequências de aminoãcidos que correspondem a esta, as quais são derivadas de regiões homologas de outros isolados de HIV-1 e sequências de aminoácidos que diferem das anteriores como re sultado de substituições conservativas de aminoãcidos, sendo essas sequências de aminoácidos caracterizadas por conterem uma lisina na posição 586.
15.- Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de se utilizar pelo menos o péptido seguinte :
a-lys-vai-thr-ala-ile-glu-lys-tyr-leu-gln-asp-gln-ala578 i I
-arg-leu-asn-ser-trp-gly-cys-ala-phe-arg-gln-val-cys597 603
-his-thr-thr-val-pro-trp-val-asn-asp-ser-b (BCH-202ck)
613 sequências de aminoãcidos que correspondem a esta, as quais de rivam de regiões homólogas de outros isolados de HIV-2 e sequências de aminoácidos que diferem das anteriores como resultado de substituições conservativas de aminoácidos, sendo essas sequências de aminoãcidos caracterizadas por conterem uma lisina na posição 578,
16. - Processo para detectar a presença de anticorpos es. colhidos entre o grupo constituído por anticorpos HIV-1, anticorpos HIV-2 e as suas misturas em uma amostra para analise, caracterizado pelo facto de se utilizar um peptido de acor do com uma qualquer das reivindicações 1 a 10 ou uma mistura de acordo com uma qualquer das reivindicações 11 a 15.
17. - Processo para detectar a presença de anticorpos es. colhidos entre o grupo constituído por anticorpos HIV-1, anticorpos HIV-2 e as suas misturas em uma amostra para análise, caracterizado pelo facto de se fazer contactar uma fracção da amostra com um peptido de acordo com uma qualquer das reivind^ cações 1 a 10 ou com uma mistura de acordo com uma qualquer das reivindicações 11 a 15.
18. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracte rizado pelo facto de se escolher o método entre o grupo de métodos de ensaio constituído por ELISA, hemaglutinação, métodos de mancha-única ou tira de manchas-múltiplas.
19. - Anticorpo, caracterizado pelo facto de reagir com imunidade cruzada com um peptido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 10 ou com as suas misturas.
20. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de ser um anticorpo monoclonal ou uma mistura de anticorpos monoclonais.
21. - Processo para detectar a presença de antigênios escolhidos entre os antigênios HIV-1, antigênios HIV-2 e as suas misturas em uma amostra para análise, caracterizado por se utilizar um anticorpo de acordo com a reivindicação 19 ou 20.
22. - Processo para detectar a presença de antigênios escolhidos entre antigênios HIV-1, antigênios HIV-2 e as suas misturas em uma amostra para análise, caracterizado pelo facto de se fazer contactar uma fracção dessa amostra com um anticorpo de acordo com a reivindicação 19 ou 20.
23. - Processo para a preparação de composições farmacêu ticas apropriadas para o tratamento de um mamífero, incluindo o homem, através do aparecimento de anticorpos suficientes pa ra protegerem esse animal tratado de infecções virais HIV-1 ou HIV-2 durante um dado período, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz de um péptido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 10 ou uma mistura de acordo 'X,... ..y'* >M com uma qualquer das reivindicações 11 a 15, como componente activo, com um ou mais veículos aceitáveis em farmácia.
24.- Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de se incluir um veículo fisiologicamente compatível.
25. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de se incluir um agente adjuvante ou um intensificador da resposta imune.
26. - Processo para a preparação de composições farmacêu ticas de acordo com a reivindicação 23, destinadas a proteger um mamífero, durante um certo período, de um agente patogánico através do aparecimento de anticorpos suficientes para permitir essa protecção, caracterizado pelo facto de se incluir ainda um segundo antigénio para esse agente patogénico, diferen te do vírus HIV-1 ou HIV-2, em uma quantidade eficaz, como componente activo.
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