PT656013E - Peptidos seus analogos e misturas para a deteccao e inducao de anticorpos contra as proteinas e1 e e2 do virus da rubeola - Google Patents

Description

84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ DESCRICÃO "Péptidos, seus análogos e misturas, para a detecção e indução de anticorpos contra as proteínas E1 e E2 do vírus da rubéola"

CAMPO TÉCNICO DO INVENTO 0 presente invento refere-se a novos péptidos lineares e cíclicos e a misturas e combinações suas derivadas, úteis para a detecção e quantificação de infecções de rubéola e para induzir a produção de anticorpos específicos para o vírus da rubéola. Estes péptidos também são úteis para a produção de vacinas contra infecções virais de rubéola. Os péptidos descritos no presente invento podem ser úteis para distinguir entre vários tipos de estados imunitários contra a rubéola. Pelo menos um dos péptidos descritos tem a capacidade de reconhecer especificamente os anticorpos que neutralizam a rubéola.

ANTECEDENTES DO INVENTO A rubéola foi descrita pela primeira vez na Alemanha, no século 18 e é, portanto, muitas vezes designada por sarampo alemão. É uma doença altamente contagiosa, caracterizada por erupções generalizadas e febre moderada. Os seus aspectos clínicos foram, durante muito tempo, confundidos com outras infecções, incluindo o sarampo. O principal risco associado com a infecção de rubéola ocorre durante o primeiro trimestre de gravidez, altura em que danos graves no feto podem resultar em surdez, cataratas, anomalias cardíacas e microencefalia. O vírus da rubéola, o agente etiológico da rubéola, pertence à família Togaviridae. É um vírus de envelope, mais ou menos esférico, com cerca de 60 nm de diâmetro. O seu genoma consiste num ARN de cadeia simples, positivo (10 kb). A glicoproteína estrutural codificada pelo seu genoma consiste em duas glicoproteínas do envelope - E1 (58k) e E2 (42-47K) - e uma proteína da nucleocápside - C(33K). O envelope virai inclui componentes da membrana da célula do hospedeiro infectado e duas glicoproteínas virais, E1 e E2. Estas glicoproteínas de envelope são responsáveis pela actividade de hemaglutinação do vírus da rubéola. As glicoproteínas E1 e E2 estão ligadas por ligações dissulfureto, formando homo- e heterodímeros.

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Foram descritas três estirpes do vírus da rubéola (Therien, Judith, M33) e foram sequenciadas porções dos seus genomas (Frey et ai., 1986, Virology 154. 228-232; Terry et a/., 1988, Arch. Virol. 98, 189-197; Clarke et ai., 1987, Nuct. Acids. Res. 15, 3041-3057). Também são conhecidas sequências da estirpe da vacina da rubéola (RA 27/3) (Nakhasi et ai, 1989, Nucl. Acid Res. 17 (11), 4393-4394).

Embora a rubéola possa ser diagnosticada por inoculação de materiais infectados (normalmente secreções nasofaríngicas) em culturas de células susceptíveis, os testes de diagnóstico mais amplamente utilizados baseiam-se nas propriedades hemaglutinantes das suas glicoproteínas. Nesses testes ("HAI"), a presença de anticorpos contra a hemaglutinina numa amostra de soro impede que o vírus se ligue aos glóbulos vermelhos (normalmente de sangue de galinha), inibindo assim a hemaglutinação (Peetermans e Huygelen, 1967, Presse Med. 75., 2177-2178 e Lennette e Schimdt, 1979, em "Diaqnostic procedures for virai, rickettsial and chlamvdial infections". 5a ed, American Public Health Association Inc., Washington). Nestes testes, um aumento no título de anticorpos no HAI é uma indicação de uma infecção recente.

Desde a introdução de anticorpos marcados com enzimas (Avrameas, 1969, Immunochemistry 6, 43-52), têm-se utilizado o imunoensaio enzimático (EIA) ou os ensaios imunossorvente com ligação de enzimas (ELISA) para o diagnóstico de uma grande variedade de infecções virais e bacterianas, incluindo infecções de rubéola. O serodiagnóstico de infecções de rubéola utilizando técnicas de ELISA foi primeiro descrito por Voller e Bidwell (1975, Br. J. Exp. Pathol. 56, 338-339).

No teste ELISA, em particular, os extractos virais ou lisados revestem tipicamente a superfície de poços de plástico, de forma que os anticorpos (quando presentes) numa amostra de soro, ou analito, se irão ligar às proteínas dos extractos virais adsorvidas. Após uma lavagem adequada, a presença de anticorpos ligados às proteínas no poço é detectada utilizando anticorpos para imunoglobulinas humanas conjugadas com uma enzima, como a peroxidase de rábano. O nível de actividade enzimática é medido em cada poço após remoção, por lavagem, da enzima não ligada. São também conhecidas, e muitas vezes utilizadas pelos peritos na arte, outras formas e variações do teste ELISA.

84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 3 A introdução do teste ELISA para a determinação específica de IgM e IgG de rubéola tem sido responsável pelo rápido declínio (i.e. de 45% em 1978-1980 para 19% em 1982) dos testes de diagnóstico HAI para infecções virais de rubéola (Steece et al., 1985, J. Clin. Microbiol. 21 (1), 140-142). Em comparação com os testes HAI, no teste ELISA não é necessário nenhum tratamento prévio dos soros e são apenas necessárias uma ou duas diluições por amostra de soro. A quantidade de material antigénico utilizado num teste ELISA é também menor do que a necessária nos testes HAI anteriores.

Existem diversos problemas relacionados com os testes de diagnóstico ELISA actualmente utilizados para a infecção de rubéola. Observam-se muitas vezes variações entre diferentes preparações de antigénios de rubéola, utilizadas para revestir os poços. Estas variações são provavelmente uma consequência de várias dificuldades encontradas no isolamento de forma reprodutível do vírus da rubéola. Em cultura de tecidos, o vírus cresce a títulos baixos, é difícil de separar dos restos de membrana celular e muito lábil (Ho-Terry et al., 1986, Arch Virol, 87, 219-228; Chagnon e LaFlamme, 1964, Can. J. Microbiol. 10, 501-503). Isto dificulta o isolamento do vírus dos restos celulares, originários das células hospedeiras. Numa tentativa de solucionar este problema, algumas técnicas de ELISA para a detecção de infecção de rubéola utilizam uma série de poços revestidos com extractos preparados com células não infectadas (antigénios de referência) e uma segunda série de poços revestidos com extractos preparados a partir de células infectadas com rubéola (antigénios virais). Cada amostra de soro é em seguida testada em ambas as séries de poços e a resposta global é calculada por subtracção do sinal medido nos poços de antigénio de referência, do sinal medido nos poços de antigénios virais.

Terry et al. (1988, Arch. Virol. 98, 189-197) e Ho-Terry et al. (1986, Arch. Virol. 90. 145-152 e o pedido de patente europeia No. 88306191.3) referem-se à reactividade de três anticorpos monoclonais não competidores dirigidos contra a glicoproteína E1 da rubéola. Os epítopos ligados por cada um destes anticorpos monoclonais foram identificados e designados por EP1, EP2 e EP3. Os anticorpos monoclonais dirigidos para EP1 e EP2 exibem tanto inibição da hemaglutinação como actividade neutralizante. Os anticorpos monoclonais contra EP3 exibem apenas actividade neutralizante. Até agora, ainda não foram

84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 4 descritos péptidos sintéticos que correspondam aos epítopos de EP1, EP2 ou EP3. A localização destes três epítopos no genoma virai foi descrita em Terry et a/, (supra).

Lozzi et al. (1990, Arch. Viro/. 110, 271-276) sintetizaram octapéptidos que se sobrepõem, que cobrem a região entre os aminoácidos 243-286, que inclui os epítopos de EP1, EP2 e EP3 da glicoproteína E1. O seu objectivo era estabelecer o tamanho mínimo para cada um destes epítopos. Estes autores testaram cada octapéptido com um conjunto de IgG humano anti-rubéola de título elevado, isolado a partir de indivíduos hiperimunizados com a vacina da rubéola (os autores sublinham que este conjunto continha não menos de 400 Unidades Internacionais de imunoglobulinas anti-rubéola/ml e que o título de HA era de cerca de 2000 Unidades/ml). Utilizando esta preparação anti-rubéola muito concentrada, estes autores detectaram uma baixa reactividade com todos seus péptidos. Utilizando soros positivos para rubéola, de pacientes vacinados e infectados naturalmente, descrevem ter observado uma absorvância de ruído de fundo maior, do que quando se utilizam imunoglobulinas purificadas e concentradas. Este estudo ilustra as dificuldade encontradas quando se tentam identificar antigénios peptídicos sintéticos de utilidade significativa para a concepção de um teste de diagnóstico, ou de uma vacina melhor.

Mais recentemente, Wolinsky et al. (1991, J. Virol. 65, 3986-3994) caracterizaram uma série de anticorpos monoclonais de murídeo que reagem com várias regiões das proteínas E1 e E2. Utilizando várias construções de plasmídeos, os autores localizaram os locais de ligação dos seus anticorpos monoclonais. A maior parte da reactividade anti-E1 estava localizada entre os resíduos 202 e 283. Em E2, os anticorpos monoclonais estavam ligados a uma região relativamente grande que cobre 116 resíduos no terminal amino. A epidemia de rubéola de 1963-1965 levou ao desenvolvimento de uma vacina contra a rubéola (Parkman et ai, 1966, N. Engl. J. Med. 275. 569-574). Esta era constituída por vírus vivos atenuados e é imunogénica em pelo menos 95% dos receptores. Os anticorpos neutralizantes gerados pela vacina atenuada surgem mais tarde do que os que sucedem a uma infecção natural e a níveis até dez vezes menores. Os anticorpos induzidos pela vacina, apesar de tudo, protegem os receptores contra a doença, de forma eficaz. As vacinas de rubéola 5 84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ actuais têm, no entanto, algumas desvantagens. Por exemplo, uma proporção significativa de pessoas vacinadas sofre de artrite ocasional (observada essencialmente em mulheres adultas), erupções ligeiras, febres e linfadenopatia. A protecção conferida pela vacina apenas dura 2-10 anos, em vez da imunidade de maior duração, que sucede a uma infecção natural. De relevância, é o aparecimento típico de pequenas quantidades de vírus infeccioso na nasofaringe, 2-3 semanas após a imunização, fazendo com que a vacinação seja extremamente perigosa para mulheres grávidas que estejam em contacto próximo com uma pessoa recentemente vacinada ou, ainda pior, que tenha ela própria sido vacinada, não sabendo que estava grávida.

As vacinas à base de péptidos sintéticos, ou recombinantes não teriam este problema, uma vez que o material antigénico seria significativamente menos alergénico ou não seria alergénico. No entanto, estas vacinas não estão ainda disponíveis e a imunogenicidade e propriedades neutralizantes de vacinas baseadas em péptidos são desconhecidas. Para além disso, não é esperado que todos os péptidos sejam úteis em vacinas. Por exemplo, títulos elevados de anticorpo em testes HAI não se correlacionam bem com uma protecção contra a infecção de rubéola (Partridge et a!., 1981, Br. Med. J. 282. 187-188). Isto pode ser devido ao facto de os epítopos envolvidos na hemaglutinação e na neutralização serem diferentes (Trudel et ai, 1982, J. Virol. Methods 5., 191-197). O diagnóstico baseado na detecção de anticorpos neutralizantes deverá ter, por outro lado, um elevado valor preditivo do estado imunitário e prevenção de casos de infecção, ou reinfecção de rubéola.

Estas diferenças são importantes, não só para avaliar as vacinas contra a rubéola baseadas em péptidos, mas também para testar o estado imunitário de pacientes relativamente à infectividade da rubéola. Por exemplo, os antigénios de rubéola "purificados" agora disponíveis, são potencialmente infecciosos e possuem epítopos quer de hemaglutinação quer neutralizantes. Assim, os testes específicos para o estado imunitário utilizando estes antigénios são questionáveis, e os antigénios utilizados nessas vacinas poderão ser infecciosos.

Tendo em conta estes problemas, seleccionaram-se algumas sequências de péptidos nas proteínas E1 e E2 do vírus da rubéola e prepararam-se péptidos por elas definidos. Estes péptidos, seleccionados pela sua capacidade de ligar 84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 6

níveis elevados de anticorpos, tal como avaliado num ELISA, são úteis em testes de diagnóstico para a infecção de rubéola. Os péptidos de acordo com o presente invento, reconhecidos pelos anticorpos neutralizantes são também úteis como ingrediente activo de uma vacina da rubéola substancialmente inócua. A antigenicidade de E1 é independente da sua glicosilação (Ho-Terry e Cohen, 1984, Arch. Virol. 79. 139-146). A porção glicosilo é muitas vezes responsável por interacções não específicas em imunoensaios. Assim, a utilização de antigénios peptídicos sintéticos, que não são glicosilados, é atraente.

Os anticorpos da glicoproteína E2 são mais abundantes em pacientes com o síndrome congénito de rubéola. Pelo contrário, os anticorpos para E1 predominam em muitos outros pacientes (Katow e Sugiura, 1985, J. Clirt. Microbiol. 21_, 449-451). Assim, cada péptido individual do presente invento pode ser utilizado para o diagnóstico diferencial de infecções de rubéola. WO 93/14206, publicado em 22 de Julho de 1993 e com uma data de apresentação de 20 de Janeiro de 1993 e data de prioridade de 20 de Janeiro de 1992, constitui parte do estado da arte, segundo o artigo 54(3) da CPE. WO 93/14206 descreve péptidos sintéticos que têm uma sequência de aminoácidos correspondente a pelo menos um determinante antigénico de pelo menos uma proteína do vírus da rubéola (RV), particularmente as proteínas E1, E2 ou C.

Dois dos péptidos sintéticos de WO 93/14206, nomeadamente os péptidos sintéticos E2 do vírus da rubéola designados por E2-1 (resíduos 1-20) GLQPRADMAAPPNPPQPPRA(C) e E2-2 (resíduos 15-36) PQPPRAHGQHYGHHHHQLPFLG(C) são aqui excluídos de reivindicação.

No presente pedido, descrevem-se novos péptidos e misturas de

84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 7 péptidos, para utilização na pesquisa em sangue, ou em fluidos corporais, quanto a uma exposição anterior ao vírus da rubéola e na preparação de uma vacina eficaz e segura contra infecções por rubéola. Os péptidos da proteína E2 são surpreendentemente activos, quer em diagnóstico, quer no estímulo de anticorpos protectores. Os péptidos E1, em mistura com os péptidos E2 são os antigénios preferidos do presente invento.

Os péptidos do presente invento são úteis numa grande variedade de testes de ligação específica, para a detecção de anticorpos contra o vírus da rubéola, como imunogénios para induzir a produção de anticorpos que poderão então ser utilizados para a detecção, isolamento ou purificação de antigénios de rubéola. Os péptidos também podem ser utilizados na preparação de vacinas contra infecções virais de rubéola.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento proporciona novos péptidos correspondentes a regiões das glicoproteínas E2 do vírus da rubéola. Também proporciona análogos desses péptidos e misturas e combinações desses péptidos e análogos. O invento proporciona também a mistura de péptidos de proteínas E2 com péptidos lineares ou cíclicos, da proteína E1 do vírus da rubéola.

Os péptidos de acordo com o invento são definidos pela fórmula seguinte: a - Y - b, em que: - Y é uma sequência de pelo menos seis aminoácidos tomados como um bloco, da sequência de aminoácidos da glicoproteína E2 de uma estirpe do vírus da rubéola que corresponde a AAn - AA37 da glicoproteína E2 de uma estirpe do vírus da rubéola, bloco esse que mantém a sequência e a direcção do terminal N para o terminal C da sequência de aminoácidos nativa e análogos seus derivados, sendo os análogos resultantes de substituições ou modificações conservativas no bloco da sequência de aminoácidos nativa; - a é seleccionado do grupo constituído por: (i) um terminal amino; (ii) uma sequência de um a oito aminoácidos; de preferência, mas não se limitando a, uma sequência tomada como um bloco de, e mantendo a sequência

84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 8 e direcção do terminal N para o terminal C, da porção da sequência de aminoácidos nativa da glicoproteína E2 imediatamente N terminal em relação a Y, ou substituições ou modificações conservativas nesta; (iii) um substituinte eficaz para facilitar o acoplamento; e (iv) um substituinte eficaz para melhorar a actividade imunogénica e antigénica do péptido; e - b é seleccionado de entre o grupo constituído por: (i) um terminal carboxi; (ii) uma sequência de um a oito aminoácidos; de preferência, mas não se limitando a, uma sequência tomada como um bloco de, e mantendo a sequência e a direcção do terminal N para o terminal C, da porção da sequência de aminoácidos nativa da glicoproteína E2, imediatamente C terminal em relação a Y ou substituições ou modificações conservativas nesta; (iii) um substituinte eficaz para facilitar o acoplamento; e (iv) um substituinte eficaz para melhorar a actividade imunogénica e antigénica do péptido. O presente invento proporciona também uma mistura de péptidos da proteína E2 do vírus da rubéola, como acima definido, juntamente com um péptido da proteína E1 com a seguinte fórmula: a-X-b, em que: - X é uma sequência de pelo menos seis aminoácidos tomados como um bloco da sequência de aminoácidos da glicoproteína E1 de uma estirpe do vírus da rubéola que corresponde a AA213 - AA239 da glicoproteína E1 da estirpe Therien do vírus da rubéola, bloco esse que mantém a sequência e a direcção do terminal N para o terminal C da sequência de aminoácidos nativa e análogos seus derivados, resultando os análogos de substituições ou modificações conservativas no bloco da sequência de aminoácidos nativa;

84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 9 -aeb são como acima definidos. O invento proporciona também um método para a detecção da presença de anticorpos contra antigénios de rubéola e anticorpos imunologicamente reactivos com estes péptidos.

Como será evidente da descrição seguinte, estes péptidos, análogos, misturas e combinações são úteis numa variedade de métodos de diagnóstico e preventivos, meios e composições, em relação ao vírus da rubéola e infecções provocadas por este.

DESCRIÇÃO SUMÁRIA DOS DESENHOS A Figura 1 representa a sequência de aminoácidos da glicoproteína E1 do vírus da rubéola (estirpe Therien). São dados os aminoácidos da sequência, utilizando o seguinte código de letras: A = ala, C = cys, D = asp, E = glu, F = phe, G = gly, H = his, I = lie, K = lys, L = leu, M = met, N = asn, P = pro, Q = gin, R = arg, S = ser, T = thr, V = vai, W = trp, Y = tyr.

As designações --EP1, EP2 e EP3 -- designam os três epítopos identificados por Terry et ai e Ho-Terry et ai supra. As designações --BCH-178 e BCH-178 cíclico -- designam péptidos particulares de acordo com o invento. A Figura 2 representa a sequência de aminoácidos da glicoproteína E2 do vírus da rubéola. As designações --BCH-463, BCH-481 e BCH-933-- designam péptidos de acordo com o invento.

Em ambas as sequência E1 e E2, os locais putativos de glicosilação são indicados por (?).

DESCRICÃO DO INVENTO

Nesta descrição, utilizou-se a sequência de aminoácidos e a numeração publicadas por Takkinen et ai (supra) para as glicoproteínas da rubéola, E1 e E2, para designar e representar as sequências de aminoácidos particulares dos péptidos de acordo com o invento. No entanto, estes péptidos e seus análogos, 10 84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ são úteis no diagnóstico e prevenção de todas as estirpes do vírus da rubéola, incluindo, por exemplo, as estirpes Therien, Judith, RA 27/3 e M33. Para além disso, os péptidos caracterizados por sequências de aminoácidos das regiões correspondentes das proteínas E1 e E2 dessas estirpes e seus análogos, também se incluem no âmbito do presente invento e nas reivindicações deste pedido. O termo "corresponde" e "correspondente" pretendem referir-se aos aminoácidos nativos das regiões definidas em qualquer estirpe do vírus da rubéola.

Como será evidente para o perito na arte, alguns autores referem-se a esta região particular da glicoproteína E2 como sequência de aminoácidos 10 a 36, em vez de aminoácidos 11 a 37. Estas variações subjectivas na identificação numérica dos aminoácidos também estão incluídas no âmbito do presente invento. 0 presente invento inclui também análogos dos péptidos acima descritos. Tal como aqui utilizado, o termo "análogo" designa inserções, deleções, substituições e modificações de aminoácidos, num ou mais locais da cadeia peptídica, na porção desta que consiste no bloco das sequências de aminoácidos de rubéola que ocorrem naturalmente. No entanto, como acima descrito, independentemente destas inserções, deleções, substituições e modificações, os péptidos de acordo com o invento deverão conter uma sequência de pelo menos seis aminoácidos tomados em sequência "como um bloco", de, por exemplo, AA213 - AA239 da glicoproteína EI, ou pelo menos seis aminoácidos tomados como um bloco de, por exemplo, AAH-AA37 da glicoproteína E2 de uma estirpe do vírus da rubéola. 0 termo análogo designa também qualquer péptido que possua a mesma, ou substancialmente a mesma imunorreactividade.

As modificações e substituições preferidas na cadeia peptídica do bloco da sequência de aminoácidos nativa são as conservativas (i.e. as que têm uma influência mínima nas estruturas secundária ou terciária e na natureza hidropática do péptido). Estas incluem substituições como as descritas por Dayhoff em Atlas of Protein Sequence and Structure 5, 1978 e por Argos em EMBO J. 8, 779-785, 1989. Por exemplo, os aminoácidos que pertencem a um dos grupos seguintes representam alterações conservativas:

84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 11 - ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; - cys, ser, tyr, thr; - vai, ile, leu, met, ala, phe; - lys, arg, his, e - phe, tyr, trp, his

De um modo semelhante, a metionina, um aminoácido que é propício à oxidação, pode ser substituído por norleucina. Também incluem substituições pelos isómeros D, dos aminoácidos L correspondentes.

Como é evidente, também se incluem no âmbito do presente invento as modificações da sequência de aminoácidos nativa que surgem naturalmente nalgumas estirpes de rubéola. Por exemplo, uma estirpe Therien de rubéola (# de acesso P07566) possui uma cisteína em vez de arginina na posição 19 da glicoproteína E2 (veja-se Figura 2). 0 termo "aminoácido" como utilizado nesta descrição (e.g. na definição de a e b) excepto quando se refere aos aminoácidos tomados como um bloco das glicoproteínas E1 e E2 do vírus da rubéola, engloba todos os aminoácidos naturais, os aminoácidos na sua configuração D e os aminoácidos não nativos, sintéticos e modificados, conhecidos, como a homocisteína, ornitina e norleucina.

Exemplos ilustrativos dos péptidos de acordo com o invento são os péptidos em que Y é uma sequência de aminoácidos que corresponde à sequência AAn-AA37 da glicoproteína E2 das estirpes de rubéola e seus análogos.

Exemplos ilustrativos dos péptidos de acordo com o presente invento são os seguintes péptidos derivados da glicoproteína E2: BCH-463: a-TLPQPPRAHGQHYGHHHHQL-b (estirpe Therien) BCH-481: a-APPTLPQPPRAHGQHYGHHHHQLPFLG-b (estirpe Therien) BCH-933: a-APPMPPQPPRAHGQHYGHHHHQLPFLG-b (estirpe RA 27/3) e seus análogos, em que a e b são como acima definidos. O péptido derivado da glicoproteína E2, de acordo com o invento.

84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 12 particularmente preferido (utilizando a estirpe Therien para facilidade de referência) é: BCH-481: a-APPTLPQPPRAHGQHYGHHHHQLPFLG-b (estirpe Therien) e seus análogos, em que a e b são como acima definidos.

Os péptidos E1 utilizados conjuntamente com os péptidos E2 de acordo com o invento, tal como definidos nestas fórmulas, podem ser lineares ou cíclicos. No entanto, preferem-se péptidos cíclicos, quer para utilização em diagnóstico, quer como componentes activos das vacinas de acordo com o presente invento. O péptido derivado da glicoproteína E1 preferido (utilizando sequências de aminoácidos da estirpe Therien, para facilidade de referência) a ser utilizado conjuntamente com os péptidos E2 é o seguinte: BCH-1 78: a-NQQSRWGLGSPNCHGPDWASPVCQRHS-b e seus análogos, em que a e b são como acima definidos. O péptido E1 de acordo com o invento mais preferido (utilizando a estirpe Therien para facilidade de referência) é: BCH-1 78 cíclico: a-NQQSRWGLGSPNCHGPDWASPVCQRHS-b e seus análogos, em que a e b são como acima definidos.

Também se incluem no âmbito do presente invento, combinações ou misturas dos péptidos sintéticos cíclicos e lineares, de acordo com o invento. Por exemplo, uma mistura de péptidos preferida para a detecção de anticorpos específicos para o vírus da rubéola compreende o péptido sintético BCH-481 ou seus análogos e qualquer outro péptido de acordo com o presente invento. Uma mistura de péptidos de acordo com o invento, mais preferida, compreende os péptidos sintéticos BCH-481, BCH-933 e BCH-1 78 cíclico e seus análogos. A mistura peptídica mais preferida para a detecção de anticorpos específicos para o vírus da rubéola, compreende os péptidos sintéticos BCH-481 e BCH-178 cíclico, ou seus análogos.

Poderá ser também desejável ligar de forma covalente duas ou mais 13 84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ sequências peptídicas de acordo com o invento, ou mesmo formar um polímero que consiste em dois ou mais péptidos de acordo com o presente invento. Estas alterações podem facilitar a adsorção passiva dos péptidos numa superfície sólida, sem perda das suas propriedades antigénicas. Poderá ser também desejável ligar de forma covalente um ou mais péptidos sintéticos de acordo com o invento, com um péptido sintético que se sabe ser possuidor de um epítopo de célula T, sendo o conjugado resultante mais útil como imunogénio.

Outra vantagem inesperada da nova mistura de péptidos de acordo com o invento é a de esta ser capaz de proporcionar a detecção completa de anticorpos específicos para a rubéola, derivados de um painel de 886 amostras de soro, recolhidas de 443 pacientes antes e após a sua vacinação contra a rubéola. A mistura que consiste nos péptidos BCH-481 e BCH-178 cíclico é o exemplo mais preferido de misturas com esta vantagem.

Outra vantagem dos péptidos de acordo com o invento é o nível elevado de especificidade que apresentam. Isto resulta num número mínimo de falsos positivos. A utilização de BCH-178 e BCH-481 numa mistura ajuda a detectar anticorpos anti-rubéola específicos, quer para a proteína E1, quer para E2. Pelo contrário, utilizando cada um destes péptidos individualmente, pode-se detectar separadamente cada anticorpo anti-rubéola e isto pode assim auxiliar a determinar o estado imunitário de um indivíduo em relação à rubéola, sendo a reactividade contra BCH-178c a melhor indicação de protecção.

Como descrito acima por a e b, é muitas vezes útil, e está no âmbito do presente invento, modificar o bloco peptídico que consiste nas sequências de aminoácidos de rubéola que ocorrem naturalmente, nos péptidos de acordo com invento, de modo a tornar o péptido escolhido mais útil como reagente de imunodiagnóstico, ou como ingrediente activo de uma vacina. Estas alterações incluem, por exemplo: - adição de um resíduo de cisteína a um ou ambos os terminais de modo a facilitar o acoplamento do péptido a um transportador adequado com reagentes de reticulação heterobifuncionais, tais como sulfossuccinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato, um reagente preferido para efectuar estas ligações, sulfossuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1 -carboxilato e N-

84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 14 succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato; - adição de 1 a 8 aminoácidos adicionais num ou ambos os terminais do péptido para facilitar a ligação dos péptidos um ao outro, para acoplamento a um suporte ou péptido ou proteína maiores, ou para modificar as propriedades físicas ou químicas do péptido. Exemplos destas alterações podem ser efectuados por adição de tirosina, ácido glutâmico ou ácido aspártico que podem ser utilizados como ligantes por meio de uma reacção de esterificação e lisina, que pode ser ligada através de uma base de Schiff ou formação de amida. Como descrito acima, estes aminoácidos adicionais incluem todos os aminoácidos naturais, os aminoácidos nas suas configurações D, aminoácidos sintéticos e modificados; e - derivatização de um ou ambos os terminais do péptido, por, por exemplo, acilação ou amidação. Estas modificações resultam em alterações na carga global do péptido e podem também facilitar a ligação covalente do péptido a um suporte sólido, a um transportador ou a outro péptido. Exemplos de substituintes eficazes para facilitar o acoplamento, ou para melhorar a imunogenicidade ou a actividade antigénica do péptido são os grupos acilo C2-C16, polietilenoglicol e fosfolípidos. A fim de preparar novos péptidos de acordo com o presente invento, podem-se utilizar quaisquer metodologias convencionais para a produção de péptidos. Estas incluem a síntese, tecnologia de ADN recombinante e suas combinações. A síntese em fase sólida é preferida, mas também se podem utilizar os outros métodos. Na abordagem de síntese, o suporte de resina pode ser qualquer resina adequada utilizada convencionalmente na arte para a preparação da fase sólida de péptidos. De preferência, a resina é resina de p-benziloxi-álcool-poliestireno ou p-metilbenzidrilamina. A seguir ao acoplamento do primeiro aminoácido protegido ao suporte de resina, o grupo protector de amino é removido por métodos Standard, utilizados convencionalmente na arte. Após a remoção do grupo protector de amino, os aminoácidos com amino protegido remanescentes e, se necessário, com as cadeias laterais protegidas, são acoplados, sequencialmente, na ordem desejada para obter o péptido escolhido. Alternativamente, podem-se acoplar grupos de múltiplos aminoácidos, utilizando uma metodologia em solução, antes do acoplamento

84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 15 com a sequência de aminoácidos suportada na resina. A selecção de um reagente de acoplamento adequado é de acordo com o estabelecido na arte. Por exemplo, são reagentes de acoplamento adequados a Ν,Ν'-diisopropril-carbodiimida ou a Ν,Ν'-diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) ou hexafluoro-fosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris(dimetilamino)fosfónio, quer sozinho, quer, de preferência, na presença de 1-hidroxibenzotriazolo. Outro procedimento de acoplamento útil utiliza anidridos simétricos de aminoácidos protegidos, pré-formados,. O grupo protector de amino necessário, utilizado para cada aminoácido introduzido na cadeia polipeptídica em crescimento é de preferência 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC), embora se possa utilizar qualquer outro grupo protector adequado, desde que este não se degrade sob as condições reaccionais de acoplamento. O grupo protector deverá ser também facilmente removível de forma selectiva na presença de qualquer outro grupo protector já presente na cadeia peptídica em crescimento.

Os critérios para seleccionar grupos protectores para os aminoácidos da cadeia lateral são: (a) estabilidade do grupo protector aos vários reagentes, sob condições reaccionais selectivas para a remoção do grupo protector de amino, em cada passo da síntese; (b) retenção das propriedades estratégicas dos grupos protectores (i.e. não deverão ser separados sob as condições de acoplamento) e (c) facilidade de remoção do grupo protector no final da síntese do péptido e sob condições que de outro modo nãò afectem a estrutura do péptido.

Os péptidos totalmente protegidos suportados em resinas, são de preferência cindidos da resina de p-benziloxi-álcool com uma solução de 50% a 60% de ácido trifluoroacético em cloreto de metileno durante 1 a 6 horas à temperatura ambiente, na presença de sequestrantes adequados, como anisolo, tioanisolo, etilmetilsulfureto, 1,2-etanoditiol e reagentes relacionados. Simultaneamente, removem-se os grupos protectores de cadeias laterais mais lábeis aos ácidos. Os grupos protectores mais resistentes a ácido são tipicamente removidos por tratamento com HF.

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Os péptidos cíclicos podem ser preparados a partir de péptidos lineares dos acordo com o invento por qualquer metodologia sintética de ciclização bem conhecida. De preferência, utilizam-se dois resíduos contendo tiol existentes, como a cisteína. No entanto, pode-se substituir um resíduo que não de tiol por um resíduo de tiol, para realizar a ciclização. Por exemplo, os péptidos sintéticos cíclicos de acordo com o presente invento podem ser preparados por conversão oxidativa directa de grupos SH protegidos ou desprotegidos, numa ligação dissulfureto, por técnicas geralmente conhecidas na arte da síntese de péptidos. Os métodos preferidos envolvem a oxidação directa de grupos SH livres com ferrocianeto de potássio. Alternativamente, a ciclização pode ser efectuada utilizando substituintes a e b.

Os péptidos de acordo com o presente invento são reagentes de diagnóstico úteis para a detecção e quantificação de anticorpos associados ao vírus da rubéola, de acordo com métodos bem conhecidos na arte. Estes incluem imunoensaios enzimáticos (EIA) tais como ELISA, radioimunoensaio (RIA), imunoensaio activado por fluorescência (FIA), hemaglutinação, aglutinação em látex, métodos e testes de ponto simples e pontos múltiplos.

Uma técnica conveniente e clássica preferida para a determinação de anticorpos contra o vírus da rubéola, que utiliza um péptido, ou uma mistura, ou combinação de péptidos de acordo com o invento, é o ensaio imunossorvente com ligação de enzimas (ELISA). Neste ensaio, por exemplo, um péptido ou uma mistura ou combinação peptídica de acordo com o invento é adsorvida, ou ligada de forma covalente, aos poços de uma placa de microtítulo. Os poços são então tratados com os soros ou analitos a testar. Após lavagem, adiciona-se uma solução de anticorpos anti-lgG humana ou anticorpos anti-lgM humana, marcados com peroxidase. A determinação da peroxidase é realizada com um substrato correspondente, e.g. 3,3', 5,5'-tetrametilbenzidina. Sem afastamento à utilidade deste ensaio ilustrativo, a peroxidase pode ser trocada por outro marcador, e.g. por um marcador radioactivo, fluorescente, quimioluminescente ou emissor de infravermelhos.

Outro método para a determinação de anticorpos contra o vírus da rubéola com os péptidos de acordo com o invento é um teste imunológico enzimático de acordo com o designado "Ensaio sanduíche de antigénio duplo".

Este método baseia-se no trabalho de Maiolini, como descrito em Immunological Methods 20, 25-34, 1978. De acordo com este método, o soro ou outro analito a testar é colocado em contacto com uma fase sólida revestida com um péptido de acordo com o invento (camada de captura) e com um péptido de acordo com o invento que foi marcado com peroxidase (camada de sonda). A reacção imunológica pode ser realizada num, ou dois passos. Realiza-se tipicamente um passo de lavagem entre os dois passos de incubação e no final do tempo de incubação. Em seguida, determina-se a peroxidase, e.g. utilizando o-fenilenodiamina. Podem-se também utilizar neste ensaio outras enzimas e cromogénios, incluindo os já descritos.

As fases sólidas adequadas para utilização nos ensaios acima descritos e nos métodos de ensaio, incluem polímeros orgânicos e inorgânicos, e.g. amilases, dextranos, celuloses naturais ou modificadas, polietileno, poliestireno, poliacrilamidas, agaroses, magnetite, pó de vidro poroso, poli(fluoreto de vinildieno) (Kynar*) e látex, a parede interna de recipientes de teste (i.e. tubos de ensaio, placas de título ou cuvetes de vidro ou material artificial), bem como a superfície de corpos sólidos (i.e., varetas de vidro e varetas de material artificial com espessamento terminal, varetas com lobos terminais ou lamelas). As contas de vidro e de material artificial são especialmente adequadas como transportadores de fase sólida.

Os péptidos de acordo com o invento e as suas misturas e combinações são úteis na determinação e quantificação de anticorpos contra o vírus da rubéola. Estes péptidos são também, eles próprios, úteis para a determinação e quantificação de antigénios do vírus da rubéola. Estes péptidos, quer livres, polimerizados ou conjugados com um transportador adequado, são úteis na indução da produção de anticorpos, imunologicamente reactivos com os antigénios do vírus da rubéola. Os anticorpos monoclonais são particularmente preferidos para este fim. Os anticorpos adequados podem ser produzidos injectando um animal mamífero ou uma ave, com uma quantidade suficiente do péptido para induzir a resposta imunitária desejada e recuperando os anticorpos do soro dos animais tratados. Os animais hospedeiros adequados para induzir a produção de anticorpos incluem, por exemplo coelhos, cavalos, cabras, porquinhos-da-índia, ratos, ratinhos, vacas, ovelhas e galinhas. De preferência, hibridomas que produzem os anticorpos monoclonais desejados, são de 18 84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ preferência preparados utilizando péptidos de acordo com o invento e técnicas convencionais. Pode-se utilizar, por exemplo, a técnica de Kohler e Milstein, bem conhecida, para a produção de anticorpos monoclonais. De modo a distinguir os anticorpos monoclonais dirigidos contra o mesmo antigénio, mas contra diferentes epítopos, pode-se utilizar o método de Stáhli et al. (J. of Immunol. Methods 32, 297-304, 1980).

Podem-se utilizar vários métodos para a determinação, ou quantificação do vírus da rubéola ou de uma sua porção utilizando os anticorpos acima. Estes são conhecidos na arte anterior. Num processo deste tipo, misturam-se quantidades conhecidas de uma amostra de soro, ou outro analito a testar, com um péptido linear ou cíclico de acordo com o invento, marcado radioactivamènte, ou uma mistura ou combinação desses péptidos e um péptido de acordo com o invento não marcado, ou uma mistura, ou combinação destes. Também se adiciona uma determinada quantidade de um anticorpo anti-péptido, de preferência um anticorpo monoclonal e deixa-se a mistura em repouso. O complexo anticorpo/antigénio resultante é então separado dos reagentes não ligados por processos conhecidos na arte, por exemplo por tratamento com sulfato de amónio, polietilenoglicol e um segundo anticorpo, quer em excesso, quer ligado a um suporte insolúvel, ou carvão activado revestido com dextrano. A concentração do péptido marcado é então determinada quer na fase ligada, quer na fase não ligada e o teor de antigénio do vírus da rubéola na amostra é determinado por comparação do nível de componente marcado com uma curva padrão de um modo conhecido per se.

Outro método adequado para utilização destes anticorpos em testes é o "Ensaios sanduíche de anticorpo duplo". De acordo com este ensaio, a amostra a testar é tratada com dois anticorpos diferentes, e.g. criados por imunização de diferentes animais, e.g. ovelhas e coelhos, com um péptido de acordo com o invento, ou uma sua mistura ou combinação. Um dos anticorpos é marcado e o outro reveste uma fase sólida. A fase sólida preferida é uma conta de plástico e o marcador preferido é a peroxidase de rábano.

Tipicamente, no "Ensaio sanduíche de anticorpo duplo" a amostra é incubada com o anticorpo ligado na fase sólida e o anticorpo marcado. No entanto, também é possível colocar em contacto a amostra primeiro com o 19 84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ anticorpo ligado e, após uma lavagem opcional, contactar a amostra com o anticorpo marcado. De preferência, no entanto, a amostra é tratada em simultâneo com a fase sólida e o anticorpo marcado, conjuntamente. Após a(s) reacção(ões) imunológica(s), a mistura é lavada e o marcador é determinado de acordo com os processos conhecidos na arte. No caso em que se usa a peroxidase como marcador, a determinação pode ser realizada utilizando um substrato, e.g., com o-fenilenodiamina ou com tetrametilbenzidina. A quantidade de componente marcado é proporcional à quantidade do(s) antigénio(s) presente(s) na amostra de analito ou soro.

Os métodos e ensaios para a determinação e quantificação de antigénios do vírus da rubéola ou anticorpos contra esse vírus, como acima descrito, podem ser realizados em estojos de teste adequados que compreendem, num recipiente, um péptido de acordo com o invento, suas misturas ou combinações, ou anticorpos contra o vírus da rubéola induzidos por um destes péptidos, ou suas misturas e combinações.

Os péptidos de acordo com o presente invento e suas misturas e combinações são também úteis como componente activo de vacinas capazes de induzir imunidade protectora contra o vírus da rubéola, em hospedeiros susceptíveis a infecção por esse vírus. As vias de administração, as doses de antigénios, o número e a frequência de injecções, variarão de indivíduo para indivíduo e podem ser semelhantes às usualmente utilizadas para proporcionar imunidade a outras infecções virais. Por exemplo, as vacinas de acordo com o presente invento são composições farmaceuticamente aceitáveis que contêm pelo menos um péptido de acordo com o presente invento, os seus análogos, ou suas misturas ou combinações, numa quantidade eficaz para criar anticorpos num mamífero, incluindo o homem, tratado com essa composição. Estes anticorpos deverão ser suficientes para proteger o mamífero tratado de uma infecção virai de rubéola, durante um período de tempo.

As vacinas são preparadas de acordo com métodos conhecidos. As composições de vacina de acordo com o presente invento são conveniente e convencionalmente combinadas com materiais transportadores fisiologicamente aceitáveis, como solução salina de grau farmacêutico, toxóide do tétano e hemocianina de lapa do género Fissurel/a. As composições de vacina de acordo 20 84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ com ο presente invento podem também conter adjuvantes ou outros potenciadores de respostas imunitárias, tais como preparações de alúmen, lipossomas ou imunomoduladores. Além disso, estas composições de vacina podem compreender outros antigénios para proporcionar imunidade contra outros vírus (e.g. papeira e sarampo) ou agentes patogénicos, para além da rubéola. A quantidade destes outros antigénios, é mais uma vez, dependente do mamífero a tratar e, evidentemente, da doença. No entanto, o antigénio deverá estar presente numa quantidade eficaz para criar anticorpos suficientes para proteger o mamífero tratado contra esse patogénio ou vírus, durante um período de tempo.

Os péptidos de acordo com o presente invento podem também ser úteis para o que se designa na arte por "espicaçar" ("spiking"). Os péptidos poderão, portanto, ser misturados com antigénios de rubéola recombinantes, ou quaisquer outros antigénios de rubéola, para potenciar a resposta imunogénica ou a actividade antigénica da vacina, ou testes de diagnóstico, respectivamente.

EXEMPLOS A seguir são descritos procedimentos gerais para a síntese e utilização dos péptidos de acordo com o invento.

Procedimento 1: Preparação de resinas aue suportam o resíduo de aminoácido protegido com N-FMOC

Adicionou-se o resíduo de aminoácido protegido com N-FMOC desejado numa mistura de cloreto de metileno (CH2CI2) e dimetilformamida (DMF) (4:1) a uma suspensão de resina p-benziloxi-álcool em CH2CI2:DMF (4:1) a 0°C. A mistura foi agitada manualmente durante alguns segundos e em seguida tratada com N-N'-diciclo-hexilcarbodiimida (DCC), seguida de uma quantidade catalítica de 4-(dimetilamino)piridina. A mistura foi agitada a 0°C por mais 30 minutos e em seguida à temperatura ambiente, durante a noite. A resina filtrada foi lavada sucessivamente com CH2CI2, DMF e isopropanol (3 lavagens cada) e finalmente com CH2CI2. A resina foi suspensa em CH2CI2, arrefecida num banho de gelo e adicionou-se piridina redestilada à suspensão agitada; seguiu-se cloreto de benzoílo. A agitação foi continuada a OoC durante 30 minutos e em seguida à temperatura ambiente durante 60 minutos. Após filtração, a resina foi lavada sucessivamente com CH2CI2, DMF e isopropanol (3 lavagens cada) e

84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 21 finalmente com éter de petróleo (duas vezes) antes de ser seca sob alto vácuo, até um peso constante. A determinação espectrofotométrica de substituição, de acordo com Meienhofer et al. (Int. J. Peptide Protein fíes., 13, 35, 1979) indica o grau de substituição da resina.

Procedimento 2: Acoplamento de aminoácidos subsequentes A resina que suporta o primeiro resíduo de aminoácido protegido com N-FMOC foi colocada num vaso reaccional de um sintetizador de péptidos Biosearch 9600* e tratada como se segue: 1) Lavada com DMF (4 vezes durante 20 s cada) 2) Pré-lavada com uma solução a 30% de piperidina em DMF (3 min) 3) Desprotegida com uma solução de piperidina a 30% em DMF (7 min) 4) Lavada com DMF (8 vezes durante 20 s cada) 5) Analisada quanto a grupos amino livres - Teste de Kaiser (tem que ser positivo) 6) A resina de péptidos foi em seguida suavemente agitada durante 1 ou 2 horas com 8 equivalentes do aminoácido desejado protegido com FMOC e 1-hidroxibenzotriazolo e hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris(dimetilamino)fosfónio, todos dissolvidos em DMF redistilado, seco, contendo 16 equivalentes de 4-metilmorfolina 7) Lavada com DMF (6 vezes durante 20 s cada).

Após o passo 7, recolheu-se uma alíquota para um teste de ninidrina. Se o teste for negativo volta-se ao passo 1 para acoplamento do aminoácido seguinte. Se o teste for positivo ou ligeiramente positivo, deverão repetir-se os passos 6 e 7. O esquema acima pode ser utilizado para acoplar cada um dos aminoácidos dos péptidos descritos no presente invento. A protecção de N com FMOC também pode ser utilizada com cada um dos aminoácidos restantes ao longo de toda a síntese.

Os péptidos marcados radioactivamente podem ser preparados por incorporação de um aminoácido tritiado utilizando o protocolo de acoplamento anterior.

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Após a adição do último aminoácido, o N-FMOC do resíduo do terminal-N é removido, voltando aos passo 1-7 do esquema anterior. A resina de péptidos é lavada com CH2CI2 e seca in vacuo para originar o péptido bruto protegido.

Procedimento 3: Desoroteccão e clivagem dos péotidos da resina A resina-péptido protegido foi suspensa numa solução a 55% de ácido trifluoroacético (TFA) em CH2CI2, contendo etanoditiol a 2,5% e anisolo a 2,5%. A mistura passada por N e agitada durante 1,5 horas à temperatura ambiente. A mistura foi filtrada e a resina foi lavada com CH2CI2. A resina foi tratada novamente com TFA a 20% em CH2CI2 durante 5 minutos à temperatura ambiente. A mistura foi filtrada e a resina foi lavada com TFA a 20% em CH2CI2 e em seguida lavada com CH2CI2. Os filtrados combinados foram evaporados in vacuo, abaixo de 35°C e o resíduo foi triturado várias vezes com éter dimetílico seco. O sólido foi dissolvido em ácido acético aquoso a 10% e liofilizado para originar o produto bruto.

Os péptidos que contêm resíduos arginina e cisteína foram ainda desprotegidos por tratamento com HF a 0°C durante 1 hora na presença de anisolo e dimetilsulfureto. Os péptidos foram extraídos com ácido acético aquoso a 10%, lavados com éter dimetílico e liofilizados para originar os péptidos brutos.

Procedimento 4: Purificação dos péptidos

Os péptidos brutos foram purificados por HPLC preparativa numa coluna Vydac* (2,5 x 25 mm) de fase inversa, C18 ou C4 com um gradiente da fase móvel. O efluente foi monitorizado a 220 nm e subsequentemente por HPLC analítica. As fracções relevantes foram reunidas, evaporadas e liofilizadas. a identidade dos péptidos sintéticos foi verificada por cromatografia de fase inversa analítica e por análise dos aminoácidos.

Procedimento 5: Ciclizacão de péptidos

Adicionou-se lentamente uma solução de ferrocianeto de potássio (0,01 M pH 7,0) a uma solução aquosa diluída (0,5 mM) do péptido linear a pH 7,0. Após 24 horas à temperatura ambiente, o pH foi baixado para 5,0 e a solução foi tratada com uma resina de permuta iónica (Bio Rad* Ag-3-X4a, na forma Cl)

84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 23 durante 30 minutos. A suspensão foi filtrada e o filtrado foi liofilizado, para originar o péptido cíclico bruto. O péptido foi purificado por HPLC preparativa de fase inversa e caracterizado por análise dos aminoácidos. A prova de ciclização foi obtida comparando a mobilidade em HPLC do péptido cíclico com o péptido linear de partida, reduzindo uma alíquota do péptido cíclico de novo ao péptido linear e também observando o desaparecimento dos grupos sulfidrilo livres (teste de Ellman), após a ciclização.

Procedimento 6: Conjugação de péptidos com albumina de soro bovino (BSA) ou hemocianina de lapa do género Fissurel/a (KLH)

Os péptidos foram conjugados com BSA ou KLH previamente derivatizados, quer com sulfossuccinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato (sulfo-SMPB), quer com sulfossuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC).

Adicionou-se uma solução aquosa de sulfo-SMPB ou sulfo-SMCC (Pierce Chemicals) a uma solução de BSA ou KLH em tampão fosfato de sódio 0,02M (pH 7,0). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 45 minutos e o transportador activado foi imediatamente aplicado a uma coluna de Sephadex G-25*, equilibrada com tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 6,0) a 4°C.

As fracções do primeiro pico de absorvância (280 nm) correspondentes ao transportador activado foram combinados num frasco de fundo redondo, ao qual se adicionou uma solução de péptido em tampão fosfato de sódio 0,05M (pH 6,2). A mistura foi intensamente passada por N2 e incubada durante a noite à temperatura ambiente. A eficácia de acoplamento foi monitorizada utilizando péptido marcado com 3H e por análise dos aminoácidos do conjugado.

Procedimento 7: Deteccão de anticorpos contra o vírus da rubéola por um ensaio imunossorvente com ligação de enzimas (ELISA)

Cada poço da placa de microtítulo foi revestido com 100 μΙ de uma solução contendo um péptido (5 pg/ml), ou mistura de péptidos (10 pg/ml) e deixado durante a noite. Os poços foram esvaziados e lavados duas vezes com 24 84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ um tampão de lavagem (Tris, 0,043 M; NaCI, 0,5M; timerosal, 0,01% p/v; Tween* 20, 0,05% v/v; pH 7,4). Os poços foram em seguida saturados com 0,35 ml de tampão de lavagem, durante 1 hora a 37°C e lavados uma vez com o mesmo tampão. As amostras de soro a analisar foram diluídas com tampão de amostra (tampão de lavagem mais caseína, 0,05% p/v). Os poços foram enxaguados com tampão de lavagem antes da adição da amostra de soro diluída (0,1 ml). Estas foram deixadas a incubar durante 1 hora, à temperatura ambiente. Os poços foram em seguida esvaziados, lavados duas vezes rapidamente e em seguida uma vez, durante dois minutos, com tampão de lavagem. Adicionou-se a solução de conjugado (anticorpo de cabra contra IgG humana, purificado por afinidade, marcado com peroxidase, 0,5 mg em 5 ml de glicerol a 50%), diluída com albumina de soro bovino a 1 % p/v em tampão de lavagem, a cada poço (0,1 ml) e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. Os poços foram em seguida esvaziados e lavados cinco vexes com tampão de lavagem. A solução de substrato (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, 8 mg por ml de DMSO) foi diluída com 100 volumes de tampão citrato-acetato 0,1M (pH 5,6) contendo 0,1% v/v de H202 a 30% e adicionada a cada poço (0,1 ml por poço). Após 10 minutos, o conteúdo de cada poço foi tratado com 0,1 ml de H2S04 e a densidade óptica foi lida a 450 nm. Todas as determinações foram realizadas em duplicado.

Utilizando procedimentos gerais, substancialmente como acima descrito, prepararam-se os seguintes péptidos específicos: BCH-178, BCH-178 cíclico, BCH-463 e BCH-481.

Estes péptidos foram em seguida avaliados quanto à sua capacidade para detectar anticorpos específicos para a rubéola.

Experiência 1

Na experiência 1, compararam-se os péptidos BCH-178 cíclico, BCH-463, BCH-481 e mistura de BCH-178 cíclico e BCH-463 ou BCH-481 em ensaios ELISA, utilizando um painel de amostras de soro e plasma seropositivos e seronegativos, de várias de fontes do Canadá, EUA e Europa.

Os resultados são apresentados na Tabela 1, como uma razão da

84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 25 absorvância da amostra e absorvância limite (0,2). O valor acima do qual uma amostra é considerada positiva, quanto à presença de anticorpos da rubéola, foi definido como sendo igual ou superior a um (1,0).

Estes resultados demonstram a superioridade da mistura de BCH-481 e BCH-178 cíclico, comparada com cada um dos péptidos separadamente.

Experiência 2

Na experiência 2, utiliza-se uma mistura de péptidos sintéticos (BCH-178 cíclico e BCH-481) num ensaio para a detecção de anticorpos específicos para a rubéola. Os resultados são comparados com os resultados obtidos com dois estojos comerciais de rubéola, baseados em lisados virais (tabela 2a e 2b). Os resultados obtidos com a mistura de BCH-481 e BCH-178 cíclico são substancialmente equivalentes aos resultados obtidos com um teste baseado num lisado virai (Enzygnost). A nossa simples mistura de péptidos é assim capaz de substituir um estojo comercialmente disponível mais complexo e proporcionar ao utilizador resultados semelhantes. Com a mistura peptídica, há a vantagem adicional de não ser necessário correr o teste em paralelo num poço de controlo.

Experiência 3

Na experiência 3, avaliou-se a utilização de uma mistura de antigénios de rubéola BCH-481 e BCH-178 cíclico para detectar anticorpos anti-rubéola presentes em 476 amostras de soro de um hospital pediátrico. As amostras de soro foram testadas sem pré-selecção (numa base de teste de rubéola de rotina) e os resultados foram comparados com os obtidos com 3 outros estojos comerciais de rubéola (Abbott, Behring e Diamedix). Todas as técnicas foram realizadas, e os resultados interpretados, como descrito pelos fabricantes. O ensaio EIA Enzygnost da Behring define uma "zona cinzenta" de reactividade indeterminada. As amostras que caem na zona cinzenta foram desprezadas, para facilidade de comparação de resultados. A tabela 3 apresenta a capacidade de cada técnica distinguir entre amostras positivas e negativas de 476 amostras de soro. Mostra que os resultados obtidos com a mistura de péptidos de acordo com o presente invento está de acordo com os obtidos com três estojos comercialmente disponíveis;

84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 26 gamas de correlação entre 97,3% e 95%.

Embora até agora tenham sido descritas várias concretizações do presente invento, é evidente que as considerações básicas da requerente podem ser alteradas, para proporcionar outras concretizações que utilizem os processos e composições de acordo com o invento. Assim, deverá ter-se em conta que o âmbito do invento será definido pelas reivindicações em anexo, e não pelas concretizações específicas aqui antes apresentadas a título de exemplo. TABELA 1 AMOSTRA ID BCH-1 78c BCH463 BCH481 BCH178C BCH463 BCH178c BCH481 75 0,6 0,5 0,7 0,45 0,95 78 0,75 0,48 0,5 0,5 1,35 85 0,70 0,4 0,4 0,45 1,05 144 0,45 2,45 8,95 1,39 9,3 143 0,35 3,2 11,9 1,88 12,75 1025 0,3 3,74 12,35 2,45 13,05 151 0,6 1,7 6,75 1,16 6,75 1026 0,2 1,28 5,85 0,76 5,85 152 0,65 0,5 0,75 0,35 0,65 156 0,35 1,7 >14 0,66 >14 1027 0,2 1,25 >14 0,58 10,85 171 0,6 0,69 2,2 0,67 2,75 196 0,55 0,51 0,7 0,57 1,15 197 0,8 0,48 0,6 0,63 1,2 279 0,65 1,01 4,1 0,54 3,75 330 0,35 0,7 2,15 0,68 2,1 333 0,75 0,88 4,0 0,655 4,5

28 84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ TABELA 3

Outros testes Biochem Detect-rubéola E1E2 (BCH-1 78 + BCH-481) Negativo/Positivo/Concordância Abott Negativo 26 2 Positivo 15 433 96,4% Diamedix Negativo 33 5 Positivo 8 430 97,3% Behring Negativo 34 17 Indeterminado 1 15 Positivo 6 403 95%

Lisboa' 11 JUL. 2000

Por BIOCHEM IMMUNOSYSTEMS INC. - O AGENTE OFICIAL -

mg.· àntómio JOAO

da CUNHA FERRE1RA

Ag. 0|. Pr. Ind-das Flores, 74-4. | ieoo LISBOA

Claims (27)

1. 84 593 EPO 656 013/PT 1/6 REIVINDICAÇÕES 1. Péptido com a fórmula a - Y - b em que: - Y é uma sequência de pelo menos seis aminoácidos tomada como um bloco da sequência de aminoácidos da glicoproteína E2 de uma estirpe de vírus da rubéola que corresponde a AAn-A37 (APPTLPQPRR AHGQHYGHHH HQLPFLG) da glicoproteína E2 de uma estirpe do vírus da rubéola, bloco esse que mantém a sequência e a direcção do terminal N para o terminal C da sequência de aminoácidos nativa e seus análogos, resultando os análogos de substituições ou modificações conservativas, no bloco da sequência de aminoácidos nativa; - a é seleccionado do grupo constituído por: (i) um terminal amino; (ii) uma sequência de um a oito aminoácidos; (iii) um substituinte eficaz para facilitar o acoplamento; e (iv) um substituinte eficaz para melhorar a actividade imunogénica ou antigénica do péptido; - b é seleccionado do grupo constituído por: (i) um terminal carboxi; (ii) uma sequência de um a oito aminoácidos; (iii) um substituinte eficaz para facilitar o acoplamento; e (iv) um substituinte eficaz para melhorar a actividade imunogénica ou antigénica do péptido, com a condição de o referido péptido não consistir nos péptidos sintéticos E2 do vírus da rubéola designados em WO 93/14206 por: E2-1 (resíduos 1-20) GLQPRADMAAPPNPPQPPRA(C) e E2-2 (resíduos 15-36) PQPPRAHGQHYGHHHHQLPFLG(C).

   84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 2/6
2. 2. Péptido de acordo com a reivindicação 1, em que a referida estirpe de rubéola é a estirpe Therien.
3. 3. Péptido de acordo com a reivindicação 2, em que Y é TLPQPPR AHGQHYGHHH HQL e seus análogos.
4. 4. Péptido de acordo com a reivindicação 3 com a sequência TLPQPPR AHGQHYGHHH HQL.
5. 5. Péptido de acordo com a reivindicação 2, em que Y é APPTLPQPPRAHGQHYGHHHHQLPFLG e seus análogos.
6. 6. Péptido de acordo com a reivindicação 5 com a sequência APPTLPQPPRAHGQHYGHHHHQLPFLG.
7. 7. Péptido de acordo com a reivindicação 1, em que a referida estirpe é RA 27/3.
8. 8. Péptido de acordo com a reivindicação 7, em que Y é APPMPPQPPRAHGQHYGHHHHQLPFLG e seus análogos.
9. 9. Péptido de acordo com a reivindicação 8 com a sequência APPMPPQPPRAHGQHYGHHHHQLPFLG.
10. 10. Mistura, ou combinação, compreendendo mais do que um péptido de acordo com qualquer reivindicação anterior.
11. 11. Mistura ou combinação que compreende: (a) pelo menos um péptido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9; e (b) pelo menos um de qualquer outro antigénio do vírus da rubéola.
12. 12. Mistura ou combinação de acordo com a reivindicação 11, em que o referido péptido da parte a) é seleccionado do grupo constituído por: BCH-463,

    84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 3/6 BCH-481, BCH-933 e seus análogos, em que: BCH-463 é a-TLPQPPRAHGQHYGHHHHQL-b BCH-481 é a-APPTLPQPPRAHGQHYGHHHHQLPFLG-b BCH-933 é a-APPMPPQPPRAHGQHYGHHHHQLPFLG-b.
13. 13. Mistura ou combinação de acordo com a reivindicação 12, em que o referido péptido da parte a) é BCH-481 ou seus análogos.
14. 14. Mistura ou combinação que compreende: (a) um péptido de fórmula: a-Y-b em que - Y é uma sequência de pelo menos seis aminoácidos tomada como um bloco da sequência de aminoácidos da glicoproteína E2 de uma estirpe do vírus da rubéola que corresponde a AAirA37 (APPTLPQPPR AHGQHYGHHH HQLPFLG) da glicoproteína E2 de uma estirpe do vírus da rubéola, bloco esse que mantém a sequência e a direcção do terminal N para o terminal C da sequência de aminoácidos nativa e seus análogos, resultando os análogos de substituições ou modificações conservativas, no bloco da sequência nativa de aminoácidos; - a é seleccionado de um grupo constituído por: (i) um terminal amino; (ii) uma sequência de um a oito aminoácidos; (iii) um substituinte eficaz para facilitar o acoplamento; e (iv) um substituinte eficaz para melhorar a actividade imunogénica ou antigénica do péptido; e - b é seleccionado do grupo constituído por: (i) um terminal carboxi; (ii) uma sequência de um a oito aminoácidos; (iii) um substituinte eficaz para facilitar o acoplamento; e (iv) um substituinte eficaz para melhorar a actividade imunogénica ou

    84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 4/6 antigénica do péptido, e (b) um péptido da proteína E1 com a seguinte fórmula: a-X-b em que: - X é uma sequência de pelo menos seis aminoácidos tomada como um bloco da sequência de aminoácidos da glicoproteína E1 de uma estirpe do vírus da rubéola, que corresponde a AA213-A239 (NQQSRWGL GSPNCHGPDW ASPVCQRHS) da glicoproteína E1 da estirpe Therien do vírus da rubéola, bloco esse que mantém a sequência e a direcção do terminal N para o terminal C da sequência de aminoácidos nativa e seus análogos, resultando os análogos de substituições ou modificações conservativas, no bloco da sequência de aminoácidos nativa; - a e b são como definidos na reivindicação 1.
15. 15. Mistura ou combinação de acordo com a reivindicação 14, em que pelo menos um dos referidos péptidos da glicoproteína E1 é o péptido BCH-178 cíclico, ou seus análogos, em que: I I BCH-178 cíclico é a-NQQSRWGLGSPNCHGPDWASPVCQRHS-b.
16. 16. Mistura ou combinação de acordo com a reivindicação 15, em que o referido péptido da parte a) é BCH-481 ou análogos seus derivados, e o referido péptido da parte b) é BCH-178 cíclico ou seus análogos.
17. 17. Mistura, ou combinação, de acordo com a reivindicação 15, em que o péptido da parte a) é uma mistura de BCH-481 e BCH-933 ou seus análogos, e o péptido da parte b) é BCH-1 78 cíclico ou seus análogos.
18. 18. Método para detectar a presença de anticorpos contra um antigénio de rubéola num analito que compreende o passo de colocar em contacto uma alíquota do analito com um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou uma combinação, ou mistura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17. 84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 5/6
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 18, seleccionado de entre o grupo constituído por: EIA, RIA, FIA, hemaglutinação, aglutinação em látex, métodos de imunoensaio de ponto simples ou de pontos múltiplos.
20. 20. Anticorpo imunologicamente reactivo com um péptido de acordo com qualquer das reivindicações l a 10.
21. 21. Anticorpo de acordo com a reivindicação 20, em que o referido anticorpo é seleccionado do grupo constituído por: anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais.
22. 22. Mistura que compreende mais do que um anticorpo de acordo com a reivindicação 21.
23. 23. Método para detectar a presença de antigénios de rubéola num analito, que compreende o passo de colocar em contacto uma alíquota do analito com um anticorpo de acordo com a reivindicação 20.
24. 24. Composição farmaceuticamente aceitável que compreende: a) um transportador farmaceuticamente aceitável; e b) pelo menos um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, numa quantidade eficaz para criar anticorpos num mamífero tratado com a referida composição, em que os referidos anticorpos são suficientes para proteger o referido mamífero tratado contra infecções virais de rubéola e para impedir a artrite associada à rubéola.
25. 25. Composição de acordo com a reivindicação 24, adaptada para tratar humanos.
26. 26. Composição de acordo com a reivindicação 24, compreendendo ainda um adjuvante, ou potenciador da resposta imunitária.
27. 27. Composição de acordo com a reivindicação 24, compreendendo ainda 84 593 ΕΡ Ο 656 013/ΡΤ 6/6 um segundo antigénio, estando o referido segundo antigénio presente numa quantidade eficaz para criar anticorpos suficientes para proteger o mamífero tratado de uma infecção por um agente patogénico que não o vírus da rubéola. Lisboa, 11» JJL. 200Õ Por BIOCHEM IMMUNOSYSTEMS INC. - O AGENTE OFICIAL -

    Rua LISBOA NTÓNIO JOÂQ CUNHA FERREIRA Ag. 0{. Pr. Ind. das Flores, 74 - 4.* iaoo