CN110423272A

CN110423272A - 一种新的抗风疹病毒膜蛋白e1的抗体及其应用技术领域

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Publication number: CN110423272A
Application number: CN201910751155.1A
Authority: CN
Inventors: 金华明; 魏丙卓
Original assignee: Jiemin (tianjin) Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Jiemin (tianjin) Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-08-15
Filing date: 2019-08-15
Publication date: 2019-11-08

Abstract

本发明提供了一种抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体的重链和轻链的可变区(及可变区中的CDR区)的核酸和氨基酸序列，也提供了衍生出此抗体重链和轻链的抗体基因的小鼠胚系抗体基因序列。根据本发明所提供的抗体重链和轻链的可变区(或CDR区)序列，或者本发明提供的小鼠的胚系抗体基因序列，本领域技术人员可以通过化学合成和/或抗体基因在异源细胞中的表达(即重组蛋白表达)的方法制备与本发明一样的或类似的抗体(或抗体类似物)。本发明还涉及该抗体在检测风疹病毒(或含有风疹病毒膜蛋白E1的物质)和在检测抗风疹病毒抗体方面的应用。

Description

一种新的抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体及其应用技术领域

本发明涉及一种抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体，具体涉及一种抗风疹病毒膜蛋白E1的单克隆抗体及其可变区氨基酸序列，以及抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体在检测风疹病毒及含有风疹病毒(或含有风疹病毒膜蛋白E1，简称RV-E1的物质)和检测抗风疹病毒抗体中的应用。

背景技术

风疹病毒是引起风疹的病原微生物。风疹病毒主要通过上呼吸道粘膜接触感染。风疹病毒感染比较常见，在一些国家，风疹血清学阳性率高达85％-98％。成年人感染风疹病毒时临床表现常不明显，症状主要有低烧、淋巴结病及皮疹，一般呈自限性，因此常被忽略。

风疹病毒感染的主要危害在于胎儿的感染。如果孕妇在妊娠期(尤其最初3个月)感染风疹病毒，病毒可通过胎盘感染胎儿，干扰组织器官的生长发育，使胎儿全身多种器官发育或功能异常，可导致流产、死胎或先天性风疹综合征(CRS)。后遗症包括神经性耳聋、先天性心脏病、白内障等。世界卫生组织(WHO)评估全球每年出生的婴儿中有10万患有CRS。

鉴于风疹病毒感染对儿童可能造成的严重危害，临床上对疑似风疹病毒感染的孕妇通常会进行实验室检验确认。临床上最常用的检测风疹病毒感染的方法是检测血清中抗风疹病毒的抗体。

临床实验室通常使用酶或者荧光小分子化合物标记的风疹病毒抗原(如风疹病毒或风疹病毒的表面抗原蛋白等)检测血清中的抗风疹病毒抗体。另外一种常用的检测方法(间接法)是用无标记的风疹病毒抗原与待测样本中的抗风疹病毒抗体相结合，然后用一个标记的抗风疹抗原抗体去探测结合到待测抗体上的病毒抗原，从而间接地检测待测样本中抗风疹病毒抗体。本发明涉及一种新的抗风疹病毒单克隆抗体。具体地说，本发明涉及一种抗风疹病毒膜蛋白E1(抗原)的抗体，并公布了它的抗体可变区的氨基酸序列。本发明还涉及该抗体在检测风疹病毒(或含有风疹病毒膜蛋白E1的物质)和在检测抗风疹病毒抗体方面的应用。

发明内容

本发明提供了一种抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体，包含轻链和重链，所述抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体包含如下1)所述的轻链和/或如下2)所述的重链，

1)抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体轻链可变区包含由序列表中Seq ID NO:1所示的氨基酸序列；

2)抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体重链可变区包含由序列表中Seq ID NO:2所示的氨基酸序列；

所述抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体可以结合风疹病毒膜蛋白E1。

优选的是，所述抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体包含如下1)所述的轻链和如下2)所述的重链，

1)抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体轻链包含由序列表中Seq ID NO:1所示的氨基酸序列；

2)抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体重链包含由序列表中Seq ID NO:2所示的氨基酸序列；

所述抗风疹病毒膜蛋白E1抗体可以结合风疹病毒膜蛋白E1。

本发明还提供了一种抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体，包含轻链和重链，轻链可变区的核酸序列包含由序列表中Seq ID NO:3所示的核酸序列；和/或重链可变区的核酸序列包含由序列表中Seq ID NO:4所示的核酸序列。

优选的是，所述抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体，轻链可变区的核酸序列包含由序列表中Seq ID NO:3所示的核酸序列；且重链可变区的核酸序列包含由序列表中Seq ID NO:4所示的核酸序列。

本发明还提供了一种抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体，包含轻链和重链，轻链可变区的互补决定区CDR1，CDR2和CDR3分别含有由序列表中Seq ID NO:5，Seq ID NO:6，Seq IDNO:7所示的氨基酸序列；和/或重链可变区的互补决定区CDR1，CDR2和CDR3分别含有由序列表中Seq ID NO:8，Seq ID NO:9，Seq ID NO:10所示的氨基酸序列。

优选的是，轻链可变区的互补决定区CDR1，CDR2和CDR3分别含有由序列表中SeqID NO:5，Seq ID NO:6，Seq ID NO:7所示的氨基酸序列；且重链可变区的互补决定区CDR1，CDR2和CDR3分别含有由序列表中Seq ID NO:8，Seq ID NO:9，Seq ID NO:10所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体，包含轻链和重链，轻链可变区的DNA序列由小鼠的胚系抗体基因IGKV4-59*01(SEQID NO.11)所决定；和/或重链可变区的DNA序列由小鼠的胚系抗体基因IGHV9-1*02(SEQID NO.12)所决定。

优选的是，轻链可变区的DNA序列由小鼠的胚系抗体基因IGKV4-59*01(SEQIDNO.11)所决定；且重链可变区的DNA序列由小鼠的胚系抗体基因IGHV9-1*02(SEQID NO.12)所决定。

本发明还提供了一种抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体，由上述任一项所述的抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体通过化学基团删减和/或添加和/或修饰而得到的衍生物，所述抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体类似物可以结合风疹病毒膜蛋白E1。

优选的是，由上述任一项所述的抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体通过一个或几个氨基酸的替换和/或删减和/或添加和/或修饰而得到的衍生物，所述抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体类似物可以结合风疹病毒膜蛋白E1。

本发明还提供了一种检测含有风疹病毒及含有风疹病毒膜蛋白E1的方法，使用上述任一项所述抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体。

优选的是，使用了上述抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体类似物。

本发明还提供了一种检测抗风疹病毒抗体的方法，使用上述任一项所述抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体。

优选的是，使用了上述的抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体类似物。

优选的是，所述的检测抗风疹病毒抗体的方法用于检测人或动物组织或体液内抗风疹病毒抗体。

附图说明

图1本发明优选实施例中质粒pGS3.1-RV-E1的构建示意图。

图2本发明优选实施例中风疹病毒膜蛋白E1的表达、纯化和鉴定结果。

图3本发明优选实施例中杂交瘤细胞株2C8E3表达的抗体的亚型鉴定及抗体可变区的克隆。

图4本发明优选实施例中抗体2C8E3在间接法ELISA中检测到天然风疹病毒K2S和重组表达的风疹病毒膜蛋白E1

图5本发明优选实施例中利用直接法ELISA通过HRP标记的抗体2C8E3检测风疹病毒的最佳稀释度。

图6本发明优选实施例中利用捕获法ELISA通过HRP标记的抗体2C8E3检测人血清中抗风疹病毒IgM抗体。

具体实施方式

在下面具体实施方式中，将详细叙述制备本发明所述抗体的方法。所述制备抗体的方法是基于经典的小鼠单克隆抗体的方法(Kohler G.et al(1975)Continuous cultureof fused cells secreting antibody of predefined specificity.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,256.)。用类似的方法还可以从大鼠，兔等动物得到类似的单克隆抗体(Kilmartin,J.V.et al(1982)Rat monoclonal antitubulin antibodies derived byusing a new nonsecreting rat cell line.J CELL BIOL.USA 93,576-582；Spieker-Polet H,et al(1995)Rabbit monoclonal antibodies:generating a fusion partnerto produce rabbit-rabbit hybridomas.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,9348-9352.)。

在经典的单克隆抗体制备方法里，首先需要具备合适的抗原，并用其免疫动物。为了制备抗风疹病毒膜蛋白E1抗体(或抗体类似物)，合适的抗原必须含有风疹病毒膜蛋白E1或E1的一部分(这个部分至少含有相应的抗原决定簇)。这个抗原可以通过天然风疹病毒的分离纯化，风疹病毒基因的异源细胞表达(即重组蛋白表达)，化学合成，或这些方法的互相组合而获得。

在经典的单克隆抗体制备方法中，首先用抗原免疫动物，并通过定时间隔采血，验证动物是否对抗原产生了抗体反应。然后将从有抗体反应的动物的脾脏中分离出来B细胞，在体外与永生的骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞。然后将这些杂交瘤细胞在培养板中极限稀释并重新生长起来(单克隆杂交瘤细胞株)，并采取这些杂交瘤细胞株的培养液上清，检测其是否含有针对抗原的特异性抗体。根据抗体产量，质量和细胞株生长特性，可以选出最佳的单克隆抗体生产细胞株，进行后续的单克隆抗体生产。

其他的方法也可以用来获取单克隆抗体。譬如，上述动物的脾脏细胞可以被分离出来，然后用标记的抗原(如荧光素标记风疹病毒膜蛋白E1)与之孵育。由于产生抗体的B细胞通常会有抗体分子呈现在细胞膜表面，这些细胞会被标记的抗原结合(染色)，从而可以被荧光流式细胞分选仪分选出来。这些分选出来的B细胞的mRNA可以被分离出来，通过体外反转录和特异性PCR反应得到抗体的可变区cDNA的文库。这个cDNA文库可以被插入到表达质粒中(如适合在哺乳动物细胞表达的抗体表达质粒，或适合在细菌细胞表达的噬菌体表达质粒)，并在适合这个表达质粒的宿主细胞中进行表达。这些宿主细胞(或噬菌体)可以通过不同的方法(如前面所述的细胞极限稀释培养方法，或噬菌体斑铺板方法)被分离纯化(克隆)出来。这些细胞株或噬菌体克隆可以被用来生产抗体，并对抗体进行分析鉴定。

本发明所述的抗体也可以根据本发明提供的抗体可变区氨基酸序列直接合成出来，并且可以通过进一步化学修饰衍生成不同的抗体类似物。

本领域技术人员也可以通过典型的重组DNA技术，将本发明提供的抗体可变区或可变区中的CDR区的氨基酸序列，或者本发明提供的胚系抗体可变区基因序列，设计到重组的抗体(或抗体类似物)的基因序列中，并通过典型的重组基因的异源细胞表达技术(重组蛋白表达)，生产出与本发明一样的或类似的抗体(或抗体类似物)。

本发明的抗风疹病毒膜蛋白E1抗体可以用于检测动物体内或体外，以及人工培养或自然环境中的风疹病毒，或风疹病毒膜蛋白E1，或含有风疹病毒E1的物质，以及能与风疹病毒膜蛋白E1特异结合的物质(如抗风疹病毒抗体)。检测的原理主要是基于本发明的抗风疹病毒膜蛋白E1抗体与风疹病毒膜蛋白E1的特异性识别和结合，并利用化学标记技术(如标记抗体，或标记的特异性二抗)或物理检测技术(如光散射技术，等离子体共振技术等)进行检测(见实施例部分)。

本发明中CDR区的确定，是通过NCBI IgBLAST序列比对而确定(Jian Ye,et al(2013)IgBLAST:an immunoglobulin variable domain sequence analysistool.Nucleic Acids Research,2013.Vol.41,doi:10.1093/nar/gkt382)。

本发明所述的胚系抗体基因是指动物从上一代生殖细胞遗传得到的“生殖系”抗体基因。胚系抗体基因在免疫细胞成熟的过程中需要经过一系列变化(DNA重组，突变，增加，缺失等)最终形成成熟的抗体基因，而这些成熟的抗体基因负责产生动物体内最终的抗体。本发明所述轻链可变区的DNA序列由小鼠的胚系抗体基因IGKV4-59*01(SEQID NO.11)所决定，即小鼠的胚系抗体基因IGKV4-59*01在免疫细胞成熟的过程中需要经过一系列变化(DNA重组，突变，增加，缺失等)最终形成成熟的抗风疹病毒膜蛋白E1抗体基因，其中包括抗风疹病毒膜蛋白E1抗体轻链可变区基因，即本发明所述轻链可变区的DNA序列。本发明所述重链可变区的DNA序列由小鼠的胚系抗体基因IGHV9-1*02(SEQID NO.12)所决定，即小鼠的胚系抗体基因IGHV9-1*02在免疫细胞成熟的过程中需要经过一系列变化(DNA重组，突变，增加，缺失等)最终形成成熟的抗风疹病毒膜蛋白E1抗体基因，其中包括抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体重链可变区基因，即本发明所述重链可变区的DNA序列。

本发明中所述抗体是指由动物的抗体基因编码并生物合成的的蛋白质。抗体类似物是指通过生物或化学方法产生的，在抗体结构的基础上，通过化学基团(如氨基酸)删减，添加，或修饰而得到的衍生物。这些衍生物仍然含有类似于抗体可变区(或抗体可变区中的CDR区)的结构，并能通过这些结构发生类似于抗原-抗体结合的反应。

本发明中所述的抗体可变区是指抗体重链和轻链中的一个结构域。在自然界中，抗体可变区由免疫球蛋白(重链和轻链)基因中的V，D(仅重链适用)，和J片段通过基因重组拼接编码。不同的抗体之间可变区的氨基酸序列具有高度的差异性(抗体的其他区域的氨基酸序列相对高度相同)，并负责与特异的抗原决定簇识别和结合。在抗体可变区中，又可以细分出骨架区和CDR区(comlementarity determining region)。一个典型的抗体可变区具有3个骨架区和3个CDR区(它们互相间插排列)。骨架区主要起到蛋白质结构域框架形成的作用，而CDR区主要起到抗原-抗体特异性识别结合的作用。

本发明中所述的抗风疹病毒膜蛋白E1抗体(或抗体类似物)可以是以单一的(或单克隆的)形式存在的，也可以是以多重的(或多克隆的)形式存在的。单一的的抗体(或抗体类似物)含有单一的结构(如单一的氨基酸序列)，而多重的抗体(或抗体类似物)含有两个以上不同的结构(如氨基酸序列)。

本发明提供了一种抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体的重链和轻链的可变区(及可变区中的CDR区)的核酸和氨基酸序列，也提供了衍生出此抗体重链和轻链的抗体基因的小鼠胚系抗体基因序列。

根据本发明所提供的抗体重链和轻链的可变区(或CDR区)序列，或者本发明提供的小鼠的胚系抗体基因序列，本领域技术人员可以通过化学合成和/或抗体基因在异源细胞中的表达(即重组蛋白表达)的方法制备与本发明一样的或类似的抗体(或抗体类似物)。

实施例

下面用实例的方式对本发明进行描述。这些实例仅用于演示实现本发明的一种方法，不应将其理解为实现本发明的唯一方法，不应将其理解为对本发明保护范围的限定。

一.风疹病毒膜蛋白E1表达质粒的构建

风疹病毒膜蛋白E1的核酸序列是根据NCBI Gene ID:1502162(RUBVgp2)全长序列人工合成的。在合成DNA序列时,风疹病毒膜蛋白E1的胞外区序列在3′端被连接上一段蛋白纯化用标签序列(6×His)。这个DNA片段被插入到哺乳动物细胞表达载体pGS3.1上，插入位点分别是EcoRI和XbaI限制性内切酶酶切位点。这个质粒被命名为pGS3.1-RV-E1，其结构如图1所示。

在质粒pGS3.1-RV-E1中，中国仓鼠谷氨酰胺合成酶(Cricetulus GS)的cDNA被插入到SV40病毒的早期基因启动子下游，GS的下游是SV40病毒早期基因的poly A信号序列。这个串联构建的作用是表达谷氨酰胺合成酶。被pGS3.1-RV-E1质粒转染的宿主细胞(如中国仓鼠细胞)将含有更高的谷氨酰胺合成酶活性，能在谷氨酰胺合成酶抑制剂(MSX)的筛选中存活下来(抗药性)。

风疹病毒膜蛋白E1(RV-E1)序列(蛋白C端带有纯化标签6X His)被插入到巨细胞病毒早期基因启动子(CMV Promoter)的下游。蛋白序列的下游是牛生长激素基因的poly A末端信号序列(BGH pA)。这组构建的作用是表达风疹病毒膜蛋白E1蛋白。风疹病毒膜蛋白E1将用固定化金属亲和层析(IMAC，或镍柱)方法纯化。

二.风疹病毒膜蛋白E1的表达与鉴定

首先，表达质粒pGS3.1-RV-E1被转染到CHO-S细胞。转染试剂是Free Style MAX(Invitrogen,16447100)，转染操作步骤如厂商产品说明书进行。转染后的CHO-S细胞被转移到一个125mL三角摇瓶中，在30mL FreeStyle CHO培养基中，细胞密度为1×10⁶个细胞/mL。细胞在CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)内培养，摇床转速为130rpm。培养液上清在细胞培养7天后被收集，上清中的RV-E1浓度(CHO-S细胞表达分泌的)被检测，检测方法是夹心法ELISA。在夹心法ELISA中，纯化的山羊抗风疹病毒多克隆抗体(同一抗体，一个不标记，一个用HRP标记，ViroStat，1701)被分别用作夹心ELISA方法的包被抗体和检测抗体。为了确定风疹病毒膜蛋白E1的浓度，已知浓度的商品RV K2S抗原(超速离心纯化的风疹病毒，Microbix公司原产，购自深圳菲鹏生物技术有限公司)被用来做浓度标准曲线。

如图2所示为风疹病毒膜蛋白E1的表达、纯化和鉴定结果。在培养基中谷氨酰胺合成酶抑制剂(MSX)的作用下，被质粒pGS3.1-RV-E1成功转染的中国仓鼠细胞(CHO-S)在96孔板中存活并成长起来。通过检测96孔板中培养基上清中的风疹病毒抗原活性(夹心法ELISA检测)，多个稳定表达风疹病毒膜蛋白E1的细胞株被挑选出来。图2中所示为其中一个细胞株，克隆号5B11，在摇瓶中培养11天后的上清，用固定化金属亲和层析(IMAC，或镍层析柱)方法分离纯化的风疹病毒膜蛋白E1。图2左为SDS-PAGE，显示蛋白质纯化的效果。图2右为Western Blot(用羊抗风疹病毒多克隆抗体检测，ViroStat，#1701)，显示纯化的风疹病毒膜蛋白E1的抗原性。各泳道所加样品顺序如表1所示：

表1

三.风疹病毒膜蛋白E1的CHO-S稳定细胞株的筛选与鉴定

被表达质粒pGS3.1-RV-E1转染的CHO-S细胞被稀释到100个细胞/孔的密度，加入到96孔板的微孔中，200μL CD-CHO培养基/孔，培养基中含12.5μM MSX试剂(谷氨酰胺合成酶GS抑制剂，用于筛选GS抗性基因)。微孔培养板在CO2培养箱(37℃，5％CO₂)，培养约20天，使抗性细胞生长。有抗性细胞生长的微孔中的细胞被转移到24孔细胞培养板中进行扩大培养(同时定量测定不同细胞株RV-E1表达水平)，转移时大约1000个细胞/孔。培养7天后，板中的细胞上清被取出做RV-E1浓度检测。结合RV-E1表达水平和细胞生长特性，若干株比较理想的细胞株被筛选出来，其中的5B11号细胞株被用于后期的RV-E1蛋白生产。

四、风疹病毒膜蛋白E1的生产和纯化

细胞培养阶段：将RV-E1稳定细胞株5B11以2×10⁵个细胞/mL浓度培养于装有400mL CD-CHO培养基的1L摇瓶中，培养基中含有12.5μM MSX试剂。将摇瓶放入CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)内的摇床(130rpm)中培养10天。将培养10天后的细胞培养液取出，200g离心5分钟(分离细胞和粗的细胞碎片)后移取上清至新的瓶中，继续3000g离心15分钟(分离细的细胞碎片)。将分离后的上清液用0.22μM的滤杯过滤除菌后4℃保存。

蛋白纯化阶段：将除菌后的细胞上清液平衡至室温后用Ni柱进行纯化。Ni柱填料(介质)，公司GE Healthcare，货号:#17-3712-02。取30mL层析柱装柱，装柱介质最终体积为10mL。细胞上清上样量400mL，流速为1.0mL/分钟，然后用不同浓度的咪唑洗脱液洗脱(20mMTris-HCl,pH 8.5，50-1000mM咪唑浓度梯度)。风疹病毒膜蛋白E1在50mM咪唑洗脱液中洗脱下来。取纯化实验各洗脱步骤样品，用SDS-PAGE和WesternBlot实验检测RV-E1目的蛋白的纯度(结果见图2)。用10KDa超滤管(Millipore，UFC900396)对含有风疹病毒膜蛋白E1的洗脱液进行浓缩，并用10KDa的透析袋过夜透析，透析液为10mM PH7.4PBS缓冲液。透析后的风疹病毒膜蛋白E1用BCA试剂盒(索莱宝，PC0020)测定总蛋白浓度。典型的总蛋白浓度为1mg/mL。纯化后的风疹病毒膜蛋白E1在4℃保存。

五.用纯化的风疹病毒膜蛋白E1免疫BALB/c小鼠

选取6～8周龄的BALB/c小鼠进行如下免疫程序：初次免疫时，用25μg纯化后的重组蛋白RV-E1与等量弗式完全佐剂混合，经乳化后皮下多点注射；首免后14天，用12.5μg重组蛋白与弗氏不完全佐剂混合，乳化后加强免疫。二免后14天，用12.5μg重组蛋白与弗氏不完全佐剂混合，乳化后加强免疫。三免后14天采血并分离血清，用0.2μg纯化的风疹病毒膜蛋白E1包被ELISA板，进行间接ELISA试验，测定血清效价。结果显示制备的鼠抗血清效价为1：72900，典型的免疫小鼠血清检测结果如表2所示。

表2

六.细胞融合

在加强免疫小鼠3天后进行细胞融合。摘出小鼠眼球取血后，脱臼处死小鼠，放入70％酒精瓶中放置2分钟后，于生物安全柜内将小鼠固定于泡沫板上，解开腹部皮肤找到脾脏，用镊子取下，放入200目不锈钢滤膜中轻轻研碎，用DMEM培养基轻轻冲洗下细胞，之后室温下的离心机中200g离心10分钟，弃上清后备用；制备饲养细胞时，脱臼处死小鼠，放入70％酒精瓶中放置2分钟后，于生物安全柜内将小鼠固定于泡沫板上，解开腹部皮肤，用注射器吸取PBS轻轻注入腹膜下，从另一边再将含有饲养细胞的液体洗出，之后室温下的离心机中200g离心10分钟，弃上清后备用。将2.0×10⁷个FO骨髓瘤细胞与2.0×10⁸个脾细胞混匀，离心机中200g离心10分钟，弃上清，轻微振荡混匀，于37℃水浴中，在90秒内滴加1ml体积浓度为50％的PEG-1450水溶液，然后滴加20mL DMEM培养基，离心机中200g离心10分钟，弃上清，重复洗一次，离心机中200g离心10分钟，弃上清，得到杂交瘤细胞，将细胞铺到10块96孔培养板中，每孔150μL。将饲养层细胞10000个细胞/孔加入上述10块96孔细胞培养板中，每孔100μL，将培养板标记好后，放入37℃的含5％CO₂的细胞培养箱中培养，在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。

七.阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆培养

首先，通过方正实验确定RV-E1作为抗原最佳包被量。将0.5、1.0、2.0、4.0μg的RV-E1纯化蛋白包被96孔板，每个浓度6个孔分别设置为3个阳性3个阴性。用不同稀释倍数的RV-E1纯化蛋白免疫鼠阳性血清进行方正滴定，同时以未免疫鼠阴性血清作为阴性对照。用每孔0.5μg纯化的RV-E1蛋白包被96孔ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤2次；每孔加入200μL的1％BSA的PBS，室温封闭2小时；三折纸上拍干；加样：加待检样品0.1mL于反应孔中，置37℃温育1小时。然后洗涤。同时做空白孔(不加样品)，阴性对照孔及阳性对照孔。各反应孔中加入新稀释的抗体0.1mL。置37℃温育1小时。然后洗涤3次。加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1mL。37℃温育1小时，洗涤3次。加底物液显色：各反应孔中加入TMB底物溶液0.1mL，室温静置10分钟。各反应孔中加入1M H₂SO₄ 0.1mL。测OD值判断结果，使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。以阴性对照OD值的2.1倍以上为阳性(以空白对照孔调零后计算)。挑选出抗RV-E1蛋白的杂交瘤细胞单克隆。

按照上述方法，将筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，通过有限稀释法将原有的孔用HAT选择培养基稀释后重新分到96孔培养板中，之后观察细胞的形态和数量。调整细胞为3～10个细胞/mL。取前一日准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μL。于37℃、5％CO₂培养箱中静置培养。在第7天换液，以后每2～3天换液1次。8～9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。每个克隆应尽快冻存，最终选定克隆号2C8E3的杂交瘤细胞株用于抗体生产，本发明中将克隆号2C8E3的杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株2C8E3，其产生的抗体命名为抗体2C8E3。

八、单克隆抗体的大量制备及抗体效价测定

(1)单克隆抗体的大量制备

通过腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂于8周龄BALB/C鼠，2周后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一只小鼠可获5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。将获得的腹水于3000g离心10分钟，弃去上层油脂和底部沉淀，收集上清分装于-20℃，腹水上清解冻并平衡至室温后，加入1/10体积的1M Tris–HCl PH8.0，使样品PH值至8.0。用20个柱体积100mM PH8.0的Tris–HCl平衡protein G亲和柱中，将调节PH至8.0后的腹水上清上柱，之后用20个柱体积100mM PH 8.0的Tris–HCl洗涤，最后用100mM Glycine–HCL PH 2.5洗脱抗体。将抗体洗脱液加入到浓缩管(Millipore，UFC801008，10K)中离心机(湘仪，L550)室温3000×g离心20分钟。分批离心至溶液体积至1ml/浓缩管(2管)，加入10mM PBS PH 7.4缓冲液4mL,继续室温3000×g离心20分钟。重复离心3次，使抗体的缓冲液为10mM PBS PH 7.4，加入10mM PBS PH 7.4至总体积10mL。最后将浓缩后的抗体溶液2mL/管分装于离心管中，-80℃中保存。利用BCA试剂盒(索莱宝，PC0020)测定抗体浓度，测定纯化后的单克隆抗体浓度为5.8mg/mL。

(2)抗体效价测定

利用ELISA间接法检测抗RV-E1抗体2C8E3的效价。将RV-E1重组蛋白用PBS稀释，以0.2μg/mL、100μL/孔包被于96孔酶标板中，4℃过夜后，酶标板用PBST溶液清洗2次，每次清洗300μL/孔。清洗后拍干。用1％BSA的PBS溶液，200μL/孔封闭酶标板，室温2小时，封闭后拍干；加入PTB稀释至20ng/mL的抗RV-E1抗体2C8E3，37℃恒温箱中反应1小时，酶标板用PBST溶液清洗2次，每次清洗300μL/孔。清洗后拍干。加入PTB稀释5000倍的HRP标记的羊抗鼠抗体，37℃恒温箱中反应1小时，酶标板用PBST溶液清洗2次，每次清洗300μL/孔。清洗后拍干。加入TMB底物溶液，100μL/孔室温反应10分钟，加入100μL/孔的1M H₂SO₄终止反应。100μL，使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。结果参见表3。

表3

九、单克隆抗体的序列分析

(1)单克隆抗体亚型鉴定

将杂交瘤细胞株2C8E3用加有10％血清的DMEM培养基(GIBCO，#C11995500BT)培养在10cm直径的细胞培养皿中(37℃、5％CO₂)。培养7天后将细胞转移至15ml离心管中，血球计数板计数后取出4×10⁶个细胞，以200g离心5分钟后，弃上清，并将离心管倒置，将管内液体控干。管内细胞利用QIAGEN公司的反转录试剂盒(Qiagen,74134)合成cDNA。

抗体亚型是通过用抗体亚型特异的引物做PCR确定的(14)上述合成的cDNA被用来作为PCR反应模板。PCR反应溶液体系：TAKARA Ex Taq(5U/μL，TAKARA，RR001B)，0.25μL；10×Ex Taq Buffer，5μL；dNTP混合物(各2.5mM)，4μL；模板cDNA，1μL；上游引物(100μM)，1μL；下游引物(100μM)，1μL；加入双蒸水至总体积50μL。PCR反应温度程序：94℃5分钟预变性，温度循环30次(94℃1分钟，57℃1分钟，72℃1分钟)，72℃10分钟延伸。反应结束后，PCR产物各取10μL上样于1％琼脂糖凝胶中进行电泳(图3)。根据PCR产物结果可以推断出抗体的亚型(表4)。本发明获得的单克隆抗体2C8E3为重链为IgG1，轻链为kappa。

杂交瘤细胞株2C8E3的全RNA被分离(见说明书。QIAGEN，#74134)，并通过反转录反应被转变成cDNA文库(见说明书。QIAGEN，#74134)。此cDNA文库被作为模板进行PCR反应。特异的引物对(Orlandi et al,见文献14)被用来扩增特定的抗体亚型。PCR反应产物被加到琼脂糖凝胶中进行电泳。图3中显示，本发明的单克隆抗体2C8E3的重链为IgG1，轻链为kappa。抗体2C8E3的重,轻链可变区的PCR片段(即泳道2和泳道6的圈出部分)被从琼脂糖凝胶中分离提取出来(全式金，EG101-01),并被亚克隆到pEASY-T1质粒(全式金，CT101-01)中送到测序公司进行DNA测序。图3中各泳道所加样品顺序如表5所示：

表4

其中S＝C or G,M＝A or C,R＝A or G,and W＝A or T

表5

(2)杂交瘤细胞株2C8E3抗体可变区(V区)测序

杂交瘤细胞株2C8E3的抗体的V区在PCR扩增后得到的片段(见上条)被从琼脂糖凝胶上切割下来，并用DNA抽提试剂盒(Qiagen，74134)提取出来。提取得到的DNA片段被与pEASY-T1克隆载体链接，并被转化到Trans1-T1感受态细胞中(Transgen,CT101-1)。转化的细菌菌落被挑取到LB培养基中，经过过夜培养被送去做DNA测序。本发明提供的抗风疹膜蛋白E1抗体(抗体2C8E3)的轻链V区核酸序列如Seq ID NO:3所示，重链V区的核酸序列如SeqID NO:4所示。

十.抗体2C8E3在检测风疹病毒或含RV-E1的物质中的应用

(1)间接法ELISA

抗体2C8E3检测K2S(天然风疹病毒，Microbix，#EL-05011,0.53mg/ml,Lot：05447A1。)和风疹病毒膜蛋白E1的能力用间接法ELISA进行了评估。在这个实验里，K2S和风疹病毒膜蛋白E1作为抗原用PBS稀释，并被包被于96孔酶标板中，包被浓度0.2μg/mL，体积100μL/孔。在4℃过夜包被后，酶标板用PBST溶液清洗2次，每次清洗300μL/孔。清洗后拍干，酶标板用含1％BSA的PBS溶液封闭，200μL/孔，室温2小时。拍干，酶标板内加入抗体2C8E3(用PTB稀释至20ng/mL)，100μL/孔，并在37℃恒温箱中反应1小时。拍干，PBST洗板3次，每次300μL/孔。拍干，酶标板内加入PTB稀释5000倍的HRP标记的羊抗鼠抗体，37℃恒温箱中反应1小时。PBST洗板3次，300μL/孔。拍干，酶标板内加入TMB底物溶液，100μL/孔，室温10分钟，然后加入100μL/孔的1M H₂SO₄，终止反应。使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。实验结果如图4所示，抗体2C8E3可以与RV-E1和天然风疹病毒蛋白结合，可以检测天然风疹病毒或风疹病毒膜蛋白E1。

超速离心纯化的灭活的风疹病毒(Microbix，K2S)和风疹病毒膜蛋白E1(RV-E1)被包被于96孔酶标板中。抗体2C8E3被加入到包被好的酶标板中进行反应。随后，HRP标记的羊抗鼠多克隆抗体(标记二抗)，TMB底物，及1M H2SO4溶液依次被加入到酶标板中(有抗原-抗体结合反应的酶标板孔此时呈现黄色)。酶标板孔的450nm吸光值(OD450，监测黄色光区域吸光度)被用酶标仪读取。图4中显示，抗体2C8E3可以检测天然风疹病毒K2S和重组表达的风疹病毒膜蛋白E1。

(2)夹心法ELISA

抗体2C8E3检测K2S和风疹病毒膜蛋白E1的能力用夹心法ELISA进行了评估。在这个实验里，羊抗天然风疹病毒多抗作为抗原用PBS稀释，并被包被于96孔酶标板中，包被浓度1μg/mL，体积100μL/孔。在4℃过夜包被后，酶标板用PBST溶液清洗2次，每次清洗300μL/孔。清洗后拍干，酶标板用含1％BSA的PBS溶液封闭，200μL/孔，室温2小时。拍干，酶标板内加入天然风疹病毒蛋白K2S(用PTB稀释至0.2μg/mL)，100μL/孔，并在37℃恒温箱中反应1小时。拍干，PBST洗板3次，每次300μL/孔。拍干，酶标板内加入抗体2C8E3(用PTB梯度稀释L)，100μL/孔，并在37℃恒温箱中反应1小时。拍干，PBST洗板3次，每次300μL/孔。拍干，酶标板内加入PTB稀释5000倍的HRP标记的羊抗鼠抗体，37℃恒温箱中反应1小时。PBST洗板3次，300μL/孔。拍干，酶标板内加入TMB底物溶液，100μL/孔，室温10分钟，然后加入100μL/孔的1M H₂SO₄，终止反应。使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。结果参见表6。

表6

十一、抗体2C8E3在检测人血清抗风疹病毒抗体中的应用

(1)抗体2C8E3的辣根过氧化物酶(HRP)标记及标记产物的鉴定

取0.5mL抗体2C8E3(20nmol，3mg)加入到透析袋(10KDa，宽度1cm)中，在2L 10mMPBS溶液(PH 7.4)中4℃过夜透析。次日将含有抗体溶液的透析袋放入1L 10mM碳酸盐缓冲液(PH 9.5)中室温搅拌透析2小时，准备与活化好的HRP进行偶联。

与此同时，使用分析天平精确称取1mg HRP，加入0.2mL超纯水溶解，使HRP浓度为5mg/mL。向上述HRP溶液中加入40μl 0.1M NaIO₄，放置在水平摇床上，室温避光反应(活化)20分钟。将活化后的HRP溶液加入到透析袋(10KDa，宽度1cm)中，在2L 1mM醋酸钠缓冲液(PH4.4)中4℃过夜透析。将透析后的HRP溶液小心吸出并转入新的1.5mL离心管中，加入1/10体积的0.2M碳酸盐缓冲液，使活化后的HRP溶液PH升高至9.0-9.5。

将以上抗体和HRP混合(进行偶联反应)，放置在水平摇床上，室温避光反应4小时。偶联反应结束后，加入10ul(用预冷的超纯水)新鲜配制的NaBH4，4℃避光过夜终止反应。将偶联反应终止后的抗体溶液移至透析袋(10KDa，宽度1cm)中，室温搅拌透析2小时。最后将溶液转移至棕色的离心管中，4℃保存。

HRP标记后的抗体2C8E3检测天然风疹病毒蛋白K2S的最佳稀释倍数用直接法ELISA评估。在实验中，天然风疹病毒蛋白K2S用PBS稀释到0.2μg/mL，然后100μL/孔包被于96孔酶标板中(4℃过夜)。用300μL/孔PBST洗板2次。拍干，用含1％BSA的PBS溶液封闭酶标板，200μL/孔，室温2小时。拍干，加入不同比例稀释的抗体2C8E3(用PTB稀释)，100ul/孔，37℃恒温箱中反应1小时。PBST洗板3次，每次300μL/孔。拍干，加入TMB底物溶液，100μL/孔，室温反应10分钟。然后加入100μL/孔的1M H₂SO₄终止反应。使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。结果如图5所示，标记后的抗体2C8E3的最佳稀释倍数为200倍稀释。

超速离心纯化的灭活的天然风疹病毒K2S被包被于96孔酶标板中。不同稀释倍数HRP标记的抗体2C8E3被加入到酶标板中与K2S进行反应。随后TMB底物溶液和1M H₂SO₄被依次加入(显色反应)。酶标板孔的450nm测定吸光值(OD450)被在酶标仪上读取。图中显示，HRP标记的抗体2C8E3在200倍稀释时的信号强度最佳。

(2)ELISA捕获法检测人血清中的IgM抗风疹病毒抗体

鼠抗人IgM抗体用PBS稀释到1μg/mL，用100μL/孔包被于96孔酶标板中(4℃过夜)。用PBST洗板2次，每次300μL/孔。拍干，用含1％BSA的PBS溶液封闭酶标板，200μL/孔，室温2小时。封闭后拍干，酶标板内加入用PTB100倍稀释的人血清，100μL/孔，37℃恒温箱中反应1小时。PBST洗板3次，每次300μL/孔。拍干，酶标板内加入天然风疹病毒蛋白K2S(用PTB稀释到0.2μg/mL)，100μL/孔，37℃恒温箱中反应1小时。用PBST洗板3次，每次300μL/孔。拍干，酶标板内加入用PTB 500倍稀释的HRP标记的抗体2C8E3，100μL/孔，37℃恒温箱中反应1小时。用PBST洗板3次，每次300μL/孔。拍干，酶标板内加入TMB底物溶液，100μL/孔，室温反应10分钟，然后加入1M H₂SO₄(100μL/孔)终止反应。使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。结果见图6，HRP标记后的抗体2C8E3可以检测人血清抗风疹病毒IgM抗体。标记后的抗体2C8E3对阴阳性血清的判定结果与商业试剂盒(Virion\Serion，ER129M)的检测结果相同。

鼠抗人IgM抗体用PBS稀释后包被于96孔酶标板中。封闭后拍干，酶标板内加入稀释的人血清，37℃恒温箱中反应1小时。洗板拍干后，酶标板内加入天然风疹病毒蛋白K2S，37℃恒温箱中反应1小时。洗板拍干后，酶标板内加入用PTB稀释的HRP标记的抗体2C8E3，37℃恒温箱中反应1小时。洗板拍干，酶标板内加入TMB底物溶液，室温反应10分钟，然后加入1M H₂SO₄终止反应。使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。图中显示，HRP标记后的抗体2C8E3检测人血清抗风疹病毒IgM抗体的判定结果与商业试剂盒(Virion\Serion，ER129M)的检测结果相同。本发明中所述实验方法及原理未详尽描述之处可参考以下文献：

1.Chaye H H.et al(1992)Cellular and humoral immune responses torubella virus structural proteins E1,E2,and C.J Clin Microbiol.USA 30,2323-2329.

2.Hobman T C.et al(1994)Expression of soluble forms of rubella virusglycoproteins in mammalian cells.Virus Res.USA 31,277-289.

3.Seto N O L.et al(1994)Expression and characterization of a solublerubella virus E1envelope protein.J Med Virol.USA 44,192-199.

4.Oker-Blom C.et al(1983)Rubella virus contains one capsid proteinand three envelope glycoproteins,E1,E2a,and E2b.J Virol.USA 46,964-973.

5.G.et al(1975)Continuous cultures of fused cells secretingantibody of predefined specificity.Nature.USA 256,495–497.

6.Lemke H.et al.(1978)Hybrid cell lines secreting monoclonal antibodyspecific for major histocompatibility antigens of the mouse.Nature.USA 271,249-251.

7.Kearney J F.et al.(1979)A new mouse myeloma cell line that has lostimmunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secretinghybrid cell lines.J IMMUNOL.USA123,1548-1551.

8.Jin A.et al.(2009)A rapid and efficient single-cell manipulationmethod for screening antigen-specific antibody secreting cells from humanperipheral blood.Nature Med.USA 15,1088-1092.

9.Tavares A H.et al.(1997)Rapid amplification of cDNA ends(RACE)improves the PCR-based isolation of immunoglobulin variable region genes frommurine and human lymphoma cells and cell lines.USA 11,1787-1792.

10.Yue Z.et al.(2000)Using Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE)toObtain Full-Length cDNAs.The Nucleic Acid Protocols Handbook.USA,15-21

11.Frohman M A.et al.(1990)RACE:RAPID AMPLIFICATION OF cDNA ENDS-PCRProtocols-4.Pcr Protocols A Guide to Methods&Applications.USA 39,28–38.

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14.Orlandi R.et al(1989)Cloning immunoglobulin variable domains forexpression by the polymerase chain reaction.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,3833-3837.

序列表

<110> 申请人名称捷敏（天津）生物技术有限公司

<120> 一种新的抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 94

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus )

<400> 1

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ser Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro

85 90

<210> 2

<211> 97

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus )

<400> 2

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr

1 5 10 15

Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly

20 25 30

Met Asn Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly Lys Asp Leu Lys Trp Met Gly

35 40 45

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Phe Ala Asp Asp Phe Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Ile Ala Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg

<210> 3

<211> 284

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus )

<400> 3

gacattcagc tgacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gttccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120

acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaattgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cacc 284

<210> 4

<211> 293

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus )

<400> 4

aggtcaaact gcaggagtct ggacctgagc tgaagaagcc tggagagaca gtcaagctct 60

cctgcaaggc ttctgggtat accttcacaa actatggaat gaactgggtg aatcaggctc 120

caggaaagga tttaaagtgg atgggctgga taaacaccta cactggagag ccaacatttg 180

ctgatgactt caagggacgg tttgccttct ctttggaaac ctctgccagc actgcctatt 240

tgcagatcgc caacctcaaa aatgaggaca tggctacata tttctgtgca aga 293

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus )

<400> 5

Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 6

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus )

<400> 6

Asp Thr Ser

1

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus )

<400> 7

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus )

<400> 8

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus )

<400> 9

Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro

1 5

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus )

<400> 10

Ala Arg Arg Arg Gly Ser Ser Ala Ser Ser Ile Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 11

<211> 286

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus )

<400> 11

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120

acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc caccca 286

<210> 12

<211> 294

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus )

<400> 12

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120

ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct acactggaga gccaacatat 180

gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac atggctacat atttctgtgc aaga 294

Claims

1.一种抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体，包含轻链和重链，其特征在于，所述抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体包含如下1)所述的轻链和/或如下2)所述的重链，

所述抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体可以结合风疹病毒膜蛋白E1。

2.一种抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体，包含轻链和重链，其特征在于，轻链可变区的核酸序列包含由序列表中Seq ID NO:3所示的核酸序列；和/或重链可变区的核酸序列包含由序列表中Seq ID NO:4所示的核酸序列。

3.一种抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体，包含轻链和重链，，其特征在于，轻链可变区的互补决定区CDR1，CDR2和CDR3分别含有由序列表中Seq ID NO:5，Seq ID NO:6，Seq ID NO:7所示的氨基酸序列；和/或重链可变区的互补决定区CDR1，CDR2和CDR3分别含有由序列表中Seq ID NO:8，Seq ID NO:9，Seq ID NO:10所示的氨基酸序列。

4.一种抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体，包含轻链和重链，其特征在于，轻链可变区的DNA序列由小鼠的胚系抗体基因IGKV4-59*01(SEQ ID NO.11)所决定；和/或重链可变区的DNA序列由小鼠的胚系抗体基因IGHV9-1*02(SEQ ID NO.12)所决定。

5.一种抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体类似物，由权利要求1-4任一项所述的抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体通过化学基团删减和/或添加和/或修饰而得到的衍生物，所述抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体类似物可以结合风疹病毒膜蛋白E1。

6.一种检测风疹病毒及含有风疹病毒膜蛋白E1的方法，使用的抗体包括权利要求1-4所述抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体。

7.如权利要求6所述的检测风疹病毒及含有风疹病毒膜蛋白E1的方法，使用抗体还包括权利要求6所述的抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体类似物。

8.一种检测抗风疹病毒抗体的方法，使用的抗体包括权利要求1-4所述抗风疹病毒膜蛋白E1的抗体。

9.如权利要求8所述的检测抗风疹病毒抗体的方法，其特征在于，使用的抗体还包括权利要求5所述的抗风疹病毒膜蛋白E1抗体类似物，所述检测抗风疹病毒抗体的方法用于检测人或动物组织或体液内抗风疹病毒E1的抗体。