CN117069849B - 识别nag的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种识别NAG的单克隆抗体及其应用,涉及用于识别NAG的免疫分析检测技术领域。本发明提供的识别NAG的单克隆抗体A和B,单克隆抗体A的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示,轻链氨基酸序列如SEQ IDNO.28所示;单克隆抗体B的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示,轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示。本发明还提供了用于检测NAG的产品。本发明提供的单克隆抗体A和B均能识别天然NAG,且B细胞培养的上清可达1:1w,转染后的293F细胞效价大于1/10w,完全能够应用于NAG蛋白的研究,具有特异性高,抗干扰能力强,检测灵敏度高和稳定性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及用于识别NAG的免疫分析检测技术领域,特别涉及识别NAG的单克隆抗体。
背景技术
糖苷酶即糖苷水解酶(Glycoside hydrolases,GH,EC3.2.1)是一类能水解糖苷键(glycosidic bonds)的酶,在生物体内的糖和糖缀合物的水解与合成过程中扮演着重要角色。其中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAG,β-2-acetamido-2-deoxy-D-glucoside acetamidodeoxyglucohydrolase,EC3.2.1.30)是一种位于溶酶体内的酸性水解酶,分子量约112500±19000,存在于所有组织中,并以前列腺和肾近球肾小管溶酶体中含量最高。NAG有多种同工酶,大多数组织中有A型(NAG-A)和B型(NAG-B)同工酶,少数组织中还有微量的I、P、S型同工酶。这些同工酶pI、底物特异性和热稳定性不同,NAG-B和NAG-I由两个β亚基组成,NAG-A由ɑ和β两个亚基组成。
多年来的研究表明NAG同工酶具有重要的临床意义,尤其是NAG-B,可作为肾小管受损的早期诊断指标。尿液中的NAG主要来源于肾近曲小管上皮细胞,当近曲小管上皮细胞受损时,尿中NAG活性将显著升高且早于其他尿酶,并且NAG上升程度与肾小管损伤程度成正比,因此可作为尿标志性蛋白,对肾损害(尤其是肾小管损害)的早期诊断有较大价值。目前,常用的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶测定方法有底物法、酶法、速率法、两点法,这些方法都是利用N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶与底物的酶促反应来测定其活性,反应容易受酶浓度、底物浓度、反应温度等等的干扰。因此,建立一种简单、高灵敏性的检测方法十分必要。
发明内容
本发明提供了一种能够特异性识别N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)的单克隆抗体,并提供了该抗体在检测NAG蛋白中的应用,在肾损害的检测和诊断中具有重要作用。为了实现上述目的,具体通过以下技术实现。
一种识别NAG的单克隆抗体,为单克隆抗体A或单克隆抗体B;所述单克隆抗体A的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示,轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.4-5所示,轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列为YAS;
所述单克隆抗体B的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6-8所示,轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9-10所示,轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列为WAS。
优选地,所述单克隆抗体A的重链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.11-14所示,轻链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ IDNO.15-18所示;
所述单克隆抗体B的重链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQID NO.19-22所示,轻链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.23-26所示。
更优选地,所述单克隆抗体A和单克隆抗体B的轻链恒定区均为κ链,重链恒定区均为IgG2a型。
优选地,所述单克隆抗体A和单克隆抗体B均为鼠单克隆抗体。
进一步优选地,所述单克隆抗体A的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示,轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示;
所述单克隆抗体B的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示,轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示。
优选地,还包括共价或非共价连接的偶联物。
更优选地,所述偶联物包括酶、荧光蛋白、荧光团、生物素或链霉亲和素。
本发明提供的上述的识别NAG的单克隆抗体,还可以在用于制备检测NAG的产品。
本发明提供的识别NAG的单克隆抗体的检测产品,包括上述任一项的识别NAG的单克隆抗体。
优选地,所述产品为检测试纸条或检测试剂盒。
更优选地,所述检测试纸条为胶体金试纸条或ELISA试纸条;所述检测试剂盒为胶体金检测试剂盒、ELISA检测试剂盒、免疫层析试剂盒、免疫比浊检测试剂盒、磁颗粒检测试剂盒、化学发光检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒或放射免疫检测试剂盒。
与现有技术相比,本发明的有益之处在于:本发明提供的单克隆抗体A和单克隆抗体B均能够很好的识别天然的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG),且B细胞培养的上清效价可达1:10000,转染后的293F细胞效价大于1:100000,完全能够应用于N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)蛋白的研究。利用本发明所述单克隆抗体制备的免疫层析试剂盒,具有特异性高,抗干扰能力强,检测灵敏度高和稳定性好等优点,检测限最低达到10U/mL。相比于现在市面上的试剂盒(常规检测限为11U/L-100U/L),本发明提供的试剂盒能够检测极微量水平N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)蛋白。
附图说明
图1为实施例2中进行杂交瘤细胞筛选的OD值结果;
图2为实施例2中进行单克隆抗体特性鉴定时的抗体分子质量鉴定的凝胶电泳图;
图3为实施例2中进行单克隆抗体的ELISA效价测定结果;
图4为使用本发明的单克隆抗体A和B制备的胶体金试纸条的检测结果示意图;
图5为使用本发明的单克隆抗体A和B制备的胶体金试纸条的特异性和抗干扰能力评价结果;
图6为使用本发明的单克隆抗体A和B制备的胶体金试纸条的灵敏性评价结果;
图7为使用本发明的单克隆抗体A和B制备的胶体金试纸条的稳定性评价结果。
具体实施方式
本申请中的“抗体”为广义概念,包括各种抗体结构,包括但不限于Y形抗体(即全长抗体)、Y形抗体的抗原结合部分、及前述两者的遗传或化学修饰。抗原结合部分指Y形抗体的一个或多个片段,且所述一个或多个片段保留抗体特异性结合NAG蛋白的能力。现有技术中已经证实全长抗体的抗原结合功能是能够通过其片段来实现的。
本申请中的“单克隆抗体(mAb)”是指基本同质的抗体,各个抗体基本相同,个别抗体中可能存在少量自然突变。单克隆抗体能够表现出对特定抗原表位的特异性和亲和力。单克隆抗体与多克隆抗体不同,多克隆抗体包括针对不同抗原表位的多种不同抗体,而单克隆抗体一般仅可以靶向抗原相同或基本相同的表位。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体,而不要求通过任何特定方法生产。事实上,抗体可以通过各种方法制备,如单个B细胞培养和克隆、杂交瘤、重组DNA或噬菌体抗体文库分离筛选。
本申请中的“识别NAG蛋白的单克隆抗体mAb”指能够以足够的亲和力结合NAG蛋白的单克隆抗体,从而能够在靶向NAG蛋白的检测、诊断和/或治疗剂中使用。本申请中的术语“亲和力”指在分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的总的非共价分子间相互作用的强度。分子间的相互作用包括氢键、静电相互作用、疏水力以及范德华力。
本申请中的“鼠抗体”、“鼠抗NAG蛋白mAb”等术语中的修饰语“鼠”表示该抗体的互补决定区(CDR)来自鼠种系免疫球蛋白序列。鼠抗体或鼠抗NAG蛋白mAb包括CDR序列来自鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。优选地,鼠抗体或鼠抗NAG蛋白mAb包括CDR序列来自鼠种系免疫球蛋白序列,而抗体骨架区(FR)来自另一种哺乳动物(如兔、羊或人类)的免疫球蛋白序列的抗体。优选地,鼠抗体或鼠抗NAG蛋白mAb包括其FR和CDR均来自鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。本申请中的“鼠抗体”或“鼠抗NAG蛋白mAb”也可以是不包含由鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基的抗体,例如,由体外随机或定点诱变、体内体细胞突变引发的抗体。但,本申请中的“鼠抗体”或“鼠抗NAG蛋白mAb”不包括CDR序列来自其他哺乳动物(例如兔)的抗体。
在本申请的实施例中,鼠抗NAG蛋白mAb是Y形抗体,包括重链和轻链,重链包括一个可变区(VH)和至少一个恒定区(CH)。VH一般位于重链的N端,且与CH相比,VH在氨基酸序列上具有更高的变异性。不同抗体的VH可以是不同的,且可以对每种抗体特异性识别。在同种型或同类型的抗体中,CH的氨基酸序列可以是相同的,但不同种型CH的氨基酸序列是不同的。本申请中的“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgG)。哺乳动物抗体具有五种不同类型的重链:γ、δ、α、μ和ε,分别代表了五种类型的抗体:IgG、IgD、IgA、IgM和IgE,人和小鼠均具有上述五种抗体同种型。
轻链是相对于重链的小多肽亚基,包括一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)。VL一般位于轻链的N端,且与CL相比,VL在氨基酸序列上具有更高的变异性。不同抗体的VH可以是不同的,并且对每种抗体的氨基酸序列具有特异性。
每个可变区VH和VL包括互补决定区(CDR)和骨架区(FR)。CDR是可变区内的高变区,其包含抗原接触残基,能够实现Y形鼠单抗对NAG蛋白的识别和接触功能。本申请的实施例中提供的抗NAG蛋白的单克隆抗体包含6个CDR,其中3个在VH区,另外3个在VL区。
VH和VL的相邻CDR由FR隔开,即抗NAG蛋白的单克隆抗体包含8个FR,其中4个在VH区,另外4个在VL区。FR是可变区的保守区,可充当支架使CDR具备能够与抗原(如NAG蛋白的胞外域)接触的三维结构。
CDR区决定抗NAG蛋白的单克隆抗体的特异性和亲和力。FR区能够协助维持抗NAG蛋白的单克隆抗体可变区的整体结构,并支撑CDR使其能够以合适的构型与抗原结合。
不同抗体FR的三维结构可以是相同的。在某些实施例中,单克隆抗体的CDR可以在保留其结合NAG蛋白的能力的情况下转接至来自其他物种的另一抗体的FR中,以形成嵌合抗体。如,可以将鼠抗NAG蛋白的单克隆抗体的CDR移植到人抗体的FR中,形成针对NAG蛋白的人源化抗体。
鼠抗NAG蛋白的制备方法有多种,包括单克隆抗体法,如细胞杂交等,包括但不限于B淋巴细胞的病毒转化或原代转化,也可以通过单个B细胞制备技术获得。
脾细胞的免疫、分离及融合可采用本领域常规方法。例如,通过刺激Balb/c小鼠的免疫反应获得NAG蛋白的胞外域的免疫原,具体包括从PBMC和次级淋巴组织中分离出NAG蛋白特异性B细胞,扩增候选IgG基因以重组表达鼠mAb。通过直接抗原ELISA验证mAb候选物的结合力和特异性,捕获ELISA和夹心ELISA对可识别NAG蛋白的mAb进一步表征,以进行后续分析开发。
鼠mAb的分离和纯化方法有多种,如可以从用鼠抗体基因转染的哺乳动物细胞的培养上清液中分离,然后利用蛋白A亲和层析进行纯化,纯度和功能效果可以通过SDS-PAGE和ELISA进行验证。
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。以下实施例中未注明具体条件的,均按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的,均为可以通过市售购买获得的常规产品。本领域技术人员可参考本文内容进行适当改进以实现和应用本发明的技术,但是类似的替换和改动应视为包括在本发明公开的内容范围内。
实验例1:N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)蛋白的提取
1、人胎盘解冻后去除脐带,用预冷的纯水清洗,去除血管和膜,剪碎;继续用预冷的含有0.5mM EDTA,1% NaN3的纯水漂洗3次。在洗净剪碎的胎盘中加入2L预冷的缓冲液(含有0.5mM EDTA、1% NaN3、0.01M phosphate buffer(Na2HPO4/KH2PO4)、pH=6.0)匀浆;充分匀浆后,4℃低温10000×g离心10min,收集上清。沉淀中再次加入1L预冷的缓冲液(含有0.5mM EDTA、1% NaN3、0.01M phosphate buffer(Na2HPO4/KH2PO4)、pH=6.0)匀浆;充分匀浆后,4℃低温10000×g离心10min,取上清,并透析至缓冲液(0.5M NaCl、1% NaN3、0.125M琥珀酸钠、pH=6.0)中。
2、透析完全后的样品,4℃低温12000×g离心1h后,上清经过0.45μM膜过滤,等待上样。用平衡液(0.5M NaCl、0.1% NaN3、12.5mM琥珀酸钠,pH=6.0)平衡5mL Con A Beads4FF层析柱30mL;过滤好的样品以0.5mL/min流速上样,上样完成后,经10mM phosphatebuffer(Na2HPO4/KH2PO4)、0.5M NaCl,pH=7.0洗杂至基线走平;10mM phosphate buffer(Na2HPO4/KH2PO4)、0.2Mα-D-甲基葡萄糖苷、pH=7.0洗脱。洗脱样品透析至5mM phosphatebuffer(Na2HPO4/KH2PO4)、pH=7.5中。
3、透析完全后的样品,4℃低温12000×g离心10min,上清经过0.45μM膜过滤,等待上样。用平衡液5mM phosphate buffer(Na2HPO4/KH2PO4),pH=7.5平衡1mL CaptoTM MMCImpRes层析柱20mL;过滤好的样品以0.5mL/min流速上样,上样完成后,用平衡液5mMphosphate buffer(Na2HPO4/KH2PO4)、pH=7.5洗至基线走平;5mM phosphate buffer(Na2HPO4/KH2PO4)、1M NaCl、pH=7.5洗脱。
4、将洗脱样品透析至20mM phosphate buffer(Na2HPO4/NaH2PO4)、0.15MNaCl、pH=7.4缓冲液中;透析后的样品用BCA Protein Quantification Kit测定蛋白浓度为1.1mg/mL共13.5mg,加入1% NaN3置于-20℃保存。
实验例2:NAG鼠单克隆抗体的制备
1、动物免疫
选取5只6-8周龄的雌性Balb/c小鼠进行免疫,抗原是提纯后的NAG蛋白与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、PBS混合,完全乳化后,200μL每只每次,采取背部多点,腹沟及腋下免疫。免疫步骤:初次免疫,抗原50μg/只,加弗氏完全佐剂进行皮下、背部多点注射;间隔两周后进行第二次免疫,剂量途径同第一次,加弗氏不完全佐剂;再15天后进行第三次免疫,剂量同上,加弗氏不完全佐剂,腹腔注射;最后一次免疫与上一次免疫时间间隔一月,NAG抗原50μg/只进行肌肉强化免疫(不含佐剂),3天后采取尾血,ELISA检测血清抗体效价。
2、B细胞的构建
(1)骨髓瘤细胞株的培养及制备
本发明采用的是SP/20骨髓瘤细胞株,该细胞株生长及融合效率均佳,倍增时间为10-12小时。融合时选择对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞。骨髓瘤细胞在融合前应做适应性培养,使细胞生长到最佳状态(即对数生长期)。
融合当天,用弯头滴管将骨髓瘤细胞从瓶壁轻轻吹下,收集于50mL离心管或融合管内,用离心机进行1000r/min离心5-10min,弃去上清液,沉淀加入30mL培养基,离心洗涤一次,离心5-10min,弃上清,沉淀用20mL培养基混匀备用。
(2)脾细胞的准备
取已经完成动物免疫的BALB/c小鼠,摘除眼球采血,并用离心机进行分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。
通过颈脱位的方法致死小鼠,将小鼠浸泡于75%酒精中5min,在超净台中用无菌取脾,取出脾脏置于已盛有10mL培养基的平皿中,轻轻洗涤,并剥去周围结缔组织,用无菌注射器带液刺穿脾脏至脾脏发白,收集平皿里的脾细胞于50mL离心管中,1000r/min离心10min,弃上清,加10mL培养基,吸取少量10稀释计数。
(3)细胞融合
融合前3天将阳性小鼠强化免疫,小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0按10:1混合,PEG融合,后置于HAT选择培养基中培养。10天后,ELISA法筛选杂交瘤细胞上清,筛选出的阳性杂交瘤细胞用有限稀释法进行克隆,经过5次筛选,最终确定6株细胞为阳性细胞。
(4)杂交瘤细胞的筛选
ELISA法:NAG抗原以10μg/mL,50μL/孔包被至96孔板,37度吸附1h,弃去孔内的液体,同时用洗涤液洗涤3次,拍干,每孔加100μL封闭液37℃封闭1h,洗涤2次,拍干。每孔加100μL待检6株杂交瘤细胞培养上清液,同时设立阳性、阴性对照和空白对照标准,37℃孵育0.5h,洗涤4次,拍干。取辣根酶标记的羊抗鼠IgG 1:10000,100μL每孔加入酶标板,37℃孵育30min,洗涤4次,拍干。
最后加入TMB底物显色液100μL/孔,显色15min后用2mol/L稀盐酸50μL/孔终止反应。如图1所示,以450nm、630nm双波长测定各孔OD值,空白孔值0.02以下,阴性孔值0.1以下,阴阳区分明显,可以判低出抗NAG的杂交瘤细胞分泌出能特异性识别NAG蛋白的抗体。用同样的方法测小鼠眼球血效价,达1:100000,可用于细胞融合。
3、编码鼠单克隆抗体基因的克隆
培养后的杂交瘤细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后提取RNA,利用总RNA提取试剂盒反转录成cDNA(65℃反转录5min)。采用PCR方法,将天然配对的兔单克隆抗体轻重链可变区基因(VH和VL)从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来,并经测序确定序列:
单克隆抗体A的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.1-3所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-5所示,轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列为YAS;
单克隆抗体A的重链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ IDNO.11-14所示,轻链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.15-18所示;
单克隆抗体B的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.6-8所示,轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9-10所示,轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列为WAS。
单克隆抗体B的重链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ IDNO.19-22所示,轻链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.23-26所示。
单克隆抗体A的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示,轻链的氨基酸序列如SEQID NO.28所示;单克隆抗体B的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示,轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示。
4、单克隆抗体的生产和纯化
将步骤3鼠单克隆抗体重链、轻链基因分别装载在pCDN3.4表达载体上,将质粒转染293F细胞;转染72-96h获得培养上清中含有重组的识别人proAMH蛋白的兔单克隆抗体。使用protein A亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出多株重组的识别人proAMH蛋白的兔单克隆抗体,依次命名为单克隆抗体A和单克隆抗体B,抗体鉴定后分装,于-20℃低温保存备用。
5、单克隆抗体特性鉴定
抗体浓度的测定:用紫外分光光度法测定单克隆抗体在280nm和260nm的吸光度值A280和A260。结果蛋白质含量为抗体A(10mg/mL)和抗体B(8mg/mL)。蛋白质含量按照下列公式计算:
蛋白质含量(mg/mL)=(A280×稀释倍数)/1.35。
抗体分子质量鉴定:采用SDS-PAGE进行测定单克隆抗体,如图2所示,显示单克隆抗体的重链为约46KD,轻链约为25KD。
ELISA效价的测定:采用间接ELISA测定纯化后的腹水单克隆抗体,如图3所示,结果显示纯化后的效价都为1:100000。
实验例3:利用单克隆抗体A和B制备胶体金快速检测试纸条检测NAG蛋白
1、制备胶体金快速检测试纸条,并定性检测尿液中的NAG蛋白
胶体金快速检测试纸条的结构为:(1)胶体金垫,含有胶体金标记的NAG单克隆抗体A;(2)硝酸纤维素膜,T线固定有NAG单克隆抗体B,C线固定有羊抗鼠IgG多克隆抗体;(3)其他试纸条支持物。
将尿液样本垂直滴加至试纸条上样垫上,在层析作用下,样本中的N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶率先与胶体金垫上胶体金标记的NAG单克隆抗体A结合形成反应复合物,反应复合物沿着硝酸纤维素膜前移,被硝酸纤维素膜检测线T上固定的NAG单克隆抗体B捕获并呈现色带,样本中的N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶越多,检测线(T)上复合物积聚越多,色带颜色越深。
如果样本中N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶为阴性则不发生结合,即不显色。无论样本中有无N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶,质控线(C)都应显示呈现色带,如无则检测无效。
2、检测结果解释(如图4所示)
阳性:检测线(T)和质控线(C)位置均出现清晰的色带,表示样本中N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶活性偏高,提示患者有肾小管损伤或糖尿病早期的肾损伤。
阴性:仅质控线(C)位置出现清晰的色带,表示样本中N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶活性正常。
无效:质控线(C)位置无色带,不论检测线(T)位置是否出现色带,试验均无效。
实验例4:利用单克隆抗体A和B制备胶体金快速检测试纸条检测NAG蛋白的特异性、灵敏性、稳定性和抗干扰能力评价
采用与实验例3的方法制备胶体金快速检测试纸条,针对NAG蛋白检测分别进行特异性、灵敏性、稳定性和抗干扰能力。
1、特异性和抗干扰能力评价
将天然尿纤维连接蛋白和溶菌酶作分别按100倍、1000倍、10000倍和10000倍稀释后作为特异性评价样本、选用50例健康人尿液样本作为抗干扰能力评价样本,用实验例3的方法制备胶体金快速检测试纸条测试,评价结果如图5所示。
2、灵敏性评价
将天然N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(1.1mg/mL)(按实验例1方法制备)稀释1000倍、10000倍、100000倍、200000倍作为灵敏性评价样本,用实验例3的方法制备胶体金快速检测试纸条测试,评价结果如图6所示。
3、稳定性评价
将按实验例3的方法制备的胶体金快速检测试纸条置于55℃加速破坏7天后,对按照上述灵敏性评价方法对其灵敏性进行评价,评价结果如图7所示。
综上,采用本申请的单克隆抗体A和B制备胶体金快速检测试纸条,能够很好的识别天然的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG),可以应用于N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)检测试剂盒的开发。
以上具体实施方式详细描述了本发明的实施,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种识别NAG的单克隆抗体,其特征在于,为单克隆抗体A或单克隆抗体B;所述单克隆抗体A的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示,轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-5所示,轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列为YAS;
所述单克隆抗体B的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6-8所示,轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.9-10所示,轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列为WAS。
2.根据权利要求1所述的识别NAG的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体A的重链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.11-14所示,轻链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.15-18所示;
所述单克隆抗体B的重链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQID NO.19-22所示,轻链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.23-26所示。
3.根据权利要求2所述的识别NAG的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体A和单克隆抗体B的轻链恒定区均为κ链,重链恒定区均为IgG2a型。
4.根据权利要求3所述的识别NAG的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体A的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示,轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示;
所述单克隆抗体B的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示,轻链的氨基酸序列如SEQID NO.30所示。
5.根据权利要求1所述的识别NAG的单克隆抗体,其特征在于,还包括共价或非共价连接的偶联物。
6.根据权利要求5所述的识别NAG的单克隆抗体,其特征在于,所述偶联物包括酶、荧光蛋白、荧光团、生物素或链霉亲和素。
7.一种权利要求1-6任一项所述的识别NAG的单克隆抗体在制备用于检测NAG的产品中的应用。
8.一种NAG的检测产品,其特征在于,包括权利要求1-6任一项所述的识别NAG的单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的NAG的检测产品,其特征在于,所述产品为检测试纸条或检测试剂盒。
10.根据权利要求9所述的NAG的检测产品,其特征在于,所述检测试纸条为胶体金试纸条或ELISA试纸条;所述检测试剂盒为胶体金检测试剂盒、ELISA检测试剂盒、免疫层析试剂盒、免疫比浊检测试剂盒、磁颗粒检测试剂盒、化学发光检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒或放射免疫检测试剂盒。
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