CN118027191A - 结合人染色体重塑分子的单克隆抗体及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及人染色体重塑分子技术领域，具体涉及结合人染色体重塑分子的单克隆抗体及应用。通过单个B细胞筛选和培养技术成功开发了高亲和力的抗人染色体重塑分子的兔单克隆抗体，具有与人染色体重塑分子的高亲和力和特异性，可用所述单克隆抗体应用于制备检测人染色体重塑分子的免疫印迹试剂盒和免疫组化试剂盒。该单克隆抗体还对于人染色体重塑分子以及相关疾病的诊断与治疗都具有重要临床价值。
Description
技术领域
本申请涉及人染色体重塑分子技术领域，具体涉及结合人染色体重塑分子的单克隆抗体及应用。
背景技术
酵母交配型转换/蔗糖不发酵(yeast switch in mating type/sucrose nonfermentation,SWI/SNF)复合物是一类在进化过程中高度保守，ATP依赖型的，包含多亚基的染色质结构调节复合物。SWI/SNF复合物的主要生物学功能是通过利用其ATPase亚基(BRM和BRG1)水解ATP获得的能量改变并重塑核小体的组蛋白和DNA之间相互作用，进而影响基因组特定区域的染色质开放程度，从而调节基因表达。
染色体重塑分子(SMARCB1)是SWI/SNF复合物的核心亚基之一，是BRG1在体外进行有效的核小体重构所必需。SMARCB1基因的缺失、突变或表观遗传修饰导致功能丧失，失去组蛋白甲基转移酶(enhancer ofzeste homolog 2,EZH2)抑制作用导致细胞增殖、肿瘤发生，EZH2是组蛋白赖氨酸甲基转移酶抑制复合体PRC2(多梳蛋白阻遏复合体)催化亚基。
针对人染色体重塑分子(SMARCB1)在恶性横纹肌样瘤(malignantrhabdoidtumours,MRT)中容易发生突变或缺失。MRT较髓母细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤的总体生存期要低很多，因此，区分MRT与髓母细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤是很有必要的。SMARCB1通常在MRT中缺失表达，而绝大多数髓母细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤都有表达。软组织中的上皮样肉瘤在组织学上经常显示横纹肌样特征，而且都不表达SMARCB1，有时很难将两者区分，然而上皮样肉瘤CD34和β-catenin阳性，MRT两者均阴性。因此，开发一种高灵敏度的人染色体重塑分子(SMARCB1)检测方法学，具有非常重要的意义。
发明内容
本申请实施例提供了一类高亲和性的人染色体重塑分子的兔单克隆抗体，以在一定程度上解决上述技术问题之一。实施例通过单个B细胞筛选和培养技术成功开发了高亲和力的抗人染色体重塑分子的兔单克隆抗体，具有与人染色体重塑分子的高亲和力和特异性，因此，可用所述单克隆抗体应用于制备检测人染色体重塑分子水平的试剂盒。本申请提供的单克隆抗体对于人染色体重塑分子以及相关疾病的诊断与治疗都具有重要临床价值。
为此，本申请至少公开了如下技术方案：
第一方面，实施例公开了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合人染色体重塑分子，所述单克隆抗体包含：
三个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：如SEQ IDNO:5所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:6所示的VL CDR2，以及如SEQ ID NO:7所示的VL CDR3；
和/或
三个根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：如SEQ IDNO:8所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:9所示的VH CDR2，以及如SEQ ID NO:10所示的VH CDR3。
第二方面，实施例公开了一种单克隆抗体，特异性结合人染色体重塑分子，所述单克隆抗体包含如SEQ ID NO:1所示的轻链及如SEQ ID NO:2所示的重链。
第三方面，本申请实施例公开了一种单克隆抗体，特异性结合人染色体重塑分子。所述单克隆抗体包含如SEQ ID NO:3所示的轻链可变区(VL)及如SEQ ID NO:4所示的重链可变区(VH)。
第四方面，本申请实施例公开了一种免疫印迹检测试剂盒，用于检测人染色体重塑分子。所述试剂盒包括第一至三方面任一所述的单克隆抗体。
第五方面，本申请实施例公开了一种免疫组化检测试剂盒，用于检测人染色体重塑分子。所述试剂盒包括第一至三方面任一所述的单克隆抗体。
第六方面，本申请实施例公开了第一至三方面任一所述的单克隆抗体在制备检测人染色体重塑分子试剂或试剂盒中的应用。
附图说明
图1为实施例采用免疫印迹方法检测兔单克隆抗体针对细胞样本中SMARCB1的识别特异性。
图2为实施例采用免疫沉淀方法检测兔单克隆抗体针对细胞样本293F中SMARCB1的识别特异性。
图3为实施例采用免疫组化检测人结肠癌组织样本中SMARCB1的染色定位图。
图4为实施例采用免疫组化检测人未分化结食管癌组织样本中SMARCB1的染色定位图。
图5为实施例采用免疫组化检测人上皮样肉瘤组织(INI-1缺失)样本中SMARCB1的染色定位图。
图6为实施例采用免疫组化检测小鼠心脏组织样本中SMARCB1的染色定位图。
图7为实施例采用免疫组化检测大鼠肺组织样本中SMARCB1的染色定位图。
图8为实施例构建的含兔单克隆抗体重链恒定区的表达载体结构示意图，图中，pBR322 origin和f1origin是在大肠杆菌(E.Coli)中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearlypromotor为在真核生物中的启动子，SV40 PAterminator是加尾信号，Heavy chain constant为兔单克隆抗体重链恒定区的核苷酸序列。
图9为本申请实施例构建的含兔单克隆抗体轻链恒定区的表达载体结构示意图，图中，pBR322 origin和f1 origin是在大肠杆菌(E.Coli)中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearlypromotor为在真核生物中的启动子，SV40 PAterminator是加尾信号，Light chain constant为兔单克隆抗体轻链恒定区的核苷酸序列。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
术语解释
在本申请中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释，具有各种抗体结构，包括但不限于Y型抗体、所谓的全长抗体、Y型抗体的抗原结合部分，以及它们的遗传学或化学修饰。其中，“抗原结合部分”是指Y型抗体的一个或多个部分或片段，可以保留该抗体与人染色体重塑分子特异性结合的能力。
在本申请中，术语“单克隆抗体”(mAb)包括具有基本相同的抗原决定簇的高度同质的抗体群。即在该抗体群中，单个抗体基本上是相同的，除了可能自然发生的少量突变。单克隆抗体可以对抗原上的特定表位显示出单一的结合特异性和亲和力。与通常包含针对不同表位的多克隆抗体相比，每个单克隆抗体可以针对抗原上相同或基本相同的表位。修饰词“单克隆”表示抗体的特性是从一个基本同质的抗体群体中获得的，并且不能被解释为需要通过任何特定的方法制得的抗体。该抗体可以通过多种方法制备，包括但仅限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体抗体库、B细胞筛选和培养以及类似的方法制得。
在本申请中，术语“兔抗体”、“抗人染色体重塑分子兔单克隆抗体”、“人染色体重塑分子的兔单克隆抗体”或者类似术语中的修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。在一个实施例中，人染色体重塑分子的兔单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR和骨架区(FR)。在一个实施例中，抗人染色体重塑分子的兔抗体或兔单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR。在一个实施例中，抗人染色体重塑分子的兔单克隆抗体可以为CDR区来源于兔源免疫球蛋白序列、而FR来自其他哺乳动物的种系免疫球蛋白序列(如小鼠或人类)的一种抗体。术语“抗人染色体重塑分子的兔单克隆抗体”也可能包含具有非兔源免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基的抗体，例如，由体外随机突变或点特异性突变引入的、或体内体细胞突变引入的突变。
在本申请中，术语“抗体”是指，由四条多肽链组成的免疫球蛋白分子，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain，H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Lightchain，L)。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，分别占重链和轻链的1/4和1/2；将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)，分别占重链和轻链的3/4和1/2。
重链的V区和轻链的V区分别称为VL和VH。VL和VH中各含有三个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为高变区(hypervariable region，HVR)或互补决定区(complementarity determining region，CDR)，包括HVRl(CDRl)、HVR2(CDR2)和HVR3(CDR3)，其中，HVR3(CDR3)变化程度更高。一般地，VH包括三个互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，VL包括三个互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。VL和VH的三个互补决定区单独或共同组成抗体的抗原结合部位(antigen-binding site)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。在V区中，CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守，称为骨架区(framework region，FR)。VH或VL各有四个骨架区，分别用FR1、FR2、FR3和FR4表示。通过骨架区的替换或改变，在保证抗体识别及结合抗原的部位不变的情况下，可以具有相同特异性的多个抗体。
重链和轻链的C区分别称为CH和CL。不同型(κ或λ)Ig的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CHl、CH2、CH3和CH4。
在本申请中，术语“构架区”或“骨架区”的残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
在本申请中，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本申请中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。
抗体
本申请实施例公开了一种抗体，所述抗体特异性结合人染色体重塑分子。
在一些实施例中，所述抗体包含根据三个Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。VLCDR1如SEQ ID NO:5所示，VL CDR2如SEQ ID NO:6所示，VL CDR3如SEQ ID NO:7所示。
在一些实施例中，所述抗体包含根据三个Kabat编号系统定义的重链可变区(HL)的互补决定区(CDRs)：VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。VL CDR1如SEQ ID NO:8所示，VL CDR2如SEQ ID NO:9所示，VL CDR3如SEQ ID NO:10所示。
在一些实施例中，所述抗体包含根据三个Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及三个Kabat编号系统定义的重链可变区(HL)的互补决定区(CDRs)：VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。VL CDR1如SEQ ID NO:5所示，VL CDR2如SEQ ID NO:6所示，VL CDR3如SEQ ID NO:7所示。VL CDR1如SEQ ID NO:8所示，VLCDR2如SEQ ID NO:9所示，VL CDR3如SEQ ID NO:10所示。
在某些实施方式中，该抗人染色体重塑分子的抗体可以具有Y型分子结构。在一个实施例中，抗人染色体重塑分子的抗体可以包括一对重链和一对轻链。重链可以包括一个重链可变区和一个或多个重链恒定区。哺乳动物的抗体一般包括五种类型的重链：γ、δ、α、μ和ε，相对应组成的抗体就称为IgG，IgD，IgA，IgM和IgE五种抗体。轻链可以是一个相对于重链更小的一个多肽亚基。轻链可以包括一个轻链可变区和一个轻链恒定区。VL通常是轻链的N端部分，在氨基酸序列上表现出更高的变异性。不同抗体之间的VL具有特异的氨基酸序列。在一个实施例中，重链可变区VH和轻链可变区VL可均用于识别和结合人染色体重塑分子。
在一些实施例中，位于VL和VH区域中的CDR，相互之间可被FR分隔开。FR是序列结构中的保守区域。FR通常可以作为一个支架，以使得CDR形成能够特异性地结合抗原(例如人染色体重塑分子)的三维结构。FR的三维结构可以在不同的抗体中呈现保守性。
在一些实施例中，所述兔单克隆抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一些实施例中，所述兔单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
抗体制备
本申请实施例提供的单克隆抗体可以通过多种方法制备，包括但仅限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体抗体库、单个B细胞筛选和培养以及类似的方法制得。
在一些实施方式中，该单克隆抗体的制备过程包括：通过重组表达的人染色体重塑分子作为免疫原，免疫新西兰大白兔；从大白兔的脾脏细胞中分选得到抗原特异性B淋巴细胞；经抗体功能验证后筛选出能分泌特异性抗体的阳性B淋巴细胞；通过扩增以获得阳性B淋巴细胞的抗体重链及轻链基因，然后进行重组表达，以获得抗人SMARCB1的兔单克隆抗体。
在一些实施例中，由生工公司合成的人SMARCB1蛋白第110位至第135位氨基酸片段(SMARCB1多肽)序列如下：VSISTEPPTYLREQKAKRNSQWVPTL(SEQ ID NO:11)。
在一些实施例中，还提供了巯基偶联的SMARCB1多肽。其偶联的过程包括：
用PBS准确分别配制3mg/mL的KLH(购自默克公司)溶液和5mg/mL的SMCC(含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂，Thermo公司)溶液；
取180μL的SMCC溶液加入已溶解的2mL的KLH溶液中，在室温条件下，置于旋转培养器上混合摇匀激活1h，可见出现白色絮状物；
用pH 7.4的1×PBS，体积比为V(PBS)：V(KLH)＝15：1透析1h，除去游离的SMCC；
用PBS准确配制10mg/mL的SMARCB1多肽溶液，分多次缓慢向溶液中加入激活的KLH(透析完成的)中，放入小型旋转培养器中，最低转速，4℃过夜。
在一些实施例中，人染色体重塑分子的单克隆抗体的制备方法包括：
(1)动物免疫
以上述实施例制得的KLH偶联的SMARCB1多肽为免疫原，每只新西兰大白兔免疫700μg免疫原进行免疫。首次免疫前，将免疫原与等量的完全弗氏佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后，每间隔3周取350μg免疫原与等量的不完全弗氏佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫四次。五次免疫后，采集兔血清样本，用ELISA方法测定其针对人SMARCB1蛋白的滴度，取血清按1:243000稀释后用ELISA测滴度，取OD450nm超过0.2的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，3天后取脾脏。
(2)分离脾细胞
于无菌环境下，将上述得到的兔脾脏用基础培养基清洗，剪除多余的结缔组织、脂肪剪除，与细胞筛网中研磨。收集研磨液(即为膜内细胞)，室温以400g离心5min，去上清，留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自BioGems公司)，吹散1min，进行红细胞裂解，加入基础培养基37mL，混匀，终止红细胞裂解。室温以400g离心5min，去上清，加入40mL常温基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬。再次室温以400g离心5min，去上清，留细胞，加入20mL常温基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。
(3)B淋巴细胞分选和培养
B淋巴细胞筛选方法参见CN110016462B说明书中第0030～0044段的方法。
(4)编码兔单克隆抗体基因的克隆
培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后用Quick-RNATM MicroPrep试剂盒(购自ZYMO公司)提取RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，挑选若干个克隆进行测序。
其中，PCR反应体系如下：4μL cDNA，1μL、10mM正向引物，1μL、10mM反向引物，12.5μL2×Gloria HiFi(武汉爱博泰克生物科技有限公司提供)，6.5μLN.F H2O。PCR扩增程序：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存
其中，轻链可变区引物对为：VL-F：SEQ ID NO:12；VL-R：SEQ ID NO:13。
重链可变区引物对为：VH-F：SEQ ID NO:14；VH-R：SEQ ID NO:15。
(5)重链和轻链表达载体的构建
将上述步骤中挑选出的若干个兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，所使用的哺乳动物表达载体pBR322见图8和图9。其中，挑选的轻链的编码基因如SEQ ID NO.16所示，挑选的轻链可变区的编码基因如SEQ ID NO.17所示。挑选的重链的编码基因如SEQ ID NO.18所示，挑选的重链可变区的编码基因如SEQ ID NO.19所示。
(6)单克隆抗体制备和纯化
将含兔单克隆抗体重链恒定区(图8)和轻链恒定区(图9)的哺乳动物细胞(如CHO)表达载体分别用NheI和XbaI限制性内切酶常规线性化处理。
将上述步骤中扩增后的PCR产物进行纯化后，采取同源重组的方式，分别将重链可变区基因和轻链可变区基因构建到相应的哺乳动物表达载体中；经测序验证之后，将含有相应兔单克隆抗体轻链基因和重链基因的表达载体一起转染至293F细胞中，转染72～96小时，所得转化子继续培养，收集培养液，使用proteinA亲和凝胶树脂离心，从离心的上清液中纯化收获识别人SMARCB1的兔单克隆抗体，使用12％SDS-PAGE凝胶电泳验证抗体纯度，对纯化的人SMARCB1蛋白的兔单克隆抗体进行氨基酸测序，于-20℃低温保存备用。
结果可知，所得兔单克隆抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，轻链互补决定区VL CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链互补决定区VL CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，重链互补决定区VL CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其重链互补决定区VH CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，重链互补决定区VH CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，重链互补决定区VH CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
在一些检测例中，采用高表达SMARCB1的293F(中科院上海细胞库)、K562(中科院上海细胞库)、HeLa(中科院上海细胞库)，不表达SMARCB1的细胞样本HeLa-SMARCB1-C3(纯合子)(ABclonal，RM02409)，高表达SMARCB1的NIH/3T3(中科院上海细胞库)、Neuro2a(中科院上海细胞库)、rattestis(武汉赛美因生物科技有限公司)对上述实施例制得的人SMARCB1蛋白的兔单克隆抗体的特异性进行了检测。
该检测过程包括：
取高表达SMARCB1的细胞，用免疫印迹的方法检测单克隆抗体的识别特异性，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上。将膜置于含3％脱脂奶粉的TBST封闭液中室温孵育1h，加入实施例提供的SMARCB1兔单克隆抗体(1:12000稀释)，4℃孵育过夜。用TBST洗膜后，加入1:10000稀释的羊抗兔二抗(JacksonImmunoResearch)，室温孵育1h。再次TBST洗膜，加入ECL显色液，显影，曝光时长90s。结果见图1，仅不表达SMARCB1的细胞样本HeLa-SMARCB1-C3未见条带，而其他泳道均能检测到特异性目的条带。由此说明，实施例提供的兔单克隆抗体对人SMARCB1具有高度的结合特异性。
在一些检测例中，用实施例提供的单克隆抗体检测高表达SMARCB1的细胞样本293F(中科院上海细胞库)，用免疫沉淀的方法检测单克隆抗体的识别特异性。
该检测过程包括：
收集293F细胞，离心，弃上清，收集沉淀，PBS清洗一次，加入IP实验专用细胞裂解液，充分裂解后应无明显沉淀，离心取上清备用；取30μL rProteinA/G Plus MaqPolyBeads(碧云天生物)清洗去除磁珠保护液，加入1mL Cell lysis buffer for IP(withoutinhibitors)(碧云天生物)，混匀，放置在磁分离器上，收集磁珠，用移液器吸弃洗杂液，重复2次，加入1mL的3％BSA，置于翻转混合仪4℃封闭1h备用。在293F细胞裂解液中加入3μgSMARCB1兔单克隆抗体(试验例2制备)，置于翻转混合仪4℃过夜，将上述完成抗体-抗原结合的复合物与备用的磁珠(碧云天生物)进行混合，置于4℃下反应2h，将上述磁珠-抗体-抗原复合物放在磁分离器上进行分离，收集上清液，进行后续WB检测；此实验时使用同型Rabbit IgG作为空白对照。WB实验有三组样本，Input组：即未经IP的细胞裂解物，判断目标蛋白位置和富集相对程度；Isotype组：使用Isotye Control IP的产物，作为蛋白与IgG结合的背景信号；IP组：IP实验组，结果见图2。由图2可知，实施例提供的兔单克隆抗体可以从293F样本中特异性的富集出SMARCB1蛋白。
在一些检测例中，将制得人SMARCB1蛋白的兔单克隆抗体作为一抗，采用免疫组化染色方法定性检测人结肠癌组织(Human colon carcinoma)、人未分化食管癌组织(Humanundifferentiated carcinoma of esophagus)、人上皮样肉瘤组织(INI-1缺失)(Humanepithelioid sarcoma(INI-1deletion))、小鼠心脏组织(mouse heart)和大鼠肺组织(ratlung)中SMARCB1。
该检测过程包括：
(1)芯片选择：
免疫组化芯片，货号TMA000-42，百奥斯公司。
人结肠癌组织样本、人未分化食管癌组织样本、人上皮样肉瘤组织(INI-1缺失)样本，这些样本来源武汉赛维尔生物科技有限公司。
小鼠心脏组织和大鼠肺组织样本，来自于武汉赛美因生物科技有限公司。
(2)IHC染色及分析
烤片：制作这些组织样本的石蜡切片于56℃的恒温箱中烤片30min。
脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中，再一起从恒温箱中取出置于常温，5min后，将切片取出浸入常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，脱蜡液试剂缸每缸5min，无水乙醇试剂缸每缸3min；用流水清洗切片3min。
抗原修复：0.01M柠檬酸钠修复液(pH 6.0)高压热修复。
内源性过氧化物酶灭活：用PBS缓冲液浸洗3次，每次1min，去除切片上的缓冲液；将切片完全浸入3％过氧化氢溶液中，室温，孵育10min。
封闭：用PBS缓冲液浸洗3次，每次3min，去除切片上的缓冲液；用免疫组化水笔圈定玻片上待检测组织区域，在圈定区域内滴加封闭液-PBS封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于常温孵育30min，从滴加封闭液开始计时。
一抗孵育：去除封闭液，在组织切片上滴加用PBS缓冲液稀释(抗体稀释比为1:1000)的一抗，水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育60min；去除抗体工作液，PBS缓冲液快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次。
二抗孵育：在组织切片上滴加即用型二抗工作液(Dako REAL EnVisionDetection System,Peroxidase/DAB,Rabbit/Mouse,HRP；Dako)后水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育25min；去除切片上的试剂，缓冲液PBS快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次
显色：在组织切片上滴加显色液工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，得到合适的染色强度后；将切片浸入大量蒸馏水中即可终止显色；终止显色后，将切片入流水中清洗10min；
复染：将稍沥干的切片浸入Mayer’s苏木素中复染切片1min，复染完成后，用流水清洗3min；
返蓝：将稍沥干的切片浸入碳酸锂饱和水溶液中蓝化3s，用流水清洗3min；
脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，浸泡期间需上下提拉数次，计时10s后，取出；置于恒温鼓风干燥箱中高温(54～58℃)下完全干燥；
封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片，加胶量需适量，加封盖玻片后需完全覆盖组织，且不能有胶溢出切片扫描。
需要说明的是，免疫组化染色结果分为:阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。
图3～5显示在人结肠癌、人未分化食管癌和人上皮样肉瘤(INI-1缺失)中的染色表现。由此说明，实施例提供的抗人SMARCB1兔单克隆抗体染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净。结合免疫印迹和免疫沉淀的结果，说明抗人SMARCB1兔单克隆抗体特异的识别人SMARCB1蛋白，无非特异性染色，有效避免假阳性结果。
图6～7显示兔单克隆抗体在小鼠心脏、大鼠肺组织样本的染色表现。由此说明，实施例提供的SMARCB1兔单克隆抗体染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净。结合免疫印迹和免疫沉淀的结果，说明SMARCB1兔单克隆抗体特异的识别大鼠、小鼠的SMARCB1蛋白，无非特异性染色，有效避免假阳性结果。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合人染色体重塑分子，所述单克隆抗体包含：
三个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：如SEQ ID NO:5所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:6所示的VL CDR2，以及如SEQ ID NO:7所示的VL CDR3；
和/或
三个根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：如SEQ ID NO:8所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:9所示的VH CDR2，以及如SEQ ID NO:10所示的VH CDR3。
2.根据权利要求2所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含三个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：所述轻链可变区具有：如SEQ ID NO:5所示的VLCDR1，如SEQ ID NO:6所示的VL CDR2，以及如SEQ ID NO:7所示的VL CDR3。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含三个根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：如SEQ ID NO:8所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:9所示的VH CDR2，以及如SEQ ID NO:10所示的VH CDR3。
4.一种单克隆抗体，特异性结合人染色体重塑分子，所述单克隆抗体包含：
如SEQ ID NO:1所示的轻链；及
如SEQ ID NO:2所示的重链。
5.一种单克隆抗体，特异性结合人染色体重塑分子，所述单克隆抗体包含：
如SEQ ID NO:3所示的轻链可变区(VL)；及
如SEQ ID NO:4所示的重链可变区(VH)。
6.一种核酸分子，其携带有编码权利要求1～5任一所述的单克隆抗体的基因。
7.一种宿主细胞，其携带有如权利要求6所述的核酸分子，并能够进行自主表达如权利要求1～5任一所述的单克隆抗体。
8.一种试剂盒，用于检测人染色体重塑分子，所述试剂盒包括：如权利要求1～5任一所述的单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，所述试剂盒选自免疫组织化学试剂盒、免疫印迹试剂盒、免疫沉淀试剂盒。
10.如权利要求1～5任一所述的单克隆抗体在制备检测人染色体重塑分子试剂或试剂盒中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410188264.8A CN118027191A (zh) | 2024-02-20 | 2024-02-20 | 结合人染色体重塑分子的单克隆抗体及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410188264.8A CN118027191A (zh) | 2024-02-20 | 2024-02-20 | 结合人染色体重塑分子的单克隆抗体及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118027191A true CN118027191A (zh) | 2024-05-14 |
Family
ID=90992828
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410188264.8A Pending CN118027191A (zh) | 2024-02-20 | 2024-02-20 | 结合人染色体重塑分子的单克隆抗体及应用 |
Country Status (1)
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| CN (1) | CN118027191A (zh) |
-
2024
- 2024-02-20 CN CN202410188264.8A patent/CN118027191A/zh active Pending
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