CN117487007B

CN117487007B - 结合人MutS同源蛋白2的单克隆抗体及应用

Info

Publication number: CN117487007B
Application number: CN202311258333.XA
Authority: CN
Inventors: 程扬; 吴海; 冷颖奇; 黄长青; 胡文娟; 徐思丹
Original assignee: Wuhan Abclonal Inc
Current assignee: Wuhan Abclonal Inc
Priority date: 2023-09-26
Filing date: 2023-09-26
Publication date: 2024-05-10
Anticipated expiration: 2043-09-26
Also published as: CN117487007A

Abstract

本申请涉及人MutS同源蛋白2的技术领域，具体涉及结合人MutS同源蛋白2的单克隆抗体及应用。通过单个B细胞筛选和培养技术成功开发了高亲和力的抗人MutS同源蛋白2的兔单克隆抗体，具有与人MutS同源蛋白2的高亲和力和特异性，可用所述单克隆抗体应用于制备检测人MutS同源蛋白2的免疫印迹试剂盒和免疫组合试剂盒。该单克隆抗体还对于人MutS同源蛋白2以及相关疾病的诊断与治疗都具有重要临床价值。

Description

结合人MutS同源蛋白2的单克隆抗体及应用

技术领域

本申请涉及人MutS同源蛋白2技术领域，具体涉及结合人MutS同源蛋白2的单克隆抗体及应用。

背景技术

人MutS同源蛋白2(Human MutS homologue 2,hMSH2)是DNA错配修复蛋白家族的一个重要成员，通常定位于细胞核并与MSH3或MSH6形成异源二聚体，参与修复DNA合成中的碱基错配。hMSH2异位表达多见于各种肿瘤细胞，且可以被EBV病毒感染、H₂O₂刺激所诱导，异位表达的hMSH2可作为γδT细胞受体(γδT cell receptor,TCRγδ)的配体分子，被TCRγδ和NK细胞受体成员2D(Natural killer group 2member D,NKG2D)双重识别，介导γδT细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。在DNA错配修复中，hMSH2蛋白质首先与hMSH6形成一种称为hMutSα二聚体复合物，并结合到DNA碱基错配区，然后与hMLH1和hPSM2基因形成的二聚体hMutLα结合，其中异源二聚体hMutSα起到识别带有缺口的新生DNA链的作用。hMutLα与hMutSα结合到DNA错配区后，即可激活与MutH蛋白有关的GATC核酸内切酶，这种酶可切出未修饰的甲基化GATC序列。错配修复蛋白MSH2蛋白在脑、肺脏、结肠、心脏、肌肉、脾脏、胃和前列腺等大部分脏器组织中的表达水平随着年龄的增长而逐渐下降，说明其与细胞衰老有着密切关联。因此，开发一种高特异度高灵敏度的MSH2抗体，对于检测MSH2蛋白的表达水平具有非常重要的意义。

发明内容

本申请提供一类高特异性的人MutS同源蛋白2兔单克隆抗体，以在一定程度上解决上述技术问题之一。本申请通过单个B细胞筛选和培养技术成功开发了高亲和力的抗人MutS同源蛋白2的兔单克隆抗体，具有与人MutS同源蛋白2的高亲和力和特异性，因此，可用所述单克隆抗体应用于制备检测人MutS同源蛋白2水平的试剂盒。本申请提供的单克隆抗体对于人MutS同源蛋白2以及相关疾病的诊断与治疗都具有重要临床价值。

为此，本申请至少公开了如下技术方案：

第一方面，实施例公开了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合人MutS同源蛋白2，所述单克隆抗体包含：

3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)，所述轻链可变区具有：如SEQ ID NO:3所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:4所示的VL CDR2，以及如SEQ IDNO:5所示的VL CDR3；

和/或

3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:8所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:9所示的VH CDR2，以及如SEQ IDNO:10所示的VH CDR3。

第二方面，实施例公开了一种单克隆抗体，特异性结合人MutS同源蛋白2，所述单克隆抗体包含：

轻链可变区(VL)；所述轻链可变区由SEQ ID NO:2所示序列组成；及

重链可变区(VH)；所述重链可变区由SEQ ID NO:7所示序列组成。

第三方面，实施例公开了一种单克隆抗体，特异性结合人MutS同源蛋白2，所述单克隆抗体包含：

轻链，所述轻链由SEQ ID NO:1所示序列组成；及

重链，所述重链由SEQ ID NO:6所示序列组成。

第四方面，实施例公开了一种免疫印迹检测试剂盒，用于检测人MutS同源蛋白2，所述试剂盒包括：第一至三方面任一所述的单克隆抗体。

第五方面，实施例公开了一种免疫组化检测试剂盒，用于检测人MutS同源蛋白2，所述试剂盒包括：第一至三方面任一所述的单克隆抗体。

第六方面，实施例公开了第一至三方面任一所述的单克隆抗体在制备检测人MutS同源蛋白2试剂或试剂盒中的应用。

附图说明

图1为实施例提供的MSH2抗原的镍柱亲和层析纯化的SDS-PAGE图；泳道1：阳性对照蛋白BSA：0.4mg/mL；泳道2：阳性对照蛋白BSA：0.2mg/mL；泳道3：Marker；泳道4：包(包涵体)；泳道5：FT(流穿)；泳道6：*5，300-1(300mM咪唑洗脱液第一管，稀释5倍上样)；泳道7：*2，-2(300mM咪唑洗脱液第二管，稀释2倍上样)；泳道8：*2，500(500mM咪唑洗脱液，稀释2倍上样)；64123D-4T-AB1为实验项目编号。

图2为实施例提供的人MutS同源蛋白2兔单克隆抗体检测的野生型HeLa、293T、A-549、NIH/3T3及C6等细胞样本以及Mouse testis组织样本中MSH2蛋白的免疫印迹结果图。

图3为实施例提供的人MutS同源蛋白2兔单克隆抗体检测的阑尾(图3A)和结肠癌组织(图3B)及MSH2表达缺失结肠癌组织(图3C)中MSH2蛋白的免疫组化染色图。

图4为实施例提供的重链的重组表达质粒结构图谱。

图5为实施例提供的轻链的重组表达质粒结构图谱。

图6为实施例提供的15点组织芯片样本名称为TMA004-15错配修复_2.00的样品排布图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

术语解释

在本申请中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释，具有各种抗体结构，包括Y型抗体、所谓的全长抗体、Y型抗体的抗原结合部分，以及它们的遗传学或化学修饰。其中，“抗原结合部分”是指Y型抗体的一个或多个部分或片段，可以保留该抗体与人MutS同源蛋白2特异性结合的能力。

在本申请中，术语“单克隆抗体”(mAb)包括具有基本相同的抗原决定簇的高度同质的抗体群。即在该抗体群中，单个抗体基本上是相同的，除了可能自然发生的少量突变。单克隆抗体可以对抗原上的特定表位显示出单一的结合特异性和亲和力。与通常包含针对不同表位的多克隆抗体相比，每个单克隆抗体可以针对抗原上相同或基本相同的表位。修饰词“单克隆”表示抗体的特性是从一个基本同质的抗体群体中获得的，并且不能被解释为需要通过任何特定的方法制得的抗体。该抗体可以通过多种方法制备，包括杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体抗体库、B细胞筛选和培养以及类似的方法制得。

在本申请中，术语“兔抗体”或“抗人MutS同源蛋白2兔单克隆抗体”或者类似术语中的修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。在一个实施例中，抗人MutS同源蛋白2的兔单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的CDR和骨架区(FR)。

在本申请中，术语“抗体”是指，由四条多肽链组成的免疫球蛋白分子，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain，H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Lightchain，L)。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，分别占重链和轻链的1/4和1/2；将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)，分别占重链和轻链的3/4和1/2。

重链的V区和轻链的V区分别称为VL和VH。VL和VH中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为高变区(hypervariable region，HVR)或互补决定区(complementarity determining region，CDR)，包括HVRl(CDRl)、HVR2(CDR2)和HVR3(CDR3)，其中，HVR3(CDR3)变化程度更高。VL和VH的3个CDR共同组成抗体的抗原结合部位(antigen-binding site)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。在V区中，CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守，称为骨架区(framework region，FR)。VH或VL各有四个骨架区，分别用FR1、FR2、FR3和FR4表示。

重链和轻链的C区分别称为CH和CL。不同型(κ或λ)Ig的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CHl、CH2、CH3和CH4。

在本申请中，术语“构架区”或“骨架区”的残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。

在本申请中，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本申请中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。

抗体

为此，实施例公开了一种抗体，所述单克隆抗体特异性结合人MutS同源蛋白2，所述单克隆抗体包含：

和/或

包含3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:8所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:9所示的VH CDR2，以及如SEQID NO:10所示的VH CDR3。

在一些实施例中，所述单克隆抗体包含3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)。所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:3所示序列的VL CDR1、如SEQID NO:4所示序列的VL CDR2和如SEQ ID NO:5所示序列的VL CDR3。在一些实施例中，所述抗体的VL CDR1如SEQ ID NO:3所示，VL CDR2如SEQ ID NO:4所示，VL CDR3如SEQ ID NO:5所示。

在一些实施例中，所述单克隆抗体包含3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)。所述重链可变区具有如SEQ ID NO:8所示序列的VH CDR1、如SEQID NO:9所示序列的VH CDR2和如SEQ ID NO:10所示序列的VH CDR3。在一些实施例中，所述抗体的VH CDR1如SEQ ID NO:8所示，VH CDR2如SEQ ID NO:9所示，VH CDR3如SEQ ID NO:10所示。

在一些实施例中，所述单克隆抗体包含3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)和3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)，所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:3所示序列的VL CDR1、如SEQ ID NO:4所示序列的VL CDR2和如SEQ ID NO:5所示序列的VL CDR3，所述重链可变区具有如SEQ ID NO:8所示序列的VL CDR1、如SEQ ID NO:9所示序列的VL CDR2和如SEQ ID NO:10所示序列的VLCDR3。

一些实施例公开了一种特异性结合人MutS同源蛋白2的单克隆抗体。所述单克隆抗体包含：由SEQ ID NO:2所示序列组成的轻链可变区(VL)以及由SEQ ID NO:7所示序列组成的重链可变区(VH)。

一些实施例公开了一种特异性结合人MutS同源蛋白2的单克隆抗体。所述单克隆抗体包含：由SEQ ID NO:1所示序列组成的轻链以及由SEQ ID NO:6所示序列组成的重链。

在某些实施方式中，该抗人MutS同源蛋白2的抗体可以具有Y型分子结构。在一个实施例中，抗人MutS同源蛋白2的抗体可以包括一对重链和一对轻链。重链可以包括一个重链可变区和一个或多个重链恒定区。哺乳动物的抗体一般包括五种类型的重链：γ、δ、α、μ和ε，相对应组成的抗体就称为IgG，IgD，IgA，IgM和IgE五种抗体。轻链可以是一个相对于重链更小的一个多肽亚基。轻链可以包括一个轻链可变区和一个轻链恒定区。VL通常是轻链的N端部分，在氨基酸序列上表现出更高的变异性。不同抗体之间的VL具有特异的氨基酸序列。在一个实施例中，重链可变区VH和轻链可变区VL可均用于识别和结合人MutS同源蛋白2。在一个实施例中，抗体的轻链恒定区为κ链，抗体的重链恒定区为IgG型。

抗体制备

实施例提供的单克隆抗体可以通过多种方法制备，包括杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体抗体库、B细胞筛选和培养以及类似的方法制得。

在一些实施方式中，该单克隆抗体的制备过程包括：通过重组表达的人MutS同源蛋白2作为免疫原，免疫新西兰大白兔；从大白兔的脾脏细胞中分选得到抗原特异性B淋巴细胞；经抗体功能验证后筛选出能分泌特异性抗体的阳性B淋巴细胞；通过扩增以获得阳性B淋巴细胞的抗体重链及轻链基因，然后进行重组表达，以获得抗人MSH2的兔单克隆抗体。

在一个实施例中，抗人MSH2的兔单克隆抗体的制备方法包括：

(1)MSH2抗原的制备

依据Uniprot公布的P43246蛋白序列，选择330-583氨基酸区域作为抗原序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，对其核苷酸序列进行密码子优化后，人工合成优化后的核酸序列，并将其构建到pGEX-4T-AB1载体(HZbscienc)上，将重组载体转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行蛋白表达，于37℃恒温摇床中表达该蛋白，表达体积为400mL，培养基为LB培养基，使用0.8mM的IPTG诱导表达，诱导时长为4h，然后使用His标签进行镍柱亲和层析纯化后获得纯度高达85％的目的蛋白MSH2。如图1为表达MSH2进行纯化的结果。

(2)免疫动物

将免疫原蛋白MSH2加入到水溶性佐剂中得到免疫试剂，然后采用腿部肌肉注射方法进行免疫兔子，共免疫五次，首免7天后进行二免，二免14天后进行三免，三免21天后进行第四次免疫，7天后进行冲击免疫，免疫剂量均相同。分别取三免、四免后血清进行抗体功能验证，验证合格后进行冲击免疫。

(3)取脾分选及培养B淋巴细胞

从冲击免疫后兔子的外周血中分离获得PBMCs细胞(外周血单个核细胞)，随后利用T淋巴细胞表面标志物进行负筛，以去除T、单核等细胞，然后用荧光染料FITC标记的山羊抗兔IgG挑选活化的B淋巴细胞，对于分选出的B淋巴细胞进行铺板培养，按照1个细胞/孔铺入预先加入滋养层细胞的96孔板中，同时添加一种或多种细胞因子进行共培养。B淋巴细胞筛选和培养方法参见专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A)”。

(4)B淋巴细胞培养上清ELISA检测

待96孔板中B淋巴细胞培养至第7-12天后，取细胞上清进行ELISA检测，用免疫原MSH2包被，选择兔子免疫前采集的血清作为阴性对照孔，根据ELISA结果选择并标记阳性细胞。

(5)cDNA获取、抗体重轻链基因扩增及重组质粒的构建

对筛选获得的阳性细胞孔中的细胞进行裂解，提取阳性细胞的总RNA并通过体外逆转录的方法获得cDNA，使用PCR扩增技术扩增出阳性细胞孔中细胞的抗体重链和轻链的相关编码片段。其中，编码抗体所述轻链的核酸序列如SEQ ID NO.12所示，编码抗体所述轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.13所示。编码抗体所述重链的核酸序列如SEQ ID NO.14所示，编码抗体所述重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.15所示。用于扩增所述重链的引物如SEQ IN NO.16和SEQ IN NO.17所示，用于扩增所述轻链的引物如SEQ IN NO.18和SEQIN NO.19所示。

对编码抗体所述轻链和编码编抗体所述重链的PCR扩增片段测序后进行序列分析，然后分别将重轻链可变区序列装载至含有重轻链抗体基因恒定区序列的载体上并进行测序鉴定，所述重链的重组表达质粒图谱如图4所示，所述轻链的重组表达质粒图谱如图5所示。

(6)质粒转染

将HEK293细胞培养至对数生长期，然后用PEI转染试剂分别将抗体重轻链重组质粒转入HEK293细胞中，抗体重链与轻链按照摩尔质量1:2进行预先混合，使用HEK293细胞基础培养基稀释质粒，同时等体积的该培养基稀释PEI，质粒(μg)：PEI(μL)＝1:3。

(7)抗体表达及纯化

对已转染抗体重轻链质粒的HEK293细胞进行扩大培养至100mL体积，转染后第6天收获细胞上清，使用0.22μm滤器过滤上清后，经过ProteinA柱进行亲和层析纯化，对结合吸附获得的抗体通过pH3.0的柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。利用pH8.8的Tris-HCl溶液迅速中和到pH7.2～7.4之间。纯化得到的抗体再经过超滤离心浓缩后，使其浓度在5mg/mL以上，然后使用野生型HeLa、293T、A-549、NIH/3T3及C6等细胞样本以及Mouse testis组织样本对兔单抗MSH2进行验证。

一个检测例中，将制得兔单抗MSH2作为一抗，采用蛋白免疫印迹检测进行野生型HeLa、293T、A-549、NIH/3T3及C6等细胞样本以及Mouse testis组织样本中MSH2蛋白的检测。具体过程包括：

1、细胞样本及组织样本的准备

野生型HeLa、293T、NIH/3T3及C6等细胞均购于中国科学院上海细胞库；野生型A-549细胞购于中国科学院武汉病毒所；小鼠购于武汉赛美因生物科技有限公司。

2、含MSH2蛋白的细胞样本制备

提前30min设置离心机转子编号、转速(12000rpm)、离心时间(15min)和温度(4℃)，盖好离心机盖子，离心机自动降温。提前30～60min将保存于-20℃中的RIPA裂解液取出，室温中使其融化。待其完全融化后，取所需体积的裂解液于50mL离心管中，并按比例加入蛋白酶抑制剂(1粒/50mL裂解液或者1粒/10mL裂解液)。

首先，根据装有细胞沉淀的10mL离心管数量，准备其6倍数量的1.5mL离心管(离心、转移上清)，每个管上标记细胞名称及裂解时间。然后每种细胞再准备1个1.5mL离心管(测蛋白浓度小样)和1个50mL离心管(收集每种细胞所有蛋白上清)，并标记好细胞名称。(注：每个10mL离心管中收集了3个T75或者1个T175细胞瓶的细胞，每个1.5mL离心管裂解1个T75细胞瓶的细胞。)

将装有细胞沉淀的10mL离心管插入冰中，使细胞沉淀完全置于冰中。按照1mL裂解液/10⁷个细胞(1个T75培养瓶细胞量)的比例加入相应体积的裂解液(细胞量足够时都加入3mL，不足时根据细胞量计算)，用最大量程为1000μL移液器调至最大量程，吹打10下，将细胞混匀，不要起气泡。然后将10mL离心管插入冰中，使液体完全置于冰中，裂解20min，每隔5min将离心管置于涡旋振荡仪上震荡10s。裂解时偶尔会出现半透明胶状不溶物，是基因组DNA复合物，属于正常现象。若出现黏稠状物质，可采用超声破碎。待20min后，用移液器吸悬液，如发现有胶状物，用移液器吸头将之挑出弃掉，不会影响蛋白提取。(注：为防止蛋白降解，整个操作过程全部在冰上完成。细胞裂解后释放大量蛋白酶，低温可以抑制蛋白酶活性。)。

3、含MSH2蛋白的组织样本制备

1)小鼠的处死

采用颈椎脱臼法，用拇指和食指用力往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓与脑髓断离，动物立即死亡。

2)解剖，获取所需组织

将已死亡的鼠置于包有塑料袋的泡沫板上，用针将四个爪子拉直固定，用酒精将鼠毛喷湿，用解剖剪剪开表皮及真皮并将真皮固定，依次取出所需组织。

3)组织清洗及保存

将获取的组织用PBS清洗并用滤纸吸干多余PBS溶液，若不需立即实验，则应标记样本名称、对应种属，解剖日期并置于-80℃冰箱保存(消化类组织如：胃、肠、胰腺等取样后应立即制样)。

4)组织裂解

1)将加有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提前从-20℃取出，至室温融化，备用。

注：a.制备常规组织样本添加蛋白酶抑制剂的用量为1片蛋白酶抑制剂/50mL裂解液。实验室购买的裂解液成品装规格为100mL，使用前融解时加2片蛋白酶抑制剂充分溶解后分装至10mL离心管内冻存，备用2)将待制样的组织，称重后剪至足够碎，之后按每200mg加入1mL裂解液的量加入裂解液混匀。

注：消化类组织如：胃、肠、胰腺等应在含有蛋白酶抑制剂的裂解液内额外添加1％Bimake蛋白酶抑制剂。

3)匀浆破碎：

将分散器打开，将探头放入盛有自来水的烧杯内清洗并将探头擦干，根据样本的体积及均一程度，将分散器开至8-13档不等，匀浆时将探头置于样本中央，待样本均一后，将分散器调至8档后关闭分散器。4)超声：

将超声破碎仪输出功率设置为20％，用细胞破碎仪超声样本，每次超声时间在4-5秒，间隔时间在5秒左右，肉眼观察，样本为均一，不粘稠液体即可。

5)离心：

将已裂解好的组织样本分装至1.5mLEP管后，12000rpm 4℃离心10min，离心后，小心吸取上清，上清即为组织提取液。

4、细胞及组织样本中总蛋白浓度测定及蛋白变性

(1)标准液的制备：

A、取6个1.5mL离心管，并依次标记为1、2、3、4、5、6；

B、用1mL移液器取320μL 1×PBS于6号1.5mL离心管中，再用200μL移液器取80μL1mg/mL BSA标准品加入到320μL PBS中，即为0.2mg/mL BSA溶液。将200μL移液器量程调到最大，吹打10次将溶液混匀，吹打时吸头长度的1/4进入液面即可。涡旋振荡仪上震荡10s混匀。

C、1、2、3、4、5号离心管中分别加入200μL 1×PBS；

D、取6号管中的BSA溶液200μL于5号管中，涡旋震荡10s混匀，即为0.1mg/mL BSA溶液。

E、取5号管中的0.1mg/mL BSA溶液200μL于4号管中，涡旋震荡10s混匀，即为0.05mg/mL BSA溶液。

F、取4号管中的0.05mg/mL BSA溶液200μL于3号管中，涡旋震荡10s混匀，即为0.025mg/mL BSA溶液。G、取3号管中的0.025mg/mL BSA溶液200μL于2号管中，涡旋震荡10s混匀，即为0.0125mg/mL BSA溶液。取200μL溶液，弃之，2号管中保留200μL0.0125mg/mLBSA。

6管BSA溶液浓度依次为：1号：0μg/μL，2号：0.0125μg/μL，3号：0.025μg/μL，4号：0.05μg/μL，5号：0.1μg/μL，6号：0.2μg/μL。

(2)待测样品的准备:将待测样品稀释(样本稀释50/100倍)。若待测样品数量不止1个时，先取与待测样品数量相同的1.5mL离心管，并做好标记(分别于管盖及管身上标记对应待测样品名称)，取500μL 1×PBS于每个1.5mL离心管中，再用2.5μL移液器精确吸取1μL待测样品于装有500μL 1×PBS的对应的离心管中，涡旋震荡10s混匀，吸取300μL弃掉，保留200μL。

(3)试剂甲准备:试剂甲现用现配，每管BSA标准溶液及样本各需要1mL试剂甲。计算好所需试剂甲的体积，取合适体积的离心管用于配置。

(4)分别向6个浓度的BSA标准溶液及样本中加入1mL试剂甲，迅速涡旋震荡10s混匀，37℃温箱静置10min。

(5)再向每管标准液和试剂甲的混合液中加入0.1mL试剂乙，同样立刻涡旋震荡10s混匀，37℃温箱静置30min。

(6)以1×PBS作为空白对照，于750nm处测定各管中溶液的吸光度值(OD值)，样品测定完后，再重复测定2次。

(7)在Excel中以3次测定的蛋白质浓度为横坐标(6个BSA标准液浓度)，吸光度值(OD值)为纵坐标，绘制出3条标准曲线。计算样品浓度。

(8)以相关系数R2值最接近1的那条标准曲线为依据，计算样本蛋白浓度。样本实际浓度(变性后)＝计算值×5/6×100μg/mL(此为样本稀释100倍的计算公式)。

(9)向装有蛋白提取液的1.5mL离心管中加入1/5上清体积的6×Loading Buffer(最终工作液为1×)，待干式恒温器温度升至95℃后，将1.5mL离心管插入加热孔中，95℃加热变性10min，待液体完全冷却后置于-20℃保存。

5、聚丙烯酰胺凝胶电泳及转膜

安装好制胶器后进行分离胶和浓缩胶的配制，然后进行点样跑胶，当溴酚蓝电泳到凝胶底部时，停止电泳，关闭电泳仪电源。凝胶电泳完成后将电源关掉，取下电泳槽盖，电泳缓冲液倒入水池中，将整个电泳槽(包括主体和缓冲液槽)放在自来水下冲洗(注意不要对着凝胶)，直至没有明显的白色泡沫。向装有1/2体积的转膜缓冲液的转膜专用塑料盒中放入2个样品多孔垫和6张滤纸(3张一组)，将转膜样品夹板黑色一侧平放在盒底(样品夹的宽边与塑料盒的窄边平行)，然后将2块转移槽样品多孔垫和6张滤纸放在样品夹板上充分浸湿，在盒中用50mL离心管在滤纸上用力来回滚压3次，使滤纸和多孔垫中的气泡充分排除。浸湿后，在黑色样品夹板上依次放一块多孔垫、三张滤纸(即从下往上依次为黑色样品夹、一块多孔垫、三张滤纸)，另外的一块多孔垫、三张滤纸放在白色样品夹板一侧，将电泳所用的电泳槽、玻板等清洗干净，放入指定位置。

6、封闭及抗体孵育

将膜转移进抗体孵育槽，往槽内加入5mL TBST置于摇床上，“SPEED档位调到40，洗膜5分钟，倒掉TBST，重复1次。注：膜在封闭之前，用TBST润洗，目的是洗掉转膜缓冲液中的一些有机物和盐离子。将TBST倒掉，加入3％的封闭液约5mL，置于摇床上，“SPEED”挡位调到20，封闭60min(封闭时间不得超过50-80min范围，时间过长和过短都会影响后期的结果)。将转膜所用的转膜槽、样品夹、多孔垫用清水冲洗干净，放入指定位置。常规一抗或者非磷酸化修饰一抗用3％脱脂牛奶，磷酸化抗体3％ BSA。封闭完后进行一抗(上述实施例提供的MSH2兔单抗，1:20000稀释)及二抗(HRP山羊抗兔IgG(H+L)(AS014)，稀释1:10000)的孵育，然后进行曝光。

结果如图2所示，野生型人源细胞HeLa、293T及A-549细胞样本中检测出高含量的MSH2蛋白，野生型小鼠细胞NIH/3T3及大鼠细胞C6细胞样本中检测出中高含量的MSH2蛋白，小鼠组织样本中也检出中表达的MSH2蛋白。由此说明，采用实施例提供的抗人MSH2的兔单克隆抗体能够特异性地结合Hela细胞样本中的MSH2。基于此，实施例还提供了一种免疫印迹检测试剂盒，用于检测人MutS同源蛋白2，所述试剂盒包括所述的单克隆抗体。

一个检测例中，将制得的MSH2兔单抗作为一抗，采用免疫组化染色方法定性检测在阑尾、结肠癌组织及MSH2表达缺失结肠癌组织中MSH2。具体过程包括：

1、样本准备

烤片：将石蜡切片(组织样本来源于芯片，芯片采购于百奥斯公司)，按同一朝向放置在切片架上，将其放入56℃的恒温箱中烤片30min；同时将脱蜡液1缸一起放入56℃的恒温箱中；脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中，再一起从恒温箱中取出置于常温，5min后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，脱蜡液试剂缸每缸5min，无水乙醇试剂缸每缸3min；用流水清洗切片3min。

2、抗原修复：0.01M柠檬酸钠修复液(pH6.0)高压热修复。

3、内源性过氧化物酶灭活：用PBS缓冲液浸洗3次，每次1min，去除切片上的缓冲液；将切片完全浸入到3％过氧化氢溶液中，室温，孵育10min。

4、封闭：用PBS缓冲液浸洗3次，每次3min，去除切片上的缓冲液；用免疫组化水笔圈定玻片上待检测组织区域，在圈定区域内滴加封闭液-PBS封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于常温孵育30min，从滴加封闭液开始计时。

5、一抗孵育：去除封闭液，在组织切片上滴加用抗体稀释液-PBS工作液(PBS中添加5％的山羊血清以及0.3％的Triton X-100)稀释的一抗(一抗稀释比：1:900)，水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育60min；去除抗体工作液，PBS缓冲液快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次。

6、二抗孵育：在组织切片上滴加即用型二抗工作液(HRP山羊抗兔IgG(H+L)(AS014)，稀释1:10000)后水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育25min；去除切片上的试剂，缓冲液PBS快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次

7、显色：在组织切片上滴加显色液工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，得到合适的染色强度后；将切片浸入大量蒸馏水中即可终止显色；终止显色后，将切片入流水中清洗10min。

8、复染：将稍沥干的切片浸入Mayer’s苏木素中复染切片1min，复染完成后，用流水清洗3min。

9、返蓝：将稍沥干的切片浸入碳酸锂饱和水溶液中蓝化3s，用流水清洗3min。

10、脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，浸泡期间需上下提拉数次，计时10s后，取出；置于恒温鼓风干燥箱中高温(54～58℃)下完全干燥。

11、封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片，加胶量需适量，加封盖玻片后需完全覆盖组织，且不能有胶溢出，然后进行切片扫描。

结果如图3所示，在阑尾(图3A)和结肠癌组织(图3B)上分别检测MSH2蛋白，在MSH2表达缺失结肠癌组织(图3C)中未检测到MSH2蛋白。图6示出了15点组织芯片样本名称为TMA004-15错配修复_2.00的样品排布图。结果可知，灵敏度12/12＝100％，特异度3/3＝100％；整体阳性中高，背景低。具体为：阳性对照样本：3/3例阑尾、3/3例胰腺、3/3例扁桃体、3/3例结肠癌细胞核阳性；阴性对照样本：2/3例MSH2表达缺失结肠癌肿瘤细胞阴性，其余细胞细胞核阳性，与理论定位一致。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合人MutS同源蛋白2，所述抗体包含：

3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区（CDRs）的轻链可变区（VL），所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:3所示序列的VL CDR1、如SEQ ID NO:4所示序列的VL CDR2和如SEQ IDNO:5所示序列的VL CDR3；和

3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区（CDRs）的重链可变区（VH）；所述重链可变区具有如SEQ ID NO:8所示序列的VH CDR1、如SEQ ID NO:9所示序列的VH CDR2和如SEQ IDNO:10所示序列的VH CDR3。

2.一种单克隆抗体，特异性结合人MutS同源蛋白2，所述单克隆抗体包含：

轻链可变区（VL）；所述轻链可变区由SEQ ID NO:2所示序列组成；及

重链可变区（VH）；所述重链可变区由SEQ ID NO:7所示序列组成。

3.一种单克隆抗体，特异性结合人MutS同源蛋白2，所述单克隆抗体包含：

轻链，所述轻链由SEQ ID NO:1所示序列组成；及

重链，所述重链由SEQ ID NO:6所示序列组成。

4.一种免疫印迹检测试剂盒，用于检测人MutS同源蛋白2，所述试剂盒包括：如权利要求1~3任一所述的单克隆抗体。

5.一种免疫组化检测试剂盒，用于检测人MutS同源蛋白2，所述试剂盒包括：如权利要求1~3任一所述的单克隆抗体。

6.如权利要求1~3任一所述的单克隆抗体在制备检测人MutS同源蛋白2试剂或试剂盒中的应用。