CN115785270B - 一种针对人cd20蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种针对人CD20蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用。制备该单克隆抗体的免疫原为血蓝蛋白(KLH蛋白)偶联人CD20多肽序列；制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，获得抗CD20蛋白兔单克隆抗体及重链和轻链序列。该单克隆抗体具有高特异性，可特异性识别人CD20蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测，因此，可用所述单克隆抗体应用于制备检测人CD20蛋白的试剂盒，以达到人CD20蛋白检测或为相关疾病诊断提供参考。

Description

一种针对人CD20蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用

技术领域

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种针对人CD20蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用。

背景技术

B淋巴细胞抗原CD20蛋白是参与调节B细胞激活和增殖的细胞表面磷酸化蛋白。它通常用作识别B细胞的标志物，在整个B细胞发育过程中表达，直到它们分化成为浆细胞。CD20蛋白在B淋巴细胞表面以寡聚体形式存在，现有实验证明CD20蛋白在B细胞表面形成的是四聚体。有证据表明，CD20蛋白对于钙池调控钙离子通道进入是必要的，这将导致B细胞激活所需的细胞质钙水平升高。抗CD20蛋白抗体免疫疗法通过激活天然单核细胞网来消耗B细胞，是B细胞淋巴瘤、白血病和自身免疫性疾病和常用疗法。

因此，本领域亟需一种新的高亲和力的用于检测抗人CD20蛋白单克隆抗体。

发明内容

本申请提供一种高亲和力的用于检测抗人CD20蛋白的兔单克隆，以在一定程度上解决上述技术问题之一。所述的抗人CD20蛋白兔单克隆抗体的免疫原为血蓝蛋白(KLH蛋白)偶联人CD20多肽序列；制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术。所述单克隆抗体能够可特异性结合人CD20蛋白，因此，可用所述单克隆抗体应用于制备检测人CD20蛋白的试剂盒，以达到人CD20蛋白检测或相关疾病诊断的临床应用价值，为实现此目的，本申请提供了如下技术方案：

第一方面，本申请提供了一种抗体，其特异性结合人CD20蛋白，所述抗体包含根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VL CDR1，其由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；VL CDR2，其由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；以及VL CDR3，其由SEQ ID NO:7所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；

和/或

包含根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VH CDR1，其由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；VH CDR2，其由SEQ ID NO:9所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；以及VH CDR3，其由SEQ IDNO:10所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；优选地，所述置换为保守性置换。

第二方面，本申请提供了一种抗体，其特异性结合人CD20蛋白，所述抗体包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)；所述轻链可变区(VL)由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成；所述重链可变区(VH)由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成。

第三方面，本申请提供了一种抗体，其包含轻链和重链，所述轻链由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成；所述重链由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成。

第四方面，本申请提供了一种缀合物，其包含第一至第三方面任一项所述的抗体，及与所述抗体连接的可检测的标记。

第五方面，本申请提供了一种试剂盒，用于检测人CD20蛋白，所述试剂盒包括第一至三方面任一项所述的抗体或第四方面所述的缀合物。

第六方面，本申请公开了第一至第三方面任一项所述抗体或第五方面所述试剂盒在检测人CD20蛋白的应用。

与现有技术相比，本发明的优点及积极效果为：

前述技术方案选取的CD20蛋白165～177AA氨基酸片段为抗原，经由KLH或BSA偶联后作为免疫原。所述重组蛋白对新西兰大白兔进行免疫，基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，获得抗CD20蛋白兔单克隆抗体及重链和轻链序列。本方案得到的抗体具有高特异性，可以特异性识别人CD20蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

附图说明

图1为本申请实施例提供的免疫印迹法检测单克隆抗体识别特异性的结果。

图2为本申请实施例提供的免疫荧光法检测单克隆抗体识别特异性的结果；其中，A为细胞样本Raji的检测结果，B为阴性细胞样本HeLa的检测结果。

图3为本申请实施例提供的单克隆抗体有不同人体组织的检测结果；其中，A为人间变性大细胞淋巴瘤组织检测结果，B为人霍奇金淋巴瘤组织检测结果，C为人肝脏组织检测结果，D为人扁桃体组织检测结果。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

术语解释

在本申请中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释，具有各种抗体结构，包括但不限于Y型抗体、所谓的全长抗体、Y型抗体的抗原结合部分，以及它们的遗传学或化学修饰。其中，“抗原结合部分”是指Y型抗体的一个或多个部分或片段，可以保留该抗体与人CD20蛋白特异性结合的能力。

在本申请中，术语“单克隆抗体”(mAb)包括具有基本相同的抗原决定簇的高度同质的抗体群。即在该抗体群中，单个抗体基本上是相同的，除了可能自然发生的少量突变。单克隆抗体可以对抗原上的特定表位显示出单一的结合特异性和亲和力。与通常包含针对不同表位的多克隆抗体相比，每个单克隆抗体可以针对抗原上相同或基本相同的表位。修饰词“单克隆”表示抗体的特性是从一个基本同质的抗体群体中获得的，并且不能被解释为需要通过任何特定的方法制得的抗体。该抗体可以通过多种方法制备，包括但仅限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体抗体库以及类似的方法制得。

在本申请中，术语“兔抗体”或“抗人CD20蛋白单克隆抗体”或者类似术语中的修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。在其中一个实施例中，抗人CD20蛋白兔单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR和骨架区(FR)。在其中一个实施例中，抗人CD20蛋白的兔抗体或兔单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR。在其中一个实施例中，抗人CD20蛋白兔单克隆抗体可以为CDR区来源于兔源免疫球蛋白序列、而FR来自于其他哺乳动物的种系免疫球蛋白序列(如小鼠或人类)的一种抗体。术语“抗人CD20蛋白兔单克隆抗体”也可能包含具有非兔源免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基的抗体，例如，由体外随机突变或点特异性突变引入的、或体内体细胞突变引入的突变。然而，术语“抗人CD20蛋白兔单克隆抗体”并不包括CDR区来自其他哺乳动物的种系(如老鼠)的抗体。

在本申请中，术语“抗体”是指，由四条异源性多肽链组成的免疫球蛋白分子，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain，H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Light chain，L)。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，分别占重链和轻链的1/4和1/2；将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)，分别占重链和轻链的3/4和1/2。

重链和轻链的V区分别称为VH和VL。VH和VL中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为高变区(hypervariable region，HVR)或互补决定区(complementaritydetermining region，CDR)，包括HVRl(CDRl)、HVR2(CDR2)和HVR3(CDR3)，其中，HVR3(CDR3)变化程度更高。VH和VL的3个CDR共同组成抗体的抗原结合部位(antigen-binding site)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。在V区中，CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守，称为骨架区(framework region，FR)。VH或VL各有四个骨架区，分别用FR1、FR2、FR3和FR4表示。

重链和轻链的C区分别称为CH和CL。不同型(κ或λ)Ig的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CHl、CH2、CH3和CH4。

在本申请中，术语“构架区”或“骨架区”的残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。

在本申请中，术语“嵌合抗体”是指其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但其仍保留对目标抗原的结合活性。

在本申请中，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(如可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。典型地，人源化抗体的至少一个或两个但通常所有三个(重和/或轻免疫球蛋白链的)受体CDR被供体CDR替换。提供CDR的免疫球蛋白称为“供体”，提供框架的免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方案中，供体免疫球蛋白是非人源(如兔)抗体，受体框架可以天然存在的人框架，或与其相比具有约85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性等。供体抗体可以是有预期性质(如，抗原特异性、亲和性、反应性等)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(如，食蟹猴)抗体。

本申请的嵌合抗体或人源化抗体可以根据免疫动物(如兔子)所产生的单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链的DNA可以从来自免疫动物的目标杂交瘤或特异性B细胞中获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含人免疫球蛋白序列。

在本申请中，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本申请中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。

在本申请中，术语“载体”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

在本申请中，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时，那么各分子在该位置上是同一的。例如，如果两个序列的10个位置中有8个匹配，那么这两个序列具有80％的同一性。

在本申请中，术语“保守性置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。

抗体

本申请实施例中公开的一种抗体，其特异性结合人CD20蛋白，所述抗体包含根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VL CDR1，其由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；VL CDR2，其由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；以及VL CDR3，其由SEQ ID NO:7所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；

和/或

包含根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VH CDR1，其由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；VH CDR2，其由SEQ ID NO:9所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；以及VH CDR3，其由SEQ IDNO:10所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；优选地，所述置换为保守性置换。

在某些实施例中，所述抗体的轻链可变区(VL)由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成；所述抗体的重链可变区(VH)由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成。

在某些实施例中，所述抗体的轻链由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成；所述重链由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成。

在某些实施例中，该抗人CD20蛋白的抗体可以具有Y型分子结构。在其中一个实施例中，抗人CD20蛋白的抗体可以包括一对重链和一对轻链。重链可以包括一个重链可变区和一个或多个重链恒定区。哺乳动物的抗体一般包括五种类型的重链：γ、δ、α、μ和ε，相对应组成的抗体就称为IgG，IgD，IgA，IgM和IgE五种抗体。轻链可以是一个相对于重链更小的一个多肽亚基。轻链可以包括一个轻链可变区和一个轻链恒定区。VL通常是轻链的N端部分，在氨基酸序列上表现出更高的变异性。不同抗体之间的VL具有特异的氨基酸序列。在其中一个实施例中，重链可变区VH和轻链可变区VL可均用于识别和结合人CD20蛋白。在其中一个实施例中，抗体的轻链恒定区为κ链，抗体的重链恒定区为IgG1型。

在某些实施例中，位于VL和VH区域中的CDR，相互之间可被都FR分隔开。FR是序列结构中的保守区域。FR通常可以作为一个支架，以使得CDR形成能够特异性地结合抗原(例如人CD20蛋白)的三维结构。FR的三维结构可以在不同的抗体中呈现保守性。CDR可以被移植到来自其他物种的另一种抗体的FR之间，同时保留其与人CD20蛋白结合的能力，形成一种融合抗体。在其中一个实施例中，将Y型兔单克隆抗体的CDR移植到人抗体的FR之间，形成一个抗人CD20蛋白的人源化抗体。在某些实施例中，该抗体包含来源于人免疫球蛋白的FR区，所述FR区任选地包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个从人源残基至相应的兔源残基的回复突变。

在某些实施例中，位于VH和VL区域中的CDR，相互之间可被都FR分隔开。FR是序列结构中的保守区域。FR通常可以作为一个支架，以使得CDR形成能够特异性地结合抗原(例如人CD20蛋白)的三维结构。FR的三维结构可以在不同的抗体中呈现保守性。兔单克隆抗体的CDR可以被移植到来自其他物种的另一种抗体的FR之间，同时保留其与人CD20蛋白结合的能力，形成一种融合抗体。在其中一个实施例中，将Y型兔单克隆抗体的CDR移植到人抗体的FR之间，形成一个抗人CD20蛋白的人源化抗体。

本申请实施例提供的抗人CD20蛋白兔单克隆抗体还可以包括来自上述实施例提供的结构或通过基因修饰获得的其抗原结合部分。在某些实施例中，抗人CD20蛋白兔单克隆抗体可以具有不同的转基因抗体结构，包括但不限于人源化抗体和嵌合抗体。在其中一个实施例中，抗人CD20蛋白兔单克隆抗体可以是一种人源化抗体，该人源化抗体的蛋白序列具有与适应人体自然变异抗体的高度同源性。其中，“人源化抗体”的蛋白质序列可以与人类变异抗体的蛋白质序列基本相同，并同时使得其兔源的CDR区保持与人CD20蛋白的结合能力。在其中一个实施例中，可以通过插入非人源抗体的CDR区来创建所述的“人源化抗体”，例如，将一个兔抗体的CDR区插入一个人源抗体支架中以制得一种人源化抗体。在其中一个实施例中，抗人CD20蛋白兔单克隆抗体可以是一种嵌合抗体。在其中一个实施例中，该嵌合抗体可以是通过将不同来源的Y型抗体的重链和轻链的可变区移植到另一动物(比如人体)的恒定区而制成的抗体。在其中一个实施例中，抗人CD20蛋白兔单克隆抗体可以是一个单链Fv(scFv)。尽管Fv段的两个结构域，即VL和VH，是由两个单独的基因编码的，但可以通过重组方法将两个单独的编码基因连接形成的一个连接子，从而编码表达scFv。在其中一个实施例中，可以根据本领域技术人员熟知的方法进行相关基因修饰和转基因操作，并且可以以与筛选全长抗体相同的方式筛选转基因抗体结构。

兔源单克隆抗体的制备

本申请公开了上述抗体的制备方法，本申请的单克隆抗体可以采用本领域已知的各种方法来制备，如通过基因工程重组技术来获得；通过化学合成或PCR扩增获得编码本申请抗体的重链和轻链基因的DNA分子，将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，并在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本申请的抗体。

在某些实施方式中，本发明用来制备人CD20兔单克隆抗体的免疫原来自交联在KLH蛋白上的人CD20多肽；制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术。在一些实施例中，所述制备方法包括：以重组人蛋白作为免疫原，免疫新西兰大白兔；从大白免的脾脏细胞中分选B淋巴细胞并进行培养；提取B淋巴细胞中的RNA，反转录成cDNA；cDNA经PCR扩增获得天然配对的的兔单克隆抗体；将然配对的的兔单克隆抗体的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因分别装载至表达载体上，并将载体转染宿主细胞，培养宿主细胞，并从宿主细胞的培养液分离，纯化获得所述的单克隆抗体。

具体来说，一个该兔源单克隆抗体的制备实施过程包括：

1、动物免疫

以KLH蛋白偶联人CD20多肽为免疫原，免疫4只新西兰大白兔，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；每只大白兔免疫300μg，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后每间隔3周取150μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，用ELISA方法测定其针对人CD20蛋白的滴度，并将最后一次免疫后血清纯化成抗体，WB、IF和IHC检测内源样本，取血清滴度高且内源检测最好的兔子，用150μg免疫原皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。

2、分离脾脏细胞。

3、B淋巴细胞分选

参见专利“201910125091.4从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法”。

4、编码兔单克隆抗体基因的克隆

培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后提取RNA并反转录成cDNA。采用PCR方法，天然配对的兔单克隆抗体轻重链可变区基因(VH和VL)从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，并经测序确定序列。

5、单克隆抗体的生产和纯化

为了获得多株识别人CD20蛋白的兔单克隆抗体，本发明将兔单克隆抗体重链、轻链基因分别装载在表达载体上，将质粒转染293F细胞；转染72～96小时获得培养上清中含有重组的识别人CD20蛋白的抗体。使用protein A亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出重组的识别人CD20蛋白的兔单克隆抗体，抗体验证合格后分装，于-20℃低温保存备用。

6、结果

本实施例筛选得到了一种能识别人CD20蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体的轻链由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成，重链由SEQ IDNO:2所示氨基酸序列组成；该单克隆抗体的轻链可变区(VL)由SEQ IDNO:3所示氨基酸序列组成；重链可变区(VH)由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成；轻链可变区(VL)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VL CDR1，其由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列组成；VL CDR2，其由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列组成；以及VL CDR3，其由SEQ IDNO:7所示氨基酸序列组成；重链可变区(VH)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VH CDR1，其由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列组成；VH CDR2，其由SEQ IDNO:9所示氨基酸序列组成；以及VH CDR3，其由SEQ ID NO:10所示氨基酸序列组成。

兔源单克隆抗体特异性鉴定

本申请实施例对前述制备的单克隆抗体的识别特异性和应用效果进行鉴定。

取高表达CD20蛋白的细胞样本Raji及阴性细胞样本HeLa，用免疫印迹的方法检测本申请制备的单克隆抗体的识别特异性，通过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

首先，按常规防范在电转移系统中奖凝胶蛋白带转移到PVDF膜上。将膜置于含5％脱脂奶粉的TBST封闭液中室温孵育1h，加入抗人CD20蛋白兔单克隆抗体(1:1000稀释)，4℃孵育过夜。用TBST洗膜后，加入1:10000稀释的羊抗兔二抗，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液，显影。

显影结果如图1所示，通过免疫印迹的方法，高表达人CD20蛋白的细胞样本Raji的检测结果，显示出清晰的条带，而阴性细胞样本HeLa的检测结果中未出现条带，表明本申请制备的单克隆抗体对人CD20蛋白具有良好的识别特异性。

取高表达CD20蛋白的细胞样本Daudi及阴性细胞样本Jurkat，用免疫荧光的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，用5％空白山羊血清将样本完全覆盖，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min，去除封闭液，在样本上滴加TBS缓冲液配制的CD20抗体(1:200稀释)工作液，置于4℃孵育过夜，将样本置于常温，复温15min，去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤，在样本上滴加与1:10000稀释的羊抗兔二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时，去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤，在样本上滴加DAPI工作液，孵育10分钟；去除DAPI工作液，加入抗荧光衰减封片剂后，于荧光显微镜下观察并采集图像。

荧光显示结果如图2所示，通过免疫荧光的方法，其中高表达CD20蛋白的细胞样本Daudi的检测结果中，可以看到抗原抗体高度结合，而阴性细胞样本Jurkat的检测结果呈阴性，表明本申请制备的单克隆抗体对人CD20蛋白具有良好的识别特异性。

兔源单克隆抗体的应用

本申请实施例提供了所制备的单克隆抗体在检测人CD20蛋白的应用，能过免疫组化组织芯片染色和鉴定的方法，具体步骤如下：

1、芯片选择

人CD20蛋白在人样本主要表达于骨髓和淋巴组织中，选择阳性样本有人扁桃体、间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤，阴性样本有胚胎性癌、A型胸腺瘤、常规肝、常规肾样本用于免疫组化检测。

2、IHC染色及分析

抗原修复：0.01M柠檬酸钠修复液(pH6.0)高压热修复；

内源性过氧化物酶灭活：用PBS缓冲液浸洗3次，每次1min，去除切片上的缓冲液；将切片完全浸入到3％过氧化氢溶液中，室温，孵育10min；

封闭：用PBS缓冲液浸洗3次，每次3min，去除切片上的缓冲液；

用免疫组化水笔圈定玻片上待检测组织区域，在圈定区域内滴加封闭液-PBS封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于常温孵育30min，从滴加封闭液开始计时；

一抗孵育：去除封闭液，在组织切片上滴加用抗体稀释液-PBS工作液稀释的一抗，水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育60min；去除抗体工作液，PBS缓冲液快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次(一抗稀释比1：8100)；

二抗孵育：在组织切片上滴加即用型二抗工作液(剂瓶A)后水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育25min；去除切片上的试剂，缓冲液PBS快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次；

显色：在组织切片上滴加显色液工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，得到合适的染色强度后；将切片浸入大量蒸馏水中即可终止显色；终止显色后，将切片入流水中清洗10min；

复染：将稍沥干的切片浸入Mayer’s苏木素中复染切片1min，复染完成后，用流水清洗3min；

返蓝：将稍沥干的切片浸入碳酸锂饱和水溶液中蓝化3s，用流水清洗3min；

脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，浸泡期间需上下提拉数次，计时10s后，取出；置于恒温鼓风干燥箱中高温(54～58℃)下完全干燥；

封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片，加胶量需适量，加封盖玻片后需完全覆盖组织，且不能有胶溢出；

切片扫描。

结果分析：免疫组化染色结果分为:阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。使用抗人CD20兔单克隆抗体，在阳性样本人扁桃体、间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤有特异性染色；在阴性样本人肝、肾、胚胎性癌、A型胸腺瘤染色呈阴性；具体结果如图2所示，结果显示抗人CD20兔单克隆抗体染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净。结合免疫印迹和免疫荧光的结果，说明抗人CD20兔单克隆抗体特异地识别人CD20蛋白，无非特异性染色，有效避免假阳性结果。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种抗体，其特异性结合人CD20蛋白，所述抗体包含：

根据Kabat编号系统定义的轻链可变区，所述轻链可变区具有三个互补决定区 ，分别为：VL CDR1，其由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列组成；VL CDR2，其由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列组成；以及VL CDR3，其由SEQ ID NO:7所示氨基酸序列组成；

和

根据Kabat编号系统定义的重链可变区，所述重链可变区具有三个互补决定区，分别为：VH CDR1，其由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列组成；VH CDR2，其由SEQ ID NO:9所示氨基酸序列组成；以及VH CDR3，其由SEQ ID NO:10所示氨基酸序列组成。

2.一种抗体，其特异性结合人CD20蛋白，所述抗体包含轻链可变区和重链可变区；所述轻链可变区由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成；所述重链可变区由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成。

3.一种抗体，其包含轻链和重链，所述轻链由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成；所述重链由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成。

4.根据权利要求1~3任一项所述的抗体，其中，所述抗体是嵌合抗体、或人源化抗体。

5.一种缀合物，其包含权利要求1~4任一项所述的抗体，及与所述抗体连接的检测标记。

6.一种用于检测人CD20蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1~4任一项所述的抗体或权利要求5所述的缀合物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含特异性识别权利要求1~4任一项所述抗体的第二抗体；所述第二抗体包括检测标记，所述第二抗体对如权利要求1~4任一项所述的抗体或如权利要求5所述的缀合物中包含的恒定区所来自的物种是特异的，所述物种是兔或人。

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