CN117624353A - 结合平滑肌肌球蛋白重链的抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
实施例公开了结合平滑肌肌球蛋白重链的抗体及其用途。该抗体能够特异性结合平滑肌肌球蛋白重链，能够应用于制备检测平滑肌肌球蛋白水平的试剂盒。另外，由于该单克隆抗体与平滑肌肌球蛋白具有高亲和力，能够用于免疫学检测，特别是免疫组化检测，在临床诊断和科研应用上具有重要的意义。
Description
技术领域
本申请涉及对平滑肌肌球蛋白具有特异性的抗体领域，还涉及结合平滑肌肌球蛋白重链的抗体及其用途。
背景技术
肌球蛋白是一种马达蛋白，是一种超家族的蛋白质，共分为11类，其中10类为非传统肌球蛋白，另一类肌球蛋白Ⅱ称为传统肌球蛋白。其中，平滑肌肌球蛋白重链，属于肌凝蛋白重链家族。该基因产物是六聚体蛋白的一个亚基，由两个重链亚基和两对不相同的轻链亚基组成。它是一种主要的收缩蛋白，通过ATP的水解将化学能转化为机械能。编码人类与大鼠NUDE1同源基因的基因是从该基因的反向链转录而来，其3'端与后者重叠。16号染色体的中心周围反转产生一个嵌合转录物，该转录物编码一种蛋白质，该蛋白质由核心结合因子β的N端前165个残基组成，与平滑肌肌球蛋白重链的碳端部分融合。这种染色体重排与M4EO亚型的急性髓性白血病有关。选择性剪接产生差异表达的同种异构体，在肌肉细胞成熟过程中比例发生变化。已经鉴定出编码不同同种异构体的选择性剪接转录变异体。
平滑肌肌球蛋白重链(SMMHC)是一种通过三磷酸腺苷水解参与肌肉收缩的蛋白。研究表明，SMM HC基因表达水平在几种类型的癌症中下调，SMMHC是很好的肌上皮标记物，能够用于乳腺管内癌与浸润性癌、平滑肌源性的肿瘤诊断。抗SMMHC的抗体能够以用于乳腺管内癌与浸润性癌、平滑肌源性的肿瘤、动脉瘤的检测及诊断，以及结合形态学观察还能够用于急性髓细胞白血病的诊断。
发明内容
本申请提供一类高特异性结合平滑肌肌球蛋白重链的抗体，为肌球蛋白的表达检测提供新的技术支持。该抗体应能够用于制备检测平滑肌肌球蛋白水平的试剂盒，对于平滑肌肌球蛋白以及相关疾病的诊断与治疗都具有重要临床价值。
为此，本申请至少公开了如下技术方案：
第一方面，实施例公开了一种抗体，所述抗体特异性结合平滑肌肌球蛋白，所述抗体包含：
3个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：如SEQ IDNO:3所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:4所示的VL CDR1，以及如SEQ ID NO:5所示的VL CDR1；
和/或
3个根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：如SEQ IDNO:8所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:9所示的VH CDR2，以及如SEQ ID NO:10所示的VH CDR3。
第二方面，实施例公开了一种抗体，特异性结合平滑肌肌球蛋白。所述抗体包含具有如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区(VL)以及具有如SEQ ID NO:7所示的重链可变区(VH)。
第三方面，实施例公开了一种抗体，特异性结合平滑肌肌球蛋白。所述抗体包含具有如SEQ ID NO:1所示的轻链以及具有如SEQ ID NO:2所示的重链。
第四方面，实施例公开了一种免疫印迹检测试剂盒，用于检测平滑肌肌球蛋白。所述试剂盒包括：如第一至三方面任一项所述的抗体。
第五方面，实施例公开了一种免疫组化检测试剂盒，用于检测平滑肌肌球蛋白。所述试剂盒包括：如第一至三方面任一项所述的抗体。
第六方面，实施例公开了第一至三方面任一所述的抗体在制备检测平滑肌肌球蛋白试剂或试剂盒中的应用。
附图说明
图1为实施例提供的构建含兔单克隆抗体重链的表达载体示意图。
图2为实施例提供的构建含兔单克隆抗体轻链的表达载体示意图。
图3为实施例提供的使用兔单克隆抗体1E2进行免疫印迹法分析小鼠肺组织样本中SMMHC的表达结果。
图4为实施例提供的使用兔单克隆抗体1E2进行免疫印迹法分析大鼠肺组织样本中SMMHC的表达结果。
图5为实施例提供的使用兔单抗克隆抗体1E2进行免疫组织化学法检测人胎盘组织样本中SMMHC表达情况。
图6为实施例提供的使用兔单抗克隆抗体1E2进行免疫组织化学法检测人结肠组织样本中SMMHC表达情况。
图7为实施例提供的使用兔单抗克隆抗体1E2进行免疫组织化学法检测小鼠肝组织样本中SMMHC表达情况。
图8为实施例提供的使用兔单抗克隆抗体1E2进行免疫组织化学法检测小鼠肺组织样本中SMMHC表达情况。
图9为实施例提供的使用兔单抗克隆抗体1E2进行免疫组织化学法检测大鼠心脏胎盘组织样本中SMMHC表达情况。
图10为实施例提供的使用兔单抗克隆抗体1E2进行免疫组织化学法检测大鼠肾组织样本中SMMHC表达情况。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均能够从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，能够从现有技术中获知。
术语解释
在本申请中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释，具有各种抗体结构，包括但不限于Y型抗体、所谓的全长抗体、Y型抗体的抗原结合部分，以及它们的遗传学或化学修饰。其中，“抗原结合部分”是指Y型抗体的一个或多个部分或片段，能够以保留该抗体与平滑肌肌球蛋白特异性结合的能力。
在本申请中，术语“单克隆抗体”(mAb)包括具有基本相同的抗原决定簇的高度同质的抗体群。即在该抗体群中，单个抗体基本上是相同的，除了能够能自然发生的少量突变。单克隆抗体能够以对抗原上的特定表位显示出单一的结合特异性和亲和力。与通常包含针对不同表位的多克隆抗体相比，每个单克隆抗体能够以针对抗原上相同或基本相同的表位。修饰词“单克隆”表示抗体的特性是从一个基本同质的抗体群体中获得的，并且不能被解释为需要通过任何特定的方法制得的抗体。该抗体能够以通过多种方法制备，包括但仅限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体抗体库以及类似的方法制得。
在本申请中，术语“兔抗体”或“抗平滑肌肌球蛋白兔单克隆抗体”或者类似术语中的修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。在一个实施例中，抗平滑肌肌球蛋白的兔单克隆抗体能够以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR和骨架区(FR)。在一个实施例中，抗平滑肌肌球蛋白的兔抗体或兔单克隆抗体能够以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR。
在本申请中，术语“抗体”是指，由四条异源性多肽链组成的免疫球蛋白分子，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain，H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Light chain，L)。抗体轻链能够分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链能够分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，分别占重链和轻链的1/4和1/2；将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)，分别占重链和轻链的3/4和1/2。
重链的V区和轻链的V区分别称为VL和VH。VL和VH中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度能够变的区域，称为高变区(hypervariable region，HVR)或互补决定区(complementarity determining region，CDR)，包括HVRl(CDRl)、HVR2(CDR2)和HVR3(CDR3)，其中，HVR3(CDR3)变化程度更高。VL和VH的3个CDR共同组成抗体的抗原结合部位(antigen-binding site)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。在V区中，CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守，称为骨架区(framework region，FR)。VH或VL各有四个骨架区，分别用FR1、FR2、FR3和FR4表示。
重链和轻链的C区分别称为CH和CL。不同型(κ或λ)Ig的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CHl、CH2、CH3和CH4。
在本申请中，术语“构架区”或“骨架区”的残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
抗体
为此，本申请实施例公开了一种抗体，所述抗体特异性结合平滑肌肌球蛋白。所述抗体包含：
3个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：如SEQ IDNO:3所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:4所示的VL CDR1，以及如SEQ ID NO:5所示的VL CDR1；
和/或
3个根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：如SEQ IDNO:8所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:9所示的VH CDR2，以及如SEQ ID NO:10所示的VH CDR3。
在一些实施例中，所述抗体包含3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)，所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:3所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:4所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:5所示的VL CDR3。
在一些实施例中，所述抗体包含3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)，所述重链可变区具有如SEQ ID NO:8所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:9所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:10所示的VH CDR3。
在一些实施例中，所述抗体包含：3个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：如SEQ ID NO:3所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:4所示的VL CDR1，以及如SEQ ID NO:5所示的VL CDR1；和3个根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：如SEQ ID NO:8所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:9所示的VH CDR2，以及如SEQ IDNO:10所示的VH CDR3。
在一些实施例中，所述抗体特异性结合人平滑肌肌球蛋白重链、小鼠平滑肌肌球蛋白重链、大鼠平滑肌肌球蛋白重链、兔平滑肌肌球蛋白重链中的一项或多项。
抗体制备
另外一方面，本申请公开了上述抗体的制备方法。这些抗体能够以采用本领域已知的各种方法来制备，如通过基因工程重组技术来获得；通过化学合成或PCR扩增获得编码本申请抗体的重链和轻链基因的DNA分子，将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，并在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本申请的抗体。
在某些实施方式中，制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术。在一些实施例中，所述制备方法包括：以重组平滑肌肌球蛋白作为免疫原，免疫新西兰大白兔；从大白兔的脾脏细胞中分选B淋巴细胞并进行培养；提取B淋巴细胞中的RNA，反转录成cDNA；cDNA经PCR扩增获得天然配对的兔单克隆抗体；将天然配对的兔单克隆抗体的重链可变区(VH)的编码基因和轻链可变区(VL)的编码基因分别装载至表达载体上，并将载体转染宿主细胞，培养宿主细胞，并从宿主细胞的培养液分离和纯化以获得所述的单克隆抗体。
一个该兔源单克隆抗体的制备实施过程包括：
(1)分选B淋巴细胞
以重组平滑肌肌球蛋白(武汉爱博泰克公司，以pGEX-4T-AB1表达重组平滑肌肌球蛋白SMMHC，使用Human SMMHC NP_002465.1(Uniprot ID：P35749)蛋白序列对应NM_002474.3构建至pGEX-4T-AB1载体，在Rosetta(DE3)细胞中表达出的高质量重组人SMMHC蛋白)为免疫原，免疫4只新西兰大白兔；每只大白兔免疫量为300μg，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗氏佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后每间隔3周取150μg免疫原与等量的不完全弗氏佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，用酶联免疫吸附剂(ELISA)方法测定其抗平滑肌肌球蛋白的滴度，取血清滴度高的兔子，用150μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后从脾脏细胞分选B淋巴细胞，B淋巴细胞筛选方法参见“能够溶性B淋巴细胞刺激因子原核表达及其单克隆抗体制备[J]生物学杂志，2021年第3期，ISSN：2095-1736”。
(2)培养B淋巴细胞
用抗原包被的酶联免疫吸附剂(ELISA)检测分选的B淋巴细胞阳性克隆。收集阳性克隆的细胞液，裂解后提取RNA并反转录成cDNA。采用PCR方法，天然配对的兔单克隆抗体轻重链可变区(VL和VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，并经测序确定序列。
(3)单克隆抗体的生产和纯化
为了获得能够识别平滑肌肌球蛋白的兔单克隆抗体，如图1和图2所示，实施例将兔单克隆抗体重链、轻链的编码基因分别装载在表达载体上，将表达载体转染293F细胞，转染72～96小时收获培养上清液，从该上清液中收获兔单克隆抗体。其中，使用protein A亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化抗体，抗体验证合格后分装，于-20℃低温保存备用。
(4)结果
结果，本实施例中筛选得到的特异性识别平滑肌肌球蛋白的兔单克隆抗体(命名为1E2)：轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:1；轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；轻链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；重链氨基酸序列为SEQ ID NO:6；重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7；重链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
抗体应用
一个应用例中，取高表达SMMHC的大小鼠肺组织样本和兔肺组织样本(武汉赛美因生物科技有限公司)，用免疫印迹的方法检测抗体1E2的识别特异性，进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规防范在电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上。将膜置于含5％脱脂奶粉的TBST封闭液中室温孵育1h，加入抗体SMMHC兔单克隆抗体(1:1000稀释)，4℃孵育过夜。用TBST洗膜后，加入1:10000稀释的羊抗兔二抗，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液，显影(见图3、图4)。结果如图3和图4能够知，抗体1E2能够有效识别天然SMMHC，具有反应特异性，能够以应用于制备检测的SMMHC的免疫印迹检测试剂盒。
一个免疫组化组织检测的应用例包括：
(1)芯片选择
由于人SMMHC蛋白在人样本主要在平滑肌和肌上皮特异性表达，选择阳性样本有人的常规阑尾、常规扁桃体，常规胰腺，结肠癌用于免疫组化检测。
(2)IHC染色及分析
抗原修复：0.01M柠檬酸钠修复液(pH6.0)高压热修复。
内源性过氧化物酶灭活：用PBS缓冲液浸洗3次，每次1min，去除切片上的缓冲液；将切片完全浸入到3％过氧化氢溶液中，室温，孵育10min。
封闭：用PBS缓冲液浸洗3次，每次3min，去除切片上的缓冲液；用免疫组化水笔圈定玻片上待检测组织区域，在圈定区域内滴加封闭液-PBS封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于常温孵育30min，从滴加封闭液开始计时。
一抗孵育：去除封闭液，在组织切片上滴加用PBS缓冲液稀释IE2(稀释比1:8000)以作为一抗，水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育60min；去除抗体工作液，PBS缓冲液快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次(一抗。
二抗孵育：在组织切片上滴加即用型二抗工作液(EnVision Detection SystemsPeroxidase/DAB,Rabbit/Mouse(Dako，K5007))后水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育25min；去除切片上的试剂，缓冲液PBS快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次。
显色：在组织切片上滴加显色液工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，得到合适的染色强度后；将切片浸入大量蒸馏水中即能够终止显色；终止显色后，将切片入流水中清洗10min。
复染：将稍沥干的切片浸入Mayer’s苏木素中复染切片1min，复染完成后，用流水清洗3min。
返蓝：将稍沥干的切片浸入碳酸锂饱和水溶液中蓝化3s，用流水清洗3min。
脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，浸泡期间需上下提拉数次，计时10s后，取出；置于恒温鼓风干燥箱中高温(54～58℃)下完全干燥；
封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片，加胶量需适量，加封盖玻片后需完全覆盖组织，且不能有胶溢出。
切片扫描。
(3)结果
检出样本：人肝，人肝癌，人肺，人肺癌，人结肠癌，人结肠，人乳腺癌，人食管，人食管癌，人脑，人扁桃体，人胎盘；小鼠心，小鼠肝，小鼠脾，小鼠肺，小鼠肾，小鼠脑，小鼠睾丸，小鼠脊髓，小鼠胃，小鼠胰腺；大鼠心，大鼠肝，大鼠脾，大鼠肺，大鼠肾，大鼠脑，大鼠睾丸，大鼠卵巢，大鼠胃，大鼠胰腺。
定位描述：平滑肌和肌上皮特异性表达，阳性率高，阳性中高，背景无或极弱。具体结果(部分阳性结果展示见图5、6、7、8、9、10)，结果显示，抗人SMMHC兔单克隆抗体免疫组织能够满足病理样本的检测。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，能够轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种抗体，所述抗体特异性结合平滑肌肌球蛋白重链，所述抗体包含：
3个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：如SEQ ID NO:3所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:4所示的VL CDR1，以及如SEQ ID NO:5所示的VL CDR1；
和/或
3个根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：如SEQ ID NO:8所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:9所示的VH CDR2，以及如SEQ ID NO:10所示的VH CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体包含3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)，所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:3所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:4所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:5所示的VL CDR3。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体包含3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)，所述重链可变区具有如SEQ ID NO:8所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:9所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:10所示的VH CDR3。
4.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体包含：
3个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：如SEQ ID NO:3所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:4所示的VL CDR1，以及如SEQ ID NO:5所示的VL CDR1；和
3个根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：如SEQ ID NO:8所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:9所示的VH CDR2，以及如SEQ ID NO:10所示的VH CDR3。
5.一种抗体，特异性结合平滑肌肌球蛋白，所述抗体包含：
具有如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区(VL)；以及
具有如SEQ ID NO:7所示的重链可变区(VH)。
6.一种抗体，特异性结合平滑肌肌球蛋白，所述抗体包含：
具有如SEQ ID NO:1所示的轻链；以及
具有如SEQ ID NO:2所示的重链。
7.一种免疫印迹检测试剂盒，用于检测平滑肌肌球蛋白，所述试剂盒包括如权利要求1～6任一所述的抗体。
8.一种免疫组化检测试剂盒，用于检测平滑肌肌球蛋白，所述试剂盒包括如权利要求1～6任一所述的抗体。
9.如权利要求1～6任一所述的抗体在制备检测平滑肌肌球蛋白试剂或试剂盒中的应用。
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